JPH11512401A - 架橋剤として使用されるジマレインイミド置換されたジヒドロキシアルカン及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規のジマレインイミド- 置換されたジヒドロキシアルカン、その製造方法及びこれを架橋剤として使用する方法に関する。従来使用される、ＳＨ基と反応し、開裂しうるビスマレインイミド誘導体の欠点は、たん白質から架橋剤を引き続き開裂するには酸性又はアルカリ性媒体中で行われなければならないことにある。本発明の目的は、ＳＨ基と反応し、酸性又はアルカリ性媒体中でたん白質から架橋剤の引き続きの開裂を要求しない、新規開裂しうる架橋剤を製造することにある。この目的は、図３中に示された一般式のジマレインイミド- 置換されたジヒドロキシアルカンによって達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 架橋剤として使用されるジマレインイミド置換されたジヒドロキシアルカン及 びその製造方法 本発明は、請求の範囲１及び２記載の新規ジマレインイミド置換されたジヒド ロキシアルカン、請求の範囲３に記載された、これを製造する方法及び請求の範 囲７に記載された、架橋剤として使用する方法に関する。 たん白質研究で、特に二官能性架橋剤（“クロス- リンカー”）が広く使用さ れている。これは２個の官能基を介して結合する物質であり、その官能基は同一 であるか（同種二官能性架橋剤）又は異なっている（異種二官能性架橋剤）。官 能基は、たん白質の対応する反応性アミノ酸側鎖と反応し、それによって側鎖の 間に架橋が形成される。架橋形成は、分子内で行われ、たとえば酵素の活性中心 で、たん白質中の２つの隣接する反応性基の間隔を決定するために使用されるか 又は架橋形成は２個又はそれ以上のたん白質分子の間の分子内で行われ、その結 果として高分子複合体が生じる。この様な分子内架橋剤は、たとえば抗原- 抗体 - 相互作用、多酵素複合体の形成、膜中でのたん白質の配列の解明に利用するこ とができる。非開裂性二官能性架橋剤と共に開裂性架橋剤もますます使用されて いる。 ＳＨ- 基に対して反応する架橋剤に、特にビスマレインイミド置換された脂肪 族及び芳香族化合物が属し、たとえば非開裂性化合物ジマレインイミドヘキサン (M.，D．Partis 等、(1983)，J．Prot．Chem．2，263)、４，４'-ジマレインイ ミドスチルベン（P．Chantler，S．M．Bower(1988)，J．Biol．Chem．263，938 ）及びｐ- フエニレンジマレインイミド(J．E．Moore，W．H．Ward(1956)，J．A m．Chem．Soc．78，2414)、塩基によって開裂しうるマレインイミドメチル -３- マレインイミド- プロピオナート（S．Sato，M．Nakao(1981)，J．Biochem．90 ，1177）及び酸によって開裂しうる、いくつかのビス(マレインイミドアルコキ シ)-化合物（K．Srinivasachar，D．M．Jr．Neville(1989)，Biochemistry28，2 501）である。 従来、使用される、ＳＨ- 基と反応する開裂性ビスマレインイミド- 誘導体の 欠点は、酸性又はアルカリ性媒体中で架橋剤をあとからたん白質から開裂しなけ ればならないことにある。この反応条件はたん白質の変性を生じ、それ故にその 官能検査は開裂反応の後にもはや不可能である。開裂反応又は酸性又は塩基性加 水分解で、しばしば所望されない副反応も生じる。 したがって本発明の課題は、上記欠点をもはや有さないＳＨ- 基と反応する、 開裂しうる新規の架橋剤を提供することであり、更に本発明の課題はこの様な試 剤の製造方法を提供することにある。 本発明の課題は、一般式 （式中ｎは１〜６、好ましくは１又は２である。） のジマレインイミド置換されたジヒドロキシアルカンを用いて解決される。たん 白質をこの化合物とインキュベーションした後、同種二官能架橋剤としてのその 適性が明らかになる。この化合物を架橋反応の後、再びたん白質複合体から開裂 することができる。この場合開裂反応は過ヨウ素酸塩処理によって穏やかな条件 下で、選択的に行われる。たん白質の活性は酸化開裂に影響されないので、その 開裂性は上記条件下で架橋剤成分の分析による同定も可能にする。 マレインイミド置換されたジ- ヒドロキシアルカンの本発明の製造は対応する ジアミノ- アルカンジオール、特にそのアンモニウム塩とＮ- 置換されたマレイ ンイミド誘導体の反応によって行われる。たとえばジアミノアルカン- ジオール とＮ- アルコキシカルボニル- ，Ｎ- アリールオキシカルボニル- 又はＮ- ヘト アリール- オキシカルボニル- マレインイミドのジヒドロハロゲニドを塩基、た とえばＮａＨＣＯ₃の存在下に対応する本発明の化合物に変えることができる。 以下に本発明を実施例によって詳細に説明する。 図１中に、架橋及び牛レチネンから成るＮａ／Ｃａ、Ｋ- 交換体の酸化開裂を 示す。 図２中にゲルマトリックス中でのたん白質架橋の酸化開裂を示す。 〔実施例〕 １．Ｄ，Ｌ- ジマレインイミド -２，３- ブタンジオールの製造方法 ＮａＨＣＯ₃１．０ｇ（１２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン１５ｍｌ及び 水６ｍｌから成る混合物中で０℃に冷却し、急速攪拌下にＤ，Ｌ- １，４- ジア ミノ -２，３- ブタンジオール- ジヒドロ- ブロマイド(P．W．Feit，O．T．Nie lsen(1967)，J．Med．Chem．10，697)を加える。２分間攪拌し、次いでＮ- メト キシカルボニルマレインイミド１．１１７ｇ（７．２ｍｍｏｌ）を少しづつ分け て加える。その後３時間攪拌し、少量の水を加え、数回酢酸エチルエステルで振 とうする。酢酸エチルエステル抽出物を水及びＮａＣｌ- 溶液で抽出し、ＭｇＳ Ｏ₄を介して乾燥し、反応蒸発器で蒸発する。無色の固体として析出したＤ，Ｌ- １，４- ジマレインイミド -２，３- ブタンジオールを吸引濾取し、エーテル 及びペンタンで洗滌する。 収量：１６４ｍｇ（理論値の１９．５％） 融点範囲：２０２−２０４℃（分解） Ｃ₁₂Ｈ₁₂Ｏ₆Ｎ₂（２８０．２４） 計算値 Ｃ５１．４３ Ｈ４．３２ Ｎ１０．０ 測定値 Ｃ５１．６４ Ｈ４．５１ Ｎ ９．６３ ２．Ｄ，Ｌ- １，４- ジマレインイミド -２，３- ブタンジオールを開裂しうる 同種二官能性架橋剤として使用する方法 ジマレインイミド置換されたジヒドロキシアルカンの架橋剤としての適性を脊 椎動物網膜のＮａ／Ｃａ、Ｋ- 交換体の例で検出する。見かけの分子量２４０Ｋ Ｄ／ｍｏｌのこのたん白質はＳＨ- 特異的試剤ｐ- 及びｏ- フエニレンジアミン イミドの架橋後に分子量４９０ＫＤ／ｍｏｌの非開裂性架橋剤を生じる。これは 還元電気泳動処理及び電気溶離の後、たん白質が固定された膜（ＰＶＤＦ- 膜， 小孔(Millipore)を免疫化学的に検出する（P．J．Bauer(1995)，BiophysicalJ． 68，A19）。 同一の架橋生成物が１０分間、室温で５０μＭ Ｄ，Ｌ- １，４- ジマレイン イミド -２，３- ブタンジオールのインキュベーションの後に得られる。たん白 質の架橋を１５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて２０分間室温で、ｐＨ値７で 酸化開裂させることができる。架橋生成物はその後もはや認められない。 図１に、ジマレインイミド- 置換されたジヒドロキシアルカンを用いて牛レチ ネンからＮａ／Ｃａ- Ｋ- 交換体の架橋の検出及び過ヨウ素酸ナトリウムの作用 の後、酸化開裂の検出に対応することを示す。検出は、３．５％〜７．５％ポリ アクリルアミド- 勾配ゲル中でＳＰＳ- 電気泳動によって、次いでＰＶＤＦ- イ モビロン膜（小孔）上での電気溶離を用いて行われる。たん白質をモノクロナー ル抗体ＰＭｅｘ２Ｄ９で免疫化学的に標識する。架橋は１００μＭ Ｄ，Ｌ- １ ，４- ジマレインイミド -２，３- ブタンジオール中で行う。 次のことが示される： ａ：次の開裂のない架橋されたたん白質 （１６０ＫＤでたん白質分解による分解生成物も標識される） ｂ：非架橋プローブ ｃ−ｈ：架橋されたプローブ、これは電気泳動 前に別個に酸化開裂される、 すなわち ｃ：５０ｍＭ ＮａＩＯ₄中で５０分 ｄ：３０ｍＭ ＮａＩＯ₄中で５０分 ｅ：１５ｍＭ ＮａＩＯ₄中で５０分 ｆ：５０ｍＭ ＮａＩＯ₄中で２０分 ｇ：３０ｍＭ ＮａＩＯ₄中で２０分 ｈ：１５ｍＭ ＮａＩＯ₄中で２０分 図２中に示すように、架橋生成物をポリアクリルアミドゲル（３．５％〜７． ５％）中で３０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムで３０分以内に室温で酸化開裂する。 前もって、たん白質の架橋は、５０μＭ Ｄ，Ｌ- １，４- ジマレインイミド - ２，３- ブタンジオール中で１０分間インキュベーションして行われる。次いで プローブを、３．５％〜７．５％ポリアクリルアミド- 勾配ゲル中でＳＤＳ- 電 気泳動によって分離する。ＰＭｅａ２Ｄ９- 標識を有するイムノブロットを上記 図２（1.ディメンション(Dimention)）中に示す。酸化開裂の前に、展開緩衝液 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをトリエタノールアミンに代えねばな らない。というのはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが過ヨウ素酸ナト リウムと反応するからである。第二ゲル痕跡を切除し、展開緩衝液を２０ｍＭト リエタノールアミン- ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と室温で交換する（２時間のインキ ュベーション）。次いで３０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムにより架橋を室温で開裂 する（３０分）。第二ＳＤＳ- 電気泳動（2.ディメンション(Dimention)）を３ ．５％〜７．５％ポリアクリル- アミド- 勾配ゲル中で再度行う。図２中に記載 された軸は、増加する分子量の方向を示す。この場合２つの軸上に分子量１６５ ＫＤ、２４０ＫＤ及び４９０ＫＤを示す。開裂された架橋生成物は、破線状対角 線の下側になければならない。一方開裂していないたん白質は対角線上にある。 このゲルのイムノブロットから、４９０ＫＤで架橋生成物はもはや認められず、 酸化開裂は２４０ＫＤ出発たん白質に再び完全に戻ることが分る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーゲン・フォルカー ドイツ連邦共和国、Ｄ−13051 ベルリン、 ビットブルゲル・ストラーセ、106

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 （式中、ｎは１〜６を示す。） のジマレインイミド置換されたジヒドロキシアルカン。 ２．ｎが１又は２を示す、請求の範囲１記載の一般式で表されるジマレインイミ ド置換されたジヒドロキシアルカン。 ３．対応するジアミノアルカンジオールをＮ- 置換されたマレインイミド誘導体 と反応させる、請求の範囲１記載の一般式で表されるジマレインイミド置換され たジヒドロキシアルカンの製造方法。 ４．反応のために、対応するジアミノアルカンジオールのアンモニウム塩を使用 する、請求の範囲３記載の方法。 ５．Ｎ- 置換されたマレインイミド誘導体としてＮ- アルコキシ- カルボニル- 、Ｎ- アリールオキシカルボニル- 又はＮ- ヘトアリールオキシカルボニル- マ レインイミドを使用する、請求の範囲３又は４記載の方法。 ６．請求の範囲１記載の一般式で表わされるジマレインイミド置換されたジヒド ロキシアルカンを架橋剤として使用する方法。