TWI592419B - 製造具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的方法及含彼之醫藥組合物 - Google Patents

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Description

製造具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的方法及含彼之醫藥組合物
       本發明係關於具有氧化還原活性之低金屬化(hypo-metallated)金屬硫(metallothionein, MT)蛋白的製造，特別是特定數目之金屬硫蛋白半胱氨酸結合位(MT cysteinyl binding sites)與生理相關金屬離子(physiologically relevant metal ions)結合的金屬硫蛋白的製造。本發明並關於含有具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的醫藥組合物，以及使用該組合物治療起因自高氧化壓力及/或鋅失衡所造成的疾病，其中清除自由基活性分子(free reactive species)以及平衡游離鋅含量以回應內部氧化還原電位，是有利於治療的。
       氧化壓力是一種經常發生於人體內之有害形式的化學壓力，主要發生於細胞內能量轉換之處，亦即粒線體內。自粒線體電子傳遞鏈中洩漏的電子被視為是造成細胞內自由基，例如活性氧物質(reactive oxygen species, ROS)、活性氮物質(reactive nitrogen species, RNS)等，產生的主因。外在刺激如環境化學物質、輻射、病毒感染，以及營養不良與生活習慣，都會造成自由基的產生，導致內部氧化壓力。因為自由基如ROS或RNS等含有未配對的電子，因此其顯現出相當程度的化學反應性(Cadenas等人，2000)，且會造成各種細胞內損傷如DNA氧化作用、脂質過氧化作用、酶不活化作用、RNA氧化作用等(Swindell，2011年)。若不加以控制，這樣的氧化壓力及隨之而來的分子損傷會表現出一系列的病症(Swindell，2011年)。例如，氧化壓力現被視為是代謝失調的潛在原因，包含但不限於糖尿病、高脂血症以及肥胖症，與年齡相關的神經性疾病，包含但不限於帕金森氏症與阿滋海默症，以及各種形式的癌症(Swindell，2011年；Chimienti，2013年；Furukawa等人，2004年；Özcan等人，2004年；Miyazaki等人，2008年；Vasto等人，2008年；Moreli等人，2014年)。
        自由基的產生與細胞內氧化還原狀態有著緊密的關聯，其中，氧化還原狀態必須被維持在嚴格的生理範圍內，以維持正常的身體功能(Jiang等人，1998年)。自由基的清除與不活化作用係由生理性抗氧化劑如麩胱甘肽(glutathione, GSH)、維生素C及E、類脂酸、類黃酮以及其他具有氧化還原活性的成分來完成(Aquilano等人，2014年)。這些具有保護作用的抗氧化劑的氧化還原活性亦與細胞的氧化還原狀態緊密連結，且其抗氧化能力的再生以及細胞內氧化還原電位的平衡係經由氧化還原活性金屬離子、酵素與受質等耦合的複雜交互作用所完成(Jiang等人，1998年；Aquilano等人，2014年)。內在抗氧化保護機制與氧化壓力源的超載，以及因此造成的細胞間氧化還原電位不平衡，將會無可避免地導致細胞內組成分的損傷與功能障礙，其表現於細胞、組織、器官以及最終系統性崩壞。
        金屬硫蛋白(MT)家族的成員在人類體內的中心作用包含如：氧化還原活性、自由基清除與金屬離子結合蛋白，連結抗氧化活性、自由基結合與金屬離子滴定至細胞內氧化還原電位等。金屬硫蛋白為低分子量、具有非常高含量的半胱胺酸的單鏈多胜肽。該半胱胺酸殘基上的硫氫基(sulfhydryl)使金屬硫蛋白可與金屬離子結合，且該半胱胺酸殘基上的硫氫基負責清除活性物質、展現抗氧化活性，以及對胞內氧化還原電位的改變作出反應(Babula等人，2012年)。
        在人類中，金屬硫蛋白被分成四個亞群(MT1-4)，其中MT1亞群含有至少8個確定的成員，且MT2-4亞群各含有1個確定的成員(Babula等人，2012年)。所有金屬硫蛋白異構物的活性半胱胺酸殘基在數量與位置上具有保守性，異構物之間的差異僅在於將這些半胱胺酸分隔開來的結構胺基酸，以及控制表現結構域的調節基因區域(Babula等人，2012年)。
        金屬硫蛋白MT1與MT2在人體內大部分的軟組織中表現，表現量最高在肝臟及腎臟，而金屬硫蛋白MT3被視為是腦專一性的異構物，在神經系統中具有最高的表現量，但也表現於心臟、腎臟及生殖器官中。金屬硫蛋白MT4異構物則顯現出最受限制的表現模式，目前僅於鱗狀上皮細胞中被發現(Babula等人，2012年)。金屬硫蛋白的表現由不同刺激所誘導，如壓力賀爾蒙(例如：醣皮質素glucocorticoids)、細胞激素(cytokines)、輻射線、重金屬以及化學污染、發炎，以及氧化壓力等(Babula等人，2012年)。金屬硫蛋白的半衰期視金屬化狀態(亦即，有多少結合位置與何種金屬離子結合)以及氧化還原狀態(亦即，有多少游離的半胱胺酸硫基團被氧化)兩者而定(Krezel等人，2007年)。金屬硫蛋白的降解主要發生於溶酶體內，且經由膽汁及尿道排出降解產物(Bremner等人，1987年)。
        基於金屬硫蛋白的重金屬結合、生理金屬離子滴定、自由基不活化作用、抗氧化劑以及氧化還原電位平衡的分子功能，最近金屬硫蛋白與一連串醫學疾病已被連結。在癌症情況下，在例如肝癌細胞、結腸癌細胞、乳突性甲狀腺癌細胞或前列腺癌細胞中，恢復金屬硫蛋白因病理性靜默的表現，已在體外及體內被證實可以阻止癌細胞的生長與轉移的潛能(亦即，遷移、黏附、浸潤)，以誘導其細胞凋亡以及減少腫瘤質量及體積(Mao等人，2012年；Yan等人，2012年；Fu等人，2013年；Arriaga等人，2014年；Han等人，2013年)。分子機制包含細胞內游離鋅含量的平衡，其亦已被證明可造成癌細胞對化療更加敏感(Arriaga等人，2014年)。
        中樞神經系統(central nervous system, CNS)中的慢性氧化壓力被廣泛地認為是與年齡相關的神經退化性疾病如帕金森氏症(Parkinson's Disease, PD)與阿滋海默症(Alzheimer's Disease, AD)的潛在原因(Eibl等人，2010年)。特別是，因為其化學性質，神經傳遞物質多巴胺(dopamine, DA)具有高度反應性，且其細胞內外的游離程度必須被嚴格調控(Eibl等人，2010年)。氧化多巴胺 (oxDA)製品具有神經毒性，且已被證實與各種細胞受質共價結合，因此阻礙其生物學上的功能。在各種受影響的蛋白質中，例如parkin蛋白，其基因亦與遺傳性家族性帕金森氏症有高度的關聯。經由氧化多巴胺 (oxDA)製品進行的Parkin蛋白的芳基化作用降低了Parkin蛋白的溶解度，並且損害其酵素活性(LaVoie等人，2005年)。經由氧化多巴胺(oxDA)物種進行的多巴胺運輸蛋白(其自突觸間隙清除游離多巴胺)的類似的芳基化作用，已被證實可不活化該運輸蛋白。在該突觸間隙中殘留的多巴胺會自動氧化，造成該問題進一步的惡化(Whitehead等人，2001年；Miyazaki等人，2008年)。金屬硫蛋白已被證實作為氧化多巴胺(oxDA)物種的直接受質，因而幫助不活化及清除該具有神經毒性的氧化多巴胺(oxDA) (Maret，2006年；Gauthier等人，2008年)。在鋅結合的金屬硫蛋白的芳基化作用後，鋅離子自金屬硫蛋白中釋放出來，且已知鋅不但可直接活化抗氧化劑銅-鋅-過氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)，亦可活化過氧化物歧化酶與過氧化氫酶基因的轉錄作用(Fattman等人，2003年)。金屬硫蛋白以這種方式進一步活化細胞防禦對抗由氧化多巴胺(oxDA)調節的氧化壓力(Eibl等人，2010年)。帕金森氏症的其他病理特徵包含a-突觸核蛋白(a-Synuclein, a-Syn)的突變及寡聚化。在帕金森氏症小鼠模式中已證實，人工活化金屬硫蛋白可以阻斷a-突觸核蛋白(a-Syn)的寡聚化，且可以去除有害的a-突觸核蛋白(a-Syn)寡聚體的氧化還原活性(Meloni等人，2011年)。過度活化表現金屬硫蛋白的小鼠在許多不同的帕金森氏症模式情境下，則可抵抗帕金森氏症的發生(Sharma等人，2013年；Ebadi等人，2005年)。
        阿滋海默症的病理特徵包含由銅調節的各種澱粉樣-b蛋白(amyloid-beta protein, b-AP)異構物的聚集、在這些b-AP斑塊中具有神經毒性的游離鋅含量的胞外累積，以及促氧化與具有神經毒性的鐵離子在神經元內的累積。所有這些有害的氧化還原電位相關的特徵可被金屬硫蛋白所抑制。例如，在小鼠阿滋海默模式中，施用與鋅結合的MT2蛋白已被證實經由鋅、銅離子交換而抑制b-AP異構物的聚集(Chung等人，2010年)。在一個鋅離子與銅離子交換的類似機制中，Meloni等人已證實與鋅離子結合的MT3蛋白(Zn2+ -MT3)可以在阿滋海默小鼠中去除活性氧物質(ROS)的產生以及b-AP斑塊所造成的神經毒性(Meloni等人，2008年)。
        慢性的不良生活方式以及營養不良所引起的氧化壓力也被確認為各種代謝失調的潛在原因(Chimienti, 2013)。對抗氧化壓力的內在保護機制的持續超載會導致新的脂肪儲存細胞(脂肪細胞)的分化與發展，以及脂質在這些脂肪細胞中的累積。在白色脂肪組織內脂質含量的增加會進一步導致氧化壓力程度的增加(Chimienti，2013年)。以金屬硫蛋白作為抗氧化劑被認為可以透過緩衝氧化壓力的程度以及提高抗氧劑保護的機制來打破這個自我擴增的週期(Chimienti，2013年；Sato等人，2010年；Higashimoto等人，2013年)。MT1及MT2蛋白已被證實在活體內可保護小鼠對抗高脂肪飲食所誘導的高脂血症及肥胖症(Sato等人，2010年)，以及對抗高脂肪飲食所誘導的氧化及內質網(endoplasmatic reticulum, ER)壓力所造成的氧化DNA損傷(Higashimoto等人，2013年)。此外，金屬硫蛋白可預防糖尿病腎病變與心肌病變，這兩者皆為基於高氧化及內質網壓力而由糖尿病所引起的疾病(Tachibana等人，2014年；Guo等人，2009年；Ruttkay-Nedecky等人，2013年)。亦有強而有力的證據顯示，與鋅結合的金屬硫蛋白可藉由在胰小島b細胞內精細地平衡細胞內游離鋅濃度，而協助穩定糖尿病患者異常的胰島素濃度，並使之正常化(Chimienti，2013年)。
       參考文獻 Cadenas E., and Davies K.J.A. (2000). Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med. 29: 222–230. Swindell, W.R. (2011). Metallothionein and the Biology of Aging. Ageing Res. Rev. 10(1): 132-45. Chimienti, F. (2013). Zinc, pancreatic islet function and diabetes: new insights into an old story. Nutrition Research Reviews 26: 1-11. Furukawa, S., et al. (2004). Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J. Clin. Invest. 114: 1752-61. Özcan, U., et al. (2004). Endoplasmatic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science 306: 457-61. Miyazaki, I., and Asanuma, M. (2008). Dopaminergic neuron-specific oxidative stress caused by dopamine itself. Acta Med. Okayama, 62 (3): 141-50. Vasto, S., et al. (2008). Inflammation, genes and zinc in Alzheimer's disease. Brain Res. Rev., 58: 96-105. Moreli, J.B., et al. (2014). 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        本發明第一方面係關於一種製造具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的方法。該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有20個半胱氨酸硫氫基，且因此形成7個金屬離子結合口袋。該20個半胱氨酸硫氫基中的2至16個未與金屬離子結合且為還原狀態，以及該7個結合口袋中的1至6個與金屬離子結合。該方法包含下列步驟： 提供一金屬硫蛋白； 去除該金屬硫蛋白上的金屬； 化學還原該去金屬的金屬硫蛋白的所有該20個半胱氨酸硫氫基；以及 藉由提供1、2、3、4、5或6個金屬離子給該7個結合口袋，以部分金屬化該去金屬並還原的金屬硫蛋白。
        在某些具體實施例中，該金屬硫蛋白具有如下之胺基酸公式： [Xn1 CXCXn2 CXCXn3 CXCXn4 CXCXn5 CXn6 CCXCCXn7 CXn8 CXn9 CXCXn10 CXCCXn11 ] 其中X係除了半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸與酪氨酸以外的任何生物來源的L型胺基酸，且n1至n11係任何由1至12的整數。
        在某些具體實施例中，在去除該金屬硫蛋白上的金屬的步驟之前，該方法進一步包含預先將該金屬硫蛋白完全金屬化的步驟。
        在某些具體實施例中，該去除該金屬硫蛋白上的金屬的步驟係由將該金屬硫蛋白酸化至pH值小於pH4的方式進行。
        在某些具體實施例中，在化學還原該去金屬的金屬硫蛋白的步驟之前，該方法進一步包含純化該去金屬的金屬硫蛋白的步驟。在某些具體實施例中，該純化該去金屬的金屬硫蛋白的步驟係由透析、陽離子交換層析法、逆相色層分析法、高壓液相層析法、電泳法、凝膠過濾層析法，以及磁力中的一種方式進行。
        在某些具體實施例中，該化學還原該去金屬的金屬硫蛋白的步驟係由加入還原劑的方式進行。在某些具體實施例中，該還原劑為麩胱甘肽(glutathione)、還原態菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamid adenine dinucleotide, NADH)、菸鹼酸(nicotinic acid)，以及二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)之一。
        在某些具體實施例中，該金屬離子係選自由鋅、銅、鐵，以及硒所組成的群組。
        本發明的第二方面係關於一種醫藥組合物，其包含至少一種以上述方法所製造的具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白。在某些具體實施例中，該至少一種具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有20個半胱氨酸硫氫基以及7個金屬離子結合口袋，該20個半胱氨酸硫氫基中的2至16個未與金屬離子結合且為還原狀態，以及該7個結合口袋中的1至6個與金屬離子結合。
        本發明的第三方面係關於以上述方法所製造的具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白於製備治療因為升高的細胞內氧化壓力、失衡的細胞內氧化還原電位、或氧化還原依賴型的金屬離子失衡所引起的疾病之藥物的應用。
        在某些具體實施例中，該因為升高的細胞內氧化壓力、失衡的細胞內氧化還原電位、或氧化還原依賴型的金屬離子失衡所引起的疾病為癌症、神經退化性疾病，以及代謝性失調其中之一。在某些具體實施例中，該癌症為肝癌、結腸癌、前列腺癌以及乳突性甲狀腺癌中的至少一種。在某些具體實施例中，該神經退化性疾病為帕金森氏症(Parkinson's disease)、阿滋海默症(Alzheimer's disease)、威爾森氏症(Wilson's Disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)，及/或杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's Disease)。在某些具體實施例中，該代謝性失調為第一型糖尿病、第二型糖尿病、高血脂症、肥胖症，及/或脂肪肝症候群。
        本發明的這些及其他方面將會從以下之較佳具體實施例的描述並結合以下圖式而變得清楚，雖然其中的變化與修飾可在不脫離本發明之精神與新穎概念的範圍前提下進行。
        本發明提供製造具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白(MT)的生物技術方法，根據本發明，該蛋白具有特定數目的金屬硫蛋白半胱氨酸結合位與生理相關金屬離子(較佳為鋅離子Zn2+ ，作為主要的生理性配體)結合，並具有另一特定數目的金屬硫蛋白半胱氨酸結合位未與金屬離子結合且處於化學性還原(即非氧化)狀態。
        根據本發明之一方面，本文所述之具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白皆具有在所有已知自然界中存在的哺乳動物金屬硫蛋白中所保存的胺基酸組成以及結構性主題，並帶有在數目上及分子內位置上皆保留的半胱氨酸胺基酸，其係該蛋白之生物活性所必需者。根據本發明，這樣的蛋白較佳地具有61至68個胺基酸的長度，且在保留位置上含有20個半胱氨酸殘基，因此形成了7個具有氧化還原活性的結合口袋，可與二價金屬離子結合。而該蛋白其餘部位的結構性胺基酸則可包含所有除了半胱氨酸以及芳香族胺基酸苯丙氨酸、色氨酸與酪氨酸以外的其他自然界中存在的生物胺基酸。
        在本發明的另一方面中，該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白，在根據本發明方法被製造後，與不少於1個且不多於6個生理相關金屬離子結合，例如鋅、鐵、銅或硒。因此，根據本發明，每個蛋白分子的金屬離子數目範圍為1至6個。
        在本發明之又一方面中，該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白，在根據本發明方法被製造、純化且與較佳的金屬離子部分金屬化之後，含有未與金屬離子結合的半胱氨酸結合口袋，其係由帶有未氧化的(即化學還原的)硫氫基的半胱氨酸殘基所組成。當該蛋白含有1、2、3、4、5或6個未與金屬離子結合的半胱氨酸結合口袋時，每個蛋白分子中分別含有2、5、9、12、13或16個未與金屬離子結合且為還原狀態的半胱氨酸硫氫基。因此，根據本發明，每個蛋白分子中未與金屬離子結合且為還原狀態的半胱氨酸硫氫基數目的範圍為2至16。
        根據目前現有的科學數據，金屬硫蛋白的主要生理學形式為完全金屬化且氧化的異構物以及完全還原且未與金屬結合的前驅蛋白(Krezel等人，2007年，參閱上述)。中間形式的金屬硫蛋白，亦即部分氧化或部分金屬化的金屬硫蛋白，則從未在活體細胞內被偵測到或分離到。
        從功能的角度來看，完全氧化的金屬硫蛋白無法清除自由基、不具有抗氧化活性、亦無法結合或釋放金屬離子。而完全還原的金屬硫蛋白前驅蛋白則能夠作為抗氧化劑且能與金屬離子結合，但邏輯上其無法釋放金屬離子以對氧化還原狀態的改變作出反應。此外，完全金屬化的金屬硫蛋白可以釋放金屬離子以對氧化還原狀態的改變作出反應且作為抗氧化劑，但其無法與額外的金屬結合。結果，只有低金屬化的金屬硫蛋白且其上未與金屬結合的半胱氨酸殘基為還原狀態者才能兼具所有功能，作為抗氧化劑、與金屬離子結合、以及釋放金屬離子以對氧化還原狀態的改變作出反應。
        此外，從「游離鋅濃度的良好平衡」(以及其所有的下游影響)的角度來看，只有部分金屬化的金屬硫蛋白可以同時作為鋅離子的「儲存庫」與「來源」。為了因應氧化還原電位的改變，完全金屬化的金屬硫蛋白無法降低游離鋅的濃度，而未與金屬結合的金屬硫蛋白前驅蛋白則無法釋放鋅離子。
        整體看來，本發明在功能上活化了自然存在或人工設計的金屬硫蛋白，藉由產生具有特定金屬化及氧化還原狀態的低金屬化金屬硫蛋白，使其能夠具有這些特定功能。反觀，自然存在形式的金屬硫蛋白，在其自然存在的金屬化及氧化還原狀態下，則無法有相同的作用。
        本發明進一步提供含有該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的醫藥組合物。該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白保留了其全部未受損的金屬離子負載、其氧化還原電位反應，以及根據其還原的半胱氨酸硫氫基數目多寡的抗氧化能力。
        本發明亦提供該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的醫療與醫藥用途，以用於預防及治療任何因為升高的細胞內氧化壓力、失衡的細胞內氧化還原電位、或氧化還原依賴型的金屬離子失衡所引起的疾病。據此，本發明係關於含有該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的醫藥組合物在治療疾病上的用途，其中細胞內氧化還原電位、氧化壓力程度、以及與氧化還原電位有關連的金屬離子的正常化及穩定化，對於該治療是有益且具有支持性的。在本發明中，這些相關的疾病包含但不限於：各種形式的癌症，如肝癌、結腸癌、前列腺癌以及乳突性甲狀腺癌；各種神經退化性疾病，如帕金森氏症、阿滋海默症、威爾森氏症(Wilson's Disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's Disease)；各種代謝性失調，例如糖尿病、高血脂症、肥胖症、脂肪肝症候群。
       金屬硫蛋白前驅蛋白的製造
        本發明所述之金屬硫蛋白前驅蛋白，在其半胱胺酸硫殘基具有不確定金屬化狀態與不確定氧化還原狀態的天然形式下，可藉由任何常規方法所製造，如重組DNA技術、蛋白合成、前蛋白原的酵素裂解、或哺乳動物金屬硫蛋白在自然界中存在的變異的分離等。
        因此，在本發明之一較佳具體實施例中，該金屬硫蛋白前驅蛋白係以習知之重組DNA技術(Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，冷泉港，1989年，以及其內所引用之文獻)製造。編碼個別全長金屬硫蛋白異構物的DNA序列可由標準核酸合成方法所合成，或可由直接自適當的基因組或cDNA文庫中分離的習知實驗室方法獲得，或是以標準的聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)方法直接自該文庫中複製並擴增。
        該DNA序列，經過適當的製備與純化之後，可被置入所選之重組表現載體，亦使用習知之標準方法。適當載體的選擇可視所用的蛋白表現系統而定。該表現系統為習知且廣泛地被描述於本發明技術領域之技藝者所公知的科學文獻中，該表現系統包含原核細菌細胞、真核酵母菌與真菌細胞，以及來自高等動物如昆蟲、節肢動物或哺乳動物的細胞培養物。可透過已建立的實驗室操作手冊之協助，將帶有編碼該所選的金屬硫蛋白變體之序列的蛋白表現載體置入適當的宿主細胞內。
        蛋白表現系統的選擇，以及置入所述編碼任何所選之金屬硫蛋白變體的DNA序列的相容重組表現載體的選擇，亦可決定例如以下之特徵： 選擇染色體外的質體載體或插入宿主細胞基因組的載體； 選擇並包括用以轉錄活化的適當啟動子序列以及轉錄終止子序列； 選擇並包括複製起始點序列以及選擇標記序列；以及 選擇並包含適合用來進行所選之蛋白表現及純化方法的融合蛋白與蛋白酶切割位置。
        所有這些及其他關於已建立的蛋白表現方法的特徵皆為本發明技術領域之技藝者所習知，且可依照相關之已建立的標準生物技術方法而決定。
        因此，據上所述，本發明之一較佳具體實施例使用以酵母菌為基礎的蛋白表現系統，乳酸克魯維斯酵母菌(Kluyveromyces lactis )(New England Biolabs公司，麻州，美國)。
        於一較佳具體實施例中，哺乳動物(如：牛或人類)的金屬硫蛋白異構物的編碼區可自適當的cDNA文庫進行PCR擴增，使用對各別目標基因具有專一性且含有限制酶切位如Xho I與Not I以及Kex蛋白酶切割位置的標準合成的PCR引子。在根據製造商提供之實驗室操作手冊進行PCR擴增所需DNA片段之後，使用Xho I與Not I限制性核酸內切酶與DNA連接酶(DNA ligase I)，將該DNA片段選殖到該製造商的pKLAC2質體載體中。經過使用限制性核酸內切酶Sac II以及該pKLAC2載體內含的相容限制酶，以將該載體進行適當的純化及線性化之後，可將該線性化基因表現組合轉形至該製造商所提供之勝任酵母菌細胞K. lactis 內。藉由使用該pKLAC2載體內含的陽性與陰性篩選標記，可依照製造商提供的實驗室操作手冊篩選K. lactis 的陽性選殖株，該陽性選殖株含有正確地合併至該宿主的基因組中的單個或多個拷貝數的所需金屬硫蛋白基因表現組合。因此，在本發明此一具體實施例中，所述穩定轉形的K. lactis 細胞接著可在適當培養基中培養，以穩定表現該所選之金屬硫蛋白變體，該金屬硫蛋白變體是在K. lactis 細胞內含的LAC4啟動子的轉錄控制下，所表現的融合到K. lactis 細胞內含的a-交配因子區域結構域(a-mating factor domain, a-MF)的融合蛋白；且在a-MF結構域被內含的Kex蛋白酶裂解後，產生所需的金屬硫蛋白的天然形式、轉譯後修飾形式，這些蛋白具有非特定金屬化狀態，以及非特定氧化還原狀態的半胱氨酸硫殘基。
       金屬硫蛋白的純化、還原及低金屬化作用
        本發明主要的目的之一即在於提供帶有特定數目的金屬離子以及帶有特定數目的未與金屬離子結合的半胱氨酸硫殘基的金屬硫蛋白，該特定數目的金屬離子協同地與該金屬硫蛋白的半胱氨酸殘基結合，而該帶有特定數目的未與金屬離子結合的半胱氨酸硫殘基則以化學還原硫氫基(-SH)形式存在。因此，本發明的較佳具體實施例利用合適的方法製造這種具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白，其中上述金屬硫蛋白前驅蛋白可被完全去金屬化、化學還原其半胱氨酸硫氫基，然後以特定數目的較佳生理相關金屬離子，如鋅、銅、鐵或其他金屬，對該蛋白進行部分金屬化。
        依照本發明，所選之金屬硫蛋白前驅蛋白的天然形式，具有不特定的金屬化及氧化還原狀態，係以任何上述的重組DNA技術、蛋白合成、前蛋白原的酶切割、該金屬硫蛋白變體的分離，或如各別自培養基、緩衝溶液或生物基質中分離及純化等的其他方法所製造。
        根據本發明，該初始的分離及純化可以任何為本發明技術領域之技藝者所公知的標準蛋白生化方法來達成。並可就先前所選的金屬硫蛋白前驅蛋白的製造方法(如上所述)以及該金屬硫蛋白前驅蛋白的給定條件來選擇已建立的方法，如在適當的水性緩衝液中進行透析、陽離子交換層析法、逆相色層分析法、高壓液相層析法、電泳法、凝膠過濾層析法等。亦可藉由使用磁力來分離各金屬硫蛋白，其中該金屬硫蛋白先以離子(如鋅離子)進行完全地預先金屬化。這種預先金屬化的目的在於使該金屬硫蛋白可進行預先分離及純化，而與特定數量的所選生理金屬離子的最終結合則是為了製造本發明終產物低金屬化金屬硫蛋白，這兩種金屬化作用是有區別性的。
        本發明之一較佳具體實施例使用了上述在酵母菌K. lactis 中表現金屬硫蛋白的重組DNA方法。在該具體實施例中，所選之金屬硫蛋白異構物，作為前驅蛋白，會被分泌到各自的培養基中，且會留在溶液中，具有不確定的金屬化及氧化還原狀態，。以例如離心或過濾等標準方法將酵母菌從培養基中分離之後，使用例如Bradford蛋白分析法等標準已建立的方法來確定該金屬硫蛋白的蛋白濃度。這會使得金屬離子所需最大量的計算受到該現存金屬硫蛋白的約束，假設所有的金屬硫蛋白結合位置都未被金屬離子佔領。由於每一莫耳的金屬硫蛋白最多可與7莫耳的雙價金屬離子結合，可添加適當數量的鋅鹽(如：硫酸鋅或氯化鋅)到該金屬硫蛋白溶液中，以使之完全地預先金屬化。該完全重構的與7個鋅離子結合的金屬硫蛋白(Zn7 -MT protein)可藉由使用磁力自該溶液中回收。
        本發明其他較佳具體實施例可使用其他標準、已建立的分離及純化方法，且可能導致分離的金屬硫蛋白具有其它或不確定的預先金屬化的狀態。
        任何分離的該金屬硫蛋白，不論其中所含的金屬化狀態如何，接著可進行酸化至任何低於pH4的pH值，以使所有結合的金屬離子完全解離。在本發明較佳具體實施例中，可選擇任何具有pKa值在1.27至4.76之間的天然存在的單價酸(蟻酸、醋酸、草酸、抗壞血酸，或其他)，並且可藉由分步添加各種酸，接著以標準方法測量該溶液的pH值，直到pH值低於pH4以下來，以達到酸化至pH4以下，或是藉由根據溶液中金屬硫蛋白的濃度(參閱上文)來計算所需的氫離子(氫離子在各別水溶液中)數量。例如，在這樣的計算中，每莫耳的金屬硫蛋白需要20莫耳的氫離子，以使所有先前與金屬結合的半胱氨酸硫殘基以氫離子飽和，假設該金屬硫蛋白已經完全預先金屬化了。
        本發明主要的目的之一係將帶有特定數目的特定金屬離子的金屬硫蛋白進行部分金屬化，上述金屬硫蛋白的分離物，在完全去金屬化之後，可自任何金屬離子中純化，包含可能已被用來進行預先金屬化作用的金屬離子(請參閱上述)。此純化作用，視本發明的具體實施例而定，可藉由任何標準蛋白生化方法達成，例如，藉由對適當的無金屬緩衝溶液進行透析。在其他具體實施例中，電泳方法或磁力可被用於去除所述金屬離子。在任何選擇的去除金屬離子的方法中，所給定的金屬硫蛋白溶液的pH值被維持在低於pH4以下，以確保所述金屬硫蛋白的無金屬狀態，並能夠完全去除任何所述的金屬離子。
        根據本發明，該相對應的金屬硫蛋白異構物，在經過上述分離、純化以及去金屬化作用之後，現在可置於化學還原狀態，以確保任何可能被氧化的半胱胺酸硫殘基的化學還原狀態。在本發明之較佳具體實施例中，可藉由添加必要數量的適當還原劑到所述之金屬硫蛋白溶液中以達到上述化學還原狀態，適當的還原劑包含但不限於麩胱甘肽(glutathione)、還原態菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamid adenine dinucleotide, NADH)、菸鹼酸(nicotinic acid)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)或其他生物化學電子供體。對化學還原所有現存的半胱胺酸硫殘基必需的還原劑的數量，可再次地由上述蛋白濃度計算而來，且根據該假設，所有的半胱胺酸硫殘基應該會被氧化。例如，在溶液中1莫耳的金屬硫蛋白可能因此需要20莫耳的單價還原劑，以將所有金屬硫蛋白半胱胺酸硫殘基完全還原為硫氫基(-SH)形式。
        根據本發明，上述金屬硫蛋白異構物，現在已完全地去金屬化且其半胱胺酸硫殘基完全地還原，並且在還原條件下仍存在於酸性溶液中，現階段可以一定數目的所選金屬離子，例如鋅離子，而被部分金屬化。於本發明之一較佳具體實施例中，該給定的金屬硫蛋白異構物可被重新建構為部分金屬化的Zn4 -MT形式，其中每一個金屬硫蛋白分子與4個雙價鋅離子結合。鋅離子的必需量可基於溶液中金屬硫蛋白異構物的濃度來計算，且4莫耳當量的鋅離子可加到該溶液中，較佳為硫酸鋅或氯化鋅。為了使部分金屬化的ZN4 -MT蛋白異構物能夠重新建構，該溶液的pH值可由先前的酸性升高至中性，而pH值介於pH6.5至pH7.5之間則被認為是中性。這可以藉由將必需數量的中和劑，如氫氧化銨、醋酸銨或其他，加入至該溶液中，且使用標準pH測量方法連續測量該溶液的pH值，直到達到該中性pH值為止。是以，在本發明此一具體實施例中，部分鋅-金屬化的金屬硫蛋白異構物可被製造，該異構物的每一分子與4個鋅離子結合，且其未與金屬離子結合的游離半胱胺酸硫氫基則為化學還原狀態，因而具有氧化還原活性。
        在本發明其他具體實施例中，不同的金屬化狀態的金屬硫蛋白，如其中每一分子僅與1至3個鋅離子結合且分別有更多的半胱氨酸硫氫基殘基被還原而具有氧化還原活性，或每一分子甚至與5或6個鋅離子結合且分別有較少的半胱氨酸硫氫基被還原而具有氧化還原活性，或者以鋅以外的生理金屬離子(如銅、鐵、硒，或其他)進行低金屬化者，皆可以類似的方式來製造。因此，除了本發明的具體實施例之外，以銅離子進行部分金屬化作用可以藉由在上述方法中以銅鹽置換鋅鹽而達成，而在其它具體實施例中，以任何選擇的金屬離子進行不同的金屬化狀態可由調整各金屬鹽的必需數量來實現。
        根據本發明，所選擇的金屬硫蛋白異構物，其在現階段為部分金屬化，其係帶有特定數目的特定金屬離子，且其在現階段具有氧化還原活性，其係帶有特定數目的半胱胺酸硫殘基以還原的硫氫基呈現，現在可以進行分離及純化，以為了可以進行隨後的製造而成為下述化合物。在本發明較佳的具體實施例中，最終純化步驟可藉由任何已建立的蛋白生化方法來完成，這些方法可使該金屬硫蛋白異構物的金屬化與氧化還原狀態未受損害。據此，在此一最終純化步驟中，應該避免pH值低於pH4以下，以及化學氧化狀態。
       金屬硫蛋白
        根據本發明之一方面，本文所述之金屬硫蛋白共享在所有已知的天然存在的哺乳動物金屬硫蛋白中保守的胺基酸組成與結構主題，並帶有胺基酸L-半胱胺酸，其為該蛋白生物活性所必需，並且在數目上以及分子內位置上皆保守。這樣的蛋白，取決於具體實施例，較佳為61~68個胺基酸長，且在保守位置上精確地包含20個半胱氨酸殘基，因此精確地形成7個具有氧化還原活性的結合口袋，其中每個口袋允許協調一種二價金屬離子的結合。根據該具體實施例，包含該蛋白的其餘部分的胺基酸可以包括所有其他天然存在的生物體的L-胺基酸，除了半胱氨酸與芳香族胺基酸，苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸之外。
        在另一方面，本發明關於具有以下胺基酸公式的金屬硫蛋白： [Xn1 CXCXn2 CXCXn3 CXCXn4 CXCXn5 CXn6 CCXCCXn7 CXn8 CXn9 CXCXn10 CXCCXn11 ], 其中，“X”可以是任何生物來源的L-胺基酸，除了半胱氨酸(“C”) 與芳香族胺基酸，苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸以外，且其中“n1”至“n11”可為任何1至12的整數。因此，在本發明的這一方面以及根據本具體實施例，該蛋白質可為38至159個胺基酸長，且在根據上述公式中的保守位置上含有不多也不少於20個L-半胱氨酸，並且不含芳香族胺基酸。本發明金屬硫蛋白的胺基酸序列可以是天然存在的或人工合成的。在一些具體實施例中，該金屬硫蛋白為具有如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列的人類金屬硫蛋白1a蛋白(MT1a)及/或具有如SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列的牛金屬硫蛋白2a蛋白(MT2a)。
        在又一方面，本發明係關於由單一胺基酸鏈組成的蛋白，並關於該蛋白的單體。然而，在涉及到本發明的另一方面中，該蛋白在根據本發明進行低金屬化與氧化還原活化之後，亦可進行二聚化或多聚化，以作為均聚物或異聚體之後，被製成具有生物活性的化合物與藥物組合物(如下所述)。
        本發明亦關於一種天然存在或人工引入的該蛋白的游離羧基端與氨基端的修飾，以及天然存在或人工引入的分子內胺基酸側鏈的修飾，例如糖基化、乙醯化，肉荳蔻醯化或其他。
        在本上下文中，術語如「蛋白異構物」、「胺基酸組成」、「結構主題」、「保守」、「結合口袋」及其他關於胺基酸及蛋白結構及功能的術語，係根據本領域技術人員所熟知的廣泛被接受的科學標準來使用。
       化合物
        根據本發明，一化合物可含有任何生物活性量的可能的金屬硫蛋白異構物的任何組合，具有如上述的任何金屬化與氧化還原狀態，或純組合物，這取決於具體實施例。
        這表示，根據本發明的該化合物可配製成蛋白異構物專一的化合物，只包含一個給定的金屬硫蛋白異構物，或為該金屬硫蛋白異構物的混合物，含有根據本發明所製造的金屬硫蛋白異構物的任何可能的組合。
        這也表示，根據本發明的該化合物可以含有只有一種特定金屬化狀態且只與一種金屬離子在只有一種特定莫耳當量下結合的金屬硫蛋白異構物，或可以包含該金屬硫蛋白的混合物，與多於一種的金屬離子在相同或多於一種特定莫耳當量下結合。因此，可能包含只有一種特定氧化還原狀態的金屬硫蛋白，或可能包含具有不同特定氧化還原狀態的該金屬硫蛋白的混合物之化合物，也都在本發明的範圍內。
        此外，本發明的化合物可含有該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白異構物以作為單體、均聚物或異源二聚體，或同源或異源多聚體，這取決於實施例。
        因此，在本發明的較佳具體實施例中，一特定的化合物可以只包含一個特定的金屬硫蛋白異構物，只具有一種金屬離子在一特定的莫耳當量下與該蛋白結合，從而允許該蛋白只有一種特定的氧化還原狀態。然而，如上所述，各種金屬化與氧化還原狀態的金屬硫蛋白異構物的可能的特定組合也在本發明的範圍內。
       醫藥組合物
        本發明亦關於包含一或多種上述定義之化合物的醫藥組合物，其中該化合物含有上述具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白，其帶有未損傷的金屬負載、氧化還原狀態與生物活性，並且能夠平衡細胞內氧化還原電位、清除自由基物種引起的氧化壓力，並因應氧化還原電位而平衡游離金屬離子的程度。因此，本發明關於基於所述具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的醫藥組合物，其中該組合物在投與受試者時，有利於治療該受試者因為並顯示升高的細胞內氧化壓力、失衡的細胞內氧化還原電位、及氧化還原依賴型的游離金屬離子失衡所引起的疾病。
        根據本發明，一醫藥組合物，其在本文中可同義地被稱為「藥物」，包括有效量的一或多種上述化合物，以其無添加的形式，或者，取決於具體實施例，與藥學上可接受之添加劑結合，例如賦形劑、稀釋劑或載體。將該藥物配製為口服用藥是本發明的一種較佳具體實施例。然而，在其他的具體實施例中，該藥物還可以配製用於靜脈內給藥、經皮給藥，或其它給藥途徑。配製用於任何給定的給藥途徑的藥物亦可預先確定選擇要添加至該藥物的醫藥添加劑，以及醫藥活性成分的數量及濃度。對基於蛋白質的醫藥組合物的配製策略已被建立，在科學文獻中廣泛地被描述，並且為本領域技術人員所公知(Banga A. K., Therapeutic Peptides and Protein Formulation: Processing and Delivery Systems, Technomic Publishing AG, Basel 1995，及其參考文獻)。
        因此，根據上述以及視實施例而定，本發明的醫藥組合物可配製成口服給藥使用，並添加標準賦形劑如，甘露醇、乳糖或澱粉、纖維素以及其他相容的添加劑，其不損害該活性成分的金屬化作用及氧化還原狀態。這樣的口服製劑可為丸劑、片劑、持續釋放製劑、膠囊、粉劑、溶液製劑、懸浮劑或乳劑等形式，且一般含有10-95%的所述活性成分，特別是含有25-75%。可添加低濃度的輔助物質，其有助於改善所述醫藥組合物的吸收、運輸及/或效力。
        配製該組合物以用於注射或經皮施用也在本發明的範疇內，在這種情況下，可加入適當合適的賦形劑，如水、鹽水、葡萄糖或甘油。再次地，配製該醫藥組合物以用於這些或任何其他選擇的施用途徑不會以任何方式損害該活性成分的金屬化及氧化還原狀態。關於這樣的配方策略以及各種可能的添加劑的規範是公開的，且為本領域技術人員所熟知。
        含有所述活性成分的所述製劑可以與劑型相容的方式，並以治療有效量施用。施用的活性成分的治療有效量可取決於受試者、該受試者的年齡與體重、待治療的病症以及所述病症的階段，以及給藥的途徑。給藥的途徑，以及治療時間及劑量可再次地取決於受試者的年齡及體重，以及取決於待治療的病症，以及該病症的階段。因為這是本發明的一個較佳具體實施例，以預防方法使用所述活性成分，連續低劑量的給藥方案可根據受試者的情況進行配製。
       生物活性
        根據本發明，具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白、含有該蛋白的化合物，以及含有該化合物並因此含有該蛋白的醫藥組合物具有如上所述的生物活性。本發明較佳地關於生物活性，例如結合及釋放生理金屬離子的能力，以回應細胞內氧化還原電位的改變，結合及清除具有氧化還原活性的重金屬離子的能力，以清除並使自由基例如ROS、RNS及其他自由基失去活性，從而發揮抗氧化的功能以及將細胞內氧化還原電位平衡於生理水平量。
        更具體地，本發明中關於結合及釋放鋅離子能力的生理活性，以回應細胞內氧化還原電位的改變，例如因升高的氧化壓力所誘導的氧化還原電位的改變。這種自所述金屬硫蛋白結合及/或釋放鋅離子的能力，以回應細胞內氧化還原電位的改變，可被解釋為平衡游離鋅的胞內含量的能力，並且還涉及本發明中的生物活性。
        在這種情況下，氧化壓力以及因此細胞內氧化還原電位產生的改變，可被自由基誘導，例如活性氧物質、活性氮物質、超氧陰離子自由基，或任何其他含有一或多個未配對電子的自由基。
        此外，生物活性也涉及抗氧化活性的能力，其中該氧化壓力誘導的自由基透過所述金屬硫蛋白的游離半胱氨酸硫氫基殘基而被結合，因而失去活性(也被同義地稱為「清除」)。這樣清除自由基將因此也平衡了細胞內氧化還原電位，故平衡細胞內氧化還原電位的能力被視為是本發明中生物活性的另一方面。
        此外，根據本發明之生物活性還涉及一種重金屬如鎘、鉛或其他的協調結合能力，並由此清除以及使所述重金屬離子失去生物活性。
        在某些具體實施例中，本發明還涉及一種生物活性，例如結合及/或釋放上述鋅離子以外的生理金屬離子，如銅或鐵離子的能力。
        在另外的具體實施例中，本發明涉及生物活性，如透過氧化還原耦合再生其他細胞內抗氧化劑，如穀胱甘肽、NADH或其他的能力，其中，該抗氧化劑的氧化形式透過所述金屬硫蛋白的氧化還原活性的半胱氨酸硫氫基而被化學還原。這可能再次被解釋為如上文已經描述的s平衡細胞內氧化還原電位的能力。
        在本發明一個較佳具體實施例中，生物活性涉及該金屬硫蛋白的能力，以直接結合並使氧化多巴胺產物失去活性，或任何其它由上述氧化壓力誘導的自由基所氧化的產物。根據不同的實施例，這包括透過所述金屬硫蛋白的氧化還原活性的半胱氨酸硫氫基而造成該非氧化形式的細胞成分的再生。
        術語「氧化還原活性」係指參與生化還原-氧化反應的能力(通常稱為「氧化還原反應」)，其中還原劑藉由提供電子而被化學氧化，且氧化劑藉由接受電子的而被化學還原。根據本發明，所述金屬硫蛋白具有氧化還原活性，因為藉由從其游離及還原的半胱氨酸硫氫基中提供電子，以及氧化還原依賴性結合或釋放鋅離子，它們能夠作為還原劑及氧化劑而參與這樣的氧化還原反應。
        本發明之一主要目標為，將金屬離子結合及平衡、抗氧化劑及清除活性的所有上述生物活性，以及氧化還原活性與氧化還原電位平衡的能力集合於一個相同的蛋白中，即上述具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白。
        在其他具體實施例中，本發明涉及生物活性，其可被視為上述活性的機制性的「下游」或「次級」。這種間接的生物活性包括，例如，抑制及/或遏止炎症的能力、抑制及/或遏止自體免疫反應的能力，或調節基因活性的能力。這樣的生物活性可能被稱為「次要」或間接的，因為他們是，以機制來說，根據上述金屬硫蛋白的「主要」功能，例如平衡游離金屬離子的含量、抗氧化劑以及清除活性、氧化還原活性或氧化還原電位平衡的能力。然而，這種間接的生物活性是包含在本發明的範疇之內。
        在進一步的具體實施例中，本發明還涉及生物活性，例如在惡性細胞如各種癌細胞內誘導細胞週期停滯與細胞凋亡的能力，或抑制這些癌細胞的轉移特性的能力，如遷移與侵襲的能力。這樣的生物活性亦包括刺激及促進神經細胞再生的能力，如在例如美國專利第8618060號及其引用的參考文獻中被廣泛地敘述，在此以參考文獻方式引入其內容。其分子機制係經科學證明為直接或間接地歸因於金屬硫蛋白的上述生物活性，因此這些相應的生物活性亦包含在本發明的範疇之內。
        該金屬硫蛋白的上述生物活性可能，取決於本發明的具體實施例，可以在人體內的任何生理隔室中施用，其中所述活性是有利於治療或預防所述病症的。任何在所述醫藥組合物內的所述金屬硫蛋白的製劑，以及任何將該蛋白施與至該體內隔室的途徑，其係可使上述生物活性充分被保護，都在本發明的範疇之內。
       治療
        根據本發明，治療涉及以本發明之蛋白、化合物或醫藥組合物預防及治療受試者，不論何時上述該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的直接或間接生物活性，如平衡細胞內游離的金屬離子的含量、抗氧化活性、清除活性、氧化還原活性、氧化還原電位平衡的能力以及其他，都是對治療有益的。
        根據本發明，這樣的治療涉及所述藥物中的任何適用製劑，並涉及該藥物任何適用的給藥路線，以及涉及任何以該藥物進行適用的治療方案，取決於待治療之受試及病症。術語「適用的」意指，如上所定義，本發明之蛋白、化合物與醫藥組合物之未損傷的生物功能。
        為本領域技術人員所熟知的是，廣泛大量的實驗及臨床數據證實，升高的氧化壓力(以及不平衡的細胞內氧化還原電位)與一系列臨床病症如各種癌症、代謝性疾病或神經退化性疾病，之間有直接的關聯，且氧化壓力為該病症的潛在原因及/或直接主要的效應或症狀。因此，根據不同的具體實施例，本發明之蛋白、化合物及醫藥組合物可被用於治療及預防任何可以與升高的氧化壓力與失衡的細胞內氧化還原電位連結的病症。
        具體地，在較佳具體實施例中，本發明之藥物可被用於治療如帕金森氏症、阿滋海默症、杭丁頓氏舞蹈、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、威爾森氏症、癡呆，以及其他相關的神經退化性疾病。
        在其它較佳具體實施例中，本發明之藥物可被用於治療如高血脂症、肥胖症、第一型糖尿病、第二型糖尿病、脂肪肝症候群，以及其他相關的代謝性失調。
        此外，在其它較佳具體實施例中，本發明之藥物可被用於治療如肝癌、乳突性甲狀腺癌、結腸癌，以及相關的癌症。
        根據本發明，在任何上述的條件的情況下，本發明之藥物可被用於治療或預防各個病症，包括治療性或預防性處理該病症的根本原因，以及用於治療或預防該病症之效果、表現與症狀，透過本文所定義之蛋白、化合物或醫藥組合物而達成。
        如本文敘述中所用以及以下整個申請專利範圍中，除非上下文另有明確說明，「一」、「一個」以及「該」的意思包括複數引用。此外，為了讀者的方便，標題或副標題亦可使用於本說明書中，其對本發明的範圍沒有任何影響。
        本文所述之技術與科學術語的含義可以被本領域之普通技術人員所清楚理解。 【00100】    以下實施例中更加具體地描述本發明，其目的僅為說明之用，因為其中許多修飾及變化對本領域技藝者而言是顯見的。以下將對本發明之各種具體實施例進行詳細說明。請參照附圖，在所有視圖中相同的數字表示相同的部件。 【00101】   實施例 【00102】    1. 具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的製造 【00103】    根據本發明，金屬硫蛋白係透過使用「K. lactis 蛋白表現系統」(New England Biolabs公司，麻州，美國)而製得。將人類MT1a蛋白的相對應cDNA (SEQ ID NO: 1)以及牛MT2a蛋白的相對應cDNA (SEQ ID NO: 3)選殖至pKLAC2載體中，然後根據製造商提供的標準操作手冊轉染K. lactis 細胞。自上清液中，以離心及對pH7的Tris-HCl標準緩衝液進行隔夜透析，而預先純化各金屬硫蛋白異構物。去金屬化作用係透過以蟻酸進行酸化作用至pH3.5，接著對蟻酸進行透析來達成。以25mM DTT對所有的半胱氨酸硫殘基進行化學還原作用之後，取出不含金屬的還原前驅蛋白(圖中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)的分裝物，供之後作為對照組樣品。作為本發明一較佳具體實施例的代表性樣本，主要蛋白部分隨後以4莫耳當量的鋅離子進行部分金屬化(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)，根據Bradford蛋白定量法，以添加各別量的氯化鋅進行。對Tris-HCl pH6.5進行隔夜透析後，樣品進行分析。透過在上述重構步驟中添加7 (而非4)莫耳當量的氯化鋅，以產生完全金屬化的蛋白(圖中以“7Zn-MT1a”以及“7Zn-MT2a”表示)以作為額外的對照樣品。 【00104】    2. 低金屬化金屬硫蛋白與一定數目的金屬離子結合 【00105】    所有樣品及對照組的金屬離子含量以如公開之方式決定(Ma, R.L., et al., 2004, Speciation of protein-bound trace elements by gel electrophoresis and atomic spectrometry. Electrophoresis 25(15): 2469-77)。簡言之，將樣品及對照組的等莫耳分裝物進行乾燥，在硝酸中進行水解，以去離子水稀釋之後，以感應耦合電漿原子發射光譜儀(inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES)分析。來自4個獨立實驗的結果顯示出每莫耳蛋白中鋅離子的莫耳當量，圖中也包含標準偏差值。 【00106】    如圖1所示，相對於不含金屬的前驅蛋白(圖中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)以及完全金屬化的對照組(其結合7莫耳當量的鋅離子)(圖中以“7Zn-MT1a”以及“7Zn-MT2a”表示)，這兩個低金屬化的金屬硫蛋白樣品(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)皆與特定數量的金屬離子結合，如重構步驟(4莫耳當量的鋅離子)所定義。 【00107】    3. 低金屬化金屬硫蛋白含有未與金屬離子結合之還原狀態的半胱氨酸硫氫基 【00108】    為了調查在根據本發明所製造的低金屬化金屬硫蛋白中游離的半胱氨酸硫殘基是以化學氧化或還原形式存在，使用發色鋅螯合劑Zincon (鋅單鈉鹽，Sigma-Aldrich公司，密蘇里州，美國)並根據製造商的標準操作手冊分析該蛋白的鋅結合與釋放特性。簡單地說，在pH7.4的標準Hepes緩衝液中，將等莫耳量的金屬硫蛋白以及對照組分別與3莫耳當量的氯化鋅預先靜置處理，然後與過量的Zincon試劑(每1 mM的金屬硫蛋白加入100 mM Zincon)混合。以Beckman Coulter公司型號DU800的分光光度計在波長620nm下偵測螢光訊號。顯示來自5個獨立實驗的結果，且圖中也包含標準偏差值。作為「氧化」對照組，在使用此分析之前，將該前驅蛋白的分裝物與500 mM H2 O2 預先靜置處理，使該蛋白在半胱氨酸硫殘基上被化學氧化(圖中以“OxApo-MT1a”以及“OxApo-MT2a”表示)。以含有所有緩衝液及試劑，包括氯化鋅，但不含任何金屬硫蛋白的空白樣品進行標準化。 【00109】    如圖2所示，在該「氧化」對照組(圖中以“OxApo-MT1a”以及“OxApo-MT2a”表示)中氧化的半胱氨酸硫殘基不再能夠協調地結合鋅離子(藉由其游離鋅的含量與空白對照組的含量相同可知)。相較之下，這二種低金屬化金屬硫蛋白異構物(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)則能夠再與3莫耳當量的鋅離子結合(因此減少了游離鋅的含量)，顯示其游離的半胱氨酸硫殘基為化學還原狀態的(亦可參閱圖3B)。 【00110】    4. 低金屬化金屬硫蛋白能夠依照氧化還原狀態而與金屬離子結合或釋放金屬離子 【00111】    根據本發明，上述發色的Zincon分析亦被用於確定低金屬化金屬硫蛋白結合或是放鋅離子的能力，以對應氧化還原電位的改變。為了測量在氧化環境下可能的鋅離子釋放，等莫耳量的低金屬化金屬硫蛋白以及對照組分別與過量的Zincon試劑(每1 mM的金屬硫蛋白加入100 mM Zincon)在pH7.4 Hepes緩衝液中混合。在添加250 mmolar H2 O2 之後，在波長620nm下偵測螢光訊號。為了測量在還原環境下可能的鋅離子結合，等莫耳量的低金屬化金屬硫蛋白在pH7.4的Hepes緩衝液中與750 mmolar DTT混合，隨後與3莫耳當量的氯化鋅混合。在pH7.4 Hepes緩衝液中添加過量的Zincon試劑(每1 mM的金屬硫蛋白加入100 mM Zincon)之後，在波長620nm下偵測螢光訊號。這兩個分析的結果都分別來自6個獨立的實驗，並且包含標準偏差。帶有所有緩衝液與試劑(包含氧化分析用的4莫耳當量的氯化鋅，以及還原分析用的3莫耳當量的氯化鋅)，但不帶有任何金屬硫蛋白的空白樣品被用來進行標準化。該還原分析的「中性」對照組以相同的方式處理，但不添加DTT (圖中以“neutral-MT1a”以及“neutral-MT2a”表示)。 【00112】    如圖3A所示，與作為負對照組的前驅蛋白(圖中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)相比，這兩種低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)在氧化環境下皆能夠釋放鋅離子。 【00113】    如圖3B所示，這兩種低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)在還原環境下皆能夠與鋅離子結合。再者，相對於該「中性」對照組(圖中以“neutral-MT1a”以及“neutral-MT2a”表示)，在以DTT還原時，未觀察到鋅結合能力的增加，更進一步地驗證了，以上低金屬化金屬硫蛋白的游離半胱氨酸硫殘基已經為還原形式的結果。 【00114】    5. 低金屬化金屬硫蛋白能夠平衡氧化還原電位且保護免於氧化壓力 【00115】    為了測試根據本發明所製得之低金屬化金屬硫蛋白對抗氧化壓力的保護能力以及平衡細胞內氧化還原電位的能力，使用來自Promega公司(Promega公司，威斯康辛州，美國)的非放射性細胞增殖套組，並根據製造商提供的標準操作手冊，在氧化壓力環境下測試小鼠肝臟細胞的代謝完整性。 【00116】    簡言之，以一標準的肝門靜脈灌注法(Butler, M. Animal Cell Culture and Technology: The Basics. 2nd Edition, 2003, Garland Publishing Inc.)將野生型小鼠的肝細胞取出初代培養，並於96孔微量盤中以標準Dulbecco's Eagle培養液培養至平均密度為每孔約10,000顆細胞。在分析前24小時，將10 mM/ml密度的低金屬化金屬硫蛋白加入各個樣品中。更換培養基以清除在外部的低金屬化金屬硫蛋白之後，加入H2 O2 使濃度為250 mM，處理6小時以作為氧化壓力來源，並藉由使用BioTek FLx800TB微量盤讀取儀在波長490nm下，測量由「MTS內鹽」形成的「甲臢」(Promega公司細胞增殖套組)來分析代謝完整性。實驗重複5次，且以一空白對照組(去除H2 O2 或低金屬化金屬硫蛋白)將結果標準化。圖中包含標準偏差。統計學分析由成對的學生氏t檢驗進行，以***表示P＜0.0001。 【00117】    如圖4所示，相對於對照組，本發明的兩個低金屬化金屬硫蛋白變體皆可顯著地保護免於氧化壓力，以平衡細胞內氧化還原電位及穩定代謝完整性的方式達成。 【00118】    本發明之示例性具體實施例的上述描述僅是為了說明及描述之目的，並非為了窮盡舉例或將本發明限制在所公開的確切形式。根據上述教示，許多修改及變化是可能的。 【00119】    選擇並描述該具體實施例是為了解釋本發明的原理及其實際應用，從而使其他本領域技藝者能夠利用本發明以及各種具體實施例與各種適合預期的特定用途之修飾。對於本發明所屬領域之技藝者而言，替代的具體實施例將變得明顯且不脫離其精神及範疇。據此，為了促進科學與實用技術的進步，揭露本發明之範疇，且意旨僅由所附之申請專利範圍的範疇所定義者限定本發明之範疇，而非以前面之描述及其中所描述的示例性具體實施例來限定
無。
       附圖說明了本發明一或多個具體實施例，且與書面描述一起解釋了本發明的原理。在任何可能的情況下，相同的附圖編號在所有的圖式中係用於指示一具體實施例的相同或類似的元件，且其中：
        圖1所示為不含金屬的金屬硫蛋白(MT)前驅蛋白(apo-proteins)(圖中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)、完全金屬化的金屬硫蛋白(圖中以“7Zn-MT1a”以及“7Zn-MT2a”表示)以及具有氧化還原活性的低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的莫耳鋅含量。
        圖2所示為氧化的金屬硫蛋白前驅蛋白(圖中以“OxApo-MT1a”以及“OxApo-MT2a”表示)以及具有氧化還原活性的低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的氧化還原狀態。
        圖3A所示為在氧化環境下，不含金屬的金屬硫蛋白前驅蛋白(圖中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)以及具有氧化還原活性的低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的氧化還原依賴型鋅離子釋放情形。圖3B所示為在氧化還原中性環境下具有氧化還原活性的低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“neutral-MT1a”以及“neutral-MT2a”表示)，以及在還原環境下具有氧化還原活性的低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的氧化還原依賴型鋅離子結合情形。
       圖4所示為在氧化壓力環境下，對照組金屬硫蛋白(圖中以“controlMT1a”以及“controlMT2a”表示)以及具有氧化還原活性的低金屬化金屬硫蛋白(圖中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的穩定代謝完整性的能力(藉以測量氧化還原電位的平衡)。
＜110＞  司馬承帝        韓東尼        郭俊宏   ＜120＞  製造具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的方法及含彼之醫藥組合物 ＜130＞  P14-109 ＜160＞  4     ＜170＞  PatentIn version 3.5   ＜210＞  1 ＜211＞  186 ＜212＞  DNA ＜213＞  人類(Homo sapiens)   ＜300＞ ＜308＞  GenBank NM_005946 ＜309＞  2014-01-19 ＜313＞  (74)..(259)   ＜400＞  1 atggacccca actgctcctg cgccactggt ggctcctgca cctgcactgg ctcctgcaaa       60 tgcaaagagt gcaaatgcac ctcctgcaag aagagctgct gctcctgctg ccccatgagc      120 tgtgccaagt gtgcccaggg ctgcatctgc aaaggggcat cagagaagtg cagctgctgt      180 gcctga                                                                 186   ＜210＞  2 ＜211＞  61 ＜212＞  PRT ＜213＞  人類(Homo sapiens)   ＜300＞ ＜308＞  GenBank NP_005937 ＜309＞  2014-01-19 ＜313＞  (1)..(61)   ＜400＞  2 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr 1               5                   10                  15      Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser             20                  25                  30          Cys Cys Ser Cys Cys Pro Met Ser Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys         35                  40                  45              Ile Cys Lys Gly Ala Ser Glu Lys Cys Ser Cys Cys Ala     50                  55                  60        ＜210＞  3 ＜211＞  186 ＜212＞  DNA ＜213＞  歐洲牛(Bos taurus)   ＜300＞ ＜308＞  GenBank NM_001075140 ＜309＞  2014-02-08 ＜313＞  (79)..(264)   ＜400＞  3 atggatccca actgctcctg caccgcgggt gaatcctgca cgtgtgccgg ctcctgcaaa       60 tgcaaagatt gcaagtgcgc ctcctgcaag aagagctgct gctcctgctg ccccgtgggc      120 tgtgccaagt gtgcccaggg ctgcgtctgc aaaggggctt cggacaagtg cagctgctgt      180 gcctga                                                                 186   ＜210＞  4 ＜211＞  61 ＜212＞  PRT ＜213＞  歐洲牛(Bos taurus)   ＜300＞ ＜308＞  GenBank NP_001068608 ＜309＞  2014-02-08 ＜313＞  (1)..(61)   ＜400＞  4 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr Ala Gly Glu Ser Cys Thr Cys Ala 1               5                   10                  15      Gly Ser Cys Lys Cys Lys Asp Cys Lys Cys Ala Ser Cys Lys Lys Ser             20                  25                  30          Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys         35                  40                  45              Val Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala     50                  55                  60

Claims (15)

  1. 一種製造具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白的方法，該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有20個半胱氨酸硫氫基以及7個結合口袋，該20個半胱氨酸硫氫基中的2至16個未與金屬離子結合且為還原狀態，以及該7個結合口袋中的1至6個與金屬離子結合，該方法包含下列步驟：提供一金屬硫蛋白；去除該金屬硫蛋白上的金屬；化學還原該去金屬的金屬硫蛋白的所有該20個半胱氨酸硫氫基；以及藉由提供1、2、3、4、5或6個金屬離子給該7個結合口袋，以部分金屬化該去金屬並還原的金屬硫蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該金屬硫蛋白具有以下之胺基酸公式：[Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11]其中X係除了半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸與酪氨酸以外的任何生物來源的L型胺基酸；以及n1至n11係任何由1至12的整數。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在去除該金屬硫蛋白上的金屬的步驟之前，進一步包含預先將該金屬硫蛋白完全金屬化的步驟。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該去除該金屬硫蛋白上的金屬的步驟係由將該金屬硫蛋白酸化至pH值小於pH4的方式進行。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在化學還原該去金屬的金屬硫蛋白的步驟之前，進一步包含純化該去金屬的金屬硫蛋白的步驟。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該純化該去金屬的金屬硫蛋白的步驟係由透析、陽離子交換層析法、逆相色層分析法、高壓液相層析法、電泳法、凝膠過濾層析法以及磁力中的一種方式進行。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該化學還原該去金屬的金屬硫蛋白的步驟係由加入還原劑的方式進行。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該還原劑為麩胱甘肽(glutathione)、還原態菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamid adenine dinucleotide,NADH)、菸鹼酸(nicotinic acid)，以及二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)之一。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該金屬離子係選自由鋅、銅、鐵以及硒所組成的群組。
  10. 一種醫藥組合物，包含至少一種以申請專利範圍第1項之方法所製造的具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白，其中該至少一種具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有20個半胱氨酸硫氫基以及7個結合口袋，該20個半胱氨酸硫氫基中的2至16個未與金屬離子結合且為還原狀態，以及該7個結合口袋中的1至6個與金屬離子結合，該至少一種具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有以下胺基酸公式之金屬硫蛋白：[Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11]，其中X係除了半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸與酪氨酸以外的任何生物來源的L型胺基酸，n1至n11係任何由1至12的整數。
  11. 一種以申請專利範圍第1項之方法所製造的具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白於製備治療因為升高的細胞內氧化壓力、失衡的 細胞內氧化還原電位或氧化還原依賴型的金屬離子失衡所引起的疾病之藥物的應用，其中該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有20個半胱氨酸硫氫基以及7個結合口袋，該20個半胱氨酸硫氫基中的2至16個未與金屬離子結合且為還原狀態，以及該7個結合口袋中的1至6個與金屬離子結合，該具有氧化還原活性之低金屬化金屬硫蛋白具有以下胺基酸公式之金屬硫蛋白：[Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11]，其中X係除了半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸與酪氨酸以外的任何生物來源的L型胺基酸，n1至n11係任何由1至12的整數。
  12. 如申請專利範圍第11項之應用，其中該因為升高的細胞內氧化壓力、失衡的細胞內氧化還原電位或氧化還原依賴型的金屬離子失衡所引起的疾病為癌症、神經退化性疾病以及代謝性失調其中之一。
  13. 如申請專利範圍第12項之應用，其中該癌症為肝癌、結腸癌、前列腺癌以及乳突性甲狀腺癌中的至少一種。
  14. 如申請專利範圍第12項之應用，其中該神經退化性疾病為帕金森氏症(Parkinson's disease)、阿滋海默症(Alzheimer's disease)、威爾森氏症(Wilson's Disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)以及杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's Disease)其中之一。
  15. 如申請專利範圍第12項之應用，其中該代謝性失調為第一型糖尿病、第二型糖尿病、高血脂症、肥胖症以及脂肪肝症候群中的至少一種。
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