JPS61112042A - 架橋試薬として適当な化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、新規化合物に関する。さらに具体的には、本
発明は、キャリアータンパク質とハプテン、ハプテンと
酵素、高分子抗原（キャリアーと結合しなくとも単独で
抗原性を有するタフバク質）と酵素、酵素と抗体などの
架橋反応に架橋試薬として使用することができる化合物
に関するものである。

先行技術 １９４５年、ランドスタイナー（Ｋ、　Ｌａｎｄｓｔｅ
ｉｎｅｒ）は、単独では免疫原（抗原）とならないジア
ゾベンゼン（ハプテン）にアルブミン等のタンツク質（
キャリアータン・セフ質）島をジアゾ基を介して結合さ
せることにより、上記ジアゾベンゼンに抗原性が賦与さ
れることを報告した〔成帯「ザ・スペシイフイシティ・
オグ・セロ口・クカル・リアクションズｊ　　（Ｔｈｅ
　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ
ａｌＲｅａｃｔｉｏｎｓ）　、第２版、バーバード大判
（１９４５）Ｌそれ以来、抗原に対する抗体の特異性を
上昇させる目的で、ハプテン側に適当なスペーサーを導
入し、これとキャリアータンパク質とを架橋させること
により抗原（免疫原）の合成が行われている。ここで、
ハシテンとは、分子量が約−万以下の低分子物質であっ
てそれ自体では抗原性をもたない化合物をいう。また、
ここでキャリアータンパク質とは、生体内または試験管
内でハプテ／と結合して免疫反応を起こさせるタンノξ
り質のことをいう。

このハプテンとキャリアーク／ノック質との架橋方法は
種々のものがあり、その一般的なものを示せば下記の通
りである。

（１）ハプテン中のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）トキ
ャリアータ／ノぞり質のアミノ基（−Ｎｕ２１との反応
を利用するもの ａ、酸無水物法： ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１０．１６１ｂ
、カルボジイミド法： ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド°エンドクリノ
ロジカル・メタボリズム（Ｊ、Ｃ１１ｎ。

ｇｎｄｅｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、４４．９１
　（１９７７）Ｃ０活性エステル法： バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｌｏｅｈｅｍ。

Ｊ、）、３２．１１１９　（１９３８）ｄ、アシルハラ
イド法： ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテ
イ（Ｊ、　Ａｒｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｅ、）、８６．
（２）ハシテン中のアミノ基（−ＮＨ２）とキャリアー
タンパク質のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはメル
カプト基（−８Ｈ）との反応を利用するもの ａ、　ジアゾ法 す、　　？リアジン法： フエブス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、１６．
Ｃ，ハロニトロベンゼン法 ｄ、ジインシアネート法： 米国特許第３　、６５４　、０９０号（１９７２）明細
書ｅ、イミドエステル法 ｆ、グルタルアルデヒド法： イムノケミストリ−（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ
）６．５３　（１９６９） ｇ、過ヨウ素酸酸化法： ジャーナル・オプ・ヒストケミストリー・アンド・サイ
トケミストリー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｃｈｅｍ。

Ｃｙｔ　ｏｃｈｅｍ、　）、２２．１０８４　（１９７
４）ｈ、カルボジイミド法 ｉ、マレイミ　ド法： ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、７８．２３５
（１９７５）、同旦、１４９３（ｔ９７８）、同匹、１
４１３ハシテンとキャリアータンパク質との架橋は、以
上のような方法により行われているがその他の物質量の
架橋、例えばノ・ブテンと酵素、高分子抗原と酵素、酵
素と抗体などの架橋についても同様な方法が用いられて
いる。

しかしながら、マレイミド法を除けば、いずれの架橋反
応も比較的過激な条件で行われるため、架橋すべき物質
として化学的に不安定な・・ブテンを用いた場合にはハ
プテン分子自体の分解が起こる恐れがあり、また酵素、
高分子抗原あるいは抗体を用いた場合では、同一分子同
志の結合（セルフカップリング）または分子間のランダ
ムカップリングにより活性の低下が引き起こされる可能
性があることや、抗原タン／Ｒりや抗体と他の物質との
架橋においては架橋部位の選択が禰しいなど、様々な問
題が残されている。

従って、上記諸問題を解決し、有用な夕／・ツク誘導体
を恒常的に提供するための架橋試薬の開発が望まれてい
た。

発明の概要 要旨 本発明は、上記問題点を解決することを目的とし、キャ
リアータンノぞり質とハプテン、ハプテンと酵素、高分
子抗原と酵素、酵素と抗体などの架橋を効率よく行う方
法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、これらの物質の
架橋反応を行う際に有用な化合物を合成し、この化合物
を架橋試薬として提供することにより上記目的を達成す
るものである。

従って、本発明の化合物は、下式（１）で示されるもの
である。

Ｒ１−Ｃｏ−Ｒ２（１） 〔たソし、Ｒ１およびＲ２は、下記の組合せのいずれか
である。

ＡＣＨ２（ＣＨ２）　ｒｎＣＯＯ（Ｙ）Ａ　ＣＨ２ＮＨ
（ＣＨ２）　ｍｏ　００　Ｙ（Ｙ）ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎ
Ｎ）（（ＣＨ２）、、ＣＯＯ（Ｙ）ここで、Ａは塩素、
臭素またはヨウ素であり、ｃｏｏｙは活性エステルを示
すものであり、ＣＯＯ（Ｙ）　はＣ０ＯＨまたはＣＯＯ
Ｙを示すものであ　　　　　　　１す、ｍは１〜６の整
数を、ｎは１〜４の整数を示す。複数個のＣＯＯ（Ｙ）
は同一でも異なってもよい。〕効果 本発明の化合物は、上記式（１）で示されるものであっ
て、前記諸問題を解決するとともに下記のような利点を
も有するものである。

（イ）　キャリアータンパク質とハプテン、ハプテンと
酵素、高分子抗原と酵素、酵素と抗体などの同種又は異
種の物質量の架橋を容易に行うことができる。

すなわち、本発明の化合物は、比較的温和な条件下（中
性付近のｐＨ領域）で縮合剤存在下（または非存在下）
で２段階の反応で物質量の架橋を行うことができるため
（詳細後記）、化学的に不安定な物質の架橋を行う場合
であっても、その物質の分解を引き起こす恐れが少な（
、また、活性を有する物質を架橋反応に供する場合は活
性の低下を引き起こす恐れが少ないうえ、短時間でしか
も高収率で目的とする複合体を合成することができる。

また、本発明の化合物は物質に官能基を有するスペーサ
ーを導入することができるので、抗原タン／Ｒり質や抗
体のよ５に架橋部位の選択が難しい物質であっても容易
に架橋を行うことができる。

（ロ）　架橋すべき物質のモル比や濃度、また縮合剤や
本発明の化合物の使用量を適宜調節することにより、架
橋数を調節することができる。そして、例えば本発明の
化合物をタン・セフ質へ導入したときの架橋数は、分子
内にアミノ酸ユニットを有しているもの（例えば、後記
式（２）〜（３）の化合物）については、アミノ酸分析
による構成アミノ酸の定量により、また分子内にア　・
ミノ酸ユニットを有してないもの（例えば後記式（１）
の化合物）についても、反応したタンツク質中のリジン
およびヒスチジン残基の減少数（リジンはカルボキシメ
チルリジンに、またヒスチジンはカルポキシメチルヒス
チジンニ、変換される）から、容易に架橋数を算出する
ことができる。従って、物質（例えば、ハシテン、キャ
リアータンパク質、酵素、高分子抗原、抗体等）間の架
橋に際し、反応条件の設定が非常に容易となることはい
うまでもない。

このように本発明の化合物は、架橋試薬として使用する
ことができ、さらに種々の物質に対する特異抗体の産生
を目的とした人工抗原の調製や、それに伴うイムノアッ
セイへの応用はもとより、アフイニテイクロマトグラフ
イーにおけるリガンドの固定用試薬、ミサイル療法にお
ける種々の薬物とホルモンあるいは抗体等との複合体の
合成、さらには他のタンパク質化学の分野においても広
範囲にわたり、その応用が期待されるところである。

本発明の化合物は、前記式（Ｉ）で示されるものであっ
て（その式の詳細な定義についても前記した通りである
）、同種または異種物質間の架橋を行う試薬（架橋試薬
）として有用な化合物である。

このような化合物のより具体的なものとしては、下式（
１）〜（３）で示されるものがある。

ＡＣＨＣｏ　（ＣＨ２）ｍＣＯＯ　（Ｙ）　　　　　　
（１）（Ｙ）ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ
ＣＯＯ（Ｙ）　　　（２）ＡＣＨＣＯＮ）Ｉ（ＣＨ２）
ｍＣＯＯＹ　　　　　　（３）式（１）〜（３）中の記
号は、具体的には下記の通りである。

Ａ：　塩素、臭素およびヨウ素のいずれかから選ばれた
ハロゲン原子である。

ＣＯＯＹ：　　活性エステルである。これは、一般にフ
ェニール系エステル（たとえば２，４．５−トドロキシ
ルアミン系のエステル（たとえばＮ−オキシ７タルイミ
ド、Ｎ−オキシコノ−り酸イミドのカルボン酸エステル
等）であって、通常Ｎ−オキシコハク酸イミドのカルボ
ン酸エステル、すなわちスクシンイミドオキシカルボニ
ル基が用いられる。

ｍ：　１から６のいずれかの整数である。

ｎ：　１から４のいずれかの整数である。

ＮＨ−（Ｃｆ（２−−Ｃｏ　：　　アミノ酸ユニットを
表わす。これは通常直鎖のω−アミノ酸であるが、炭化
水素分枝鎖であってもかまわない。従って、本発明のｍ
は炭素数を表わすものである。

化合物の合成 本発明の化合物は上記式（１）で示されるものであり、
さらに具体的には上記式（１）〜（３）で示されるもの
である。このような式（１）〜（３）で示される本発明
の化合物の合成方法を示せば下記の通りである。

（イ）　化合物（１）の合成 化合物（１）は、末端にカルボキシル基とハロメチルカ
ルボニル基とをそれぞれ有する化合物であり、合目的的
な任意の方法により合成される。

たとえば、ｍ＝２の場合は、レブリン酸をメタノール溶
液中ハロゲン単体でハロゲン化し、得られた５−ハロゲ
ンレブリン酸のメチルエステルを加水分解させることに
より得られる。

（ロ）　化合物（２）の合成 化合物（２）は、両末端にカルボキシル基を有すると共
にアミノ酸ユニットをも有する化合物であり、合目的的
な任意の方法により合成される。

好ましい合成法の一つとしては、二価の酸無水物とアミ
ノ酸とを脱水縮合により結合させることよりなる方法を
挙げることができろうなお、化合物（２）の両末端のカ
ルボキシル基は、いずれもほぼ同等にアミノ基と結合す
る力を有するものであステルに変換して用いることもで
きる（詳細後記）。

（ニ）　化合物（３）の合成 化合物（３）は、末端にハロメチルカルボニル基と活性
エステルとをそれぞれ有すると共にアミノ酸ユニットを
も有する化合物であり、合目的的任意の方法によって合
成することができる。

一つの好ましい合成法は、先ず、末端にカルボキシル基
とハロメチルカルボニル基とをそれぞれ有すると共にア
ミノ酸ユニットをも有する化合物〔式ＡＣＨ２ＣＯＮＨ
（ＣＨ２）　ｍ　ＣＯＯＨ（Ａ　−ｍの定義は前記と同
じ）〕をたとえばファーメントフォルシュング（Ｆｅｒ
ｍｅｎｔｆｏｒｓｃｈｕｎｇ）　１２．３１６（１９３
１）、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
。

ＢＩｏ＝ｈｑｍ、）　ＩＯ２，５１（１９８０）　　な
どに従って合成したのち、この化合物を縮合剤存在下に
て、活性エステル化させろことからなるものである。縮
合剤としては、カルボジイミド（たとえばＮ、Ｎ’−ジ
シクロへキブルカルボジイミド、等）を用いることがふ
つうである。

化合物（３）は、活性エステル部分でタン・にり質中の
アミノ基と容易に結合することができる。

化合物の利用 本発明の化合物は、前記したように架橋試薬として用い
ることができる。

すなわち、架橋反応に供される一方の物質と本発明の化
合物とを縮合剤存在下または非存在下で反応させてこの
物質に官能基（カルボキシル基、ハロアゼチル基など）
を有するスペーサーを導入し、ついでこの物質ともう一
方の物質とを縮合剤存在下または非存在下で反応させる
ことにより物質量の架橋を行うことができる。

具体的には、例えば、キャリアータンパク質とハプテン
との架橋を本発明化合物（１）を用いて行５場合は、以
下の通りである。

まず、キャリアータン・ぞり質と化合物（１）とを反応
させて（この場合、タンＡり質中の一級アミノ基または
ヒスチジン残基と化合物（１）中のハロアセチル基とが
反応する）キャリアータンパク質に官能基（化合物（１
）由来のカルボキシル基）を有するスペーサーを導入し
、次いでこの化合物と分子内に一級のアミノ基を有する
ハプテンとを縮合剤（例えば、水溶性カルボジイミド）
存在下で反応させることにより、キャリアータンパク質
とハプテンとの複合体を合成することができる。

また、化合物（２）を用いる場合は、まず縮合剤（例え
ば、水溶性カルボジイミド）存在下でキャリアータンパ
ク質と化合物（２）とを反応させて官能基（カルボキシ
ル基）を有するスペーサーを導入し、次いでこの化合物
と一級アミン基を有するハシテンとの反応を縮合剤（上
記）存在下で行うことＫより、上記台寺イ鴫複合体を合
成することができる。

さらに、二価性架橋試薬である化合物（３）を用いる場
合は、キャリアータンノぞり質と化合物（３）を混和す
るだけで、官能基（ハロアセチル基）を有するスペーサ
ーが導入されるので（なお、この反応では、キャリアー
タンＩＲり中の一級アミノ基と活性エステルとが反応す
るので縮合剤は不要である）、この化合物とアミン基ま
たはチオール基を有するハプテンとを混和することによ
り、上記複合体を合成することができる。なお、化合物
（３）はキャリアータンパク質と反応を行って官能基（
ハロアセチル基な有するスペーサー）を導入した後、こ
の官能基をアミノ基に変換しても使用することができ、
その場合は、縮合剤存在下でカルボキシル基を有するハ
プテンと反応させることにより上記のような腹合体を合
成することができる。

本発明の試薬は、上記反応方法に従えば、上記例に限定
されることなく、ハプテンと酵素、高分子抗原と酵素、
酵素と抗体など、同種または異種物質間の架橋反応にも
使用可能であることはいうまでもない。

実　　験　　例 合成例 本発明の化合物の合成を以下のようにして行った。

１、化合物（２）の合成 レブリン酸５８ｇ　（５０，７ｍ１）をメタ／−ル５０
０ｍ１に溶解して水浴で１５℃に保ち、臭素８０ｇ　（
２５，６４ｍ１）を１時間かけて滴下した。ついで、反
応液を３０℃で２．５時間放置し、臭素の色が消失して
淡黄色になったところで、さらに１時間還流を行った。

ついで、メタノールを留去し、残ｆｆ１Ｋ水１００ｍ１
およびエチルエーテル５００ｍ１を加え、炭酸水素す）
　ＩＪウムで中和したのち、有機層を５チ炭酸水素ナト
リウム水溶液２００ｍ１で２回洗浄し、溶媒を留去する
ことＫより、２−ブロモ、３−ブロモおよび５−ブロモ
レブリン酸メチルエステルの混合物を得た。

収量＝８７ｇ　収率：８３チ ついで、得られた混合物を０．２〜０　、２５ｍｍＨｇ
で減圧蒸留し、７３〜８６℃で流出してくる両分を集め
た（収量：　４７．６ｇ　　収率：　５４．７％）。

その全量を２１臭化水素酸４００ｇに溶解したのち、６
８時間加水分解を行い、水で抽出・留去後、ベンゼン−
ヘキサンより再結晶を行うことにより、目的物質を得た
。

収量：　１５．１ｇ　　収率：　３７．４５俤ＩＲスペ
クトル：　１７１０ｃｍ７１（Ｃ＝　Ｏ）マススペクト
ル：　Ｍ”＝　１９４、Ｍ”＋２　＝　１９６ＩＨＮＭ
Ｒ（ＣＤＣ１３）　：δ２　、８５　（４Ｈ，ｔｎｌ、
３．９３（２Ｈ，ｓ） ２、化合物口）の合成 無水コハク酸５　ｇ　（４４，９６ｍｍｏｌ）とグリシ
／３．７５ｇ　（４９，９６ｍｍｏｌ）を乳ばちで粉末
混合し、油浴中加熱（約１４０℃）して溶融させること
によって、クリーム色のアメ状物質を得た。これを水約
４０ｍ１に溶解し、水酸化カリウム５．６ｇ（０，１ｍ
ｏｌ）を加えて溶解後、水浴中ｌＯＯ℃で１時間加水分
解を行った。ついで、反応液を塩酸で中和し、減圧濃縮
したのち、少食の水忙溶解し、イオン交換樹脂（Ｄｏｗ
ｅｘ　５０ＷＸ２）を用いて塩およびグリシンを除き、
目的物を含むフラクションを得、ついでこのフラクショ
ンを減圧濃縮後、エタノール−クロロホルムで再結晶を
行うこと罠より、白色の結晶を得た。

収＠　：　１．４４ｇ　　収率：　１６．５％ＩＨ−Ｎ
ＭＲスヘクトル（Ｄ２ｏ）： δ３．７（２Ｈ，ｓ） ２．４（４塊３） ３、化合物（３）の合成 ブロモアセチル−β−アラニン４　ｇ　（１９，０５ｍ
ｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル３０ｍ１に溶解し、水冷
攪拌下Ｎ−ヒドロキシサクシ／イミｌ’２．１９ｇ（１
９，０５ｍｍｏｌｌおよびジシクロへキシルカルボジイ
ミド３．９３ｇ（１９，０５ｍｍｏｌ）を添加後、４℃
で一晩反応を行った。ついで、生成したジシクロへキシ
ルウレアを１過によって除いたアセトニトリル溶液を減
圧濃縮後、酢酸エチル−ヘキサンで再結晶を行って、白
色の針状晶を得た。

収量：　２．５７ｇ　　収率：４４チ ｍ、ｐ、：　１１２℃ ＩＨ−高化スベクトルｔｐＭｓｏ−ｄ６）：δ３．８５
（２也８） ３．３０（２氏ｔ） ２．８７（２Ｈ，ｔ） ２．８３（２に８） マススペクトル：Ｍ”＝３０６、Ｍ”＋２＝３０８３−
（イ）と同様にして目的物を得た。

３−０）と同様にして目的物を得た。

参考例 本発明の化合物を用いてキャリアータン、６り質に活性
基を導入し、さらにハプテンとの結合を行った。なお、
キャリアータンパク質としては牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を用いた。

１、ＢＳＡへの可溶化試薬の導入 ＢＳＡは、ハプテン分子と架橋を行った際にしばしば不
溶化を起こす恐れがあるので、まず、可溶化試薬（下記
）を用いて、ＢＢＡ中の遊離カルボキシル基の水酸基を
スルホ基に置換した。

ＢＢＡを可溶化するために上記可溶化試薬を合成した。

アミノメタンスルホン酸５　ｇ　（４４，９６ｍｍｏｌ
）を水５０ｍ１に溶解し、ｐＨ８，ＯＫ調整した。つい
で、この溶液に水冷攪拌下ブロモアセチルプロミド５．
８８ｍ１　（６７，４５ｍｍｏｌ）を滴下した。こＯＷ
、水酸化ナトリウム水溶液で反応液のｐＨを７〜９に保
ち％　　ＰＨが変化しな（なった時点で反応終了とした
。反応液は臭化水素酸でｐＨ４，０とし、減圧濃縮を行
った。残留物にアンモニア水２０ｒｎｌを加えて溶解し
、末端のブロモアセチル基をアミノアセチル基に変換さ
せたのち、再び減圧濃縮を行った。

ついで、得られた残留物を少量の水に溶解し、イオン交
換カラム（Ｄｏｗ＠ｘ　５ＱＷＸ２．３Ｘ４０ｃｍ。

移動相：水）にかけ、未反応原料、グリシ／およびアン
モ三アを除去した。目的物の含まれるフラクションをア
ミノ酸分析により確認したのち、減圧濃縮し、水−エタ
ノール溶液より再結晶して、白色の針状晶を得た。

収量：１．８３ｇ　　収率：　１６．３チｍ−ｐ−：　
２９０℃以上 ＩＲスペクトル：　　１２００ｃｍ　　、　１０４０ｃ
ｍ７”（−８ｏ３Ｈ）１７００ｃｍ−”　（−Ｃ＝Ｏ） ＩＨ−聴スベクトル（Ｄ２０）： δ３．７　　（２氏８） ４．２　　（２風１） （２）ＢＳＡへの可溶化試薬の導入 ＢＳＡ　Ｉｇ（１，５１５Ｘ１０−２ｍｍｏｌ）を水２
０ｍ１に溶解し、上記可溶化試薬７　、６４ｍｇを加え
、ｐＨを４．７に調整した。これに１−エチル−３−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（
以下ＥＤＣ−）ＩＣＩと記す）８．３５ｇを一度に加え
、塩酸でｐＨを４．７に保ちながら室温にてｐＨが変化
しなくなるまで反応を行った。ついで、反応液を水に対
し充分透析したのち、凍結乾燥を行うことにより、目的
物（ＢＳＡ−８ｏ３Ｈと略す）を得た。

なお、反応液の一部を取り、ゲル濾過 （５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５、ｌ　、５Ｘ　７０ｃｍ
）に付した後、アミノ酸分析でグリシンの増加数を求め
て、修飾数を５７個と決定した。

（ＢＳＡ−８ｏ３Ｈのメチルエステル化）前述のＢＳＡ
−８ｏ３ＨＩｇを１００　ｍｌのメタノールに溶解し、
濃塩酸８７６μｌを加え、時々攪拌しながら室温暗所で
３日間反応を行った。次いで、反応液を遠沈（３０００
ｒｐｍ、　１０分）することによりメタノールを除去し
、さらにメタノール１００ｍ１で２回、エチルエーテル
１００ｍ１で２回洗浄することにより、残るカルボキシ
ル基を保護した目的物（ＭｅＢＳＡＳＯ３Ｈと略す）を
得た。

２、　　ＭｅＢＳＡと本発明の化合物との反応（イ）化
合物（２）との反応 ＭｅＢＳＡ−８ｏ３Ｈ８５ｍｇ　（１，１３９Ｘ１０−
３ｍｍｏｌ）および化合物（２）Ｃｍ＝１、ｎ　＝　２
゜Ｎ−スクシニルグリシン）　６０．２　ｍｇ　（０，
３４４ｍｍｏｌ）を水３ｍ１Ｋ溶かし、ＥＤＣ−Ｉ（Ｃ
Ｉ　　２８６ｍｇを加え、ｐＨを４．７に保ちながら室
温で１時間反応を行った。反応液を１０％酢酸に対して
充分に透析したのち、凍結乾燥を行って、目的の化合物 ＣＰ　ｒ　ｏ　−ＮＨ＋ＣＯ（ＣＨ２）　２ＣＯＮＨＣ
Ｈ２ＣＯＯＨ（以下化合物（４）と記す）と ＣＰ　ｒ　Ｏ−ＮＨ−３ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯ（ＣＨ２１
２ＣＯＯＨ（以下化合物（５）と記す）との混合物を得
た。

反応液の一部を取り、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ［Ｆ
］Ｇ−２５，１、５Ｘ７０　ａｍ）　したのち、アミノ
酸分析でグリシンの増加数を求めて、修飾数を５個と決
定した。

（ロ）化合物（２）のＢＳＡ誘導体への導入Ｍｅ　ＢＳ
Ａ−８０３Ｈ１００ｍｇ　（１３、３Ｘ１０−’ｍｍｏ
ｌ）および化合物（１）１３．８ｇ＜０．０６７ｍｍｏ
ｌ）を水１５ｍ１に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８
，３に調整したのちＩ分間反応を行い、さらにＺ３’Ｃ
で一晩放置した。ついで反応液を１０％酢酸に対して充
分に透析後、凍結乾燥を行って、目的の化合物（Ｐ　ｒ
　Ｏ−ＮＨ＋ＣＭ　２　Ｃｏ　ＮＨ（ＣＨ２）　ｚ　Ｃ
ｏ　ＯＨ（以下化合物（６）と記す）を得た。

ＢＳＡ　５００ｍｇ（７，５７６Ｘ１０″″３ｍｍｏｌ
）を０．１Ｍ　＋７７酸−０，１Ｍ塩化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）１０ｍｇに溶解し、アセトニトリル１
ｍｌに溶かした化合物（３）４６．５２ｍｇ　（６，６
ｍｍｏＬ）を加え、激しく攪拌しながら室温で１時間反
応を行った。ついで、反応液を水に対して充分に透析す
ることにより、目的の化合物（Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｎ）））
Ｃｏ　（ＣＨ２）２ＮＨＣＱＣ）（２Ｂ　ｒ（以下化合
物（７）と記す）を得た。

反応液の一部を取り、ゲル濾過（５ｅｐｈａｄｅｘ（Ｂ
Ｇ−２５，１，５Ｘ７０ｃｍ）後、アミノ酸分析でβ−
アラニンの増加数を求めて、修飾数を【２個と決定した
。

（ニ）■〜■ ＢＳＡを０．ＩＭすｙｆｌｌ−０，１Ｍ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐ）Ｉ　７．５）　５００μｌに溶解し、これ
にエタノール１００μｍに溶解した化合物（３）を加え
、激しく攪拌しながら室温で１時間反応を行った。

修飾数の算出は、上記（イ）と同様に行い、その結果を
反応条件とともに下表ＩＫ示す。

（ホ）■〜■ ホースラディツシュ（西洋ワサビ）ノソーオキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）を０．１Ｍリン酸−０，１Ｍ塩化ナトリウ
ム緩衝液（ｐ）Ｉ７．５）１．５ｍｌに溶解し、アセト
ニトリル１００μｌに溶解した化合物（３）を加え、Ｚ
３℃で１時＋ｌａ反応を行った。修飾数の算出結果を反
応条件とともに下表１に示す。

３、　　ＢＳＡ中のアミ７基の保護（アミジン化）（ハ
）で得られた化合物（力を含む反応成約５ｍ１（タン・
ξり質的２５０ｍｇ　）を氷冷し、水酸化ナトリウム水
溶液でｐ）ｌを８．５に調整した。アセトイミノメチル
エステル塩酸塩１．９３ｇを氷冷した水４ｍｌに溶解し
、水酸化ナトリウム水溶液でｐ）１８．０として上記溶
液に加え、ｐＨを８．５に保ちながら水冷下１．５時間
反応を行った。反応液を水に対して充分透析することに
より、目的タン、ｅり質を得た。なお、反応液の一部を
取って、１３．２４および３６時間と加水分解し、アミ
ノ酸分析により得られたリジンの数を０時間に外挿する
ことにより、アミジン化数を（イ）個と決定した。

さらに、反応液の一部を取り、ゲル濾過（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ（９Ｇ−２５，１，５Ｘ７０ｃｍ）Ｌ、た後、アミ
ノ酸分析でβ−アラニンの数を求めることにより、アミ
ジン化反応中に起こる化合物（３）との反応数を２個と
決定した。

４、化合物（７）中の末端ブロモアセチル基のアミノア
セチル基への置換 上記３、で得られたタン・ぞり質溶液について、Ｑ、５
ＭＩＭ’ｌ’酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９，０に対しお
℃で４日間透析を行った。透析外液をＨ２Ｏに変え、さ
らに透析を行うことＫより、上記（ハ）の化合物のスペ
ーサー末端の臭素がアミノ基に置換された化合物（Ｐ　
ｒ　ｏ　−ＮＨ）Ｃｏ　（ＣＨ２）　２ＮＨＣＯＣＨ２
ＮＨ２（以下化合物（８）と記す）を得た。

なお、透析内液の一部を取り、加水分解後アミノ酸分析
でグリシンの増加数を求めることにより、臭素のアミノ
基への変換数を６個と決定した。

５、化合物（４）および（５）とハプテンとの架橋（イ
）で得られた修飾タン、ｅり質〔化合物（４）および（
５）の混合′吻３５ｍｇ（６，３１Ｘ１０−５ｍｍｏｌ
　）を０５Ｍグアニジン水溶液または■６Ｍ尿素水溶液
１ｍｔ　　にそれぞれ溶解し、ＥＤＣ−ＨＣｌ　　１０
０ｍｇを加えた後、ただちにエチルグリシン塩酸塩４．
４ｍｇ（３，１５刈０−２ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを４
．７に保ちながら室温にて加分間反応を行った。

反応液の一部を取り、ゲルー過（Ｓ＠ｐｈａｄｅｘＯＧ
−２５，１、５Ｘ７０ｃｍ）後、アミノ酸分析でグリシ
ンの増加数を求め【、架橋数を■の場合は４．９個、■
の場合は４．１個と決定した。

６、化合物（８）とハプテンとの架橋 ４、で得られた化合物（８）を０．１Ｍリン酸−０，１
Ｍ塩化ナトリウム緩衝液５ｍｌに溶解した。一方、七ン
ノサイドＡを同緩衝液５ｍｌに溶解し、ＥＤＣ・ＨＣＩ
　　４５７ｍｇ　を加え、ｐＨ５，０に調繁した。

これに上記溶液を加え、ｐ）Ｉを４．７に保ちながら、
室温で１時間反応を行った。

反応液の一部を取り、ゲル濾過（５ａｐｈａｄ＠ｘ＠Ｇ
−２５，１、５Ｘ７０ｃｍ）後、２７０ｎｍおよび３０
０ｎｍの吸光度より、架橋数を６．７個と決定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式（ I ）で示される化合物。 Ｒ＾１−ＣＯ−Ｒ＾２　（ I ） 〔たゞし、Ｒ＾１およびＲ＾２は、下記の組合せのいず
   れかである。 ￥Ｒ＾１￥　　　　　　　　　　￥Ｒ＾２￥ ＡＣＨ＿２　　　　　　　　　　（ＣＨ＿２）＿ｍＣＯ
   Ｏ（Ｙ） ＡＣＨ＿２　　　　　　　　　　ＮＨ（ＣＨ＿２）＿ｍ
   ＣＯＯＹ （Ｙ）ＯＣＯ（ＣＨ＿２）＿ｎ　ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯ
   Ｏ（Ｙ） こゝで、Ａは塩素、臭素またはヨウ素であり、ＣＯＯＹ
   は活性エステルを示すものであり、ＣＯＯ（Ｙ）はＣＯ
   ＯＨまたはＣＯＯＹを示すものであり、ｍは１〜６の整
   数を、ｎは１〜４の整数を示す。複数個のＣＯＯ（Ｙ）
   は同一でも異なつてもよい。〕 ２、下式（１）で示される、特許請求の範囲第１項の化
   合物。 ＡＣＨ＿２ＣＯ（ＣＨ＿２）＿ｍＣＯＯ（Ｙ）　（１） （ここで、Ａ、ｍおよびＣＯＯ（Ｙ）の定義は前記の通
   りである。） ３、下式（２）で示される、特許請求の範囲第１項の化
   合物。 （Ｙ）ＯＣＯ（ＣＨ＿２）＿ｎＣＯＮＨ（ＣＨ＿２）＿
   ｍＣＯＯ（Ｙ）　（２） （ここで、ＣＯＯ（Ｙ）、ｎおよびｍの定義は前記の通
   りである。） ４、下式（３）で示される、特許請求の範囲第１項の化
   合物。 ＡＣＨ＿２ＣＯＮＨ（ＣＨ＿２）＿ｍＣＯＯＹ　（３） （ここで、Ａ、ｍおよびＣＯＯＹの定義は前記の通りで
   ある。） ５、ＣＯＯＹがスクシンイミドオキシカルボニル基であ
   る、特許請求の範囲第２〜４項のいずれか１項の化合物
   。