JPS59164797A - タンパク誘導体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、スペーーリーーを介して活性基をもつタン・
ξり誘導体およびその製造法に関する。さらに具体的に
は、本発明は、タンノξりへのスペーサーを介した活性
基の導入を可能とするために二価性架橋試薬を用いる方
法およびそれによって得られるタン・ξり誘導体に関す
る。

最近、植物成分分析にイムノアッセイが応用され始め、
アルカロイドや配糖体への応用例はすでに報告されてい
る（　Ｚｅｎｋ＋　Ｍ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ　：Ｐｌａｎｔ
ａｍｅｄｉｃａ、　４１（１）　＋１　（１９８１）　
）　ｏ　”ゾテン性抗原に対するイムノアッセイを確立
する上で、ハプテン分子とキャリアープロティンとを架
橋させる方法は、重要な因子となる。

先行技術 従来、抗体の抗原に対する特異性を増加させるため、ハ
シテン側に適当なスペーサーを導入し、タンパクと架橋
させる方法が一般に用いられてきた。

ハシテン性抗原とタン・ξりとの架橋方法について一般
的なものを示すと次のとおりである。

（１）ハプテン中の−ＣＯＯＨとタンパクの−ＮＨ２と
の架橋法 ａ、酸無水物法： Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、ＭｅｔｈＯｄｓ＋１．０＋１６
１．（１９７６）ｂ、カルボジイミド法： Ｊ、Ｃｈｉ　ｎ　、Ｅｎｄｃｒ　ｔｎｏ　ｌ　、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　＋４４，９１（１９７７）Ｃ４活性エステル
法： Ｂｉｎｃｈｅｍ、Ｊ、　、３２．１１１９（１９３８）
ｄ、アシルハライド法： Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８６．１８３９（１９
６４）（２）ハプテン中の−ＮＴ−］２とタンノぐりの
−ＣＯＯＴ（または−８Ｈとの架堝法 ａ、ジアゾ法 す、　　）リアジン法：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　、１
６＋３９（１９７１）Ｃ，ハロニトロベンゼン法 ｄ、　　・ジイソシアネート法： Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　３．６５４，０９０（１９７２
）ｅ、イミドエステル法 ｆ５　　グルタルアルデヒド法： Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　６＋　５３　（１
９６９）ｇ、過ヨウ素酸酸化法： Ｊ、Ｈｉｓｔｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、２２
＋１０８４（１９７４）ｈ、カルボジイミド法 ｉ、　　マレイミド型：　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、７
８，２３５（１９７５）（３）酵素とタン・ξりとの架
橋方法についても以下にまとめて示す。

ａ、グルタルアルデヒド法（上記の（２）のｆ、と同じ
）ｂ、過ヨウ素酸酸化法（上記の（２）のｇ、と同じ）
Ｃ，マレイミド法（上記の（２）のｉと同じ）ｄ、イソ
シアネート法： Ｊ、Ｂｊｏ、Ｃｈｅｍ、　、　２３６．２４７７　（１
９６１）ｅ、ベンゾキノン法： Ａｎｎ　、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、　、　１２７ｃ　、
　１．９７（１９７６）また、柚々のマレイミド型の二
価性架橋試薬を用いた、タン、ｏり間の架橋反応につい
ての報告（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、８３．１４９３（１
９７８）およびＪ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９２．１４１３（１９８２））は
いくつか見つけられる。

ハシテンとキャリアープロティンとを架橋させる方法は
以上のようにさまざまであるが、エンザイムイムノアツ
セイの開発において、特定の酵素とハプテン分子、抗原
タン）ｅりあるいは抗体との架橋は、アッセイを確立す
る上で、非常に重要な問題である。

従来、はとんどの架橋反応が非常に過激な条件下で行な
われるため、化学的に不安定な化合物や極微量しか得ら
れない天然物等への応用に関しては、ハプテン分子の修
飾が難しい等、合成の面で多くの問題が残されている。

すなわち、ハプテンにおいては過激な条件のためハプテ
ン分子自体の分解や酵素活性の低下、一方抗原タンパク
および抗体においては架橋部位を選択することが難しい
点やタンノぞりのセルフまたはランダムカップリングの
ためのさまざまな問題等である。

また、キャリアープロティンに繁用される牛血清アルブ
ミン（以下ＢＳＡと略す）は、ノ・ブテン分子と架橋し
た際にしばしば不溶化して、免疫原として用いることが
できない場合が生じてくる。

この様な点から、ハシテン分子とキャリアープロティン
とをスペーサを介して架橋させる温和な合成技術の開発
（適当なスペーサーの開発も含む）、および架橋後も水
に対して可溶である等の諸条件を満たした合成技術の開
発、が窒まれている。

発明の概要 要旨 化学的に不安定な化合物や極微量しか得られない天然物
等のハプテン抗原について、タンＩｌｌりとの架橋前に
ハシテン分子内にスペーサーを導入することは有機合成
化学上非常に困難な問題である。同様にこれらのハプテ
ンとタンパクの架橋反応についても合成反応は非常圧限
られたものしか用いられない。

このような点から、本発明者らはカル昶キシル基、チオ
ール基またはアミノ基を有するすべてのハシテンとタン
ノぐりとの架橋に際し、スペーサーの導入を可能とする
二価性架橋試薬を開発した。

従って、本発明のタンパク誘導体は、タンノＲりの遊離
アミノ基または遊離チオール基の少なくとも１個に％カ
ルゼキシル基、ハロメチルカルＩニル基およびアミノ基
からなる群から選ばれる活性基を末端にもつ適当な長さ
の鎖状構造体（これは、タン／Ｒりと反応する基を持た
ないものとする）を含むこと、を特徴とするものである
。このタン・ぞり誘導体は、後記の化合物（７）から（
１１１で代表される。

また、本発明のタン・ぐり誘導体の製造法は、タンノＲ
りと反応する基を持たない適当な長さの鎖状構造体とそ
の一端に結合したカルボキシル基、）−ロメチルカルボ
ニル基およびアミノ基からなる群から選ばれる活性基と
上記鎖状構造体の他端に結合したカルボキシル基′、ノ
１０メチルカルボニル基および活性エステル基からなる
群から選ばれる基とからなる二価性架橋試薬をタンパク
のアミン基またはチオール基と結合させること、を特徴
とするものである。この二価性架橋試薬は、後記の化合
物（２）から（５）で代表される。

効果 本発明により、タンパク分子内にスペーサーを有してそ
れを介して特定の活性基含有する新しいタンパク誘導体
を得ることができた。目的とするハプテンが化学的に不
安定であったり、極微量しか得られない場合においても
、中性付近のｐＨ領域で組合剤存在下で非常に温和な１
ステツプの反応でハプテン−タン／１’り間の架橋を行
なうことができる。さらに架橋数の調節に関しては、タ
ンＡりへの活性基／スペーサの修飾数の制限やタン）Ｒ
りとハプテンとのモル比、濃度および活性化試薬（たと
えばカルボジイミド）の使用ｌ°の調節によりかなり広
範囲にコントロールできるものと考えられる。

本発明の好ましい実施態様において、タンパクの溶解性
を高めるべくスルホ基およびアミノ酸ユニットを含む可
溶化試薬を尋人した場合は、タンパクのスペーサー導入
後の水に対する溶解性が飛躍的に増大している。また、
本発明のさらに他の好ましい実施態様においては、タン
／Ｒり中の活性基を保護することにより、結合部位を確
実に特定することもできる。

架橋には上記の好ましい実施態様を採ることが望ましい
が、本発明中の二価性架橋試薬を用いるだけでも、充分
目的を達成することができる。

従って本発明は免疫測定法の領域においてハシテンやそ
の他の抗原、酵素への応用範囲を飛躍的に応けるもので
ある。さらに、最近注目を集めているアフイニテークロ
マトグラフイーでのりガンｒの固定用試薬としての本発
明中の二価性架橋試薬の応用についても同様に期待され
るものである。

本発明には各挿の化合物が関連をゼするが、その主要な
ものｉｔとめて示せばＦ記の亜りである。

前記のように、化合物（力〜（ＩＩ）が本発明タン・ぐ
り誘導体の代表的な具体例であり、化合物（２）〜（５
）はタンパクへスペーサーを介して特定の活性基を導入
するための二価性架橋試薬の代表的な具体例である。ま
た、化合’ＩｙＩ（１）はタンノξりの溶解性を胃める
ための可溶化試薬であり、これがタンノξり中に導入さ
れたものが化合物（６）である。

ＮＨ２（ＣＨ２）　ｍＣ０ＮＨ（ＣＨ２）　ｎ５ＯａＨ
（１）ＸＣＩ（２ＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ（２１ＨＯ
ＣＯ（ＣＨ２）　ｎＣ０Ｎ’Ｈ（ＣＨ２）　ｍＣ０ＯＨ
（３１ＸＣＨ２ＣＯＮＴ（（ＣＨ２）ｍＣ００Ｈ（４）
ＸＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ００Ｙ（５）（−Ｐｒ
ｏ−ＣＯ−）Ｎ）’Ｔ（ＣＴ（２）ｍＣＯＮＴ（（ＣＨ
２）ｎＳＯ３Ｈ（６）ＣＰ　ｒ　ｏ　Ｎ■Ｔ−）ＣＨ，
２ＣＯ（ＣＨ２瑞Ｃ０ＯＨ（７）［Ｐｒｏ−ＮＨ−）Ｃ
ｏ（Ｃｆ（２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨｆ８１
［Ｐｒｏ　ＮＨ−３−Ｃｏ（ＣＨ２）ｍＮＴ（Ｃｏ（Ｃ
Ｈ２）ｎＣＯＯＨ（８’）〔Ｐｒ　ｏ−ＮＨ−）ＣＨ２
ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ（９）［Ｐｒｏ　ＮＨ−
）Ｃｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＣＯＣＨ２Ｘ　　　　　００）
（Ｐ　ｒ　ｏ　−ＮＨ−）Ｃｏ　（ＣＨ２）　ｍＮＨＣ
ＯＣＩ（２ＮＨ２（Ｉ　］）式中の記号は、下記の通り
である。

Ｘ：塩素、臭素およびヨウ素から選ばれたハロゲン原子
である。

ｃｏｏｙ：活性エステルであり、一般にフェニール系エ
ステル（たとえば２，４．５−トリクロロフェニールエ
ステル、ｐ−ニトロフェニールエステル等）および０−
アシルヒドロキシルアミン系のエステル（たとえばＮ−
オキシフタルイミドのエステル、Ｎ−オキシコハク酸イ
ミドのエステル等）であって、通常Ｎ−オキシコハク酸
イミドのエステルが用いられる。

ｍ：任意の自然数であるが、好ましくは１から６のいず
れかの整数である。

ｎ：任意の自然数であるが、好捷しくは１から４のいず
れかの整数である。

ＮＨ−（ＣＨ２瑞−Ｃｏ　ニアミノ酸ユニットを表わす
。これは通常直鎖のω−アミノ酸であるが、分枝鎖であ
ってもかまわない。従って、ｍは炭素数を表わすものと
解すべきである。

（Ｐｒｏ−ＣＯ）　：遊離カルボキシル基で結付したタ
ンノξりの残基である。

［Ｐｒｏ−ＮＨ−）　：遊離アミノ基で結合したタンパ
クの残基である。

「タンパク」とは特定のものを意味するものではなく、
いかなるものでもよい。中でも牛血清アルブミン（以下
ＢＳＡと略す）またはホースラディツシュ（西洋ワサビ
）パーオキシダーゼ等カ一般的に用いられる。

また、本発明のタン・ぐり誘導体は化合物（η〜（１１
）と化合物（６）との両構造を同時に持つものであって
もよく、さらにはタンパク中のカルボキシル基を保護し
、余分のアミン基を保護しているものであってもよい。

この場合、カルボキシル基の保護はメチルエステル化、
アミン基の保護はアミジン化等が好ましく、また容易に
行なうこともできる。

タンパク誘導体の合成 上記のような化合物は、縮合その他の単位反応を適宜組
付せて使用することによって合成することができる。縮
合法に関しては、各棟の放置や総説たとえば「酵素免疫
測定法」（医学書院）（１９７８）、ファルマシアレビ
ュー、３．２７（１９８０）、等に参照することができ
る。

可溶化試薬の導入 タンＡり中の遊離カルボキシル基をあらかじめスルホ基
に変換させることにより、水に対する溶解性の向上が期
待される。また、可溶化試薬中にアミノ酸ユニットを含
有させれば、タン、０り内への導入数の算出が、加水分
解後にアミノ酸分析をすることにより容易に測定できる
ため非常に簡単で確実に行なえる。

タン、５り内にスルホ会台基を導入した例としてはＬｉ
ｎ　＆　Ｋｏｓｈｌａｎｄ、　Ｊｒ、がＮＨ２ＣＨ２Ｓ
Ｏ３Ｈによるリゾチウムの化学修触を行なっている（　
Ｊ、Ｂｉｏ。

Ｃｈｅｍ、ｖづ２４２．２４４７（１９６７）が、これ
は酵素機能研究を目的としたものでタンノックの可溶化
を目的とするものではなかった。

（イ）化合物（１）の合成 化合物（１）は、アミノ酸ユニットおよびスルホ岳か基
を有するタンノξりの可溶化試薬であって、本発明にお
いてタンノククの可溶化を行なうのに好ましいものの一
つである。タンＡｒりとの結合は、そのカルボキシルと
化合物（１）の末端アミン基との反応による。

化合物（１）は、合目的的な任意の方法によって合成す
ることができる。一つの好−ましい方法は、アミノアル
キルスルホン酸とハロアルキルハライドとを反応させ、
末端ハロゲンをアンモニア処理によりアミン基に置換さ
せることからなるものである。アンモニア処理は、アン
モニア水またはアンモニウム塩存在下にて容易に行なわ
れる。

（ロ）化合物（６）の合成 化合物（６）は、化合物（１）をタンＡりの遊離カルボ
キシル基と反応させてカルボキシル基をブロックさせた
可溶化タンノＲりである。

化合物（６）は、合目的的な任意の方法によって合成す
ることができるが、通常は化合物（１）とタンノぞりと
を結合させることにより得られる。化合物（１１の末端
のアミノ基とタンノｅりの遊離カルボキシルとの間の縮
合によるアミド結合形成からなるこの反応は、縮合剤の
作用下に行なうのがふつうである。通常は、水溶性カル
ボジイミドと呼ばれる一群の縮合剤（たとえば、Ｎ、Ｎ
’−ジシクロへキシルカルボジイミド、１−エチル−３
，３′−ジメチルカルボジイミド）を三級アミノ誘導体
として水溶性をもたせて用いることが多い。

一つの好筐しい方法は、酸性条件下で、両試薬を１−エ
チル−３’、３’−ジメチルカルボジイミドの三級アミ
ノ塩酸塩（以下ＥＤＣ−ＭＣＩと略す）を縮合剤として
用い反応させ、生成物を透析させることからなるもので
ある。

可溶化試薬（１）の結合数は、加水分解後にアミノ酸分
析により容易に算出することができる。

二価性架橋試薬 本発明でいう二価性架橋試薬は、一般に、カルボキシル
基、ハロメチルカルボニル基およびアミノ基からなる群
から選ばれる活性基、すなわちハプテンと結合するため
の基、とカルボキシル基、ハロメチルカルボニル基およ
び活性エステル基からなる群から選ばれる基、すなわち
タンパクの遊離アミノ基“または遊離チオール基と結合
するだめの基、とをそれぞれ両端に有する適当長さの鎖
状構造体（これは、タン、ｅりと反応する基を持たない
ものとする）、すなわちスペーサー、からなるものであ
る。

このような試薬の具体例は、化合物（２）〜（５）の化
合物である。すなわち、化合物（２）から（５）は、カ
ルボキシル基、チオール基またはアミノ基を有するすべ
てのハプテン−タンパク間またはタン／ｅり間等をつな
ぐことのできる二価性架橋試薬である。

これらの化合物（２）〜（５）の最も大きな特徴は、化
合物（２）を除きすべてが分子内にアミノ酸ユニットを
有し、アミノ酸分析により簡単に修飾数を決定できると
いうことにある。化合物（２）についてもリジンおよび
ヒスチジン（ともにアミン基を有する）の減少数から反
応数を決定できる。

（イ）化合物（２）の合成 化合物（２）は、末端にカルボキシル基とハロメチルカ
ルボニル基とをそれぞれ有する化合物であり、合目的的
な任意の方法により合成される。

たとえば、ｍ＝２の場合は、レズリン酸をメタノール溶
液中ハロゲン単体でハロゲン化し、得られた５−ハロゲ
ンレズリン酸のメチルエステルを加水分解させることに
より得られる。

（ロ）化合物（３）の合成 化合物（３）は、両末端にカルボキシル基を有すると共
にアミノ酸ユニットをも含有する化合物であり、合目的
的な任意の方法により合成される。

好ましい方法は、二価の酸無水物とアミノ酸とを脱水縮
合により結合させることよりなる。

両末端のカルボキシル基は、いずれも同等にアミン基と
結合する力を有する。

（ハ）化合物（４）の合成 化合物（４）は、末端にカルボオキシル基と・・ロメチ
ルカルポニル基とをそれぞれ有すると共にアミノ酸ユニ
ットをも有する化合物であり、合目的的な任意の方法に
より得られる。

Ｘ　＝　Ｂｒ、　ｍ　＝　１の化合物（４）はすでに合
成例（Ｆｅｒｍｅｎｔｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、　！２．３
１６　（１９３１）、Ａｎａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０４．５１　（１９８０）　）
があるが、これは二価性架橋試薬として使用されたもの
ではない。

一つの好捷しい方法は、弱アルカリ性情液中アミノ酸ヲ
ハロメチル力ルポニルノ・ライドと加水分解により直接
反応させることよりなる。

に）化合物（５）の合成 化合物（５）は、末端に・・ロメチル力ルボニル基と活
性エステルとをそれぞれ有すると共にアミノ酸ユニツ）
ｋも有する化合物であり、合目的的任意の方法によって
合成することができる。

一つの好ましい方法は、化合物（４）を縮合剤存在下に
て、活性エステル化させることからなる。縮合剤として
は、水溶性カルボジイミド（たとえばＮ、Ｎ’−ジシク
ロカルデジイミド、人−エチル−３，３′−ジメチルカ
ルボジイミＰ等）を用いることがふつうである。

化合物（５）は、エステル結合部分でタン／ｅり中のア
ミノ基と容易に結合することができる。

化合物（力から旧）は、カルボキシル基、ノ・ロメチル
カルボニル基およびアミノ基からなる群から選ばれる活
性基をある適度の長さのスペーサーを介して有していて
、その活性基の種類に応じてカルボキシル基、チオール
基またはアミン基を有するすべての化合１勿（／・ブテ
ンおよびタン／ｅりにとど壕らない）と結合することが
できるキャリアープロティンである。

この化合物の機１におよび利用方法ならびにタンパクの
時定には、ｌ：ｆＴＫｔ己のとおりである。

化付物（７）〜（１１）の一般的な製造方法は、前記の
二価性架橋試薬を縮合条件下（前記のとおり）であるい
は直接にタンノにりのアミノ基またはチオール基と結合
させることよりなり、いずれも極めて穏やかな反応条件
で達成できる。

タンノξりは、そのままの状態でもよいが、前記の可溶
化および活性基の保護を行なった方がより有用なタン・
ぐり誘導体として得られる。

寸だ、スペーサーにアミノ酸ユニットを含有していると
、タン・ξりへの修飾数を容易に知ることができるとい
う利点は前にも述べた通りである。

タン・ξりとして一般によく用いられるＢＳＡおよび・
ξ−オキシダーゼについて検討したが、いずれも良好な
結果が得られる。

（イ）化合物（力および（９）の合成 化合物（７）捷たは（９）は、化合物（２）寸たけ（４
）のノ・ロメチルカルボニル基をそれぞれタンパクのア
ミノ基と直接結合させることにより得られる。たとえば
、弱アルカリ性溶液中に両者を混イＥさせるだけの、穏
やかな単一ステップの反応で容易に得られる。

（ロ）化合物（８）および（８′）の合成化合物（８）
および（８′）は、化合物（３）をタン、ｅり中のアミ
ノ基と反応させることにより同時に得られる。化合物（
８）および（８′）の生成比は不明であるが、スペーサ
ーの末端にはカルボキシル基が反応可能な状態で在任す
ることは明白であり、またそれは確認されてもいる。

反応は縮合剤（前記のとおり）の存在下で行なわれ、好
ましい例として酸性条件下でＥＤＣ−ＨＣＩを用いる方
法があけらｎる。

（ハ）化合物（１０）の合成 化合物（１０）は、化合物（５）の活性エステル部位と
タン・ξりのアミノ基とを直接Ｍ＆させることにより得
ら扛る。反応は穏やかな条件下で行なわれ、生成物は透
析だけで光分梢製される。

り／ノククとして、ＢＳＡおよび西洋わさびの／に一オ
キシダーゼを用い、異なる混会モル比（化合物（５）／
タンパク）により検討を行なったところ、タンパクへの
修飾数はモル比を変えることにより自在にコントロール
できることがわかっている。

に）化付物（１１）の合成 化合＊（団は、合目的的任意の方法によって合成するこ
とができるが、化付物００）の末端ノ・ロゲンをアミノ
基に変換することで容易に得られる。

一つの好ましい方法は、化合物０１とアンモニウム塩（
たとえば酢酸アンモニウム）との混合液中で放置するこ
とからなる。

末端を変換させる前に、タンノぞり中の余分のアミノ基
を保護（たとえばアミジン化）すればさらに好ましい。

タンノＲり中の活性基の保護 ハプテンとの反応あるいは前記のスペーサーの導入反応
に際して不用な活性基は適当に保護すること（あるいは
保護しておくこと）が好ましい。

そのような活性基の保護は、合目的的な任意の方法で行
なうことができる。カルボキシル基についてはメチルエ
ステル化法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　１２　Ｂ、　９０３　（１９６８）　）、アミノ基
についてはアミジン化法（同１１．５９５（１９６７）
　　）カ好ましい。

スペーサーの末端にカルボキシル基をもつキャリアープ
ロティン（化合物（７）、１８）、（８’）および（９
））は、水溶性カルポジイミＦ％等の縮合剤を使用して
温和な条件でハプテン中のアミノ基と反応させることが
できる。また、スペーサーの末端にハロメチルカルボニ
ル基を有するキャリアープロティン（化合物００）は、
直接アミン基またはチオール基と反応できるばかりでな
く、末端基をアミノ基に変換する（化合物（１ｍ））だ
けで、ハプテン中のカルボキシル基と上記同様に縮合剤
を用いて反応可能となる。

スペーサー末端の反応性を検討するために化合物（８）
、（ｓ’）および（９）に対してグリシンエチルエステ
ルを、並びに化合物αＢに対して七ンノサイドＡを、そ
れぞれモデルハシテンとして反応させたところ、いずれ
も満足な結果が得られている。

実験例 実施例１．可溶化試薬（１）の合成（ｍ＝１、ｎ＝１の
とき）アミノメタンスルホン酸５　ｇ　（４４，９６ｍ
ｍｏｌ）を水５０ｍ１に溶かし、ｐＨ８，０に調整する
。これにプロモアセチルズロミド５−８８ｍ１　（６７
，４５ｍｍｏｌ）を水冷攪拌下滴下する。この際、水酸
化す）　ＩＪウム水溶液で反応液のｐ）ｆを７〜９に保
ち、ｐＨが変化しなくなったら反応終了とする。反応液
は臭化水素酸でｐＨ４，０とし、減圧濃縮する。残渣に
アンモニア水２０　ｍ　ｌを加えて溶解し、末端の−Ｂ
ｒ基を−ＮＨ２基に変換させた後、再び減圧濃縮する。

得られ、た残渣を少量の水に溶かし、イオン交換カラム
（Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ２．３Ｘ４０ｃｍ、移動相；水
）にかけ源料、グリシンおよびアンモニアを除く。目的
物の含まれる７ラクシヨンをアミノ酸分析により確認し
た後、減圧ｍ？Ｍし、水−エタノール溶液より再結晶す
ることにより、白色の針状晶が得られる。

収１ｊｔ：　１．８３ｇ　　収率：　１６．３チｍ、ｐ
−：　２９０℃以上 ＩＲスペクトル：　１２００ｃｍ　　、　１０４０ｃｍ
−１（−８Ｏ３Ｈ）１ １７００ｃｍ’　（−Ｃ＝Ｏ） ＩＨ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２０）： δ３．７　（２Ｈ，ａ） ４．２　（２Ｈ，ｓ） 実施例２．牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の可溶化（化合
物（６）の合成） ＢＳＡ　Ｉｇ　（１，５１５Ｘ１０−２ｍｍｏｌ）を水
２０　ｍ　ｌに溶かし、可溶化試薬（１）　（ｍ　＝　
１　）　７．６４ｍｇを加え、ｐＨを４．７に調整する
。これにＥＤＣ−ＨＣＩ　８．３５ｇを一度に加え、塩
酸でｐＨを４．７に保ちながら室温にてｐＨが変化しな
くなるまで反応を縦続させる。反応液を水に対し充分透
析させ、これを凍結乾燥させることにより、目的物（Ｂ
ＳＡ−８ｏ３Ｈと略す）が得られた。反応液の一部を取
り、ゲル濾過（５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５，１，５Ｘ
　７０ｃｍ）後アミノ酸分析でグリシンの増加数を求め
ることにより、修飾数を５７個と決矩した。

実施例３．　ＢＳＡ中のカルボニル基の保護（可溶化さ
せたＢＳＡのメチルエステル化）前述のＢＳＡ−８ｏ３
Ｉ（１ｇを１００ｍ１のメタノールに溶かし、濃塩酸８
７６＃ｆ　ｔ−加え、時々攪拌しながら室温暗所で３日
間反応させる。反応液を遠沈（３０００ｒｐｍ、　１０
分）することによりメタノールを除き、さらにメタノー
ル１００ｍ１で２回、エチルエーテル１００ｍ１で２回
洗浄することにより、残るカルボニル基を保−した目的
物（Ｍｅ　ＢＳＡ、−８Ｏ３Ｈと略す）が得られる。

また、可溶化のための極性基を置換させる以前のＢＳＡ
　自体につ、いても−゛上記同様にして目的物（ＭｅＢ
ＳＡと略す）を得る。

実施例４．化合物（２）の合成 （Ｘ＝Ｂｒ、　ｍ＝２゜５−ブロモレブリン酸）レブリ
ン酸５８ｇ　（５０，７ｍ１）をメタノール５００ｍ１
に溶解させて水浴で１５℃に保ち、臭素８０ｇ　（２５
，６４ｍ１）を１時間かけて滴下する。さらに、反応液
を３０’Ｃで２．５時間放置し、臭素の色が消失し淡黄
色になったら、１時間還流する。メタノールを留去し、
残漬に水１００ｍ１およびエチルエーテル５００ｍ１を
加え、過剰の炭酸水素ナトリウムで中和する。

有機層を５係炭酸水素す）　ＩＪウム水溶液２００ｍ１
で２回洗浄した後、溶媒を留去すると、２−ブロモ、３
−ブロモおよび５−ブロモレズリン酸メチルエステルの
混合物が得られる。

収量＝８７ｇ　　　収率：８３％ 得られた混合物を０．２〜０　、２５　ｍｍＨｇで減圧
蒸留し、７３〜８６℃で流出してくる両分を集める。

収量：　４７．６ｇ　　収率：　５４．７チ得られたメ
チルエステル４７．６ｇを２０チ臭化水素酸４００ｇに
溶解させ、６８時間加水分解を行ない、水で抽出・留去
後に、ベンゼン−ヘキサンより再結晶させる。

収量：　１５．１ｇ　　収率：　３７．４５チＩＲスペ
クトル：　　１７１０ｃｍ−１（Ｃ−０）マススペクト
ル：Ｍ＋＝１９４、Ｍ＋＋２＝１９６ＩＨＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ２）　：δ２　、８５　（４）１．　ｍ）、３．９
３（２Ｈ，ｓ）無水コハク酸５　ｇ　（４４，９６ｍｍ
ｏｌ）とグリシン３．７５ｇ　（４９，９６ｍｍｏｌ）
を乳ばちで粉末混合し、油浴中加熱して（約１４０℃）
溶融させると、クリーム色のアメ状物質が得られる。こ
れを水約４０ｍ１に洛かし、水酸化カリウム５．６ｇ（
０，１ｍｏｌ）を加えて溶解後、水浴中１００℃で１時
間加水分解を行なう。反応液を塩酸で中和し、減圧濃縮
した後、少量の水に溶かし、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅ
ｘ　５０ＷＸ２　）により塩およびグリシンを除く。目
的物を含むフラクションをｄ圧践縮後、エタノール−ク
ロロホルムから再結晶させることにより、白色の結晶が
得られる。

収量：１．４４ｇ　　　収率：　１６．５％１）Ｔ−Ｎ
ＭＲスペクトル（Ｄ２０）：δ３゜７　　（２Ｈ−、ｓ
　） ２．４　　（４Ｈ，ｓ） ６−１．、　（Ｘ＝Ｂｒ、　ｍ＝１゜ブロモアセチルグ
リシン）グリシン５ｇ　（０，３３ｍｏｌ）を１００ｍ
１の水に溶かし、水酸化ナトリウム水浴液でｐＨ８，０
に調整する。

この溶液を水冷下にて倣しく攪拌しながら、プロモアセ
チルズロミ）’　４３．５ｍｌ　（０，５ｍｏｌ　）を
滴下し、同時に反応液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ
８，０に保つ。ｐＨが変化しなくなるまで反応を続け、
終了後に臭化水素酸を反応液に加え、ｐＨを２．５に調
整する。塩が析出する捷で減圧濃縮し、濃縮液を酢酸エ
チル１００ｍ１で８回抽出する。有機層を濃縮すると黄
色のオイル状物質が残る。これを７０００で真空蒸留し
て臭化酢酸を除き、酢酸エチル−エチルエーテルより再
結晶させると、白色結晶が得られる。

収量：　２２．５ｇ　　　収率：　３４．５％ｍ、ｐ、
：　１１３１１５°Ｃ ＩＲスペクトル：　　３３００ｃｍ　’　（−ＮＨ）１
６５０．１７１０ｃｍ”””　（−Ｃ＝Ｏ）６−２．　
（Ｘ＝Ｂｒ、　ｍ＝２゜ブロモアセチル−β−アラニン
）β−アラニン２５ｇ　（０，２８ｍｏｌ）およびブロ
モアセチルプロミド３６．７ｇ（０，４２ｍｏｌ）を用
い、実施例６−１．と同様に反応させる。

収量：　８．８４ｇ　　　収率：１５チｍ、ｐ、：　８
０−８１°Ｃ ＩＲスペクトル：　　３３００ｃｍ”−’（−ＮＨ）１
６５０．１７１０ｃｍ”−’　（−Ｃ＝Ｏ）６−３．　
（Ｘ＝ＢｒＸｍ＝３゜グロモアセチルーγ−アミノ酪酸
）ｒ−アミノ酪酸５　ｇ　（０，０５ｍｏｌ）およびブ
ロモアセチルプロミド５　ｍｌ　（０，０５３ｍｏｌ）
を用い、実施例６−１．と同様に反応させる。反応終了
後、エチルエーテル５０ｍ１で３回洗浄し、さらに濃塩
酸でｐＨ２に調整し、エチルエーテルで５回抽出する。

有機層を無水硫酸す）　ＩＪウムで乾燥後濃縮し、メタ
ノールークロロホルムを溶離液とするシ１ツカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより分離後、エチルエーテルよ
り再結晶すると、白色結晶が得られた。

収量：　５５５ｍｇ　　　収率：５チ ｍ、ｐ、ニア５−７６．５℃ ＩＲスペクトル：　　１７１０．１６４０ｃｍ−’　（
−Ｃ＝Ｏ）ＩＨ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣ１３）：δ
１．９２　（２Ｈ，ｓ） ２．４５　（２Ｈ、ｑ） ３−４５　（２Ｈ、ｑ） ３゜９０（２ＨＸｓ） 実施例７．化合物（５）の合成 ７・−１，（Ｘ＝Ｂｒ、　ｍ＝２゜Ｎ−ブロモアセチル
スクシンイミジル−β−アラニン） ブロモアセチル−β−アラニン４　ｇ　（１９，０５ｍ
ｍｏｌ）を転線アセトニトリル３０　ｍ　ｌに溶かし、
水冷攪拌下Ｎ−ヒドロキシサクシンイミｔ’２．１９ｇ
（１９，０５ｍｍｏりおよびジンクロヘキシルカルポジ
イミ）’　３．９３ｇ　（１９，０５ｍｍｏｌ）を加え
て、４℃で一晩反応させる。生成したジシクロへキシル
ウレアを濾過で除き、アセトニ）　ＩＪルを減圧濃縮後
、酢酸エチル−ヘキサンより再結晶すると、白色の針状
晶が得られる。

収量：　２．５７ｇ　　　収率：４４チｍ、ｐ、：　１
１τＣ Ｌ　Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）　：δ３
．８５　（２Ｉ（、ｓ） ３．３０　（２Ｈ，ｔ） ２．８７　（２８Ｘｔ） ２．８３　（２ＨＸｓ） マススペクトル：　Ｍ＋＝３０６、Ｍ＋＋２＝３０８７
−２．　（Ｘ＝Ｉ３ｒ、　ｍ＝１゜Ｎ−プｏ　モア　−
１１！　チ／ｌ／　スクシンイミジルグリシン） 実施例７−１．と同様にして目的物を得る。

７−３．　（Ｘ＝ＢｒＸｍ＝３゜Ｎ−ブロモアセチルス
クシンイミジル−ｒ−アミノ酪酸） 実施例７＝１．と同様にして目的物を得る。

（化合・吻（３）のＢＳＡ誘導体への結合）シン）　６
０．２ｍｇ　（０，３４４ｍｍｏｌ）を水３’ｍｌに溶
かし、ＥＤＣ−ＨＣｌ　２８６ｍｇを加え、ｐＨ１４，
７に保ちながら室温で１時間反応させる。反応液を１０
％酢酸に対し充分に透析した後、凍結乾燥させると、目
的の化合物（８）および（８′）の混合物が得られる。

反応液の一部を取り、ゲル濾過（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５，１、５Ｘ　７０ｃｍ　）　シた後に、アミノ酸分
析でグリシンの増加数を求めることにより、修飾数を５
個と決定した。

実施例９．化合物（９）の合成 ９−１１化合物（４）のＢＳＡ誘導体への結合）ＭｅＢ
ＳＡ−８ｏ３Ｈ１００ｍｇ　（１３，３Ｘ１０−４ｍｍ
ｏｌ）および化合物（４）　（Ｘ＝Ｂｒ、ｍ　＝　２゜
ブロモアセチル−β−アラニン）　１４．０ｍｇ（０，
０６７ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに溶かし、水酸化ナトリウ
ムでｐＨ８，３に調慨し、加分反応させた後、乙℃で一
晩放置する。反応液を１０％酢酸に対し充分に透析後凍
結乾燥することにより、目的の化合物（９）が得られる
。

反応液の一部を取り、ゲル濾過（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５，１，５Ｘ７０ｃｍ）した後、アミノ酸分析でβ−
アラニンの増加数を求めることにより、修飾数を２３個
と決定した。

９−２．〜９−７゜ 反応試薬および条件を代えて、実施例９−１゜と同様の
操作によりそれぞれに対応する化合物（９）を得る。反
応条件および修飾数などは下表１に示す。

実施例１０．化合物（力の合成 （化合物（２）のＢＳＡ誘導体への結合）ＭｅＢＳＡ−
８ｏ３Ｈ１００ｍｇ　（１３，３Ｘ１０−４ｍｍｏｌ　
）および化合Ｒｆｆｉ（２）　（Ｘ　＝Ｂｒ、　ｍ＝２
．５−ブチルレズリン酸）１３．８ｇ（０、０６７ｍｍ
ｏ　Ｉ　）を用い、実施例９〜１゜と同様操作を行なう
ことにより、目的の化合物（力が得られる。

＋ｉ　−１，（化合物（５）のＢＳＡへの納付）ＢＳＡ
　５００ｒｎｇ　（７，５７６刈０−３ｍｍｏｌ）’ｆ
ｉｒ　０．ＩＭリンｓ−ｏ、１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，５）ｌｏｍｌに溶かし、アセトニトリル１ｍ
ｌに溶かした化合物（５）（Ｘ−Ｂｒ１ｍ−２ｏ　Ｎ−
ブロモアセチルスクシンイミジル−β−アラニン）　４
６．５２ｍｇ（６，６ｍｍｏｌ）を加え、激しく攪拌し
ながら室温で１時１１５反応させる。反応液を水に対し
充分に透析することにより、目的の化合物（１０）が得
られる。

反応液の一部を取り、ゲル１過（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５、］、　、５　Ｘ　７０ｃｍ）　ｌ、た後、アミノ
酸分析でβ−アラニンの増加数を求めることにより修飾
数を１２個と決定した。

＋１−　２．〜１１　−　６゜ ＢＳＡを０．１Ｍリン酸−〇、ＩＭ塩化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）　５００μｌに溶かし、エタノール１
００１１１に溶かした化合物（５）　（Ｘ＝Ｂｒ、　ｍ
　＝　２゜Ｎ−ブロモアセチルスクシンイミジル−β−
アラニン）を加え、激しく攪拌しながら室温で１時間反
応させる。

修飾数の算出は、実施例１１−１．、と同悼に行ない、
反応条件とともに結果ｄ二下表２に示す。

＋１−７．〜１１−９、 ホースラディツシュ（西洋ワサビ）・ξ−オキシダーゼ
（ＨＲＰＯ）を０．１Ｍリン酸−０，１Ｍ塩化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，５）１．５ｍｌに俗かし、アセトニ
トリル１００μｌに溶かした化合物（５）　（Ｘ＝Ｂｒ
、　ｍ　＝２゜Ｎ−ブロモアセチルスクシンイミジル−
β−アラニン）を加えて、２３℃で１時間反応させる。

修飾数の算出を何ない、反応条件とともに結果は下表２
に示す。

実施例１２．　ＢＳＡ中のアミノ基の保護（アミジン化
）実施例１１−１．で得られた化合物００）を含む反応
液約５ｍ１（タンノック約２５０ｍｇ）を氷冷し、水酸
化ナトリウム水溶液でｐＴ（を８．５にｍ％する。アセ
トイミノメチルエステル塩酸塩１．９３ｇを氷冷した水
４ｍｌに溶かし、水酸化す）　ＩＪウム水溶液でｐＨ８
，０とし、上記溶液に加え、ｐＨを８．５に保ちながら
水冷下１．５時間反応させる。反応液を水に対し充分透
析することにより、目的タンノξりが得られる。

反応液の一部’ｋｊ４Ｙって、１３．２４および３６時
間と加水分解し、リジンの数′ｆｆ：０時間に外挿する
ことによりアミジン化数を加個と決定した。

さらに、反応液の一部を取り、ゲルＩ１４過（８°ｐ門
４°゛０２５・１・５ｘ７０°”）した後・ぢ′酸分析
でβ−アラニンの数を求めることにより、アミジン化反
応中に起こる化合物（５）との反応数を２個と決定した
。

実施例１３．化合物（１１）の合成 （化合物（１０）中の末端−Ｂｒ基の−ＮＨ２置換）実
施例１２．で得られたタン、ｅり溶液を０．５Ｍ酢酸ア
ンモニウム緩衝液ｐ）Ｔ　９．０に対し２３℃で４日間
透析する。透析外液をＨ２Ｏに変え、さらに透析するこ
とにより、末端のＢｒがアミノ基に置換された目的の化
合物０１）が得られる。

透析内液の一部を取り、加水分解後アミノ酸分析でグリ
シンの増加数を求めることにより、ＢｒからＮＦ２への
変換数を６個と決定した。

実施例１４化合物（８）および（ｇ）のハプテンとの架
橋実施例８．で得られた修飾タンノξり（化合物（８）
および（８′）の混合物）　５　ｍｇ　（６，３１Ｘ　
１０−５ｍｍｏｌ、修飾数５個）を（０５Ｍグアニジン
水溶液または（２）６Ｍ尿素水溶液１ｍｌにそれぞれ浴
かし、ＥＤＣ−ＨＣｌｌｏｏｍｇを加えた後、ただちに
エチルグリシン塩酸塩４．４ｍｇ（３，１５Ｘ１０−２
ｍｍｏｌ　）を加え、ｐＨを４．７に保ちながら室温に
て加分間反応させる。

反応液の一部を取り、ゲルｆ過（３ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５，１，５Ｘ７０ｃｍ）　した後、アミノ酸分析−ｔ
ｌ’クリシンの増加数を求めることにより、架橋数を■
の場合は４．９個、■の場合は４．１個と決定した。

実施例１５．化合物（９）のハプテンとの架橋実施例９
−１．で得られた修飾タン、ｏり５ｍｇ（６，４１Ｘ１
０−５ｍｍｏｌ、修飾数ｎ個）水１ｍｌに溶かし、ＥＤ
Ｃ−ＨＣＩ　１５（１ｍｇを加えた後、ただちにエチル
グリシン塩酸塩４．４７ｍｇ　（３，２１Ｘ１０”’ｍ
ｍｏｌ）を加え、ｐＨを４．７に保ちながら室温で１時
間反応させる。

反応液の一部を取り、ゲルｆ過（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５，１，５Ｘ７０ｃｍ）した後、アミノ酸分析でグリ
シンの増加数を求めることにより、架橋数を１３個と決
定した。

実施例１６．化合物（１１）のノ・ブテンへの架橋実施
例１３．で得られた化合物旧）を０．１ＭＩＪン酸−０
、ＩＭｊａ化ナトリウム緩′１＠液（ｐＨ５，０）２ｍ
ｌ　Ｋ溶かす。一方、センノサイドＡを同緩両液５ｍｌ
に溶かし、ＥＤＣ−ＨＣｌ　４５７ｍｇを加え、ｐＨ５
，０に調整する。これに上記漬液を加え、ｐＨを４．７
に保ちながら、室温で１時間反応させる。

反応液の一部を取り、ゲルｒ過（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５，１，５Ｘ７０ｃｍ　）　した後、２７０ｎｍおよ
び３００ｎｍの吸光度より、架橋数をり、７個と決定し
た。

出願人代理人　　猪　　股　　　清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパクの遊離アミノ基または遊離チオール基の少
   なくとも１個に、カルボキシル基、ハロメチルカルボニ
   ル基およびアミン基からなる群から選ばれる活性基を末
   端にもつ適当な長さの鎖状構造体（これは、タン・ぐり
   と反応する基を持たないものとする）を含むことを特徴
   とする、タンパク誘導体。 ２、タンパクが牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはホー
   スラディツシュ（西洋ワサビ）パーオキシダーゼである
   、特許請求の範囲第１項記載のタンノξり誘導体。 ３、タンパク中の遊離カルボキシル基の水酸基が、アミ
   ン基と反応しない極性基とアミノ酸ユニットとを有する
   可溶化試薬のアミノ酸ユニットのアミノ基で置換されて
   いる、特許請求の範囲第１項および第２項いずれかに記
   載のタンノｅり誘導体。 ４、極性基がスルホ基である、特許請求の範囲第３項記
   載のタン・ξり誘導体。 ５、可溶化試薬が下式（１）で示される、特許請求の範
   囲第３項記載のタン・ぐり誘導体。 ＮＨ２（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ０３Ｈ（１
   ）（式中、ｍは１から６のいずれかの整数であり、ｎは
   １から４のいずれかの整数である。）６タンパク中の遊
   離カルボキシル基が保護されている、特許請求の範囲第
   １項から第５項いずれかに記載のタン、ｅり誘導体。 ７、カルボキシル基の保護がメチルエステル化によるも
   のである、特許請求の範囲第６項記載のタンパク誘導体
   。 ８、スペーサーと結合していないアミン基またはチオー
   ル基が保護されている、特許請求の範囲第１項から第７
   項いずれかに記載のタンパク誘導体。 ９．７ミノ基の保護がアジミン化によるものである、特
   許請求の範囲第８項記載のタンノＲり誘導体。 １０、下式（７）で示される、特許請求の範囲第１項か
   ら第９項いずれかに記載のタンパク誘導体。 ［：Ｐｒｏ−ＮＨ−）ＣＨ２Ｃｏ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ
   （７１（式中、ｍは１から６のいずれかの整数であり、
   （Ｐ　ｒ　ｏ　−ＮＨ−）は遊離アミノ基で結合したタ
   ン、６りの残基である。） １１、下式（８）または（８って示される。特許請求の
   範囲第１項から第９項いずれかに記載のタンＡり誘導体
   。 （Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｇｏ（ＣＨ２）。Ｃ０ＮＨ（ＣＨ２）
   、、Ｃ０ＯＨｆ８１［Ｐｒ０−　ＮＨ−）ｃｏ（ＣＨ２
   ）　ｍＮＨＣＯ（ＣＨ２）　ｎＣ０ＯＨ（８つ（式中、
   ｍおよび（Ｐｒｏ−ＮＨ−１−は前記と同じであり、ｎ
   は１から４のいずれかの整数である。）１２、下式（９
   ）で示さｈる、特許請求の範囲第１項から第９項いずね
   かに記載のタンノξり誘導体。 ［Ｐｒｏ−ＮＨ−）ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯ
   Ｈ（９１（式中、ｍおよび（Ｐｒｏ−ＮＨ＋は前記と同
   じである。） １３、下式（１０）で示される、特許請求の範囲第１項
   から＠９項いずれかに記載のタンパク誘導体。 （Ｐ　ｒ　ｏ−ＮＨ−）ｃｏ　（ＣＨ２）ｍＮＨｃＯｃ
   Ｈ２ＮＨ２（ＩＧ（式中、Ｘは塩素、臭素およびヨウ素
   から選ばれるハロゲン原子を表わし１ｍおよび［Ｐｒｏ
   −ＮＨ−）は前記と同じである。 １４、下式（１０で示される、特許請求の範囲第１項か
   ら第９項いずれかに記載のタンパク誘導体。 （Ｐｒｏ−ＮＨ−）ＣＯ（ＣＨ２）ｍＮＨＣＯＣＨ２Ｎ
   Ｈ２（１１）（式中、ｍおよび（：Ｐｒｏ−ＮＨ９−は
   前記と同じである。） １５、タンパクと反応する基を持たない適当な長さの鎖
   状構造体とその一端に結合したカルゼキシル基、へロメ
   チルカルゼニル基およびアミン基からなる群から選ばれ
   る活性基と上記鎖状構造体の他端に結合したカルゼキシ
   ル基、ノ・ロメチルカルゼニル基および活性エステル基
   からなる群から選ばれる基とからなる二価性架橋試薬を
   タンパク中のアミノ基またはチオール基と結合させるこ
   とを特徴とする、タンノぐりの遊離アミノ基または遊離
   チオール基の少なくとも１個に、カルボキシル基、ハロ
   メチルカルボニル基またはアミノ基を末端にもつ適当な
   長さのスペーサーを含むタン・ξり誘導体の製造法。 １６、二価性架橋試薬が、下式（２）で示される、特許
   請求の範囲第１５項記載のタンパク誘導体の製造法。 ＸＣＨ２ＣＯ（ＣＨＸＣＨ２Ｃ０（ＣＨ２）式中、Ｘは
   塩素、臭素およびヨウ素から選ばれるハロゲン原子を曵
   わし、ｍは１から６のいずれかの整数である。） １７、二価性架橋試薬が、下式（３）で示される、特許
   請求の範囲第１５項記載のタンパク誘導体の製造法。 ＨＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ００１１
   （３）（式中、ｍは前記と同じであり、ｎは１から４の
   いずれかの整数である。） １８、二価性架橋試薬が、下式（４）で示される、特許
   請求の範囲第１５項記載のタン、ｏり誘導体の製造法。 ＸＣＴ（２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）　ｍＣ０ＯＨ（４）（式
   中、Ｘおよびｍは前記と同じである。）１９、二価性架
   橋試薬が、下式（５）で示される、特許請求の範囲第１
   ５項記載のタンパク誘導体の製造法。 ＸＣ）１２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＹ　　　　　　
   　（５）（式中、Ｘおよびｍは前記と同じであり、Ｃ０
   ０Ｙは活性エステルである。） ２０、二価性架橋試薬を、下式（４）で示される化合物
   のカルボキシル基を活性エステルに変換させることによ
   り得る、特許請求の範囲第１９項記載のタンパク誘導体
   の製造法。 ＸＣＨ２Ｃ０ＮＨ（ＸＣＨ２Ｃ０ＮＨ（ＣＨ２）式中、
   Ｘおよびｍは前記と同じである。）２１、導入されたス
   ペーサーの末端の活性基を、さらに他の活性基に変換さ
   せる工程を含む、特許請求の範囲第１５項記載のタン・
   り誘導体の製造法。 ２２、変換が、／・ロゲンからアミノ基への置換である
   、特許請求の範囲第２１項記載のタン、ｅり誘導体の製
   造法。 ２３結合を、水溶性力ルポジイミＰ存在下で行なう、特
   許請求の範囲第１５項記載のタン・ξり誘導体の製造法
   。 ２４、活性エステルのＹがＮ−スクシンイミ、ジルであ
   る、特許請求の範囲第１９項および第２０項いずれかに
   記載のタンパク誘導体の製造法。 ２５、スペーサーと結合していないアミノ基またはチオ
   ール基ををらに保役する工程を含む、特許請求の範囲第
   １５項記載のタン・ξりあ導体の製造法。 ２６、保穫が、アミ７基のアミジン化である、特許請求
   の範囲第２５項記載のタンパク誘導体の製造法。