NO180417B - Syrelabile linkermolekyler - Google Patents

Syrelabile linkermolekyler Download PDF

Info

Publication number
NO180417B
NO180417B NO920040A NO920040A NO180417B NO 180417 B NO180417 B NO 180417B NO 920040 A NO920040 A NO 920040A NO 920040 A NO920040 A NO 920040A NO 180417 B NO180417 B NO 180417B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
compound
acid
ppm
conjugate according
substance
Prior art date
Application number
NO920040A
Other languages
English (en)
Other versions
NO920040L (no
NO180417C (no
NO920040D0 (no
Inventor
Petrus Johannes Boon
Franciscus Michael Kaspersen
Ebo Sybren Bos
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of NO920040D0 publication Critical patent/NO920040D0/no
Publication of NO920040L publication Critical patent/NO920040L/no
Publication of NO180417B publication Critical patent/NO180417B/no
Publication of NO180417C publication Critical patent/NO180417C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/60—Two oxygen atoms, e.g. succinic anhydride
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Mushroom Cultivation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Denne oppfinnelse vedrører forbindelser som kan anvendes på området immunterapi av kreft, anvendelse av forbindelsene for sammenbinding av en proteinholdig substans, en bærer, en polymer eller en nukleinsyre og en aktiv substans som har en nukloefil reaktiv gruppe, et hydrolytisk labilt konjugat av en proteinholdig substans og en aktiv substans som har en nukleofil reaktiv gruppe, et hydrolytisk labilt konjugat av en proteinholdig substsans, en bærer, et antistoff eller et fragment derav, en polymer eller en nukleinsyre og en aktiv substans som har en nukleofil reaktiv gruppe.
Dette innebærer nærmere bestemt immunokonjugater av en cytotoksisk gruppe med en målsøkende gruppe, særlig immunokonjugater av antistoffer eller fragmenter eller funksjonelle derivater av antistoffer koblet til en cytotoksisk substans såsom legemidler, toksiner eller radioisotoper. Den muliggjør spesielt frigjøring av substanser bundet til en målsøkende gruppe ved anvendelse av syrespaltbare linkermolekyler.
Immunoterapi er allerede en ofte foreslått behandlings-måte innenfor feltet kreftterapi. Med den målsøkende mulighet til antistoffer eller elementer av et spesifikt bindingspar kan det oppnås en mye mere presis lokalisering av de aktive forbindelser, samtidig som den samlete dose av den aktive forbindelse kan senkes, slik at de generelle skadelige virkninger reduseres. I tidlige forsøk er (monoklonale) antistoffer eller andre målsøkende grupper direkte blitt tilsatt radioaktive elementer såsom<67>Ga, 131J, 99mTc,<11:L>In eller andre isotoper (f.eks. Marchalonis J.J., Biochem. J. 113, 299-305, 1969) . I et senere stadium er det oppnådd kobling av isotoper til antistoffer ved anvendelse av chelateringsmidler såsom EDTA (Krejcarek og Tucker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 77, 581-585, 1977) eller DTPA (US 4454106).
Anvendelse av medikamenter eller toksiner er også blitt foreslått. Koblingen av medikamenter eller toksiner til antistoffet eller til en bærer tilsatt ett eller flere antistoffer må gjennomføres ved et sammenkoblingsmiddel, selvom det også er mulig å lage rekombinante fusjonsproteiner av toksiner og/eller bærere og den målsøkende gruppe.
Koblingsmidler er vel kjente, og et betydelig område av disse reagenser er tilgjengelige. I bred forstand omfatter et koblingsreagens to eller flere reaktive•funksjonelle grupper kovalent koblet sammen, såsom karbohydroksy-, amino-, tio-eller sulfhydrylgrupper. Den kovalente binding mellom de to funksjonelle grupper kan være direkte, men i mange tilfeller er de reaktive funksjonelle grupper adskilt ved kovalent binding til henholdsvis en brodannende gruppe eller en spacer. De reaktive funksjonelle grupper kan være de samme eller forskjellige. Forskjellige grupper vil måtte foretrekkes fordi de tillater en mere kontrollert kobling.
Linkerens kjemiske struktur bestemmer den aktive for-bindelsens evne til frigjøring og til å uttrykke sin aktivitet på målstedet. Til å begynne med ble det anvendt peptidlinker-strukturer som var tilbøyelige til spalting av lysosomale enzymer (Trouet et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 79, 626-629,1982). Denne tilnærming krever internalisering av konjugatene etter binding til målcellen. I målcellen vil de lysosomale enzymer frigjøre den aktive forbindelse fra det målsøkende molekyl.
En annen utvikling er en linkerstruktur basert på akonitinsyre, for å knytte til seg aminogruppeholdige medikamenter ved en syrelabil amidbinding (Shen og Ryser, Biochem. Biophys. Res. Comm. 102, 1048-1054, 1981). Her igjen vil en effektiv frigjøring av medikamentet kreve transport av konjugatene til intracellulære, sure organeller såsom endo-somer og lysosomer (De Duve et al., Eur. J. Biochem. 13 7, 391-397, 1983).
Det samme gjelder for US-patent 4 618 492 som beskriver anvendelse av aminosulfhydryl-linkerreagenser kjennetegnet ved evne til å hydrolysere i svakt sure løsninger.
For anvendelse av en slik linker må konjugatet inter-naliseres. Bare en mindre del av de antistoffer som produseres mot tumorassosierte antigener er imidlertid istand til å fremkalle internalisering av immunkomplekset, og således av den tilknyttete aktive forbindelse. Dette er spesielt riktig når størrelsen av konjugatet blir øket ved tilstedeværelse av en bærer. Denne manglende evne til å fremkalle internalisering er en vesentlig ulempe ved anvendelse av immunokonjugater innenfor området kreftterapi.
Ifølge oppfinnelsen er det funnet en gruppe av sammen-kobl ingsreagenser som tillater kontrollert frigjøring av biologisk aktive substanser under nøytrale (også ment å innbefatte fysiologisk pH) eller svakt sure betingelser. Disse linkere tillater frigjøring av den cytotoksiske substans i umiddelbar nærhet av målet, og unngår derved nødvendigheten av internalisering av de målsøkende grupper, selvom linkerne ifølge oppfinnelsen også er egnet for internalisering av målsøkende grupper.
Vanligvis vil disse sammenkoblingsreagenser omfatte aminomaleinsyrederivater:
hvori
RI = H eller laverealkyl,
R2 = H,
R3er
og R. er eji tilknyttet reaktiv gruppe valgt blandt
der m=0eller 1, n=0-3, 0=0 eller
1, og
Rg = laverealkyl eller fenyl,
istand til å binde R^ til en proteinholdig substans eller et
antistoff (fragment).
Et annet aspekt omfatter, som innledningsvis nevnt, konjugatet:
hvori
RI og R2 er som definert i krav 1,
R5 = den acylerte aktive substans og
R6 = R3 som definert i krav 1, koblet med en proteinholdig substans, et antistoff eller et fragment derav.
Videre er konjugater omfattende følgende forbindelser med formel:
hvor R1#R2, R5og R6er som definert ovenfor, gjenstand for oppfinnelsen.
Blandinger av konjugater som beskrevet ovenfor er også innbefattet.
Fordelen ved oppfinnelsen ligger i det faktum at de ovenfor beskrevne forbindelser kan hydrolyseres ved nøytrale eller svært svakt sure pH-verdier. Fordi det er et nøytralt eller svakt surt miljø i tumorvev, vil dette muliggjøre spalting av konjugatene i den umiddelbare nærhet av tumor-cellene, og derved unngå nødvendigheten av internalisering av konjugatet. Dette betyr at konjugatene kan fremstilles ikke bare med antistoffer, men med en hvilken som helst målsøkende gruppe som er istand til å gjenkjenne spesifikke markører på de celler eller strukturer som konjugatene tar sikte på. Det er således mulig å anvende nukleinsyrer, bærermolekyler, proteinholdige substanser, polymerer eller en hvilken som helst slags komponent med spesifikke bindingspar.
Et annet terapeutisk område for disse konjugater er derfor dreping av en spesielle cellepopulasjon, f.eks. T-celler ved autoimmune sykdommer.
En annen fordel ved frigjøring av de aktive forbindelser i det umiddelbare miljø omkring målcellen er at forbindelsene også kan virke på nærliggende ondartete celler, på hvilke gjenkjenningssetet for den målsøkende gruppe ikke er tilstede.
Ytterligere en annen fordel ved linkermolekyler ligger i det faktum at sensitiviteten for (sur) spalting kan forandres ved å variere størrelsen og/eller karakteren av substituentene i R1og/eller R2i aminomalein-syregruppen. Generelt kan det sies at jo mere voluminøse substituentene er, jo mere labilt vil konjugatet være. Denne egenskap gir mulighet for å skreddersy konjugatene til spesifikke krav. Først og fremst er det mulig å ta hensyn til den tid som er nødvendig for at den målsøkende gruppe skal finne frem til målcellene samt til oppholdstiden ved nevnte celler.
For det andre kan det på denne måte oppnås en kontrollert frigjøring av den aktive forbindelse som kan tilpasses til a) målcellenes spesifikke miljø, b) saneringshastigheten for de ubundne konjugater og c) den type av aktiv forbindelse som anvendes. Dette siste punkt er spesielt nyttig når det vites at størrelsen av og pKa for de aktive forbindelser som skal anvendes, kan forandre tilbøyeligheten til avspalting fra konjugatene. Det er derfor mulig å fremskaffe et konjugat som vil frigjøre en hvilken som helst spesiell aktiv forbindelse i det ønskete pH-området.
Konjugatets stabilitet i vanlig serum (pH 7,4) er slik at avspalting av linkeren foregår med en Tl/2 på flere dager, slik at ikke-bundete konjugater er blitt fjernet fra serum før det er blitt dannet en skadelig mengde av de cytotoksiske forbindelser. De ovenfor beskrevne linkerforbindelser er nyttige for tverrbinding av molekyler, såsom proteiner, f.eks. antistoffer eller antistoff-fragmenter eller funksjonelle derivater av antistoffer, eller andre elementer med spesifikke bindingspar, såsom ligander eller peptidhormoner, eller reseptorbindingsfragmenter eller derivater derav, spesielt for celleoverflatereseptorer,- til effektormolekyler såsom cytotoksiske medikamenter, toksiner, metalloproteiner, kjelater med (radioaktive) metaller, eller til andre proteiner, karbohydrater, nukleinsyrer eller andre biologisk aktive molekyler, for å danne konjugater for anvendelse i diagnose eller terapi in vivo eller in vitro.
Den foretrukne målsøkende gruppe er et molekyl som er spesifikt for en tumorcelle, såsom antistoffer eller antistoffragmenter målrettet mot antigener såsom CEA, AFP, BFP, hCG, £2-mikroglobulin eller andre tumormarkører, eller målrettet mot antigener eller antistoffer beslektet med virus som HBsAg, HBeAg, anti-HBs, NANBV, retrovirus som HTLV eller FeLV.
Den foretrukne aktive substans som skal avgis er et cytotoksisk medikament. Spesielt foretrukket er den aktive substans et medikament som har en kjemisk gruppe som kan acyleres, f.eks. en amin-, hydrazid-, fenolisk hydroksy-, tio-eller merkaptogruppe, såsom adriamycin, daunomycin, mitomycin C, verrucarin A eller andre trichotekener, metotreksat, 5-fluoruracil eller derivater, cytarabin, pentostatin, vinkristin eller andre vinca-alkaloider, etoposid, teniposid, daktinomycin, mitoksantron, bleomycin eller en. hvilken som helst annen cytotoksisk substans.
For et gitt konjugat vil en fagmann på dette området anerkjenne at det kan gjøres et estimat av frigjørings-hastigheter for medikamentet og utbytte av fritt medikament på målstedet for et område av pH og temperaturbetingelser som påtreffes in vivo. På denne basis kan det foretas en beregning av den mengde konjugat som er nødvendig for en vesentlig cytotoksisk virkning på målcellene.
Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved følgende eksempler:
Eksempel 1
Fremstilling av et bifunksjonelt linkerreagens
Et bifunksjonelt reagens som tjener til innføring av en labil aminomaleinsyrestruktur ble fremstilt som beskrevet i skj erna 1. 1. Fremstilling av N-suksinimidyl, S-benzoylmerkaptoacetat lii 1. S-benzoylmerkaptoeddiksyre (4,6 g; 23,4 mmol) fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet av R.F. Schneider et al. (J. Nucl. Medicine 25, 223-229, 1984), og N-hydroksysucinimid (2,7 g; 23,4mmol) ble løst i diklormetan (50 ml). Løsningen ble avkjølt ved -10°C, hvoretter dicykloheksylkarbodiimid (4,86 g,- 23,6 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved -10°C i 1 time og deretter holdt ved 4°C i 16 timer. Utfelt dicykloheksylurea ble frafiltrert, og filtratet inndampet in vacuo. Den faste rest ble gnidd ut med etylacetat-eter (1:1), filtrert, vasket med eter og deretter tørket in vacuo til å gi tittelforbindelsen 1 (4,0 g,- 13,6 mmol;
58%) .
"'"H-NMR (d6DMS0) :
2,82 ppm (S, 4H, -CO-CH2-CH2-CO-):
4,45 ppm (S, 2H, -S-CH2-C0-);
7,6-8,0 ppm (m, 5H, arom.).
2. Fremstilling av S-hydroksy, S-metyl-asparaginsyre ( 2) Forbindelse 2 ble fremstilt av pyrodruesyre og kopperglycinat ifølge fremgangsmåten beskrevet av L. Benoiton et al. (J. Am. Chem. Soc. 81, 1726-1729, 1959).
3_. Fremstilling av N- (S-benzoylmerkaptoacetyl) -S-hydroksy,
S-metyl-asparaginsyre (3)
3. Forbindelse 1 (0,58 g; 2,0 mmol) ble løst i dimetylformamid (DMF) (5,0 ml). 2-hydroksy, S-metyl-asparaginsyre (0,32 g,- 2 mmol) og trietylamin (0,28 ml) ble deretter tilsatt til DMF-løsningen. En klar blanding ble oppnådd i løpet av 15 minutter. Blandingen ble omrørt i 5 timer. Et par dråper eddiksyre ble tilsatt, og
løsningsmiddelet ble fjernet in vacuo. Resten ble løst i vandig kaliumhydrogensulfatløsning (2% w/w, (10 ml). Produktet ble deretter ekstrahert fra den vandige løsning med sec-butanol-diklormetan (2:3, v/v; 3 ganger, 10 ml hver).
Den organiske fase hie vasket én gang med mettet natriumkloridløsning og tørket over natriumsulfat. Løsningsmidlene ble fjernet in vacuo, og resten ble renset ved kromatografi på silika-60 (Merck, 40-63 ptm) ved anvendelse av løsningsmiddelsysternet butanol-1-eddiksyre-vann (4:1:1; v/v) til å gi forbindelsen 3 (0,44 g; 64%) .
"^H-NMR (CD30D) : 1,38 ppm (s, CH3) og 1,50 ppm (s, CH3) (forholdet erytro:treo « 1:1; sum:3H)
3,88-4,00 (ppm (m, 1H, -NH-CH-CO-) 4,87 ppm (s, 2H, -S-CH2-C0-);
7,48-8,02 (m, 5H, arom.).
4. Fremstilling av 2-N-(S-benzoylmerkaptoacetyl)amino, 3-metyl-maleinsyreanhydrid (4)
4. Asparaginsyrederivatet 3 (0,20 g; 0,58 mmol) ble løst i eddiksyreanhydrid (2,0 ml). Løsningen ble holdt ved 100°C i 20 minutter. Deretter ble løsningsmiddelet fordampet in vacuo for å gi en fast rest, som ble gnidd ut med eter-heksan (1:1, v/v), frafiltrert og tørket in vacuo for å gi den rene tittelforbindelse 4 (0,092 g, 52%) .
^"H-NMR (CCD13) : 2,23 ppm (s, 3H, CR^) , 3,89 ppm (s, 2H, -S-CH2-CO-); 7,46-8,05
(m, 5H, arom.)
8,75 ppm (br.s, 1H, NH).
Eksempel 2
Derivatisering av adriamycin med det bifunksjonelle linkerreagens 4. (Skjema II).
Adriamycin.HC1 (66 mg; 0,11 mmol) ble slemmet opp i DMF (1,0 ml). Maleinsyreanhydridderivatet 4 (39 mg; 0,13 mmol) og etyldiisopropylamin (63 0,36 mmol) ble tilsatt i rekke-følge. En klar løsning ble oppnådd i løpet av 5 minutter. TLC (silika,- Merck) i løsningsmiddelsystemet diklormetan-metanol-vann-trietylamin (70:30:5:0,1; v/v) viste fullstendig omdanning av adriamycin. Reaksjonsblandingen ble tilsatt dråpevis til kald etylacetat (30 ml) under omrøring, hvoretter produktene falt ut. Bunnfallet ble isolert ved sentrifugering og deretter vasket tre ganger med etylacetat og til slutt med eter og tørket (56 mg; 58%).
<1>H-NMR (DMSO, D<6>) bekreftet tilstedeværelsen av linker-strukturen og indikerte at de to mulige isomere strukturer, produkter av omsetningen av adriamycinamin-funksjonen i enten 1 4 C eller C karbonylposxsjonen i maleinsyreanhydridreagenset (se skjema II) må være tilstede i omtrent like store mengder.
De to isomere produkter ble klart atskilt under hplc-analyse på en Bondapak-Cl8-kolonne (se fig. IA): med isokratisk eluering ved anvendelse av løsningsmiddelsystemet A:B = 92:8 v/v, hvor A = metanol-vann (3:2, v/v), inneholdende 0,3% (w/v) ammoniumacetat, og B = metanol, ved en strøm på 1,0 ml/min og påvisning ved 254 nm.
Eksempel 3
pH-avhengig frigjøring av adriamycin fra dets linkerderivat
Frigjøringshastigheten for adriamycin fra linkerderivatet ble studert ved forskjellige pH-verdier i området fra 5,0 til 7,5. En stokkløsning (10 mg/ml) av forbindelsen beskrevet i eksempel 2 ble fremstilt. Alikvoter av denne løsning ble for-tynnet med 50 mM natriumfosfatbuffer med en pH på henholdsvis 5,0, 6,0, 6,5, 7,0 og 7,5, til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml. På forskjellige tidspunkter, opptil 24 timer, ble prøver underkastet hplc-analyse. Eksempler på slike analyser, ved pH 6,5 og 7,0, er gitt i fig. 2.
Som vist i fig. IB er frigjøringshastigheten for adriamycin pH-avhengig, idet den er syrekatalysert. Ut i fra fig. 2 kan det også sluttes at følsomheten for hydrolyse er kvalitativt lik for begge isomere linkerderivater. Det fremgår også at kvantitativ frigjøring av adriamycin fra linkerderivatene blir oppnådd med tiden.
Eksempel 4
Konjugering av adriamycinlinkerderivatet med humant serumalbumin (HSA) (skjema III).
A: Maleoylering av HSA
En friskt fremstilt løsning av N-suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)cykloheksan-l-karboksylat (SMCC) (2,0 mg) i DMF (0,4 ml) ble tilsatt til en omrørt løsning (2,0 ml) av HSA (10 mg/ml) i 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5.
Blandingen ble omrørt i 3 0 minutter og deretter filtrert gjennom en kolonne av Sephadex G-25 (PD-10) , som var ekvilibrert og eluert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5. Proteinkonsentrasjonen (7,3 mg/ml) av HSA-fraksjonen ble bestemt ved metoden til Lowry.
Konsentrasjonen av maleimidogrupper ble bestemt ved omsetning av disse funksjoner med et kjent overskudd av cysteamin og påfølgende spektrofotometrisk bestemmelse av den mengde cysteamin som var tilbake etter omsetning med 2,2'-ditiodipyridin ifølge fremgangsmåten til D.R. Grassetti et al., Arch. Biochem. Biophys. 119, 41-49, 1967.
B. Konjugerin<g>av adriamycinderivat til HSA
En løsning av adriamycinlinkerderivat (1,5 mg) beskrevet i eksempel 2 i dimetylformamid (0,5 ml) ble tilsatt til 1,3 ml av det maleoylerte HSA, oppnådd som beskrevet under A. 0,5 M hydroksylamin (0,072 ml), buffret ved pH 7,0, ble tilsatt til den omrørte blanding. Løsningen ble holdt ved romtemperatur i 15 minutter og deretter i 15 timer ved 4°C.
En 20 mM løsning av cysteamin (0,10 ml) buffret ved pH 7,5, ble tilsatt. Etter 15 minutter ble løsningen påsatt på en Sephadex LH-20-kolonne, ekvilibrert og eluert med 50 mM natriumfosfatbuffer-DMF (2:1; v/v), ved pH 7,5. Det proteinholdige eluat ble oppsamlet og filtrert gjennom en kolonne av Sephadex G-25, som var eluert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5. Mengden av HSA ble bestemt ved Lowry-metoden. Mengden av adriamycin bundet til HSA ble bestemt spektrofotometrisk. (SM4g7= 9000). Substitusjonsforholdet ble funnet å være 3,7 mol adriamycin pr. mol HSA.
Eksempel 5
Fremstilling av et bifunksjonelt linkerreagens
Et bifunksjonelt reagens, som atskiller seg fra forbindelse 4 (skjema I) ved substitusjon av merkaptobenzoyl- for merkaptoacetylfunksjonen, ble fremstilt som beskrevet i skjema IV. 1. Fremstilling av S-acetyl-merkaptoeddiksyre (5) Acetylklorid (175 ml) ble langsomt tilsatt til merkaptoeddiksyre (100 ml) . Blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløpstemperatur i 1 time. Påfølgende destillasjon in vacuo ga den rene tittelforbindelse (84,1 g).
^H-NMR (CDC13): 2,41 ppm (s, 3H); 3,74 ppm (s, 2H).
2. Fremstilling av N-suksinimidyl-S-acetylmerkaptoacetat 6. Forbindelse 5 (84 g; 0,62 mol) og N-hydroksy-suksinimid (72 g; 0,62 mol) ble løst i diklormetan (600 ml). Løsningen ble avkjølt til 0°C, hvoretter dicykloheksylkarbodiimid (129,8 g; 0,627 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time og i ytterligere 2 0 timer ved romtemperatur. Etter avkjøling av blandingen
ved 0°C ble bunnfallet av dicykloheksylurea frafiltrert. Filtratet ble inndampet in vacuo for å etterlate en fast rest. Produktet ble gnidd ut med propanol-2 (400 ml) ved 0°C og deretter isolert ved filtrering. Krystallinsk 6. ble oppnådd i 92,5% utbytte (134,2 g).
■*"H-NMR (CDC13) : 2,43 ppm (s, 3H) ; 2,85 ppm (s, 4H) , 3,98 ppm (s, 2H). ;3_. Fremstilling av N- (S-acetylmerkaptoacetyl) -S-alanin 7 ;Til en løsning av E-alanin (24,36 g; 0,27 mol) i vann (300 ml), ble tilsatt en 20% (v/v) løsning av etyldiisopropylamin i dimetylformamid inntil pH var 8,5. Etter fortynning av blandingen med dimetylformamid (100 ml) ble det tilsatt en løsning av forbindelse 6 (60 g; ;0,20 mol) i dimetylformamid (200 ml) langsomt (30 min) til den omrørte reaksjonsblanding, mens løsningens pH ble holdt på 6,5 til 7,0 ved samtidig tilsetning av etyldiisopropylamin (20% v/v i DMF). Blandingen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur. Løsningens pH ble justert til 1-2 ved tilsetning av 5% (w/w) vandig kaliumhydrogensulfitt, hvorpå produktet ble ekstrahert ;med diklormetari-butanol-2 (3:2, v/v; 4 ganger 250 ml). De sammenslåtte organiske sjikt ble vasket to ganger med en mettet natriumkloridløsning og deretter med vann. Løsningsmidlene ble fjernet ved fordampning in vacuo. Resten ble løst i diklormetan. Løsningen ble tørket over natriumsulfat. Etter fjerning av uorganiske salter ved filtrering ble løsningsmiddelet fordampet in vacuo for å gi tittelforbindelsen som et fast stoff (53,8 g) ;bestående av en omtrent l:l-blanding av tittelforbindelsen 7 (0,19 mol; 74%) og dimetylformamid. ;<X>H-NMR (CDC13): 2,40 ppm (s, 3H); 2,56 ppm (t, 2H; ;-CH2-CO-0); 3,50 ppm (q, 2H; -NH-CH2-CH2-); 3,58 ppm (s, 2H; -S-CH2-CO); 7,01 ppm (bred t, 1H; -NH-CH2-). ;4. Fremstilling av p-nitrofenylesterderivatet av N-(S-acetylmerkaptoacetyl)-E-alanin 8;Forbindelse 7 (22,0 g; 0,107 mol) og p-nitrofenol (14,95 g) ble løst i diklormetan. Løsningen ble avkjølt ved -5°C, hvoretter dicykloheksylkarbodiimid (24,46 g) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved -5°C i 30 minutter, og fikk deretter varme seg opp til romtemperatur i 2 timer. Blandingen ble avkjølt til -5°C. Utfelt dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble inndampet in vacuo for å etterlate en rest som spontant krystalliserte. Det faste stoff ble gnidd ut med diisoprophleter, filtrert, vasket tre ganger med diiso-propyleter-etylacetat (2:1 v/v) og deretter tørket in vacuo for å gi den homogene tittelforbindelse (18,6 g). ■"■H-NMR (CDC13) : 2,37 ppm (s, 3H, CH3>; 2,86 ppm (t, 2H, -CH2-C0-0); 3,54 ppm (s, 2H, -S-CH2-CO-); 3,62 ppm (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 6,78 ppm (bred t, 1H, -NH-); 7,33 ppm (d, 2H, arom); 8,30 ppm (d, 2H, arom). 5. Fremstilling av N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-S-hydroksy,fi-me tyl) -asparaginsyre 9. ;Forbindelse 8. (1,0 g; 3,07 mmol) ble løst i dimetylformamid (7 ml). S-hydroksy,S-metyl-asparaginsyre (0,5 g,-3,07 mmol) ble tilsatt til løsningen. Trietylamin (0,64 ml; 4,5 mmol) ble tilsatt til den omrørte oppslemming. Omrøringen ble fortsatt i 2,5 timer, hvoretter det ble oppnådd en klar løsning. Løsningsmiddelet ble deretter fordampet in vacuo. Resten ble løst i vann, og den vandige løsning ble deretter ekstrahert tre ganger med etylacetat for å fjerne p-nitrofenolen. Etter surgjøring av den vandige løsning til pH 1-2 ved tilsetning av 5% ;(w/w) vandig kaliumhydrogensulfat, ble løsningen ekstrahert fire ganger med diklormetan-butanol-2 (3:2; ;v/v) . De samlete organiske ekstrakter ble inndampet in vacuo for å gi forbindelse 9. som er sirup. Produktet ble renset ved kolonnekromatografi på silika (R) ("Merck" 40-63/xm) ved anvendelse av butanol-l-eddiksyre-vann (4:1:1; ;v/v) som elueringsmiddel. Fraksjoner inneholdende ren 9 ble slått sammen og inndampet in vacuo. Resten ble løst i vann, hvoretter produktet ble isolert ved lyofilisering (450 mg, 42%). ;^•H-NMR (DMSO, D<6>): 1,30 ppm (s, 3H, CH3); 2,32 ppm (t, 2H, -CH2-CH2-C0-) ; 2,37 ppm (s, 3H, CH-^-CO-); 3,24 ppm (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,58 ppm (s, 2H, -S-CH2-C0-); 4,57 ppm (d, 1H, -NH-CH-COOH); 7,98 ppm (d, 1H, -NH-CH-COOH); 8,04 ppm (t, 1H, -NH-CH2-CH2-) . ;6. Fremstilling a 2-(N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-S-alanyl) amino-3 -metyl-maleinsyreanhydrid 10 ;Forbindelse 9 (0,284 g) ble løst i friskt destillert eddiksyreanhydrid (4,0 ml). Løsningen ble holdt ved 100°C i 15 minutter. Deretter ble løsningsmiddelet fordampet in vacuo for å gi en sirup som ble omrørt med dietyleter-heksan (1:1; v/v) . Løsningsmidlene ble fjernet ved dekan-tering, hvoretter oljen ble tørket in vacuo (0,256 g). ;<1>H-NMR (DMSO,D<6>): 2,01 ppm (s, 3H, CH3~); 2,37 ppm (s, 3H, CH3-CO); 2,65 ppm (t, 2H, -CH2-CH2-CO); 3,32 ppm (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,58 ppm (s, 2H, -S-CH2-CO); 8,22 (t, 1H, -NH-CH2-); 10,8 ppm (svært bred s, 1H, -NH-C). ;Eksempel 6;7. Fremstilling av analoger av det bifunksjonelle linkerreagens 10 ;Bifunksjonelle reagenser som atskiller seg fra forbindelse 10 i substituenten i 3-stilling i maleinsyreanhydrid-systemet ble fremstilt som vist i skjema V. ;Disse synteser ble utført på en måte analog med den som er beskrevet for reagens 10.. ;S-hydroksy-asparaginsyre-derivatene 12b- d ble fremstilt fra henholdsvis kopperglycinat og 2-oksobutan-syre, 2-oksopentansyre og 4-metyl-2-oksopentansyre, ifølge fremgangsmåten beskrevet av L. Benoiton et al. (J. Am. Chem. Soc, 81, 1726-1729, 1959). S-hydroksy-asparaginsyre ble levert fra Sigma Chem. Comp. ;Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble gjennomført på på forhånd belagte plater av silikagel 60 F254 ("Merck") ved anvendelse av løsningsmiddelsystemet butanol-1:eddiksyre:vann = 4:1:1. NMR-spektra ble registrert på et Bruker 200 MHz FT-spektrometer. Kjemiske skift er gjengitt som 6-verdier (parts per million) i forhold til tetrametylsilan som en indre standard. Positivt ion FAB massespektra ble oppnådd ved anvendelse av et Finigan MAT 90 revers geometri massespektrometer. ; A: 2- [N- (S-acetyl-merkaptoacetyl) -S-alanyl] -aminomaleinsyre-anhydrid 14a ;SATA-S-Ala-ONP 8 (0,50 g, 1,53 mmol) og S-hydroksyasparaginsyre (0,228 g, 1,53 mmol) fikk reagere i dimetylformamidløsning (4 ml) i nærvær av trietylamin (0,43 ml, 3,06 mmol) i 16 timer ved omgivende temperatur. Omsetningsproduktet 13a ble isolert og renset som beskrevet for forbindelse 9. Utbyttet var 0,22 g (43%). TLC: Rf = 0,18. ;^■H-NMR (<6>d-DMSO, 6 i ppm): 2,32 (t, 2H, -CH2-CH2-CO-) ; 2,37 (s, 3H, CH3-CO-); 3,25 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,58 (S, 2H, -S-CH2-CO-); 4,37 (d, 1H, -CHOH-COOH); 4,66 og 4,71 (dd, sum 1H, -NH-CH-COOH); 7,96 (d, 1H, -NH-CH-COOH); 8,80 (t, 1H,-NH-CH2-CH2-). ;Forbindelse 13a (0,206 g) ble løst i friskt destillert eddiksyreanhydrid (3 ml). Løsningen ble holdt ved 100°C i 30 minutter. Løsningsmiddelet ble så fordampet in vacuo for å gi en sirup. Eddiksyreanhydrid-resten ble fjernet ved samfordampning (3 ganger) med toluen in vacuo. Utbyttet var kvantitativt. ;<1>H-NMR (<6>d-DMSO, 6 i ppm): 2,35 (s, 3H, CH3-CO-); 2,70 (t, 2H, -CH2-CH2-CO); 3,27 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,66 (s, 2H, -S-CH2-CO-); 6,72 (s, intensitet <1, H-C=C-); 8,23 (t, 1H, -NH-CH2-CH2-); 9,0 (br s, 1H, -NH-C=C-). ;B. 2-[N-(S-acetylmerkaptoacetyl)-S-alanyl]amino-3-etyl-maleinsyreanhydrid 14b ;S-hydroksy-S-etylasparaginsyre 12b (2,17 g, 12 mmol) ble slemmet opp i dimetylformamid (15 ml). Trietylamin (3,41 ml, 25 mmol) ble tilsatt, hvoretter blandingen ble oppvarmet ved 100°C i 5 minutter for å oppnå en klar løsning. ;Løsningen ble avkjølt til omgivende temperatur, hvoretter SATA-fi-Ala-ONP 8 (4,0 g, 12 mmol) i dimetyl formamid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer. Isolering og rensing ved kolonnekromatografi ble utført som beskrevet for forbindelse 9. for å gi 3,96 g (89%) av 13b. TLC: Rf=0,30. ;"*"H-NMR (<6>d-DMSO, 6 i ppm): 0,74(t, 3H, CH3-CH2-); 1,52 (g, 2H, CH3-CH2-); 2,38 (t, 2H, -CH2-CH2-CO-); 2,34 (s, 3H, CH3-C0-); 3,23 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,56 (s, 2H, -S-CH2-C0-); 4,88 (d, 1H, -NH-CH-COOH); 8,05 (2H, -NH-CH-COOH) og -NH-CH2-C<H>2<->).
Asparaginsyrederivatet13b ble behandlet med eddiksyreanhydrid som beskrevet for 13a for å gi 14b i kvantitativt utbytte.
<1>H-NMR (<6>d-DMSO, <5 i ppm): 1,04 (t, 3H, CH3-CH2-); 2,48 (q, 2H, CH3-CH2-); 2,64 (t, 2H, -CH2-CH2-CO-); 2,34 )s, 3H, CH3-CO-); 3,28 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-) ; 3,56 (s, 2H, -S-CH2-CO-); 8,22 (t, 1H, -NH-CH2-CH2-); 10,5 (br S, -NH-C=C-).
FABS (glycerol) m/z 329 (M<H+>)<;><C>13<H>16O<gN>2<S>krever 328,33.
C. 2- [N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-S-alanyl]amino-3-n-propyl-maleinsyreanhydrid 14c
S-hydroksy-S-n-propyl-asparaginsyre 12c (0,293 g;
1,53 mmol) og trietylamin (0,43 ml; 3,06 mmol) ble oppvarmet i dimetylf ormamid (2 ml) inntil det var oppnådd en klar løsning. Ved romtemperatur ble tilsatt SATA-S-Ala-ONp 8 (0,50 g; 1,53 mmol). Blandingen ble omrørt i 3 timer. Isolering og rensing av asparaginsyrederivat 13c ble gjort som beskrevet for forbindelse 9. Utbyttet av 13c var 0,46 g (79%). TLC: Rf = 0,38.
<1>H-NMR (<6>d-DMSO, 6 i ppm): 0,85 (t, 3H, CH3-CH2-CH2-);
1,37 (m, 2H, CH3-CH2-CH2-); 1,67 (br t, 2H, CH3-CH2-CH2-); 2,29 (t, 2H, -CH2-CH2-CO-); 2,37 (s, 3H, CH3-C0-); 3,24 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,57 (s, 2H; -S-CH2-CO-) ; 4,56 (d, 11Hz, 1H, -NH-CH-COOH) ; 7,96 (d, 1H, -NH-CH-COOH); 8,08 (t, 1H, -NH-CH2-CH2-).
Forbindelse 13c (0,3 g) ble cyklisert og dehydrert ved eddiksyreanhydrid-behandling til å gi 14c (93%).
<1>H-NMR (<6>d-DMSO, 6 i ppm): 0,85 (t, 3H, CH3-CH2-CH2-);
1,46 (m, 2H, CH3-CH ); ^4g (^ ^ CH CH CH } . 2,63 (t, 2H, -CH2-^2-c6-); 2'34 (S' 3H' CH3"C°-)'- 27 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,57 (s, 2H, -S-CH2-CO-); 8,25 (t, 1H, NH-CH2-CH2-); 10,6 (br s, -NH-C=C-).
D: 2-[N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-fi-alanyl]amino-3-isobutyl-maleinsyreanhydrid 14d
S-hydroksy-S-isobutyl-asparaginsyre 12d (0,314 g;
1,53 mmol) ble acylert med SATA-S-Ala-ONp 8 (0,5 g; 1,53 mmol) ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet ovenfor til å gi 0,444 g (74%) av asparaginsyrederivatet 13d. TLC: Rf = 0,44.
FABS (glycerol) m/z: 393 (MH<+>); C15H24N208S krever 392,4.
Eddiksyreanhydrid-behandling av 13d (0,40 g) ga maleinsyreanhydrid-derivatet 14d i 96% utbytte (0,35 g) .
<1>H-NMR (<6>d-DMSO, 6 i ppm): 0,83 (t, 6H, (CH3)2CH-CH2-);
1,79 (m, 1H, (CH3)2CH-CH2-); 2,67 (t, 2H, -CH2-CH2-CO-); 2,37 (s, 3H, CH3-C0-); 3,27 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-); 3,57 (S, 2H, -S-CH2-CO-); 8,20 (t, 1H, -NH-CH2-CH2-); 10,6 (br S, -NH-C=C-).
FABS (glycerol) m/z 357 (M<H+>)<;><C>15<H>20<N>2<O>gS krever 356,4.
E: N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-S-alanyl-asparaginsyre-anhydrid 14e
Tittelforbindelsen er et bifunksjonelt reagens som mangler maleinsyredobbeltbindingen og er utformet for å tillate fremstilling av referansekonjugater mellom medikament og protein, hvori bindingen er ved en stabil amidbinding, i motsetning til de labile amino-maleinsyre- bindinger som oppnås med reagensene 10. og I4a- d.
L-asparaginsyre (0,408 g; 3,06 mmol) ble acylert i dimetylformamidløsning (7 ml) med SATA-S-Ala-ONp 8. (1,0 g; 3,06 mmol) i nærvær av trietylamin (0,64 ml; 4,6 mmol). Isolering og rensing av reaksjonsproduktet 13e ved silika-kromatografi ble utført som beskrevet for forbindelse 9.. Utbyttet av SATA-S-Ala-Asp-OH var 61% (0,59 g). TLC: Rf = 0,38
FABMS (glycerol) m/z 321 (MH+) ; C^H^N^S krever 320,3.
Asparaginsyrederivatet 13e (0,34 g) ble oppvarmet i eddiksyreanhydrid (5 ml) ved 100°C i 60 minutter. Løsnings-midler ble fjernet ved fordampning in vacuo, etterfulgt av samfordampning in vacuo ved toluen (tre ganger), for å gi asparaginsyreanhydridderivatet 14e som en gulaktig sirup.
FABMS (glycerol) m/z 303 (M<H+>)<;><C>11H14N2°6<S>krever 302,3.
Eksempel 7
Derivatisering av adriamycin med det bifunksjonelle linkerreagens 10 (Skjema VII)
Adriamycin.HC1 (275 mg; 0,47 mmol) ble slemmet opp i N,N-dimetylformamid (2,0 ml). N-etyl-diisopropylamin (248 fil; 1,42 mmol) og en løsning av maleinsyreanhydrid-reagenset 10. (179 mg; 0,57 mmol) i N,N-dimetylformamid (1,0 ml) ble tilsatt i rekkefølge. En klar løsning ble oppnådd i løpet av 2 minutter. Kald (0°C) etylacetat (40 ml) ble langsomt tilsatt til reaksjonsblandingen under omrøring, hvoretter produktet falt ut. Bunnfallet ble isolert ved sentrifugering og deretter vasket to ganger med etylacetat og til slutt med dietyleter og tørket (325 mg; 80%).
<1>H-NMR (DMSO, D<6>) bekreftet tilstedeværelsen av linker-strukturen, idet de to mulige isomere strukturer var tilstede i et forhold på ca. 1:2:
B. Derivatisering av adriamycin med de bifunksjonelle linker-reagenser 14a- e (skjema VII).
Ved anvendelse av de eksperimentelle betingelser beskrevet ovenfor under A, ble adriamycin omsatt med de bifunksjonelle reagenser I4a- e (skjema V og VI) for å gi adriamycinlinker-derivater som atskiller seg fra hverandre ved substituenten i aminomaleinsyredobbeltbindingen.
For letthets skyld vil disse produkter bli referert til som: H-linkerderivat (oppnådd gjennom 14a), metyl-linkerderivatet (oppnådd gjennom 10.) , etyl-linkerderivat et (oppnådd gjennom 14b), propyl-linkerderivatet (oppnådd gjennom 14c), isobutyl-linkerderivatet (oppnådd gjennom 14d), stabilt linkerderivat (oppnådd gjennom 14e).
Adriamycin-linkerderivatene ble i hvert tilfelle oppnådd som en blanding av to isomere strukturer, resultatet av omsetningen av daunosamin-aminogruppen enten i C-l- eller C-4-karbonylposisjonen i anhydriddelen av linkerreagensene.
Adriamycin-linkerderivatene blekarakterisert ved^"H-NMR, FABMS og tynnsjiktkromatografi. Analytiske data er sammenstilt i tabell I.
Eksempel 8
Konjugering av adriamycin-linkerderivåtet med humant serumalbumin (ESA) (Skjema VIII)
En løsning av adriamycin-linkerderivat (119 mg), beskrevet i eksempel 6, i dimetylformamid (2,0 ml) ble tilsatt til en løsning (30 ml) av maleoylert HSA (13 mg/ml; 16 maleimidgrupper pr. mol HSA), fremstilt som beskrevet i eksempel 4A. 0,5 M hydroksylamin (1,04 ml), buffret ved pH 7,0, ble tilsatt til den omrørte blanding.
Løsningen ble holdt ved romtemperatur i 15 minutter og deretter i 15 timer ved 4°C.
Isolering av HSA-adriamycin-konjugatet ble utført ved suksessiv kromatografi på Sephadex LH-20 og på Sephadex G-50, som beskrevet i eksempel 4B. Substitusjonsforholdet ble funnet å være 15,8 ± 0,5 mol adriamycin pr. mol HSA, i slutt-konjugatet. Tallet er basert på mengden av S-alanin i konjugatet som bestemt ved aminosyreanalyse.
Ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrevet ovenfor ble H-, metyl-, etyl-, propyl-, isobutyl- og de stabile (Asp) linkerderivatene av adriamycin (beskrevet i eksempel 6B) konjugert til humant serumalbumin, som tidligere var substituert med maleimid-funksjonene ved anvendelse av N-suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-cykloheksan-l-karboksylat
(SMCC) .
Tabell II sammenfatter data fra aminosyreanalyser av et antall forskjellige adriamycin-linker-HSA-preparater. Disse data angir at koblingsreaksjonene mellom tiolgruppen i adriamycin-linkerderivatene og maleimidgruppene på HSA foregår på tilnærmet kvantitativ måte. Disse data angir dessuten at de anvendte kromatografiske metoder (Sephadex LH-20 og Sephadex G-50) var effektive til å fjerne overskuddet av ubundete adriamycin-derivater fra konjugatene.
Eksempel 9
Cytotoksisitetsbestemmelse
En human ovariecellelinje, A2780, ^ e ^yrket i Roux~flasker i Medium 505. For hvert eksperiment ble cellene trypsinisert og oppslemmet i medium til en sluttkonsentrasjon på 2 x 10<4>celler pr. ml. 100 fil av celleoppslemmingen ble pipettert i hver av brønnene i en mikrotitreringsplate, og platene ble etterlatt i 16 timer ved 37°C for å oppnå maksimal vedhefting. Etter én utveksling av friskt medium ble det tilsatt en fortynningsserie av adriamycin (ADR) og HSA-ADR-konjugat, hvori medikamentet var bundet til proteingruppen via den metyl-substituerte aminomaleinsyrestrukturen til cellene. Inkuberingen ble gjennomført i 1-7 dager ved pH 6,0 og 7,3 ved 37°C under standard cellekulturbetingelser. Ved slutten av inkuberingsperioden ble det tilsatt 50fxg av 1 g/l MTT i mediet uten FCS til hver brønn, og inkuberingen ble fortsatt i 4 timer. Deretter ble mediet forsiktig fjernet, platene ble blottet tørre, og formazankrystallene dannet i cellene ble løst i 100/xl DMSO. Etter kraftig rysting ble absorbansen ved 570 nm avlest i en Titertek Multiskan. Ut i fra de oppnådde kurver ble utledet ID5Q,s(ID50= 50% dødelighet av de behandlete celler) for de enkelte eksperimentelle betingelser. Resultatene er vist i fig. 3.
ID50for HSA-ADR ved pH 6,0 er identisk med den for fri ADR etter 1 ukes inkubering ved pH 6,0, hvilket angir en Tl/2 på 2-3 døgn for denne type av pH-labil linker. ID50for HSA-ADR ved pH 7,5 forandres fra 0,14 til 0,11 [ xg/ ml. Det tilsvarer en Tl/2 på ca. 10 dager ved denne pH.
På samme måte som beskrevet ovenfor ble det stabile linker HSA-adriamycin-konjugat testet og sammenliknet med den hydrogen- og den metylderivatiserte linker (fig. 4). Også testet og sammenliknet ble de metyl-, etyl- og propyl-derivatiserte linkere i HSA-adriamycin-konjugatene (fig. 5).
Endelig er vist testingen og sammenlikningen av metyl- og isobutyl-linkerne i fig. 6.
Eksempel 10
Dette eksempel beskriver anvendelsen av bifunksjonelle reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelse på anguidin og verrucarin A, medlemmer av familien av trikotekener,
mykotoksiner med ekstremt høy cytotoksisitet.
A: Aminomaleinsyrederivater av anguidin (skjema IX) 3-0-(a-amino i sobutyry1)anguidin 16
Til en løsning av anguidin (diacetoksycirpenol; 72 mg;0,2 mmol; levert av Sigma Chem. Comp.) i tørr diklormetan (1,0 ml) ble tilsatt i rekkefølge N-(tert-butyloksykarbonyl)- a-aminoisobutyryl-fluorid (Boc-Aib-F; 80,6 mg; 0,4 mmol; fremstilt av N-(tert-butyloksykarbonyl)-a-aminoisosmørsyre,Boc-Aib-OH, og cyanurfluorid ifølge en litteraturmetode: Tet. Letters 32, 1303-1306, 1991), 1,5-diazabicyklo[4.3.0]non-5-en (DBN, 0,2 mmol) og trietylamin (0,4 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved omgivende temperatur, hvorpå løsnings-middelet ble fjernet in vacuo. Tittelforbindelsen 16 ble oppnådd i 85% utbytte (77 mg) etter kromatografi på silika (løsningsmiddelsystem: diklormetan-metanol = 97,5:2,5).
^"H-NMR (CDC13) : 1,41 ppm (s, 6H, CH3 (Aib) ) ; 3,90 (d, 1H, J=5 Hz, H-2); 4,15 (dd (AB), 2H, J=12 Hz, H-15); 5,13 (dd, 1H, J=5 Hz, H-4) ; 5,79 (d, 1H, J=3 Hz, H-3). FABMS (glycerol) m/z452 (MH+) ; C^H^NOg krever 451,22.
3-0-[N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-S-alanyl-dehydro-aspartyl-aminoisobutyryl]anguidin-(3-0-(Sata-SAla-dehydroAsp-Aib)-anguidin) 17a
Til en løsning av H-Aib-anguidin 16 (30 mg; 66 iimol) i dimetylformamid (0,40 ml) ble tilsatt i rekkefølge N,N-diisopropyl, N-etylamin (12 fj. 1, 66 iimol) og maleinsyre-anhydr id-reagens 14a (20 mg; 66 iimol) . Blandingen ble omrørt ved omgivende temperatur i 30 minutter og deretter tilsatt langsom til kald dietyleter under omrøring. Bunnfallet av produktet 17a ble oppsamlet ved filtrering, vasket tre ganger med dietyleter og tørket in vacuo (33 mg; 66%).
<1>H-NMR (CDC13): 1,58 (ds, 6H, CH3(Aib)); 2,40 (s, 3H, CH3-C0-S-); 3,54 (s, 2H, CO-CH2-S-); 5,16 (dd, 1H, J=5Hz, H-4); 5,75 (d, 1H, J=3 Hz, H-3); 7,04 (s, 1H, HC=C).
FABMS m/z 752 (MH+) ; C-..H. ,_N_0.. S krever 751,26. ' 34 45 3 14
3-0-[N-(S-acetyl-merkaptoacetyl)-fi-alanyl-fi-metyl-dehydroAspartyl-aminoisobutyryl] anguidin- (3-0- (Sata-SAla-fi-CH3,dehydroAsp-Aib)anguidin) 17b
Til en løsning av H-Aib-anguidin 16 (28 mg,- 62 iimol) i diklormetan (1,0 ml) ble tilsatt i rekkefølge N,N-diisopropyl, N-etylamin (11//l; 62 iimol) og maleinsyreanhydrid-reagens 10.
(20 mg; 66 iimol) . Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved omgivende temperatur.
De rå reaksjonsprodukt ble renset ved kromatografi på silika (løsningsmiddelsystem: diklormetan-metanol-N,N-diisopropyl,N-etylamin (80:20:2)) til å gi tittelforbindelsen 17b (16,1 mg; 35%) .
■"■H-NMR (CDC13) :1,38 (s, 3H, CH3 (Aib) ) ; 1,41 (s, 3H, CH3(Aib)); 1,48 (s, 3H, CH3-C=C); 2,37 (s, 3H, CH3-C0-S-); 3,58 (s, 2H, S-CH2-C0-); 5,15 (dd, 1H, J=5 Hz, H-4); 5,76 (d, 1H, J=3 Hz, H-3) .
B. Aminomaleinsyre-derivater av verrucarin A (skjema X)
Trikotekenet verrucarin A inneholder en enkelt hydroksylfunksjon i 2'-stillingen på den makrocykliske ringstruktur. Ved anvendelse av reaksjonsbetingelsene beskrevet under A for anguidin ble verrucarin A omsatt med Boc-Aib-F 15. til å gi 2 '-0-(a-aminoisobutyryl)-derivatet 18.
(27 mg; 93% utbytte etter kromatografi på silika). Derivat 18 ble deretter acylert med maleinsyreanhydrid-reagensene 10 eller 14a til å gi aminomaleinsyre-derivatene henholdsvis 19a (H-linkerderivat) og 19b (metyl-linkerderivat).
Begge forbindelser ble renset ved kromatografi på silika i løsningsmiddelsystemet diklormetan-metanol-N,N-diisopropyl,N-etylamin (90:10:1; v/v). Utbytte: 19a, 88% (28 mg); 19b, 62% (17 mg).
Forklaringer til figurene
Fig. IA er et HPLC kromatogram som viser at 2-N-(S-benzoylmerkaptoacetyl)amino-3-metyl-aminomaleinsyre-derivatene av adriamycin er en ca. l:l-blanding av de to mulige isomere strukturer, inneholdende enten en C-l eller en C-4amidbinding (posisjonene er angitt i strukturformelen for adriamycin-
derivatet).
Fig. IB viser i diagramform syresensitiviteten for aminomaleinsyre-bindingene ifølge oppfinnelsen, angitt ved den økte frigjøringshastighet for adriamycin ettersom inkuberings-mediets pH blir surere. Fig. 2 gjengir en serie HPLC kromatogrammer som viser de forskjellige frigjøringshastigheter for adriamycin fra et metylsubstituert aminomaleinsyrederivat ved pH 6,5 og 7,0. Diagrammene angir også at de to isomere strukturer har en omtrent like stor sensitivitet overfor hydrolyse. Disse diagrammer som representerer rådata ble anvendt til å konstruere diagrammet i fig. IB.
Fig. 3-6 er beskrevet i eksempel 8.

Claims (16)

1 . Forbindelse karakterisert ved formelen:
hvori RI = H eller laverealkyl, R2 = H, R3 er og R4 er en tilknyttet reaktiv gruppe valgt blandt
der m=0 eller 1, n=0-3, o=0 eller 1, og R6 = laverealkyl eller fenyl, istand til å binde R3 til en proteinholdig substans eller et antistoff (fragment).
2. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 for sammenbinding av en proteinholdig substans, en bærer, en polymer eller en nukleinsyre og en aktiv substans som har en nukleofil reaktiv gruppe.
3. Hydrolytisk labilt konjugat av en proteinholdig substans og en aktiv substans som har en nukleofil reaktiv gruppe karakterisert ved den generelle formel:
hvori RI og R2 er som definert i krav 1, R5 = den acylerte aktive substans og R6 = R3 som definert i krav 1, koblet med en proteinholdig substans, et antistoff eller et fragment derav.
4. Hydrolytisk labilt konjugat av en proteinholdig substans, en bærer, et antistoff eller et fragment derav, en polymer eller en nukleinsyre og en aktiv substans som har en nukleofil reaktiv gruppe karakterisert ved den generelle formel:
hvori RI og R2 er som definert i krav l, R5 = den acylerte aktive substans og R6 = R3, som definert i krav 1, koblet med en proteinholdig substans, et antistoff eller et fragment derav.
5. Forbindelse eller konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1, 3 og 4, karakterisert ved at RI = metyl, R2 = H
R4 er som definert i krav 1 og R6 er som definert i krav 3.
6. Forbindelse eller konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1, 3 og 4, karakterisert ved at RI = etyl, R2 = H,
R4 er som definert i krav 1 og Rg er som definert i krav 3.
7. Forbindelse eller konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1, 3 og 4, karakterisert ved at RI = isopropyl, R2 = H, ]
R4 er som definert i krav 1 og Rg er som definert i krav 3.
8. Forbindelse eller konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1, 3 og 4, karakterisert ved at RI = H, R2 = H,
R4 er som definert i krav 1 og Rc er som definert i krav 3.
9. Forbindelse eller konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1, 3 og 4, karakterisert ved at RI = isobutyl, R2 = H,
R4 er som definert i krav 1 og Rg er som definert i krav 3.
10. Konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 3-9, karakterisert ved at bæreren er et serumalbumin.
11. Konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 3-10, karakterisert ved at bæreren er humant serumalbumin.
12. Konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 3-11, karakterisert ved at den aktive substans er et cytotoksisk middel.
13. Konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 3-12, karakterisert ved at den aktive substans er adriamycin.
14. Konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 3-12, karakterisert ved at den aktive substans er anguidin.
15. Konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 3-12, karakterisert ved at den aktive substans er verrucarin A.
16. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den inneholder en forbindelse eller konjugat ifølge hvilket som helst av kravene 3-15 .
NO920040A 1990-12-31 1992-01-02 Syrelabile linkermolekyler NO180417C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90203526 1990-12-31

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO920040D0 NO920040D0 (no) 1992-01-02
NO920040L NO920040L (no) 1992-07-01
NO180417B true NO180417B (no) 1997-01-06
NO180417C NO180417C (no) 1997-04-16

Family

ID=8205218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO920040A NO180417C (no) 1990-12-31 1992-01-02 Syrelabile linkermolekyler

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5306809A (no)
EP (1) EP0495265B1 (no)
JP (1) JPH04334377A (no)
KR (1) KR920012063A (no)
AT (1) ATE109476T1 (no)
AU (1) AU646121B2 (no)
CA (1) CA2058595A1 (no)
DE (1) DE69103255T2 (no)
DK (1) DK0495265T3 (no)
ES (1) ES2061166T3 (no)
FI (1) FI101678B1 (no)
HU (1) HUT60484A (no)
IE (1) IE65406B1 (no)
NO (1) NO180417C (no)
NZ (1) NZ241217A (no)
PT (1) PT99954B (no)
ZA (1) ZA9110203B (no)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5505931A (en) * 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
EP0638583A1 (en) * 1993-08-13 1995-02-15 Hoechst Aktiengesellschaft Aminosugar active substances, a process for their preparation and use as pharmaceuticals
DE4433890C2 (de) * 1994-09-22 1999-02-18 Deutsches Krebsforsch Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
EP0871490B1 (en) * 1995-12-22 2003-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
DE19636889A1 (de) 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
US6030997A (en) * 1998-01-21 2000-02-29 Eilat; Eran Acid labile prodrugs
US6800616B2 (en) 1998-02-26 2004-10-05 Supergen, Inc. Treatment of HIV infections
CA2248592A1 (en) 1998-08-31 2000-02-29 Christopher D. Batich Microspheres for use in the treatment of cancer
US6140015A (en) * 1998-12-10 2000-10-31 International Business Machines Corporation Photoresist compositions with pendant polar-functionalized aromatic groups and acid-labile branching
TWI242000B (en) * 1998-12-10 2005-10-21 Univ Southern California Reversible aqueous pH sensitive lipidizing reagents, compositions and methods of use
AU766256B2 (en) * 1999-03-11 2003-10-09 Ardenia Investments Ltd. New compounds for the treatment of cancer
US6706892B1 (en) * 1999-09-07 2004-03-16 Conjuchem, Inc. Pulmonary delivery for bioconjugation
BRPI0003386B8 (pt) * 2000-08-08 2021-05-25 Cristalia Produtos Quim Farmaceuticos Ltda pró-droga homo ou heterodiméricas úteis no tratamento de doenças ou disfunções mediadas por fosfodiesterases; composições farmacêuticas contendo a pró-droga ou seus sais farmacêuticos aceitáveis; processo de obtenção destas pró-drogas
MXPA03003401A (es) * 2000-10-16 2004-06-30 Neopharm Inc Formulacion liposomica de mitoxantrona.
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
ATE446317T1 (de) 2001-05-11 2009-11-15 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Spezifische bindungsproteine und ihre verwendung
GB0116143D0 (en) * 2001-07-02 2001-08-22 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Chemical capture reagent
KR100507968B1 (ko) * 2001-08-18 2005-08-17 한국과학기술연구원 자기집합체를 형성하는 항암제-키토산 복합체 및 그의제조방법
WO2003051113A1 (en) * 2001-12-14 2003-06-26 The University Of Wyoming Methods and compositions for controlled release of drugs
US8361464B2 (en) 2002-03-01 2013-01-29 Immunomedics, Inc. Anthracycline-Antibody Conjugates for Cancer Therapy
WO2003075847A2 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Emory University NOVEL CURCUMINOID-FACTOR VIIa CONSTRUCTS AS SUPPRESSORS OF TUMOR GROWTH AND ANGIOGENESIS
US20050069551A1 (en) * 2002-03-08 2005-03-31 Emory University Cytotoxic compound-protein conjugates as suppressors of tumor growth and angiogenesis
EP1506218B1 (en) * 2002-05-24 2017-04-12 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Reversible modification of membrane interaction
CN1733314A (zh) * 2004-08-11 2006-02-15 张阳德 半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒的制备方法
US20060135459A1 (en) * 2004-11-09 2006-06-22 Epstein Alan L Targeted innate immunity
EP1838736B1 (en) 2005-01-05 2013-03-06 Biogen Idec MA Inc. Cripto binding molecules
WO2008057298A2 (en) 2006-10-27 2008-05-15 Wei-Chiang Shen Lipidized interferon and uses thereof
WO2008091701A2 (en) * 2007-01-25 2008-07-31 Dana-Farber Cancer Institute Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
JP5618549B2 (ja) * 2007-03-15 2014-11-05 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサーリサーチ リミテッド Ｅｇｆｒ抗体及びｓｒｃ阻害剤を用いる治療方法及び関連製剤
JP5532486B2 (ja) 2007-08-14 2014-06-25 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途
WO2010011684A2 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Prodrug and fluoregenic compositions and methods for using the same
WO2010106700A1 (ja) * 2009-03-17 2010-09-23 国立大学法人東京大学 タンパク質の電荷調節剤、及びタンパク質内包高分子ミセル複合体
US8535948B2 (en) * 2009-03-26 2013-09-17 Institute For Systems Biology Method to determine protein interaction sites
CA2766409C (en) 2009-07-03 2023-04-25 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
US20110076232A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
KR101961495B1 (ko) 2009-12-23 2019-03-22 아비펩 피티와이 리미티트 면역-컨쥬게이트 및 그 제조방법 ２
CA2803646A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Angiochem Inc. Short and d-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof
WO2013012733A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
JP6244301B2 (ja) 2011-08-18 2017-12-06 アフィニティ バイオサイエンス ピーティーワイ リミテッド 可溶性ポリペプチド
SI2802606T1 (en) 2012-01-10 2018-08-31 Biogen Ma Inc. Improves the transfer of healing molecules through the hematoencephalic barrier
GB201202268D0 (en) 2012-02-09 2012-03-28 Medical Res Council Intracellular immunity
WO2014057436A2 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
CA2895284A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 Immunomedics, Inc. Pro-drug form (p2pdox) of the highly potent 2-pyrrolinodoxorubicin conjugated to antibodies for targeted therapy of cancer
WO2014141094A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
EP3104857A4 (en) 2014-02-14 2017-10-11 The Regents of The University of California Cyclic peroxides as prodrugs for selective delivery of agents
WO2016051389A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Enhanced loading of intact, bacterially derived vesicles with small molecule compounds
DK3331902T3 (da) 2015-08-07 2021-07-26 Alx Oncology Inc Konstruktioner med et sirp-alpha-domæne eller en variant deraf
EA034582B1 (ru) 2015-08-07 2020-02-21 АЭлЭкс ОНКОЛОДЖИ ИНК. Конструкции варианта sirp-альфа и их применение
PT3380495T (pt) 2015-11-24 2021-08-19 Transfert Plus Sec Compostos peptídicos e conjugados peptídicos para o tratamento de cancro através de quimioterapia mediada por recetores
US10800817B2 (en) 2016-12-19 2020-10-13 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release
US10040831B2 (en) 2016-12-19 2018-08-07 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release
US11613564B2 (en) 2019-05-31 2023-03-28 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer
US11180534B1 (en) 2021-06-04 2021-11-23 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for treating SARS-CoV-2 infections
US20230277682A1 (en) * 2022-01-14 2023-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verrucarin a derivatives and antibody drug conjugates thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4631190A (en) * 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4542225A (en) * 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4744981A (en) * 1985-10-17 1988-05-17 Neorx Corporation Trichothecene antibody conjugates
US4997913A (en) * 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
US5140013A (en) * 1989-11-28 1992-08-18 Universite Laval Maleic anhydride derivatives used as conjugation agents of anti-tumor agents on desired carriers

Also Published As

Publication number Publication date
ZA9110203B (en) 1993-01-27
HUT60484A (en) 1992-09-28
IE65406B1 (en) 1995-10-18
KR920012063A (ko) 1992-07-25
FI916131A (fi) 1992-07-01
ATE109476T1 (de) 1994-08-15
DE69103255T2 (de) 1994-12-08
DE69103255D1 (de) 1994-09-08
IE914567A1 (en) 1992-07-01
HU914133D0 (en) 1992-03-30
EP0495265A1 (en) 1992-07-22
FI916131A0 (fi) 1991-12-27
AU646121B2 (en) 1994-02-10
PT99954A (pt) 1993-06-30
DK0495265T3 (da) 1995-01-02
PT99954B (pt) 1999-06-30
AU9009891A (en) 1993-01-28
NO920040L (no) 1992-07-01
NO180417C (no) 1997-04-16
NO920040D0 (no) 1992-01-02
US5306809A (en) 1994-04-26
CA2058595A1 (en) 1992-07-01
ES2061166T3 (es) 1994-12-01
NZ241217A (en) 1993-12-23
FI101678B (fi) 1998-08-14
EP0495265B1 (en) 1994-08-03
JPH04334377A (ja) 1992-11-20
FI101678B1 (fi) 1998-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO180417B (no) Syrelabile linkermolekyler
Trouet et al. A covalent linkage between daunorubicin and proteins that is stable in serum and reversible by lysosomal hydrolases, as required for a lysosomotropic drug-carrier conjugate: in vitro and in vivo studies.
CA1303524C (en) Drug-monoclonal antibody conjugates
EP0452858B1 (en) Metal complexes of acid adducts to dioxime ligands useful in labelling proteins and other amine-containing compounds
US5112954A (en) Method of enhancing the effect of cytotoxic agents
US5360895A (en) Derivatized gold clusters and antibody-gold cluster conjugates
AU597903B2 (en) Antibody complexes of hapten-modified diagnostic or therapeutic agents
EP1745802A1 (en) Method of conjugating therapeutic compounds to cell targeting moieties via metal complexes
JPH08507517A (ja) 酸解裂性化合物、それらの調製及び二価の酸不安定性架橋剤としての利用
CA2264610A1 (en) Branched peptide linkers
JPH0770175A (ja) リソゾーム酵素開裂性抗腫瘍剤結合体
JPH02152993A (ja) アンチマーおよびアンチマー複合体
EP0510132A1 (en) POLYMERS CARRIER FOR RELEASING COVALENTLY TIED ACTIVE SUBSTANCES.
JP2011148820A (ja) 免疫グロブリンｆａｂフラグメントを選択的且つ定量的に官能基化する方法
US5010176A (en) Antibody-drug conjugates
JP3273608B2 (ja) 治療薬の部位特異的インビボ活性化
JP6998386B2 (ja) システイン改変抗体－毒素複合体及びその製造方法
EP0318948B1 (en) Cleavable immunoconjugates for the delivery and release of agents in native form
Hudecz et al. Immunoconjugate design: a predictive approach for coupling of daunomycin to monoclonal antibodies
JP7153082B2 (ja) システイン改変抗体－毒素複合体（ｔｄｃ）の部位特異的結合サイトのスクリーニング
JPH0742316B2 (ja) オシド単位の酸化およびシツフ塩基の形成により変性されたリボソ−ム不活性化糖タンパク、およびこの糖タンパクを含む生体内持続性免疫毒素
US4919928A (en) Conjugates in which a monovalent carboxylic ionophore is associated by means of a covalent bond with a macromolecule, their use as immunotoxin potentiators and the intermediate activated ionophores
Goerlach et al. In vitro antitumor activity of 2'-deoxy-5-fluorouridine-monoclonal antibody conjugates
US20040038871A1 (en) Conjugates of aminodrugs
EP0622084A1 (en) Antibody-drug conjugates