CN105713084A - 制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法及含有该金属硫蛋白的医药组合物 - Google Patents

制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法及含有该金属硫蛋白的医药组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法、含有该蛋白的医药组合物，以及应用该医药组合物来治疗因为升高的细胞内氧化压力及/或失衡的细胞内氧化还原电位及/或氧化还原依赖型的金属离子失衡所引起的疾病。

Description

制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法及含有该金属硫蛋白的医药组合物
技术领域
本发明是关于具有氧化还原活性的低金属化(hypo-metallated)金属硫(metallothionein,MT)蛋白的制造，特别是特定数目的金属硫蛋白半胱氨酸结合位(MTcysteinylbindingsites)与生理相关金属离子(physiologicallyrelevantmetalions)结合的金属硫蛋白的制造。本发明并关于含有具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的医药组合物，以及使用该组合物治疗起因自高氧化压力及/或锌失衡所造成的疾病，其中清除自由基活性分子(freereactivespecies)以及平衡游离锌含量以回应内部氧化还原电位，是有利于治疗的。
背景技术
氧化压力是一种经常发生于人体内的有害形式的化学压力，主要发生于细胞内能量转换之处，亦即粒线体内。自粒线体电子传递链中泄漏的电子被视为是造成细胞内自由基，例如活性氧物质(reactiveoxygenspecies,ROS)、活性氮物质(reactivenitrogenspecies,RNS)等，产生的主因。外在刺激如环境化学物质、辐射、病毒感染，以及营养不良与生活习惯，都会造成自由基的产生，导致内部氧化压力。因为自由基如ROS或RNS等含有未配对的电子，因此其显现出相当程度的化学反应性(Cadenas等人，2000)，且会造成各种细胞内损伤如DNA氧化作用、脂质过氧化作用、酶不活化作用、RNA氧化作用等(Swindell，2011年)。若不加以控制，这样的氧化压力及随之而来的分子损伤会表现出一系列的病症(Swindell，2011年)。例如，氧化压力现被视为是代谢失调的潜在原因，包含但不限于糖尿病、高脂血症以及肥胖症，与年龄相关的神经性疾病，包含但不限于帕金森氏症与阿滋海默症，以及各种形式的癌症(Swindell，2011年；Chimienti，2013年；Furukawa等人，2004年；等人，2004年；Miyazaki等人，2008年；Vasto等人，2008年；Moreli等人，2014年)。
自由基的产生与细胞内氧化还原状态有着紧密的关联，其中，氧化还原状态必须被维持在严格的生理范围内，以维持正常的身体功能(Jiang等人，1998年)。自由基的清除与不活化作用是由生理性抗氧化剂如麸胱甘肽(glutathione,GSH)、维生素C及E、类脂酸、类黄酮以及其他具有氧化还原活性的成分来完成(Aquilano等人，2014年)。这些具有保护作用的抗氧化剂的氧化还原活性亦与细胞的氧化还原状态紧密连结，且其抗氧化能力的再生以及细胞内氧化还原电位的平衡是经由氧化还原活性金属离子、酵素与受质等耦合的复杂交互作用所完成(Jiang等人，1998年；Aquilano等人，2014年)。内在抗氧化保护机制与氧化压力源的超载，以及因此造成的细胞间氧化还原电位不平衡，将会无可避免地导致细胞内组成分的损伤与功能障碍，其表现于细胞、组织、器官以及最终系统性崩坏。
金属硫蛋白(MT)家族的成员在人类体内的中心作用包含如：氧化还原活性、自由基清除与金属离子结合蛋白，连结抗氧化活性、自由基结合与金属离子滴定至细胞内氧化还原电位等。金属硫蛋白为低分子量、具有非常高含量的半胱胺酸的单链多胜肽。该半胱胺酸残基上的硫氢基(sulfhydryl)使金属硫蛋白可与金属离子结合，且该半胱胺酸残基上的硫氢基负责清除活性物质、展现抗氧化活性，以及对胞内氧化还原电位的改变作出反应(Babula等人，2012年)。
在人类中，金属硫蛋白被分成四个亚群(MT1-4)，其中MT1亚群含有至少8个确定的成员，且MT2-4亚群各含有1个确定的成员(Babula等人，2012年)。所有金属硫蛋白异构物的活性半胱胺酸残基在数量与位置上具有保守性，异构物之间的差异仅在于将这些半胱胺酸分隔开来的结构氨基酸，以及控制表现结构域的调节基因区域(Babula等人，2012年)。
金属硫蛋白MT1与MT2在人体内大部分的软组织中表达，表达量最高在肝脏及肾脏，而金属硫蛋白MT3被视为是脑专一性的异构物，在神经系统中具有最高的表达量，但也表达于心脏、肾脏及生殖器官中。金属硫蛋白MT4异构物则显现出最受限制的表达模式，目前仅于鳞状上皮细胞中被发现(Babula等人，2012年)。金属硫蛋白的表达由不同刺激所诱导，如压力贺尔蒙(例如：糖皮质素glucocorticoids)、细胞激素(cytokines)、辐射线、重金属以及化学污染、发炎，以及氧化压力等(Babula等人，2012年)。金属硫蛋白的半衰期视金属化状态(亦即，有多少结合位置与何种金属离子结合)以及氧化还原状态(亦即，有多少游离的半胱胺酸硫基团被氧化)两者而定(Krezel等人，2007年)。金属硫蛋白的降解主要发生于溶酶体内，且经由胆汁及尿道排出降解产物(Bremner等人，1987年)。
基于金属硫蛋白的重金属结合、生理金属离子滴定、自由基不活化作用、抗氧化剂以及氧化还原电位平衡的分子功能，最近金属硫蛋白与一连串医学疾病已被连结。在癌症情况下，在例如肝癌细胞、结肠癌细胞、乳突性甲状腺癌细胞或前列腺癌细胞中，恢复金属硫蛋白因病理性静默的表达，已在体外及体内被证实可以阻止癌细胞的生长与转移的潜能(亦即，迁移、黏附、浸润)，以诱导其细胞凋亡以及减少肿瘤质量及体积(Mao等人，2012年；Yan等人，2012年；Fu等人，2013年；Arriaga等人，2014年；Han等人，2013年)。分子机制包含细胞内游离锌含量的平衡，其亦已被证明可造成癌细胞对化疗更加敏感(Arriaga等人，2014年)。
中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)中的慢性氧化压力被广泛地认为是与年龄相关的神经退化性疾病如帕金森氏症(Parkinson'sDisease,PD)与阿滋海默症(Alzheimer'sDisease,AD)的潜在原因(Eibl等人，2010年)。特别是，因为其化学性质，神经传递物质多巴胺(dopamine,DA)具有高度反应性，且其细胞内外的游离程度必须被严格调控(Eibl等人，2010年)。氧化多巴胺(oxDA)制品具有神经毒性，且已被证实与各种细胞受质共价结合，因此阻碍其生物学上的功能。在各种受影响的蛋白质中，例如parkin蛋白，其基因亦与遗传性家族性帕金森氏症有高度的关联。经由氧化多巴胺(oxDA)制品进行的Parkin蛋白的芳基化作用降低了Parkin蛋白的溶解度，并且损害其酵素活性(LaVoie等人，2005年)。经由氧化多巴胺(oxDA)物种进行的多巴胺运输蛋白(其自突触间隙清除游离多巴胺)的类似的芳基化作用，已被证实可不活化该运输蛋白。在该突触间隙中残留的多巴胺会自动氧化，造成该问题进一步的恶化(Whitehead等人，2001年；Miyazaki等人，2008年)。金属硫蛋白已被证实作为氧化多巴胺(oxDA)物种的直接受质，因而帮助不活化及清除该具有神经毒性的氧化多巴胺(oxDA)(Maret，2006年；Gauthier等人，2008年)。在锌结合的金属硫蛋白的芳基化作用后，锌离子自金属硫蛋白中释放出来，且已知锌不但可直接活化抗氧化剂铜-锌-过氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)，亦可活化过氧化物歧化酶与过氧化氢酶基因的转录作用(Fattman等人，2003年)。金属硫蛋白以这种方式进一步活化细胞防御对抗由氧化多巴胺(oxDA)调节的氧化压力(Eibl等人，2010年)。帕金森氏症的其他病理特征包含α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)的突变及寡聚化。在帕金森氏症小鼠模式中已证实，人工活化金属硫蛋白可以阻断α-突触核蛋白(α-Syn)的寡聚化，且可以去除有害的α-突触核蛋白(α-Syn)寡聚体的氧化还原活性(Meloni等人，2011年)。过度活化表达金属硫蛋白的小鼠在许多不同的帕金森氏症模式情境下，则可抵抗帕金森氏症的发生(Sharma等人，2013年；Ebadi等人，2005年)。
阿滋海默症的病理特征包含由铜调节的各种淀粉样-β蛋白(amyloid-betaprotein,β-AP)异构物的聚集、在这些β-AP斑块中具有神经毒性的游离锌含量的胞外累积，以及促氧化与具有神经毒性的铁离子在神经元内的累积。所有这些有害的氧化还原电位相关的特征可被金属硫蛋白所抑制。例如，在小鼠阿滋海默模式中，施用与锌结合的MT2蛋白已被证实经由锌、铜离子交换而抑制β-AP异构物的聚集(Chung等人，2010年)。在一个锌离子与铜离子交换的类似机制中，Meloni等人已证实与锌离子结合的MT3蛋白(Zn2+-MT3)可以在阿滋海默小鼠中去除活性氧物质(ROS)的产生以及β-AP斑块所造成的神经毒性(Meloni等人，2008年)。
慢性的不良生活方式以及营养不良所引起的氧化压力也被确认为各种代谢失调的潜在原因(Chimienti,2013)。对抗氧化压力的内在保护机制的持续超载会导致新的脂肪储存细胞(脂肪细胞)的分化与发展，以及脂质在这些脂肪细胞中的累积。在白色脂肪组织内脂质含量的增加会进一步导致氧化压力程度的增加(Chimienti，2013年)。以金属硫蛋白作为抗氧化剂被认为可以透过缓冲氧化压力的程度以及提高抗氧剂保护的机制来打破这个自我扩增的周期(Chimienti，2013年；Sato等人，2010年；Higashimoto等人，2013年)。MT1及MT2蛋白已被证实在活体内可保护小鼠对抗高脂肪饮食所诱导的高脂血症及肥胖症(Sato等人，2010年)，以及对抗高脂肪饮食所诱导的氧化及内质网(endoplasmaticreticulum,ER)压力所造成的氧化DNA损伤(Higashimoto等人，2013年)。此外，金属硫蛋白可预防糖尿病肾病变与心肌病变，这两者皆为基于高氧化及内质网压力而由糖尿病所引起的疾病(Tachibana等人，2014年；Guo等人，2009年；Ruttkay-Nedecky等人，2013年)。亦有强而有力的证据显示，与锌结合的金属硫蛋白可通过在胰小岛β细胞内精细地平衡细胞内游离锌浓度，而协助稳定糖尿病患者异常的胰岛素浓度，并使之正常化(Chimienti，2013年)。
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发明内容
本发明第一方面是关于一种制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法。该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白具有20个半胱氨酸硫氢基，且因此形成7个金属离子结合口袋。该20个半胱氨酸硫氢基中的2至16个未与金属离子结合且为还原状态，以及该7个结合口袋中的1至6个与金属离子结合。该方法包含下列步骤：
提供一金属硫蛋白；
去除该金属硫蛋白上的金属；
化学还原该去金属的金属硫蛋白的所有该20个半胱氨酸硫氢基；以及
通过提供1、2、3、4、5或6个金属离子给该7个结合口袋，以部分金属化该去金属并还原的金属硫蛋白。
在某些具体实施例中，该金属硫蛋白具有如下的氨基酸序列：
[Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11]
其中X是除了半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸以外的任何生物来源的L型氨基酸，且n1至n11是由1至12的整数。
在某些具体实施例中，在去除该金属硫蛋白上的金属的步骤之前，该方法进一步包含预先将该金属硫蛋白完全金属化的步骤。
在某些具体实施例中，该去除该金属硫蛋白上的金属的步骤是由将该金属硫蛋白酸化至pH值小于pH4的方式进行。
在某些具体实施例中，在化学还原该去金属的金属硫蛋白的步骤之前，该方法进一步包含纯化该去金属的金属硫蛋白的步骤。在某些具体实施例中，该纯化该去金属的金属硫蛋白的步骤是由透析、阳离子交换层析法、逆相色层分析法、高压液相层析法、电泳法、凝胶过滤层析法，以及磁力中的一种方式进行。
在某些具体实施例中，该化学还原该去金属的金属硫蛋白的步骤是由加入还原剂的方式进行。在某些具体实施例中，该还原剂为麸胱甘肽(glutathione)、还原态烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamidadeninedinucleotide,NADH)、烟碱酸(nicotinicacid)，以及二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)之一。
在某些具体实施例中，该金属离子是选自由锌、铜、铁，以及硒所组成的群组。
本发明的第二方面是关于一种医药组合物，其包含至少一种以上述方法所制造的具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白。在某些具体实施例中，该至少一种具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白具有20个半胱氨酸硫氢基以及7个金属离子结合口袋，该20个半胱氨酸硫氢基中的2至16个未与金属离子结合且为还原状态，以及该7个结合口袋中的1至6个与金属离子结合。
本发明的第三方面是关于以上述方法所制造的具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白于制备治疗因为升高的细胞内氧化压力、失衡的细胞内氧化还原电位、或氧化还原依赖型的金属离子失衡所引起的疾病的药物的应用。
在某些具体实施例中，该因为升高的细胞内氧化压力、失衡的细胞内氧化还原电位、或氧化还原依赖型的金属离子失衡所引起的疾病为癌症、神经退化性疾病，以及代谢性失调其中之一。在某些具体实施例中，该癌症为肝癌、结肠癌、前列腺癌以及乳突性甲状腺癌中的至少一种。在某些具体实施例中，该神经退化性疾病为帕金森氏症(Parkinson'sdisease)、阿滋海默症(Alzheimer'sdisease)、威尔森氏症(Wilson'sDisease)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(AmyotrophicLateralSclerosis,ALS)，及/或杭丁顿氏舞蹈症(Huntington'sDisease)。在某些具体实施例中，该代谢性失调为第一型糖尿病、第二型糖尿病、高血脂症、肥胖症，及/或脂肪肝症候群。
本发明的这些及其他方面将会从以下的较佳具体实施例的描述并结合以下图式而变得清楚，虽然其中的变化与修饰可在不脱离本发明的精神与新颖概念的范围前提下进行。
附图说明
附图说明了本发明一或多个具体实施例，且与书面描述一起解释了本发明的原理。在任何可能的情况下，相同的附图编号在所有的图式中是用于指示一具体实施例的相同或类似的组件，且其中：
图1所示为不含金属的金属硫蛋白(MT)前驱蛋白(apo-proteins)(图中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)、完全金属化的金属硫蛋白(图中以“7Zn-MT1a”以及“7Zn-MT2a”表示)以及具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的摩尔锌含量。
图2所示为氧化的金属硫蛋白前驱蛋白(图中以“OxApo-MT1a”以及“OxApo-MT2a”表示)以及具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的氧化还原状态。
图3A所示为在氧化环境下，不含金属的金属硫蛋白前驱蛋白(图中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)以及具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的氧化还原依赖型锌离子释放情形。图3B所示为在氧化还原中性环境下具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(图中以“neutral-MT1a”以及“neutral-MT2a”表示)，以及在还原环境下具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的氧化还原依赖型锌离子结合情形。
图4所示为在氧化压力环境下，对照组金属硫蛋白(图中以“controlMT1a”以及“controlMT2a”表示)以及具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)的稳定代谢完整性的能力(藉以测量氧化还原电位的平衡)。
具体实施方式
本发明提供制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白(MT)的生物技术方法，根据本发明，该蛋白具有特定数目的金属硫蛋白半胱氨酸结合位与生理相关金属离子(较佳为锌离子Zn2+，作为主要的生理性配体)结合，并具有另一特定数目的金属硫蛋白半胱氨酸结合位未与金属离子结合且处于化学性还原(即非氧化)状态。
根据本发明的一方面，本文所述的具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白皆具有在所有已知自然界中存在的哺乳动物金属硫蛋白中所保存的氨基酸组成以及结构性主题，并带有在数目上及分子内位置上皆保留的半胱氨酸氨基酸，其是该蛋白的生物活性所必需的。根据本发明，这样的蛋白较佳地具有61至68个氨基酸的长度，且在保留位置上含有20个半胱氨酸残基，因此形成了7个具有氧化还原活性的结合口袋，可与二价金属离子结合。而该蛋白其余部位的结构性氨基酸则可包含所有除了半胱氨酸以及芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸以外的其他自然界中存在的生物氨基酸。
在本发明的另一方面中，该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白，在根据本发明方法被制造后，与不少于1个且不多于6个生理相关金属离子结合，例如锌、铁、铜或硒。因此，根据本发明，每个蛋白分子的金属离子数目范围为1至6个。
在本发明的又一方面中，该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白，在根据本发明方法被制造、纯化且与较佳的金属离子部分金属化之后，含有未与金属离子结合的半胱氨酸结合口袋，其是由带有未氧化的(即化学还原的)硫氢基的半胱氨酸残基所组成。当该蛋白含有1、2、3、4、5或6个未与金属离子结合的半胱氨酸结合口袋时，每个蛋白分子中分别含有2、5、9、12、13或16个未与金属离子结合且为还原状态的半胱氨酸硫氢基。因此，根据本发明，每个蛋白分子中未与金属离子结合且为还原状态的半胱氨酸硫氢基数目的范围为2至16。
根据目前现有的科学数据，金属硫蛋白的主要生理学形式为完全金属化且氧化的异构物以及完全还原且未与金属结合的前驱蛋白(Krezel等人，2007年，参阅上述)。中间形式的金属硫蛋白，亦即部分氧化或部分金属化的金属硫蛋白，则从未在活体细胞内被侦测到或分离到。
从功能的角度来看，完全氧化的金属硫蛋白无法清除自由基、不具有抗氧化活性、亦无法结合或释放金属离子。而完全还原的金属硫蛋白前驱蛋白则能够作为抗氧化剂且能与金属离子结合，但逻辑上其无法释放金属离子以对氧化还原状态的改变作出反应。此外，完全金属化的金属硫蛋白可以释放金属离子以对氧化还原状态的改变作出反应且作为抗氧化剂，但其无法与额外的金属结合。结果，只有低金属化的金属硫蛋白且其上未与金属结合的半胱氨酸残基为还原状态者才能兼具所有功能，作为抗氧化剂、与金属离子结合、以及释放金属离子以对氧化还原状态的改变作出反应。
此外，从“游离锌浓度的良好平衡”(以及其所有的下游影响)的角度来看，只有部分金属化的金属硫蛋白可以同时作为锌离子的“储存库”与“来源”。为了因应氧化还原电位的改变，完全金属化的金属硫蛋白无法降低游离锌的浓度，而未与金属结合的金属硫蛋白前驱蛋白则无法释放锌离子。
整体看来，本发明在功能上活化了自然存在或人工设计的金属硫蛋白，通过产生具有特定金属化及氧化还原状态的低金属化金属硫蛋白，使其能够具有这些特定功能。反观，自然存在形式的金属硫蛋白，在其自然存在的金属化及氧化还原状态下，则无法有相同的作用。
本发明进一步提供含有该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的医药组合物。该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白保留了其全部未受损的金属离子负载、其氧化还原电位反应，以及根据其还原的半胱氨酸硫氢基数目多寡的抗氧化能力。
本发明亦提供该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的医疗与医药用途，以用于预防及治疗任何因为升高的细胞内氧化压力、失衡的细胞内氧化还原电位、或氧化还原依赖型的金属离子失衡所引起的疾病。据此，本发明是关于含有该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的医药组合物在治疗疾病上的用途，其中细胞内氧化还原电位、氧化压力程度、以及与氧化还原电位有关连的金属离子的正常化及稳定化，对于该治疗是有益且具有支持性的。在本发明中，这些相关的疾病包含但不限于：各种形式的癌症，如肝癌、结肠癌、前列腺癌以及乳突性甲状腺癌；各种神经退化性疾病，如帕金森氏症、阿滋海默症、威尔森氏症(Wilson'sDisease)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(AmyotrophicLateralSclerosis,ALS)、杭丁顿氏舞蹈症(Huntington'sDisease)；各种代谢性失调，例如糖尿病、高血脂症、肥胖症、脂肪肝症候群。
金属硫蛋白前驱蛋白的制造
本发明所述的金属硫蛋白前驱蛋白，在其半胱胺酸硫残基具有不确定金属化状态与不确定氧化还原状态的天然形式下，可通过任何常规方法所制造，如重组DNA技术、蛋白合成、前蛋白原的酵素裂解、或哺乳动物金属硫蛋白在自然界中存在的变异的分离等。
因此，在本发明的一较佳具体实施例中，该金属硫蛋白前驱蛋白是以习知的重组DNA技术(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，冷泉港，1989年，以及其内所引用的文献)制造。编码个别全长金属硫蛋白异构物的DNA序列可由标准核酸合成方法所合成，或可由直接自适当的基因组或cDNA文库中分离的习知实验室方法获得，或是以标准的聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,PCR)方法直接自该文库中复制并扩增。
该DNA序列，经过适当的制备与纯化之后，可被置入所选的重组表达载体，亦使用习知的标准方法。适当载体的选择可视所用的蛋白表达系统而定。该表达系统为习知且广泛地被描述于本发明技术领域的技术人员所公知的科学文献中，该表达系统包含原核细菌细胞、真核酵母菌与真菌细胞，以及来自高等动物如昆虫、节肢动物或哺乳动物的细胞培养物。可透过已建立的实验室操作手册的协助，将带有编码该所选的金属硫蛋白变体的序列的蛋白表达载体置入适当的宿主细胞内。
蛋白表达系统的选择，以及置入所述编码任何所选的金属硫蛋白变体的DNA序列的兼容重组表达载体的选择，亦可决定例如以下的特征：
选择染色体外的质体载体或插入宿主细胞基因组的载体；
选择并包括用以转录活化的适当启动子序列以及转录终止子序列；
选择并包括复制起始点序列以及选择标记序列；以及
选择并包含适合用来进行所选的蛋白表达及纯化方法的融合蛋白与蛋白酶切割位置。
所有这些及其他关于已建立的蛋白表达方法的特征皆为本发明技术领域的技术人员所习知，且可依照相关的已建立的标准生物技术方法而决定。
因此，据上所述，本发明的一较佳具体实施例使用以酵母菌为基础的蛋白表达系统，乳酸克鲁维斯酵母菌(Kluyveromyceslactis)(NewEnglandBiolabs公司，麻州，美国)。
于一较佳具体实施例中，哺乳动物(如：牛或人类)的金属硫蛋白异构物的编码区可自适当的cDNA文库进行PCR扩增，使用对各别目标基因具有专一性且含有限制性酶切位点如XhoI与NotI以及Kex的标准合成的PCR引物。在根据制造商提供的实验室操作手册进行PCR扩增所需DNA片段之后，使用XhoI与NotI限制性核酸内切酶与DNA连接酶(DNAligaseI)，将该DNA片段克隆到该制造商的pKLAC2质体载体中。经过使用限制性核酸内切酶SacII以及该pKLAC2载体内含的兼容限制酶，以将该载体进行适当的纯化及线性化之后，可将该线性化基因表达组合转形至该制造商所提供的胜任酵母菌细胞K.lactis内。通过使用该pKLAC2载体内含的阳性与阴性筛选标记，可依照制造商提供的实验室操作手册筛选K.lactis的阳性克隆株，该阳性克隆株含有正确地合并至该宿主的基因组中的单个或多个拷贝数的所需金属硫蛋白基因表达组合。因此，在本发明此一具体实施例中，所述稳定转化的K.lactis细胞接着可在适当培养基中培养，以稳定表达该所选的金属硫蛋白变体，该金属硫蛋白变体是在K.lactis细胞内含的LAC4启动子的转录控制下，所表达的融合到K.lactis细胞内含的α-交配因子区域结构域(α-matingfactordomain,α-MF)的融合蛋白；且在α-MF结构域被内含的Kex蛋白酶裂解后，产生所需的金属硫蛋白的天然形式、翻译后修饰形式，这些蛋白具有非特定金属化状态，以及非特定氧化还原状态的半胱氨酸硫残基。
金属硫蛋白的纯化、还原及低金属化作用
本发明主要的目的之一即在于提供带有特定数目的金属离子以及带有特定数目的未与金属离子结合的半胱氨酸硫残基的金属硫蛋白，该特定数目的金属离子协同地与该金属硫蛋白的半胱氨酸残基结合，而该带有特定数目的未与金属离子结合的半胱氨酸硫残基则以化学还原硫氢基(-SH)形式存在。因此，本发明的较佳具体实施例利用合适的方法制造这种具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白，其中上述金属硫蛋白前驱蛋白可被完全去金属化、化学还原其半胱氨酸硫氢基，然后以特定数目的较佳生理相关金属离子，如锌、铜、铁或其他金属，对该蛋白进行部分金属化。
依照本发明，所选的金属硫蛋白前驱蛋白的天然形式，具有不特定的金属化及氧化还原状态，是以任何上述的重组DNA技术、蛋白合成、前蛋白原的酶切割、该金属硫蛋白变体的分离，或如各别自培养基、缓冲溶液或生物基质中分离及纯化等的其他方法所制造。
根据本发明，该初始的分离及纯化可以任何为本发明技术领域的技术人员所公知的标准蛋白生化方法来达成。并可就先前所选的金属硫蛋白前驱蛋白的制造方法(如上所述)以及该金属硫蛋白前驱蛋白的给定条件来选择已建立的方法，如在适当的水性缓冲液中进行透析、阳离子交换层析法、逆相色层分析法、高压液相层析法、电泳法、凝胶过滤层析法等。亦可通过使用磁力来分离各金属硫蛋白，其中该金属硫蛋白先以离子(如锌离子)进行完全地预先金属化。这种预先金属化的目的在于使该金属硫蛋白可进行预先分离及纯化，而与特定数量的所选生理金属离子的最终结合则是为了制造本发明终产物低金属化金属硫蛋白，这两种金属化作用是有区别性的。
本发明的一较佳具体实施例使用了上述在酵母菌K.lactis中表达金属硫蛋白的重组DNA方法。在该具体实施例中，所选的金属硫蛋白异构物，作为前驱蛋白，会被分泌到各自的培养基中，且会留在溶液中，具有不确定的金属化及氧化还原状态，。以例如离心或过滤等标准方法将酵母菌从培养基中分离之后，使用例如Bradford蛋白分析法等标准已建立的方法来确定该金属硫蛋白的蛋白浓度。这会使得金属离子所需最大量的计算受到该现存金属硫蛋白的约束，假设所有的金属硫蛋白结合位置都未被金属离子占领。由于每一摩尔的金属硫蛋白最多可与7摩尔的双价金属离子结合，可添加适当数量的锌盐(如：硫酸锌或氯化锌)到该金属硫蛋白溶液中，以使之完全地预先金属化。该完全重构的与7个锌离子结合的金属硫蛋白(Zn7-MTprotein)可通过使用磁力自该溶液中回收。
本发明其他较佳具体实施例可使用其他标准、已建立的分离及纯化方法，且可能导致分离的金属硫蛋白具有其它或不确定的预先金属化的状态。
任何分离的该金属硫蛋白，不论其中所含的金属化状态如何，接着可进行酸化至任何低于pH4的pH值，以使所有结合的金属离子完全解离。在本发明较佳具体实施例中，可选择任何具有pKa值在1.27至4.76之间的天然存在的单价酸(蚁酸、醋酸、草酸、抗坏血酸，或其他)，并且可通过分步添加各种酸，接着以标准方法测量该溶液的pH值，直到pH值低于pH4以下，以达到酸化至pH4以下，或是通过根据溶液中金属硫蛋白的浓度(参阅上文)来计算所需的氢离子(氢离子在各别水溶液中)数量。例如，在这样的计算中，每摩尔的金属硫蛋白需要20摩尔的氢离子，以使所有先前与金属结合的半胱氨酸硫残基以氢离子饱和，假设该金属硫蛋白已经完全预先金属化了。
本发明主要的目的之一是将带有特定数目的特定金属离子的金属硫蛋白进行部分金属化，上述金属硫蛋白的分离物，在完全去金属化之后，可自任何金属离子中纯化，包含可能已被用来进行预先金属化作用的金属离子(请参阅上述)。此纯化作用，视本发明的具体实施例而定，可通过任何标准蛋白生化方法达成，例如，通过对适当的无金属缓冲溶液进行透析。在其他具体实施例中，电泳方法或磁力可被用于去除所述金属离子。在任何选择的去除金属离子的方法中，所给定的金属硫蛋白溶液的pH值被维持在低于pH4以下，以确保所述金属硫蛋白的无金属状态，并能够完全去除任何所述的金属离子。
根据本发明，该相对应的金属硫蛋白异构物，在经过上述分离、纯化以及去金属化作用之后，现在可置于化学还原状态，以确保任何可能被氧化的半胱胺酸硫残基的化学还原状态。在本发明的较佳具体实施例中，可通过添加必要数量的适当还原剂到所述的金属硫蛋白溶液中以达到上述化学还原状态，适当的还原剂包含但不限于麸胱甘肽(glutathione)、还原态烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamidadeninedinucleotide,NADH)、烟碱酸(nicotinicacid)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)或其他生物化学电子供体。对化学还原所有现存的半胱胺酸硫残基必需的还原剂的数量，可再次地由上述蛋白浓度计算而来，且根据该假设，所有的半胱胺酸硫残基应该会被氧化。例如，在溶液中1摩尔的金属硫蛋白可能因此需要20摩尔的单价还原剂，以将所有金属硫蛋白半胱胺酸硫残基完全还原为硫氢基(-SH)形式。
根据本发明，上述金属硫蛋白异构物，现在已完全地去金属化且其半胱胺酸硫残基完全地还原，并且在还原条件下仍存在于酸性溶液中，现阶段可以一定数目的所选金属离子，例如锌离子，而被部分金属化。于本发明的一较佳具体实施例中，该给定的金属硫蛋白异构物可被重新建构为部分金属化的Zn4-MT形式，其中每一个金属硫蛋白分子与4个双价锌离子结合。锌离子的必需量可基于溶液中金属硫蛋白异构物的浓度来计算，且4摩尔当量的锌离子可加到该溶液中，较佳为硫酸锌或氯化锌。为了使部分金属化的ZN4-MT蛋白异构物能够重新建构，该溶液的pH值可由先前的酸性升高至中性，而pH值介于pH6.5至pH7.5之间则被认为是中性。这可以通过将必需数量的中和剂，如氢氧化铵、醋酸铵或其他，加入至该溶液中，且使用标准pH测量方法连续测量该溶液的pH值，直到达到该中性pH值为止。是以，在本发明此一具体实施例中，部分锌-金属化的金属硫蛋白异构物可被制造，该异构物的每一分子与4个锌离子结合，且其未与金属离子结合的游离半胱胺酸硫氢基则为化学还原状态，因而具有氧化还原活性。
在本发明其他具体实施例中，不同的金属化状态的金属硫蛋白，如其中每一分子仅与1至3个锌离子结合且分别有更多的半胱氨酸硫氢基残基被还原而具有氧化还原活性，或每一分子甚至与5或6个锌离子结合且分别有较少的半胱氨酸硫氢基被还原而具有氧化还原活性，或者以锌以外的生理金属离子(如铜、铁、硒，或其他)进行低金属化者，皆可以类似的方式来制造。因此，除了本发明的具体实施例之外，以铜离子进行部分金属化作用可以通过在上述方法中以铜盐置换锌盐而达成，而在其它具体实施例中，以任何选择的金属离子进行不同的金属化状态可由调整各金属盐的必需数量来实现。
根据本发明，所选择的金属硫蛋白异构物，其在现阶段为部分金属化，其是带有特定数目的特定金属离子，且其在现阶段具有氧化还原活性，其是带有特定数目的半胱胺酸硫残基以还原的硫氢基呈现，现在可以进行分离及纯化，以为了可以进行随后的制造而成为下述化合物。在本发明较佳的具体实施例中，最终纯化步骤可通过任何已建立的蛋白生化方法来完成，这些方法可使该金属硫蛋白异构物的金属化与氧化还原状态未受损害。据此，在此一最终纯化步骤中，应该避免pH值低于pH4以下，以及化学氧化状态。
金属硫蛋白
根据本发明的一方面，本文所述的金属硫蛋白共享在所有已知的天然存在的哺乳动物金属硫蛋白中保守的氨基酸组成与结构主题，并带有氨基酸L-半胱胺酸，其为该蛋白生物活性所必需，并且在数目上以及分子内位置上皆保守。这样的蛋白，取决于具体实施例，较佳为61～68个氨基酸长，且在保守位置上精确地包含20个半胱氨酸残基，因此精确地形成7个具有氧化还原活性的结合口袋，其中每个口袋允许协调一种二价金属离子的结合。根据该具体实施例，包含该蛋白的其余部分的氨基酸可以包括所有其他天然存在的生物体的L-氨基酸，除了半胱氨酸与芳香族氨基酸，苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸之外。
在另一方面，本发明关于具有以下氨基酸序列的金属硫蛋白：
[Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11],
其中，“X”可以是任何生物来源的L-氨基酸，除了半胱氨酸(“C”)与芳香族氨基酸，苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸以外，且其中“n1”至“n11”可为1至12的任何整数。因此，在本发明的这一方面以及根据本具体实施例，该蛋白质可为38至159个氨基酸长，且在根据上述公式中的保守位置上含有不多也不少于20个L-半胱氨酸，并且不含芳香族氨基酸。本发明金属硫蛋白的氨基酸序列可以是天然存在的或人工合成的。在一些具体实施例中，该金属硫蛋白为具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的人类金属硫蛋白1a蛋白(MT1a)及/或具有如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的牛金属硫蛋白2a蛋白(MT2a)。
在又一方面，本发明是关于由单一氨基酸链组成的蛋白，并关于该蛋白的单体。然而，在涉及到本发明的另一方面中，该蛋白在根据本发明进行低金属化与氧化还原活化之后，亦可进行二聚化或多聚化，以作为均聚物或异聚体之后，被制成具有生物活性的化合物与药物组合物(如下所述)。
本发明亦关于一种天然存在或人工引入的该蛋白的游离羧基端与氨基端的修饰，以及天然存在或人工引入的分子内氨基酸侧链的修饰，例如糖基化、乙酰化，肉荳蔻酰化或其他。
在本上下文中，术语如“蛋白异构物”、“氨基酸组成”、“结构主题”、“保守”、“结合口袋”及其他关于氨基酸及蛋白结构及功能的术语，是根据本领域技术人员所熟知的广泛被接受的科学标准来使用。
化合物
根据本发明，一化合物可含有任何生物活性量的可能的金属硫蛋白异构物的任何组合，具有如上述的任何金属化与氧化还原状态，或纯组合物，这取决于具体实施例。
这表示，根据本发明的该化合物可配制成蛋白异构物专一的化合物，只包含一个给定的金属硫蛋白异构物，或为该金属硫蛋白异构物的混合物，含有根据本发明所制造的金属硫蛋白异构物的任何可能的组合。
这也表示，根据本发明的该化合物可以含有只有一种特定金属化状态且只与一种金属离子在只有一种特定摩尔当量下结合的金属硫蛋白异构物，或可以包含该金属硫蛋白的混合物，与多于一种的金属离子在相同或多于一种特定摩尔当量下结合。因此，可能包含只有一种特定氧化还原状态的金属硫蛋白，或可能包含具有不同特定氧化还原状态的该金属硫蛋白的混合物的化合物，也都在本发明的范围内。
此外，本发明的化合物可含有该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白异构物以作为单体、均聚物或异源二聚体，或同源或异源多聚体，这取决于实施例。
因此，在本发明的较佳具体实施例中，一特定的化合物可以只包含一个特定的金属硫蛋白异构物，只具有一种金属离子在一特定的摩尔当量下与该蛋白结合，从而允许该蛋白只有一种特定的氧化还原状态。然而，如上所述，各种金属化与氧化还原状态的金属硫蛋白异构物的可能的特定组合也在本发明的范围内。
医药组合物
本发明亦关于包含一或多种上述定义的化合物的医药组合物，其中该化合物含有上述具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白，其带有未损伤的金属负载、氧化还原状态与生物活性，并且能够平衡细胞内氧化还原电位、清除自由基物种引起的氧化压力，并因应氧化还原电位而平衡游离金属离子的程度。因此，本发明关于基于所述具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的医药组合物，其中该组合物在投与受试者时，有利于治疗该受试者因为并显示升高的细胞内氧化压力、失衡的细胞内氧化还原电位、及氧化还原依赖型的游离金属离子失衡所引起的疾病。
根据本发明，一医药组合物，其在本文中可同义地被称为“药物”，包括有效量的一或多种上述化合物，以其无添加的形式，或者，取决于具体实施例，与药学上可接受的添加剂结合，例如赋形剂、稀释剂或载体。将该药物配制为口服用药是本发明的一种较佳具体实施例。然而，在其他的具体实施例中，该药物还可以配制用于静脉内给药、经皮给药，或其它给药途径。配制用于任何给定的给药途径的药物亦可预先确定选择要添加至该药物的医药添加剂，以及医药活性成分的数量及浓度。对基于蛋白质的医药组合物的配制策略已被建立，在科学文献中广泛地被描述，并且为本领域技术人员所公知(BangaA.K.,TherapeuticPeptidesandProteinFormulation:ProcessingandDeliverySystems,TechnomicPublishingAG,Basel1995，及其参考文献)。
因此，根据上述以及视实施例而定，本发明的医药组合物可配制成口服给药使用，并添加标准赋形剂如，甘露醇、乳糖或淀粉、纤维素以及其他兼容的添加剂，其不损害该活性成分的金属化作用及氧化还原状态。这样的口服制剂可为丸剂、片剂、持续释放制剂、胶囊、粉剂、溶液制剂、悬浮剂或乳剂等形式，且一般含有10-95％的所述活性成分，特别是含有25-75％。可添加低浓度的辅助物质，其有助于改善所述医药组合物的吸收、运输及/或效力。
配制该组合物以用于注射或经皮施用也在本发明的范畴内，在这种情况下，可加入适当合适的赋形剂，如水、盐水、葡萄糖或甘油。再次地，配制该医药组合物以用于这些或任何其他选择的施用途径不会以任何方式损害该活性成分的金属化及氧化还原状态。关于这样的配方策略以及各种可能的添加剂的规范是公开的，且为本领域技术人员所熟知。
含有所述活性成分的所述制剂可以与剂型兼容的方式，并以治疗有效量施用。施用的活性成分的治疗有效量可取决于受试者、该受试者的年龄与体重、待治疗的病症以及所述病症的阶段，以及给药的途径。给药的途径，以及治疗时间及剂量可再次地取决于受试者的年龄及体重，以及取决于待治疗的病症，以及该病症的阶段。因为这是本发明的一个较佳具体实施例，以预防方法使用所述活性成分，连续低剂量的给药方案可根据受试者的情况进行配制。
生物活性
根据本发明，具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白、含有该蛋白的化合物，以及含有该化合物并因此含有该蛋白的医药组合物具有如上所述的生物活性。本发明较佳地关于生物活性，例如结合及释放生理金属离子的能力，以响应细胞内氧化还原电位的改变，结合及清除具有氧化还原活性的重金属离子的能力，以清除并使自由基例如ROS、RNS及其他自由基失去活性，从而发挥抗氧化的功能以及将细胞内氧化还原电位平衡于生理水平量。
更具体地，本发明中关于结合及释放锌离子能力的生理活性，以响应细胞内氧化还原电位的改变，例如因升高的氧化压力所诱导的氧化还原电位的改变。这种自所述金属硫蛋白结合及/或释放锌离子的能力，以响应细胞内氧化还原电位的改变，可被解释为平衡游离锌的胞内含量的能力，并且还涉及本发明中的生物活性。
在这种情况下，氧化压力以及因此细胞内氧化还原电位产生的改变，可被自由基诱导，例如活性氧物质、活性氮物质、超氧阴离子自由基，或任何其他含有一或多个未配对电子的自由基。
此外，生物活性也涉及抗氧化活性的能力，其中该氧化压力诱导的自由基透过所述金属硫蛋白的游离半胱氨酸硫氢基残基而被结合，因而失去活性(也被同义地称为「清除」)。这样清除自由基将因此也平衡了细胞内氧化还原电位，故平衡细胞内氧化还原电位的能力被视为是本发明中生物活性的另一方面。
此外，根据本发明的生物活性还涉及一种重金属如镉、铅或其他的协调结合能力，并由此清除以及使所述重金属离子失去生物活性。
在某些具体实施例中，本发明还涉及一种生物活性，例如结合及/或释放上述锌离子以外的生理金属离子，如铜或铁离子的能力。
在另外的具体实施例中，本发明涉及生物活性，如透过氧化还原耦合再生其他细胞内抗氧化剂，如谷胱甘肽、NADH或其他的能力，其中，该抗氧化剂的氧化形式透过所述金属硫蛋白的氧化还原活性的半胱氨酸硫氢基而被化学还原。这可能再次被解释为如上文已经描述的s平衡细胞内氧化还原电位的能力。
在本发明一个较佳具体实施例中，生物活性涉及该金属硫蛋白的能力，以直接结合并使氧化多巴胺产物失去活性，或任何其它由上述氧化压力诱导的自由基所氧化的产物。根据不同的实施例，这包括透过所述金属硫蛋白的氧化还原活性的半胱氨酸硫氢基而造成该非氧化形式的细胞成分的再生。
术语“氧化还原活性”是指参与生化还原-氧化反应的能力(通常称为“氧化还原反应”)，其中还原剂通过提供电子而被化学氧化，且氧化剂通过接受电子的而被化学还原。根据本发明，所述金属硫蛋白具有氧化还原活性，因为通过从其游离及还原的半胱氨酸硫氢基中提供电子，以及氧化还原依赖性结合或释放锌离子，它们能够作为还原剂及氧化剂而参与这样的氧化还原反应。
本发明的一主要目标为，将金属离子结合及平衡、抗氧化剂及清除活性的所有上述生物活性，以及氧化还原活性与氧化还原电位平衡的能力集合于一个相同的蛋白中，即上述具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白。
在其他具体实施例中，本发明涉及生物活性，其可被视为上述活性的机制性的“下游”或“次级”。这种间接的生物活性包括，例如，抑制及/或遏止炎症的能力、抑制及/或遏止自体免疫反应的能力，或调节基因活性的能力。这样的生物活性可能被称为“次要”或间接的，因为他们是，以机制来说，根据上述金属硫蛋白的“主要”功能，例如平衡游离金属离子的含量、抗氧化剂以及清除活性、氧化还原活性或氧化还原电位平衡的能力。然而，这种间接的生物活性是包含在本发明的范畴之内。
在进一步的具体实施例中，本发明还涉及生物活性，例如在恶性细胞如各种癌细胞内诱导细胞周期停滞与细胞凋亡的能力，或抑制这些癌细胞的转移特性的能力，如迁移与侵袭的能力。这样的生物活性亦包括刺激及促进神经细胞再生的能力，如在例如美国专利第8618060号及其引用的参考文献中被广泛地叙述，在此以参考文献方式引入其内容。其分子机制是经科学证明为直接或间接地归因于金属硫蛋白的上述生物活性，因此这些相应的生物活性亦包含在本发明的范畴之内。
该金属硫蛋白的上述生物活性可能，取决于本发明的具体实施例，可以在人体内的任何生理隔室中施用，其中所述活性是有利于治疗或预防所述病症的。任何在所述医药组合物内的所述金属硫蛋白的制剂，以及任何将该蛋白施与至该体内隔室的途径，其是可使上述生物活性充分被保护，都在本发明的范畴之内。
治疗
根据本发明，治疗涉及以本发明的蛋白、化合物或医药组合物预防及治疗受试者，不论何时上述该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的直接或间接生物活性，如平衡细胞内游离的金属离子的含量、抗氧化活性、清除活性、氧化还原活性、氧化还原电位平衡的能力以及其他，都是对治疗有益的。
根据本发明，这样的治疗涉及所述药物中的任何适用制剂，并涉及该药物任何适用的给药路线，以及涉及任何以该药物进行适用的治疗方案，取决于待治疗的受试及病症。术语“适用的”意指，如上所定义，本发明的蛋白、化合物与医药组合物的未损伤的生物功能。
为本领域技术人员所熟知的是，广泛大量的实验及临床数据证实，升高的氧化压力(以及不平衡的细胞内氧化还原电位)与一系列临床病症如各种癌症、代谢性疾病或神经退化性疾病，之间有直接的关联，且氧化压力为该病症的潜在原因及/或直接主要的效应或症状。因此，根据不同的具体实施例，本发明的蛋白、化合物及医药组合物可被用于治疗及预防任何可以与升高的氧化压力与失衡的细胞内氧化还原电位连结的病症。
具体地，在较佳具体实施例中，本发明的药物可被用于治疗如帕金森氏症、阿滋海默症、杭丁顿氏舞蹈、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、威尔森氏症、痴呆，以及其他相关的神经退化性疾病。
在其它较佳具体实施例中，本发明的药物可被用于治疗如高血脂症、肥胖症、第一型糖尿病、第二型糖尿病、脂肪肝症候群，以及其他相关的代谢性失调。
此外，在其它较佳具体实施例中，本发明的药物可被用于治疗如肝癌、乳突性甲状腺癌、结肠癌，以及相关的癌症。
根据本发明，在任何上述的条件的情况下，本发明的药物可被用于治疗或预防各个病症，包括治疗性或预防性处理该病症的根本原因，以及用于治疗或预防该病症的效果、表达与症状，透过本文所定义的蛋白、化合物或医药组合物而达成。
如本文叙述中所用以及以下整个申请专利范围中，除非上下文另有明确说明，“一”、“一个”以及“该”的意思包括复数引用。此外，为了读者的方便，标题或副标题亦可使用于本说明书中，其对本发明的范围没有任何影响。
本文所述的技术与科学术语的含义可以被本领域的普通技术人员所清楚理解。
以下实施例中更加具体地描述本发明，其目的仅为说明的用，因为其中许多修饰及变化对本领域技术人员而言是显见的。以下将对本发明的各种具体实施例进行详细说明。请参照附图，在所有视图中相同的数字表示相同的部件。
实施例
1.具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的制造
根据本发明，金属硫蛋白是透过使用“K.lactis蛋白表达系统”(NewEnglandBiolabs公司，麻州，美国)而制得。将人类MT1a蛋白的相对应cDNA(SEQIDNO:1)以及牛MT2a蛋白的相对应cDNA(SEQIDNO:3)克隆至pKLAC2载体中，然后根据制造商提供的标准操作手册转染K.lactis细胞。自上清液中，以离心及对pH7的Tris-HCl标准缓冲液进行隔夜透析，而预先纯化各金属硫蛋白异构物。去金属化作用是通过以蚁酸进行酸化作用至pH3.5，接着对蚁酸进行透析来达成。以25mMDTT对所有的半胱氨酸硫残基进行化学还原作用之后，取出不含金属的还原前驱蛋白(图中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)的分装物，供之后作为对照组样品。作为本发明一较佳具体实施例的代表性样本，主要蛋白部分随后以4摩尔当量的锌离子进行部分金属化(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)，根据Bradford蛋白定量法，以添加各别量的氯化锌进行。对Tris-HClpH6.5进行隔夜透析后，样品进行分析。透过在上述重构步骤中添加7(而非4)摩尔当量的氯化锌，以产生完全金属化的蛋白(图中以“7Zn-MT1a”以及“7Zn-MT2a”表示)以作为额外的对照样品。
2.低金属化金属硫蛋白与一定数目的金属离子结合
所有样品及对照组的金属离子含量以如公开的方式决定(Ma,R.L.,etal.,2004,Speciationofprotein-boundtraceelementsbygelelectrophoresisandatomicspectrometry.Electrophoresis25(15):2469-77)。简言之，将样品及对照组的等摩尔分装物进行干燥，在硝酸中进行水解，以去离子水稀释之后，以感应耦合电浆原子发射光谱仪(inductivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometry,ICP-OES)分析。来自4个独立实验的结果显示出每摩尔蛋白中锌离子的摩尔当量，图中也包含标准偏差值。
如图1所示，相对于不含金属的前驱蛋白(图中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)以及完全金属化的对照组(其结合7摩尔当量的锌离子)(图中以“7Zn-MT1a”以及“7Zn-MT2a”表示)，这两个低金属化的金属硫蛋白样品(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)皆与特定数量的金属离子结合，如重构步骤(4摩尔当量的锌离子)所定义。
3.低金属化金属硫蛋白含有未与金属离子结合的还原状态的半胱氨酸硫氢基
为了调查在根据本发明所制造的低金属化金属硫蛋白中游离的半胱氨酸硫残基是以化学氧化或还原形式存在，使用发色锌螯合剂Zincon(锌单钠盐，Sigma-Aldrich公司，密苏里州，美国)并根据制造商的标准操作手册分析该蛋白的锌结合与释放特性。简单地说，在pH7.4的标准Hepes缓冲液中，将等摩尔量的金属硫蛋白以及对照组分别与3摩尔当量的氯化锌预先静置处理，然后与过量的Zincon试剂(每1μM的金属硫蛋白加入100μMZincon)混合。以BeckmanCoulter公司型号DU800的分光亮度计在波长620nm下侦测荧光讯号。显示来自5个独立实验的结果，且图中也包含标准偏差值。作为「氧化」对照组，在使用此分析之前，将该前驱蛋白的分装物与500μMH2O2预先静置处理，使该蛋白在半胱氨酸硫残基上被化学氧化(图中以“OxApo-MT1a”以及“OxApo-MT2a”表示)。以含有所有缓冲液及试剂，包括氯化锌，但不含任何金属硫蛋白的空白样品进行标准化。
如图2所示，在该「氧化」对照组(图中以“OxApo-MT1a”以及“OxApo-MT2a”表示)中氧化的半胱氨酸硫残基不再能够协调地结合锌离子(通过其游离锌的含量与空白对照组的含量相同可知)。相较之下，这二种低金属化金属硫蛋白异构物(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)则能够再与3摩尔当量的锌离子结合(因此减少了游离锌的含量)，显示其游离的半胱氨酸硫残基为化学还原状态的(亦可参阅图3B)。
4.低金属化金属硫蛋白能够依照氧化还原状态而与金属离子结合或释放金属离子
根据本发明，上述发色的Zincon分析亦被用于确定低金属化金属硫蛋白结合或是放锌离子的能力，以对应氧化还原电位的改变。为了测量在氧化环境下可能的锌离子释放，等摩尔量的低金属化金属硫蛋白以及对照组分别与过量的Zincon试剂(每1μM的金属硫蛋白加入100μMZincon)在pH7.4Hepes缓冲液中混合。在添加250μmolarH2O2之后，在波长620nm下侦测荧光讯号。为了测量在还原环境下可能的锌离子结合，等摩尔量的低金属化金属硫蛋白在pH7.4的Hepes缓冲液中与750μmolarDTT混合，随后与3摩尔当量的氯化锌混合。在pH7.4Hepes缓冲液中添加过量的Zincon试剂(每1μM的金属硫蛋白加入100μMZincon)之后，在波长620nm下侦测荧光讯号。这两个分析的结果都分别来自6个独立的实验，并且包含标准偏差。带有所有缓冲液与试剂(包含氧化分析用的4摩尔当量的氯化锌，以及还原分析用的3摩尔当量的氯化锌)，但不带有任何金属硫蛋白的空白样品被用来进行标准化。该还原分析的「中性」对照组以相同的方式处理，但不添加DTT(图中以“neutral-MT1a”以及“neutral-MT2a”表示)。
如图3A所示，与作为负对照组的前驱蛋白(图中以“apo-MT1a”以及“apo-MT2a”表示)相比，这两种低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)在氧化环境下皆能够释放锌离子。
如图3B所示，这两种低金属化金属硫蛋白(图中以“hypo-MT1a”以及“hypo-MT2a”表示)在还原环境下皆能够与锌离子结合。再者，相对于该「中性」对照组(图中以“neutral-MT1a”以及“neutral-MT2a”表示)，在以DTT还原时，未观察到锌结合能力的增加，更进一步地验证了，以上低金属化金属硫蛋白的游离半胱氨酸硫残基已经为还原形式的结果。
5.低金属化金属硫蛋白能够平衡氧化还原电位且保护免于氧化压力
为了测试根据本发明所制得的低金属化金属硫蛋白对抗氧化压力的保护能力以及平衡细胞内氧化还原电位的能力，使用来自Promega公司(Promega公司，威斯康星州，美国)的非放射性细胞增殖试剂盒，并根据制造商提供的标准操作手册，在氧化压力环境下测试小鼠肝脏细胞的代谢完整性。
简言之，以一标准的肝门静脉灌注法(Butler,M.AnimalCellCultureandTechnology:TheBasics.2ndEdition,2003,GarlandPublishingInc.)将野生型小鼠的肝细胞取出初代培养，并于96孔微量盘中以标准Dulbecco'sEagle培养液培养至平均密度为每孔约10,000颗细胞。在分析前24小时，将10μM/ml密度的低金属化金属硫蛋白加入各个样品中。更换培养基以清除在外部的低金属化金属硫蛋白之后，加入H2O2使浓度为250μM，处理6小时以作为氧化压力来源，并通过使用BioTekFLx800TB微量盘读取仪在波长490nm下，测量由“MTS内盐”形成的“甲臜”(Promega公司细胞增殖试剂盒)来分析代谢完整性。实验重复5次，且以一空白对照组(去除H2O2或低金属化金属硫蛋白)将结果标准化。图中包含标准偏差。统计学分析由成对的学生氏t检验进行，以***表示P<0.0001。
如图4所示，相对于对照组，本发明的两个低金属化金属硫蛋白变体皆可显著地保护免于氧化压力，以平衡细胞内氧化还原电位及稳定代谢完整性的方式达成。
本发明的示例性具体实施例的上述描述仅是为了说明及描述的目的，并非为了穷尽举例或将本发明限制在所公开的确切形式。根据上述教示，许多修改及变化是可能的。
选择并描述该具体实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使其他本领域技术人员能够利用本发明以及各种具体实施例与各种适合预期的特定用途的修饰。对于本发明所属领域的技术人员而言，替代的具体实施例将变得明显且不脱离其精神及范畴。据此，为了促进科学与实用技术的进步，揭露本发明的范畴，且意旨仅由所附的申请专利范围的范畴所定义者限定本发明的范畴，而非以前面的描述及其中所描述的示例性具体实施例来限定。

Claims (16)

1.一种制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法，该具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白具有20个半胱氨酸硫氢基以及7个结合口袋，该20个半胱氨酸硫氢基中的2至16个未与金属离子结合且为还原状态，以及该7个结合口袋中的1至6个与金属离子结合，包含下列步骤：
提供一金属硫蛋白；
去除该金属硫蛋白上的金属；
化学还原该去金属的金属硫蛋白的所有该20个半胱氨酸硫氢基；以及
通过提供1、2、3、4、5或6个金属离子给该7个结合口袋，以部分金属化该去金属并还原的金属硫蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中该金属硫蛋白具有以下的氨基酸序列：
[Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn 11]
其中
X是除了半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸以外的任何生物来源的L型氨基酸；以及
n1至n11是任何1至12的整数。
3.如权利要求1所述的方法，在去除该金属硫蛋白上的金属的步骤之前，进一步包含预先将该金属硫蛋白完全金属化的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中该去除该金属硫蛋白上的金属的步骤是由将该金属硫蛋白酸化至pH值小于pH4的方式进行。
5.如权利要求1所述的方法，在化学还原该去金属的金属硫蛋白的步骤之前，进一步包含纯化该去金属的金属硫蛋白的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其中该纯化该去金属的金属硫蛋白的步骤是由透析、阳离子交换层析法、逆相色层分析法、高压液相层析法、电泳法、凝胶过滤层析法，以及磁力中的一种方式进行。
7.如权利要求1所述的方法，其中该化学还原该去金属的金属硫蛋白的步骤是由加入还原剂的方式进行。
8.如权利要求8所述的方法，其中该还原剂为麸胱甘肽(glutathione)、还原态烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamidadeninedinucleotide,NADH)、烟碱酸(nicotinicacid)，以及二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)之一。
9.如权利要求1所述的方法，其中该金属离子是选自由锌、铜、铁，以及硒所组成的群组。
10.一种医药组合物，包含至少一种以权利要求1-9任一项所述的方法所制造的具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白。
11.如权利要求10所述的医药组合物，其中该至少一种具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白具有20个半胱氨酸硫氢基以及7个结合口袋，该20个半胱氨酸硫氢基中的2至16个未与金属离子结合且为还原状态，以及该7个结合口袋中的1至6个与金属离子结合。
12.以权利要求1所述的方法所制造的具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白在制备治疗因为升高的细胞内氧化压力、失衡的细胞内氧化还原电位、或氧化还原依赖型的金属离子失衡所引起的疾病的药物的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其中该因为升高的细胞内氧化压力、失衡的细胞内氧化还原电位、或氧化还原依赖型的金属离子失衡所引起的疾病为癌症、神经退化性疾病，以及代谢性失调其中之一。
14.如权利要求13所述的应用，其中该癌症为肝癌、结肠癌、前列腺癌以及乳突性甲状腺癌中的至少一种。
15.如权利要求13所述的应用，其中该神经退化性疾病为帕金森氏症(Parkinson'sdisease)、阿滋海默症(Alzheimer'sdisease)、威尔森氏症(Wilson'sDisease)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(AmyotrophicLateralSclerosis,ALS)，以及杭丁顿氏舞蹈症(Huntington'sDisease)其中之一。
16.如权利要求13所述的应用，其中该代谢性失调为第一型糖尿病、第二型糖尿病、高血脂症、肥胖症，以及脂肪肝症候群中的至少一种。
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