ES2535222T3 - Entrecruzamiento de monómeros de superóxido dismutasa - Google Patents

Abstract

Un análogo de superóxido dismutasa estabilizado, en donde dicho análogo tiene una estructura terciaria y comprende un primer monómero de SOD1, un segundo monómero de SOD1, y un entrecruzador; dicho entrecruzador comprende un brazo espaciador con una longitud desde 3 Å hasta 15 Å; en donde dicho primer monómero de SOD1 comprende una primera cisteína en una primera posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje, y dicho segundo monómero de SOD1 comprende una segunda cisteína en una segunda posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje; y la primera cisteína está covalentemente unida a la segunda cisteína por el entrecruzador.

Description

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ingredientes de la formulación, no lesivo para el paciente, y sustancialmente no pirógeno. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como soportes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tal como lactosa, glucosa, y sacarosa; (2) almidones tal como almidón de maíz y fécula de patata; (3) celulosa y sus derivados, tal como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz, y aceite de soja; (10) glicoles, tal como propilenglicol; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua sin pirógeno; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tamponadas con fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son no pirógenas, es decir, no inducen elevaciones de temperatura significativas cuando se administran a un paciente.

El término “prevenir” está reconocido en la técnica, y cuando se usa en relación a una afección, tal como una recaída local (por ejemplo, dolor), una enfermedad tal como cáncer, un síndrome complejo tal como insuficiencia cardiaca o cualquier otra afección médica, se entiende bien en la técnica, e incluye la administración de una composición que reduce la frecuencia de, o retrasa el inicio de, síntomas de una afección médica en un sujeto relativo a un sujeto que no recibe la composición. Por tanto, la prevención del cáncer incluye, por ejemplo, reducir el número de crecimientos cancerosos detectables en un población de pacientes que reciben un tratamiento profiláctico relativo a una población control sin tratar, y/o retrasar la aparición de crecimientos cancerosos detectables en una población tratada frente a una población control sin tratar, por ejemplo, en una cantidad estadística y/o clínicamente significativa. La prevención de una infección incluye, por ejemplo, reducir el número de diagnósticos de la infección en una población tratada frente a una población control sin tratar, y/o retrasar el inicio de los síntomas de la infección en una población tratada frente a una población control sin tratar. La prevención del dolor incluye, por ejemplo, reducir la magnitud de, o alternativamente retrasar, las sensaciones de dolor experimentadas por sujetos en una población tratada frente a una población control sin tratar.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un compuesto, por ejemplo, tal como un polipéptido o análogo de péptido de la presente invención, con respecto al uso en el tratamiento, se refiere a una cantidad del polipéptido o péptido en una preparación que, cuando se administra como parte de una pauta de dosis deseada (a un mamífero, preferiblemente un ser humano) alivia un síntoma, mejora una afección, o ralentiza el inicio de afecciones de enfermedad según estándares clínicamente aceptables para el trastorno o afección que se va a tratar o el fin cosmético, por ejemplo, en una proporción beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.

Los términos tratamiento “profiláctico” o “terapéutico” son reconocidos en la técnica e incluye la administración al huésped de una o más de las composiciones objeto. Si se administra antes de la manifestación clínica de una afección indeseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado indeseado del animal huésped) entonces el tratamiento es profiláctico (es decir, protege al huésped contra el desarrollo de la afección indeseada), mientras que si se administra después de la manifestación de la afección indeseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, se pretende para disminuir, mejorar o estabilizar la afección indeseada existente o los efectos secundarios de la misma).

Ejemplificación

La invención que se describe ahora en general, se entenderá más fácilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen meramente para fines de ilustración de ciertos aspectos y formas de realización de la presente invención, y no se pretenden para limitar la invención.

Expresión y purificación de proteínas

WtSOD1 se compró de Sigma-Aldrich (Sr. Louis, Missouri). Las construcciones para la expresión de G93A y G85R en S. cerevisiae se han obtenido a través del generoso regalo del Dr. P. John Hart, PhD (Health Science Center de la Universidad de Texas, San Antonio). La expresión y purificación de G93A y G85R se llevó a cabo como se ha publicado previamente (26, 27). Brevemente, cada construcción en el vector de expresión de levaduras YEp-351 se transformó en levaduras EGy118ΔSOD1 y se hicieron crecer a 30ºC durante 36-48 horas. Los cultivos se precipitaron, se lisaron usando bolas de vidrio de 0,5 mm y un mezclador, y se sometieron a corte con sulfato de amonio al 60%. Después de la precipitación con sulfato de amonio, la muestra se precipitó y el sobrenadante se diluyó con 0,19 volúmenes hasta una concentración final de sulfato de amonio 2,0 M. Esta muestra se purificó después usando una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica de fenil-sepharosa 6 de flujo rápido (alto sub) (GE Life Sciences) usando un gradiente de sal que disminuye linealmente de 300 ml desde un tampón con alta sal (sulfato de amonio 2,0 M, fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 0,1 M, DTT 0,25 mM, pH 7,0) a un tampón de baja sal (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 0,1 M, DTT 0,25 mM, pH 7,0). Las muestras que contenían SOD1 eluyeron en sulfato de amonio entre 1,6-1,1 M y se identificaron usando análisis por SDS PAGE, se juntaron e intercambiaron a un tampón Tris 10 mM, pH 8,0. La proteína se cargó después en una columna de cromatografía de intercambio aniónico Mono Q 10/100 (GE Life Sciences) y se eluyó usando un

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C 0,5 mg/ml a 30ºC durante la noche. La muestra digerida se centrifugó a 14.000 RPM durante 10 minutos y después se inyectó en el Eksigent UPLC usando el gradiente anterior. Después de la cromatografía líquida, las muestras se introdujeron usando ionización de nanoespray y los datos de MS/MS se recogieron usando CID. Los compuestos se identificaron usando el software Bruker Daltonics Data Analysis, se deconvolucionaron, y se exportaron a un fichero mascot genérico. Se realizó el análisis entrecruzado y no entrecruzado cargando los ficheros mascot genéricos en la máquina de búsqueda MASCOT seleccionando ninguna como la enzima, usando la base de datos NCBIr, con 1,2 Da (tolerancia de error de MS) y 0,6 Da (error de tolerancia MS/MS). Las búsquedas MASCOT para las muestras entrecruzadas y no entrecruzadas se compararon y las m/z identificadas en la muestra entrecruzada y la muestra no entrecruzada se sometieron a una búsqueda MS Bridge (protein prospector, UCSF) usando BMOE como el entrecruzador (220,05 Da). MS Bridge busca todos los pesos moleculares potenciales de péptidos entrecruzados más el peso molecular del entrecruzador. Los péptidos identificados de la búsqueda MS Bridge como que están implicados en entrecruzamiento se caracterizaron adicionalmente por cromatogramas iónicos extraídos en el software Data Analysis.

Análisis de metal

El análisis de metal se realizó usando espectrometría de masas con plasma inductivamente acoplado (ICP-MS) en el Laboratorio de Análisis Químico de la Universidad de Georgia (Athens, GA). Brevemente, se envió tampón solo para análisis como un blanco junto con 1 μM de cada variante; el análisis se repitió en triplicado. Además, 5 μM de cada variante se analizó usando el FTMS en modo ESI usando el método de infusión directa.

Ensayo de estabilidad de termofluorescencia

Las curvas de fusión de SOD1 G93A y G85R se siguieron en presencia o ausencia de DTME o BMOE y un exceso tanto de cobre como zinc donde un aumento en la temperatura de fusión sugiere unión y un aumento en la estabilidad de la proteína. Por tanto, se analizaron muestras de proteína en ausencia de entrecruzador (que se resuspenden en DMSO) o cobre y zinc en presencia de DMSO al 2-4% para determinar los efectos de DMSO sobre la estabilidad de la proteína. En la primera secuencia de reacciones, se incubó 10 μM de SOD1 mutante con concentraciones crecientes de DTME o BMOE 0-20 μM, incubada con SYPRO™ naranja 20X y añadida a una placa de 96 pocillos. Alternativamente, en la segunda secuencia de reacciones, se incubaron 10 μM de SOD1 mutante con cobre 20 μM, zinc 20 μM y BMOE o DTME 0-20 μM. La temperatura de fusión de la proteína se siguió usando una máquina de RT-PCR (Applied Biosystems) con un aumento de 0,3ºC en temperatura cada minuto de 25-100ºC. Los datos se analizaron restando un blanco de colorante solo de cada pocillo respectivo, normalizado a 1, y se representó temperatura frente a fracción de proteína desnaturalizada. Restar un blanco de DTME o BMOE, cobre, zinc, colorante dio resultados similares que restar un blanco de colorante solo. Repetido en triplicado.

Ensayo de actividad SOD1

La actividad SOD1 se siguió usando un ensayo basado en gel de nitroazul de tetrazolio (NBT) (69-72). Se incubaron 10 μg (~42 μM) de SOD1 wt o mutante en presencia o ausencia de cobre y zinc 80 μM y/o BMOE 42 μM, después se analizó en un gel de poliacrilamida al 12,5%. Alternativamente, se incubaron 10 μg (~42 μM) de SOD1 wt o mutante en presencia o ausencia de cobre y zinc 80 μM y/o DTME 42 μM. Las muestras entrecruzadas con DTME se dividieron por la mitad, donde una mitad se incubó con TCEP 10 mM y la otra no, después se analizaron en un gel de poliacrilamida al 12,5%. El gel se tiñó usando una solución que contenía fosfato de potasio 50 mM, pH 7,8, 1 comprimido de NBT (10 mg/comprimido) y riboflavina 0,1 mg/ml durante 45 minutos en la oscuridad. Después de 45 minutos de incubación se añadió 1 μl/ml de TEMED y el gel se expuso a la luz durante 2 minutos. Los radicales superóxido crean formazán azul insoluble a partir de NBT. La actividad SOD1 se ve como una banda incolora ya que SOD1 capta el superóxido, inhibiendo de esta manera la formación de color azul. Repetido en triplicado.

Resultados

Entrecruzamiento usando entrecruzador de grupo funcional maleimida extrínseco para estabilizar SOD1 dimérica

Todos los entrecruzadores de maleimida probados que tenían longitudes de cadena en el intervalo de 8-14 Å produjeron la estabilización del dímero de SOD1, incluyendo ditio-bismaleimidoetano (DTME, brazo espaciador 13,3 Å), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB, brazo espaciador 10,2 Å), 1,8-bis-maleimido-dietilenglicol (BM(PEG)2, brazo espaciador 14,7 Å), 1,4-bismaleimidobutano (BMB, brazo espaciador 10,9 Å), y tris[2meleimidoetil]amina (TMEA, 10,3 Å) (figura 12). Alternativamente, la única vinilsufona probada, 1,6-hexanol-bisvinilsulfona (HBVS, brazo espaciador, 14,7 Å), no produjo la formación de SOD1 dimérica (figura 12).

Para investigar la estequiometría de la unión del entrecruzador, se compararon los pesos moleculares de variantes G93A entrecruzadas (DTME o BMOE) frente a no entrecruzadas usando cromatografía líquida (LC)-espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS). Se determinó que el peso molecular experimental para la especie monomérica no entrecruzada era 15851,055 Da (teórico 15850,889 Da), y se determinó que el peso molecular experimental para la especie entrecruzada con DTME dimérica era 32013,904 Da (0,244 Da de diferencia del valor teórico del peso molecular de dos monómeros de G93A más un DTME (312,037 Da)). El peso molecular

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experimental de G93A entrecruzada con DTME dimérica, 32013,904 Da, sugiere que un equivalente de entrecruzador produjo un equivalente de dímero (figura 8), consistente con la unión de un único entrecruzador a dos monómeros. Se obtuvieron resultados similares para el entrecruzamiento de G93A y BMOE (datos no mostrados).

Para descartar la aparición de reacciones catalizadas por el entrecruzador, se usó un entrecruzador reductivamente lábil, DTME, y el entrecruzamiento se siguió usando inmunotransferencia. El entrecruzamiento usando DTME produjo SOD1 dimérica, sin embargo en presencia de agente reductor solo se observó monómero (figura 8E), lo que sugiere que la creación del dímero de SOD1 se debía específicamente a entrecruzadores químicos unidos.

Estabilización del dímero de SOD1 mediada por intercambio tiol-disulfuro

La masa de SOD1 intacta y los datos de fragmentación MS/MS usando la disociación con separador en embudo (FSD) de la variante G93A entrecruzada (iones precursores) reveló un mecanismo de reacción único, intercambio tiol-disulfuro, para entrecruzar SOD1 (figura 13). Primero, la SOD1 intacta y la SOD1 con 1/2 de DTME eluyen a diferentes tiempos de retención en la carrera de cromatografía líquida lo que sugiere que son especies únicas descartando por tanto la posibilidad de fragmentación en el disulfuro de DTME. Segundo, la fragmentación se produce preferentemente en el sitio de entrecruzamiento. La especie modificada por medio DTME sugiere que el intercambio se produjo entre el enlace sulfhidrilo-sulfhidrilo en el espaciador de DTME y la fracción tiol de un residuo de cisteína en G93A. Por último, la posibilidad de intercambio tiol-disulfuro se confirmó además modelando la mitad de DTME en la interfase del dímero, específicamente Cys111, de la estructura de SOD1 ((2C9V (Strange, 2006 #95))) (figura 7). Por tanto, se pudo entrecruzar monómeros de SOD1 eficazmente usando numerosas moléculas (figura 12) y dos mecanismos de reacción distintos, es decir maleimida (figura 8, figuras 11 y figura 12) e intercambio tiol-disulfuro (figura 13), siendo el último adecuado para estrategias terapéuticas basadas en péptidos.

Cys111 es el sitio de entrecruzamiento químico

Para identificar el sitio de entrecruzamiento, se compararon datos de proteólisis y LC-FTMS/MS, que proporcionaron datos de secuencia de péptidos digeridos, para muestras no entrecruzadas y entrecruzadas (figura 14). Debido a la resistencia a proteasas de SOD1 WT y G93A, probablemente conferida a través de la unión a metales y un enlace disulfuro intramolecular, se usó la variante G85R, que es menos resistente a proteasas. Se observó la m/z 487,790 (Mr 973,563; residuos 1-9, extremo N acetilado) en ambas muestras y se presenta como un control positivo, subrayando intensidades similares del péptido en las muestras entrecruzada y no entrecruzada. Se observaron dos Mr que estaban en la muestra entrecruzada pero no en la nativa: 5232,674 (m/z 873,120) y 5347,700 (m/z 892,291). MS-Bridge identificó tanto 5232,674 como 5347,700 como que estaban implicadas en el entrecruzamiento (residuos 103-125 de un monómero entrecruzado a través de BMOE a los residuos 103-126 de un segundo monómero) y (residuos 103-126 de un monómero entrecruzado a través de BMOE a los residuos 103-126 de un segundo monómero), respectivamente. El entrecruzamiento predicho para 5232,674 tenía una precisión de 6,19 ppm mientras que 5347,700 tenía una precisión de 5,88 ppm. Por tanto, la espectrometría de masa confirmó que el entrecruzamiento era estequiométrico y se producía principalmente a través de Cys111, y que la reactividad cruzada con otros residuos de cisteína de SOD1 Cys6, Cys57 y Cys146 era relativamente baja (figura 14). Notablemente, debido a la complejidad del entrecruzamiento había una falta de fragmentación de iones precursores de los péptidos entrecruzados.

El entrecruzamiento químico estabiliza los dímeros de G93A y G85R

Sypro naranja se une preferentemente a parches hidrofóbicos que se exponen según se desnaturaliza la proteína. Se usó un ensayo basado en fluorescencia que sigue la unión de Sypro naranja como función de la temperatura para observar tendencias en las temperaturas de desnaturalización tanto de G93A como de G85R. Este ensayo no es reversible, probablemente como resultado de la agregación de SOD1, y mientras que las temperaturas de desnaturalización recuerdan las temperaturas de fusión previamente observadas de SOD1, no son estabilidades termodinámicas apropiadas. SOD WT no se pudo seguir usando este ensayo porque su temperatura de fusión está en el límite de detección (~100ºC). Se observaron aumentos no precedentes en la estabilidad de los mutantes analizados (figura 9 y figura 15). SOD1 G93A, por ejemplo, se estabilizó en ~20ºC; la incubación con exceso de cobre y zinc no tuvo efecto en la estabilidad de G93A; y las concentraciones menores de entrecruzador tuvieron un mayor efecto en la estabilidad de G93A. SOD1 G85R, por otra parte, se estabilizó ~20ºC en presencia de exceso de cobre y zinc; aumentó además ~45ºC (de ~40ºC a 85ºC) en presencia de cobre, zinc, y entrecruzador; y las mayores concentraciones de entrecruzador tuvieron un mayor efecto sobre la estabilidad de G85R. Por tanto, el grado de estabilización alcanzado aquí por lo que son esencialmente chaperones farmacológicos (covalentes) es el mayor nunca alcanzado para SOD1, y por lo que sabemos, para cualquier proteína asociada a enfermedad.

La actividad de SOD1 G85R variante de ELAf se restablece estabilizando el dímero de SOD1

Además de la estabilidad investigamos el efecto que el entrecruzamiento químico tenía sobre la actividad SOD1 usando un ensayo basado en gel. La actividad de SOD1 WT y G93A no estaba afectada por la adición de cobre, zinc o entrecruzamiento químico. Sin embargo, además de aumentar la termoestabilidad de SOD1 G85R, el entrecruzamiento químico aumentó su afinidad de unión a metal cualitativa, lo que produce la transformación de

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