JPH0265792A - 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 - Google Patents

修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法

Info

Publication number
JPH0265792A
JPH0265792A JP63217982A JP21798288A JPH0265792A JP H0265792 A JPH0265792 A JP H0265792A JP 63217982 A JP63217982 A JP 63217982A JP 21798288 A JP21798288 A JP 21798288A JP H0265792 A JPH0265792 A JP H0265792A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
peptide
enzyme
substrate
ester
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP63217982A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2764725B2 (ja
Inventor
Hiroki Ki
季 浩喜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JNC Corp
Original Assignee
Chisso Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chisso Corp filed Critical Chisso Corp
Priority to JP63217982A priority Critical patent/JP2764725B2/ja
Publication of JPH0265792A publication Critical patent/JPH0265792A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2764725B2 publication Critical patent/JP2764725B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、修飾酵素を水と非混合性の有機溶媒中で用い
ることにより、D−アミノ酎残基を導入した光学活性な
ペプチドを得る製造υ、に関するものである。D−アミ
ノ酸を構成eZとするポリペプチドは、生体適合材木1
やドラングデリ/ヘリーシステムを構築するうえでff
i安であり、L−アミノ酸よりなるペプチドへのローア
ミノ酸残フ、(の・n久方法が、注目されている。
[従来の技術] ペプチドの合成法としては、大別して、化学合成法、酵
素法、発酵法がある。この内、化学合成法には、 N、
N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
用いる方法、活性エステル法,混合醜無水物法、NCA
法などがある.これらの方法の生化学合成法では、目的
物がラセミ化する可能性があり、光学活性体を得るため
には,その後光学分,1.IIの過程が、必要である・
他方、酵2も法では、加水分解の逆戻I心を利用し、概
ね−・段階の酵素反応によりペプチドが、つくられる、
−段階の反応が、関与するだけなので生tr力法の企画
、h¥ui、t?理が9容易であるなどの特徴がある。
しかし、酵素法では、基質特異性、1!lちアミン基、
保1;〜ノ、(に対する選択性があり、化学合成法はど
広範囲の利用可能性はない。
近年、遺伝T1′7の技術を用いて酵Jニの機能、安定
を置基質特異性の改善または改質、生産菌の改良が盛ん
に行われており、酵素を用いることによる各種ペプチド
の効率的な生産法が、確立されつつある。
方、木発舅者を含む発明者らによって、酵素を化学修飾
し、if!1.酵素を有機溶媒中で(動かせる方U、を
ペプチド合成に応用した発明が、出願されている。(特
WIII/183−119,277号)。
従来の1IS2素を用いるペプチド合成法は、天然酵素
の1χ体選択性、即ち、L一体のみを基質として認識し
、加水分解反応の逆反応であるペプチド合成反応を触媒
し、 L一体のアミノ酸残基しがペプチド鎖に導入出来
ない。
[発明が解決しようとする問題点1 本発明名は、I−記の酵素を用いたペプチド合成法の問
題点を解決し、L−アミノ酸よりなるペプチド鎖にD−
アミノ酸を効率良く導入する方法を検シ、1した。本発
明者らは、既に酵素の化学修飾により得られた酵素−合
成高分子複合体が、水に不溶の有機溶媒に可溶化し、該
有機溶媒中で効率良くペプチド合成を触媒することを見
いだしている。
この修飾酵素のペプチド合成に於ける基質特異性を検シ
・1する過程で適当なN−末端を保護したアミノ酸エス
テルを第一基質に選べば1反+5の過程で得られる修飾
酵素−)、(質複合体が、第二基質としてのD−アミノ
酸エステルと選択的に反応し、D−アミノ酸を導入した
ペプチドが生成することを見いだした。
以上の説明から明らかなように未発明の目的は、特定の
修飾酵素を用いてに述の第一基質と第二基質を反応させ
る新規な(D−アミノ酸を導入した)ペプチドの製造〃
、を提供することである。
1問題点全解決するだめの手段] 本発明は、下記(1)の構成を有する。
(1)酵素として、修飾チオールプロテアーゼを用い、
第一リ、(質として、一般式 %式%(1) で示されるN−末端をアシルノ1(で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、
一般式 %式%(2) (ただし、Xは、アシル型保護基、AI 、 A2は、
アミノ耐残JLi 、 R+ 、 R,lは、アルギル
基を示す、)で示されるD−アミノ酸エステルを用い水
と非混合性の有機溶媒中で該(1)と(2)の化合物を
カンプリング反応させ、D一体のアミノ酸を導入するこ
とを特徴とする修S酵素による光学活性ペプチドの製造
法。
本発明の構成と効果につき以下に1祥述する。
本発明において使用する酵素としては、プロテアーゼ特
にjよ、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン、
カルボキシペブチタ゛−ゼなどのセリンプロテアーゼ、
パパイン、プロメレイン、フィシンなどのチオールプロ
テアーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼである
修飾剤としては、ポリビニルアルコール。ポリエチレン
グリコール、ポリヒニルビロリドン、カルボギシメチル
セルロースなどの高分子を用いるが、特には、ポリエチ
レングリコールか、好ましい。
これらの酵素を修飾する方法としては、上記の合成高分
子の末端を2.4.8− トリクロル−5−)リアジン
やサクシニルイミFで活性化し、これに酵素のアミツノ
人を共有結合させる方法または1合成品分子とll52
素を非共有結合で結合させた複合体を形成させる方法な
どがある。
本発明で使用する第一基質としては、−・般式%式%(
1) で示されるN−末端全アシルJ、(で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルであり、第二基質と1、で
は、 競式 H−(A7)、−OR?   −・−・−・−・・−・
(2)で工、されるD−アミノ酸エステルである(ただ
し1−記(1) 、 (2)式において、A、 、 A
、は、アミ2ノ醇残ノ、(、R,、R・は、アルキル基
、 n、n’はl以にの整数、 Xはアシル1%Il保
護)、(を小す)。
このような各ノ1(質に係るアミノ酸またはペプチドの
1体例としては、限定されないが、後述の実施例に小さ
れるようなヘンソイル−L−アラニン1、−トリプトフ
ァン、Dlリプトファン、D−アラニン若しくはし一ア
ラニンを挙げることができる。
また、flR,又はOR2)、(を形成すべきアルコー
ルとしては、メチルアルコール、エチルアルコールなど
を挙げることができる。更に、Xとしてはヘンヘイル基
を挙げることができる。
また、水を非混合性の有機溶媒としては、極性)6(を
右しない不活性溶媒が望ましく1例えばベンゼン トル
エンのような芳香族炭化水素または、ヘキサノ、ヘプタ
ンのような脂肪族炭化水素を挙げることかできる。
rS1!Iliチオールプロテアーゼは、−上述の溶媒
の溶液として使用する。使用濃度は限定されないが0.
1〜100B /溶媒Il交好ましくは1〜50B/溶
媒m父である。
また、第−及び第二基質の力、ブリング反応は1両者の
有機溶媒溶液に上述の修飾チオールプロテアーゼの溶媒
溶液を混合し酵素の作用温度で、例えば12〜120時
間攪拌、振とう又は静置して反応させる9反応物は、常
法により、原料基質、酵素、目的物に分離する。カップ
リング反応に使用する修飾酵素の反応原木1(基質)に
対する使用比率は、限定されないが、各基質100+s
M 当り有機溶媒溶液として100u文(lomg/ 
m文)程度である。
[発明の効果1 本発明の効果を列挙すると以Fの通りである。
1、−段階の反応でL−アミノ酸よりなるペプチド鎖に
D−アミノ酸が挿入された一連のペプチドが得られる。
2、第二)、(質として、ラセミ体のアミ、′酸エステ
ルを用いても、D一体のアミノ酸エステルを選択的に(
ブチトに・4人できる。
3.11機溶媒中で反応溶液は、均一である。
また、部分は、飽和濃度しか存在しないので、第一部質
の加水分解がおこらず効−Vよくペプチド合成が何える
[実施例] 実施例1(修飾パパインの合成) パハイヤの果実乳液により得たパパイン50+I1gを
含ム0.28酢Mwt’ljH(pH4,5)  IO
+si ニO,1M木M化十トリウム水溶液を加えpH
を10に:A整し、2.4ビス(0−メトキシポリエチ
レングリコール)−6クロル〜S−トリアジン(ポリエ
チレングリコール部分の分Y−量が、5000のもの)
 0.9gを加え、28°Cで・時間反応させた。これ
を常法により精製し7ぐパイン分子中のアミツノ、(の
37%に2.4−ビス(θノトギソポリエチレングリコ
ール)−6クロルーS−トリアノンが置換した修飾パフ
ペインを(1蚕た。
この修飾パパインは、水溶液中で未修飾パパインの72
%の酵素活性を保持していた。
実施例2(光学活性ペプチドのV造) 実施例1で得た修S酵素を用い、ll8mMのペンソイ
ル−し−アラニンメチルエステル(Bl−L−a la
−OMe)と5011NのD−トリプトファン メチル
エステル(D−Trp−OMe )  (第1図A)ま
たは、53mMノL−ノリ−トファン メチルエステル
(L−Trp−OMe)(第1図B)のベンゼン溶液の
各々100u Iを採り、これに20mMジオスレ・イ
]・−ルを含むn N パパインのベンゼン溶液(10
mg/ml ) 100ulを加えて、37℃で恒温振
とうし、反応させた。24時間後の反応溶液をlulと
り、生成物をイアトロスキャンで分析した。0−アミノ
酸エステルが、選択的にペプチドに挿入されていること
は、次の結果より明らかである。
第1図(A、B)は、24時間後の反応溶液のイアトロ
スキャンのクロマトグラムを示す。縦軸は、カラン)G
、横軸は、保持時間(分)を示す、 JlG 13)1
 M 6Mには5 グロロフォルム:メタメール−20
,1の混合溶媒を用いた。ピーク番弓の1から5は、3
.7/、1は、第一・ノ、(質(トベンンイルーし一ア
ラニン メチルエステル)、2は、ペプチド生成物(N
−ヘンンイルーし一アラニルー〇−)リブトフγン メ
チルエステル(第1図A)、または、N−ベンゾイル−
し−アラニル−L−トリプトファン メチルエステル(
第1図B)、3は、ペプチド第二生成物(トベンゾイル
ーし一7ラニルーL−)リプトフγニル〜L−)リブト
ファン メチルエステル)4は、第二基質(D−トリプ
トファン メチルエステル)(第1図A)または、L〜
トリプトファン メチルエステル(第1図B)、5は、
修飾酵素を示す。
クロマトグラムの面積より計算した、D一体ペプチドと
L一体ペプチドの生成比は、8:1である。
(D−Ala−OMe) (20mM)または、0−ア
ラニン  メチルエステル(L−A Ia−OMe) 
(20mM)を用イテ、ペプチド合成反応を行った。こ
の場合のD一体ジペプチドとし一体ジペプチドの生成比
は、7.8: lであった。
実施例3(光学活性ペプチドの製造) 実施例2と同様の修飾酵素と第一基質を用い第二基質と
して、D−アラニン メチルエステル
【図面の簡単な説明】
第1図(A、B)は、未発111の実施例2における反
応溶液のイアトロスキャンのクロマトグラムを示す。 第1図 以  上

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)酵素として、修飾チオールプロテアーゼを用い、
    第一基質として、一般式 X−(A_1)_n−OR_1・・・・・・・・・・・
    ・(1) で示されるN−末端をアシル基で保護したアミノ酸また
    は、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、一般
    式 H−(A_2)_n−OR_2・・・・・・・・・・・
    ・(2) (ただし、Xは、アシル型保護基、A_1、A_2は、
    アミノ酸残基、R_1、R_2は、アルキル基を示す。 )で示されるD−アミノ酸エステルを用い、水と非混合
    性の有機溶媒中で該(1)と(2)の化合物をカップリ
    ング反応させ、D−体のアミノ酸を導入することを特徴
    とする修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法。
JP63217982A 1988-08-31 1988-08-31 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 Expired - Fee Related JP2764725B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63217982A JP2764725B2 (ja) 1988-08-31 1988-08-31 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63217982A JP2764725B2 (ja) 1988-08-31 1988-08-31 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0265792A true JPH0265792A (ja) 1990-03-06
JP2764725B2 JP2764725B2 (ja) 1998-06-11

Family

ID=16712770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63217982A Expired - Fee Related JP2764725B2 (ja) 1988-08-31 1988-08-31 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2764725B2 (ja)

Also Published As

Publication number Publication date
JP2764725B2 (ja) 1998-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4339534A (en) Process for enzymatic production of peptides
AU616054B2 (en) Urethane-protected amino acid-n-carboxyanhydrides
US4086136A (en) Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase
JP4312615B2 (ja) D−酵素組成物およびそれらの使用方法
US4645740A (en) Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins
US8883444B2 (en) Peptide synthesis using enzymatic activation and coupling
US5580751A (en) Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
So et al. Lipase-catalyzed synthesis of peptides containing D-amino acid
US8124372B2 (en) Selective enzymatic amidation of C-terminal esters or acids of peptides
US4579820A (en) Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins
JPH0265792A (ja) 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法
Stepanov Proteinases as catalysts in peptide synthesis
US8450084B2 (en) Chemo-enzymatic peptide synthesis via C-terminal ester interconversion
WO1989006656A1 (en) Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process
JP2525253B2 (ja) 単一の分子量を有するアミノ酸オリゴマ―の酵素的合成方法
CA1059938A (en) Process for producing a peptide
EP2167673B1 (en) Process for the conversion of c-terminal peptide esters or acids to amides employing subtilisin in the presence of ammonium salts
JPH05507403A (ja) ペプチドの製造方法
JPH04187095A (ja) 生理活性ジペプチドの製造法
JPH04299988A (ja) リジン−ε−ペプチドの製造方法
JPS637760B2 (ja)
JPH05184374A (ja) 非水系酵素反応法
JPH02234674A (ja) 化学修飾酵素ならびにペプチド合成方法
JPH02257890A (ja) ペプチドアミドの製造方法
JPS63254994A (ja) N置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees