JPH0265792A - 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 - Google Patents
修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法Info
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- JPH0265792A JPH0265792A JP63217982A JP21798288A JPH0265792A JP H0265792 A JPH0265792 A JP H0265792A JP 63217982 A JP63217982 A JP 63217982A JP 21798288 A JP21798288 A JP 21798288A JP H0265792 A JPH0265792 A JP H0265792A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、修飾酵素を水と非混合性の有機溶媒中で用い
ることにより、D−アミノ酎残基を導入した光学活性な
ペプチドを得る製造υ、に関するものである。D−アミ
ノ酸を構成eZとするポリペプチドは、生体適合材木1
やドラングデリ/ヘリーシステムを構築するうえでff
i安であり、L−アミノ酸よりなるペプチドへのローア
ミノ酸残フ、(の・n久方法が、注目されている。
ることにより、D−アミノ酎残基を導入した光学活性な
ペプチドを得る製造υ、に関するものである。D−アミ
ノ酸を構成eZとするポリペプチドは、生体適合材木1
やドラングデリ/ヘリーシステムを構築するうえでff
i安であり、L−アミノ酸よりなるペプチドへのローア
ミノ酸残フ、(の・n久方法が、注目されている。
[従来の技術]
ペプチドの合成法としては、大別して、化学合成法、酵
素法、発酵法がある。この内、化学合成法には、 N、
N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
用いる方法、活性エステル法,混合醜無水物法、NCA
法などがある.これらの方法の生化学合成法では、目的
物がラセミ化する可能性があり、光学活性体を得るため
には,その後光学分,1.IIの過程が、必要である・
他方、酵2も法では、加水分解の逆戻I心を利用し、概
ね−・段階の酵素反応によりペプチドが、つくられる、
−段階の反応が、関与するだけなので生tr力法の企画
、h¥ui、t?理が9容易であるなどの特徴がある。
素法、発酵法がある。この内、化学合成法には、 N、
N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
用いる方法、活性エステル法,混合醜無水物法、NCA
法などがある.これらの方法の生化学合成法では、目的
物がラセミ化する可能性があり、光学活性体を得るため
には,その後光学分,1.IIの過程が、必要である・
他方、酵2も法では、加水分解の逆戻I心を利用し、概
ね−・段階の酵素反応によりペプチドが、つくられる、
−段階の反応が、関与するだけなので生tr力法の企画
、h¥ui、t?理が9容易であるなどの特徴がある。
しかし、酵素法では、基質特異性、1!lちアミン基、
保1;〜ノ、(に対する選択性があり、化学合成法はど
広範囲の利用可能性はない。
保1;〜ノ、(に対する選択性があり、化学合成法はど
広範囲の利用可能性はない。
近年、遺伝T1′7の技術を用いて酵Jニの機能、安定
を置基質特異性の改善または改質、生産菌の改良が盛ん
に行われており、酵素を用いることによる各種ペプチド
の効率的な生産法が、確立されつつある。
を置基質特異性の改善または改質、生産菌の改良が盛ん
に行われており、酵素を用いることによる各種ペプチド
の効率的な生産法が、確立されつつある。
方、木発舅者を含む発明者らによって、酵素を化学修飾
し、if!1.酵素を有機溶媒中で(動かせる方U、を
ペプチド合成に応用した発明が、出願されている。(特
WIII/183−119,277号)。
し、if!1.酵素を有機溶媒中で(動かせる方U、を
ペプチド合成に応用した発明が、出願されている。(特
WIII/183−119,277号)。
従来の1IS2素を用いるペプチド合成法は、天然酵素
の1χ体選択性、即ち、L一体のみを基質として認識し
、加水分解反応の逆反応であるペプチド合成反応を触媒
し、 L一体のアミノ酸残基しがペプチド鎖に導入出来
ない。
の1χ体選択性、即ち、L一体のみを基質として認識し
、加水分解反応の逆反応であるペプチド合成反応を触媒
し、 L一体のアミノ酸残基しがペプチド鎖に導入出来
ない。
[発明が解決しようとする問題点1
本発明名は、I−記の酵素を用いたペプチド合成法の問
題点を解決し、L−アミノ酸よりなるペプチド鎖にD−
アミノ酸を効率良く導入する方法を検シ、1した。本発
明者らは、既に酵素の化学修飾により得られた酵素−合
成高分子複合体が、水に不溶の有機溶媒に可溶化し、該
有機溶媒中で効率良くペプチド合成を触媒することを見
いだしている。
題点を解決し、L−アミノ酸よりなるペプチド鎖にD−
アミノ酸を効率良く導入する方法を検シ、1した。本発
明者らは、既に酵素の化学修飾により得られた酵素−合
成高分子複合体が、水に不溶の有機溶媒に可溶化し、該
有機溶媒中で効率良くペプチド合成を触媒することを見
いだしている。
この修飾酵素のペプチド合成に於ける基質特異性を検シ
・1する過程で適当なN−末端を保護したアミノ酸エス
テルを第一基質に選べば1反+5の過程で得られる修飾
酵素−)、(質複合体が、第二基質としてのD−アミノ
酸エステルと選択的に反応し、D−アミノ酸を導入した
ペプチドが生成することを見いだした。
・1する過程で適当なN−末端を保護したアミノ酸エス
テルを第一基質に選べば1反+5の過程で得られる修飾
酵素−)、(質複合体が、第二基質としてのD−アミノ
酸エステルと選択的に反応し、D−アミノ酸を導入した
ペプチドが生成することを見いだした。
以上の説明から明らかなように未発明の目的は、特定の
修飾酵素を用いてに述の第一基質と第二基質を反応させ
る新規な(D−アミノ酸を導入した)ペプチドの製造〃
、を提供することである。
修飾酵素を用いてに述の第一基質と第二基質を反応させ
る新規な(D−アミノ酸を導入した)ペプチドの製造〃
、を提供することである。
1問題点全解決するだめの手段]
本発明は、下記(1)の構成を有する。
(1)酵素として、修飾チオールプロテアーゼを用い、
第一リ、(質として、一般式 %式%(1) で示されるN−末端をアシルノ1(で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、
一般式 %式%(2) (ただし、Xは、アシル型保護基、AI 、 A2は、
アミノ耐残JLi 、 R+ 、 R,lは、アルギル
基を示す、)で示されるD−アミノ酸エステルを用い水
と非混合性の有機溶媒中で該(1)と(2)の化合物を
カンプリング反応させ、D一体のアミノ酸を導入するこ
とを特徴とする修S酵素による光学活性ペプチドの製造
法。
第一リ、(質として、一般式 %式%(1) で示されるN−末端をアシルノ1(で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、
一般式 %式%(2) (ただし、Xは、アシル型保護基、AI 、 A2は、
アミノ耐残JLi 、 R+ 、 R,lは、アルギル
基を示す、)で示されるD−アミノ酸エステルを用い水
と非混合性の有機溶媒中で該(1)と(2)の化合物を
カンプリング反応させ、D一体のアミノ酸を導入するこ
とを特徴とする修S酵素による光学活性ペプチドの製造
法。
本発明の構成と効果につき以下に1祥述する。
本発明において使用する酵素としては、プロテアーゼ特
にjよ、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン、
カルボキシペブチタ゛−ゼなどのセリンプロテアーゼ、
パパイン、プロメレイン、フィシンなどのチオールプロ
テアーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼである
。
にjよ、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン、
カルボキシペブチタ゛−ゼなどのセリンプロテアーゼ、
パパイン、プロメレイン、フィシンなどのチオールプロ
テアーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼである
。
修飾剤としては、ポリビニルアルコール。ポリエチレン
グリコール、ポリヒニルビロリドン、カルボギシメチル
セルロースなどの高分子を用いるが、特には、ポリエチ
レングリコールか、好ましい。
グリコール、ポリヒニルビロリドン、カルボギシメチル
セルロースなどの高分子を用いるが、特には、ポリエチ
レングリコールか、好ましい。
これらの酵素を修飾する方法としては、上記の合成高分
子の末端を2.4.8− トリクロル−5−)リアジン
やサクシニルイミFで活性化し、これに酵素のアミツノ
人を共有結合させる方法または1合成品分子とll52
素を非共有結合で結合させた複合体を形成させる方法な
どがある。
子の末端を2.4.8− トリクロル−5−)リアジン
やサクシニルイミFで活性化し、これに酵素のアミツノ
人を共有結合させる方法または1合成品分子とll52
素を非共有結合で結合させた複合体を形成させる方法な
どがある。
本発明で使用する第一基質としては、−・般式%式%(
1) で示されるN−末端全アシルJ、(で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルであり、第二基質と1、で
は、 競式 H−(A7)、−OR? −・−・−・−・・−・
(2)で工、されるD−アミノ酸エステルである(ただ
し1−記(1) 、 (2)式において、A、 、 A
、は、アミ2ノ醇残ノ、(、R,、R・は、アルキル基
、 n、n’はl以にの整数、 Xはアシル1%Il保
護)、(を小す)。
1) で示されるN−末端全アシルJ、(で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルであり、第二基質と1、で
は、 競式 H−(A7)、−OR? −・−・−・−・・−・
(2)で工、されるD−アミノ酸エステルである(ただ
し1−記(1) 、 (2)式において、A、 、 A
、は、アミ2ノ醇残ノ、(、R,、R・は、アルキル基
、 n、n’はl以にの整数、 Xはアシル1%Il保
護)、(を小す)。
このような各ノ1(質に係るアミノ酸またはペプチドの
1体例としては、限定されないが、後述の実施例に小さ
れるようなヘンソイル−L−アラニン1、−トリプトフ
ァン、Dlリプトファン、D−アラニン若しくはし一ア
ラニンを挙げることができる。
1体例としては、限定されないが、後述の実施例に小さ
れるようなヘンソイル−L−アラニン1、−トリプトフ
ァン、Dlリプトファン、D−アラニン若しくはし一ア
ラニンを挙げることができる。
また、flR,又はOR2)、(を形成すべきアルコー
ルとしては、メチルアルコール、エチルアルコールなど
を挙げることができる。更に、Xとしてはヘンヘイル基
を挙げることができる。
ルとしては、メチルアルコール、エチルアルコールなど
を挙げることができる。更に、Xとしてはヘンヘイル基
を挙げることができる。
また、水を非混合性の有機溶媒としては、極性)6(を
右しない不活性溶媒が望ましく1例えばベンゼン トル
エンのような芳香族炭化水素または、ヘキサノ、ヘプタ
ンのような脂肪族炭化水素を挙げることかできる。
右しない不活性溶媒が望ましく1例えばベンゼン トル
エンのような芳香族炭化水素または、ヘキサノ、ヘプタ
ンのような脂肪族炭化水素を挙げることかできる。
rS1!Iliチオールプロテアーゼは、−上述の溶媒
の溶液として使用する。使用濃度は限定されないが0.
1〜100B /溶媒Il交好ましくは1〜50B/溶
媒m父である。
の溶液として使用する。使用濃度は限定されないが0.
1〜100B /溶媒Il交好ましくは1〜50B/溶
媒m父である。
また、第−及び第二基質の力、ブリング反応は1両者の
有機溶媒溶液に上述の修飾チオールプロテアーゼの溶媒
溶液を混合し酵素の作用温度で、例えば12〜120時
間攪拌、振とう又は静置して反応させる9反応物は、常
法により、原料基質、酵素、目的物に分離する。カップ
リング反応に使用する修飾酵素の反応原木1(基質)に
対する使用比率は、限定されないが、各基質100+s
M 当り有機溶媒溶液として100u文(lomg/
m文)程度である。
有機溶媒溶液に上述の修飾チオールプロテアーゼの溶媒
溶液を混合し酵素の作用温度で、例えば12〜120時
間攪拌、振とう又は静置して反応させる9反応物は、常
法により、原料基質、酵素、目的物に分離する。カップ
リング反応に使用する修飾酵素の反応原木1(基質)に
対する使用比率は、限定されないが、各基質100+s
M 当り有機溶媒溶液として100u文(lomg/
m文)程度である。
[発明の効果1
本発明の効果を列挙すると以Fの通りである。
1、−段階の反応でL−アミノ酸よりなるペプチド鎖に
D−アミノ酸が挿入された一連のペプチドが得られる。
D−アミノ酸が挿入された一連のペプチドが得られる。
2、第二)、(質として、ラセミ体のアミ、′酸エステ
ルを用いても、D一体のアミノ酸エステルを選択的に(
ブチトに・4人できる。
ルを用いても、D一体のアミノ酸エステルを選択的に(
ブチトに・4人できる。
3.11機溶媒中で反応溶液は、均一である。
また、部分は、飽和濃度しか存在しないので、第一部質
の加水分解がおこらず効−Vよくペプチド合成が何える
。
の加水分解がおこらず効−Vよくペプチド合成が何える
。
[実施例]
実施例1(修飾パパインの合成)
パハイヤの果実乳液により得たパパイン50+I1gを
含ム0.28酢Mwt’ljH(pH4,5) IO
+si ニO,1M木M化十トリウム水溶液を加えpH
を10に:A整し、2.4ビス(0−メトキシポリエチ
レングリコール)−6クロル〜S−トリアジン(ポリエ
チレングリコール部分の分Y−量が、5000のもの)
0.9gを加え、28°Cで・時間反応させた。これ
を常法により精製し7ぐパイン分子中のアミツノ、(の
37%に2.4−ビス(θノトギソポリエチレングリコ
ール)−6クロルーS−トリアノンが置換した修飾パフ
ペインを(1蚕た。
含ム0.28酢Mwt’ljH(pH4,5) IO
+si ニO,1M木M化十トリウム水溶液を加えpH
を10に:A整し、2.4ビス(0−メトキシポリエチ
レングリコール)−6クロル〜S−トリアジン(ポリエ
チレングリコール部分の分Y−量が、5000のもの)
0.9gを加え、28°Cで・時間反応させた。これ
を常法により精製し7ぐパイン分子中のアミツノ、(の
37%に2.4−ビス(θノトギソポリエチレングリコ
ール)−6クロルーS−トリアノンが置換した修飾パフ
ペインを(1蚕た。
この修飾パパインは、水溶液中で未修飾パパインの72
%の酵素活性を保持していた。
%の酵素活性を保持していた。
実施例2(光学活性ペプチドのV造)
実施例1で得た修S酵素を用い、ll8mMのペンソイ
ル−し−アラニンメチルエステル(Bl−L−a la
−OMe)と5011NのD−トリプトファン メチル
エステル(D−Trp−OMe ) (第1図A)ま
たは、53mMノL−ノリ−トファン メチルエステル
(L−Trp−OMe)(第1図B)のベンゼン溶液の
各々100u Iを採り、これに20mMジオスレ・イ
]・−ルを含むn N パパインのベンゼン溶液(10
mg/ml ) 100ulを加えて、37℃で恒温振
とうし、反応させた。24時間後の反応溶液をlulと
り、生成物をイアトロスキャンで分析した。0−アミノ
酸エステルが、選択的にペプチドに挿入されていること
は、次の結果より明らかである。
ル−し−アラニンメチルエステル(Bl−L−a la
−OMe)と5011NのD−トリプトファン メチル
エステル(D−Trp−OMe ) (第1図A)ま
たは、53mMノL−ノリ−トファン メチルエステル
(L−Trp−OMe)(第1図B)のベンゼン溶液の
各々100u Iを採り、これに20mMジオスレ・イ
]・−ルを含むn N パパインのベンゼン溶液(10
mg/ml ) 100ulを加えて、37℃で恒温振
とうし、反応させた。24時間後の反応溶液をlulと
り、生成物をイアトロスキャンで分析した。0−アミノ
酸エステルが、選択的にペプチドに挿入されていること
は、次の結果より明らかである。
第1図(A、B)は、24時間後の反応溶液のイアトロ
スキャンのクロマトグラムを示す。縦軸は、カラン)G
、横軸は、保持時間(分)を示す、 JlG 13)1
M 6Mには5 グロロフォルム:メタメール−20
,1の混合溶媒を用いた。ピーク番弓の1から5は、3
.7/、1は、第一・ノ、(質(トベンンイルーし一ア
ラニン メチルエステル)、2は、ペプチド生成物(N
−ヘンンイルーし一アラニルー〇−)リブトフγン メ
チルエステル(第1図A)、または、N−ベンゾイル−
し−アラニル−L−トリプトファン メチルエステル(
第1図B)、3は、ペプチド第二生成物(トベンゾイル
ーし一7ラニルーL−)リプトフγニル〜L−)リブト
ファン メチルエステル)4は、第二基質(D−トリプ
トファン メチルエステル)(第1図A)または、L〜
トリプトファン メチルエステル(第1図B)、5は、
修飾酵素を示す。
スキャンのクロマトグラムを示す。縦軸は、カラン)G
、横軸は、保持時間(分)を示す、 JlG 13)1
M 6Mには5 グロロフォルム:メタメール−20
,1の混合溶媒を用いた。ピーク番弓の1から5は、3
.7/、1は、第一・ノ、(質(トベンンイルーし一ア
ラニン メチルエステル)、2は、ペプチド生成物(N
−ヘンンイルーし一アラニルー〇−)リブトフγン メ
チルエステル(第1図A)、または、N−ベンゾイル−
し−アラニル−L−トリプトファン メチルエステル(
第1図B)、3は、ペプチド第二生成物(トベンゾイル
ーし一7ラニルーL−)リプトフγニル〜L−)リブト
ファン メチルエステル)4は、第二基質(D−トリプ
トファン メチルエステル)(第1図A)または、L〜
トリプトファン メチルエステル(第1図B)、5は、
修飾酵素を示す。
クロマトグラムの面積より計算した、D一体ペプチドと
L一体ペプチドの生成比は、8:1である。
L一体ペプチドの生成比は、8:1である。
(D−Ala−OMe) (20mM)または、0−ア
ラニン メチルエステル(L−A Ia−OMe)
(20mM)を用イテ、ペプチド合成反応を行った。こ
の場合のD一体ジペプチドとし一体ジペプチドの生成比
は、7.8: lであった。
ラニン メチルエステル(L−A Ia−OMe)
(20mM)を用イテ、ペプチド合成反応を行った。こ
の場合のD一体ジペプチドとし一体ジペプチドの生成比
は、7.8: lであった。
実施例3(光学活性ペプチドの製造)
実施例2と同様の修飾酵素と第一基質を用い第二基質と
して、D−アラニン メチルエステル
して、D−アラニン メチルエステル
第1図(A、B)は、未発111の実施例2における反
応溶液のイアトロスキャンのクロマトグラムを示す。 第1図 以 上
応溶液のイアトロスキャンのクロマトグラムを示す。 第1図 以 上
Claims (1)
- (1)酵素として、修飾チオールプロテアーゼを用い、
第一基質として、一般式 X−(A_1)_n−OR_1・・・・・・・・・・・
・(1) で示されるN−末端をアシル基で保護したアミノ酸また
は、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、一般
式 H−(A_2)_n−OR_2・・・・・・・・・・・
・(2) (ただし、Xは、アシル型保護基、A_1、A_2は、
アミノ酸残基、R_1、R_2は、アルキル基を示す。 )で示されるD−アミノ酸エステルを用い、水と非混合
性の有機溶媒中で該(1)と(2)の化合物をカップリ
ング反応させ、D−体のアミノ酸を導入することを特徴
とする修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63217982A JP2764725B2 (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63217982A JP2764725B2 (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0265792A true JPH0265792A (ja) | 1990-03-06 |
JP2764725B2 JP2764725B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=16712770
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63217982A Expired - Fee Related JP2764725B2 (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2764725B2 (ja) |
-
1988
- 1988-08-31 JP JP63217982A patent/JP2764725B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Publication date |
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JP2764725B2 (ja) | 1998-06-11 |
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |