JPS63203683A - ビオチニル化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビオチニル化剤（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｎｇ
　ａｇｅｎｔｓ　）として有用な化合物に関する。更に
特定的には本発明は、ビオチンを低分子量チオールおよ
び蛋白質に可逆的に結合させるのに使用することのでき
る化合物に関するものである。

発明の背景 チオールとアミノ官能基を経てビオチンを蛋白質に結合
させるために数多くの試薬がこれまでに使われてきた。

チオール官能基に特異的な非開裂性ビチオニル化剤の例
にはｓ　３−（Ｎ−マレイミド）プロピオニルビオチン
が含まれこれはＢａｙｅｒらによってＡｎａ１７ｔｉｃ
ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ。

１４９．５２９−５５６　（１９８５）に述べられてお
りＮ−インドアセチル−Ｎ′−ビオチニルヘキシレンジ
アミンはＥｉｕｔＯｈらによってＪ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、１７８゜３２）−５３９（１９８４）に述べ
られている。アミノ官能基に特異的な開裂性のビオチニ
ル化剤の例には３−（４−（１１−ビオナノイル−６−
アミノカプロイルオキシ）フェニル）プロピオン酸Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＰＩｌｆ　）が
含まれ、これはＭｏｕｔｏｎらによってＡｒｃｈｉｖｅ
ｓ　ｏｆＢｉｏｃｈａｍｉｓｔｒ）ｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ＋ｉｃｅ、　２１８．１０１〜１０８（１９８
２）に述べられそしてスルホスクシンイミジル２−（ビ
オチンアミド）エチル１，３′−ジチオプロピオネ−）
　（ＮＨ８−８日−ＢｉＯｔｉｎ　）　　はＰｉｅｒｃ
ｅｃｈｅｍｔｃａｘ社から販売されている。

幾つかの応用のためＫはビオチン残基を取り去りそして
遊離のラベルされていない蛋白質を再生することが望ま
しいことである。例えばチオール含有蛋白質を含む混合
物からのチオール含有蛋白質を回収するためには、ビオ
チン残基は固定化されたアビジンとともに用いることが
できる。−たび、単離されれば、非修飾の状態の蛋白質
を研究することが重要まこととなる。

このような場合、蛋白質の全体性に影響を及ぼさない条
件下にビオチン残基を開裂させる必要がある。

上記したこれらの開裂しうるビオチル化剤。

例えばＢＰＫおよびＮＨ３−８８−ビオチンは試薬の一
部分、すなわち、アルキルアミＶ残基を蛋白質上に歿留
させる。多くの蛋白質は遊離チオール官能基および７／
”またはジスルフィド官能基を含みそれらは容易に還元
されて遊離チオール官能基となることから、チオール官
能基に対して特異的な、開裂性ビオチニル化剤であって
遊離のラベルされていない蛋白質の再生を許容するもの
は、アフィニティー精製の技術に広い応用性を有するも
のである。

発明の要約 チオール−ジスルフィド交換反応を経てチオール含有物
質に可逆的にビオチンを結合させるのに使われる化合物
がここに合成され、そして試験された。かかる化合物は
連結手によってビオチン部分がジチオピリジル部分に連
結したものからなる。

１つのこの好ましい具体例によれば本発明は次の式 を有するビオチン−２−（２’−ピリジルジチオ）−エ
チルアミドを提供するものである。

もう、１つの好ましい具体例によれば本発明は次の式 を有するＮ−（２−ピリジルジチオプロピオニル）ビオ
シチンを提供するものである。

壬の使用において本発明の化合物は蛋白質チオールのよ
うなチオールと反応して、ピリジン−２−千オンを放出
しビオチン−ジチオ一連結蛋白質を生成する。

遊離の蛋白質はりチオ基の還元により遊離される。固定
化アビジンと組合わせて、使用する際には本発明の化合
物は選択的な蛋白質の分離の手段と７フイニテイークロ
マトグラフイーを介した蛋白質と蛋白質複合物との選択
的分離のための手段を提供する。

本発明の詳細な説明 本発明は次の式 （式中Ｘおよびｙは１から５の整数であり、ｎは０また
は１であり、Ｒは少なくとも１つのアミド官能基を含有
する非環式連結基であり、そして２は場合によって−５
−Ｓ−基の開裂で生じるチオール−チオンの互変異性を
保持するような型または位置における１つまたはそれ以
上の置換基で置換されたピリジル基である）で示される
化合物を提供するものでおる。

非環式連結基として上で定義されたＲで表わされた２価
の基は、少なくとも１つのアミド官能基を含有し少なく
とも１つのアミド官能基の窒素原子と炭素原子が鎖原子
である原子の直鎖からなるものである。好ましいＲ基は
一〇〇ＮＨ−および−ＣＨ（Ｃｏ２Ｈ）ＮＨＣＯ−から
なる。

２基に関しては好ましい例には２−ピリジル、４−ピリ
ジル、５−ニトロ−２−ピリジルおよび５−カルボキシ
−２−ピリジルが含まれるが。

しかし生成したチオール−チオンの互変異性を安定化す
るどのような置換基も好適である。

Ｒと２の両方の好ましい具体例をこれまでに記載したが
、この分野で普通の技術を持った人が化合物の製造する
ためのＲおよび２にすることができる種々の変化および
修飾は本発明の範囲に含まれるものであると理解すべき
である。

本発明の化合物は多くの異なった方法で製造しうる。こ
れらの方法のもつとも好ま１．いものは下記する通りで
ある。

式（１）の化合物で式中ｎが０であるものは次の式 ％式％（） （式中、ｘ、ｙおよび２は上記で定義したとおシである
）で示されるピリジルジチオアルキルアミンの酸塩とビ
オチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとを第三
アミンの存在下に接触させることによって製造される。

この反応は有機溶媒中で０〜５０℃の温度で行なわれる
。好適した溶媒は例えばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミＦ
’、Ｎ、Ｎ−）メチルアセトアミ−およびジメチルスル
ホキシドを含むものである。反応時間は反応温度に応じ
て変化する。

式（ｎ）の出発化合物は、次の式 ｚ−ｓ−ｓ−ｚ　　　　　　　　　（Ｉ［Ｉ）（式中、
２は一ヒ記で定義した通りである）で示されるジピリジ
ルスルフィ−と次の式 Ｈ８−（ＣＨ２）ｘ＋ｙ−ＮＨ２（Ｆ／）（式中％Ｘお
よびｙは上記に定義した通シである）で示されるメルカ
プトアルキルアミンの酸塩とを接触させることによって
製造することができる。反応は有機溶媒中で０〜３０℃
の温度１〜２４時間の間に行なわれる。好適した溶媒は
。

エタノール、酢殴エチルおよびジオキサンである。

式（１）の化合物で式中ｎが１でＲが一〇〇ＮＨ−であ
るものは、次の式 （式中、Ｘは上記で定義した通りである）で示される化
合物と次の式 ％式％（） （式中、ｙおよび２は上記で定義した通りである）で示
されるピリジルジチオアルキルアミンの酸塩とを第三ア
ミンの存在下に接触させることによって製造される。反
応は有機溶媒中で０〜５０℃の温度で行なわれる。好適
した溶媒はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、　Ｎ、Ｎ−
ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホキシｒを含
む。反応は１〜２４時間の間に行なわれる。

式Ｖの化合物の製造方法はこの技術分野で公知のもので
ある。例えば式（■）の化合物で式中ｘ＝５であるもの
、すなわち、ビオチンアミドーヘキナン酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルの製造法は、　Ｃｏ５ｔｅｌ
ｌｏらのＣｈｉｎ、　Ｃｈｅｍ、。

２５、１５７２〜１５８０　（１９７９）　　に記載さ
れ、またＢｅｈｒｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（カ
リホルニア州　ラジコン）から入手することができる。

式１の化合物で１式中Ｒが一０Ｈ（ＣＯ２Ｈ）ＮＨｃ（
０）　−であるものは次の式 （式中、Ｘは上記で定義したとおりである）で示される
化合物の有機酸塩と１次の式 （式中、ｙと２はまた上記で定義された通シである）で
示される化合物とを接触させて製造することができる。

反応は水性の緩衝液中に溶解した式（■）の適当な塩と
、水と混和しつる有機溶媒、好ましくは双極性非プロト
ン溶媒例えばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の式（■
）の溶液とを接触させることによって行なわれる。混合
物の全体の…はアミノ基が脱プロトン化（ｄｅｐｒｏ−
ｔｏｎａｔｅ）され、それゆえ反応性であるようなもの
であるべきである。ｚ５および８．５の間の−が任意に
用いられる。適当な緩衝液は妨害性の官能基を含まない
よう表ものである。アルカリ金属の重炭酸塩の緩衝液が
好ましい。反応は０〜３０℃の範囲で行なわれ、好まし
くは試薬が０〜５℃で混和され混合物は、室温にまであ
たたまるのにまかされる。反応物はほぼ等モル量でα１
〜α２Ｍの間の濃度において一緒にされる。

反応は一般には室温で２時間後に完了するが、しかじよ
シ長く行なうこともできる。生成物は混合物をｐＨ３ま
たはそれ以下に酸性にして沈殿される。

出発物質の式（■）の化合物は、ビオチンＮ−ヒｒロキ
シスクシンイミドエステルと次の式％式％） （式中、Ｘは上記に定義された通りでありＷはｔｅｒｔ
−ブチロキシカルボニル（ｔａｒｔ−ＢＯＣ）のような
適当表保護基である）の化合物と接触させることにより
製造される。反応物は保護されたアミノ―の緩衝溶液を
エステルの有機溶媒溶液に加えることによって接触させ
る。この反応は０〜３０℃の温度で１時間〜２４時間の
間に行なわれる。適切な有機溶媒にはＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、：）メチルスルホキシドおよび同様のも
のが含まれる。得られた生成物は式（■）のＮ−α−ｔ
ａｒｔ　−Ｂｏｏ誘導体である。使用するに先立って、
この誘導体は適当な、有機酸との処理によって脱保護さ
れ、（■）の酸塩誘導体とされる。

式（■）の化合物の製造方法はこの技術分野で既知であ
シ米国特許第４，１４９，００３号、４，２３１，９９
９号、および４，２３２，１１９号に記載されている。

本発明の新規な化合物は、ビオチン誘導体化子オールを
適当な還元状態にｌ！ＩｇＬ、たときに遊離チオール含
有物質の再生を許容する、開裂可能でチオール特異性の
ビオチル化剤である。

その使用において本発明の化合物は、チオールを含有す
る物質１例えば蛋白質のチオールと反応しピリジル−２
−千オンを放出してビオチン誘導体化蛋白質を生ずる。

この反応はチオール−ジスルフィド交換に基づくもので
この際ビオチニル化中に放出されたピリジン−２−チオ
ンははとんどの蛋白質が透明である波長（λｍａｘ−３
４３：ξｍａｘ−ａｏｏｏ　）において最大値をもつ色
原体である。この千オンの生成によってビオチニル化が
都合よく単純な分光計でモニターされることになる。

本発明によるビオチニル化は、水性緩衝液中のチオール
含有物質と水混和性有機溶媒、好ましくは双極性非プロ
トン溶媒中の式（１）の化合物とを接触させることから
成るものである。多くの生化学の応用のために便利な緩
衝液はｐＨ７，４のリン酸緩衝食塩水（ＦＢ＋３）であ
る。しかし１通常はラベルされるべき分子の関数である
正確な組成のｐＨ６〜９の範囲の多様な緩衝液も満足に
用いられる。好ましい態様において緩衝液はまたチオー
ル基に対する少量の酸化防止剤を含有する。適当な酸化
防止剤はエチレンジアミ／テトラ酢！！１（ＥＤＴＡ）
である。チオール−ジスルフィド交換であるビオチニル
化反応は４℃〜５０℃の温度の範囲で１時間から８時間
の間に行なわれる。上で述べたように縮合反応の副生成
物が色原体であるので反応の進行は便利に分光分析でモ
ニターされる。ひとたび反応が完了したと判断されると
過剰のビオチニル化剤と副生成物はのぞかれる。巨大分
子の場合にはこれはゲル口過または透析によって容易に
なし遂げられる。

本発明の化合物は天然のまたは人工的に誘導されたチオ
ール基？経ているいろな物質をビオチニル化するのに使
用することができる。そのような物質は例えばホルそン
、酵素および抗体のような蛋白質並びに低分子量物質よ
りなるものである。

適当なアビジン共役体（ａｖｉｄｉｎ　ｃｏｎｊｕｐ、
ａｔｅ　）、特に酵素で標識したアビジン共役体と組合
わせた式（１）の化合物の使用により、普遍的で多目的
のチオール特異性プローブが提供される。例えばプロッ
ト化されたチオール蛋白質の式（＋）の化合物による直
接のステインニング（染色）は引き続くアビジン酵素複
合体の検出を可能とする。

アビジンアフィニティーマトリックス（例えば固定化ア
ビジン）と組みあわせた式（Ｉ）の化合物の使用はタン
パク質およびタンパク質複合体をアフィニティークロマ
トゲラフィーを経て選択的に分離する手段を提供する。

例えば、特に目的とする抗原のためのアフィニティーを
持っており式（１）の化合物でビオチニル化された抗体
は目的の抗原を含んだ粗混合物に加えられる。

目的抗原は、ビオチンでラベルされた抗体に結合し、結
果として得られる複合体はアビジンアフィニティーマト
リックスで回収される。結合した複合体はアビジンマト
リックスからグチオス１／イトールのような適当表チオ
ールでジスルフィド１結合を還元することＫよりアビジ
ンマトリックスから回収できる。

本発明の化合物は特に抗体豊たけそのフラグメントにビ
オチンを結合させるのに好適している。抗体の抗原結合
部位には遊離の７ミノ基を含む。抗体がこれらのアミノ
官能基と反応性のビオチンラ（ル剤でラベルされている
とすればこのう（ル化された抗体のその抗原へ結合する
能力は妨害される。しかしながらもしも抗体がいくつか
の内部鎖のおよび／またはジスルフィド基を遊離チオー
ル基に変換するためのおだやかな還元に付されているな
らば抗体は次いで本発明のチオール特異性の化合物によ
ってビオチンでうにルされる。チオール特異性：）（ル
化剤の使用によって抗原結合部位による妨害を回避する
ことができる。

次に本発明を実施例によって例示する。

実施例　！ ２．２′−ジピリジルジスルフィｒの溶液は試薬エタノ
ール７５−中にこのジスルフィド２．６４１（１２ｍｍ
ｏｇ）を溶解させて調製された。試薬エタノール７５Ｎ
ｔ中の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩１．２９　ｆ
　（１１，３ｍｍｏＱ）の口過された溶液は。

次いで最初の溶液に１時間にわたシ攪拌しながら加えら
れた。添加の完了後に攪拌は、室温でつづけられた。２
時間の後、反応混合物は１８時間、冷蔵庫の中に置かれ
た。その後得られた懸濁液は不溶解物質、すなわち酸化
された２−メルカプトエチルアミンを除くために口過さ
れ、そして口液はジエチルエーテル５００−で希釈され
た。形成された沈殿物は口過によって除かへそして口液
は回転蒸発器で蒸発させて、体積５０−とじ九。濃縮し
た口液は再びジエチルエーテルで５００−の容積に希釈
され、こうして羊毛状の沈殿物が生成した。４℃に冷却
した後、生成物は回収され真空下で乾燥され、２−（２
’−ピリジルジチオ）−エチルアミン塩酸塩を得た。生
成物はＴＬＣ！　（ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１
：１）の系、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６［］Ｆ−２５４プ
レート）によってほぼ均一のものであり１石吸収にてＲ
ｆｏ、４７のニンヒドリン陽性のスポットを示した。Ｄ
２０中のＮＭＲは指定された構造と一致した。

実施例　■ ビオチンＺＪ−ヒＶロキシスクシンイミドエステルと２
−　（２’−ピリジルジチオ）−二チルアミン塩酸塩の
溶液は、このエステル１７３Ｆ（２，１５ｍｍｏｇ）と
このアミン塩酸塩０．５３Ｆ（２，３９ｍｍｏｆｆ　）
とをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアぐド１５−中に溶解する
ことによって調製された。トリエチルアミン（α６５ｍ
、　４．５４　ｍｍｏｆｆｉ　）が加えられ混合物はお
おいをかけて１８時間、室温で攪拌された。反応混合物
は次・いて口過されてトリエチルアミン塩酸塩の沈殿を
除き、口液は真空下に５０℃で回転蒸発器中で蒸発させ
られた。得られた油状物は、蒸留水２５−で磨砕され、
羊毛状の固体が得られ、それはめつめられ乾燥されそし
てメタノール（２５ｍ）／水（１００＋ｄ）から再結晶
された。再結晶された固体は真空中ｐ２ｏ５の存在下で
乾燥し、ビオチン−２−（２’−ピリジルジチオ）−エ
チルアミドα３７Ｆを得た。

生成物のＴＬＯ（ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１：
１）　Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０１Ｆ−２５４プレート
）による分析では主々、　ＵＶ吸収とヨーＣ染色による
スポットＲｆＱ、６５を示した。Ｄ）１８０−Ｄ６中の
ＮＭＲはピリジルチオとビオチン部分の特徴あるピーク
を示した。過剰の２−メルカプトエチルアミンによる生
成物の処理では、スにクトル分析（Ａｍ１ｚ”３４３０
ｍ　：　ｅｍａｚ−１０６Ｘ１０’　）による測定でほ
とんど化学量論的な２−ピリジルチオンの放出があった
ことが分った。

実施例　■ 凍結乾燥大腸菌（１！！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ、ｏ
ｌｉ　）のβ−ガ２クトシダーゼ（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製。

−分子あたり１４個の遊離スルフィリリル基を有するに
工Ａグレード）を、エチレンジアミンナト２酢酸ｊ　ｍ
Ｍを含有する声７．４のリン酸塩で緩衝された食塩水に
溶解し全酵素濃度０．７１１１１Ｆ／−を有し、全固体
濃度ｘ１ｑ／−を有するストック溶液４．０−を得た。

ストック溶液のイ（１，４１１９または酵素分子量４６
５．０００を基にして五〇ｍｍｏＱ）を４−の石英キュ
ベツトに加え、これらのキュベツトは、Ｉ（ｉｔａｃｈ
ｉ　１００　”　８０型分光計において３４５　ｎｍに
おいて互にゼロに調節された。

Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中のビオチン−２−（２
’−ピリジルジチオ）エチルアミドの４、　Ｑ　ｍＭ溶
液はＤＭＦ’　５−にこのビオチン誘導体ａ５４岬を加
えることによって、調製された。シリンジを使ってビオ
チン試薬５９　ｔｔＱ　（１５６ｍｍｏＱ）がβ−ガラ
クトシダーゼ溶液２−を含んだキュベツトの１つに加え
られた。２つの溶液の混合物は直ちに行なわれた。また
β−ガラクトシダーゼ溶液２−を含む他のキュベツトに
対して、溶媒３９μ悲が加えられた。これらの溶液の混
合は、直ちに行なわれた。

充填されたキュベツトは、分光計に置かれ。

ピリジルチオンの放出による吸収が連続的に３４３　ｎ
ｍでモニターされた。１．５時間後、α１６１の吸収が
現われ、これは２−ピリジルチオン４５、６　ｎｍｏＱ
に対応した。反応の化学量論に従えば、２−ピリジルチ
オンの収率は酵素１　ｍｍｏＱ４たり平均して、反応し
たビオチン１５ｎｍｏＱに相当する。

過剰のビオチン試薬はｐＨ７４の緩衝液で平衡化された
セファデックス２５カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＦＤ−
１０）中に反応溶液を通ずることによってビオチニル化
された酵素から除かれた。ビオチニル化された酵素を含
む分画け、Ａ２８０タンパク質吸収で捜し出されそして
分画はプールされ、６．４−の溶液が得られた。

実施例　■ ２８０　ｎｍにおける０、７０蛋白質吸収単位を含有す
る溶液である実施例■からのビオチニル化された酵素溶
液の１−が、アビジン−アガロースゲル（カリホルニア
州、ラ　ジョブのＢｅｈｒｉｇＤｉａｇｎＯ１ｉ１ｔｉ
Ｃ８社ｊ３Ｉ）１１Ｉｄのベッドを通して、／セーコレ
ートせしめられた。その流出物が集められた後、ベッド
はｐＨ７，４の緩衝液１．７−で洗浄された。−緒にさ
れた流出物は２８０ｎｍにおいてタンパク質吸収単位を
α０４だけしか含まないことが見出された。このことは
、カラム上に９４％ノヒオチニル化酵素が保持されてい
ることを示す。対照実験において、流出物中に現れた非
ビオチニル化β−ガラクトシダーゼの試料によって生じ
た事実上すべての吸収単位は、修飾されていない酵素は
カラム上には保持され危いことを示すものである。

実施例　■ 実施例■で記載したようにして調製された固定化ビオチ
ニル化β−ガラクトシダーゼ生成物の１−を１ｍＭのエ
チレンジアミンテトラ酢酸を含有するｐＨ７４のリン酸
塩で緩衝された食塩水中の５０　ｍＭのりチオスレイト
ール溶液４−で処理された。ジチオスレイトール試薬は
ゲルペッドを通して室温で口過され、口液はあつめられ
た。この過程でほぼ２時間の間、ゲルは試薬にさらされ
た。全体の集められた口液はセファデックスＧ−２５の
ゲル口過カラムに通されて回収されたβ−ガラクトシダ
ーゼからジチオスレイトールを分離した。アビジン−ア
ガロースゲルに結合したビオチンでラベルされたβ−ガ
ラクトシダーゼの０Ｄ２１１０の単位のうち１．２８の
０Ｄ２８０単位が回収され、酵素の８２％が開裂してい
ることが示された。

実施例　■ ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１，
１０ｆ、五２５ｍｍｏＱ）は１１．Ｎ−ジメチルホルム
アミド１１−中に溶解されそして得られた溶液は水浴中
で５℃に冷却された。その後１Ｍの重炭酸ナトリウム１
１−中のＮ−α−を一肛−Ｌ−リジンα９２７Ｆ（五７
７　ｍｍｏＱ　）の溶液が攪拌下に初めの溶液に１．５
時間にわたって加えられた。攪拌は室温で一夜続けられ
た。反応混合物は次いで真空で口過されそして口液は減
圧下に３５℃で回転蒸発器で蒸発させられた。得られた
白いくもった油状物は水２７−に溶解され得られた溶液
は水浴中で５℃に冷却された。溶液が１Ｎ塩酸でｐＨ３
に酸性化されたとき白い沈殿物が形成された。反応混合
物は次いで約３０分間攪拌され次いで真空で口過された
。得られた白色固体は氷水中で洗浄し１次いで真空下に
一夜４０℃でＰ２Ｏ５の存在のもとに乾燥され、Ｎ−α
−ｔ　−ＢＯＣ−ビオシチン１．１Ｏｆを得た。

実施例　■ トリフルオロ酸ｉ！＆　４．５−とアニソール（Ｌ５０
ｄとの混合物をＮ−α−ｔ　−ＢＯＣ−ビオシチ／１．
０８Ｆ（２，２９ｍｍｏｆ）に加えた。得られた反応混
合物を室温で３０分間攪拌し次いで真空下に３０℃で回
転蒸発器で蒸発させ粘調な黄色の油状物を得た。油状物
はエチルエーテル２０−で磨砕し得ら九だＪｌ！Ｉ濁液
を真空口過した。得られた白い固体を水酸化す）　ＩＪ
ウムの存在下に真空で一夜乾燥させビオシチントリフル
オロアセテート１．３４Ｆを得た。

実施例　■ ビオシチントリフルオロアセテート（α５０ｆ１ｔ　Ｏ
３ｍｍｏＱ）を−ａ３のｃＬ５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝
液５．０−に溶解し、得られた溶液を次いで水浴中で５
℃に冷却した。その後Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２
−中のＨ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ
）−プロピオネートα５２１（１，０３ｍｍｏｇ）の溶
液を最初の溶液Ｋｆｆｌ拌しながら滴下して加えた。添
加が完了した後攪拌は続けられ反応は室温にもどされた
。２時間後反応混合物は１Ｎの塩酸で−３に酸性化され
、そして冷蔵庫に一装置かれて生成物を沈殿せしめた。

冷却して得られた懸濁液は真空口過されそして回収され
た固体は真空中で乾燥され融点１６６〜１６９℃のＮ−
（２−ピリジルジチオプロビオニル）ビオシチン０．５
６ｆを得た。

生成物はＴＬ（！　（ｎ−プロノミノール：水（７：３
）の系Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ＩＦ−２５４−プレー
ト）によってほぼ均一のものであり単一のσＶ吸収、単
一のヨウド染色成分を示した。過剰の２−メルカプトエ
チルアミンでの生成物の処理により９０％以上のピリジ
ルジチオ部分の放出のめったことが光学分析（Ａ３Ｂｚ
−５４３ｎｍ　：　＠ｍ＠ｚ　−７，０６Ｘ１０４）に
よって測定された。ＤＭＢＯ−Ｄ６中の蘭では、ピリジ
ルチオおよびビオチニル部分の特徴あるピークが示され
た。

実施例　■ 実施例■の方法を用いるがビオチン−２−（２’−ピリ
ジルジチオ）−エチルアミドをＮ−（２−ピリジルジチ
オプロピオニル）−ビオシチンでおきかえたとζろ、後
者の試薬により、ビオチニル化されたβ−ガラクトシダ
ーゼが得られた。反応の測定された吸収は２−ピリジル
チオンの放出によるものであるが処理された酵素のＩ　
ｎｍｏＱあたシ平均で２−ピリジルチオン１２ｎｍＯＱ
の放出に相当するものである。

過剰のビオチン試薬はｊ　ｍＭのエチレンジアミンテト
ラ酢酸を含むｐＨ７，４のリン酸塩で緩衝された食塩水
で平衡化されたセファデックスＧ−２５に反応溶液を通
す仁とによってビオチル化酵素から除かれた。ビオチニ
ル化酵素を含む分画けＡ２８０のタンパク質吸収で捜し
出されプールされた。

実施例　Ｘ 実施例■で得られたビオチニル化酵素溶液は実施例Ｖに
述べられた方法により処理され、アビジンアガロース上
に固定化されたビオチニル化β−ガラクトシダーゼが得
られた。

アビシ／−アガロースゲルに加えられたビオチンでラベ
ルされたβ−ガラクトシダーゼの全体で五〇〇の０Ｄ２
８０単位のうち２６０のＯＤ２８０単位が結合されてお
り、このことは８６％のビオチニル化酵素がカラム上に
保持されていることを示すものである。

実施例　Ｘ 実施例Ｘの固定化されたビオチンでう（ルされたβ−ガ
ラクトシダーゼ生成物を実施例Ｖの方法により処理して
ラベルされていないβ−ガラクトシダーゼを得た。

アビジン−アガロースゲルに結合している酵素の全体で
２．６０の０Ｄ２８０単位のうち１．８４０Ｄ２８０単
位が回収され、このことは、酵素の７１％がカラムから
開裂されたことを示すものである。

特許出願人　　ヘキスト・セラニーズ・コーポレイショ
ン 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘおよびｙは１から５の整数であり、ｎは０ま
   たは１であり、Ｒは少なくとも１つのアミド官能基を含
   有する非環式の連結基であり、Ｚは場合によつて−Ｓ−
   Ｓ−基の開裂で生ずるチオール−チオンの互変異性を保
   持するような型のまたは位置における１つまたはそれ以
   上の置換基で置換されたピリジル基である）で示される
   化合物。 ２）Ｚが２−ピリジル、４−ピリジル、５−ニトロ−２
   −ピリジルおよび５−カルボキシ−２−ピリジルよりな
   る群から選ばれる請求項１の化合物。 ３）Ｚが２−ピリジルまたは４−ピリジルである請求項
   ２の化合物。 ４）Ｒが−ＣＯＮＨ−または−ＣＨ（ＣＯ＿２Ｈ）ＮＨ
   ＣＯ−である請求項３の化合物。 ５）次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するビオチン−２−（２′−ピリジルジチオ）−エ
   チルアミドである請求項４の化合物。 ６）次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するＮ−（２−ピリジルジチオプロピオニル）ビオ
   シチンである請求項４の化合物。 ７）チオールを含有する物質のビオチン誘導体を製造す
   る方法であつて、上記物質に次の式▲数式、化学式、表
   等があります▼（ I ） （式中、ｘおよびｙは１〜５の整数であり、ｎは０また
   は１であり、Ｒは、少なくとも１つのアミド官能基を含
   有する非環式の連結基であり、Ｚは場合によつて−Ｓ−
   Ｓ−基の開裂で生ずるチオール−チオンの互変異性を保
   持するような型のまたは位置における１つまたはそれ以
   上の置換基で置換されたピリジル基である）で示される
   化合物を接触させ、そして上記ビオチン誘導体を単離す
   ることから成る方法。 ８）上記チオール含有物質の水性緩衝溶液に有機溶媒に
   溶解させた式 I の化合物を接触させ、そしてこの接触
   はｐＨ４〜９で行なわれるものである請求項７による方
   法。 ９）上記チオールを含有する物質が蛋白質である請求項
   ７による方法。 １０）標的物質を含有する混合物から標的物質および標
   的結合物質を回収する方法であつて、上記標的物質のた
   めのチオールを含有する結合物質を用意し、チオールを
   含有する結合物質と次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｘおよびｙは１から５の整数であり、ｎは０また
   は１であり、Ｒは少なくとも１つのアミド官能基を含有
   する非環式の連結基であり、Ｚは場合によつて−Ｓ−Ｓ
   −基の開裂で生ずるチオール−チオンの互変異性を保持
   するような型または位置における１つまたはそれ以上の
   置換基で置換されたピリジル基である）で示される化合
   物とを接触させることによつて上記チオールを含有する
   結合物質のビオチン誘導体を調製し、上記標的物質を含
   有する混合物とビオチンで誘導された結合物質とを接触
   させて標的物質とビオチンで誘導された結合物質との錯
   体とし、上記錯体を固定化されたアビジンと接触させて
   アビジンが結合した錯体とし、そして上記アビジンが結
   合した錯体をチオールで処理し、それによつて上記錯体
   が、上記の固定化されたアビジンから解放されることか
   らなる上記方法。 １１）標的物質を含有する混合物からの標的物質および
   標的結合物質の錯体を回収する方法であつて上記標的物
   質のためのチオールを含有する結合物質を用意し、上記
   チオールを含有する結合物質と次の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｘおよびｙは１から５の整数であり、ｎは０ま
   たは１であり、Ｒは少なくとも１つのアミド官能基を含
   有する非環式の連結基であり、Ｚは場合によつて−Ｓ−
   Ｓ−基の開裂で生ずるチオール−チオンの互変異性を保
   持するような型または位置における１つまたはそれ以上
   の置換基で置換されたピリジル基である）で示される化
   合物とを接触させることによつて上記チオールを含有す
   る結合物質のビオチン誘導体を調製し、上記のビオチン
   で誘導された結合物質を固定化されたアビジンと接触さ
   せて固定化された結合物質とし、上記の固定化された結
   合物質を上記標的物質を含有する混合物と接触させて上
   記の標的物質と上記の結合物質との固定化された錯体と
   し、そして上記固定化された錯体をチオールで処理し、
   それによつて上記の錯体が、上記の固定化されたアビジ
   ンから解放されることからなる上記の方法。