JPH06504776A - 免疫グロブリンと検出可能な標識との部位特異的結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンと検出可能な標識との部位特異的結合体発明の技術分野 この出願は、免疫グロブリンの相補性決定領域の変化を伴わない免疫グロブリン と検出可能な標識との部位特異的な結合体、およびそのような結合体の調製法に 関する。とりわけ、本発明は、免疫グロブリン上の特定部位での免疫グロブリン と検出可能な標識との結合であって、それと同時に免疫グロブリン上の分析対象 物結合部位の接近性を維持することに関する。

発明の背景 抗体−酵素結合体などの免疫グロブリンと検出可能な標識との結合体を調製する ために種々の方法が記載されてきているが、そのような方法は多くの部位でのラ ンダムな結合となっており、その結果、結合体における不均一性および再生産性 の欠如をきたしている。

酵素を用いた抗体のＦｃ領域の部位特異的な炭水化物標識もまた、オシャネッシ −（０’　５ｈａｎｎｅｓｓｙ）らの「ラベリング・オブ・ザ・オリゴサツカラ イド・マイエティーズ・オブ・イムノグロブリンズ（Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉら、そのような方法に従うて調製した結 合体は酵素と抗体（生来的に短い）との間に距離があり、その結果、歪んだコン ホメーション的に歪曲した抗体および／または酵素となる。

ヨーロッパ特許出願第３２．８６３号には、炭水化物残基またはカルボキシル基 を含有する化合物とチオール残基または電子欠乏残基を含有する化合物とを連結 するための結合法および結合剤が記載されている。とりわけ、Ｆｃ領域における 免疫グロブリンの標識（酵素など）へのカップリングが記載されている。しかし ながら、そのような方法およびそれに使用する連結試薬では、Ｆｃ領域上のジス ルフィドと免疫グロブリンの相補性決定領域との間で識別できないような反応条 件となる。この識別の欠如の結果、相補性決定領域内のジスルフィド結合の還元 による該領域の変化となり、そのために免疫グロブリン上の結合部位に影響を与 える。

従って、抗体の相補性決定領域中のジスルフィド結合の還元的開裂および該領域 の変性を回避できる部位特異的結合体を調製する方法に対する必要性が存在する 。

発明の要約 本発明に従えば、免疫グロブリンのＦｃ領域中に導入したスルフヒドリル基を酵 素にカップリングし、免疫グロブリンのＦａｂ部分は変化させずにおき、該Ｆｃ 領域と酵素標識との間には制御された距離が存在する。その結果、本発明に従っ て調製した結合体は、以前に記載された結合体に比べて一層大きな結合能および シグナル生成能を示す。それゆえ、短い、歪んだおよび／またはコンホメーショ ン的に歪曲された結合体による難点が回避され、それと同時に結合体の寿命、特 異性、感度、および他の性能因子が改良される。

とりわけ、ＮＨ−構造を含有する連結基により免疫グロブリンのＦｃグリコジル 化部分にスルフヒドリル基が導入され、その際、Ｆａｂ部分、または相補性決定 領域は変化しない。そのような置換または誘導体化した免疫グロブリンの現在の ところ好ましいクラスは、式： ％式％） （式中、ｍは１〜２０の整数： Ｙは免疫グロブリン分子（Ｆｃグリコジル化領域がリンカ−と反応する）；（Ｄ 　Ｘは−ＣＨ２ＮＨ＝または−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯ−。

Ｒ１は１〜２０の炭素原子を含有する連結基；ｎは１〜２０の整数；または （ｉ　ｉ）式（１）のＸ−Ｒ１−３Ｈは還元されたグルタチオンまたは還元され たヒドラジドリボアミドであってよい） 上記誘導体化免疫グロブリン分子は、その末端のスルフヒドリル基において種々 の検出可能な残基に容昌にカップリングすることができ、得られた結合体は種々 の診断的および治療的適用に有用である。

そのような誘導体化抗体（免疫グロブリン）分子にカップリングすることのでき る検出可能な残基は、該検出可能な残基上の立体的に損なわれない位置にて、ス ルフヒドリル反応性の官能基（末端基として位置するのが好ましい）を含有する ことができるように、それ自体まず誘導体化する。そのような反応性官能基の例 としては、ハロアセテートおよび好ましくはマレイミドが挙げられる。そのよう な誘導体化残基を調製するため、およびそのような結合体を調製するために当該 技術分野で知られた方法を用いることができる。好ましくは、本発明による結合 体は、上記誘導体化残基を酵素に結合させたものからなる。酵素は、長い連結基 の末端にマレイミド、ハロアセチル（たとえば、ヨードアセチル、ブロモアセチ ルおよびクロロアセチル）などのカップリング基を含有する。これら結合体は、 酵素イムノアッセイにおいて特に有用である。

好ましい結合体には、構造； （式中、ＸおよびＲ１は式（１）の定義と同じ：Ｌは１〜４０の炭素原子を含有 する連結基（ＬはＲ７と同じであっても異なってもよい））で示される２官能性 カツプリング基を含有する。

式（２）において、Ｘは式（１）で定義する残基（Ｙ）に結合し、Ｌは検出可能 な残基（Ｅ）に結合する。

一層好ましくは、そのような結合体は、式：（式中、Ｘは−ＣＨ，ＮＨ−１−Ｃ Ｈ冨ＮＮＨＣ−１還元されたグルタチオンの断片、および還元されたヒドラジド リポアミドの断片よりなる群から選ばれた基；Ｒ，は１〜２０め炭素原子を含有 する基；Ｒ１はシクロヘキシルメチル； Ｒｓは１〜１０の炭素原子を含有するアルキレン基；およびｋは１〜１０の整数 である）で示される。

結合体の現在のところ好ましいクラスは、式：％式％（） （式中、Ｑは式（３）によって示されるヘテロ２官能性カップリング基：Ｙは式 （１）と同じ； Ｅは検出可能な残基； ｎは式（１）と同じ；および ０およびｐはそれぞれ１〜１０の整数から選ばれる）によって特徴付けられる。

好ましくは、式（４）において、ｐに対する０の比は約１：１〜約１＝１０の範 囲であり、ｎは約１〜約１０の範囲にある。式（４）の結合体は、向上した均一 性および低い多分散性を示し、当該技術分野で知られた方法に従って調製した結 合体に比べて感度が驚（はど向上している。

本発明の誘導体化免疫グロブリンは、免疫グロブリンの部位特異的過ヨウ素酸酸 化、ついで適当なポリアミノジスルフィド試薬を用いた還元的アミノ化、ついで ジスルフィド還元からなる一連の工程により調製する。

図１は、本発明に従って調製した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）／アルカリホスファタ ーゼ結合体と、当該技術分野で知られた結合体法に従って調製した抗ＣＥＡ／ア ルカリホスファターゼ結合体との活性の比較を示す。

図２は、本発明に従って調製した抗癌抗原（ＣＡ）１９−９／アル力リホスフア ターゼ結合体と、当該技術分野で知られた結合体法に従ってｍ製した抗ＣＡ１９ −９７アルカリホスフアターゼ結合体との活性の比較を示す。

図３は、本発明に従って調製した抗ビオチン／アルカリホスファターゼ結合体と 、当該技術分野で知られた結合体法に従ワて＊ｌｉｌ’ｌ、た抗ビオチン／アル カリホスファターゼ結合体との活性の比較を示す。

図４は、本発明に従って調製したヤギ抗ヒトＩｇＥ／アルカリホスファターゼ結 合体と、当該技術分野で知られた方法に従って調製したヤギ抗ヒトＩｇＥ／アル カリホスファターゼ結合体との活性の比較を示す。

図５は、本発明に従って調製した抗下垂体系タンパク質（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　 ｔｈｒｅａｄｐｒｏｔｅｉｎ）　（Ｆ　Ｔ　Ｐ　）　／アルカリホスファターゼ 結合体と、当該技術分野で知られた結合体法に従って調製した抗ＰＴＰ／アルカ リホスファターゼ結合体との活性の比較を示す（括弧内の値は酵素／抗体比を示 す）。

本明細書において使用する「免疫グロブリン」なる語は、たとえば血漿、初乳、 涙、および他の体液中に存在するタンパク質分子のクラスの成員を意味する。免 疫グロブリン、または抗体は、抗原と特異的に、非共有結合により、および可逆 的に結合する。

本明細書において使用する「抗体」なる語は、免疫グロブリンの均一なまたは不 均一な集団を意味する（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清など） 。

抗体−抗原複合体形成は、免疫グロブリンの特異的結合部位（相補性決定領域と して知られる）と抗原決定基との間の接触によって起こる。

５つの免疫グロブリンクラスが識別され、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、、ＩｇＧお よびＩｇＭとして同定される。ＩｇＧは血漿中の主要な免疫グロブリンであり、 全血漿免疫グロブリンの約７５％を占め、微生物およびその毒素と闘うための、 内部体液、とりわけ血管外物質に最も豊富に存在する免疫グロブリンである。Ｉ ｇＧには４つのサブクラスがあり、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３および ＩｇＧ−４と同定され、これらはアミノ酸配列の違いにより識別される。ヒト血 清においては、ＩｇＧ−１が血漿免疫グロブリンの約６５％を占める。

本明細書において使用するｒＦｃ領域」なる語は、Ｙ字状の免疫グロブリン分子 の幹または足に対応し、２本のＨ鎖のＣ末端切片が１または２以上のジスルフィ ド結合で連結された免疫グロブリンの領域を意味する。

本明細書において使用するｒＦａｂ領域」なる語は、Ｆｃ領域以外の免疫グロブ リンの領域を意味する。各Ｆａｂ領域は、Ｌ鎖がＨ鎖のＮ末端部分にジスルフィ ド結合によって連結されており、そのような各Ｆａｂ領域はＹ字状の免疫グロブ リン分子の２つの腕の一方である。各Ｆａｂ領域は、その超可変領域内に単一の 結合部位を含み、非沈降性の１価抗体として振る舞う。

本明細書において使用する「標識」または「検出可能な標識」なる語は、通常は 結合体におけるように免疫グロブリンにカップリングすることにより、免疫グロ ブリンを標識するのに用いることのできる化合物を意味する。標識は構造および 機能を広範囲にわたって変化させることができ、酵素、放射性標識、蛍光源（ｆ ｌｕｏｒｏｇｅｎ）　、ビオチン、毒素、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多 糖類、ポリペプチド、リポソーム、発色団、化学ルミネッセンス、発色粒子およ び発色微細粒子などが挙げられるが、これらに限られるものではない。

上記で定義したＲ３およびＲ２基において、たとえば式（１）、（２）および（ ３）において、アルキル基が好ましく、シクロヘキシルメチルが特に好ましいＲ １基である。「アルキル」なる語は、３またはそれ以上の炭素原子が存在する場 合の直鎖または分岐鎖を含む。好ましいアルキル鎖は、それぞれ７未満の炭素原 子を含む。現在のところ最も好ましいのはエチルおよびグルタチオンであり、Ｒ ２は好ましくはシクロヘキシルメチルである。

（ｂ５誘導体化免疫グロブリン この発明の誘導体化免疫グロブリンは、工程：（ｉ）免疫グロブリンを部位特異 的に酸化して、該免疫グロブリンのＦｃ領域のグリコジル化地帯中の少なくとも ２つのヒドロキシル基を少なくとも２つのアルデヒド基に変換し： （ｉ　ｉ）これらアルデヒド基を還元的にアルキル化して該免疫グロブリンのＦ ｃ領域上にジスルフィド残基を導入し：ついでことによって調製する（その際、 各工程において水溶液相反応条件を採用する）。

免疫グロブリン分子の酸化は、化学的酸化または酵素的酸化のいずれかによって 行うことができることを理解すべきである。たとえば、化学的酸化剤としては、 過ヨウ素酸、臭素などが挙げられるが、これらに限られるものではなく、酵素的 酸化剤としては、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼなどの連続 的な使用が挙げられるが、これらに限られるものではない。

同様に、免疫グロブリンのジスルフィド基を還元して末端スルフヒドリル基を生 成する反応は、ジスルフィド基の化学的または酵素的開裂のいずれかによって行 うことができる。たとえば、Ｆｃ導入リンカ−中のジスルフィド基の化学的還元 は、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、水素化ホウ素ナ トリウム、亜ジチオン酸ナトリウムなどを使用することにより行うことができる 。

Ｆｃ部位におけるジスルフィド基の酵素的還元の場合は、そのような還元は、ジ スルフィド結合を含有するある種の化学的導入リンカ−を、ジスルフィドをチオ ールに酵素的に還元する適当な酵素に暴露することによって行うことができる。

それゆえ、リンカ−伸長グルタチオンの酸化形は、グルタチオンリダクターゼへ の暴露によってチオールを生成することができる。同様に、リンカ−伸長リポア ミドの酸化形は、リポアミドデヒドロゲナーゼへの暴露によってチオールを生成 することができる。

アミノジスルフィド化合物を用いて還元的アルキル化を行う場合にはシッフ塩基 が形成され、これは還元によって安定化される。

各指示工程の後、修飾した免疫グロブリン生成物は当該技術分野で知られた方法 に従って精製し、濃縮するのが好ましい。

本発明によれば、糠中のビシナルジオール残基を特異的に酸化してアルデヒド基 とするため、過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎａ　Ｉ　０４）などのアルカリ金属過ヨ ウ素酸塩を用いる（たとえば、オシャネッシーら参照）。それにより、免疫グロ ブリンのＦｃ領域のグリコジル化地帯は、その中の少なくとも２つのヒドロキシ ル基の部位特異的酸化を受けて２つのアルデヒド基を生成する反応を担う。従っ て、相補性決定領域は、本質的に構造的な変化を受けない。当業者によって理解 されるであろうように、そのような酸化は、免疫グロブリン反応物および過ヨウ 素酸酸化剤の濃度、ｐＨ，温度および時間を含む多くの変数に依存する。もちろ ん、そのような変数の種々の組合せを用いることができる。

生成するアルデヒド基の数を変化させ、最終的に酸化免疫グロブリンの標識の程 度を変化させることによって、酸化の程度をある程度制御することが可能である と思われる。各免疫グロブリン分子について生成するアルデヒド基の数は酸化条 件に依存しており、一層厳しい酸化条件では分子量たりに一層多くのアルデヒド 基が生成する。好ましくは、免疫グロブリンは、免疫グロブリンのＦｃ領域のグ リコジル化地帯中に各酸化免疫グロブリン当たり約２〜約１０のアルデヒド基を 含有する。

ついで、得られたアルデヒド基含有免疫グロブリンを精製し、濃度するのが最も 好ましい。精製はクロマトグラフィーによって行うのが好ましい。たとえば、現 在のところ好ましい方法は、修飾免疫グロブリンを分離する目的で、該修飾免疫 グロブリンを含有する反応媒体をセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア ・ＬＫＢ・バイオテクノロジー、ビス力タウエイ、ニューシャーシー州、米国） などのゲル濾過カラムに通すことである。そのような構成のカラムを従来通り平 衡化し、好ましくは約７．０のｐＨを有するリン酸ナトリウムおよび塩化ナトリ ウムなどの緩衝液を用いて溶出する。溶出中に画分を回収し、適当な前辺て決定 した吸光度ピーク（たとえば、２８０ｎｍ）を有する両分をプールする。適当な 吸光係数を用い、吸光度ピークからタンパク質の濃度を計算することができる。

そのようなプールからのアルデヒド基含有免疫グロブリンの濃縮を行うのが都合 良く好ましい。現在のところ好ましいのは、約３０，０００の数平均分子量カッ トオフを有する物質を通過する能力のあるセントリコン（Ｃｅｌｊｒｉｃｏｎ） チューブ（アミコン、デンバー、マサチューセッツ州、米国）などの分子量サイ ジング膜を含有するチューブを用いた約５０００ｘｇの遠心分離を用いることで ある。

ついで、精製した濃縮アルデヒド基含有免疫グロブリンを水溶液相条件下、適当 なアミノジスルフィド試薬またはジヒドラジドジスルフィド試薬と接触させて、 これらアルデヒド基により各免疫グロブリン当たり少なくとも一つのジスルフィ ド基を導入する。

アミノまたはヒドラジド置換チオール（すなわち、スルフヒドリル）末端化合物 を用いることもできるが、所望のチオール末端基置換基の収率を最大にし望まし くない副反応を回避するためには、チオール末端化合物よりもジスルフィド化合 物の方が特に好ましい。

従って、アルデヒド基含有免疫グロブリンとの反応に用いるためのそのようなジ スルフィド化合物の一つの好ましいクラスは、酸化されたグルタチオン、ヒドラ ジドリポアミド、または式： ％式％ （式中、Ｘは−ＣＨ２ＮＨ２および−Ｃｏ−ＮＨＮＨ！−よりなる群から選ばれ ；Ｒ１は１〜２０の炭素原子を含有する基、好ましくはメチレンである）で示さ れることを特徴とする化合物であってよい。

当業者によって理解されるであろうように、分子の集合に２官能性試薬を添加す ると、これら分子に対して分子内修飾および分子間修飾の両方が引き起こされる 。従って、本発明の上記ジスルフィド化合物は、免疫グロブリンの炭水化物に富 んだＦｃ領域と反応して、分子内で反応した場合に、ジスルフィド結合を含有す るＦｃ領域上に大きなヘテロ環を生成するか、または分子間で反応した場合に２ つの免疫グロブリン間にジスルフィド基を導入する。

合には、該塩基を還元して安定化する。たとえば、ジアミンジスルフィド試薬と 反応させた場合にはシッフ塩基の還元による安定化が必要であるが、カップリン グ試薬がジヒドラジドジスルフィドである場合には還元による安定化は必要では ない。そのような還元的安定化は、制御された反応条件下、アルカリ金属水素化 シアノホウ素、好ましくは水素化シアノホウ素ナトリウムを用いて都合よく行う 。

現在のところ好ましいのは、ジアミノジスルフィドの添加後約５分〜約２４時間 、さらに好ましくはジアミノジスルフィドのそのような添加後約１５分〜約６０ 分の時間間隔で水素化シアノホウ素を反応媒体に添加することである。該シッフ 塩基の還元の結果、２価の第二級アミン基が生成する。

得られた誘導体化ジスルフィド基含有免疫グロブリンを、酸化されたアルデヒド 基含有免疫グロブリンの精製および濃縮に使用すると記載された方法および装！ に従って精製および濃縮するのが好ましい。

ついで、精製し濃縮したジスルフィド基含有免疫グロブリンを、水溶液相条件下 で還元剤と接触すると、該還元剤は該免疫グロブリン中のジスルフィド基を遊離 のスルフヒドリル末端基に還元する。化学的な還元剤を用いる場合には、ジチオ スレイトールなどのジチオールが好ましい。酵素的な還元剤を用いる場合には、 グルタチオンリダクターゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼなどが好ましい。ジス ルフィド基の還元は、免疫グロブリン分子の内部構造中に存在しているジスルフ ィド基を含む、免疫グロブリン分子の他の部分には同等本質的な影響を及ぼすこ となく行われる。この還元は、ジチオール還元剤、並びにｐＨを含む多くの変数 に依存しており、これらジスルフィド還元条件の組合せを用いることもできる。

この点に関し、本発明者らは、驚Ｘべきことにまた予期しないことに、ジチオス レイトールなどの還元剤の充分に低い濃度（たとえば、約２ｍＭ）では、本発明 の方法によってＦｃ領域中に導入したジスルフィド結合のみが反応に預かって同 時にチオールを生成するが、相補性決定領域およびヒンジ領域中のジスルフィド 結合はそのような還元剤の低濃度では本質的に影響を受けないことを見いだした 。

Ｆｃ領域のアルデヒド基は、還元剤としての水素化シアノホウ素ナトリウムの存 在下でのみアミン含有リンカ−（たとえば、シスタミンおよび酸化されたグルタ チオン）と不可逆的に反応するであろうが、Ｆｃ領域のアルデヒドと反応させる べきリンカ−がヒドラジド基（Ｈ，Ｎ−ＮＨ−Ｃｏ−）を含有している場合には 水素化シアノホウ素ナトリウムは必要ない。特に、Ｆｃ領域上のアルデヒドの還 元的アミノ化のための水素化シアノホウ素ナトリウムの使用は、反応性リンカ− 中または免疫グロブリンの鏡開連結中のジスルフィド結合を還元しない。

本発明によれば、Ｆｃに導入したジスルフィド側鎖基のスルフヒドリル末端側鎖 への実質的に完全な変換を行うことができる。対照的に、上記以前に記載された （ヨーロッパ特許出願第３２，８６３号）ジスルフィド基の還元は、化学的還元 剤の実質的に一層高い濃度で行われる。

得られたスルフヒドリル基含有免疫グロブリンを精製するのが好ましい。現在の ところ好ましいのは、酸化されたアルデヒド基含有免疫グロブリンの調製に使用 すると上記に記載されたもののような精製法および装置を利用することである。

精製した生成物は、検出可能な残基との結合に直接用いるのに適している。

（ｃ）誘導体化免疫グロブリンと検出可能な残基との結合体本発明のＦｃ部位特 異的誘導体化スルフヒドリル基含有免疫グロブリンは、本質的にあらゆるタンパ ク質または当該技術分野で知られた他のタイプの検出可能な残基または標識と結 合して新規かつ有用な結合体を生成することができる。そのような検出可能な残 基または標識としては、酵素、発色団、ルミネッセンス化合物、燐光化合物、化 学ルミネッセンス化合物、蛍光化合物などが挙げられるが、これらに限られるも のではない。スルフヒドリル末端側鎖により、出発物質である免疫グロブリンお よび標識の非結合の活性すなわち正常な活性が保持された結合体を得ることがで き、本発明の誘導体化免疫グロブリンを用いることにより、増大した性能および 安定性を達成することができるようにコンホメーシヨンにおける自由度の歪みを 回避した結合体が生成される。

本発明の誘導体化免疫グロブリンとのカップリングに用いる標識は、少なくとも 一つの末端スルフヒドリル反応性官能基を含有するように誘導体化する。そのよ うな反応性官能基の例としては、マレイミド、ハロアセチル（ヨードアセチル、 ブロモアセチルおよびクロロアセチル）などが挙げられるが、これらに限られる ものではない。そのような誘導体化マーカーを調製するため、およびそのような 結合体を調製するため、当該技術分野で知られた方法を用いることができる。

当業者であれば理解されるであろうように、本発明は、本明細書に記載したカッ プリング基を用いて調製した多くの異なる結合体を包含する。単一の検出可能な 残基分子の多くの分子をこの発明の単一の誘導体化免疫グロブリン分子に結合す ることもできるし、または多くの誘導体化免疫グロブリン分子を単一の検出可能 な残基分子に結合することもできる。また、カップリングした分子の単一の結合 体は、記載したような２官能性カツプリング基（Ｑ）を複数含有していてもよい 。

本発明の好ましい結合体を調製するに際して、１９８８年９月２２日に「ヘテロ ２官能性カツプリング剤」の発明の名称で出願した継続中の米国特許出願第２４ ６．９７１号明細書（参照のため本明細書中に引用する）に記載された方法を用 いて調製した誘導体化酵素を用いることができる。そのような好ましい出発物質 である酵素は、式： （式中、Ｒ２は１〜２０の炭素原子を含有する基；Ｒ８は１〜１０の炭素原子を 含有するアルキレン基：には１〜１０の整数； ｎは１〜２０の整数； Ｅは酵素である）によって特徴付けられる。

式（７）の誘導体化酵素において、酵素（Ｅ）と末端マレイミド基との間の連結 基は、約２〜約４のアミノ酸からなるアミノ酸の比較的長いオリゴマー鎖を含有 しているのが好ましく、このようなオリゴマー鎖は、そのような連結基を導入し た結合された分子間に一層良好な物理的分離をもたらすばかりでなく、そのよう な鎖を含有する結合体の水溶解性および分散性を高めるようにも機能する。

この発明の誘導体化免疫グロブリンとマレイミド基が末端の側鎖を有する誘導体 化酵素との結合体を調製するため、当該技術分野で知られたあらゆる都合のよロ ブリン分子を、水溶液相条件下、マレイミド末端側鎖を有する精製酵素と混合す る。スルフヒドリル基とマレイミド基とのカップリング反応において反応条件の 種々の組合せを用いることができる。カップリング反応は暗所にて行うのが好ま しく、少なくとも約１時間、好ましくは約１時間撹拌させる。約２０時間を越え る時間は、通常、結合体の収率を増加させるようには思えないことを理解すべき である。結合またはカップリング反応は、反応基の出発モル比に基づいて実質的 に完了まで進行すると思われる。

残留する遊離基または反応性スルフヒドリル基を有しない結合体を調製するのが 好ましい。従って、結合体中の誘導体化免疫グロブリン分子上の未反応スルフヒ ドリル基は、メチル−ヘプチルのアルキル基で置換したマレイミドなどのキヤ・ ツピング剤を反応させる。好ましいキャツピング剤は、Ｎ−エチルマレイミド（ ＮＥＭ）である。一つの都合のよい現在のところ好ましいキャッピング法は、緩 衝水性生成物結合体含有培地にＮＥＭの水溶液を約０．３ｍＭの最終濃度で添加 し、この混合物を周囲温度にて少なくとも約１時間撹拌することである。キヤ・ ソビングした結合体は、イムノアッセイ法に直接用いることができる。

本発明による結合体は、競合イムノアッセイ、サンドイッチイムノア・ソセイ、 免疫測定イムノアッセイなどの当該技術分野で知られた均一および不向−イムノ アソセイ系（使用した検出可能な残基の量を測定し、試験試料中に存在する分析 対象物の量と相関させることができる）で分析対象物の決定を行うのに有用であ る。一般に、そのような測定は、免疫グロブリン、すなわち抗体が特異的な分析 対象物に結合する能力に依存し、その際、そのような分析対象物に対する抗体を 検出可能な残基で標識してなる結合体を用いてそのような結合の程度を決定する 。

典型的に、結合の程度は、結合体（分析対象物との結合反応に関与しているかま たは関与していない）中に存在する検出可能な残基の量によって決定され、その 際、検出され測定された検出可能な残基の量を試験試料中に存在する分析対象物 の量と相関させることができる。

て市販の包装形態にて、または試験キットとして、すなわち本発明による結合体 または本明細書に記載したイムノアッセイおよび当該技術分野で知られているよ うなイムノアッセイを行うのに適した他の試薬を入れた１または２以上の容器の 包装した組合せにて提供される。試薬はさらに、使用者の見地からアッセイにお いて有用であることが知られている他の物質、たとえば緩衝液、希釈液、標準、 コントロールなどを含んでいてもよい。

本発明を下記実施例により説明するが、これらに限られるものではない。

実施例１ 抗癌胚抗原（抗−ＣＥＡ）免疫グロブリンの部位特異性チオール化およびその子 　−ウシ腸アルカリホスホターゼへのカップリングニー（ａ）抗体のＦｃ領域に おけるチオール基の生成抗−ＣＥＡ免疫グロブリン（０，１６Ｍ塩化ナトリウム を含有する０、１Ｍ）リエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液中、４ｍｇ／ｍｌ、 ｐＨ８）の１ｍｌ溶液を、コハク色バイアルに入れる。０．１６Ｍ−ＮａＣ１を 含有するＯ、１Ｍ−ＴＥＡ緩衝液（ｐＨ８）に溶解した２００ｍＭ−ｍ−過ヨウ 素酸ナトリウム（シグマ・ケミカル・カンパニー、Ｕ、Ｓ、Ａ、ミズーリ州ルイ ス、ストリート）の１１０μｌ溶液を抗体溶液に加え、得られる混合物を暗所で 約５℃にて、回転撹拌機で１時間穏やかに撹拌する。

酸化シタ抗体ヲ、セファデック７、　（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５のｌＸ ４５ｃｍカラムにおＩ′ｆるクロマトグラフィーで上記反応混合物から精製する 。カラムを平衡状態にし、０．１Ｍ−ＮａＣ１を含有するＯ、１Ｍリン酸ナトリ ウム（ｐＨ７，０）で溶離する。それぞれ約１ｍｌの両分を溶離中に集め、２８ ０ｎｍの吸光度を測定する。

ピーク画分をプールし、免疫グロブリンプールのプロティン濃度を、１３．９の 数平均分子量約３００００以下の物質を通す大きさの膜を含有するセントリコン （Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）チューブ（アミコン、Ｕ、Ｓ、Ａ、、マサチューセッツ 州デンバーズ）を用い、５０００Ｘｇで遠心分離して、免疫グロブリンプールを １．０ｍｌに濃縮する。濃縮物を、０．１Ｍ−ＮａＣＩを含有する０、１Ｍリン 酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解した０、７５Ｍシスタミン・ジ塩酸塩（シグ マ・ケミカル・カンパニー）の２５０μｍと混合し、得られる混合物を室温で穏 やかに撹拌する。約１５分後、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍリン 酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解したＱ、３ｍＭシアノホウ水素化ナトリウム （シグマ・ケミカル・カンパニー）の６３μＩを加え、得られる混合物を、室温 にて回転撹拌機で一夜穏やかに撹拌する。

セファデックスＧ−２５のｌＸ４５ｃｍカラムにおけるゲル濾過で、誘導化した 抗体を回収する。カラムを平衡状態にし、０．１Ｍ−ＮａＣ１および２ｍＭ−Ｅ ＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム（ ｐＨ７，０）で溶離する。溶離中にそれぞれ約１ｍｌの画分を集め、２８０ｎｍ の吸光度を測定する。ピーク画分をプールし、変性した抗体の濃度を上述の２８ ０ｎｍの吸光度から算出する。

プールした抗体を再度、上記と同じ寸法および源のセントリコンチューブを用い て、１ｍｌに濃縮し、５０μｌの４０ｍＭジチオトレイトール（シグマ・ケミカ ル・カンパニー、０．ＩＭ−ＮａＣＩおよび２ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する０、１ Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解）で室温にて、１５分間処理する。１ ×４５ｃｍのセファデックスＧ−２５カラムにおけるクロマトグラフィーで、過 剰のジチオトレイトールを除去する。それぞれ約１ｍｌの両分を集め、２８０ｎ ｍのをプールし、結合が開始するまで氷上に貯蔵する。

（ｂ）酵素の誘導化 子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ポアリンガ−・マンハイム、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 インジアナ州インジアナポリス）の１０ｍｇ／ｍｌの０．６ｍｌアリコートを、 ０゜１Ｍ　ＮａＣＬ　１ｍＭ−ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ−ＺｎＣ１！を含有 する０゜１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に対してシア濾過する（ｄ ｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。

透析緩衝液で容量を１ｍｌに調整し、酵素溶液をバイアルに入れる。酵素溶液に 、ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ、０３１４１２７の記載に従って製造した、スク シンイミドエステルとマレイミド化合物の３０原子伸長へテロ三官能性リンカ− （１ｉｎｋｅｒ）試薬、スクシンイミジル（トリカプロアミドシクロヘキシルメ チル）Ｎ−マレイミド（ＳＴＣＭ）リンカ−０，８ｍｇを含有する２００μｍの ＤＭＦを加える。

得られる反応混合物を室温にて、回転撹拌機で３０分分間中かに撹拌し、誘導化 酵素をセファデックスＧ−２５のｌＸ４５ｃｍカラムにおけるクロマトグラフィ ーで精製する。カラムを平衡状態にし、０．１Ｍ−ＮａＣＬ　１ｍＭ−ＭｇＣ１ ！および０．１ｍＭ−ＺｎＣＩ２を含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ７゜０）で溶離する。それぞれ約１ｍｌの画分を溶離中に集め、２８０ｎｍ の吸光度を測定する。ピーク画分をプールし、プール中の酵素濃度を１０の吸光 係数（Ｃ）誘導化酵素とＦｃ領域でチオール化した抗体との結合上記工程（ｂ） の誘導化アルカリホスファターゼと、上記工程（ａ）の活性化抗体を２：１（酵 素：抗体）のモル比で混合する。混合物を回転撹拌機で、２〜８℃にて一夜撹拌 することにより、ＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ測定で示される、出発酵素と 抗体の約９０％結合が得られる。

Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ、シグマ・ケミカル・カンパニー）を用い室温で １時間にわたりて処理し、抗体の未反応チオール基をキャップする。結合体（ｃ ａｎｊｕｇａｔｅ）に５ｍＭ溶液のアリコートを加え、結合体中のＮＥＭの最終 濃度を約０゜３ｍＭとする。

（ｄ）Ｆｃ結合体の性能 上記製造したＦｃ結合体の性能を、癌胚抗原（ＣＥＡ）に対するサンドイッチ型 微粒子捕捉酵素免疫測定（ＭＥ　Ｉ　Ａ）［キングらのｒＩｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄ ｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ＣａｎｃｅｒＪ（２版発行）により、アボット（Ａｂ ｂＯｔｔ）・工Ｍｘ・システム（Ｓｙｓｔｅｍ）　（登録商標、評価する［フィ オアらのｒｃｌｉｎ、　Ｃｈｅ！１．　Ｊ（Ｖ　ｏ　ｌ　、３４．１７２６〜１ ７３２頁、１９８８年）参照］。この検定フォーマットに従い、捕捉抗体（抗− ＣＥＡ）と共有カップリングしたラテックス微粒子を、最初に既知もしくは未知 量の分析物を含有するサンプルと、次いでアルカリホスファターゼ−標識抗体結 合体（抗−ＣＥＡ／アルカリホスファターゼ結合体）と共に、培養する。各工程 で毛管作用および緩衝洗浄により未吸着物質を除去する。未結合体（ｕｎｂｏｕ ｎｄ　ｃｏｊｕｇａｔｅ）の除去に続いて、酵素基質（４−メチルウンベリフエ リイホスフエート）を加え、蛍光増加の割合を測定する。

図１および表１のデータにおいて、本発明のＦｃ部位−特異的結合体の性能と、 ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ、０３１４１２７に記載の、イミノチオラン−活性 化酵素とＳＴＣＭリンカー−活性化抗体の混合によって製造される抗−ＣＥＡ／ アルカリホスファターゼ結合体（ＳＴＣＭ結合体）の性能を比較する。これらの 結果から明らかに、本発明のＦｃ部位−特異的結合体がＳＴＣＭ結合体に比べて 検定感度が４００％改善されていることが証明される。

表１ １　Ｍ　ｘ　ＣＥ　Ａ検定における、抗−ＣＥＡ／アルカリホスファターゼＦｃ 部位−特異的結合体と、イミノチオラン／ＳＴＣＭ伸長リンカ−を用いて製造さ れる結合体（ＳＴＣＭ結合体）の比較 蛍光の割合（カウント／　ｓ　／　ｓ　）４　４６、３　９４．９ １０　９７．４　２００．６ ６０　５３４．１　１０００．３ １００　７８５．１　１５６５．７ ２００　１４３３．１　２６３４．３ また、上記２つの結合体をそれぞれ、４５℃にて３日間、同じストレスに付して 、それらの安定性を評価する。表２に示すデータによれば、本発明のＦｃ部位− 特異的結合体の熱的安定性は、上記ＳＴＣＭ結合体のそれぞれに匹敵し、また熱 ストレス後でも、本発明のＦｃ部位−特異的結合体は、ＳＴＣＭ結合体と比較し て、３倍以上のシグナルを与えることが認められる。

熱ストレス（４５℃で３日）後の、抗−ＣＥＡ／アルカリホスファターゼＦｃ部 ６０　３７７．９　６１６．３ １００　５９９．１　９６８．３ 実施例２ 抗−癌抗原（ＣＡ）１９−９免疫グロブリンのＦｃ部位−特異的チオール化およ びその子ウシ腸アルカリホスファターゼへのカップリングニー抗−ＣＡ１９−９ １ｇＧおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼのそれぞれを、実施例１の工程（ ａ）および（ｂ）の記載と実質的に同様に活性化し、次し）でそれらを１．５： ｌ（酵素：抗体）のモル比で混合して結合させる。未反応のチオール基を、実施 例１と同様にＮ−エチルマレイミドでキヤ・ツブする。

アボット弓Ｍｘ・システムを用い、サンドイッチ型ＭＥＩＡフォーマ・ソトでＦ ｃ部位−特異的結合体の性能を検定し、実施例１と同様に製造したＳＴＣλ４結 合体の性能と比較する。図２および表３に示す結果から、Ｆｃ部位−特異的結合 体がＳＴＣＭ結合体より約８倍もの感度を示すことが明らかである。

表３ 蛍光の割合（カウント／ｓ／５） Ｃ１９−９標準　ＳＴＣＭ結合体　Ｆｃ結合体（ユニット／ｍＬ）　（４μｇ／ ｍＬ）　（１μｇ／ｍＬ）３０　６０．７　７５．２ ９０　１４１．１　２３７．８ １８０　２７６．０　４６２．７ ３２０　４６２．１　７５０．５ 実施例３ 抗−尿路感染（ＵＴＩ）免疫グロブリンのＦｃ部位−特異的チオール化およびそ の子ウシ腸アルカリホスファターゼへのカップリングニーウサギおよびヒツジ抗 −ＵＴＩ免疫グロブリンおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼのそれぞれを、 実施例１の工程（ａ）および（ｂ）の記載と実質的に同様に活性化し、次いで誘 導化した両物質を２＝１（酵素：抗体）のモル比で混合し、回転撹拌機で穏やか に振とうさせながら２〜８℃にて一夜培養することにより結合させる。−夜の培 養に続いて、結合体中の残ったチオール基を実施例１と同様に、５ｍＭ−Ｎ−エ チルマレイミドでキャップする。

かかるＦｃ結合体の性能を、テスト生体としてＥ、Ｃｏ１１抽出物を用い、アボ ット・テスト−パック（Ａｂｏｔｔ　Ｔｅ５ｔ−ＰａｃｋＸ登録商標）［Ｗ、Ｅ 、ブラウン−ｍの「Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　Ｊ（Ｖ　ｏ　１　、３３．１５６ ７頁、１９８７年）参照コの免疫検定装置で評価し、ナカネおよびカワオイの方 法［Ｐ、に、ナカネおよびアキラ・カワオイの「Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｔ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｔ　Ｊ（Ｖ　ｏ　Ｉ　、　２２． １０８４〜１０９１頁、１９７４年）参照］に従って製造した過ヨウ素酸塩結合 体の性能と比較する。Ｆｃ部位−特異的結合体は、過ヨウ素酸塩結合体より約４ 倍以上の活性を有することがわかる。

実施例４ 抗−ビオチン免疫グロブリンのＦｃ部位−特異的チオール化およびその子ウシ腸 アルカリホスファターゼへのカップリングニーウサギ抗−ビオチン免疫グロブリ ンおよび子ウシ編アルカリホスファターゼの勺れぞれを、実施例１の工程（ａ） および（ｂ）の記載と実質的に同様に活性化し、次いで誘導化した両物質を１： １のモル比で混合して結合させる。得られる混合物を回転撹拌機で２〜８℃にて 一夜穏やかに撹拌する。翌朝、得られる結合体の未反応チオール基を実施例１と 同様に、ＮＥＭの５ｍＭストック溶液でキャップする。

Ｆｃ部位−特異的結合体をＤＮＡプローブ・ヒト乳頭腫ウィルス（Ｈｕ＋ｗａｎ 　Ｐａｐｉ１１ｏ＋ｓａ　Ｖｉｒｕｓ、　ＨＰＶ）検定で評価したところ、実施 例１で示されるように製造したＳＴＣＭ結合体と比較して、感度において２０倍 増加していることが認められる（図３および表４参照）。

表４ ＨＰＶ−ＤＮＡプローブ検定による、抗−ビオチン／アルカリホスファターゼＦ ｃ部位−特異的結合体とＳＴＣＭ結合体の比較ＨＰＶ標的の　ＳＴＣＭ結合体　 Ｆｃ結合体分子　（０，４ｕｇ／ｍｌｊ　（０，０４μｇ／ｍＬ）（０，２μｇ ／ｍＬ）０　１．０　１．０　１．０ １００　１．０　１．０８　１．１７ １０００　１．０　１．４０　１．９２１００００　１．７　３．８３　７．１ ２実施例５ 抗癌抗原（ＣＡ１２５）免疫グロブリンのＦｃ部位特異的チオール化およびその 生絹アルカリホスファターゼへの連結 モノクローナル抗−ＣＡ１２５免疫グロブリンおよびアルカリホスファターゼを 、それぞれ、実施Ｍｌの工程（ａ）および（ｂ）に記載のようにして活性化し、 各々モル比１：１および２：１（酵素：抗体）にて誘導化物質を結合することに より連結した。得られた混合物を２〜８℃にて一夜回転撹拌器にてゆるやかに撹 拌しへ。得られた結合体に５ｍＭＮＥＭを加えて実施例１の末端基キャップ処理 に供した。

これら結合体の性能をアボッ）ＩＭｘシステムを用いサンドイッチタイプＭＥＩ Ａフォーマットを用いて評価し、欧州特許公開第０３１４１２７号に記載のＳＴ ＣＭ延長リンカ−で誘導された酵素でＤＴＴ−還元抗体を結合して調製した結合 体に匹敵し得ることが分かった。

実施例６ 抗ヒトＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃ部位特異的チオール化およびその牛腸アルカ リホスファターゼへの連結 羊抗ヒトＩ　ｇＭ免疫グロブリンおよび牛腸アルカリホスファターゼを、それぞ れ、実施例１の工程（ａ）および（ｂ）に記載のようにして活性化し、各々モル 比１：ｌおよび２：１（＃素：抗体）にて誘導化物賀を結合することにより連結 し、その混合物を２〜８℃にて一夜回転撹拌器にてゆるやかに撹拌した。得られ た結合体に５ｍＭＮＥＭを加えて実施例１の末端基キャップ処理に供した。

これら結合体の性能をアボットＩＭｘシステムを用いサンドイッチタイプＭＥＩ Ａを用いて評価し、前記実施例１に記載のイミノチオランおよびＳＴＣＭ延長リ ンカ−を用いて調製した結合体に匹敵し得ることが分かった。

実施例７ 抗ヒトＩｇＥ免疫グロブリンのＦｃ部位特異的チオール化およびその牛腸アルカ リホスファターゼへの連結 羊抗ヒトＩｇＥ免疫グロブリンおよびアルカリホスファターゼを、それぞれ、実 施例１の工程（ａ）および（ｂ）に記載のようにして活性化し、各々モル比１： ｌにて誘導化物質を結合することにより連結した。その抗体／Ｉｌｌ素混合物を ２〜８℃にて一夜回転撹拌器にてゆるやかに撹拌し、得られた結合体に５ｍＭ　 ＮＥＭを加えて実施例１の末端基キャップ処理に供した。

これらＦｃ結合体の性能を以下のようにしてサンドイッチタイプイムノアッセイ にて評価した。

一片のニトロセルロース紙にアレルゲンを固定化したパネルを種々のアレルゲン に特異的なヒトＩｇＥ分子で処理した。そのニトロセルロース紙をリン酸緩衝食 塩水で洗浄し、１　：　１０００−１　：１６０００の範囲の種々の希釈度にて Ｆｃ部位特異的結合体で処理し、ついでアルカリホスファターゼへの発色反応に 供した。その結果、図４に示すように、Ｆｃ部位特異的結合体は前記に引用のナ カネおよびカワオイの過ヨウ化物法で得られる結合体に比べて約３倍感受性が高 いことを示した。

実施例８ 机下垂体系蛋白（抗−ＰＴＰ）のＦｃ部位特異的チオール化およびその牛腸アル カリホスファターゼへの連結 抗−ＦＴＰ免疫グロブリンおよびアルカリホスファターゼを、それぞれ、実施例 １の工程（ａ）および（ｂ）に記載のようにして活性化し、各々モル比１：１お よび２：１（酵素：抗体）にて誘導化物質を結合することにより連結した。その 抗体／酵素混合物を２〜８℃にて一夜回転撹拌器にてゆるやかに撹拌し、得られ た結合体に５ｍＭ　ＮＥＭを加えて実施例１の末端基キャップ処理に供した。

このＦｃ部位特異的結合体の性能をアボット１Ｍｘシステムを用いサンドインチ タイプＭＥＩＡフォーマットを用いて評価し、前記ナカネおよびカワオイの方法 により調製した結合体と比較した。その結果、図５および表５に示すように、Ｆ ｃ部位特異的結合体のノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対する信号において、過ヨウ化結合 体に比べて１０倍改良されている。

表５ 机下垂体系蛋白／アルカリホスファターゼＦｃと過ヨウ化結合体のＩＭｘＰＴＰ アッセイによる比較 ０．０　７６．４　２３．２ ０．０６２　測定せず　６６．３（２，８６）０．１２５　測定せず　１１１． ９（４，８２）０．２５０　１０２．１（１，３４）　２２７．４（９，８０） ０．５００　１５５．９（２，０４）　４２５．５（１８，３４）１．０００　 ２６６．４（３，４９）　８５０．０（３６，６４）（カッコ内の数値はノイズ 比に対する信号を示す）実施例９ 酸化グルタチオンの延長類縁体の抗体Ｆｃ領域への挿入およびグルタチオンリダ クターゼ触媒によるチオール類の発生抗体を実施例１に記載と同様にしてｐＨ８ および２〜８℃にて遇ヨウ化ナトリウムにて酸化し、過剰の試薬を除いたのち、 過剰の酸化グルタチオン（約１００ｍＭ）および水素化シアノホウ素ナトリウム （１５ｍＭ）の存在下に還元的アルキル化に供した。−夜室温にて反応後、過剰 の試薬を実施例１に記載と同様にしてセファデックスＧ−２５にてゲル濾過して 除去する。

抗体の活性化の最終工程を酵素的に行う。Ｆｃ領域に共有的に結合した酸化グル タチオンの延長類縁体で誘導した抗体に、酵素グルタチオンリダクターゼの数μ ｇおよび過剰のＮＡＤＰＨ（約１ｍＭ）を加え、適当量のチオール（２〜６モル ／抗体モル）が発生するまで反応させる。

チオールの発生に続いて、抗体は３７０Ｍ延長リンカ−で誘導されたアルカリホ スファターゼと結合し、得られた混合物を実施例１に記載と同様にして２〜８℃ にて一夜ゆるやかに撹拌する。最後に、その結合体を実施例１に記載と同様にし てＮＥＭにてキャップ処理し、透析して過剰の試薬を除去する。

実施例１０ ヒドラジドリポアミドおよびヒドラジドリポアミドの延長類縁体の抗体Ｆｃ領域 への挿入およびリポアミドデヒドロゲナーゼ触媒によるチオール類の発生抗体を 実施例１に記載と同様にしてｐＨ８および２〜８℃にて過ヨウ化ナトリ７ムにて 酸化し、過剰の試薬を除いたのち、過剰のヒドラジドリポアミドまたはヒドラジ ドリボアミドの延長類縁体（１０〜５０ｍＭ）で処理する。−夜室温にて反応後 、過剰の試薬を実施例１に記載と同様にしてセファデックスＧ−２５にてゲル濾 過して除去する。

抗体の活性化の最終工程を酵素的に行う。Ｆｃ領域に共有的に結合したりボアミ ド成分で誘導した抗体に、リポアミドデヒドロゲナーゼの数μｇおよび過剰のＮ ＡＤＰＨ（約１ｍＭ）を加え、適当量のチオール（２〜６モルチオール／抗体モ ル）が発生するまで反応させる。

チオールの発生に続いて、抗体は３７０Ｍ延長リンカ−で誘導されたアルカリホ スファターゼと結合し、得られた混合物を実施例１に記載と同様にして２〜８℃ にて一夜ゆるやかに撹拌する。最後に、その結合体を実施例１に記載と同様にし てＮＥＭにてキャップ処理し、使用前に透析して過剰の試薬を除去する。

ここに記載の発明の多くの改良および変形はその精神および範囲を逸脱すること なく可能であり、したがって、そのような限定は、以下のクレームによってのみ 付される。

のψ？〜〜のψ？〜−ａ）ψす輿○ 〜　〜　〜　〜　−−１−〇　〇　〇　〇（ＯＯＯＴ） ＜（４／＠／　」／：　＜、　＃）♀障（０００Ｔ） Ｃ％％、Ｊ　（４／４／打４１）♀１１ＨＰＶ　ＤＮＡプローブアッセイにおけ るＦｃ部位特異的結合体ｖＳＦｃ部位特異的結合体と過ヨウ素酸結合体との比較 −Ｏ−Ｆｃ結合体（１°１） −・−Ｆｃ結合体（２：Ｉ） 一〇−過ヨウ素酸　（３１） 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　フセイン、マザール アメリカ合衆国６００４８イリノイ州リバティービル、オールド・バーン・サー クル１６４３番 （７２）発明者　ボンド、ハヮード・イーアメリカ合衆国６００４５イリノイ州 レイク・フォレスト、リトル・メロディ−・レーン９６番

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．下記工程 （ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域のグリコシル化地帯を酸化剤で部位特異的に酸 化して、該免疫グロブリンの該地帯の少なくとも２個のヒドロキシル基をアルデ ヒド基に変換させ、 （ｂ）工程（ａ）で酸化された免疫グロブリンをジスルフィド化合物と反応させ て、該アルデヒド基の少なくとも１つを還元的にアミノ化して該免疫グロブリン のＦｃ領域にジスルフィド基を導入し、（ｃ）工程（ｂ）で反応させた免疫グロ ブリンのジスルフィド基のジスルフィド結合を還元剤にて選択的に還元させ、該 免疫グロブリンの該ジスルフィド基の少なくとも１つを２個のスルフヒドリル基 に変換させるからなることを特徴とする誘導化免疫グロブリンの製造方法。
2. ２．工程（ｂ）におけるジスルフィド化合物が式Ｘ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ１−Ｘ （式中、Ｘはアミノアルキル基またはセミヒドラゾン基、Ｒ１は炭素数１〜２０ 個を含む基、Ｒ１およびＸは、それらの間のジスルフィド原子と共に、巨大環状 基または異項環基もしくは免疫グロブリン分子当り少なくとも１個のアルデヒド 基を式−Ｘ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−（式中、Ｒ１およびＸは前記と同じ）で示されるジ スルフィド基を含む基に変換する分子内免疫グロブリンジスルフィド含有鎖を形 成してもよい） で示される請求の範囲第１項の方法。
3. ３．工程（ａ）における酸化剤が化学酸化剤である請求の範囲第１項の方法。
4. ４．ＸがＣＨ２−ＮＨ２、−ＣＯＮＨＮＨ２、グルタチオンのフラグメント、還 元ヒドラジドリポアミドのフラグメント、アルキル鎖改変鎖延長グルタチオン、 およびアルキル鎖改変鎖延長ヒドラジドリポアミドからなる群から選ばれる請求 の範囲第２項の方法。
5. ５．該化学酸化剤が過ヨウ化アルカリ金属、ヨウ素および臭素からなる群から選 ばれる請求の範囲第３項の方法。
6. ６．該化学酸化剤が過ヨウ化ナトリウムである請求の範囲第３項の方法。
7. ７．工程（ａ）における酸化剤が酵素酸化剤である請求の範囲第１項の方法。
8. ８．該酵素酸化剤が、ニューロアミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼか らなり、該酸化工程が該免疫グロブリンをニューロアミニダーゼおよびガラクト ースオキシダーゼで順次接触させることからなる請求の範囲第７項の方法。
9. ９．工程（ｂ）におけるジスルフィド化合物が、シスタミン、酸化グルタチオン 、酸化ヒドラジドリポ酸、アルキル鎖改変鎖延長酸化グルタチオン、およびアル キル鎖改変鎖延長酸化ヒドラジドリポ酸からなる群から選ばれる請求の範囲第１ 項の方法。
10. １０．工程（ｃ）における還元剤が、メルカプトエタノール、ジチオスレイトー ル、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜ニチオン酸ナトリウムからなる群から選ば れる請求の範囲第１項の方法。
11. １１．工程（ｃ）における還元剤がグルタチオンリダクターゼおよびリポアミド デヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる酵素還元剤である請求の範囲第１項の 方法。
12. １２．工程（ｃ）のスルフヒドリル基含有免疫グロブリンを、該免疫グロブリン に連結したマレイミド基を含有する検出し得る成分と接触させて結合体を生成す る請求の範囲第１項の方法。
13. １３．該検出し得る成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子 、着色粒子、および発光分子からなる群から選ばれる請求の範囲第１２項の方法 。
14. １４．該検出し得る成分が酵素である請求の範囲第１２項の方法。
15. １５．該マレイミド基が連結基を介して該検出し得る成分と結合している請求の 範囲第１２項の方法。
16. １６．該連結基が異種２官能性連結基である請求の範囲第１５項の方法。
17. １７．請求の範囲第１項における還元剤が、工程（ａ）における天然の免疫グロ ブリンのジスルフィド結合を実質的に還元しない量で存在する請求の範囲第１項 の方法。
18. １８．該還元剤が約１ｍＭから約５ｍＭの間のジチオスレイトールである請求の 範囲第１７項の方法。
19. １９．該還元剤が約２ｍＭジチオスレイトールである請求の範囲第１４項の方法 。
20. ２０．そのＦｃ領域のグリコシル化地帯において式−Ｘ−Ｒ１−ＳＨ （式中、Ｘはアミノアルキル基またはセミヒドラゾン基、Ｒ１は炭素数１〜２０ 個を含む連結基である） で示される少なくとも１個の基で置換されている免疫グロブリンからなることを 特徴とする誘導化免疫グロブリン。
21. ２１．Ｘが−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯ−、アルキル鎖改変鎖延長還元 グルタチオン、およびアルキル鎖改変鎖延長還元ヒドラジドリポアミドからなる 群から選ばれる請求の範囲第２０項の誘導化免疫グロブリン。
22. ２２．Ｒ１が炭素数１〜８個を含むアルキル基である請求の範囲第２０項の誘導 化免疫グロブリン。
23. ２３．Ｒ１がメチレンである請求の範囲第２０項の誘導化免疫グロブリン。
24. ２４．式 ｍＹ（Ｘ−Ｒ１−ＳＨ）ｎ （式中、ＹはＦｃグリコシル化領域が連結基と反応性である免疫グロブリン分子 、ｍは１〜２０の整数、およびｎは１〜２０の整数である）であることを特徴と する請求の範囲第２０項の誘導化免疫グロブリン。
25. ２５．スルフヒドリル反応性官能基を含有する検出し得る成分と連結した請求の 範囲第２０項の誘導化免疫グロブリンからなる結合体。
26. ２６．該スルフヒドリル反応性官能基がマレイミドである請求の範囲第２５項の 結合体。
27. ２７．該スルフヒドリル反応性官能基が２官能性連結基で該免疫グロブリン分子 と連結している請求の範囲第２６項の結合体。
28. ２８．該検出し得る成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子 、着色粒子、および発光分子からなる群から選ばれる請求の範囲第２５項の結合 体。
29. ２９．該検出し得る成分が酵素である請求の範囲第２５項の結合体。
30. ３０．該２官能性連結基が、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸおよびＲ１は請求の範囲２０に記載と同じ、Ｌは、Ｒ１と同一または 異なって、炭素数１〜４０個を含む連結基である）で示される請求の範囲第２２ 項の結合体。
31. ３１．構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは−ＣＨ２−ＮＨ−または−ＣＨ＝ＮＮＣＯ、Ｒ１およびＲ２は各々 独立して炭素数１〜２０個を含む基から選ばれる、ｋは１〜１０の整数、かつＸ は該免疫グロブリンのＦｃ領域のグリコシル化地帯に連結しており、末端＞ｃ＝ ０基は該検出し得る成分に連結している）で示される２官能性連結基の少なくと も１つを介して検出し得る成分に連結した免疫グロブリンからなることを特徴と する結合体。
32. ３２．式 〔Ｙ〕ｏ〔Ｑ〕ｍ〔Ｅ〕ｐ （式中、Ｙは免疫グロブリン分子のＦｃ領域のグリコシル化地帯、Ｑは該２官能 性連結基、Ｅは酵素、ｍは１〜２０の整数、およびｏおよびｐは各々独立して１ 〜１０の整数である） で示される請求の範囲第３１項の結合体。
33. ３３．該検出し得る成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子 、着色粒子、および発光分子からなる群から選ばれる請求の範囲第３１項の結合 体。
34. ３４．該検出し得る成分が酵素である請求の範囲第３１項の結合体。
35. ３５．次工程 （ａ）試料を構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは−ＣＨ２−ＮＨ−または−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯ−、Ｒ１およびＲ２は 各々独立して炭素数１〜２０個を含む基から選ばれる、ｋは１〜１０の整数、か つＸは該免疫グロブリンのＦｃ領域のグリコシル化地帯に連結しており、末端＞ ｃ＝０基は該検出し得る成分に連結している）で示される２官能性連結基の少な くとも１つを介して検出し得る成分に連結した免疫グロブリンからなる結合体と 接触させ、（ｂ）該試料中に存在する分析物の量の関数として、該分析物と結合 反応したまたはしなかった結合体の量を測定するからなる、試料中の分析物を測 定するイムノアッセイ法。
36. ３６．該結合体が、式 〔Ｙ〕ｏ〔Ｑ〕ｍ〔Ｅ〕ｐ （式中、Ｙは免疫グロブリン分子のＦｃ領域のグリコシル化地帯、Ｑは該２官能 性連結基、Ｅは酵素、ｍは１〜２０の整数、およびｏおよびｐは各々独立して１ 〜１０の整数である） で示される請求の範囲第３５項の方法。
37. ３７．該検出し得る成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子 、着色粒子、および発光分子からなる群から選ばれる請求の範囲第３５項の方法 。
38. ３８．該検出し得る成分が酵素である請求の範囲第３５項の方法。
39. ３９．テストキットが、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは−ＣＨ２−ＮＨ−または−ＣＨ＝ＮＮＨＣＯ−、Ｒ１およびＲ２は 各々独立して炭素数１〜２０個を含む基から選ばれる、ｋは１〜１０の整数、か つＸは該免疫グロブリンのＦｃ領域のグリコシル化地帯に連結しており、末端＞ ｃ＝０基は該検出し得る成分に連結している）で示される２官能性連結基の少な くとも１つを介して検出し得る成分に連結した免疫グロブリンからなる結合体か らなることを特徴とする液体試料中に存在する分析物のイムノアッセイ測定用の テストキット。
40. ４０．該結合体が、式 〔Ｙ〕ｏ〔Ｑ〕ｍ〔Ｅ〕ｐ （気中、Ｙは免疫グロブリン分子のＦｃ領域のグリコシル化地帯、Ｑは該２官能 性連結基、Ｅは酵素、ｍは１〜２０の整数、およびｏおよびｐは各々独立して１ 〜１０の整数である） で示される請求の範囲第３９項のテストキット。
41. ４１．該検出し得る成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子 、着色粒子、および発光分子からなる群から選ばれる請求の範囲第３９項のテス トキット。
42. ４２．該検出し得る成分が酵素である請求の範囲第３９項のテストキット。