ES2716132T3 - Método de producción de proteínas metalotioneína con actividad rédox hipo-metaladas y composición farmacéutica que la contiene - Google Patents

Abstract

Un método de producción de una proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada, que comprende las siguientes etapas: proporcionar una proteína metalotioneína que comparte la composición de aminoácidos y los motivos estructurales conservados en todas las metalotioneínas de mamíferos de origen natural conocidas, en el que tales proteínas contienen exactamente 20 residuos de cisteína en posiciones conservadas, formando exactamente siete bolsillos de unión con actividad rédox, cada uno de los cuales permite una unión coordinada de un ion metal divalente; desmetalación de la proteína metalotioneína; reducción de forma química de todos los residuos de azufre de cisteína de la proteína metalotioneína desmetalada a la forma de sulfhidrilo (-SH) de forma química reducida; y metalación parcial de la proteína metalotioneína desmetalada reducida proporcionando 1, 2, 3, 4, 5 o 6 iones metálicos a los 7 bolsillos de unión; en el que la proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada como se produce tiene 20 grupos sulfhidrilo de cisteína y 7 bolsillos de unión, en la que 2 a 16 de los 20 grupos sulfhidrilo de cisteína son libres y reducidos, y en el que están ocupados 1 a 6 de los 7 bolsillos de unión por iones metálicos.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de proteínas metalotioneína con actividad rédox hipo-metaladas y composición farmacéutica que la contiene.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención.

La presente invención se refiere a la producción de proteínas metalotioneínas (MT) con actividad rédox hipo-metaladas, en particular a la producción de proteínas MT con números definidos de sitios de unión a MT cisteinilo ocupados con iones metálicos relevantes fisiológicamente.

2. Descripción de la técnica relacionada.

El estrés oxidativo es una forma dañina de estrés químico que ocurre constantemente en el cuerpo humano, principalmente en el sitio de conversión de energía intracelular, las mitocondrias. La fuga de electrones de la cadena de transporte de electrones mitocondrial se considera la causa principal de la generación intracelular de radicales libres, tal como ROS (especies reactivas de oxígeno), RNS (especies reactivas de nitrógeno) y otras. Los estímulos externos, como los productos químicos ambientales, la radiación, las infecciones por virus, así como la desnutrición y el estilo de vida, contribuyen a la generación de radicales libres, lo que lleva al estrés oxidativo interno. Los radicales libres, como ROS o RNS, muestran un grado considerable de reactividad química debido a que comprenden electrones no pareados (Cadenas et al., 2000) y pueden causar una variedad de daño intracelular como la oxidación del ADN, la peroxidación de lípidos, la inactivación de enzimas, la oxidación del ARN y otros (Swindell, 2011). Si no se controla, tal estrés oxidativo y el daño molecular posterior se puede manifestar en una variedad de afecciones médicas (Swindell, 2011). Por ejemplo, ahora se considera que el estrés oxidativo es la causa subyacente de los trastornos metabólicos que incluyen, pero no se limitan a, diabetes, hiperlipidemia y obesidad, trastornos neurológicos relacionados con la edad que incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, así como diversas formas de cáncer (Swindell, 2011; Chimienti, 2013; Furukawa et al., 2004; Ozcan et al., 2004; Miyazaki et al., 2008; Vasto et al., 2008; Moreli et al., 2014).

La generación de radicales libres está estrechamente vinculada con el estado rédox intracelular, que a su vez se debe mantener dentro de límites fisiológicos estrictos, para la función normal del cuerpo (Jiang et al., 1998). La eliminación e inactivación de los radicales libres se realiza mediante antioxidantes fisiológicos como el glutatión (GSH), las vitaminas C y E, el ácido lipoico, los flavonoides y otros componentes con actividad rédox (Aquilano et al., 2014). La actividad rédox de tales antioxidantes protectores, de nuevo, está estrechamente vinculada al estado rédox de la célula, y la regeneración de su capacidad antioxidante, y a su vez el equilibrio del potencial rédox intracelular, se realiza a través de la compleja interacción de parejas de iones de metal activo rédox, enzimas y sustratos, y otros (Jiang et al., 1998; Aquilano et al., 2014). La sobrecarga de los mecanismos de protección antioxidante intrínsecos con factores de estrés oxidativo, y de este modo desestabilizar el potencial rédox intracelular, inevitablemente conducirá al daño y al mal funcionamiento de los componentes intracelulares, manifestándose en la destrucción celular, tisular, orgánica y finalmente sistémica.

Los miembros de la metalotioneína (MT) de familia de proteínas tienen un papel central en el cuerpo humano, ya que las proteínas con actividad rédox, de captación de radicales y de unión a iones metálicos, vinculando la actividad antioxidante, la unión de radicales libres y la titulación de iones metálicos al potencial rédox intracelular. Los MT son polipéptidos monocatenarios de bajo peso molecular con un contenido extraordinariamente alto del aminoácido cisteína. Son los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína, los que permiten que las proteínas MT se unan a iones metálicos, eliminen especies reactivas, muestren actividad antioxidante, y respondan a los cambios en el potencial rédox intracelular (Babula et al., 2012).

En humanos, las MT se agrupan en cuatro subgrupos (MT1-4), con el subgrupo MT1 que contiene al menos ocho miembros identificados, y los subgrupos MT2-4 que contienen un miembro identificado cada uno (Babula et al., 2012). Dado que los residuos de cisteína activos se conservan tanto en número como en posición, en todas las isoformas de MT, las diferencias entre las isoformas solo se pueden encontrar en aminoácidos estructurales que separan las cisteínas, así como en regiones de genes reguladores que controlan los dominios de expresión (Babula et al., 2012).

MT1 y MT2 se expresan en la mayoría de los tejidos blandos del cuerpo humano, con niveles más altos en hígado y riñón, mientras que MT3 se ve como una isoforma específica del cerebro, mostrando niveles más altos de expresión en el sistema nervioso, pero también en corazón, riñón y órganos reproductivos. La isoforma MT4 muestra el patrón de expresión más restringido, y hasta ahora solo se ha encontrado en células epiteliales escamosas (Babula et al., 2012). La expresión de MT es inducida por diversos estímulos como hormonas del estrés (por ejemplo, glucocorticoides), citoquinas, radiación, metales pesados y contaminación química, inflamación y estrés oxidativo (Babula et al, 2012). Las proteínas MT se pueden detectar tanto intra como extracelularmente, y son captadas y distribuidas en diversos compartimentos corporales a través de los receptores de megalina/megalina-cubulina (Leung et al., 2012; Atrian et al., 2013). El tiempo de vida media de las MT depende del estado de metalación (esto es, cuántos sitios de unión están ocupados por cuales iones metálicos) y el estado rédox (esto es, cuántos grupos de azufre de cisteína libres se oxidan) (Krezel et al., 2007). La degradación de las MT se produce principalmente en los lisosomas, y la excreción de los productos de degradación se produce a través de la bilis y el tracto urinario (Bremner et al., 1987).

En base a sus funciones moleculares de unión a metales pesados, titulación de iones metálicos fisiológicos, inactivación de radicales libres, equilibrio de antioxidantes y potencial rédox, las MT se han vinculado recientemente a una variedad de afecciones médicas. En el contexto del cáncer, la restauración de la expresión patológicamente silenciada de las MT en, por ejemplo, las células de carcinoma hepatocelular, las células de cáncer de colon, las células de cáncer papilar de tiroides o las células de cáncer de próstata, se ha demostrado que in vitro e in vivo bloquean el crecimiento y el potencial metastático (esto es, la migración, la adhesión, la invasión) de las células cancerosas, para inducir su apoptosis. y para disminuir la masa y el volumen del tumor (Mao et al., 2012; Yan et al., 2012; Fu et al., 2013; Arriaga et al., 2014). Los mecanismos moleculares implican el equilibrio de los niveles de zinc intracelular libre, que también se ha demostrado que hace que las células cancerosas sean más sensibles a los agentes quimioterapéuticos (Arriaga et al., 2014).

El estrés oxidativo crónico en el sistema nervioso central (CNS) es bien aceptado como causa subyacente de trastornos neurodegenerativos relacionados como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer (PD y AD, respectivamente) (Eibl et al., 2010). En particular, el neurotransmisor dopamina (DA) es altamente reactivo debido a sus propiedades químicas, y sus niveles intra- y extracelulares libres deben estar estrictamente regulados (Eibl et al., 2010). Los productos de dopamina oxidada (oxDA) son neurotóxicos, y se ha demostrado que se unen covalentemente a una variedad de sustratos celulares, obstruyendo así sus funciones biológicas. Entre las proteínas afectadas se encuentran, por ejemplo, parkin, cuyo gen también está altamente asociado al desarrollo de la PD familiar hereditaria. La arilación de parkin a través de productos oxDA disminuye su solubilidad y deteriora su actividad enzimática (La Voie et al., 2005). Se ha demostrado que la arilación similar, a través de la especie oxDA, del transportador de dopamina (que elimina la dopamina libre de la hendidura sináptica) inactivó el transportador. La dopamina que queda trenzada en el espacio sináptico, nuevamente se auto oxida, lo que resulta en un agravamiento adicional del problema (Whitehead et al., 2001; Miyazaki et al., 2008). Se ha demostrado que las MT actúan como sustrato directo para las especies oxDA, lo que ayuda a inactivar y eliminar las oxDA neurotóxicas (Maret, 2006; Gauthier et al., 2008). Tras la arilación de la MT unida al zinc, los iones de zinc se liberan del MT y, a su vez, se sabe que el zinc no solo activa directamente la enzima antioxidante Cu-Zn-SOD, sino que también activa la transcripción de los genes de SOD y catalasa (Fattman et al., 2003). De esta manera, las metalotioneínas están activando aún más la defensa celular contra el estrés oxidativo mediado por oxDA (Eibl et al., 2010). Las características patológicas adicionales de la PD incluyen la mutación y la oligomerización de la proteína a-sinucleína (a-Syn). Se ha demostrado en modelos de ratón para la PD, que la activación artificial de la MT puede bloquear la oligomerización de las proteínas a-Syn, y puede abolir la actividad rédox perjudicial de los oligómeros a-Syn (Meloni et al., 2011). Los ratones con expresión de MT activada en exceso son resistentes al desarrollo de la PD en muchas situaciones diferentes de modelos de PD (Sharma et al., 2013; Ebadi et al., 2005).

Las características patológicas de la AD incluyen la agregación mediada por cobre de diversas isoformas de la proteína beta-amiloide (p-AP), la acumulación extracelular de niveles neurotóxicos de zinc libre dentro de estas placas p-AP, así como la acumulación intraneuronal de iones de hierro prooxidantes y neurotóxicos. Todas estas características perjudiciales relacionadas con el potencial rédox pueden ser inhibidas por las metalotioneínas. La administración de MT2 unido a zinc, por ejemplo, ha demostrado inhibir la agregación de las isoformas p-AP a través del intercambio de zinc por iones de cobre, en modelos AD de ratón (Chung et al., 2010). En un mecanismo similar de intercambio de Zn2+ por Cu2+, Meloni et al. han demostrado que Zn2+ -MT3 puede anular la producción de ROS y la neurotoxicidad resultante de las placas de p-AP en ratones con ^a D (Meloni et al., 2008).

El estrés oxidativo crónico inducido por el estilo de vida y la desnutrición también se ha establecido como causa subyacente de diversos trastornos metabólicos (Chimienti, 2013). La sobrecarga continua de los mecanismos de protección intrínseca contra el estrés oxidativo, conduce a la diferenciación y al desarrollo de nuevas células de almacenamiento de grasa (adipocitos), así como a la acumulación de lípidos en estos adipocitos. El aumento del contenido de lípidos en el tejido graso blanco, a su vez, conduce a una mayor elevación de los niveles de estrés oxidativo (Chimienti, 2013). Se cree que las proteínas MT como antioxidantes pueden romper este ciclo de autoamplificación, al regular los niveles de estrés oxidativo y aumentar los mecanismos de protección antioxidante (Chimienti, 2013; Sato et al., 2010; Higashimoto et al., 2013). Se ha demostrado que MT1 y MT2 protegen a los ratones contra la hiperlipidemia y la obesidad inducidas por la dieta alta en grasas (Sato et al., 2010), así como contra el estrés oxidativo y ER (retículo endoplasmático) inducidos por la dieta alta en grasas incluido el daño del ADN oxidativo resultante (Higashimoto et al., 2013). Adicionalmente, las metalotioneínas protegen contra la nefropatía diabética y la miocardiopatía, las cuales son afecciones inducidas por la diabetes basadas en el estrés oxidativo y ER elevado (Tachibana et al., 2014; Guo et al., 2009; Ruttkay-Nedecky et al., 2013). También hay pruebas sólidas de que las MT unidos a zinc ayudan a estabilizar y normalizar los niveles aberrantes de insulina en pacientes diabéticos, al equilibrar de forma fina los niveles de zinc intracelular libre en las células p de los islotes pancreáticos (Chimienti, 2013). Se ha demostrado que los niveles de Zn2+ bien equilibrados en los islotes pancreáticos son esenciales no solo para la biosíntesis y el almacenamiento de insulina, así como para la maduración de los gránulos de insulina antes de la liberación, sino también para la secreción controlada de insulina estimulada por glucosa (Slepchenko et al., 2015).

En vista de la técnica relacionada, se hace referencia adicional a la enseñanza de T. T. Ngu et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications 401 (2010), páginas 69-74, que se refiere a la transferencia de arsénico entre proteínas metalotioneínas a pH fisiológico y describe proteínas apo-metalotioneínas (apo-MT) parcialmente metaladas aisladas y enseña un método de producción de especies parcialmente As-metaladas por transferencia de metal de proteína-proteína, ya que As no puede metalizar MT a pH 7. Además, revela el uso de Cd⁴-a-hMT, Cd³-p-hMT y Cdz-pahMT. Dichas proteínas unidas a Cd sirven como precursores para incubar a pH bajo con equivalentes de As para obtener especies As3+-MT parcialmente metaladas.

3. Referencias

Cadenas E., and Davies K.J.A. (2000). Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med. 29: 222-230.

Swindell, W.R. (2011). Metallothionein and the Biology of Aging. Ageing Res. Rev. 10(1): 132-45. Chimienti, F. (2013). Zinc, pancreatic islet function and diabetes: new insights into an old story. Nutrition Research Reviews 26: 1-11.

Furukawa, S., et al. (2004).Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J. Clin. Invest.

114: 1752-61.

Ozcan, U., et al. (2004).Endoplasmatic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science 306: 457-61.

Miyazaki, I., and Asanuma, M. (2008). Dopaminergic neuron-specific oxidative stress caused by dopamine itself.Acta Med. Okayama, 62 (3): 141-50.

Vasto, S., et al. (2008). Inflammation, genes and zinc in Alzheimer's disease. Brain Res. Rev., 58: 96-105.

Moreli, J.B., et al. (2014). DNA Damage and Its Cellular Response in Mother and Fetus Exposed to Hyperglycemic Environment. Biomed Res Int., Vol. 2014, Article ID 676758.

Jiang, L.J., et al. (1998). The glutathione rédox couple modulates zinc transfer from metallothionein to zinc-depleted sorbitol dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3483-3488.

Aquilano, K., et al. (2014). Glutathione: new roles in rédox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. August, Vol.

5, Article 196.

Babula, B., et al. (2012). Mammalian metallothioneins: properties and functions. Metallomics 4: 739-50.

Leung, JY., et al. (2012). Metallothionein promotes regenerative axonal sprouting of dorsal root ganglion neurons after physical axotomy. Cell Mol Life Sci. 2012 March; 69(5):809-17.

Atrian, S., and Capdevila, M. (2013).Metallothionein-protein interactions. Biomol Concepts. 2013 April; 4(2):143-60. Krezel, A., and Maret, W. (2007). Different rédox states of metallothionein/ thionein in biological tissue.Biochem. J. 402: 551-8.

Bremner, I., et al. (1987). Metallothionein in blood, bile and urine.Experientia Suppl. 52: 507-17.

Mao, J., et al. (2012). Metallothionein MT1M is a tumor suppressor of hepatocellular carcinomas. Carcinogenesis 12: 2568-77.

Yan, D.W., et al. (2012). Downregulation of Metallothionein 1F, a putative oncosuppressor, by loss of heterozygosity in colon cancer tissue.Biochim. Biophys. Acta 2012, 1822, 918-926.

Fu, Y., et al. (2013). Metallothionein 1G functions as a tumor suppressor in thyroid cancer through modulating the PI3K/Akt signaling pathway. BMC Cancer 13: 462.

Arriaga, J.M., et al., (2014). Metallothionein 1G and zinc sensitize human colorectal cancer cells to chemotherapy. Mol Cancer Ther.2014 Mar 14.epub ahead of print.

Han, Y.C., et al. (2013). Metallothionein 1h tumour suppressor activity in prostate cancer is mediated by euchromatinmethyltransferase 1. J Pathol 2013; 230 (2),: 184-93.

Eib1, J.K., et al. (2010). Zinc-metallothionein: a potential mediator of antioxidant defence mechanisms in response to dopamine-induced stress. Can. J. Physiol. Pharmacol. 88: 305-312.

LaVoie, M.J., et al. (2005). Dopamine covalently modifies and functionally inactivates parkin. Nat. Med. 11(11):1214-21. Whitehead, RE., et al. (2001). Reaction of oxidized dopamine with endogenous cysteine residues in the human dopamine transporten J. Neurochem. 76(4): 1242-1251.

Miyazaki, I., and Asanuma, M. (2008). Dopaminergic neuron-specific oxidative stress caused by dopamine itself. Acta Med. Okayama, 62(3): 141-150.

Maret, W. (2006). Zinc coordination environments in proteins as rédox sensors and signal transducers. Antioxid. Rédox Signal. 8(9-10): 1419-1441.

Gauthier, M.A., et al. (2008). Covalent arylation of metallothionein by oxidized dopamine products: a possible mechanism for zinc-mediated enhancement of dopaminergic neuron survival. Neurotox. Res. 14(4): 317- 328.

Fattman, C.L., et al. (2003). Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine. Free Radic. Biol. Med. 35(3): 236-256.

Meloni, G., Vasák, M. (2011). Rédox activity of a-synuclein-Cu is silenced by Zn7-metallothionein-3. Free RadicBiol Med.

50(11): 1471-9.

Sharma, S., et al. (2013).Biomarkers in Parkinson's disease (recent update).Neurochem Int. 63(3):201-29.

Ebadi, M., et al. (2005).Metallothionein-mediated neuroprotection in genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res Mol Brain Res. 134(1):67-75.

Chung, R.S., et al. (2010). The native copper- and zinc-binding protein metallothionein blocks copper-mediated Abeta aggregation and toxicity in rat cortical neurons. PloS One 5, e12030.

Meloni, G., et al. (2008). Metal swap between Zn7-metallothionein-3 and amyloid-beta-Cu protects against amyloid beta toxicity. Nat. Chem. Biol. 4: 366-372.

Chimienti, F. (2013). Zinc, pancreatic islet cell function and diabetes: new insights into an old story. Nutr. Res. Rev.

26(1):1-11.

Sato, M., et al. (2010).Development of high-fat-diet-induced obesity in female metallothionein-null mice.FASEB J. 24; 2375-2384.

Higashimoto, M., et al. (2013).Preventive effects of metallothionein against DNA and lipid metabolic damages in dyslipidemic mice under repeated mild stress. J. Med. Invest. 60(3-4):240-8.

Tachibana, H., et al. (2014). Metallothionein deficiency exacerbates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology, 306: F105-F115.

Guo, R., et al. (2009). Metallothionein Alleviates Oxidative Stress-Induced Endoplasmic Reticulum Stress and Myocardial Dysfunction. J. Mol. Cell Cardiol.47(2): 228-237.

Ruttkay-Nedecky, B., et al. (2013).The Role of Metallothionein in Oxidative Stress. Int. J. Mol. Sci. 14: 6044-6066.

Slepchenko, KG., et al. (2015). Autocrine effect of Zn(2+) on the glucose-stimulated insulin secretion. Endocrine. 2015 Sep; 50(1): 110-22.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un método de producción de una proteína metalotioneína con actividad rédox hipometalada. La proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada tiene 20 grupos sulfhidrilo de cisteína, formando de este modo 7 bolsillos de unión a iones metálicos. Dos (2) a 16 de los 20 grupos sulfhidrilo de cisteína son libres y reducidos, y 1 a 6 de los 7 bolsillos de unión están ocupadas por iones metálicos. El método comprende las siguientes etapas:

proporcionar una proteína metalotioneína;

desmetalación de la proteína metalotioneína;

reducción de forma química de todos los 20 grupos sulfhidrilo de cisteína de la proteína metalotioneína desmetalada; y metalación parcial de la proteína metalotioneína desmetalada reducida proporcionando 1,2, 3, 4, 5 o 6 iones metálicos a los 7 bolsillos de unión.

En algunas realizaciones, la proteína metalotioneína tiene una fórmula de aminoácidos de [Xn1CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXCXn6CCXCCXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11] en la que X es cualquier L-aminoácido biogénico con la excepción de cisteína, fenilalanina, triptófano, y tirosina, y n1 a n11 son números enteros de cualquier valor desde 1 a 12.

En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de premetalación completa de la proteína metalotioneína antes de la etapa de desmetalación de la proteína metalotioneína.

En algunas realizaciones, la etapa de desmetalación de la proteína metalotioneína se realiza acidificando la proteína metalotioneína a un valor de pH inferior a pH 4.

En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de purificación de la proteína metalotioneína desmetalada antes de la etapa de reducción de forma química de la proteína metalotioneína desmetalada. En algunas realizaciones, la etapa de purificación de la proteína metalotioneína desmetalada se realiza mediante uno de diálisis, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de fase reversa, cromatografía líquida de alta presión, métodos electroforéticos, filtración en gel y fuerza magnética.

En algunas realizaciones, la etapa de reducción de forma química de la proteína metalotioneína desmetalada se realiza añadiendo un agente reductor. En algunas realizaciones, el agente reductor es uno de glutatión, dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH), ácido nicotínico y ditiotreitol (DTT).

En algunas realizaciones, los iones metálicos se seleccionan del grupo de zinc, cobre, hierro y selenio.

La proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada producida por el método descrito anteriormente se puede usar para una composición farmacéutica, que comprende al menos una de tales proteínas metalotioneínas con actividad rédox hipo-metaladas. La al menos una proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada tiene 20 grupos sulfhidrilo de cisteína y 7 bolsillos de unión a iones metálicos, de 2 a 16 de los 20 grupos sulfhidrilo de cisteína son libres y reducidos, y 1 a 6 de los 7 bolsillos de unión están ocupadas por iones de metales.

Se observa que la proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada producida por el método descrito anteriormente se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección originada por un estrés oxidativo intracelular elevado, potencial rédox intracelular desbalanceado, o desbalance dependiente del potencial rédox de iones metálicos. La afección originada por el estrés oxidativo intracelular elevado, el potencial rédox intracelular desbalanceado o el desbalance dependiente del potencial rédox de los iones metálicos puede ser cáncer, enfermedades neurodegenerativas o trastornos metabólicos. El cáncer es al menos uno de carcinoma hepatocelular, cáncer de colon, cáncer de próstata y/o cáncer de tiroides papilar. Las enfermedades neurodegenerativas pueden ser la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Wilson, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y/o la enfermedad de Huntington. Los trastornos metabólicos pueden ser diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, hiperlipidemia, obesidad y/o síndrome del hígado graso.

Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción de la realización preferida tomada en conjunto con los siguientes dibujos, aunque las variaciones y modificaciones en los mismos se pueden realizar sin apartarse del espíritu y alcance de los nuevos conceptos de la divulgación.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos ilustran una o más realizaciones de la invención y, junto con la descripción escrita, sirven para explicar los principios de la invención. Siempre que sea posible, se usan los mismos números de referencia en todos los dibujos para referirse a los mismos elementos o elementos similares de una realización, y en los que:

La figura 1 muestra los contenidos molares de zinc de apo-proteínas metalotioneínas (MT) libre de metal ("apo-MT1a" y "apo-MT2a"), proteínas MT completamente metaladas ("7Zn-MT1a" y "7Zn-MT2a"), y proteína MT con actividad rédox hipo-metalada ("hipo-MT1a" e "hipo-MT2a").

La figura 2 muestra el estado rédox de las apo-proteínas metalotioneínas (MT) oxidadas ("OxApo-MT1a" y "OxApo-MT2a") y la proteína MT con actividad rédox hipo-metalada ("hipo-MT1a" e “hipo-MT2a").

La figura 3A muestra la liberación de zinc dependiente de rédox de apo-proteínas MT libres de metal ("apo-MT1a" y "apo-MT2a") y proteína MT con actividad rédox hipo-metalada ("hipo-MT1a" e "hipo-MT2a"), bajo condiciones oxidativas.

La figura 3B muestra la unión al zinc dependiente de rédox de la proteína MT con actividad rédox hipo-metalada en condiciones rédox-neutras ("neutro-MT1a" y "neutro-MT2a") y la proteína MT con actividad rédox hipo-metalada en condiciones reductoras ("hipo-MT1a" e “hipo-MT2a").

La figura 4 muestra la capacidad de estabilizar la integridad metabólica (como medida del equilibrio del potencial rédox), de las proteínas MT de control ("controlMT1a" y "controlMT2a") y la proteína MT con actividad rédox hipo-metalada ("hipo-MT1a" e “hipo-MT2a ") bajo condiciones de estrés oxidativo.

Descripción detallada de la realización preferida.

La invención proporciona un método biotecnológico para producir proteínas metalotioneínas (MT) con actividad rédox hipo-metalada, que según la invención tendrán números definidos de sitios de unión a MT cisteinilo ocupados con iones metálicos fisiológicamente relevantes (preferiblemente zinc Zn2+, como ligando fisiológico predominante), además de tener números definidos adicionales de sitios de unión de cisteinilo MT desocupados y estar en un estado de forma química reducido (esto es, no oxidado).

Las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas obtenidas por el método descrito en este documento comparten la composición de aminoácidos y los motivos estructurales conservados en todas las metalotioneínas de mamíferos de origen natural conocidas, con el aminoácido cisteína, que es esencial para la actividad biológica de dichas proteínas, que se conserva tanto en número como en posición intramolecular. Tales proteínas tienen preferiblemente una longitud de 61 a 68 aminoácidos y contienen 20 residuos de cisteína en posiciones conservadas, formando de este modo siete bolsillos de unión con actividad rédox para iones metálicos divalentes. Los aminoácidos estructurales que comprenden el resto de dichas proteínas pueden incluir todos los demás aminoácidos biogénicos de origen natural, con excepción de la cisteína y los aminoácidos aromáticos fenilalanina, triptófano y tirosina.

Las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas, después de producirse según la invención, se unen no menos de una y no más de seis iones metálicos fisiológicamente relevantes, tal como el zinc, el hierro, el cobre o el selenio. Por consiguiente, el número de iones metálicos por molécula de proteína puede variar desde 1 a 6.

Las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas, después de ser producidas, purificadas y metaladas parcialmente con iones metálicos preferidos, según el método de la presente invención, contienen bolsillos de unión de cisteína no ocupados compuestos de residuos de cisteína con grupos sulfhidrilo no oxidados. (esto es, reducido de forma química). Cuando la proteína contiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 bolsillos de unión a cisteína no ocupadas, cada proteína tiene 2, 5, 9, 12, 13 o 16 grupos de sulfhidrilo de cisteína libres y reducidos, respectivamente. Por consiguiente, el número de grupos sulfhidrilo de cisteína libres y reducidos por molécula de proteína puede variar desde 2 a 16.

Según los datos científicos actuales, las formas fisiológicamente significativas de proteínas metalotioneínas son la isoforma totalmente metalada, así como las apo-proteínas libres de metal oxidadas y reducidas (Krezel et al., 2007, véase arriba). Las formas intermedias, ya sea parcialmente oxidadas o parcialmente metaladas, nunca se han detectado o aislado in vivo.

Desde el punto de vista funcional, las apo-proteínas metalotioneínas completamente oxidadas no podrían eliminar los radicales libres, mostrar actividad antioxidante, o unirse o liberar iones metálicos. Una apo-proteína de metalotioneína completamente reducida podría actuar como antioxidante y podría unir iones metálicos, pero lógicamente no podría liberar iones metálicos en respuesta a cambios rédox. Además, una proteína metalotioneína completamente metalada podría liberar iones metálicos en respuesta a cambios rédox y actuar como antioxidante, pero no sería capaz de unirse a iones metálicos adicionales. En consecuencia, solo una proteína MT hipo-metalada con sus residuos de cisteína libres en forma reducida se situaría para actuar en las tres formas, como antioxidante, como la unión de ion metálico y la molécula sensible a rédox que libera iones metálicos.

También, desde el punto de vista del "equilibrio fino intra y extracelular de los niveles de zinc libre" (y todos sus efectos aguas abajo), solo una proteína MT parcialmente metalada puede actuar tanto como "sumidero" y "fuente" de iones de zinc. En respuesta a los cambios en el potencial rédox, las proteínas MT totalmente metaladas no podrían disminuir los niveles de zinc libre, mientras que las apo-proteínas metalotioneínas libres de metales no podrían liberar iones de zinc.

En conjunto, la presente invención activa funcionalmente las proteínas MT de origen natural o diseñadas artificialmente para que puedan actuar de estas formas específicas, generando proteínas MT hipo-metaladas en estados específicos de metalación y rédox. En contraste, las formas de origen natural de las proteínas metalotioneínas, en su metalación de origen natural y los estados rédox, no pueden funcionar de la misma manera.

Las proteínas MT hipo-metaladas obtenidas por el método de la presente invención se pueden usar adicionalmente para composiciones farmacéuticas que contienen estas proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas. Las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas conservan su carga completa de iones metálicos no deteriorada, su sensibilidad de potencial rédox y su capacidad antioxidante en función de sus grupos de sulfhidrilo de cisteína reducidos.

Las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas obtenidas por el método de la presente invención se pueden usar para el tratamiento preventivo y curativo de cualquier afección originada por el estrés oxidativo intracelular elevado, el potencial rédox intracelular desbalanceado o desbalance dependiente del potencial rédox de iones metálicos. De acuerdo con lo anterior, las composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas MT con actividad para rédox hipometaladas se pueden usar en el tratamiento de afecciones, donde la normalización y la estabilización del potencial rédox intracelular, los niveles de estrés oxidativo, y los niveles libres de iones metálicos unidos al potencial rédox son beneficiosos y de apoyo para el tratamiento. Tales afecciones incluyen, pero no se limitan a: diversas formas de cáncer, tal como el carcinoma hepatocelular, el cáncer de colon, el cáncer de próstata y el cáncer papilar de tiroides; diversas enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Wilson, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la enfermedad de Huntington; diversos trastornos metabólicos, tales como los tipos de diabetes mellitus, hiperlipidemia, obesidad, síndrome del hígado graso.

Producción de apo-proteínas de metalotioneína

Las apo-proteínas de metalotioneína, en su forma nativa con estado de metalación indefinido y el estado rédox indefinido de sus residuos de azufre de cisteína, se pueden producir por cualquier método convencional de tecnología de ADN recombinante, síntesis de proteínas, escisión enzimática de pro-proteínas previas, o aislamiento de variantes de origen natural de proteínas metalotioneínas de mamíferos.

De este modo, las apo-proteínas metalotioneínas se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante establecida (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, 1989, y las referencias en esta). La secuencia de ADN que codifica la isoforma de proteína de metalotioneína de longitud completa respectiva se puede sintetizar ya sea mediante métodos estándar de síntesis de ácido nucleico, o se puede obtener mediante métodos de laboratorio establecidos para aislarla directamente de bibliotecas de ADNc o genómicas apropiadas, o indirectamente copiarla y amplificarla de dichas bibliotecas por el método estándar de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La secuencia de ADN, después de una preparación y purificación apropiadas, se puede introducir luego en un vector de expresión recombinante de elección, usando, de nuevo, los métodos estándar establecidos. La elección de un vector apropiado puede depender de la elección del sistema de expresión de proteínas que se va a usar. Los sistemas de expresión, según lo establecido y ampliamente descrito en la literatura científica bien conocida para los expertos en el arte, incluyen células bacterianas procarióticas, levaduras eucarióticas y células fúngicas, así como cultivos celulares derivados de animales superiores tal como insectos, artrópodos o mamíferos. La introducción del vector de expresión de la proteína, equipado con la secuencia de codificación para la variante de la proteína MT elegida, en las células huésped apropiadas, se puede facilitar mediante los protocolos establecidos.

La elección del sistema de expresión de proteínas y el vector de expresión recombinante compatible en el que se introduce el ADN codificador descrito para cualquier variante de metalotioneína elegida, también puede determinar características como

la elección de vectores de plásmidos extracromosómicos frente a los vectores que se integran en los genomas de la célula huésped;

la elección e inclusión de secuencias promotoras apropiadas para la activación transcripcional, así como secuencias de terminación transcripcional;

la elección e inclusión de secuencias de origen de replicación y secuencias de marcadores de selección; y

la elección e inclusión de secuencias para proteínas de fusión y sitios de escisión de proteasas apropiados para los métodos de expresión y purificación de proteínas elegidos.

Todas estas y características adicionales relativas a los métodos establecidos de expresión de proteínas, son bien conocidas para los expertos en el arte, y se pueden decidir en relación con los métodos estándar establecidos de biotecnología.

De este modo, de acuerdo con lo anterior, en un ejemplo se puede usar el sistema de expresión de proteínas basado en levadura Kluyveromyceslactis (K. lactis) (New EnglandBiolabs Inc., MA, USA).

Las regiones codificantes de las isoformas de mamífero (por ejemplo, bovinas o humanas) de metalotioneínas se pueden amplificar por PCR a partir de bibliotecas de ADNc apropiadas, usando cebadores de PCR sintetizados estándar específicos para el gen de interés respectivo y que incluyen sitios de restricción tal como XhoI y NotI así como el sitio de escisión de proteasa Kex. Después de la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN deseados según los protocolos del fabricante, los fragmentos de ADN se pueden clonar en el vector plásmido pKLAC2 del fabricante usando las endonucleasas de restricción XhoI y NotI y la ADN ligasa I. Después de la purificación apropiada así como la linealización de dicho vector usando la endonucleasa de restricción SacII y el sitio de restricción compatible intrínseco al vector pKLAC2, las células competentes de K. lactis proporcionadas por el fabricante se pueden transformar con dicho casete de expresión linealizado. Usando marcadores de selección positivos y negativos intrínsecos al vector pKLAC2, los clones positivos de K. lactis, que contienen copias individuales o múltiples del casete de expresión de metalotioneína deseado correctamente integrado en el genoma del huésped, se pueden seleccionar usando los protocolos de los fabricantes. De este modo, en este ejemplo, dichas células de K. lactis transformadas de manera estable se pueden cultivar luego en un medio de cultivo apropiado, para expresar de manera estable la variante de metalotioneína elegida como una proteína de fusión fusionada con el dominio del factor de emparejamiento intrínseco de K. lactisa (a-MF) bajo control transcripcional del promotor LAC4 de K. lactis intrínseco, y para secretar, después de la escisión de proteasa Kex intrínseca de a-MF, la forma nativa y modificada de forma postraduccional de la proteína metalotioneína deseada, con estado de metalación no específico y estado rédox no específico de residuos de azufre de cisteína.

Purificación, reducción e hipometalación de proteínas de metalotioneína

Un objetivo clave de la presente invención es proporcionar proteínas metalotioneínas con números definidos de iones metálicos unidos de forma coordinada a sus residuos de cisteína, así como con números definidos de residuos de azufre de cisteína libres que están presentes en forma de sulfhidrilo reducido de forma química (-SH). Por lo tanto, las realizaciones preferidas de la invención usan métodos apropiados para producir tales proteínas metalotioneínas con actividad rédox hipo-metaladas, en las cuales las apo-proteínas metalotioneínas descritas anteriormente pueden ser completamente desmetaladas, reducidas de forma química en sus grupos sulfhidrilo de cisteína, y luego metaladas parcialmente con cantidades definidas de los iones metálicos fisiológicamente relevantes preferidos, como zinc, cobre, hierro u otros.

Según la presente invención, las formas nativas de apo-proteínas metalotioneínas elegidas, con metalación no especificada y estado rédox, producidas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente de tecnología de ADN recombinante, síntesis de proteínas, escisión enzimática de pre-pro-proteínas, el aislamiento de variantes de las proteínas de metalotioneína, o métodos alternativos, primero se pueden aislar y purificar a partir del medio de cultivo respectivo, la solución reguladora o el sustrato biológico.

Según la invención, este aislamiento y purificación iniciales se pueden lograr mediante cualquier método estándar de bioquímica de proteínas bien conocido para los expertos en el arte. Los métodos establecidos, como la diálisis contra las soluciones reguladoras acuosas apropiadas, la cromatografía de intercambio catiónico, la cromatografía de fase reversa, la cromatografía de líquidos a alta presión, los métodos electroforéticos, la filtración en gel, etc., se pueden elegir con respecto al método de producción previamente elegido de la apo-proteínas MT (como se describe anteriormente) y la condición dada de dichas apo-proteínas MT. El aislamiento de las proteínas MT respectivas también se puede lograr mediante el uso de fuerza magnética, en cuyo caso las proteínas MT primero pueden ser previamente metaladas completamente, por ejemplo, iones de zinc. Tal premetalación, con el fin de permitir el aislamiento y la purificación iniciales, se debe distinguir de la unión final de cantidades definidas de iones metálicos fisiológicos elegidos, con el fin de producir el producto final hipo-metalado de la presente invención.

Un ejemplo de esta invención usa el método de ADN recombinante mencionado anteriormente de la expresión de la proteína MT en la levadura Klyuveromyces lactis. En este ejemplo, la isoforma MT elegida, como apo-proteína, se secretará en el medio de cultivo respectivo y permanecerá en solución, con una metalación no definida y un estado rédox. Después de la separación de las células de levadura del medio de cultivo, mediante métodos estándar como centrifugación o filtración, etc., la concentración de proteína de dicha solución de MT se puede determinar usando métodos estándar bien establecidos como el ensayo de proteínas de Bradford, etc. Esto, a su vez, permitirá el cálculo de la cantidad máxima requerida de iones metálicos que se pueden unir a las presentes proteínas MT, suponiendo que todos los sitios de unión de MT no estén ocupados. Dado que cada mol de proteína MT se puede unir a hasta siete moles de iones metálicos divalentes, se puede añadir la cantidad apropiada de sal de zinc (por ejemplo, como sulfato de zinc o cloruro de zinc, etc.) a la solución de MT, para permitir una premetalación completa. De esta solución, la proteína Zn⁷-MT completamente reconstituida se puede recuperar usando fuerza magnética.

Otros ejemplos pueden hacer uso de otros métodos estándar, bien establecidos de aislamiento y purificación, y pueden conducir a aislados de proteína MT con un estado de premetalación sin definir u otro.

Cualquiera de los aislados de proteína MT, independientemente del estado de metalación de las proteínas MT contenidas en estas, se puede someter luego a acidificación, a cualquier valor de pH por debajo de pH 4, para permitir la disociación completa de todos los iones metálicos unidos. En realizaciones preferidas de esta invención, se puede elegir cualquier ácido monovalente de origen natural con un valor de pKa entre 1.27 y 4.76 (ácido fórmico, ácido acético, ácido oxálico, ácido ascórbico u otros), y la acidificación a pH 4 inferior se puede lograr mediante adición gradual del ácido respectivo, seguida de una medición estándar del valor de pH de la solución, hasta que se alcanza un valor de pH inferior a pH 4, o calculando la cantidad necesaria de iones de hidrógeno (iones hidronio en soluciones acuosas, respectivamente) en base a concentración de proteína MT en solución (véase arriba). Por ejemplo, en dicho cálculo, se requieren 20 moles de iones de hidrógeno por mol de proteína MT, para saturar todos los residuos de azufre de cisteína previamente unidos al metal con iones de hidrógeno, asumiendo que las proteínas MT respectivas han sido pre­ metaladas completamente.

De acuerdo con uno de los objetivos clave de la presente invención, que es la metalación parcial de las proteínas MT con números definidos de iones metálicos específicos, los aislados de la proteína MT descritos anteriormente, después de la desmetalación completa, ahora se pueden purificar a partir de cualquier ion metálico, incluidos los iones metálicos que se podrían haber usado para la pre-metalación (véase más arriba). Esta purificación, dependiente de la realización de la presente invención, se puede lograr mediante cualquier método bioquímico de proteína estándar, por ejemplo mediante diálisis frente a una solución reguladora sin metal apropiada. En otras realizaciones, se pueden usar métodos electroforéticos, o fuerza magnética, para eliminar dichos iones metálicos. En cualquier método elegido para la eliminación de iones metálicos, el valor de pH de la solución de proteína MT dada se debe mantener por debajo de pH 4, para garantizar el estado libre de metales de tales proteínas MT y para permitir la eliminación completa de cualquiera de dichos iones metálicos.

De acuerdo con la presente invención, las respectivas isoformas de la proteína MT pueden ahora, después del aislamiento, purificación y desmetalación descritos anteriormente, someterse a condiciones de reducción química para garantizar la reducción química de cualquier residuo de azufre de cisteína potencialmente oxidado. En realizaciones preferidas de la presente invención, esto se puede lograr mediante la adición de cantidades necesarias de agentes reductores apropiados, que incluyen pero no se limitan a glutatión, dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH), niacina (ácido nicotínico), ditiotreitol (DTT) u otros donantes bioquímicos de electrones., a la solución de proteína MT descrita. Las cantidades de agente reductor necesarias para la reducción de forma química de todos los residuos de azufre de cisteína presentes, se pueden calcular nuevamente a partir de la concentración de proteína mencionada anteriormente, y en base a la suposición de que todos los residuos de azufre de cisteína pueden ser oxidados. Por ejemplo, un mol de proteína MT en la solución puede requerir de este modo 20 moles de agente reductor monovalente para la reducción completa de todos los residuos de azufre de cisteína MT a la forma de sulfhidrilo (-SH).

De acuerdo con la presente invención, las isoformas de la proteína MT descritas anteriormente, que ahora están desmetaladas completamente y se reducen completamente en sus residuos de azufre de cisteína, y todavía están en solución ácida en condiciones reductoras, ahora se pueden metalizar parcialmente con cantidades definidas de Ios iones de metal elegidos, por ejemplo iones de zinc. En una realización preferida de la invención, la isoforma MT dada se puede reconstituir en forma de Zn⁴-MT parcialmente metalada, con cuatro iones de zinc divalentes unidos por una molécula de MT. La cantidad necesaria de iones de zinc se puede calcular en base a la concentración de isoforma MT en solución, y se pueden añadir cuatro equivalentes molares de iones de zinc a dicha solución, preferiblemente como sulfato de zinc o cloruro de zinc. Con el fin de permitir la reconstitución de la isoforma de la proteína Zn4-MT parcialmente metalada, el valor de pH de dicha solución se puede elevar de previamente ácido a neutro, y los valores de pH entre pH 6.5 y pH 7.5 se consideran neutros. Esto se puede lograr añadiendo a dicha solución las cantidades necesarias de agentes neutralizantes como el hidróxido de amonio, acetato de amonio u otros, y la medición consecutiva del valor de pH de la solución, usando métodos de medición de pH estándar, hasta alcanzar dicho valor de pH neutro. De este modo, en esta realización de la invención, puede producirse una isoforma de la proteína MT parcialmente metalada con Zn, unida a cuatro iones de zinc por molécula y con sus grupos sulfhidrilo de cisteína libres que se reducen de forma química y, por lo tanto, se puede producir una actividad rédox.

En otras realizaciones de la presente invención, diferentes estados de metalación, con solo de uno a tres iones de zinc unidos por molécula y, respectivamente, más residuos de sulfhidrilo de cisteína se reducen y se activan con rédox, o incluso con cinco o seis iones de zinc unidos por molécula y respectivamente, se pueden producir de manera análoga menos grupos sulfihidrilo de cisteína que se reducen y tengan actividad rédox, o hipometalación con iones metálicos fisiológicos distintos al zinc (tal como cobre, hierro, selenio u otros). De este modo, en una realización adicional de la invención, la metalación parcial con iones de cobre se puede lograr reemplazando las sales de zinc con sales de cobre en el método descrito anteriormente, mientras que en otras realizaciones más se pueden lograr diferentes estados de metalación con cualquier ion metálico elegido adaptando las cantidades necesarias de las respectivas sales metálicas.

Según la presente invención, la isoforma de la proteína MT elegida, que ahora está parcialmente metalada con números definidos de iones metálicos específicos, y ahora tiene actividad rédox con números definidos de residuos de azufre de cisteína presentes como grupos sulfhidrilo reducidos, ahora se puede aislar y purificar, para permitir la fabricación posterior en los compuestos descritos a continuación. En realizaciones preferidas de la invención, la purificación final se puede realizar mediante cualquier método bioquímico de proteínas establecido que permita la metalación no alterada y el estado rédox de dichas isoformas de proteínas MT. De acuerdo con lo anterior, durante esta etapa de purificación final, se deben evitar los valores de pH por debajo de pH 4, así como las condiciones de oxidación química.

Proteínas metalotioneínas

Las proteínas metalotioneína descritas en este documento comparten la composición de aminoácidos y los motivos estructurales conservados en todas las metalotioneínas de mamíferos de origen natural conocidas, con el aminoácido L-cisteína, como esencial para la actividad biológica de dichas proteínas, conservándose tanto en número como en posición intramolecular. Tales proteínas tienen preferiblemente una longitud de 61 a 68 aminoácidos, y contienen exactamente 20 residuos de cisteína en posiciones conservadas, formando de este modo exactamente siete bolsillos de unión con actividad rédox, cada una de las cuales permite la unión coordinada de un ion metálico divalente. Los aminoácidos que comprenden el resto de dichas proteínas pueden incluir todos los otros L-aminoácidos biogénicos de origen natural con excepción de la cisteína y los aminoácidos aromáticos fenilalanina, triptófano y tirosina.

En una realización, el método de la presente invención se relaciona con la fabricación de proteínas metalotioneínas con la fórmula del aminoácido: [Xn-iCXCXn² CXCXn³ CXCXn⁴ CXCXn⁵ CXn⁶ CCXCCXn⁷ CXn⁸ CXn⁹ CXCXn¹⁰CXCCXn¹¹ ], en la que “X” puede ser cualquier L-aminoácido biogénico con la excepción de cisteína("C") y los aminoácidos aromáticos fenilalanina, triptófano y tirosina, y en la que "n1" a "n11" pueden ser números enteros de cualquier valor desde 1 a 12. De este modo, en este aspecto de la invención y dependiendo de la realización, las proteínas pueden tener una longitud de 38 a 159 aminoácidos, y contener no más y no menos de 20 L-cisteínas en posiciones conservadas según la fórmula anterior, y no contener aminoácidos aromáticos. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas metalotioneínas pueden ser de origen natural o sintetizadas artificialmente. En algunos ejemplos, las proteínas metalotioneínas son proteína metalotioneína 1a humana (MT1a) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y/o la proteína metalotioneína 2a bovina (MT2a) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

En otro ejemplo más, la presente invención se refiere a las proteínas compuestas de una sola cadena de aminoácidos, y se refiere a los monómeros de las proteínas. Sin embargo, en relación con un aspecto adicional de la invención, las proteínas, después de ser hipo-metaladas y con actividad rédox según la presente invención, también se pueden dimerizar o multimerizar como homo o heterómeros al fabricarse en compuestos biológicamente activos y composiciones farmacéuticas (como se describe abajo).

La invención también se refiere a las modificaciones de origen natural o las introducidas artificialmente del carboxiterminal y amino-terminal libre de dichas proteínas, así como a modificaciones de origen natural o introducidas artificialmente de cadenas laterales de aminoácidos intramoleculares, tal como por ejemplo, glicosilación, acetilación, miristoilación u otros.

En el presente contexto, los términos como "isoforma de la proteína", "composición de aminoácidos", "motivos estructurales", "conservados", "bolsillos de unión" y otros términos relacionados con la estructura y la función de aminoácidos y proteínas, se usan de acuerdo con las normas científicas bien aceptadas bien conocidas para el experto en el arte.

Compuesto

Un compuesto puede contener cualquier cantidad biológicamente activa de cualquier combinación de posibles isoformas de la proteína M^t , de cualquier metalación y estado rédox como se describió anteriormente, o composiciones puras de las mismas.

Esto significa que los compuestos que comprenden las isoformas de la proteína MT producidas según esta invención se pueden formular como compuestos específicos de la isoforma de la proteína, que contienen solo una isoforma de la proteína MT dada, o como mezclas de dichas isoformas de la proteína de la MT, que contienen cualquier combinación posible de isoformas de proteína MT producidas según la invención.

También significa que los compuestos que comprenden las isoformas de la proteína MT producidas según esta invención, pueden contener isoformas de la proteína MT de un solo estado de metalación específico, con una sola especie de ion metálico unida a un solo equivalente molar específico, o pueden contener mezclas de dichas proteínas m T, con más de una especie de ion metálico unidas al mismo o más de un equivalente molar específico. Por lo tanto, también es un ejemplo posible de la invención, que los compuestos pueden contener dichas proteínas MT de un solo estado rédox específico, o pueden contener mezclas de dichas proteínas MT con diversos estados rédox específicos.

Adicionalmente, un compuesto que comprende las isoformas de la proteína MT producidas según la invención puede contener dichas isoformas de la proteína MT con actividad rédox hipo-metaladas como monómeros, homo o heterodímeros, u homo o heteromultímeros.

Por lo tanto, en algunos ejemplos, un compuesto específico puede contener solo una isoforma específica de la proteína MT, con solo una especie de ion metálico unida a dicha proteína, en un equivalente molar específico, permitiendo solo un estado rédox específico de dicha proteína. Sin embargo, como se describió anteriormente, también son posibles combinaciones específicas de isoformas de la proteína MT de diversos estados de metalación y rédox.

Composición farmacéutica

Se pueden proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos definidos anteriormente, en los que los compuestos contienen las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas descritas anteriormente con carga de metal no deteriorada, estado rédox y actividad biológica, y son capaces de equilibrar el potencial rédox intracelular, de eliminar las especies de radicales libres que causan estrés oxidativo, y de equilibrar los niveles de iones metálicos libres en respuesta al potencial rédox. De este modo, las isoformas de la proteína MT producidas según la invención se pueden usar para proporcionar composiciones farmacéuticas basadas en las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas descritas, en las que las composiciones, tras la administración a un sujeto, son beneficiosas para el tratamiento de las afecciones del sujeto que se originan y se manifiestan en un estrés oxidativo elevado, un desbalance intracelular de potencial rédox y un desbalance dependiente de rédox de los niveles de iones metálicos libres.

Una composición farmacéutica, que en el presente contexto se puede llamar sinónimo "medicamento", comprende una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos descritos anteriormente, en su versión pura o en combinación con aditivos farmacéuticamente aceptables, como un vehículo, diluyente, o portador. En un ejemplo, el medicamento se puede formular para administración oral. Sin embargo, en ejemplos adicionales, el medicamento también se puede formular por vía intravenosa, percutánea u otras vías de administración. La formulación del medicamento para cualquier ruta de administración dada también puede predeterminar la elección de los aditivos farmacéuticos que se añaden al medicamento, así como la cantidad y concentración del ingrediente farmacéuticamente activo. Se establecen estrategias de formulación para composiciones farmacéuticas basadas en proteínas, ampliamente descritas en la literatura científica y bien conocidas para los expertos en el arte (Banga A. K., Therapeutic Peptides and Protein Formulation: Processing and Delivery Systems, Technomic Publishing AG, Basel 1995, y referencias en este documento).

De este modo, las composiciones farmacéuticas que comprenden las isoformas de la proteína MT producidas según el método de la presente invención se pueden formular para administración oral, con la adición de excipientes estándar como manitol, lactosa o almidón, celulosa y otros aditivos compatibles, que pueden no perjudicar la metalación y el estado rédox de los ingredientes activos. Tales formulaciones orales pueden tomar la forma de píldoras, comprimidos, formulaciones de liberación sostenida, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones, y similares, y generalmente pueden contener 10-95% de los ingredientes activos descritos, por lo general 25-75%. Las sustancias auxiliares, que podrían ayudar a mejorar la absorción, el transporte y/o la efectividad de dicha composición farmacéutica, se pueden añadir en concentraciones menores.

En otro ejemplo, las composiciones se pueden formular para inyección o aplicación percutánea, en cuyo caso se pueden añadir excipientes apropiados como agua, solución salina, dextrosa o glicerol. Nuevamente, la formulación de las composiciones farmacéuticas para estas o cualquier otra ruta de administración elegida no puede alterar de ninguna manera la metalación y el estado rédox de los ingredientes activos. Las directrices relativas a tales estrategias de formulación, así como a todo tipo de aditivos posibles, se publican y son bien conocidas para los expertos en el arte.

Las formulaciones descritas que contienen los ingredientes activos descritos se pueden administrar de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad terapéuticamente eficaz de ingrediente activo administrado puede depender del sujeto que se va a tratar, la edad y el peso corporal de dicho sujeto, la afección que se va a tratar y la etapa de dicha afección, así como la ruta de administración. La ruta de administración, así como la duración del tratamiento y la dosis, pueden depender nuevamente de la edad y el peso corporal del sujeto que se va a tratar, así como de la afección que se va a tratar, y la etapa de la afección. En un ejemplo, los ingredientes activos descritos se pueden usar de manera preventiva y los regímenes de administración de dosis baja continua se pueden formular según la situación del sujeto.

Actividad biológica

Las proteínas MT hipo-metaladas y con actividad rédox obtenidas por el método de la presente invención, un compuesto que comprende las proteínas, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos y, por lo tanto, las proteínas, poseen actividad biológica como se describe anteriormente. La invención se refiere preferiblemente a un método para obtener proteínas MT hipo-metaladas y con actividad rédox que tienen actividad biológica tal como la capacidad para unirse y liberar iones metálicos fisiológicos en respuesta a cambios del potencial rédox intracelular, para unir y eliminar iones metálicos pesados activos en rédox, para eliminar e inactivar radicales libres tal como ROS, r Ns y otros, y ejercer así funciones antioxidantes, así como equilibrar el potencial rédox intracelular a niveles fisiológicos.

Más específicamente, dicha actividad biológica se relaciona con la capacidad de unirse y liberar iones de zinc en respuesta a los cambios del potencial rédox intracelular, tal como por ejemplo, los cambios de potencial rédox inducidos por el estrés oxidativo elevado. Tal capacidad de unión y/o liberación de iones de zinc de las proteínas MT descritas, en respuesta al potencial rédox intracelular, se puede interpretar como la capacidad de equilibrar los niveles intra y extracelulares de zinc libre.

En este contexto, el estrés oxidativo, y por lo tanto los cambios en el potencial rédox intracelular, pueden ser inducidos por radicales libres tales como especies reactivas de oxígeno, especies reactivas de nitrógeno, radicales de anión superóxido, o cualquier otro radical libre que contenga uno o más electrones no pareados.

Adicionalmente, la actividad biológica también se relaciona con la capacidad de la actividad antioxidante, en la que los radicales libres que inducen el estrés oxidativo se unen y, por lo tanto, se inactivan (como sinónimo también se describen como "eliminados"), a través de los residuos sulfhidrilo de cisteína libres de las proteínas MT descritas. En consecuencia, dicha eliminación de radicales libres también equilibrará el potencial rédox intracelular y, por lo tanto, la capacidad de equilibrar el potencial rédox intracelular se considera otro aspecto de la actividad biológica.

Adicionalmente, la actividad biológica en este documento también se relaciona con la capacidad de unión coordinativa de metales pesados tales como cadmio, plomo u otros, y eliminando así y desactiva biológicamente dichos iones de metales pesados.

Las proteínas MT hipo-metaladas y con actividad rédox obtenidas por el método de la presente invención también pueden poseer otra actividad biológica tal como la capacidad de unión y/o liberación de iones metálicos fisiológicos distintos de los iones de zinc descritos anteriormente, tal como por ejemplo iones de cobre o hierro.

Las proteínas MT hipo-metaladas y con actividad rédox obtenidas por el método de la presente invención también pueden poseer actividades biológicas tales como la capacidad de regenerar otros antioxidantes intracelulares tales como glutatión, NADH u otros, mediante acoplamiento rédox, en el que las formas oxidadas de los antioxidantes se reducen de forma química por los grupos sulfhidrilo de cisteína con actividad rédox de las proteínas MT descritas. Esto se podría interpretar nuevamente como la capacidad de equilibrar el potencial rédox intracelular, como ya se describió anteriormente.

Las proteínas MT hipo-metaladas y con actividad rédox obtenidas por el método de la presente invención también pueden poseer como actividad biológica la capacidad de unir e inactivar directamente productos de dopamina oxidados, o cualquier otro producto oxidado por radicales libres que inducen el estrés oxidativo descrito anteriormente. Esto incluye la regeneración de la versión no oxidada de dicho componente celular, a través de los grupos sulfhidrilo de cisteína con actividad rédox de proteínas MT descritas.

El término "actividad rédox" se refiere a la capacidad de participar en reacciones bioquímicas de reducción-oxidación (comúnmente denominadas "reacciones rédox"), en las que los agentes reductores se oxidan de forma química mediante la donación de electrones, y los agentes oxidantes se reducen de forma química al aceptar electrones. Las proteínas MT descritas tienen actividad rédox ya que pueden participar en tales reacciones rédox tanto como agentes reductores, donando electrones de sus grupos sulfhidrilo de cisteína libres y reducidos, así como también la unión dependiente de rédox o la liberación de iones de zinc.

Un objetivo clave de la presente invención es combinar todas las actividades biológicas descritas anteriormente de la unión y el equilibrio de los iones metálicos, la actividad antioxidante y de eliminación, así como la actividad rédox y la capacidad de equilibrar el potencial rédox, en una y la misma proteína, las proteínas MT con actividad rédox hipometaladas descritas obtenidas por el método de la presente invención.

En ejemplos adicionales, las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas obtenidas por el método de la presente invención pueden además tener actividades biológicas, que podrían verse como "aguas abajo" mecánicamente o "secundarias" a las actividades descritas anteriormente. Tales actividades biológicas indirectas incluyen, por ejemplo, la capacidad de inhibición y/o supresión de la inflamación, la capacidad de inhibir y/o suprimir las reacciones autoinmunes, o la capacidad de regular la actividad de los genes. Tales actividades biológicas se podrían denominar "secundarias" o indirectas, ya que se refieren, desde un punto de vista mecánico, a las funciones "primarias" descritas anteriormente de las proteínas MT, tal como el equilibrio de los niveles de ion metálico libre, la actividad antioxidante y de eliminación, la actividad rédox o capacidad de equilibrio del potencial rédox.

Las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas obtenidas por el método de la presente invención pueden además tener actividades biológicas, tales como la capacidad de inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis en células malignas como diversas células cancerosas, o la capacidad de inhibir propiedades metastásicas, tales como la capacidad de migración e invasión, de tales células cancerosas. Tales actividades biológicas también incluyen la capacidad de estimular y promover la regeneración de las células nerviosas, como se describe ampliamente en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,618,060 y referencias citadas en la misma. Se ha demostrado científicamente que los mecanismos moleculares son directa o indirectamente atribuibles a las actividades biológicas descritas anteriormente de las proteínas MT.

Las actividades biológicas descritas anteriormente de las proteínas MT se pueden ejercer en cualquier compartimento fisiológico del cuerpo humano, donde tales actividades son beneficiosas para tratar o prevenir las afecciones descritas. Se puede aplicar cualquier formulación de las proteínas MT descritas en composiciones farmacéuticas descritas, así como cualquier ruta de administración de las proteínas a los compartimentos corporales, que permita una conservación completa de las actividades biológicas descritas anteriormente.

Tratamiento

El término "tratamiento" usado en este documento se refiere tanto al tratamiento preventivo como al curativo de sujetos con proteínas MT obtenidas por el método de la presente invención, compuestos o composiciones farmacéuticas que comprenden la misma, siempre que se describan actividades biológicas directas o indirectas descritas anteriormente de las proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas, tal como el equilibrio de los niveles de iones metálicos libres intra y extracelulares, la actividad antioxidante, la actividad de eliminación, la actividad rédox, la capacidad de equilibrio del potencial rédox y otras, son beneficiosas para el tratamiento.

Tal tratamiento se refiere a cualquier formulación aplicable del medicamento descrito, a cualquier ruta de administración aplicable del medicamento, así como a cualquier régimen de tratamiento aplicable con el medicamento, dependiendo del sujeto y la afección que se va a tratar. El término "aplicable" se refiere a funciones biológicas no deterioradas, como se definió anteriormente, de las proteínas obtenidas por el método de la presente invención, compuestos y composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas.

Bien conocido para los expertos en el arte, un amplio conjunto de datos experimentales y clínicos demuestra una relación directa entre el estrés oxidativo elevado (así como el potencial rédox intracelular desbalanceado) y una serie de afecciones clínicas tales como diversos cánceres, enfermedades metabólicas o enfermedades neurodegenerativas, siendo el estrés oxidativo causa subyacente y/o efecto primario inmediato o síntoma de dichas afecciones. Por lo tanto, las proteínas obtenidas por el método de la presente invención, los compuestos y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se pueden usar para el tratamiento curativo y preventivo de cualquier afección clínica que pueda vincularse con un estrés oxidativo elevado y un potencial rédox intracelular desbalanceado.

Específicamente, el medicamento se puede usar para el tratamiento de afecciones tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiloide (ALS), la enfermedad de Wilson, la demencia y otras enfermedades neurodegenerativas relacionadas.

El medicamento también se puede usar para el tratamiento de afecciones tales como hiperlipidemia, obesidad, diabetes mellitus tipo 1 y 2, síndrome del hígado graso y otros trastornos metabólicos relacionados.

Adicionalmente, el medicamento se puede usar para el tratamiento de afecciones tales como carcinoma hepatocelular, cáncer papilar de tiroides, cáncer de colon y afecciones relacionadas con el cáncer.

En el contexto de cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente, el medicamento se puede usar para el tratamiento curativo o preventivo de la afección respectiva, el tratamiento curativo o preventivo inclusivo de las causas subyacentes de dichas afecciones, así como para el tratamiento curativo o preventivo con respecto a los efectos, manifestaciones y síntomas de dichas afecciones, mediante la administración de una proteína, compuesto o composición farmacéutica como se define en este documento.

Como se usa en la descripción de este documento y en todas las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "una" y "el" incluye una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, los títulos o subtítulos se pueden usar en la especificación para la comodidad de un lector, que no tendrá influencia en el alcance de la presente invención.

El significado de los términos técnicos y científicos tal como se describen en este documento puede ser claramente entendido por un experto en el arte.

La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que pretenden ser ilustrativos solamente ya que numerosas modificaciones y variaciones en los mismos serán evidentes para los expertos en el arte. Varias realizaciones de la invención se describen ahora en detalle. Refiriéndose a los dibujos, los números similares indican componentes similares en todas las vistas.

Ejemplos

1. Producción de proteínas MT con actividad rédox hipo-metaladas.

Se produjeron proteínas MT usando the "K. lactis Protein Expression System" (New England Biolabs Inc., MA, USA). Los ADNc respectivos para MT1a humana (SEQ ID NO: 1) y MT2a bovina (S^eQ ID NO: 3) se clonaron en pKLAC2, y las células de K. lactis se transfectaron, según los protocolos de los fabricantes. De los sobrenadantes, las respectivas isoformas de la proteína MT se purificaron previamente mediante centrifugación y diálisis durante toda la noche contra la solución reguladora estándar de Tris-HCl a pH 7. La desmetalación se logró mediante acidificación a pH 3.5 con ácido fórmico, seguido de diálisis contra ácido fórmico. Después de la reducción química de todos los residuos de azufre de cisteína con DTT 25 mM, se retiraron partes alícuotas de apo-proteínas reducidas sin metal ("apo-MT1a" y "apo-MT2a") para su uso posterior como muestras de control. Como ejemplos representativos de una realización preferida de la invención, las fracciones de proteínas principales se metalizaron parcialmente con 4 equivalentes molares de iones de zinc ("hipo-MT1a" e "hipo-MT2a"), añadiendo cantidades respectivas de cloruro de zinc, con base en la cuantificación de proteínas de Bradford. Después de la diálisis durante toda la noche contra Tris-HCl pH 6.5, las muestras se sometieron a análisis. Se generaron muestras de control adicionales de proteínas totalmente metaladas ("7Zn-MT1a" y "7Zn-MT2a") mediante la adición de 7 (en lugar de 4) equivalentes molares de cloruro de zinc en la etapa de reconstitución anterior.

2. Las hipo-MT se unen a cantidades definidas de iones metálicos.

El contenido de iones metálicos de todas las muestras y controles se determinó como se publicó (Ma, R.L., et al., 2004, Speciation of protein-bound trace elements by gel electrophoresis and atomic spectrometry. Electrophoresis 25(15): 2469-77). En resumen, se secaron alícuotas equimolares de muestras y controles, se digirieron en ácido nítrico y, después de la dilución en agua desionizada, se analizaron mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). Los resultados de cuatro experimentos independientes se muestran como equivalentes molares de Zn2+ por mol de proteína, y las desviaciones estándar se incluyen en los gráficos.

Como se muestra en la figura 1, en relación con las apo-proteínas libres de metal ("apo-MT1a" y "apo-MT2a") y los controles completamente metalados (que se unen a 7 equivalentes molares de Zn2+) ("7Zn-MT1a" y "7Zn-MT2a"), ambas muestras hipoMT (" hipo-MT1a "e" hipo-MT2a ") se unen a cantidades específicas de iones metálicos como se definen por el procedimiento de reconstitución (4 equivalentes molares de Zn2+).

3. Los hipo-MT contienen grupos de sulfhidrilo de cisteína libres reducidos

Para investigar si los residuos de azufre de cisteína libres en hipo-MT, como se producen según la invención, están presentes en forma oxidada o reducida de forma química, las propiedades de unión y liberación de zinc de dichas proteínas se analizaron usando el agente quelante de zinc cromóforo Zincon (sal monosódica zincon, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. En resumen, se preincubaron cantidades equimolares de proteínas MT así como controles con 3 equivalentes molares de cloruro de zinc en solución reguladora estándar Hepes a pH 7.4, y luego se mezclaron con exceso de reactivo de Zincon (Zincon 100 |iM por 1 |iM de proteína MT). La señal de fluorescencia se detectó a 620 nm con un espectrofotómetro Beckman Coulter DU800. Se muestran los resultados de cinco experimentos independientes, las desviaciones estándar se incluyen en los gráficos. Como controles de "oxidación", las partes alícuotas de las apo-proteínas se oxidaron de forma química en sus residuos de azufre de cisteína mediante preincubación con H²O² 500 |iM antes de usar en este ensayo ("OxApo-MT1a" y "OxApo-MT2a"). Se incluyó una muestra de blanco con todas las soluciones reguladoras y reactivos, incluido el cloruro de zinc, pero sin ninguna proteína MT, para la normalización.

Como se muestra en la figura 2, los residuos de azufre de cisteína oxidados como en los controles de "oxidación" ("OxApo-MT1a" y "OxApo-MT2a"), ya no se pueden unir de manera coordinada a los iones de zinc (indicados por los mismos niveles de zinc libre que en el control de blanco). En contraste, ambas isoformas hipo-MT ("hipo-MT1a" e "hipo-MT2a") son capaces de unirse a tres equivalentes molares de iones de zinc (y así reducir los niveles de zinc libre), lo que indica que sus azufres de cisteína libres son reducidos de forma química (véase también la figura 3B).

4. Los Hipo-MT se pueden unir o liberarse de forma dependiente de rédox.

El ensayo de Zincon cromóforo mencionado anteriormente también se usó para determinar la capacidad de las proteínas hipo-MT, según la invención, para unirse o liberar iones de zinc en respuesta a cambios en el potencial rédox. Para medir la liberación potencial de zinc en condiciones oxidativas, se mezclaron cantidades equimolares de proteínas hipo-MT así como controles con un exceso de reactivo Zincon (Zincon 100 |iM por 1 |iM de proteína MT), en solución reguladora Hepes a pH 7.4. Después de la adición de 250 amolar de H² O² , se detectó fluorescencia a 620 nm. Para medir la unión potencial de zinc en condiciones reductoras, se mezclaron cantidades equimolares de proteínas hipo-MT con DTT 750 ^molares y, posteriormente, con tres equivalentes molares de cloruro de zinc, en solución reguladora Hepes a pH 7.4. Después de la adición del exceso de reactivo de Zincon (Zincon 100 |iM por 1 |iM de proteína MT), en solución reguladora Hepes a pH 7.4, se detectó fluorescencia a 620 nm. Para ambos ensayos, se muestran los resultados de seis experimentos independientes, desviación estándar inclusiva. Se incluyeron muestras de blanco con todos las soluciones reguladoras y reactivos (incluidos 4 equivalentes molares de cloruro de zinc para el ensayo de oxidación y 3 equivalentes molares de cloruro de zinc para el ensayo de reducción), pero sin ninguna proteína MT, para la normalización. Los controles "neutros" del ensayo de reducción se trataron de manera idéntica, pero sin la adición de DTT ("neutra-MT1a" y "neutra-MT2a").

Como se muestra en la figura 3A, en contraste con las apo-proteínas ("apo-MT1a" y "apo-MT2a") como controles negativos, ambas proteínas hipo-MT ("hipo-MT1a" e “hipo-MT2a") son capaces de liberar iones de zinc bajo condiciones oxidativas.

Como se muestra en la figura 3B, ambas proteínas hipo-MT ("hipo-MT1a" e "hipo-MT2a") son capaces de unirse a iones de zinc en condiciones reductoras. También, en relación con los controles "neutras" ("neutra-MT1a" y "neutra-MT2a"), no se observa un aumento en la capacidad de unión de zinc al reducirse con DTT, lo que valida aún más los resultados anteriores de residuos de azufre de cisteína libres de las proteínas hipo-MT ya están en forma reducida.

5. Las hipo-MT pueden equilibrar el potencial rédox y proteger del estrés oxidativo

Para probar la capacidad de las proteínas hipo-MT, producidas según la invención, de proteger contra el estrés oxidativo y de equilibrar el potencial rédox intracelular, se analizó la integridad metabólica de las células hepáticas de ratón en condiciones de estrés oxidativo, usando el kit de proliferación celular no radioactivo de Promega (Promega, WI, EE. UU.) según los protocolos de los fabricantes.

En resumen, se llevaron hepatocitos de ratón de tipo salvaje a un cultivo primario mediante un método de perfusión de vena porta hepática estándar (Butler, M. Animal Cell Culture and Technology: The Basics. 2nd Edition, 2003, Garland Publishing Inc.), y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio Eagle estándar de Dulbecco a una densidad igual de aproximadamente 10,000 células por pocillo. Se añadieron proteínas hipo-MT a las muestras respectivas, a 10 |iM/ml, 24 horas antes del ensayo. Después de intercambiar el medio para eliminar las proteínas hipo-MT externas, se añadió H² O² durante 6 horas a 250 |iM como factor de estrés oxidativo, y se analizó la integridad

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método de producción de una proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada, que comprende las siguientes etapas:

proporcionar una proteína metalotioneína que comparte la composición de aminoácidos y los motivos estructurales conservados en todas las metalotioneínas de mamíferos de origen natural conocidas, en el que tales proteínas contienen exactamente 20 residuos de cisteína en posiciones conservadas, formando exactamente siete bolsillos de unión con actividad rédox, cada uno de los cuales permite una unión coordinada de un ion metal divalente; desmetalación de la proteína metalotioneína;

reducción de forma química de todos los 20 residuos de azufre de cisteína de la proteína metalotioneína desmetalada a la forma de sulfhidrilo (-SH) de forma química reducida; y

metalación parcial de la proteína metalotioneína desmetalada reducida proporcionando 1, 2, 3, 4, 5 o 6 iones metálicos a los 7 bolsillos de unión;

en el que la proteína metalotioneína con actividad rédox hipo-metalada como se produce tiene 20 grupos sulfhidrilo de cisteína y 7 bolsillos de unión, en la que 2 a 16 de los 20 grupos sulfhidrilo de cisteína son libres y reducidos, y en el que están ocupados 1 a 6 de los 7 bolsillos de unión por iones metálicos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína metalotioneína tiene una fórmula de aminoácidos de

[Xn1 CXCXn2CXCXn3CXCXn4CXCXn5CXn6CXn7CXn8CXn9CXCXn10CXCCXn11 ], en la que

X es cualquier L-aminoácido biogénico con la excepción de cisteína, fenilalanina, triptófano y tirosina; y n1 a n11 son números enteros de cualquier valor de 1 a 12.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además una etapa de premetalación completa de la proteína metalotioneína antes de la etapa de desmetalación de la proteína metalotioneína.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de desmetalación de la proteína metalotioneína se realiza acidificando la proteína metalotioneína a un valor de pH por debajo de pH 4.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además una etapa de purificación de la proteína metalotioneína desmetalada antes de la etapa de reducción de forma química de la proteína metalotioneína desmetalada.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la etapa de purificación de la proteína metalotioneína desmetalada se realiza mediante una diálisis, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de fase reversa, cromatografía líquida de alta presión, métodos electroforéticos, filtración en gel y fuerza magnética.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de reducción de forma química de la proteína metalotioneína desmetalada se realiza añadiendo un agente reductor.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el agente reductor es uno de glutatión, dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH), ácido nicotínico, y ditiotreitol (DTT).

9. El método de la reivindicación 1, en el que los iones metálicos se seleccionan del grupo que consiste en zinc, cobre, hierro y selenio.