JP5792715B2 - スーパーオキシドジスムターゼモノマーの架橋 - Google Patents
スーパーオキシドジスムターゼモノマーの架橋 Download PDFInfo
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Description
Cys111−架橋剤媒介型安定化が最も一般的なfALS SOD1バリアントおよび酸化されたWT SOD1に適用可能であるか否かを判定する
予備的結果の中で、本出願人らは、G93AおよびG85R SOD1バリアントの個別のSOD1モノマーを繋留するために、ホモ二官能性、Cys111特異的、マレイミド架橋剤を使用した。本出願人らは、そうでなければ不活性であるG85Rバリアントに対するほぼ完全な活性も同時に回復しながら、G85R SOD1の融点を約45℃だけ上昇させることによって、本出願人らの知るかぎりにおいてあらゆるタンパク質にとっての小分子媒介型安定化の前例のないレベルを達成した。このより広い治療可能性を決定するため、5つの最も一般的なfALS SOD1バリアント(D90A、A4V、E100G、H46RおよびI113T)、C6Gおよび酸化されたWT SOD1が、以下の方法で分析される:
A. 最も一般的なSOD1 D90A、A4V、E100G、H46R、I113TおよびC6Gバリアントを発現させ精製する。
合理的な所定の制約および反復的な実験により決定された制約の両方を用いて、チオール−ジスルフィド交換媒介型SOD1ダイマー安定化に適した約2000個のペプチドの組合せライブラリを、考えられる2000万超のジ、トリ、テトラおよび環状ペプチドから解析し使用してもよい。これらのペプチドは、ハイスループットサービス施設により合成されてもよい;多重化質量分析法検定が、生理学的還元剤グルタチオンの存在下で、化合物のオンレートおよびそのオフレートを決定する;多重化安定化検定が実施され、ジスムターゼ活性が、最良の200個の化合物について決定される。
本発明の一態様は、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体において、前記類似体が三次構造を有し第1のSOD1モノマーおよび第2のSOD1モノマーを含み;前記第1のSOD1モノマーが第1の面および第1のα−アミノ酸残基を含み、前記第2のSOD1モノマーが第2の面と第2のα−アミノ酸残基を含み;前記第1のα−アミノ酸残基が第1の側鎖を含み、前記第2のα−アミノ酸残基が第2の側鎖を含み;第1のα−アミノ酸残基が1つの接続部により第2のα−アミノ酸残基に接続されている安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体である。
本発明の別の態様は、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)類似体の製造方法であって、第1のSOD1モノマー、第2のSOD1モノマー、および架橋剤を反応させて前記類似体を形成するステップを含む製造方法である。
「類似体」という用語は、機能がSOD1タンパク質に類似している分子またはその断片を意味する。
WtSOD1をSigma−Aldrich(St.Louis、Missouri)から購入した。S・セレビシエ(S.cerevisiae)中のG93AおよびG85Rの発現のための構成体は、Dr.P.John Hart、Ph.D.(University of Texas Health Science Center、San Antonio)からの寛大な寄贈品である。G93AおよびG85Rの発現および精製は、先に公表された通り(26、67)に実施した。簡単に言うと、酵母発現ベクターYEp−351内の各構成体を、EGy118ΔSOD1酵母へと形質転換させ、30℃で36〜48時間成長させた。培養をペレット化し、0.5mmのガラスビーズおよびブレンダーを用いて分解し、60%の硫酸アンモニウムカットに付した。硫酸アンモニウム沈降の後、試料をペレット化し、上清を、硫酸アンモニウムの最終濃度が2.0Mになるまで0.19体積で希釈した。その後この試料を、高塩分緩衝液(2.0Mの硫酸アンモニア、50mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.1MのEDTA、0.25mMのDTT、pH7.0)から低塩分緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.1MのEDTA、0.25mMのDTT、pH7.0)まで線形的に減少する300mLの塩勾配を用いて、フェニル−セファロース6高速流(high sub)疎水性相互作用クロマトグラフィカラム(GE Life Sciences)を使用して精製した。SOD1を含む試料を1.6〜1.1Mの間の硫酸アンモニアで溶離させ、SDS PAGE分析を用いて同定し、プールし、10mMのトリス、pH8.0緩衝液に対し交換した。その後タンパク質を、Mono Q10/100アニオン交換クロマトグラフィカラム(GE Life Sciences)に投入し、低塩分緩衝液(10mMトリス、pH8.0)から高塩分緩衝液(10mMのトリス、pH8.0、1Mの塩化ナトリウム)まで線形的に増加する200mLの塩勾配を用いて溶離した。勾配を、0〜30%の10mMトリス、pH8.0、1Mの塩化ナトリウムから実施し、SOD1を5〜12%の間の10mMトリス、pH8.0、1Mの塩化ナトリウムで溶離させた。SOD1タンパク質を、SDS PAGE、ウエスタンブロット、MALDI−TOFおよびFTMSを介して確認した。
Wt、G93AまたはG85R SOD1をおよそ20分間、5〜25mMのDTTと共にインキュベートし、Amicon Ultra−4遠心分離スピンコンセントレーター(MWCo10K)を用いるかまたは逆相クロマトグラフィ(ZIPTIP、Millipore, Inc)を用いて、両方の緩衝液を交換した。ZIPTIPにより清浄した試料を、同様に、5mMのEDTAでのインキュベーションに付した。Amiconコンセントレーターを用いて緩衝液交換したSOD1試料をHPLC水に交換し、一方ZIPTIP試料は、ZIPTIPの後、pH7.4のPBSまたはHPLC水にさらに交換した。DTTで還元されたSOD1を、1:1(20μM:20μMまたは10μM:10μM)または1:3(20μM:60μMまたは10μM:30μM)のタンパク質対架橋剤比でインキュベートした。
WtSOD1およびG93A SOD1を上述の通りにDTT処理し、1:1のモル比で架橋した。wtSOD1は前述の全ての架橋剤で架橋されたが、一方G93Aは、DTMEおよびビス(マレイミド)エタン(BMOE、スペーサーアーム8.0Å(0.8nm))で架橋された。BMOEを使用したのは、そのスペーサーアームの長さが比較的短いからであった。架橋の後、1μlの試料を、1μlのマトリクス、20mg/mLのシニピン酸を含むMALDI標的上でスポッティングし、Bruker Daltonics Microflex上で分析した。MALDIは、毎回、高分子量タンパク質較正標準Protein Calibration Standard I(Bruker Daltonics)を用いて較正した。MALDI−TOFを、72〜90%の間のレーザー出力を用いて線形モードで作動させた。MALDI−TOFスペクトルは、架橋されたものについてのものであり、未架橋試料は、FlexAnalysis software(Bruker Daltonics)を用いて分析した。トリプリケートで反復した。
前述の通り、1:1のモル比(5μM:5μM)でDMTEまたはBMOEを使用してG93Aを架橋させた。1時間後、3%のアセトニトリルおよび1%のギ酸を試料に加え、14,000RPMで10分間回転させて、沈殿したタンパク質を全てペレット化した。架橋した試料をオートサンプラ内に入れ、30分間3〜50%B、7分間50〜95%B、5分間95%B、1分間95〜3%Bそして15分間3%Bという勾配で、Proxeon 1D HPLCまたはEksigent 2D UPLCのいずれかの中に1μLの架橋した試料を吸引させた。緩衝液Aは、0.1%のギ酸を伴うHPLC水であり、緩衝液Bは100%のアセトニトリル、0.1%のギ酸である。液体クロマトグラフィの後、試料を、ナノスプレーイオン化を用いてイオン化し、94Tesla Bruker Daltonics FTMSを用いて分析した。FTMSを、Apex制御ソフトウェアを用いて制御し、Apollo IIソフトウェアを用いてソースパラメータを制御した。35〜40Vのスキマー1電圧を用いてスペクトル(モノマーおよびダイマーG93A)を収集し、一方、スキマー1の電圧を140Vに上昇させることにより架橋済みG93Aを断片化するためにファンネルスキマー解離を使用した。架橋されたおよび未架橋のG93AのLC−FTMSデータを、Date Analysisソフトウェア(Bruker Daltonics)を用いて分析した。これらの実験をトリプリケートで反復した。
前述の通りに、1:1のモル比(5μM:5μM)でBMOEを用いてG85Rを架橋した。1時間後、架橋されたタンパク質を99℃で30分間加熱し、次に10mMのTCEPで10分間インキュベートした。その後、加熱し還元した架橋済みG85Rを30℃で一晩、1.5μLの0.5mg/mLのGlu−Cと共にインキュベートした。消化した試料を14,000RPMで10分間回転させて、次に上記の勾配を用いてEksigent UPLC内に注入した。液体クロマトグラフィの後、ナノスプレーイオン化を用いて試料を導入し、CIDを用いてMS/MSデータを収集した。Bruker Daltonics Data Analysisソフトウェアを用いて化合物を同定し、デコンボリューションに付し、包括的マスコットファイルにエキスポートした。1.2Da(MS許容誤差)および0.6Da(MS/MS許容誤差)で、NCBIrデータベースを用いて、酵素として無しを選択するMASCOT検索エンジン内に包括的マスコットファイルをアップロードすることによって、架橋済みおよび未架橋分析を実施した。未架橋および架橋済み試料についてのMASCOT検索を比較し、架橋済み試料内では同定されたものの未架橋試料内では同定されなかったm/zを、架橋剤(220.05Da)としてBMOEを用いてMS Bridge(タンパク質プロスペクター、UCSF)検索に付した。MS Bridgeは、架橋済みペプチドの潜在的分子量全てに架橋剤の分子量に加えたものを検索する。架橋済みに関与するものとしてMS Bridge検索から同定されたペプチドを、データ分析ソフトウェア内で抽出イオンクロマトグラムによりさらに特徴づけした。
University of Georgia Chemical Analysis Lab(Athens、GA)において、誘導結合プラズマ質量分析法(ICP−MS)を用いて金属分析を実施した。簡単に言うと、各バリアント1μMと共に、ブランクとしての分析のために単独緩衝液を送った。分析はトリプリケートで反復した。さらに、各バリアント5μMを、直接注入法(direct infusion)を用いてESIモードでFTMSを使用して分析した。
溶融温度の上昇がタンパク質安定性の結合および増加を示唆するG93AおよびG85R SOD1の溶融曲線を、DTMEまたはBMOEおよび余剰の銅および亜鉛の両方の存在下または不在下で監視した。したがって、タンパク質の安定性に対するDMSOの効果を判定するために、2〜4%のDMSOの存在下で、架橋剤(これはDMSO中に再懸濁している)または銅および亜鉛の不在下で、タンパク質試料を分析した。最初の反応シーケンスにおいては、0〜20μMの増大する濃度のDTMEまたはBMOEと共に10μMの変異体SOD1をインキュベートし、20X SYPRO(商標)Orangeと共にインキュベートし、96ウェル平板に加えた。あるいは、第2の反応シーケンスでは、10μMの変異体SOD1を20μMの銅、20μMの亜鉛そして0〜20μMのBMOEまたはDTMEと共にインキュベートした。タンパク質の溶融温度を、毎分0.3℃の温度上昇で25〜100℃の間、RT−PCRマシン(AppliedBiosystems)を用いて監視した。それぞれのウェル各々から染料単独のブランクをサブトラクトすることによってデータを分析し、1に正規化し、折り畳み不良タンパク質の画分に対する温度の関係をグラフにした。DTMEまたはBMOE、銅、亜鉛、染料ブランクのサブトラクションにより、染料単独のブランクのサブトラクションと類似の結果が得られた。トリプリケートで反復した。
ニトロブル−テトラゾリウム(NBT)ゲルベースの検定を用いて、SOD1活性を監視した(69−72)。80μMの銅および亜鉛および/または42μMのBMOEの存在下または不在下で、10μg(約42μM)のwtまたは変異体SOD1をインキュベートし、次に12.5%のポリアクリルアミドゲル上で分析した。あるいは、80μMの銅および亜鉛および/または42μMのDTMEの存在下または不在下で、10μg(約42μM)のwtまたは変異体SOD1をインキュベートした。DTMEで架橋された試料を二分し、ここで半分を10mMのTCEPでインキュベートし、残りの半分はインキュベートせずに、その後12.5%のポリアクリルアミドゲル上で分析した。50mMのリン酸カリウム、pH7.8、NBT1錠(10mg/錠)および0.1mg/mLのリボフラボンを含む溶液を用いて、ゲルを45分間暗所で染色した。45分のインキュベーションの後、1μL/mLのTEMEDを添加し、ゲルを2分間光に曝露した。スーパーオキシドラジカルが、NBTから不溶性ブルーホルマゾンを形成させる。SOD1はスーパーオキシドを除去して青色形成を阻害することから、SOD1の活性は、無色のバンドとして見える。トリプリケートで反復した。
ダイマーSOD1を安定化させるための外因性マレイミド官能基架橋剤を用いた架橋
8〜14Aの範囲内の鎖長を有する被験マレイミド架橋剤は全て、ジチオ−ビスマレイミドエタン(DTME、スペーサーアーム13.3Å)、1,4−ビスマレイミジル−2,3−ジヒドロキシブタン(BMDB、スペーサーアーム10.2Å)、1,8−ビス−マレイミドジエチレングリコール(BM(PEG)2、スペーサーアーム14.7Å)、1,4ビスマレイミドブタン(BMB、スペーサーアーム10.9Å)およびトリス[2−マレイミドエチル]アミオン(TMEA、10.3Å)を含めたSOD1ダイマーの安定化を結果としてもたらした(図12)。あるいは、試験した1つのビニルスルホン、1,6−ヘキサノール−ビス−ビニルスルホン(HBVS、スペーサーアーム14.7Å)は、結果としてダイマーSOD1を形成しなかった(図12)。
DTMEで架橋されたG93Aバリアント(前駆体イオン)のファンネルスキマー解離(FSD)を用いた無傷のSOD1の質量およびMS/MS断片化データから、SOD1を架橋するための独特の反応機序であるチオール−ジスルフィド交換が明らかになった(図13)。第1に、無傷のSOD1および1/2のDTMEを伴うSOD1は、液体クロマトグラフィのランにおいて異なる保持時間で溶離し、それらが唯一の種でありしたがってDTMEのジスルフィドにおける断片化の可能性が排除されることを示唆している。第2に、断片化は、架橋の部位で優先的に発生する。半分のDTMEにより修飾された種は、DTMEのスペーサー内部のスルフヒドリル−スルフヒドリル結合とG93A上のシステイン残基のチオール部分との間で交換が起こったことを示唆している。最終的に、チオール−ジスルフィド交換の可能性は、SOD1構造のダイマー界面、具体的にはCys111においてDTMEの半分をモデル化することによってさらに確認された((2C9V(Strange、2006#95)))(図7)。こうして、本出願人らは、数多くの分子(図12)および2つの全く異なる反応機序、すなわちマレイミド(図8、図11および図12)およびチオール−ジスルフィド交換(図13)を用いて(ペプチドベースの治療戦略のためには後者が適している)効率良くSOD1モノマーを架橋することができた。
架橋部位を同定するために、本出願人らは、未架橋試料と架橋済み試料について、消化されたペプチドの配列データを提供するタンパク質分解およびLC−FTMS/MSデータを比較した(図14)。WTおよびG93A SOD1のプロテアーゼ耐性がおそらくは金属結合および分子内ジスルフィド結合を介して付与されていることから、プロテアーゼ耐性が比較的低いG85Rバリアントが使用された。m/z487.790(Mr973.563;残基1〜9、アセチル化N末端)は両方の試料中で観察され、未架橋試料と架橋済み試料におけるペプチドの類似の強度を浮彫りにする陽性対照として提示されている。本出願人らは、5232.674(m/z873.120)および5347.700(m/z892.291)という、架橋済み試料内にはあるものの未変性試料内には無い2つのMrを観察した。MS−Bridgeは、それぞれ架橋(BMOEを介して第2のモノマーの残基103〜126に架橋された1つのモノマーの残基103〜125)および(BMOEにより第2のモノマーの残基103〜126に架橋された1つのモノマーの残基103〜126)に関与しているものとして5232.674および5347.740の両方を同定した。5232.674についての予測された架橋は、6.19ppmの精度を有し、一方5347.700は、5.88ppmの精度を有していた。したがって、質量分析法では、架橋が化学量論的であり主としてCys111を通して発生したこと、そして他のSOD1システイン残基Cys6、Cys57およびCys146との交叉反応が比較的低いものであったことが確認された(図14)。注目すべきことに、架橋の複雑さに起因して、架橋されたペプチドの前駆体イオン断片化が欠如していた。
Sypro orangeは、タンパク質が変性されるにつれて露呈状態となる疎水性パッチに優先的に結合する。温度の関数としてのSypro orange結合を監視する蛍光ベースの検定を用いて、G93AとG85Rの両方の変性温度の傾向を観察した。この検定は、おそらくはSOD1の凝集の結果として可逆的でなく、変性温度は以前に観察されたSOD1の溶融温度に似ているものの、適切な熱力学的安定性を示さない。WT SOD1は、その溶融温度が検出限界(約100℃)にあることから、この検定を用いて監視できなかった。本出願人らは、分析した2つの変異体の安定性の空前の増加を観察した(図9および図15)。例えばG93A SOD1は約20℃までに安定化し;余剰の銅および亜鉛とのインキュベーションはG93Aの安定性に対し一切影響を及ぼさず;架橋剤の濃度が低くなると、G93Aの安定性に対しさらに大きい効果が及ぼされた。一方、G85R SOD1は、余剰の銅および亜鉛の存在下において約20℃で安定化し;銅、亜鉛および架橋剤の存在下において約45℃(約40℃〜85℃)でさらに増大し、架橋剤の濃度が高くなると、G85Rの安定性にさらに大きい効果がもたらされた。したがって、ここで、本質的に(共有の)薬理学的シャペロンであるものによって達成される安定化度は、本出願人らの知るかぎりいずれの疾病関連タンパク質に関してもSOD1についてこれまで達成された最高のものである。
安定性に加えて、本出願人らは、ゲルベースの検定を用いて、化学的架橋がSOD1活性に対して及ぼす影響を調査した。WTおよびG93A SOD1活性は、銅、亜鉛または化学的架橋の添加により影響されなかった。しかしながら、G85R SOD1の熱安定性を増大させることに加えて、化学的架橋は、その定性的金属結合親和力を増大させ、その結果として、G85R SOD1を、試験管内および生体内で触媒不活性であるタンパク質から、試験管内でそして潜在的には生体内でも活性であるタンパク質へと変換させた(図10)。DTME架橋中に観察されたG85R活性の増大は、TCEPを用いたDTMEの内部ジスルフィド結合の分割時点で逆転した(図16)。したがって、G85R SOD1の熱安定性の改善に加えて、これらの化合物は、酸化的ストレスに対する生命体の耐性を増大させる潜在的可能性を有し、本出願人らのアプローチは他の機能喪失疾患について考慮されてもよい。
単離されたままのWT、G93AおよびG85R SOD1の金属含有量は誘導結合プラズマ質量分析法(ICP−MS)を用いて決定され、これらは補足的表1の中に列挙されている。すなわち、単離されたままのWT SOD1はモノマー1個あたりおよそ2個の銅および亜鉛分子を含み、単離されたままのG93Aは、モノマー1個あたり1個の銅分子と1.5個の亜鉛分子を含み、G85Rはモノマー1個あたり1個未満の銅と1.5個の亜鉛を含んでいた。これらのデータから、WTおよびG93A SOD1は金属を十分に含み、さらに幾分かの偶発的な(非活性部位)金属結合が発生していたように思われる。したがって本出願人らは、FTMSを用いて金属含有量も同様に分析し、脱溶媒和プロセスが大部分の偶発的な金属を除去する傾向をもつことを観察した。すなわち、単離されたままのWT SOD1は、完全に金属化されているように思われ、単離されたままのG93A SOD1は約95%金属化されているように思われ、単離されたままのG85R SOD1は部分的に金属化され、金属化されていないまたは一価金属化(singly metallated)された画分のさらに大きい集団で約70%が金属化されていると思われた。これらのデータによって、G85Rの集団がより大きい割合の部分金属化形態および未金属化形態で構成されていることを理由として、G93A試料の場合に比べてG85R試料に対し外因性金属が添加された場合に観察された安定性の増大の説明がつくかもしれない。
本明細書中で引用されている全ての米国特許および米国公開特許出願は、本明細書に参照により援用される。
当業者であれば、本明細書中で記述された本発明の具体的実施形態に対する数多くの均等物を認識し、日常的なものにすぎない実験を用いてそれらを確認できるものである。このような均等物は、以下のクレームにより包含されるように意図されている。
Claims (15)
- 第1のSOD1モノマー、第2のSOD1モノマーおよび架橋剤を含む、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)類似体であって、
前記第1のSOD1モノマーが、野生型ヒトSOD1の111位に対応する第1のシステインを含み、
前記第2のSOD1モノマーが、野生型ヒトSOD1の111位に対応する第2のシステインを含み、
前記第1のシステインが前記架橋剤により前記第2のシステインに共有結合により接続されていることを特徴とする、安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ類似体。 - 前記第1のSOD1モノマーと前記第2のSOD1モノマーの配列同一性が85%以上であることを特徴とする、請求項1記載の類似体。
- 前記第1のSOD1モノマーと前記第2のSOD1モノマーが、実質的に同じアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1または2記載の類似体。
- 前記第1のSOD1モノマーが、野生型配列であるか、またはG93A、G85R、D90A、A4V、E100G、H46R、C6GおよびI113Tからなる群より選択される変異を含むことを特徴とする、請求項1〜3いずれか1項記載の類似体。
- 前記第2のSOD1モノマーが、野生型配列であるか、またはG93A、G85R、D90A、A4V、E100G、H46R、C6GおよびI113Tからなる群より選択される変異を含むことを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項記載の類似体。
- 前記架橋剤が、DTME、TMEA、BMDB、BM(PEG)2、BMBおよびBMOEからなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜5いずれか1項記載の類似体。
- 前記架橋剤が、有機水銀化合物、マレイミド、ビニルスルホンおよびアルキル化剤からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜5いずれか1項記載の類似体。
- 前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して10度から60度まで増大する;
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して20度から40度まで増大する;
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して15度から25度まで増大する;
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して30度から50度まで増大する;
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して20度増大する;または
前記類似体の変性温度が、未架橋のモノマーに比例して40度増大する、
ことを特徴とする請求項1〜7いずれか1項記載の類似体。 - 前記架橋剤が、7オングストローム(0.7nm)から11オングストローム(1.1nm)までの長さを有するスペーサーアームを含む;または
前記架橋剤が、9オングストローム(0.9nm)の長さを有するスペーサーアームを含む、
ことを特徴とする請求項1〜8いずれか1項記載の類似体。 - 前記類似体が、野生型スーパーオキシドジスムターゼ酵素の活性の少なくとも90%を75℃の温度まで保持することを特徴とする請求項1〜8いずれか1項記載の類似体。
- 請求項1〜10いずれか1項記載の安定化されたSOD1類似体、および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
- 安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)類似体の製造方法であって、第1のSOD1モノマー、第2のSOD1モノマー、および架橋剤を反応させて前記類似体を形成するステップを含み、
前記第1のSOD1モノマーが、野生型ヒトSOD1の111位に対応する第1のシステインを含み、
前記第2のSOD1モノマーが、野生型ヒトSOD1の111位に対応する第2のシステインを含み、
前記第1のSOD1モノマー、前記第2のSOD1モノマー、および前記架橋剤を反応させることにより、前記第1のシステインおよび前記第2のシステインを前記架橋剤に共有結合により接続する、
ことを特徴とする、製造方法。 - 請求項1〜10いずれか1項記載の安定化されたSOD1類似体を含む、神経性疾患を治療するための組成物。
- 請求項1〜10いずれか1項記載の安定化されたSOD1類似体を含む、神経変性疾患を予防するための組成物。
- 前記神経変性疾患が、筋委縮性側索硬化症であることを特徴とする、請求項13または14記載の組成物。
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