JP2764725B2 - 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 - Google Patents
修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、修飾酵素を水と非混合性の有機溶媒中で用
いることにより、Ｄ−アミノ酸残基を導入した光学活性
なペプチドを得る製造法に関するものである。Ｄ−アミ
ノ酸を構成要素とするポリペプチドは、生体適合材料や
ドラッグデリバリーシステムを構築するうえで重要であ
り、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチドへのＤ−アミノ酸残
基の導入方法が、注目されている。
いることにより、Ｄ−アミノ酸残基を導入した光学活性
なペプチドを得る製造法に関するものである。Ｄ−アミ
ノ酸を構成要素とするポリペプチドは、生体適合材料や
ドラッグデリバリーシステムを構築するうえで重要であ
り、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチドへのＤ−アミノ酸残
基の導入方法が、注目されている。
［従来の技術］ ペプチドの合成法としては、大別して、化学合成法、
酵素法、発酵法がある。この内、化学合成法には、N,
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
用いる方法、活性エステル法、混合酸無水物法、NCA法
などがある。これらの方法の中、化学合成法では、目的
物がラセミ化する可能性があり、光学活性体を得るため
には、その後光学分割の過程が必要である。
酵素法、発酵法がある。この内、化学合成法には、N,
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
用いる方法、活性エステル法、混合酸無水物法、NCA法
などがある。これらの方法の中、化学合成法では、目的
物がラセミ化する可能性があり、光学活性体を得るため
には、その後光学分割の過程が必要である。
他方、酵素法では、加水分解の逆反応を利用し、概ね
一段階の酵素反応によりペプチドが作られる。一段階の
反応が、関与するだけなので生産方法の企画、解析、管
理が、容易であるなどの特徴がある。しかし、酵素法で
は、基質特異性、即ちアミノ基、保護基に対する選択性
があり、化学合成法ほど広範囲の利用可能性はない。
一段階の酵素反応によりペプチドが作られる。一段階の
反応が、関与するだけなので生産方法の企画、解析、管
理が、容易であるなどの特徴がある。しかし、酵素法で
は、基質特異性、即ちアミノ基、保護基に対する選択性
があり、化学合成法ほど広範囲の利用可能性はない。
近年、遺伝子工学の技術を用いて酵素の機能、安定
性、基質特異性の改善または改質、生産菌の改良が盛ん
に行われており、酵素を用いることによる各種ペプチド
の効率的な生産法が、確立されつつある。
性、基質特異性の改善または改質、生産菌の改良が盛ん
に行われており、酵素を用いることによる各種ペプチド
の効率的な生産法が、確立されつつある。
一方、本発明者を含む発明者らによって、酵素を化学
修飾し、該酵素を有機溶媒中で働かせる方法をペプチド
合成に応用した発明が、出願されている。（特願昭63−
119,277号） 従来の酵素を用いるペプチド合成法は、天然酵素の立
体選択性、即ち、Ｌ−体のみを基質として認識し、加水
分解反応の逆反応であるペプチド合成反応を触媒し、Ｌ
−体のアミノ酸残基しかペプチド鎖に導入出来ない。
修飾し、該酵素を有機溶媒中で働かせる方法をペプチド
合成に応用した発明が、出願されている。（特願昭63−
119,277号） 従来の酵素を用いるペプチド合成法は、天然酵素の立
体選択性、即ち、Ｌ−体のみを基質として認識し、加水
分解反応の逆反応であるペプチド合成反応を触媒し、Ｌ
−体のアミノ酸残基しかペプチド鎖に導入出来ない。
［発明者が解決しようとする問題点］ 本発明者は、上記の酵素を用いたペプチド合成法の問
題点を解決し、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチド鎖にＤ−
アミノ酸を効率良く導入する方法を検討した。本発明者
らは、既に酵素の化学修飾により得られた酵素−合成高
分子複合体が、水に不溶の有機溶媒に可溶化し、該有機
溶媒中で効率よくペプチド合成を触媒することを見いだ
している。
題点を解決し、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチド鎖にＤ−
アミノ酸を効率良く導入する方法を検討した。本発明者
らは、既に酵素の化学修飾により得られた酵素−合成高
分子複合体が、水に不溶の有機溶媒に可溶化し、該有機
溶媒中で効率よくペプチド合成を触媒することを見いだ
している。
この修飾酵素のペプチド合成に於ける基質特異性を検
討する過程で適当なＮ−末端を保護したアミノ酸エステ
ルを第一基質に選べば、反応の過程で得られる修飾酵素
−基質複合体が、第二基質としてのＤ−アミノ酸エステ
ルと選択的に反応し、Ｄ−アミノ酸を導入したペプチド
が生成することを見いだした。
討する過程で適当なＮ−末端を保護したアミノ酸エステ
ルを第一基質に選べば、反応の過程で得られる修飾酵素
−基質複合体が、第二基質としてのＤ−アミノ酸エステ
ルと選択的に反応し、Ｄ−アミノ酸を導入したペプチド
が生成することを見いだした。
以上の説明から明らかなように本発明の目的は、特定
の修飾酵素を用いて上述の第一基質と第二基質を反応さ
せる新規な（Ｄ−アミノ酸を導入した）ペプチドの製造
を提供することである。
の修飾酵素を用いて上述の第一基質と第二基質を反応さ
せる新規な（Ｄ−アミノ酸を導入した）ペプチドの製造
を提供することである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記（１）の構成を有する。
（１）酵素として、分子中のアミノ基が2,4−ビス（０
−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロル−Ｓ
−トリアジンで置換された修飾パパインを用い、第一基
質として、一般式 Ｘ−（A1）ｎ−OR1 ………（１） （ここでｎは整数）で示されるＮ−末端をアシル基で保
護したＬ−アミノ酸または、ペプチドのエステルを用
い、第二基質として、一般式 Ｈ−（A2）−OR2 ………（２） （ただし、Ｘはアシル型保護基、A1,A2はアミノ酸残
基、R1,R2はアルキル基を示す。）で示されるＤ−アミ
ノ酸エステルを用い、水と非混合性の有機溶媒中で該
（１）と（２）の化合物をカップリング反応させ、Ｄ−
体のアミノ酸を導入することを特徴とする修飾酵素によ
る光学活性ペプチドの製造法。
−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロル−Ｓ
−トリアジンで置換された修飾パパインを用い、第一基
質として、一般式 Ｘ−（A1）ｎ−OR1 ………（１） （ここでｎは整数）で示されるＮ−末端をアシル基で保
護したＬ−アミノ酸または、ペプチドのエステルを用
い、第二基質として、一般式 Ｈ−（A2）−OR2 ………（２） （ただし、Ｘはアシル型保護基、A1,A2はアミノ酸残
基、R1,R2はアルキル基を示す。）で示されるＤ−アミ
ノ酸エステルを用い、水と非混合性の有機溶媒中で該
（１）と（２）の化合物をカップリング反応させ、Ｄ−
体のアミノ酸を導入することを特徴とする修飾酵素によ
る光学活性ペプチドの製造法。
本発明の構成と効果につき以下に詳述する。
本発明において使用する酵素としては、プロテアーゼ
特には、キモトリプシン、トリプシン、スプチリシン、
カルボキシペプチダーゼなどのセリンプロテアーゼ、パ
パイン、プロメレイン、フィシンなどのチオールプロテ
アーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼ、好まし
くはパパインである。
特には、キモトリプシン、トリプシン、スプチリシン、
カルボキシペプチダーゼなどのセリンプロテアーゼ、パ
パイン、プロメレイン、フィシンなどのチオールプロテ
アーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼ、好まし
くはパパインである。
修飾剤としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチ
ルセルロースなどの高分子を用いるが、特には、ポリエ
チレングリコールが好ましい。
ングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチ
ルセルロースなどの高分子を用いるが、特には、ポリエ
チレングリコールが好ましい。
これらの酵素を修飾する方法としては、上記の合成高
分子の末端を2,4,6−トリクロル−Ｓ−トリアジンやサ
クシニルイミドで活性化し、これに酵素のアミノ基を共
有結合させる方法または、合成高分子と酵素を非共有結
合で結合させた複合体を形成させる方法などがある。
分子の末端を2,4,6−トリクロル−Ｓ−トリアジンやサ
クシニルイミドで活性化し、これに酵素のアミノ基を共
有結合させる方法または、合成高分子と酵素を非共有結
合で結合させた複合体を形成させる方法などがある。
本発明で使用する第一基質としては、一般式 Ｘ−（A1）ｎ−OR1 ………（１） で示されるＮ−末端をアシル基で保護したＬ−アミノ酸
または、ペプチドのエステルであり、第二基質として、
一般式 Ｈ−（A2）−OR2 ………（２） で示されるＤ−アミノ酸エステルである（だたし、上記
（１）、（２）式において、A1,A2はアミノ酸残基、R1,
R2はアルキル基、ｎは１以上の整数、Ｘはアシル型保護
基を示す）。
または、ペプチドのエステルであり、第二基質として、
一般式 Ｈ−（A2）−OR2 ………（２） で示されるＤ−アミノ酸エステルである（だたし、上記
（１）、（２）式において、A1,A2はアミノ酸残基、R1,
R2はアルキル基、ｎは１以上の整数、Ｘはアシル型保護
基を示す）。
このような各基質に係るアミノ酸またはペプチドの具
体例としては、限定されないが、後述の実施例に示され
るようなベンゾイル−Ｌ−アラニン、Ｌ−トリプトファ
ン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アラニン若しくはＬ−ア
ラニンを挙げることができる。
体例としては、限定されないが、後述の実施例に示され
るようなベンゾイル−Ｌ−アラニン、Ｌ−トリプトファ
ン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アラニン若しくはＬ−ア
ラニンを挙げることができる。
また、OR1又はOR2基を形成すべきアルコールとして
は、メチルアルコール、エチルアルコールなどを挙げる
ことができる。更に、Ｘとしてはベンゾイル基を挙げる
ことができる。
は、メチルアルコール、エチルアルコールなどを挙げる
ことができる。更に、Ｘとしてはベンゾイル基を挙げる
ことができる。
また、水と非混合性の有機溶媒としては、極性基を有
しない不活性溶媒が望ましく、例えばベンゼン、トルエ
ンのような芳香族炭化水素または、ヘキサン、ヘプタン
のような脂肪族炭化水素を挙げることができる。
しない不活性溶媒が望ましく、例えばベンゼン、トルエ
ンのような芳香族炭化水素または、ヘキサン、ヘプタン
のような脂肪族炭化水素を挙げることができる。
修飾チオールプロテアーゼは、上述の溶媒の溶液とし
て使用する。使用濃度は限定されないが0.1〜100mg/溶
液ml、好ましくは１〜50mg/溶媒mlである。
て使用する。使用濃度は限定されないが0.1〜100mg/溶
液ml、好ましくは１〜50mg/溶媒mlである。
また、第一及び第二基質のカップリング反応は、両者
の有機溶媒溶液に上述の修飾チオールプロテアーゼの溶
媒溶液を混合し酸素の作用温度で、例えば12〜120時間
撹拌、振とう又は静置して反応させる。反応物は、常法
により、原料基質、酵素、目的物に分離する。カップリ
ング反応に使用する修飾酵素の反応原料（基質）に対す
る使用比率は限定されないが、各基質100mM当り有機溶
媒溶液として100μ（10mg/ml）程度である。
の有機溶媒溶液に上述の修飾チオールプロテアーゼの溶
媒溶液を混合し酸素の作用温度で、例えば12〜120時間
撹拌、振とう又は静置して反応させる。反応物は、常法
により、原料基質、酵素、目的物に分離する。カップリ
ング反応に使用する修飾酵素の反応原料（基質）に対す
る使用比率は限定されないが、各基質100mM当り有機溶
媒溶液として100μ（10mg/ml）程度である。
［発明の効果］ 本発明の効果を列挙すると以下の通りである。
1.一段階の反応でＬ−アミノ酸よりなるペプチド鎖にＤ
−アミノ酸が挿入された一連のペプチドが得られる。
−アミノ酸が挿入された一連のペプチドが得られる。
2.第二基質として、ラセミ体のアミノ酸エステルを用い
ても、Ｄ−体のアミノ酸エステルを選択的にペプチドに
導入できる。
ても、Ｄ−体のアミノ酸エステルを選択的にペプチドに
導入できる。
3.有機溶媒中で反応溶液は、均一である。
また、水分は、飽和濃度しか存在しないので、第一基
質の加水分解がおこらず効率よくペプチド合成が行え
る。
質の加水分解がおこらず効率よくペプチド合成が行え
る。
［実施例］ 実施例１（修飾パパインの合成） パパイアの果実乳液により得たパパイン50mgを含む0.
2M酢酸緩衝液（pH4.5）10mlに0.1M水酸化ナトリウム水
溶液を加えpHを10に調整し、2,4−ビス（０−メトキシ
ポリエチレングリコール）−６−クロル−Ｓ−トリアジ
ン（ポリエチレングリコール部分の分子量が、5000のも
の）0.9gを加え、28℃で一時間反応させた。これを常法
により精製し、パパイン分子中のアミノ基の37％に2,4
−ビス（０−メトキシポリエチレングリコール）−６−
クロル−Ｓ−トリアジンが置換した修飾パパインを得
た。
2M酢酸緩衝液（pH4.5）10mlに0.1M水酸化ナトリウム水
溶液を加えpHを10に調整し、2,4−ビス（０−メトキシ
ポリエチレングリコール）−６−クロル−Ｓ−トリアジ
ン（ポリエチレングリコール部分の分子量が、5000のも
の）0.9gを加え、28℃で一時間反応させた。これを常法
により精製し、パパイン分子中のアミノ基の37％に2,4
−ビス（０−メトキシポリエチレングリコール）−６−
クロル−Ｓ−トリアジンが置換した修飾パパインを得
た。
この修飾パパインは、水溶液中で未修飾パパインの72
％の酵素活性を保持していた。
％の酵素活性を保持していた。
実施例２（光学活性ペプチドの製造） 実施例１で得た修飾酵素を用い、118mMのベンゾイル
−Ｌ−アラニンメチルエステル（BZ−Ｌ−a1a−0Me）と
50mMのＤ−トリプトファンメチルエステル（Ｄ−Trp−0
Me）（第１図Ａ）または、53mMのＬ−トリプトファンメ
チルエステル（Ｌ−Trp−0Me）（第１図Ｂ）のベンゼン
溶液の各々100μを採り、これに20mMジオスレイトー
ルを含む修飾パパインのベンゼン溶液（10mg/ml）100μ
加えて、37℃で恒温振とうし、反応させた。24時間後
の反応溶液を１μとり、生成物をイアトロスキャンで
分析した。Ｄ−アミノ酸エステルが、選択的にペプチド
に挿入されていることは、次の結果より明らかである。
−Ｌ−アラニンメチルエステル（BZ−Ｌ−a1a−0Me）と
50mMのＤ−トリプトファンメチルエステル（Ｄ−Trp−0
Me）（第１図Ａ）または、53mMのＬ−トリプトファンメ
チルエステル（Ｌ−Trp−0Me）（第１図Ｂ）のベンゼン
溶液の各々100μを採り、これに20mMジオスレイトー
ルを含む修飾パパインのベンゼン溶液（10mg/ml）100μ
加えて、37℃で恒温振とうし、反応させた。24時間後
の反応溶液を１μとり、生成物をイアトロスキャンで
分析した。Ｄ−アミノ酸エステルが、選択的にペプチド
に挿入されていることは、次の結果より明らかである。
第１図（A,B）は、24時間後の反応溶液のイアストロ
スキャンのクロマトグラムを示す。縦軸は、カウント
数、横軸は、保持時間（分）を示す。展開溶媒には、ク
ロロフォルム：メタノール＝20:1の混合溶媒を用いた。
ピーク番号の１から５は、各々、１は第一基質（Ｎ−ベ
ンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル）、２は、ペプ
チド生成物（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−トリ
プトファンメチルエステル（第１図Ａ）、または、Ｎ−
ベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−トリプトファンメチル
エステル（第１図Ｂ）、３は、ペプチド第二生成物（Ｎ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−トリプトファンメチ
ルエステル−Ｌ−トリプトファンメチルエステル）、４
は、第二基質（Ｄ−トリプトファンメチルエステル）
（第１図Ａ）または、Ｌ−トリプトファンメチルエステ
ル（第１図Ｂ）、５は、修飾酵素を示す。
スキャンのクロマトグラムを示す。縦軸は、カウント
数、横軸は、保持時間（分）を示す。展開溶媒には、ク
ロロフォルム：メタノール＝20:1の混合溶媒を用いた。
ピーク番号の１から５は、各々、１は第一基質（Ｎ−ベ
ンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル）、２は、ペプ
チド生成物（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−トリ
プトファンメチルエステル（第１図Ａ）、または、Ｎ−
ベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−トリプトファンメチル
エステル（第１図Ｂ）、３は、ペプチド第二生成物（Ｎ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−トリプトファンメチ
ルエステル−Ｌ−トリプトファンメチルエステル）、４
は、第二基質（Ｄ−トリプトファンメチルエステル）
（第１図Ａ）または、Ｌ−トリプトファンメチルエステ
ル（第１図Ｂ）、５は、修飾酵素を示す。
クロマトグラムの面積より計算した、Ｄ−体ペプチド
とＬ−体ペプチドの生成比は、8:1である。
とＬ−体ペプチドの生成比は、8:1である。
実施例３（光学活性ペプチドの製造） 実施例２と同様の修飾酵素と第一基質を用い、第二基
質として、Ｄ−アラニンメチルエステル（Ｄ−Ala−0M
e）（20mM）または、Ｄ−アラニンメチルエステル（Ｌ
−Ala−0Me）（20mM）を用いて、ペプチド合成反応を行
った。この場合のＤ−体ジペプチドとＬ−体ジペプチド
の生成比は、7.8:1であった。
質として、Ｄ−アラニンメチルエステル（Ｄ−Ala−0M
e）（20mM）または、Ｄ−アラニンメチルエステル（Ｌ
−Ala−0Me）（20mM）を用いて、ペプチド合成反応を行
った。この場合のＤ−体ジペプチドとＬ−体ジペプチド
の生成比は、7.8:1であった。
第１図は、本発明の実施例２における反応溶液のイアト
ロスキャンのクロマトグラムを示す。
ロスキャンのクロマトグラムを示す。
Claims (1)
- 【請求項１】酵素として、分子中のアミノ基が2,4−ビ
ス（０−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロ
ル−Ｓ−トリアジンで置換された修飾パパインを用い第
一基質として、一般式 Ｘ−（A1）ｎ−OR1 ………（１） （ここでｎは整数）で示されるＮ−末端をアシル基で保
護したＬ−アミノ酸または、ペプチドのエステルを用
い、第二基質として、一般式 Ｈ−（A2）−OR2 ………（２） （ただし、Ｘはアシル型保護基、A1,A2はアミノ酸残
基、R1,R2はアルキル基を示す。）で示されるＤ−アミ
ノ酸エステルを用い、水と非混合性の有機溶媒中で該
（１）と（２）の化合物をカップリング反応させ、Ｄ−
体のアミノ酸を導入することを特徴とする修飾酵素によ
る光学活性ペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63217982A JP2764725B2 (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63217982A JP2764725B2 (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0265792A JPH0265792A (ja) | 1990-03-06 |
| JP2764725B2 true JP2764725B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=16712770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63217982A Expired - Fee Related JP2764725B2 (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2764725B2 (ja) |
-
1988
- 1988-08-31 JP JP63217982A patent/JP2764725B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
| JPH0265792A (ja) | 1990-03-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |