JPH04334377A - 酸−不安定性リンカー分子 - Google Patents

酸−不安定性リンカー分子

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JPH04334377A
JPH04334377A JP3361486A JP36148691A JPH04334377A JP H04334377 A JPH04334377 A JP H04334377A JP 3361486 A JP3361486 A JP 3361486A JP 36148691 A JP36148691 A JP 36148691A JP H04334377 A JPH04334377 A JP H04334377A
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Petrus J Boon
ペトルス・ヨハネス・ボーン
Franciscus M Kaspersen
フランシスクス・ミカエル・カスペルセン
Ebo Sybren Bos
エボ・シブレン・ボス
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Akzo NV
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    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】本発明はガン免疫療法に関するも
ので、特に細胞毒性部分と標的決定性（ｔａｒｇｅｔｉ
ｎｇ）部分との免疫結合体に関し、更に詳しくは薬剤、
毒素、放射性同位元素等の細胞毒性物質に結合した抗体
又は抗体のフラグメントや機能性誘導体の免疫結合体に
関するものである。特に酸−可分割性のリンカー分子を
使用して、標的決定性の部分と結合している物質の放出
に関する。
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】免疫療
法は、ガン治療分野では既に数多く検討された治療様式
の一つである。抗体や特定の結合ペアの構成子の標的決
定能により、活性化合物の局在化がはるかに正確に出来
る様になると同時に活性化合物の全用量を減じる事が出
来、これにより一般的な有害効果が減少する。初期の試
みでは、（モノクローナル）抗体又は他の標的決定部分
は、直接、放射性元素例えば６７Ｇａ，１３１Ｉ，９９
ｍＴｃ，１１１Ｉｎ、又はその他の同位元素（例えばＪ
．Ｊ．マーカロニス、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３、２
９９〜３０５頁，１９６９年）等に結合された。 その後同位元素を抗体に結合させるのは、ＥＤＴＡ（ク
リカレクとタッカー、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ　　Ｃｏｍｍｕｎ．７７，５８１〜５８５頁，
１９７７年）又はＤＴＰＡ（米国特許第４４５４１０６
号）等のキレート剤の使用により行われている。薬剤や
毒素の使用も検討されている。薬剤や毒素の抗体への結
合、あるいは１個以上の抗体を結合した担体への結合は
、連結剤によらねばならないが、毒素及び／又は担体と
標的決定部分との組み換え融合蛋白質とすることも可能
である。連結剤は公知のものであり、これ等試薬の相当
数が使用出来る。広義では、連結試薬はたがいに共有結
合をしている二つ以上の反応性官能基、例えばカルボヒ
ドロキシ基、アミノ基、チオ基、スルフヒドリル基等を
含む。二つの官能基間の共有結合は直接的でも良いが、
多くの場合反応性官能基は架橋基又はスペーサーへ各々
が共有結合して離れている。この反応性官能基は同一で
も異なっていても良い。結合の調節がしやすいので異な
る基の方が好ましい。リンカーの化学構造が、放出され
て標的部位で活性を発揮する活性化合物の能力を左右す
る。当初ペプチド的リンカー構造を採用したが、これは
リソソーム酵素により分割されやすいものであった（Ｔ
ｒｏｕｅｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．７９，６２６〜６２９頁、１９８２年）。この手法で
は標的細胞への結合後、結合体の内在化が必要となる。 標的細胞中でリソソーム酵素は、標的決定分子から活性
化合物を放出する。他の開発は、酸−不安定性アミド結
合を通じ、アミノ基含有薬剤を結合する為の、アコニチ
ン酸に基づくリンカー構造に関するものである（Ｓｈｅ
ｎ及びＲｙｓｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
，１０２，１０４８〜１０５４頁、１９８１年）。 ここでもやはり薬剤の効果的放出には、エンドソームや
リソソーム等の細胞内の酸性器官への結合体移動が必要
であった。（Ｄｅ　　Ｄｕｖｅ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１３７，３９１〜３９７頁、１９８３年）。 弱酸性溶液中での加水分解能を特徴とするアミノ−スル
フヒドリル連結試薬の使用を記載した米国特許第４６１
８４９２号でも同じことである。この様なリンカーを使
用するには結合体が内在化されねばならない。しかし腫
瘍に関連する抗原に対して生成された抗体のごく一部し
か、免疫性複合体の内在化ひいては結合している活性化
合物の内在化を誘発することが出来ない。このことは、
結合体サイズが担体の存在により増加すると特に著しい
。内在化を誘発できないことは、ガン治療の分野での免
疫結合体使用の主要な欠点である。
【課題を解決するための手段】本発明者達は、中性（生
理的ｐＨも含む）又は弱酸性条件下で生物学的に活性な
物質を制御放出させ得る、一群の連結試薬を発見した。 これらのリンカーは標的の真近で細胞毒性物質を放出さ
せ、これにより標的決定部分を内在化させる必要を無く
すが、本発明のリンカーは標的決定部分の内在化にも適
しているのは言う迄もない。一般にこれらの連結試薬は
マレアミド酸誘導体から成り、下記式で示される。
【化４】 （式中Ｒ１はＨ、低級アルキル、低級アルキレン、低級
アリール又はアラルキル；又は２価の有機−Ｏ−，−Ｓ
−又は−（Ｎ−Ｒ′）−連結部分と結合している化合物
であり、Ｒ２は水素、アルキル、アリール又はアラルキ
ルであり、Ｒ３は−（Ｃ＝Ｏ）−，−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−
，−Ｓ−（Ｃ＝Ｏ）−，−Ｏ−（Ｃ＝Ｓ）−，−Ｓ−（
Ｃ＝Ｓ）−，−Ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−，−Ｎ−（Ｃ＝Ｓ）−
、又は隣接窒素の孤立電子対の電子を非局在化させ得る
その他の化学構造であり、Ｒ４は、Ｒ３を担体分子、蛋
白質性物質、抗体（フラグメント）、ポリマー、又は核
酸に連結することができる懸垂（ｐｅｎｄａｎｔ）反応
基を示す。）本発明の他の態様は下記の式で表される結
合体から成る。
【化５】 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は上記定義通りであり、Ｒ５
はアシル化活性物質であり、Ｒ６は、担体、蛋白質性物
質、抗体（フラグメント）、ポリマー、又は核酸と結合
しているＲ３である。）又、次の式で表される化合物も
含まれる。
【化６】 （式中の各基は上記定義通りである。）上記結合体の混
合物もやはり本発明に含まれる。本発明の利点は上述化
合物を中性又は極めて弱い酸性ｐＨ値で加水分解出来る
事にある。腫瘍組織には中性又は弱酸性環境があるので
、この特性により結合体分割を腫瘍細胞の真近かで行な
う事が出来、これにより結合体の内在化の必要性を回避
する。これは結合体が抗体とだけでなく、結合体の標的
となる細胞又は構造上の、特定の標識を認識する事が出
来ればどんな標的決定部分とでも組み合わす事が出来る
事を意味する。従って核酸、担体分子、蛋白質性物質、
ポリマー、あるいは特異的結合ペアのどんな種類の構成
物でも使用する事が出来る。これらの結合体を用いた、
その他治療分野は従って、特定集団の細胞、例えば自己
免疫疾患に於けるＴ−細胞を殺す事である。標的細胞の
真近な環境で活性化合物を放出する事の他の利点は、そ
こに標的決定部分が認識する部位が存在しない様な隣接
悪性細胞に対して、この化合物が作用する事である。上
記、リンカー分子のその他の利点は、マレアミド酸部分
のＲ１及び／又はＲ２の置換基の大きさ及び／又は性質
を変える事で、（酸性）分割への感度を変えられる事で
ある。一般に置換基が大きければ大きい程結合体は不安
定になると言える。この性質が結合体を特定の要求に合
致させやすくする。まず第１に、標的決定部分が標的細
胞に局在化するのに要する時間と、その細胞での滞留時
間とを計算する事が出来る。第２にこの方法では、ａ）
標的細胞の特定環境ｂ）未結合の結合体のクリアランス
速度及びｃ）使用する活性化合物の種類に合わせ得る活
性化合物の制御放出を行なう事が出来る。この最後の項
目は、使用する活性化合物の大きさとｐＫａが結合体か
らの分割のしやすさを変え得るという特に有用なもので
ある。従って所望のｐＨ域でどんな特定活性化合物でも
放出する結合体を生成する事が出来る。正常血清（ｐＨ
７．４）中では結合体の安定度は、数日のＴ１／２でリ
ンカー分割が起る程度なので、未結合の結合体は、有害
量の細胞毒性化合物が生成される前に血清からクリアさ
れている。上記の連結化合物は、例えば抗体、抗体のフ
ラグメント、抗体の機能的誘導体等の蛋白質；あるいは
リガンドやペプチドホルモン等の特異的結合ペアの他の
構成物；あるいは受容体結合フラグメントやその誘導体
、特に細胞表面受容体等の分子を、細胞毒性薬剤、毒素
、メタロプロテイン、（放射性）金属とのキレート等の
効果体分子とに架橋連結して、あるいは他の蛋白質、炭
水化物、核酸、又は他の生物学的に有効な分子に架橋連
結して、生体内又は試験管内での診断や治療に有用な結
合体を形成するのに役立つ。好ましい標的決定部分は、
ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＢＦＰ、ｈＣＧ、β２−ミクログロブ
リン、他の腫瘍標識等の抗原を標的とする、あるいはＨ
ＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗−ＨＢｓ、ＮＡＮＢＶ等のウ
ィルスやＨＴＬＶ、ＦｅＬＶ等のレトロウィルスに関係
する抗原又は抗体を標的とする抗体又は抗体フラグメン
ト等の、腫瘍細胞に対して特異的な分子である。搬送す
べき活性物質で好ましいのは細胞毒性薬剤である。特に
好ましい活性物質は、アシル化し得る化学的部分、例え
ばアミン基、ヒドラジド基、フェノリックヒドロキシ基
、チオ基、又はメルカプト基を有する薬剤、例えばアド
リアマイシン、ダウノマイシン、ミトマイシンＣ、ベル
カリン（ｖｅｒｒｕｃａｒｉｍ）Ａ又は他のトリコテセ
ン類、メトトレキサート、５−フルオロウラシル又はそ
の誘導体、チタラビン、ペントスタチン、ビンクリスチ
ン又は他のビンカ−アルカロイド類、エトポシド、テニ
ポシド、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、ブレオ
マイシン、あるいは他の細胞毒性物質等である。技術に
精通した者であれば、ある結合体に対し、生体内でのｐ
Ｈと温度範囲での標的部位で薬剤の放出速度と遊離薬剤
の収率を予測出来ると認めるであろう。これに基づいて
標的細胞に実質的な細胞毒性効果を及ぼすのに必要な結
合体量を算出する事が出来る。本発明の特徴を以下の実
施例で更に詳しく述べる。
【実施例】
実施例　　１ 二官能性リンカー試薬の調製 不安定なマレインアミド酸構造体を導入するために用い
る二官能性試薬を下記スキムＩに従って調製した。
【化７】 １．　　Ｓ−ベンゾイル−メルカプト酢酸Ｎ−スクシン
イミジル（１）の調製 Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ．（Ｊ．
Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　　２５，２２３−２３９
，１９８４）が述べた操作方法に従って調製したＳ−ベ
ンゾイル−メルカプト酢酸（４．６ｇ；２３．４ｍｍｏ
ｌｅｓ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．７ｇ；
２３．４ｍｍｏｌｅｓ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）
に溶解した。溶液を−１０℃に冷却し、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（４．８６ｇ；２３．６ｍｍｏｌｅｓ
）を添加した。混合物を−１０℃で１時間攪拌し、その
後４℃で１６時間放置した。沈殿したジシクロヘキシル
尿素を濾別し、濾液を減圧で蒸発させた。固形残留物を
酢酸エチル−エーテル（１：１）で粉砕し、濾過し、エ
ーテルで洗浄し、減圧で乾燥して、標記化合物１（４．
０ｇ：１３．６ｍｍｏｌｅｓ；５８％）を得た。 １Ｈ−ＮＭＥ（ｄ６ＤＭＳＯ）：２．８２ｐｐｍ（ｓ，
４Ｈ，−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）；４．４５ｐ
ｐｍ（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；７．６−８
．０ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ．）。 ２．　　β−ヒドロキシ，β−メチルアスパラギン酸（
２）の調製 化合物２を、Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ．
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，１７２６−１７
２９，１９５９）が述べた方法に従ってピルビン酸とグ
リシン銅塩より調製した。 ３．　　Ｎ−（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−
β−ヒドロキシ，β−メチル−アスパラギン酸（３）の
調製 化合物１（０．５８ｇ；２．０ｍｍｏｌｅｓ）をジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）（５．０ｍｌ）に溶解した。 引き続き、β−ヒドロキシ，β−メチル−アスパラギン
酸（０．３２ｇ；２ｍｍｏｌｅｓ）とトリエチルアミン
（０．２８ｍｌ）をＤＭＦ溶液に添加した。１５分以内
に清澄な混合物を得た。混合物を５時間攪拌した。酢酸
を２−３滴滴下した後溶媒を減圧で除去した。残留物を
二硫酸カリウム（２％ｗ／ｗ）水溶液（１０ｍｌ）に溶
解した。その後、生成物をｓｅｃ−ブタノール−ジクロ
ロメタン（２：３ｖ／ｖ；各１０ｍｌで３回）を用いて
水溶液より抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム溶液
で一度洗い、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧で
除去し、残留物をシリカ−６０（Ｍｅｒｃｋ，４０−６
３μｍ）のクロマトグラフィにおいて溶媒系にブタノー
ル−１−酢酸−水（４：１：１ｖ／ｖ）を用いて精製し
て、化合物３（０．４４ｇ；６４％）を得た。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１．３８ｐｐｍ（ｓ，Ｃ
Ｈ３）及び１．５０ｐｐｍ（ｓ，ＣＨ３）（エリトロ：
トレオ比＝約１：１；合計：３Ｈ）；３．８８〜４．０
０ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−）；４．８
７ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；７．４
８−８．０２（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ，）。 ４．　　２−Ｎ−（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル
）アミノ，３−メチル−マレイン酸無水物（４）の調製
アスパラギン酸誘導体３（０．２０ｇ；０．５８ｍｍｏ
ｌｅｓ）を無水酢酸（２．０ｍｌ）に溶解した。溶液を
１００℃で２０分間放置後、溶媒を減圧で蒸発乾固した
。得られた固形残留物をエーテル−ヘキサン（１：１ｖ
／ｖ）で粉砕し、濾別し、減圧で蒸発して、純粋な標記
化合物４（０．０９２ｇ；５２％）を得た。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．２３ｐｐｍ（ｓ，３
Ｈ，ＣＨ３）；３．８９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ
２−ＣＯ−）；７．４６−８．０５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏ
ｍ．）；８．７５ｐｐｍ（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ）実施
例２ 二官能性リンカー試薬４によるアドリアマイシンの誘導
体化（スキムＩＩ）
【化８】 アドリアマイシン塩酸塩（６６ｍｇ；０．１１ｍｍｏｌ
ｅｓ）をＤＭＦ（１．０ｍｌ）に懸濁した。続けて、無
水マレイン酸誘導体４（３９ｍｇ；０．１３ｍｍｏｌｅ
ｓ）とエチル，ジイソプロピルアミン（６３μｌ；０．
３６ｍｍｏｌｅｓ）を添加した。５分以内に清澄な溶液
を得た。ジクロロメタン−メタノール−水−トリエチル
アミン（７０：３０：５：０．１ｖ／ｖ）の溶媒系を用
いるＴＬＣ（シリカ；Ｍｅｒｃｋ）は、アドリアマイシ
ンの完全転換を示した。反応混合物を冷酢酸エチル（３
０ｍｌ）に攪拌しながら滴下して加え、沈殿物を生成し
た。沈殿物を遠心分離し、引き続き酢酸エチルで３回洗
い最後にエーテルで洗って乾燥した（５６ｍｇ；５８％
）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，ｄ６）はリンカー構造体
の存在を確認し、そして２つの考えられ得る異性体構造
体、無水マレイン酸試薬のＣ１あるいはＣ４のどちらか
のカルボニル位にアドリアマイシンアミン官能基が反応
した生成物（スキムＩＩ参照）がほとんど同量存在する
ことを示した。これら２つの異性体生成物は、Ｂｏｎｄ
ａｐａｋ−Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣ分析で明確に分
離された（図１Ａ参照）：溶媒系Ａ：Ｂ＝９２：８ｖ／
ｖ［ここでＡ＝酢酸アンモニウム０．３％（ｗ／ｖ）を
含むメタノール−水（３：２ｖ／ｖ）、Ｂ＝メタノール
］を用い、１．０ｍｌ／分の流速でアイソクラティック
溶出し、２５４ｎｍで検出した。 Ｒｔ アドリアマイシン：９．８分 異性体１：１１．０分 異性体２：１５．５分 実施例３ アドリアマイシンのそのリンカー誘導体からのｐＨ−依
存性放出 アドリアマイシンのそのリンカー誘導体からの放出率を
５．０−７．５の範囲の様々なｐＨで試験した。実施例
２で述べられた化合物のストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ
）を用意した。この溶液の一定量をｐＨが各々５．０，
６．０，６．５，７．０及び７．５の５０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液で希釈し、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度にし
た。２４時間までの様々な時間で、試料をＨＰＬＣ分析
した。ｐＨ６．５と７．０でのこの分析例を図２に示し
た。図１Ｂに示されるように、アドリアマイシンの放出
率はｐＨ依存性であり、酸で促進される。図２により、
加水分解に対する感受性も両方のリンカー誘導体におい
て定性的に同等であることが結論づけられた。アドリア
マイシンのそのリンカー誘導体からの定量的放出が時間
と共に達成されることも明らかである。 実施例　　４ アドリアマイシン−リンカー誘導体のヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）への結合（スキムＩＩＩ）
【化９】 Ａ．　　ＨＳＡのマレオイル化 新たに調製したＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ＳＭＣＣ）（２．０ｍｇ）のＤＭＦ（４．０ｍｌ）
溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５中
のＨＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）の攪拌溶液（２．０ｍｌ）
に加えた。混合物を３０分間攪拌し、引き続いて、セフ
ファデックスＧ−２５（ＰＤ−１０）カラムを通して濾
過した。このカラムは５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７．５で平衡化し、溶出した。ＨＳＡ分画のタンパ
ク質濃度（７．３ｍｇ／ｍｌ）はローリー（Ｌｏｗｒｙ
）法により測定した。マレイミド基の濃度を、Ｄ．Ｒ．
Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ　　ｅｔ　　ａｌ．（Ａｒｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１９，４１−４９，
１９６７）の操作方法に従って、これらの官能基を既知
の過剰のシステアミンと反応させ、引き続いて残ってい
るシステアミン量を２，２′−ジチオジピリジンと反応
させて分光光度計で測定することによって測定した。 Ｂ．　　アドリアマイシン−リンカー誘導体のＨＳＡへ
の結合 実施例２で述べられたアドリアマイシン−リンカー誘導
体（１．５ｍｇ）のジメチルホルムアミド溶液（０．５
ｍｌ）を、Ａ．の条件で述べられたようにして得られた
マレオイル化ＨＳＡ１．３ｍｌに添加した。ｐＨ７．０
に調整された０．５Ｍヒドロキシルアミン（０．０７２
ｍｌ）を攪拌しながら混合溶液に加えた。この溶液を室
温で１５分間放置後、４℃で１５時間放置した。ｐＨ７
．５に調整されたシステアミンの２０ｍＭ溶液（０．１
０ｍｌ）を加えた。１５分後、この溶液を、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液−ＤＭＦ（２：１ｖ／ｖ）ｐＨ７
．５で平衡化したセファデックスＬＨ−２０カラムにか
け、溶出した。タンパク質を含む溶出液を集め、セファ
デックスＧ−２５のカラムにかけ、５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ７．５で溶出した。ＨＳＡ量をローリ
ー法で測定した。ＨＳＡへのアドリアマイシンの結合量
を分光光度計で測定した（εＭ４８７＝９０００）。 置換比はＨＳＡ１モル当たりアドリアマイシン３．７モ
ルであることが確認された。 実施例　　５ 二官能性リンカー試薬の調製 メルカプトベンゾイル官能基をメルカプトアセチル官能
基で置換することにより化合物４（スキムＩ）とは異な
る二官能性試薬を、下記スキムＩＶに従って調製した。
【化１０】 １．　　Ｓ−アセチル−メルカプト酢酸（５）の調製塩
化アセチル（１７５ｍｌ）をメルカプト酢酸（１００ｍ
ｌ）にゆっくりと添加した。混合物を１時間還流温度で
加熱した。引き続き、減圧で蒸留して、純粋な標記化合
物（８４．１ｇ）を得た。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．４１ｐｐｍ（ｓ，３
Ｈ）；３．７４ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）。 ２．　　Ｓ−アセチル−メルカプト酢酸Ｎ−スクシンイ
ミジル（６）の調製 化合物５（８４ｇ；０．６２モル）とＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（７２ｇ；０．６２モル）をジクロロメタ
ン（６００ｍｌ）に溶解した。この溶液を０℃に冷却し
、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１２９．８ｇ；０
．６２７モル）を添加した。混合物を０℃で１時間、室
温で更に２０時間攪拌した。次に、混合物を０℃に冷却
し、ジシクロヘキシル尿素の沈殿物を濾別した。濾液を
減圧で蒸発させると、固形残留物が残った。生成物を０
℃で２−プロパノール（４００ｍｌ）で粉砕し、続いて
濾過して単離した。収率９２．５％で結晶６を得た。 （１３４．２ｇ）。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．４３ｐｐｍ（ｓ，３
Ｈ）；２．８５ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ）；３．９８ｐｐｍ（
ｓ，２Ｈ）。 ３．　　Ｎ−（Ｓ−アセチルメルカプトアセチル）−β
−アラニン（７）の調製。 β−アラニン（２４．３６ｇ；０．２７モル）の水溶液
（３００ｍｌ）中に、エチルジイソプロピルアミンの２
０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド溶液をｐＨが８．
５になるまで添加した。混合物をジメチルホルムアミド
（１００ｍｌ）で稀釈後、化合物６（６０ｇ；０．２０
モル）のジメチルホルムアミド溶液（２００ｍｌ）を撹
拌している反応混合物に徐々に（３０分間で）添加した
。このとき、溶液のｐＨはエチルジイソプロピルアミン
（２０％ｖ／ｖ）のＤＭＦ溶液を同時に添加してｐＨ６
．５−７．０に維持した。混合物を室温で１時間撹拌し
た。溶液のｐＨを５％（ｗ／ｗ）二硫酸カリウム水溶液
を添加して１−２に調整した。その後、生成物をジクロ
ロメタン−２−ブタノール（３：２，ｖ／ｖ；２５０ｍ
ｌ×４回）で抽出した。合された有機層を飽和塩化ナト
リウム溶液で２回、引き続き水で洗った。溶媒を減圧で
蒸発して除去した。残留物をジクロロメタンに溶解した
。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過して無機
塩を除去した後、溶媒を減圧で蒸発させて、標記化合物
７（０．１９モル；７４％）とジメチルホルムアミドの
約１：１混合物からなる固形物質（５３．８ｇ）として
標記化合物を得た。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．４０ｐｐｍ（ｓ，３
Ｈ）；２．５６ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ；−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ
）；３．５０ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ；−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ
２−）；３．５８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ；−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ
Ｏ）；７．０１ｐｐｍ（ｂｒｔ，１Ｈ；−ＮＨ−ＣＨ２
−）。 ４．　　Ｎ−（Ｓ−アセチルメルカプトアセチル）−β
−アラニンのｐ−ニトロフェニルエステル誘導体（８）
の調製。 化合物７（２２．０ｇ；０．１０７モル）とｐ−ニトロ
フェノール（１４．９５ｇ）をジクロロメタンに溶解し
た。この溶液を−５℃に冷却し、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（２４．４６ｇ）を添加した。混合物を−５
℃で３０分間撹拌し、室温まで２時間、加温した。混合
物を−５℃に冷却した。沈殿したジシクロヘキシル尿素
を濾過によって除去した。濾液を減圧で蒸発すると、自
然に結晶化する残留物が残った。その固体をジイソプロ
ピルエーテルで粉砕し、濾過し、ジイソプロピルエーテ
ル−酢酸エチル（２：１ｖ／ｖ）で３回洗った後、減圧
で乾燥して、均質な標記化合物を得た（１８．６ｇ）。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．３７ｐｐｍ（ｓ，３
Ｈ，ＣＨ３）；２．８８ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−
ＣＯ−Ｏ−）３．５４ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２
−ＣＯ−　　）３．６２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−ＮＨ−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−）；６．７８ｐｐｍ（ｂｒ　　ｔ，１Ｈ
，−ＮＨ−）；７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，ａｒｏｍ）
；８．３０ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，ａｒｏｍ）５．　　Ｎ−
（Ｓ−アセチル−メルカプトアセチル）−（β−ヒドロ
キシ，β−メチル）−アスパラギン酸（９）の調製。 化合物８（１．０ｇ；３．０７ｍｍｏｌｅｓ）をジメチ
ルホルムアミド（７ｍｌ）に溶解した。β−ヒドロキシ
，β−メチル−アスパラギン酸（０．５ｇ；３．０７ｍ
ｍｏｌｅｓ）をこの溶液に加えた。この撹拌した懸濁液
の中にトリエチルアミン（０．６４ｍｌ；４．５ｍｍｏ
ｌｅｓ）を加えた。２．５時間撹拌を続けた後、清澄な
溶液を得た。その後、溶媒を減圧で蒸発させた。残留物
を水に溶解し、ｐ−ニトロフェノールを除去するために
、水溶液を酢酸エチルで３回洗った。この水溶液に５％
（ｗ／ｗ）二硫酸カリウム水溶液を添加してｐＨ１−２
に酸性化した後、この溶液をジクロロメタン−２−ブタ
ノール（３：２　　ｖ／ｖ）で４回抽出した。合した有
機抽出物を減圧で蒸発させて、シロップとして化合物９
を得た。生成物を溶出液として１−ブタノール−酢酸−
水（４：１：１ｖ／ｖ）を用いて、シリカ（Ｒ）（“Ｍ
ｅｒｃｋ”４０−６３μｍ）のカラムクロマトグラフィ
により精製した。純粋な９を含む分画を合し、減圧で蒸
発させた。残留物を水に溶解した後、生成物を凍結乾燥
により分離した（４５０ｍｇ；４２％）。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，Ｄ６）：１．３０ｐｐｍ（ｓ
，３Ｈ，ＣＨ３）；２．３２ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ
２−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．３７ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ，Ｃ
Ｈ３−ＣＯ−）；３．２４ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−ＮＨ−
ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．５８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，−Ｓ
−ＣＨ２−ＣＯ−）；４．５７ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，−Ｎ
Ｈ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；７．９８ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，−
ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；８．０４ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）。 ６．　　２−（Ｎ−（Ｓ−アセチル−メルカプトアセチ
ル）−β−アラニル）アミノ，３−メチル，無水マレイ
ン酸（１０）の調製 化合物９（０．２８４ｇ）を新しく希釈した無水酢酸（
４．０ｍｌ）に溶解した。溶液を１００℃で１５分間置
いた。引き続いて、溶媒を減圧で蒸発させてシロップを
得た。これをジエチルエーテル−ヘキサン（１：１　　
ｖ／ｖ）と共に撹拌した。溶媒をデカントして除去し、
オイルを減圧で乾燥した（０．２５６ｇ）。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，Ｄ６）；２．０１ｐｐｍ（ｓ
，３Ｈ，ＣＨ３−）；２．３７ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ，ＣＨ
３−ＣＯ）；２．６５ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−ＣＯ）；３．３２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−ＮＨ−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−）；３．５８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−
ＣＨ２−ＣＯ）；８．２２（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２
−）；１０．８ｐｐｍ（非常にブロード　　ｓ，１Ｈ，
−ＮＨ−Ｃ）。 実施例５ 二官能性リンカー試薬（１０）の類似体の調製無水マレ
イン酸系の３位の置換基の点で化合物１０とは異なる二
官能性試薬を下記スキムＶに従って調製した。
【化１１】 これらの合成は、試薬１０について述べられたと同様の
方法で実施した。β−ヒドロキシ、アスパラギン酸誘導
体１２ｂ−ｄを、Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎｅｔａｌ．（Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，１７２６−１７２９
，１９５９）によって述べられた方法に従って、グリシ
ン銅塩と２−オキソプタン酸、２−オキソペンタン酸ま
たは４−メチル，２−オキソペンタン酸より調製した。 β−ヒドロキシアスパラギン酸はＳｉｇｍａ　　Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｐ．より入手した。予め被覆されたシリカゲ
ル６０　　Ｆ２５４（“Ｍｅｒｃｋ”）プレートで溶媒
系として１−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１を用い
て、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を実施した。ＮＭ
ＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ　　２００　　ＭＨｚＦＴ
　　分光計で記録した。化学的シフトを、内部標準とし
てのテトラメチルシランに対するδ値（ｐｐｍ）として
表した。陽イオンＦＡＢ質量スペクトルをＦｉｎｉｇａ
ｍ　　ＭＡＴ９０　　逆相ジオメトリー質量分析計で得
た。 Ａ：２−［Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）
−β−アラニル］アミノ無水マレイン酸（１４ａ）ＳＡ
ＴＡ−β−Ａｌａ−ＯＮｐ８（０．５０ｇ，１．５３ｍ
ｍｏｌｅｓ）及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸（０．
２２８ｇ，１．５３ｍｍｏｌｅｓ）を環境温度で１６時
間、トリエチルアミン（０．４３ｍｌ，３．０６ｍｍｏ
ｌｅｓ）の存在下、ジメチルホルムアミド溶液（４ｍｌ
）中で反応させた。反応生成物を化合物９で述べられた
ように単離精製した。収率は０．２２ｇ（４３％）であ
った。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１８。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ，δ　　ｐｐｍ）：２．
３２（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２−）；２．
３７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＯ−）；３．２５（ｑ，２
Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．５８（ｓ，２Ｈ
，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；４．３７（ｄ，１Ｈ，−Ｃ
ＨＯＨ−ＣＯＯＨ）；４．６６及び４．７１（ｄｄ，ｓ
ｕｍ　　１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；７．９６（
ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；８．８０（ｔ，
１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）。 化合物１３ａ（０．２０６ｇ）を新たに希釈した無水酢
酸（３ｍｌ）に溶解した。この溶液を１００℃で３０分
間放置した。その後、溶媒を減圧で蒸発させてシロップ
を得た。残留する無水酢酸を減圧でトルエンと共蒸留（
３回）して除去した。収率は定量的であった。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ，δ　　ｐｐｍ）；２．
３５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＯ−）；２．７０（ｔ，２
Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ）；３．２７（ｑ，２Ｈ，
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．６６（ｓ，２Ｈ，−
Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；６．７２（ｓ，強度＜１，Ｈ−
Ｃ＝Ｃ−）；８．２３（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−）；９．０（ｂｒ　　ｓ，１Ｈ，−ＮＨ−Ｃ＝Ｃ
−）。 Ｂ：２−［Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）
−β−アラニル］アミノ，３−エチル，無水マレイン酸
（１４ｂ）。 β−ヒドロキシ，β−エチルアスパラギン酸１２ｂ（２
．１７ｇ，１２ｍｍｏｌｅｓ）をジメチルホルムアミド
（１５ｍｌ）に懸濁した。トリエチルアミン（３．４１
ｍｌ，２５ｍｍｏｌｅｓ）を添加し、混合物を１００℃
で５分間加熱して澄明な溶液を得た。溶液を周囲の温度
まで冷却した後、ジメチルホルムアミド中のＳＡＴＡ−
β−Ａｌａ−ＯＮｐ８（４．０ｇ，１２ｍｏｌｅｓ）を
添加した。反応混合物を１６時間撹拌した。カラムクロ
マトグラフィによる分離及び精製は化合物９に対して述
べられたようにして実施して、化合物１３ｂ　　３．９
６ｇ（８９％）を得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３０。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ，δ　　ｐｐｍ）：０．
７４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−）；１．５２（ｑ，
２Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−）；２．３８（ｔ，２Ｈ，−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−ＣＯ）；２．３４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−
ＣＯ−）；３．２３（ｑ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ
２−）；３．５６（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）
；４．８８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；８
．０５（２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ　　及び−ＮＨ
−ＣＨ２−ＣＨ２−）。 アスパラギン酸誘導体１３ｂを１３ａに対して述べられ
たように無水酢酸で処理し、１４ｂを定量的収率で得た
。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ，δ　　ｐｐｍ）：１．
０４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−）；２．４８（ｑ，
２Ｈ２，ＣＨ３−ＣＨ２−）；２．６４（ｔ，２Ｈ，−
ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．３４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ
３−ＣＯ−）；３．２８（ｑ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−
ＣＨ２−）；３．５６（ｓ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ
−）；８．２２（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−
）；１０．５（ｂｒ　　ｓ，−ＮＨ−Ｃ−Ｃ−）。ＦＡ
ＢＭＳ（グリセロール）ｍ／ｚ　　３２９（ＭＨ＋）；
Ｃ１３Ｈ１６Ｏ６Ｎ２Ｓ：３２８．３３。 Ｃ：２−［Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）
−β−アラニル］アミノ，３−ｎ，プロピル、マレイン
酸無水物（１４ｃ） β−ヒドロキシ，β−ｎ−プロピル，アスパラギン酸１
２ｃ（０．２９３ｇ；１．５３ｍｍｏｌｅｓ）とトリエ
チルアミン（０．４３ｍｌ；３．０６ｍｍｏｌｅｓ）を
ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中で加熱して、澄明な
溶液を得た。室温でＳＡＴＡ−β−Ａｌａ−ＯＮｐ（０
．５０ｇ；１．５３ｍｍｏｌｅ）を添加した。混合物を
３時間撹拌した。アスパラギン酸誘導体１３ｃの分雛乃
び精製を、化合物９に対して述べられたように行った。 １３ｃの収率は０．４６ｇ（７９％）であった。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３８。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ　　δ　　ｐｐｍ）：０
．８５（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．
３７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６
７（ｂｒ　　ｔ，２Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−）；
２．２９（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）；２
．３７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＯ）；３．２４（ｑ，２
Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．５７（ｓ，２Ｈ
，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；４．５６（ｄ，１１Ｈｚ，
１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；７．９６（ｄ，１Ｈ
，−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ）；８．０８（ｔ，１Ｈ，−
ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）。 化合物１３ｃ（０．３ｇ）を無水酢酸処理によって環化
及び脱水して、１４ｃを得た（９３％）。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ，δ　　ｐｐｍ）：０．
８５（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．４
６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−）；２．４８
（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−）；２．６３
（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．３４（
ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＯ−）；３．２７（ｑ，２Ｈ，−
ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．５９（ｓ，２Ｈ，−Ｓ
−ＣＨ２−ＣＯ−）；８．２５（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−）；１０．６（ｂｒ　　ｓ，−ＮＨ−Ｃ
＝Ｃ−）。 Ｄ：２−［Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）
−β−アラニル］アミノ，３−イソプチル，無水マレイ
ン酸（１４ｄ） β−ヒドロキシ，β−イソブチル，アスパラギン酸１２
ｄ（０．３１４ｇ；１．５３ｍｍｏｌｅｓ）を述べられ
た方法を用いてＳＡＴＡ−β−Ａｌａ−ＯＮｐ８（０．
５ｇ；１．５３ｍｍｏｌｅｓ）でアシル化して、アスパ
ラギン酸誘導体１３ｂ　　０．４４４ｇ（７４％）得た
。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４４。 ＦＡＢＭＳ（グリセロール）ｍ／ｚ：３９３（ＭＨ＋）
；Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｓ：３９２．４。 １３ｄ（０．４０ｇ）の無水酢酸処理によって、無水マ
レイン酸誘導体１４ｄを９６％の収率で得た（０．３５
ｇ）。 １Ｈ−ＮＭＲ（６ｄ−ＤＭＳＯ，δ　　ｐｐｍ）：０．
８３（ｔ，６Ｈ，（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２−）；１．
７９（ｍ，１Ｈ，（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２−）；２．
６７（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．３
７（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ３−ＣＯ）；３．２７（ｑ，２Ｈ
，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．５７（ｓ，２Ｈ，
−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；８．２０（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ
−ＣＨ２−ＣＨ２）；１０．６（ｂｒ　　ｓ，−ＮＨ−
Ｃ＝Ｃ−）。ＦＡＢＭＳ（グリセロール）ｍ／ｚ　　３
５７（ＭＨ＋）；Ｃ１５Ｈ２０Ｎ２Ｏ６Ｓ：３５６．４
。 Ｅ：Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）β−ア
ラニルー無水アスパラギン酸（１４ｅ）標記化合物は、
マレイン酸二重結合のない二官能性試薬であり、薬物と
タンパク質の間の参照結合（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　　ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を調製するためにデザインされた
ものである。この参照結合は試薬１０と１４ａ−ｄより
得られる不安定なマレアミン酸結合とは反対に、安定な
アミド結合を介する。
【化１２】 Ｌ−アスパラギン酸（０．４０８ｇ，３．０６ｍｍｏｌ
ｅｓ）をジメチルホルムアミド（７ｍｌ）溶液中、トリ
エチルアミン（０．６４ｍｌ；４．６ｍｍｏｌｅｓ）の
存在下、ＳＡＴＡ−β−Ａｌａ−ＯＮｐ８（１．０ｇ；
３．０６ｍｍｏｌｅｓ）でアシル化した。シリカクロマ
トグラフィーによる反応生成物１３ｅの単離及び精製は
化合物９に対して述べられた方法を用いて実施した。Ｓ
ＡＴＡ−β−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨの収率は６１％（０
．５９ｇ）であった。 ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３８。 ＦＡＢＭＳ（グリセロール）ｍ／ｚ　　３２１（ＭＨ＋
）；Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏ７Ｓ：３２０．３。 アスパラギン酸誘導体１３ｅ（０．３４ｇ）を無水酢酸
（５ｍｌ）中で１００℃で６０分間加熱した。溶媒を減
圧で蒸発して除去し、次に減圧でトルエンと共に蒸発（
３回）すると、黄色状シロップとして無水アスパラギン
酸誘導体１４ｅを得た。 ＦＡＢＭＳ（グリセロール）ｍ／ｚ　　３０３（ＭＨ＋
）；Ｃ１１Ｈ１４Ｎ２Ｏ６Ｓ：３２０．３。 実施例６ アドリアマイシンの二官能性リンカー試薬１０による誘
導体化１０（スキムＶＩＩ）
【化１３】 アドリアマイシン塩酸塩（２７５ｍｇ；０．４７ｍｍｏ
ｌｅｓ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ
）　　中に懸濁した。続いて、Ｎ−エチルジイソプロピ
ル−アミン（２４８μｌ；１．４２ｍｍｏｌｅｓ）及び
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ）中の無水
マレイン酸試薬１０（１７９ｍｇ；０．５７ｍｍｏｌｅ
ｓ）の溶液を添加した。２分以内に澄明な溶液を得た。 冷（０℃）酢酸エチル（４０ｍｌ）を撹拌しながら反応
混合物に徐々に加え、生成物が沈澱した。沈澱物を遠心
により分離し、引き続き酢酸エチルで２回洗い最後にジ
エチルエーテルで洗い、乾燥した（３２５ｍｇ；８０％
）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，Ｄ６）は、リンカー構造
体の存在、２つの考えられる異性体構造体が約１：２の
比で存在していることを確認した。 Ｂ：アドリアマイシンの二官能性リンカー試薬１４ａ−
ｅによる誘導体化（スキムＶＩＩ） 上記Ａで述べられた実験条件を用いて、アドリアマイシ
ンを二官能性試薬１４ａ−ｅと反応させて（スキムＶと
ＶＩ）、マレアミン醸二重結合における置換基の異なる
アドリアマイシン−リンカー誘導体を得た。便宜的に、
これらの生成物を以下のように呼称する：Ｈ−リンカー
誘導体（１４ａより得た）、メチル−リンカー誘導体（
１０より得た）、エチル−リンカー誘導体（１４ｂより
得た）、プロピル−リンカー誘導（１４ｃより得た）、
イソブチル−リンカー誘導体（１４ｄより得た）、安定
なリンカー誘導体（１４ｅより得た）。各アドリアマイ
シン−リンカー誘導体は、リンカー試薬の無水物部分の
Ｃ−１もしくはＣ−４カルボニル部位にダウノサミンア
ミノ基が反応した結果、２つの異性体構造体の混合物と
して得られた。アドリアマイシン−リンカー誘導体は１
Ｈ−ＮＭＲ，ＦＡＢＭＳ及び薄層クロマトグフィによっ
て特徴づけられた。分析データを表１にまとめた。
【表１】 実施例７ アドリアマイシン−リンカー誘導体のヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）への結合（スキムＶＩ１）
【化１４】 実施例６で述べられたジメチルホルムアミド（２．０ｍ
ｌ）中のアドリアマイシン−リンカー誘導体（１１９ｍ
ｇ）の溶液を、実施例４Ａで述べられたように調製され
たマレオイル化ＨＳＡ（１３ｍｇ／ｍｌ；ＨＳＡ１モル
当たり１６個のマレイミド基）の溶液（３０ｍｌ）に添
加した。ｐＨ７．０に調整された０．５Ｍヒドロキシル
アミン（１．０４ｍｌ）を撹拌した混合物に加えた。こ
の溶液を室温で１５分間放置した後、４℃で１５時間放
置した。ＨＳＡ−アドリアマイシン結合体の分離は、実
施例４Ｂで述べられたように、セファデックスＬＨ−２
０とセファデックスＧ−５０での連続クロマトグラフィ
によって行なわれた。置換比は最終結合体においてＨＳ
Ａ１モル当たりアドリアマイシン１５．８±０．５モル
であった。この値は、アミノ酸分析によって測定した結
合体中のβ−アラニンの量から算出した。上で述べられ
たような操作方法を用いて、（実施例６Ｂで述べられた
）アドリアマイシンのメチルー、エチルー、プロピルー
、イソブチルー、及び安定な（Ａｓｐ）−リンカー誘導
体を、予めＮ−スクシンイミジルー４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）−シクロヘキサン−１−カルポキシレート（
ＳＭＣＣ）を用いてマレイミド官能基で置換したヒト血
清アルブミンに結合した。表１１は、多数の異なるアド
リアマイシン−リンカー−ＨＳＡ製剤についてのアミノ
酸分析のデータを要約する。このデータは、アドリアマ
イシン−リンカー−誘導体のチオール基とＨＳＡ上のマ
レイミド基の間のカップリング反応がほとんど定量的に
進行することを示している。更にデータは、適用された
クロマトグラフィ法（セファデックスＬＨ一２０及びセ
ファデックスＧ−５０）が、結合体から過剰の非結合性
アドリアマイシン−誘導体を除去するのに効果的である
ことを示している。
【表２】 実施例８ 細胞毒性測定 ヒト卵巣細胞系、Ａ２７８０をＲｏｕｘフラスコ中でメ
ディウム５０５の中で培養した。各実験細胞をトリプシ
ン処理し、最終濃度２×１０４細胞／ｍｌになるように
メディウム中に懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌを
微量滴定プレートの各ウエルにピペットで移した。この
プレートを最大付着を得るために３７℃で１６時間、放
置した。新しいメディウムに１回変えた後、アドリアマ
イシン（ＡＤＲ）の希釈系列と、薬物がメチル−置換マ
レアミド酸構造を通じてタンパク質部分に連結している
ＨＳＡ−ＡＤＲ結合体の希釈系列を細胞に加えた。標準
細胞培養条件下で、３７℃でｐＨ６．０と７．３で１〜
７日間インキューベーションを行なった。インキュベー
ション時間の最後に、ＦＣＳを含まないメディウム中１
ｇ／ｌ　　ＭＴＴの５０μｌを各ウエルに添加し、４時
間インキュベーションを続けた。引き続き、メディウム
を注意深く除去し、プレートをブロット乾燥し、細胞中
に形成されたホルマザン結晶を１００μｌのＤＭＳＯに
溶解した。徹底的に振とうした後、５７０ｎｍの吸光度
をＴｉｔｅｒｔｅｋ　　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎで読み取っ
た。 得られたカーブより各個別実験条件に対するＩＤ５０（
ＩＤ５０＝処理細胞の５０％致死率）を導いた。 この結果を図３に示す。ｐＨ６．０でのＨＳＡ−ＡＤＲ
のＩＤ５０はフリーのＡＤＲをｐＨ６．０で一週間イン
キュベーションした後の値と同じであり、このことは、
この種のｐＨ−不安定リンカーのＴ１／２が２〜３日間
であることを示している。ｐＨ７．５でのＨＳＡ−ＡＤ
ＲのＩＤ５０は０．１４から０．１１μｇ／ｍｌまで変
化する。それはこのｐＨでのＴ１／２が１０日間程度で
あることに相当する。上記で述べられたように同じ様に
して、ＨＳＡ−アドリアマイシン結合体における安定リ
ンカー、水素及びメチル誘導体化リンカーとを試験し比
較した（図４）。ＨＳＡ−アドリアマイシン結合体にお
けるメチル、エチル及びプロピル誘導体化リンカーも試
験し、比較した（図５）。最後に図６において、メチル
及びイソブチルのリンカーの試験及び比較を示す。実施
例９ 本実施例は、非常に高い細胞毒性をもっているトリコテ
セン、マイコトキシン族のメンバーのアングイジン（ａ
ｎｇｕｉｄｉｎｅ）とベルカリンＡについて、本発明の
二官能性試薬の適用を述べる。 Ａ：アングイジンのマレアミド酸誘導体（スキムＩＸ）
３−Ｏ−（α−アミノイソプチリル）アングイジン１６
【化１５】 乾燥ジクロロメタン（１．０ｍｌ）中のアングイジン（
ジアセトキシシルペノール（ｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉ
ｒｐｅｎｏｌ）；７２ｍｇ；０．２ｍｍｏｌｅｓ；ｓｉ
ｇｍａ　　Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｐ．より購入）の溶液中に
連続してＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）α
−アミノイソブチリルフッ化物（Ｂｏｃ−Ａｉｂ−Ｆ；
８０．６ｍｇ；０．４ｍｍｏｌｅｓ；文献の方法に従い
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）α−アミノ
イソ酪酸、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、とフッ化シアヌルよ
り調製：Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　　３２，１３０３０
１３０６，１９９１）、１，５−ジアザビシクロ［４．
３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ，０．２ｍｍｏｌ）と
トリエチルアミン（０．４ｍｍｏｌｅｓ）を添加した。 反応混合溶液を、室温で１時間撹拌し後、溶媒を真空内
で除去した。シリカでのクロマトグラフィ（溶媒システ
ム：ジクロロメタン−メタノール＝９７．５：２．５）
の後タイトル化合物１６を８５％の収率（７７ｍｇ）で
得た。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４１ｐｐｍ（ｄｓ，
６Ｈ，ＣＨ３（Ａｉｂ））；３．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
５Ｈｚ，Ｈ−２）；４．１５（ｄｄ（ＡＢ），２Ｈ，Ｊ
＝１２Ｈｚ，Ｈ−１５）；５．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝
５Ｈｚ，Ｈ−４）；５．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ，
Ｈ−３）。ＦＡＢＭＳ（グリセロール）ｍ／ｚ　　４５
２（ＭＨ＋）；Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ８　　計算値４５１．
２２。 ３−Ｏ−［Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）
−β−アラニル−デハヒドロアスパルチル−アミノイソ
プチリル］アングイジン （３−Ｏ−（Ｓａｔａ−βＡｌａ−デヒドロＡｓｐ−Ａ
ｉｂ）アングイジン１７ａ ジメチルホルムアミド（０．４０ｍｌ）中のＨ−Ａｉｂ
−アングイジン１６（３０ｍｇ；６６μｍｏｌｅｓ）の
溶液に、連続的にＮ，Ｎ−ジイソプロピル，Ｎ−エチル
アミン（１２μｌ，６６μｍｏｌｅｓ）と無水マレイン
酸試薬１４ａ（２０ｍｇ；６６μｍｏｌｅｓ）を添加し
た。混合液を室温で３０分間撹拌し、引き続き、撹拌し
ながら冷ジエチルエーテルをゆっくりと加えた。生成物
１７ａの沈澱物を濾過して集め、ジエチルエーテルで３
回洗い、真空中で乾燥した（３３ｍｇ；６６％）。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．５８（ｄｓ，６Ｈ，
ＣＨ３（Ａｉｂ））；２．４０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｃ
Ｏ−Ｓ−）；３．５４（ｓ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ）
；５．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｈ−４）；５．
７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ｈ−３）；７．０４（ｓ
，１Ｈ，ＨＣ＝Ｃ）。 ＦＡＢＭＳ　　ｍ／ｚ　　７５２（ＭＨ＋）；Ｃ３４Ｈ
４５Ｎ３Ｏ１４Ｓ　　計算値７５１．２６。 ３−Ｏ−［Ｎ−（Ｓ−アセチルーメルカプトアセチル）
−β−アラニル−β−メチル，デヒドロアスパルチル−
アミノイソプチリルアングイジン（３−Ｏ−（Ｓａｔａ
−βＡｌａ−β−ＣＨ３，デヒドロＡｓｐ−Ａｉｂ）ア
ングイジン）１７ｂ ジクロロメタン（１．０ｍｌ）中のＨ−Ａｉｂ−アング
イジン１６（２８ｍｇ；６２μｍｏｌｅｓ）の溶液に、
連続的にＮ，Ｎ−ジイソプロピル，Ｎ−エチルアミン（
１１μｌ；６２μｍｏｌｅｓ）と無水マレイン酸試薬１
０（２０ｍｇ；６６μｍｏｌｅｓ）を添加した。混合液
は３０分間、室温で撹拌した。粗反応生成物をシリカで
のクロマトクプラフィで精製し（溶媒システム：ジクロ
ロメタン−メタノール−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル，Ｎ−
エチルアミン（８０：２０：２）、タイトル化合物１７
ｂを得た。（１６．１ｍｇ；３５％）。 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３８（ｓ，３Ｈ，Ｃ
Ｈ３（Ａｉｂ））；１．４１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３（Ａｉ
ｂ））；１．４８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｃ＝Ｃ）；２．
３７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−ＣＯ−Ｓ−）；３．５８（ｓ
，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−）；５．１５（ｄｄ，１Ｈ
，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｈ−４）；５．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３
Ｈｚ，Ｈ−３）。 Ｂ：ベルカリンＡのマレアミド酸誘導体（スキムＸ）ト
リコテセン、ベルカリンＡは大環状環構造の２位に単一
の水酸基を含んでいる。アングイジンに対しＡで述べら
れた反応条件を用いて、ベルカリンＡをＢｏｃ−Ａｉｂ
−Ｆ１５と反応させ、２′−Ｏ−（α−アミノイソブチ
リル）−誘導体１８（２７ｍｇ；シリカによるクロマト
グラフィの後の収率９３％）。引き続き、誘導体１８を
無水マレイン酸試薬１０あるいは１４ａでアシル化し、
マレアミド酸誘導体１９ａ（Ｈ−リンカー誘導体）と１
９ｂ（メチル−リンカー誘導体）を各々、得た。両方の
化合物は、溶媒系にジクロロメタン−メタノールーＮ，
Ｎ−ジイソプロピル，Ｎ−エチルアミン（９０：１０：
１；ｖ／ｖ）を用いたシリカによるクロマトグラフィに
より精製した。収率：１９ａ　　８８％（２８ｍｇ）；
１９ｂ　　６２％（１７ｍｇ）。
【化１６】
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）アドリアマイシンの２−Ｎ−（Ｓ−ベン
ゾイルメルカプトアセチル）アミノ，３−メチル，マレ
アミド酸誘導体が、Ｃ−１又はＣ−４アミド結合（該当
部位をアドリアマイシン誘導体の構造式中に示す）のど
ちらかを含有する、二つの可能性のある異性体構造の約
１：１混合物である事を示すＨＰＬＣクロマトグラフ。 （Ｂ）培養基のｐＨが一層酸性になるにつれ、アドリア
マイシン放出速度が増加する事を示す本発明のマレアミ
ド酸結合の酸に対する感度を示すグラフ。
【図２】ｐＨ６．５と７．０でのメチル置換マレアミド
酸誘導体からのアドリアマイシン放出の異なる速度を示
す、一連のＨＰＬＣクロマトグラフ。このグラフにより
二つの異性体構造がほぼ等しい加水分解感度を有する事
も分る。原データであるこれ等グラフは、図１のＢのグ
ラフを構成するのに使用した。
【図３】アドリアマイシン（ＡＤＲ）とＨＳＡ−ＡＤＲ
結合体の、ヒト卵巣細胞における細胞毒性の変化を示す
グラフ。
【図４】ＨＳＡ−アドリアマイシン結合体の安定、水素
及びメチル誘導体化リンカーの不安定性を示すグラフ。
【図５】ＨＳＡ−アドリアマイシン結合体のメチル、エ
チル及びプロピル誘導体化リンカーの不安定性を示すグ
ラフ。
【図６】メチル及びイソブチル誘導体化リンカーの不安
定性を示すグラフ。

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　式 【化１】 （式中、Ｒ１はＨ、低級アルキル、−Ｎ−低級アルキル
    、−Ｏ−低級アルキル、−Ｓ−低級アルキル、−Ｎ−低
    級アラルキル、−Ｏ−低級アラルキル、−Ｓ−低級アラ
    ルキル、−Ｎ−低級アルキレン、−Ｏ−低級アルキレン
    、−Ｓ−低級アルキレン、−Ｎ−低級アリール、−Ｏ−
    低級アリール、−Ｓ−低級アリールを示し、Ｒ２はＨ、
    低級アルキル、低級アラルキル、低級アリールを示し、
    Ｒ３は−（Ｃ＝Ｏ）−，−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−，−Ｓ−（
    Ｃ＝Ｏ）−，−Ｏ−（Ｃ＝Ｓ）−，−Ｓ−（Ｃ＝Ｓ）−
    ，−Ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−，−Ｎ−（Ｃ＝Ｓ）−、又は窒素
    の孤立電子対の電子を非局在化させ得るその他の化学構
    造であり、Ｒ４は、担体分子、蛋白質性物質、抗体（フ
    ラグメント）、ポリマー又は核酸にＲ３を連結させるこ
    とができる懸垂反応基である。）で表される化合物。
  2. 【請求項２】　　蛋白質性物質、担体、ポリマー又は核
    酸と、親核性反応基を有する活性物質とを連結させる方
    法であって、上記請求項１記載の化合物を使用する事を
    特徴とする該方法。
  3. 【請求項３】　　一般式 【化２】 （式中、Ｒ１とＲ２は請求項１の定義通りであり、Ｒ５
    はアシル化活性物質であり、Ｒ６は、請求項１で定義し
    たＲ３が、蛋白質性物質、抗体又はそのフラグメント、
    担体、ポリマー、又は核酸と結合したものである。）で
    表される、蛋白質性物質、担体、ポリマー又は核酸と親
    核性反応基を有する活性物質との加水分解に不安定な結
    合体。
  4. 【請求項４】　　一般式 【化３】 （式中、Ｒ１とＲ２は請求項１の定義通りであり、Ｒ５
    はアシル化活性物質であり、Ｒ６は、請求項１で定義し
    たＲ３が、蛋白質性物質、抗体又はそのフラグメント、
    担体、ポリマー、又は核酸と結合したものである。）で
    表される、蛋白質性物質、担体、抗体又はそのフラグメ
    ント、ポリマー、又は核酸と親核性反応基を有する活性
    物質との加水分解に不安定な結合体。
  5. 【請求項５】　　Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり
    、Ｒ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求項１の
    定義通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りである、請
    求項１，３及び４のいずれか一項に記載の化合物又は結
    合体。
  6. 【請求項６】　　Ｒ１がエチルであり、Ｒ２がＨであり
    、Ｒ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求項１の
    定義通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りである、請
    求項１，３及び４のいずれか一項に記載の化合物又は結
    合体。
  7. 【請求項７】　　Ｒ１がイソプロピルであり、Ｒ２がＨ
    であり、Ｒ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求
    項１の定義通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りであ
    る、請求項１，３及び４のいずれか一項に記載の化合物
    又は結合体。
  8. 【請求項８】　　Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ
    ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求項１の定義
    通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りである、請求項
    １，３及び４のいずれか一項に記載の化合物又は結合体
    。
  9. 【請求項９】　　Ｒ１がイソブチルであり、Ｒ２がＨで
    あり、Ｒ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求項
    １の定義通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りである
    、請求項１，３及び４のいずれか一項に記載の化合物又
    は結合体。
  10. 【請求項１０】　　Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであ
    り、Ｒ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求項１
    の定義通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りである、
    請求項１，３及び４のいずれか一項に記載の化合物又は
    結合体。
  11. 【請求項１１】　　Ｒ１がＨであり、Ｒ２がエチルであ
    り、Ｒ３が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４であり、Ｒ４が請求項１
    の定義通りであり、Ｒ６が請求項３の定義通りである、
    請求項１，３及び４のいずれか一項に記載の化合物又は
    結合体。
  12. 【請求項１２】　　前記担体が血清アルブミンである、
    請求項１及び３〜１１のいずれか一項に記載の結合体。
  13. 【請求項１３】　　前記担体がヒト血清アルブミンであ
    る、請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載の結合
    体。
  14. 【請求項１４】　　前記活性物質が細胞毒素剤である、
    請求項１及び３〜１３のいずれか一項に記載の結合体。
  15. 【請求項１５】　　前記活性物質がアドリアマイシンで
    ある、請求項１及び３〜１４のいずれか一項に記載の結
    合体。
  16. 【請求項１６】　　前記活性物質がアングイジンである
    、請求項１及び３〜１４のいずれか一項に記載の結合体
    。
  17. 【請求項１７】　　前記活性物質がベルカリンＡである
    、請求項１及び３〜１４のいずれか一項に記載の結合体
    。
  18. 【請求項１８】　　請求項１又は請求項３〜１７のいず
    れか一項に記載の化合物あるいは結合体を含む医薬組成
    物。
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