JPH0265792A - 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、修飾酵素を水と非混合性の有機溶媒中で用い
ることにより、Ｄ−アミノ酎残基を導入した光学活性な
ペプチドを得る製造υ、に関するものである。Ｄ−アミ
ノ酸を構成ｅＺとするポリペプチドは、生体適合材木１
やドラングデリ／ヘリーシステムを構築するうえでｆｆ
ｉ安であり、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチドへのローア
ミノ酸残フ、（の・ｎ久方法が、注目されている。

［従来の技術］ ペプチドの合成法としては、大別して、化学合成法、酵
素法、発酵法がある。この内、化学合成法には、　Ｎ、
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
用いる方法、活性エステル法，混合醜無水物法、ＮＣＡ
法などがある．これらの方法の生化学合成法では、目的
物がラセミ化する可能性があり、光学活性体を得るため
には，その後光学分，１．ＩＩの過程が、必要である・
他方、酵２も法では、加水分解の逆戻Ｉ心を利用し、概
ね−・段階の酵素反応によりペプチドが、つくられる、
−段階の反応が、関与するだけなので生ｔｒ力法の企画
、ｈ￥ｕｉ、ｔ？理が９容易であるなどの特徴がある。

しかし、酵素法では、基質特異性、１！ｌちアミン基、
保１；〜ノ、（に対する選択性があり、化学合成法はど
広範囲の利用可能性はない。

近年、遺伝Ｔ１′７の技術を用いて酵Ｊニの機能、安定
を置基質特異性の改善または改質、生産菌の改良が盛ん
に行われており、酵素を用いることによる各種ペプチド
の効率的な生産法が、確立されつつある。

方、木発舅者を含む発明者らによって、酵素を化学修飾
し、ｉｆ！１．酵素を有機溶媒中で（動かせる方Ｕ、を
ペプチド合成に応用した発明が、出願されている。（特
ＷＩＩＩ／１８３−１１９，２７７号）。

従来の１ＩＳ２素を用いるペプチド合成法は、天然酵素
の１χ体選択性、即ち、Ｌ一体のみを基質として認識し
、加水分解反応の逆反応であるペプチド合成反応を触媒
し、　Ｌ一体のアミノ酸残基しがペプチド鎖に導入出来
ない。

［発明が解決しようとする問題点１ 本発明名は、Ｉ−記の酵素を用いたペプチド合成法の問
題点を解決し、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチド鎖にＤ−
アミノ酸を効率良く導入する方法を検シ、１した。本発
明者らは、既に酵素の化学修飾により得られた酵素−合
成高分子複合体が、水に不溶の有機溶媒に可溶化し、該
有機溶媒中で効率良くペプチド合成を触媒することを見
いだしている。

この修飾酵素のペプチド合成に於ける基質特異性を検シ
・１する過程で適当なＮ−末端を保護したアミノ酸エス
テルを第一基質に選べば１反＋５の過程で得られる修飾
酵素−）、（質複合体が、第二基質としてのＤ−アミノ
酸エステルと選択的に反応し、Ｄ−アミノ酸を導入した
ペプチドが生成することを見いだした。

以上の説明から明らかなように未発明の目的は、特定の
修飾酵素を用いてに述の第一基質と第二基質を反応させ
る新規な（Ｄ−アミノ酸を導入した）ペプチドの製造〃
、を提供することである。

１問題点全解決するだめの手段］ 本発明は、下記（１）の構成を有する。

（１）酵素として、修飾チオールプロテアーゼを用い、
第一リ、（質として、一般式 ％式％（１） で示されるＮ−末端をアシルノ１（で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、
一般式 ％式％（２） （ただし、Ｘは、アシル型保護基、ＡＩ　、　Ａ２は、
アミノ耐残ＪＬｉ　、　Ｒ＋　、　Ｒ，ｌは、アルギル
基を示す、）で示されるＤ−アミノ酸エステルを用い水
と非混合性の有機溶媒中で該（１）と（２）の化合物を
カンプリング反応させ、Ｄ一体のアミノ酸を導入するこ
とを特徴とする修Ｓ酵素による光学活性ペプチドの製造
法。

本発明の構成と効果につき以下に１祥述する。

本発明において使用する酵素としては、プロテアーゼ特
にｊよ、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン、
カルボキシペブチタ゛−ゼなどのセリンプロテアーゼ、
パパイン、プロメレイン、フィシンなどのチオールプロ
テアーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼである
。

修飾剤としては、ポリビニルアルコール。ポリエチレン
グリコール、ポリヒニルビロリドン、カルボギシメチル
セルロースなどの高分子を用いるが、特には、ポリエチ
レングリコールか、好ましい。

これらの酵素を修飾する方法としては、上記の合成高分
子の末端を２．４．８−　トリクロル−５−）リアジン
やサクシニルイミＦで活性化し、これに酵素のアミツノ
人を共有結合させる方法または１合成品分子とｌｌ５２
素を非共有結合で結合させた複合体を形成させる方法な
どがある。

本発明で使用する第一基質としては、−・般式％式％（
１） で示されるＮ−末端全アシルＪ、（で保護したアミノ酸
または、ペプチドのエステルであり、第二基質と１、で
は、　競式 Ｈ−（Ａ７）、−ＯＲ？　　　−・−・−・−・・−・
（２）で工、されるＤ−アミノ酸エステルである（ただ
し１−記（１）　、　（２）式において、Ａ、　、　Ａ
、は、アミ２ノ醇残ノ、（、Ｒ，、Ｒ・は、アルキル基
、　ｎ、ｎ’はｌ以にの整数、　Ｘはアシル１％Ｉｌ保
護）、（を小す）。

このような各ノ１（質に係るアミノ酸またはペプチドの
１体例としては、限定されないが、後述の実施例に小さ
れるようなヘンソイル−Ｌ−アラニン１、−トリプトフ
ァン、Ｄｌリプトファン、Ｄ−アラニン若しくはし一ア
ラニンを挙げることができる。

また、ｆｌＲ，又はＯＲ２）、（を形成すべきアルコー
ルとしては、メチルアルコール、エチルアルコールなど
を挙げることができる。更に、Ｘとしてはヘンヘイル基
を挙げることができる。

また、水を非混合性の有機溶媒としては、極性）６（を
右しない不活性溶媒が望ましく１例えばベンゼン　トル
エンのような芳香族炭化水素または、ヘキサノ、ヘプタ
ンのような脂肪族炭化水素を挙げることかできる。

ｒＳ１！Ｉｌｉチオールプロテアーゼは、−上述の溶媒
の溶液として使用する。使用濃度は限定されないが０．
１〜１００Ｂ　／溶媒Ｉｌ交好ましくは１〜５０Ｂ／溶
媒ｍ父である。

また、第−及び第二基質の力、ブリング反応は１両者の
有機溶媒溶液に上述の修飾チオールプロテアーゼの溶媒
溶液を混合し酵素の作用温度で、例えば１２〜１２０時
間攪拌、振とう又は静置して反応させる９反応物は、常
法により、原料基質、酵素、目的物に分離する。カップ
リング反応に使用する修飾酵素の反応原木１（基質）に
対する使用比率は、限定されないが、各基質１００＋ｓ
Ｍ　当り有機溶媒溶液として１００ｕ文（ｌｏｍｇ／　
ｍ文）程度である。

［発明の効果１ 本発明の効果を列挙すると以Ｆの通りである。

１、−段階の反応でＬ−アミノ酸よりなるペプチド鎖に
Ｄ−アミノ酸が挿入された一連のペプチドが得られる。

２、第二）、（質として、ラセミ体のアミ、′酸エステ
ルを用いても、Ｄ一体のアミノ酸エステルを選択的に（
ブチトに・４人できる。

３．１１機溶媒中で反応溶液は、均一である。

また、部分は、飽和濃度しか存在しないので、第一部質
の加水分解がおこらず効−Ｖよくペプチド合成が何える
。

［実施例］ 実施例１（修飾パパインの合成） パハイヤの果実乳液により得たパパイン５０＋Ｉ１ｇを
含ム０．２８酢Ｍｗｔ’ｌｊＨ（ｐＨ４，５）　　ＩＯ
＋ｓｉ　ニＯ，１Ｍ木Ｍ化十トリウム水溶液を加えｐＨ
を１０に：Ａ整し、２．４ビス（０−メトキシポリエチ
レングリコール）−６クロル〜Ｓ−トリアジン（ポリエ
チレングリコール部分の分Ｙ−量が、５０００のもの）
　０．９ｇを加え、２８°Ｃで・時間反応させた。これ
を常法により精製し７ぐパイン分子中のアミツノ、（の
３７％に２．４−ビス（θノトギソポリエチレングリコ
ール）−６クロルーＳ−トリアノンが置換した修飾パフ
ペインを（１蚕た。

この修飾パパインは、水溶液中で未修飾パパインの７２
％の酵素活性を保持していた。

実施例２（光学活性ペプチドのＶ造） 実施例１で得た修Ｓ酵素を用い、ｌｌ８ｍＭのペンソイ
ル−し−アラニンメチルエステル（Ｂｌ−Ｌ−ａ　ｌａ
−ＯＭｅ）と５０１１ＮのＤ−トリプトファン　メチル
エステル（Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ　）　　（第１図Ａ）ま
たは、５３ｍＭノＬ−ノリ−トファン　メチルエステル
（Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ）（第１図Ｂ）のベンゼン溶液の
各々１００ｕ　Ｉを採り、これに２０ｍＭジオスレ・イ
］・−ルを含むｎ　Ｎ　パパインのベンゼン溶液（１０
ｍｇ／ｍｌ　）　１００ｕｌを加えて、３７℃で恒温振
とうし、反応させた。２４時間後の反応溶液をｌｕｌと
り、生成物をイアトロスキャンで分析した。０−アミノ
酸エステルが、選択的にペプチドに挿入されていること
は、次の結果より明らかである。

第１図（Ａ、Ｂ）は、２４時間後の反応溶液のイアトロ
スキャンのクロマトグラムを示す。縦軸は、カラン）Ｇ
、横軸は、保持時間（分）を示す、　ＪｌＧ　１３）１
　Ｍ　６Ｍには５　グロロフォルム：メタメール−２０
，１の混合溶媒を用いた。ピーク番弓の１から５は、３
．７／、１は、第一・ノ、（質（トベンンイルーし一ア
ラニン　メチルエステル）、２は、ペプチド生成物（Ｎ
−ヘンンイルーし一アラニルー〇−）リブトフγン　メ
チルエステル（第１図Ａ）、または、Ｎ−ベンゾイル−
し−アラニル−Ｌ−トリプトファン　メチルエステル（
第１図Ｂ）、３は、ペプチド第二生成物（トベンゾイル
ーし一７ラニルーＬ−）リプトフγニル〜Ｌ−）リブト
ファン　メチルエステル）４は、第二基質（Ｄ−トリプ
トファン　メチルエステル）（第１図Ａ）または、Ｌ〜
トリプトファン　メチルエステル（第１図Ｂ）、５は、
修飾酵素を示す。

クロマトグラムの面積より計算した、Ｄ一体ペプチドと
Ｌ一体ペプチドの生成比は、８：１である。

（Ｄ−Ａｌａ−ＯＭｅ）　（２０ｍＭ）または、０−ア
ラニン　　メチルエステル（Ｌ−Ａ　Ｉａ−ＯＭｅ）　
（２０ｍＭ）を用イテ、ペプチド合成反応を行った。こ
の場合のＤ一体ジペプチドとし一体ジペプチドの生成比
は、７．８：　ｌであった。

実施例３（光学活性ペプチドの製造） 実施例２と同様の修飾酵素と第一基質を用い第二基質と
して、Ｄ−アラニン　メチルエステル

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ、Ｂ）は、未発１１１の実施例２における反
応溶液のイアトロスキャンのクロマトグラムを示す。 第１図 以　　上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素として、修飾チオールプロテアーゼを用い、
   第一基質として、一般式 Ｘ−（Ａ＿１）＿ｎ−ＯＲ＿１・・・・・・・・・・・
   ・（１） で示されるＮ−末端をアシル基で保護したアミノ酸また
   は、ペプチドのエステルを用い、第二基質として、一般
   式 Ｈ−（Ａ＿２）＿ｎ−ＯＲ＿２・・・・・・・・・・・
   ・（２） （ただし、Ｘは、アシル型保護基、Ａ＿１、Ａ＿２は、
   アミノ酸残基、Ｒ＿１、Ｒ＿２は、アルキル基を示す。 ）で示されるＤ−アミノ酸エステルを用い、水と非混合
   性の有機溶媒中で該（１）と（２）の化合物をカップリ
   ング反応させ、Ｄ−体のアミノ酸を導入することを特徴
   とする修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法。