JPH02234674A

JPH02234674A - 化学修飾酵素ならびにペプチド合成方法

Info

Publication number: JPH02234674A
Application number: JP1055053A
Authority: JP
Inventors: Norihiro Kawasaki; 功博川崎; Katsushige Takashita; 勝滋高下
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; Sanshin Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; Sanshin Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1989-03-09
Publication date: 1990-09-17
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: JP2657694B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ぐ産業上の利用分野２本発明は天然酵素の機能向上を目的とした化学ｆＰ飾酵
素、およびそれを用いるペプチドの製造方法に関する。

く１箕来技郷ｒ）酵素などのタンパク質中に存在する化学反応性官能塞の
１１℃飾はタンパク刊の生物活性と棺造との関連を化学
的に知る有力な手段である。最近ではこの化学修ｆ１ｉ
Ｄ法により本来のタンパク質を目的に応じてそ１の機能
を向上させ、より優れた医薬品あるいは、触媒としての
酵素を創る試みがある。

特に酵素を触媒とする有機化合物の合成においては、天
然物よりも耐存機溶削性、耐熱性に優れな１Ｌ，学修飾
酵素が望まれている。また特開昭６３８３６５号におい
て出願人は、ジメチルスルホニオフェノール類の物質特
許を開示し、また特開昭６２−２６３１３２号において
活性エステルを開示した。これらの出願明細書には、ア
ミノ酸のアジル１ヒについて記載があるものの酵素につ
いての実施例はない。かつまた、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドから誘導されたＮ−アジルオキシスクシンイミ
ドを酵素修飾に使用し、酵素にアシル基を導入する方法
については、特開昭６２−９６０８４号に開示されてい
る、しかしこの開示は、リボキシゲナーゼに関するもの
であり、エンドペプチダーゼに関する開示は見当たらな
い。

く発明が解決しようとする問題点〉上記の記載と重複するが、従来一般式に行なわれる化学
修飾法としては、１．Ｎ−ヒドロキジスクジンイミド活性エステルを用い
るタンパク質中のアミノ基をアシル化する方法。

２．グルタルアルデヒドを用いて分子内の２つのアミノ
基にクロスリンクを生成させる方法。

３、Ｎ−スクジニルイミジル−３−（２−ピリジルジヂ
オ）ブロピオネート類を用いて、タンパク質中のチオー
ル基をジスルフィド結合へ変換する方法。

ｌ１．塩化ジアヌルを介してポリエチレング刀コール類
を導入する方法。

などか知られている。しかしながらこれらはｆヒ学修飾
反応においては使用条件である水溶媒に対してｌＢｉ飾
試薬が不溶であり、反応系にジメチルポル仏アミド等の
水と相溶性のある有機溶剤を添加することになる。その
ために一部のタンパク質は変性、失活という問題が発生
する場合がある。

また、酵素を用いるペプチド合成に関して、ペプチド合
成反応は有機溶剤一水系での反応が好ましいが、この条
件下では天然酵素は有機溶剤によって大巾に失活し、目
的物が生成しないという問題点があった。

〈問題点を解決ずるなめの手段〉本発明者らは、このような従来の酵素の化学修飾法およ
び酵素法ペブチド合成の欠点を克服するために鋭意研究
を重ねた結果、一般式ｎで表わされるスルポニウム塩（式中Ｒはベンジルオキシ
、第三ブトキシ、９−フルオレニルメトキシ、ｐ−メト
キシベンジルオキシ、Ｃ１〜Ｃ１７のアルキル基を示す
）を用いた酵素の化学修飾法Ｏならびに上式で表わされる化合物のＲ−Ｃ一基を酵素へ
導入した、化学修飾酵素の発明に至った。

すなわち、上記一般式で表わされるスルホニウム塩は極
めて高い水溶性を有しており、適当な緩衝液中ｐＨ５．
０〜１１．０において酵素中のアミノ基へ容易にＲ．　
−　Ｃ　Ｏ一基（Ｒは上記）を導入することが可能であ
る。すなわち従来の酵素化学修飾法にみられるような、
ポリエチレングリコール基などの両親媒な高分子を導入
する方法に比べ、比較的低一分子で疎水性の高い基を導
入できる特長を有する。この場合、修飾率は酵素の総ア
ミノ基量に対してｌＯ〜６５％である。これより多すぎ
ると有機溶剤には溶解するものの酵素活性中心をＲ．　
−　Ｃ　０一基が阻害するため触媒能が失活する。

少なずぎれば耐有機溶剤性が劣るため好ましくない。修
飾反応は水のみの系で十分で、有機溶剤を必ずしも必要
としない。反応温度は室温以下の条件下で反応が進行す
る。ここで用いる酵素としては、キモトリブシン、トリ
プシン、サーモリシン、ペプジンなどのタンパク分解酵
素（プロテアーゼ）が好ましい。また本発明の修飾され
た酵素においては、導入基がペンジルオキシ、第三ブ１
・キシ、９−フルオレニルメトキシ、ｐ−メトキジベン
ジルオキシの場合には、温和な条件下で切断することが
可能てあり、容易にもとの天然酵素へ再生てきる特徴を
も有する。さらに、本発明の１ヒ学修飾酵素は酵素表面
の親水性基に、Ｒ−Ｃ　Ｏ一基を導入したことで酵素内
部の活性中心を有機溶剤から保護しているものと推定さ
れる。このなめ本発明に関する酵素は高い耐有機溶剤性
を示し、しかも従来の高分子の導入された化学修飾酵素
に比べ天然品の立木構造をほとんど変化さぜることのな
い１ヒ学修飾酵素である。その結果として、効率の良い
触媒として機能し、特にペプチド合成に用いることが出
来る。

（、作　川冫タンパク分解酵素、たとえばキモトリプシン、１・リプ
シン、ザーモリジン、ペプシン等を用いる酵素法ペプチ
ド合成においては、基質であるＮ端１呆譲アミノ酸の低
い水溶性のなめに水と相溶性の氾》る有機溶剤を添加す
ることで反応率を高めている。しかしながら、未修飾酵
素では耐有機溶剤性がないなめに、しばしば大幅な失活
が認められ、目的のペプチドが得られないことがある。

この点において、本発明の化学修飾酵素はジメチルホル
ムアミド等に対して高い耐有機溶剤性を示すことから、
高収率にてペプヂド結合を生成することが可能である。

く実方色１列〕》次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発
明は下記の実施例に限定されるものではない。

合成例１４−ペンジルオキジ力ルポ゛ニルオキシフェニルジメヂ
ルスルホニウノ＼　メチルサルフェート（Ｚ−ＤＳＩ”
）を用いるキモトリプジンの化学１１幕飾方法。

キモトリプジンＡ４　（ＢＭＹ）１４ｍｇをＮａｚＢ７
＋０７　８Ｃ　ＩＩ’７衝液（ｐＨ７．８＞５ｍｌに溶
解させ、４−ペンジルオキシ力ルポニルオキシフェニル
ジメチルスルポニウム　メチルザルフェートをキモ１・
リプシンに対して４２．５・〜３・１０当量加え１６時
間静置した。反応液を遠心分離（ＩＯＯＯＯＧ，　１０
分）し、上清を７２時間透析した。凍結乾燥後、白色粉
末を得な。

この化学修飾キモトリプシンＩｍｇを０．１ｍｌ１−リ
スＭ衝液に溶解さぜその内５μ１を高速液体クロマ１・
グラフイー（カラム：ＡＡｐａｃｋ，溶Ｍ液０．ＩＭク
エン酸緩衝液ｐＨ７．７，○ＰＡ検知システノ、，圧力
：　５０Ｋｇ／ｃｍ２，６０℃，流速０．６μし／ｍｉ
ｎ）にかけたところ未修飾キモ｝ヘリプシンは溶出時間
２分であったが、修飾物は３．４分に移動した。更にア
ミノ基の修飾率は、Ｉ〜リニトロベンゼンスルホン酸法
により測定した。遊離アミノ基量から算出した結果を表
１に示す。

（以下余白）合成例２４−（９−フルオレニルメ）・キシ力ルホ゛ニルオキシ
）フェニルジメチルスルホニウム　メチルサルフェート
（Ｆｍｏｃ−ＤＳＰ）を用いるトリプシンの化学修飾法
。

トリプシン（シグマ）１４ｍｇをＮ　ａ　２　Ｂ　４　
０　７一Ｈ　Ｃ　Ｉ　ｔ＆衝液（ｐＨ７．８）５ｍｌに
溶解させ、Ｆｍｏｃ−ＤＳＰをトリプシンに対して４２
．５〜３４０当量加え１６時間静置した。反応液を遠心
分１１Ｉ．（１００００Ｇ，　１　０分）し、上清を７
２時間透析したのち凍結乾燥をし、白色粉末を得た。

この化学１１！飾１〜リプシンの修飾率は、合成例１の
場合同様１へリニｌ・ロベンゼンスルホン酸法により測
定した。遊離アミノ基量から算出した結果を表２に示す
，．（以下余白）実施例１化学修飾された酵素のエステラーゼ活性試験合成例１に
より修飾されたキモトリプシン２ｍｇをトリス緩衝液（
ｐＨ８．０）ｌｍｌに溶解させその溶液に基質としては
、２，３−ジー０−（フエニルアラニル）一α−メヂル
ーＤ−グルコシド７０ｍｇを１・リスＭ．衝液１０ｍｌ
に溶解させ、さらにジメヂルホルムアミドを混合し４０
℃、３０分でインキユベートした。０．０１μｌを→ノ
ーンプリングし０．４９ｍｌの冷水を加え反応を止めそ
の内５μ１を高速液体クロマトグラフィ（条件は合成例
１に準ずる）により遊離するフエニルアラニンを測定し
な。エステル加水分解率の結果を表３に示す。

本発明の修飾キモ１へリプシンは、未修飾キモトリプシ
ンに比べ、３０％ジメチルホルムアミド中においても高
い活性を持続することが確認され、耐有機溶剤性に優れ
ることが判明した。

一な一ノグー実施例２３５％ペンジルオキジ力ルポ゛ニル化されたキモＩ−リ
プシン（Ｚ−３５キモトリプシン）を用いるペンジルオ
キシカノレポ゜ニルチロシルク刀シノレアミト（Ｚ−Ｔ
ｙ　＋．−　一Ｇ　］　ｙ−Ｎｆ｛２）の合成ペンジル
オキシ力ルポ゜ニルヂロシン１ｍＭ、グリシルアミド０
．１Ｍ、合成例１で調製した３５％ペンジルオキジ力ル
ホ゜ニル化されたキモトリプシン（Ｚ−３５キモトリプ
シン）２ｍｇを１・リスｖｊ．ｔｌ’ｒ液（ｐＨ６．７
）ｌｍｌに溶解し適量のジメヂポルムアミドを加え、２
０℃で４８時間静かに撹拌した。反応液をサンプリング
し、高速液１本夕ロマ１・グラフィー（Ｃ１８−ＯＤＳ
力ラム，２７８ｎｍ，溶離液：アセ１・ニトリル：水一
１：１）にかけ、Ｚ−Ｔｙｒ−Ｇ］　ｙ一ＮＨ２の生成
率を測定した。その結果を表４に示す。

（以下余白）実施例３化学修飾された酵素のエステラーゼ活性試験合成例２に
より修飾されたトリプシン２ｍｇをトリス緩衝液（ｐＨ
８．０＞ｌｍｌに溶解させその溶液に基質として、ペン
ゾイルアルギニンメチルエステル（Ｂｚ−Ａｒｇ−ＯＭ
ｅ）１００ｍｇを１・リス緩衝液１０ｍｌに溶解させ、
さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を混合し４０
℃、３０分でインキユベートした。この反応液を実施例
２の場合と同様、高速液体クロマトグラフィーによりＵ
Ｖ２８０ｎｍ検出システムを用い遊離するペンゾイルア
ルギニンを測定しな。

エステル加水分解率の結果を表５に示す。

本発明の修飾トリプシンは、未修飾トリプシンに比べ、
４０〜６０％ジメチルスルホキシド中においても高い活
性を持続することが確認され、耐有機溶剤性に優れるこ
とが判明しな。

実施例４３０％　９−フルオレニルメトキシ力ルボニル化された
トリプシン（Ｆｍｏｃ−３０トリプシン）を用いるペン
ジルオキシ力ルポニルアルギニルロイシンアミド（Ｚ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ２）の合成ペンジルオキシ力ルポ“ニルアルギニン５ｍＭ、ロイシ
ンアミド０．５Ｍを、合成例２で調製した３０％　９−
フルオレニルメトキシ力ルボニル化されたトリブシン（
Ｆｍｏｃ−３０｝リプシン）を２ｍｇをトリスｉｆＵ１
ｔ液（ｐＨ６．５）ｌｍｌに溶解し，適量のジメチスル
ホキシドを加え、２０℃で４８時間静かに撹拌した。Ｚ
−Ａｒｇ−ＬｅｕＮ　Ｈ　２の生成率は実施例２と同様
測定した。

その結果を表６に示す。

（以下余白）〈発明の効果〉本発明の修飾トリプシン、修飾キモトリプシンは、いず
れも未修飾１〜リプシン、キモトリプシンに比べ、耐有
機溶剤性に優れ、またプロテアーゼの逆反応を利用した
ペプチド合成反応においても高濃度の有機溶媒の添加に
より未修飾の酵素を利用した場合よりも高い収率を得る
ことができた。

よって、本発明の化学修飾酵素は高い耐有機性を有し、
有機溶剤中でのペプヂド合成に有用であ雪印乳業株式会
社三新１ヒ学工業株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）▲数式、化学式、表等があります▼基を酵素の総
アミノ基量に対して１０〜６５％導入してなる化学修飾
酵素。（ただしＲはベンジルオキシ基、第三ブトキシ基、９−
フルオレニルメトキシ基、ｐ−メトキシベンジルオキシ
基、Ｃ＿１〜Ｃ＿１＿７のアルキル基のいずれかを示す
）
（２）被修飾酵素が、エンドペプチダーゼである特許請
求範囲第１項記載の酵素。
（３）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるスルホニウム塩（式中はＲはベンジルオキ
シ基、第三ブトキシ基、９−フルオレニルメトキシ基、
ｐ−メトキシベンジルオキシ基、Ｃ＿１〜Ｃ＿１＿７の
アルキル基のいずれかを示す。）による酵素の化学修飾
方法。
（４）特許請求の範囲第３項記載の化学修飾をｐＨ４．
０〜１２．０の水溶液中で行うことを特徴とする酵素の
化学修飾方法。
（５）特許請求の範囲第１項または第２項記載の化学修
飾酵素を触媒として用いてなるペプチドの合成方法。
（６）ペプチド合成反応の溶媒が水と相溶性のある有機
溶剤と水との混合溶媒である特許請求の範囲第５項記載
の方法。
（７）ペプチド合成反応のｐＨが５．０〜１１．０であ
る特許請求の範囲第５項記載の方法。