JP2018538306A - 銅に関連した疾患を処置するための手段及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
銅は、酵素活性、酸素輸送、及び細胞シグナル伝達などの決定的な生物学的機能において重要な役割を果たす、真核生物及び大半の原核生物にとって必須な微量元素である。しかしながら、その高い酸化還元活性及びフリーラジカル生成を触媒するその能力のために、銅は、脂質、タンパク質、DNA、及び他の生体分子に対して有害な作用を及ぼす可能性がある。特に、ミトコンドリアは、銅毒性から生じる酸化的傷害における主要な標的であると考えられている。さらに、銅はタンパク質と干渉する可能性があり、金属タンパク質に由来する亜鉛などの他の金属を置換する可能性があり、これにより、その活性が抑制される。銅がその起こり得る毒性作用を発揮しないために、それは通常、遊離形ではなく、錯体としてのみ存在する。ヒト生体では、血漿中の銅の約95%が、肝細胞によって合成されかつ分泌されるマルチ銅フェロキシダーゼであるセルロプラスミンなどのタンパク質に結合している。1つの細胞あたり1原子より少ない遊離銅が存在していると推定されている。
本発明者らは初めて、肝細胞及び肝細胞ミトコンドリアから銅を大量に除去する意外なメタノバクチンの能力に基づいた、(1)銅除去期、続いて非処置期を含む、新規な処置処方計画、(2)(以前には処置が困難であった又は処置不可能であった)急性期ウィルソン病の新規な処置、及び(3)不安定なメタノバクチンの優れた能力を保持しているが(したがって、上記に示された処置処方計画及び医学的適応症に従って使用するのに適している)、体温において向上した安定性という利点を与える安定化形メタノバクチン、を示唆する。
R1−(X)2〜5−R2(I)
(式中、
R1及びR2は各々、Nを含みかつエネチオレートに結合している5員ヘテロ環であり;
各Xは、独立して任意のアミノ酸から選択される)
を含み得るかまたはからなり得る。
ウィルソン病(WD)は、常染色体劣性遺伝性銅過負荷障害であるが、これは未処置のまま放置した場合には致命的である依然として治癒不可能な疾患である。全体的な治療アプローチは、医学療法又は肝移植のいずれかによる、正常な銅恒常性の回復及び維持である。銅キレート剤(例えば、D−ペニシラミン、トリエンチン、及びテトラチオモリブデート)及び/又は亜鉛塩は現在、WD処置の標準基準を示す。選択された具体的なアプローチに関わらず、処置は、患者の生涯にわたって継続しなければならない。なぜなら、銅の異常な蓄積は、銅含量の少ない食事によって制御することができないからである。重要なことには、医学療法の不履行又は中止は、難治性の肝臓悪化又は神経学的悪化のリスクを伴う。
ウィルソン病(WD)は、銅を輸送するATPアーゼであるATP7Bにおける突然変異を伴う遺伝性障害であり、その結果、障害され機能的ではないか、又は障害されたATP7Bタンパク質活性がもたらされる。ATP7Bにおける500個を超える突然変異が同定され、その大半が少量の突然変異である。
したがって、第一の態様では、本発明は、被験者におけるウィルソン病の処置法に使用するための銅結合性メタノバクチンを提供し、該処置は、(a)メタノバクチンの投与という第一期、続いて(b)非処置の第二期(第二期は第一期より長い)という処置サイクルを少なくとも1回含む。「非処置」は、メタノバクチンが全く投与されない期間を指す。場合により及び有利には、「非処置」は、他のWD治療薬(特に銅キレート剤)が全く投与されないことを含み得る。驚くべきことには、本明細書に記載のメタノバクチンは、長期の作用を有する、大量の銅の除去の(周期的)処置期を可能とする、極めて効果的かつ十分な耐容性を示す銅除去剤であることが判明した。すなわち、本発明者らは、(当技術分野において公知である銅キレート剤の場合のような)定常的な投与は、WD処置のためにメタノバクチンを使用する場合には必ずしも必要とされず、患者はむしろ、過剰な銅を除去するためにメタノバクチンによる(周期的)処置期、続いて好ましくはWD治療薬の投与を全く必要としない期間を受けることができることを発見した。これは、一生続く高用量での定常的な投与をしばしば必要とする現在公知であるWD治療薬を上回る意義ある利点である。それ故、本発明による処置処方計画は、WD患者の生活の質を顕著に向上させ、それにより、患者のコンプライアンス及び全体的な治療の成功を向上させることが期待される。
以前に説明されているように、本発明は、WD患者における(場合により反復)銅除去を可能とする、新規かつ効果的な処置処方計画を提供する。本発明の根底にある別の驚くべき洞察は、メタノバクチンが、今日までに肝移植が実施されなければ必ず致命的であった容態である、急性肝不全(ALF)を呈している急性WDの処置に対して有効であるという事実である。
本明細書の何処かで示されているように、本発明者らは、新規な処置処方計画によるWDの処置のための、及び薬物療法では元に戻すことができないと現在まで考えられてた急性WDの処置のための、安全かつ有効な銅除去剤としてのメタノバクチンの治療能を認識した最初の人々であった。本明細書において使用する「メタノバクチン」又は「mb」という用語は一般的に、細菌、特にメタノトローフ細菌に由来する銅結合性(及びCu(II)還元性)ペプチドを指す。特記しない限り、「銅」は本明細書においてCu(I)及びCu(II)の両方を指すために使用される。天然メタノバクチンは、細胞外培地に分泌されると考えられ、そこで、それらはCu(II)又はCu(I)に結合し銅を細胞内へとシャトルすることによってカルコフォアとして機能する。
R1−(X)2〜5−R2(I)
(式中、
R1及びR2は各々、Nを含みかつエネチオレートに結合している5員ヘテロ環であり;
各Xは、独立して任意のアミノ酸から選択される)
を含み得るか又はからなり得る。
R1GSCYR2SCM(II)
(式中、
R1は、(N−2−イソプロピルエステル−(4−チオニル−5−ヒドロキシ−イミダゾール)及びN−2−イソプロピルエステル−(4−チオカルボニル−5−ヒドロキシ−イミダゾレート)から選択され、R2はピロリジン−(4−ヒドロキシ−5−チオニル−イミダゾール)及びピロリジン−(4−ヒドロキシ−5−チオカルボニル−イミダゾレートから選択される)
を含むか又はからなると考えられる。該mb−OB3bは特に、式(IV):
を含み得るか又はからなり得る。
(式中、
Yは銅(Cu(I)又はCu(II))又は亜鉛(Zn(I)又はZn(II))から選択される)
を有すると予想される。
R1ASR2AA(III)
(式中、
R1は、4−グアニジノブタノイル−イミダゾールであり、R2は1−アミノ−2−ヒドロキシ−オキサゾロンである)
であると予想される。
であり得る。
(式中、
Yは、銅(Cu(I)又はCu(II))又は亜鉛(Zn(I)又はZn(II))から選択される)
を有すると予想される。
以前に説明されているように、本発明によるメタノバクチンは、本明細書に記載のような望ましい生物学的効果を誘発すると予想され、すなわち、それらは好ましくは高い結合親和性で銅に結合することができ、系からの銅の除去及び好ましくは胆汁を介したその排出を奏功することができる。特定の理論に固定したくはないが、本発明者らは、増加した銅負荷量に因るミトコンドリア障害が、WDモデルであるLPP−/−ラット由来の肝臓における疾患状態と共に次第に増加することを確立した。添付の実施例に示されているように、メタノバクチンは、ミトコンドリア内及び肝細胞内の銅を急速に除去することができる。本明細書に記載のようなメタノバクチンは好ましくは、同じ有益な特徴を示すと予想される。
メタノバクチンのそれを必要とする被験者(特にWD患者)への投与は、治療効果を誘発することが期待される。本明細書において使用する「治療効果」という用語は一般的に、処置の望ましい影響又は有益な影響、例えば、疾患徴候の寛解又は緩解を指す。疾患の「徴候」という用語は本明細書においてその知覚できる表出を説明するために使用され、これは、理化学的検査中に検出され得る及び/又は患者によって知覚され得る疾患のしるし(すなわち症状)として本明細書で以後に定義される臨床徴候、並びに、細胞レベル及び分子レベルで疾患の表出を意味する病理学的徴候の両方を含む。WD徴候の寛解又は緩解は、WDの診断について記載されているのと同じ試験を使用することによって評価され得る。さらに又は代替的には、それぞれの患者の一般的な外見(例えば体力、健康)を評価することも可能であり、これはまた、治療効果が誘発されたかどうかを当業者が評価することを助けるだろう。当業者は、本発明の化合物の治療効果を観察するのに適した数多くの他の方法を知っているだろう。
さらなる態様では、本発明者らは、安定化形のメタノバクチンを提供する方法を発見した。
前記に示されているように、メタノバクチン、特に安定化形のメタノバクチンを含む医薬組成物も本明細書において考えられる。特に、該医薬組成物は、ウィルソン病の処置の使用のために考えられ、該処置は(i)全肝内の銅レベル、(ii)全肝細胞内の銅レベル、及び/又は(iii)肝細胞ミトコンドリア内の銅レベルを減少させる。すなわち、医薬組成物は好ましくは、Zn(I)又はZn(II)と錯体を形成しているメタノバクチンを含み、並びに/あるいはpH≧9で提供される。該組成物は37℃で少なくとも20、50、75、100、125、150時間又はそれ以上安定であり得る。したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のような(特に、安定化された)メタノバクチンを含む医薬組成物、及び医薬組成物の製造のための該(安定化)メタノバクチンの使用を含む。「医薬組成物」という用語は特に、ヒトへの投与に適した組成物を指す。しかしながら、非ヒト動物への投与に適した組成物も本明細書において考えられる。
医薬組成物はまた、関心のある特定の疾患の処置に有効であるさらなる活性物質を含み得る。例えば、WDの処置に現在使用されている活性物質としては、銅キレート剤であるd−ペニシラミン(D−PA)、トリエンチン(TETA)及びテトラチオモリブデート(TTM)並びに亜鉛塩が挙げられる。がんの処置のために有用な追加の活性物質としては、公知の化学療法剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤;細胞傷害性抗生物質、及びモノクローナル抗体が挙げられる。神経変性障害の処置のための活性物質としては、レボドパ及びその誘導体、ドーパミンアゴニスト、MAO−B阻害剤、カテコール−O−メチルトランスフェラーゼ(COMT)阻害剤、抗コリン作動剤、アマンタジン、コリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン、及びリルゾールが挙げられるがこれらに限定されない。特定の疾患の処置のために適切な追加の薬剤を選択することは、当業者の知識範囲内である。
本発明の医薬組成物は、様々な剤形で、例えば固形剤形、液体剤形、気体剤形、若しくは凍結乾燥剤形で製剤化され得、とりわけ、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ、ゲル剤、散剤、錠剤、溶液剤、エアゾール、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳化剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、若しくは流エキス剤の剤形で、又は所望の投与法に特に適した剤形であり得る。医薬品を生産するためのそれ自体公知のプロセスは、Forth, Henschler, Rummel (1996) Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Urban & Fischerに示されている。
様々な経路が、本発明によるメタノバクチン及び医薬組成物の投与に考えられ得る。典型的には、投与は、非経口的に成し遂げられるが、経口投与も考えられる。非経口送達法としては、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下、又は鼻腔内の投与が挙げられる。
本明細書に開示されたメタノバクチン及び医薬組成物はまた、様々ながんの処置にも考えられる。多くのがん種は、増加した腫瘍内の銅及び/又は変化した銅の全身分布を示す。銅は、増殖、血管新生、及び転移をはじめとする腫瘍進行の多くの局面における限定要因としての役目を果たすと認識されている。したがって、本明細書に記載のメタノバクチン及び医薬組成物は、これらの過程を阻害する有望なツールである。
タンパク質凝集は、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、例えばクロイツフェルトヤコブ病(CJD)、致死性家族性不眠症(FFI)、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、家族性筋萎縮性側索硬化症(fALS)及び多くのその他をはじめとする、様々な神経変性障害の注目すべき特色である。ますます増えつつある研究が、遷移金属は、病的沈着物に見られるいくつかのタンパク質の凝集プロセスを加速することができ、特に銅は最も顕著な凝集の加速を引き起こすことを示唆する。したがって、それ故、メタノバクチンによる処置による銅の除去は、タンパク質の凝集を減少させ、これにより、該疾患の兆候及び症状を寛解又はさらには元に戻すと考えられる。
さらに、銅調節異常は、損なわれた抗酸化防御機序及び酸化的ストレスに起因する、糖尿病における臓器傷害の原因機序として示唆されている。顕著には、TETAによる処置は、糖尿病患者におけるエネルギー代謝に役割を有するミトコンドリアタンパク質に対して作用することが示され、その結果、心臓の構造及び機能の回復がなされた(Jullig et al., Proteomics Clin Appl. 2007 Apr;1(4):387-99)。本出願の実施例3に実証されているように、メタノバクチンは驚くべきことに、蓄積されたミトコンドリア内の銅を効率的に除去することができ、それ故、特にミトコンドリアから過剰な銅レベルを除去し、これにより全体的な酸化的ストレス及び組織傷害を減少させることに基づいた、新規な糖尿病療法のための有望な薬剤でもある。以前の研究に一致して、メタノバクチンは特に、糖尿病性心筋症並びに動脈及び/又は腎の構造/機能を改善し、糖尿病患者における左心室(LV)肥大を寛解すると考えられる(Zhang et al. Cardiovasc Diabetol. 2014 Jun 14;13:100参照)。
本明細書に記載のメタノバクチン及び医薬組成物を用いての処置に好適なさらなる疾患及び障害としては、細菌感染症、炎症疾患、線維症、肝硬変、鉛及び/又は水銀中毒が挙げられる。
全てのその文法形における「処置」という用語は、本明細書に記載の疾患、特にWDの治療的又は予防的処置を含む。「治療的又は予防的処置」は、臨床的及び/又は病理学的徴候の完全な予防を目的とした予防的処置、あるいは、臨床的及び/又は病理学的徴候の寛解又は緩解を目的とした治療的処置を含む。したがって、「処置」という用語はまた、本明細書に記載の疾患、具体的にはWDの寛解又は予防を含む。
メタノバクチンの正確な用量は、処置の目的に依存し得(例えば急性WDの予防療法又は維持療法、対、処置)、公知の技術を使用して当業者によって確認可能であるだろう。投与経路、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時刻、薬物相互作用、及び容態の重症度の調整が必要であり得、当業者による日常的な実験を用いて確認可能であろう。一般的に、1mg/kg(体重)(bw)の用量が、本明細書の何処かで記載されているような所望の治療効果を誘発することができる可能性がある。本発明の使用及び方法に適用可能な例示的な用量は、1mg/kg(bw)〜1000mg/kg(bw)、例えば1mg/kg(bw)〜100kg/mg(bw)、特に1mg/kg(bw)〜50mg/kg(bw)、例えば1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、又は50mg/kg(bw)の用量を含む。
また、本明細書に記載のメタノバクチン、特に安定化形のメタノバクチン、及び医薬組成物は、キットの一部として提供され得ることが考えられる。したがって、さらなる態様では、本発明はまた、ウィルソン病の処置に使用するための、メタノバクチン、具体的にはこのような安定化形のメタノバクチン又はそれを含む医薬組成物を含むキットに関し、該処置は、(i)全肝内の銅レベル、(ii)全肝細胞内の銅レベル、及び/又は(iii)肝細胞ミトコンドリア内の銅レベルを減少させる。
材料及び方法
患者から得られた試料
ハイデルベルク大学病院でウィルソン病のために移植を受けた肝不全を有する4人のWD患者の肝臓を、この治験に含めた。2名の患者(1番及び2番)は、以前に銅キレーション療法を全く受けておらず、一方、2名の患者(3番及び4番)は、D−PA処置後に肝不全を呈した。患者はインフォームドコンセントに同意し、治験は、ドイツのハイデルベルグ医科大学の倫理委員会によって承認された。外植時にWD患者の肝臓を、液体窒素中で衝撃凍結させ、−80℃で保存した。融解した試料を、組織学的分析及び電子顕微鏡による分析のために直ちに固定した。
LPPラット株は、Jimo Borjigin(ミシガン大学、アナーバー、米国)(ahmed et al.、同上)によって提供された。ラットを、自由接取のAltromin 1314食餌(Altromin Spezialfutter GmbH、ドイツ)及び水道水で維持した。食餌の銅含量は13mg/kgであった。全ての動物は、ヘルムホルツセンターミュンヘンの実験動物の管理と使用に関するガイドラインの下で処置された。LPP−/−ラットはATP7b突然変異を備え、したがってATP7b−/−である。ヘテロ接合型LPP+/−ラットは、この治験における対照としての役目を果たした。
動物実験は、オーバーバイエルン行政府(ミュンヘン、ドイツ)の政府機関によって承認された。
LPPラットを、150mg/kg(bw)の用量で1日1回連続して3若しくは5日間の腹腔内注射、又は1日2回連続して8日間の腹腔内注射のいずれかによりMBを用いて、あるいはそれぞれ100mg/kg(bw)/日の用量のD−PA若しくは480mg/kg(bw)/日の用量のTETAを用いて飲料水を介して4日間処置した(Togashi et al., Hepatology 15, 82-87 (1992))。処置開始年齢時のAtp7b−/−ラット肝における250μg/gの重量比の銅含量平均値に基づいて(Zischka et al.、同上)、8gの重量比のLPP−/−ラット肝は、約31.5μmolの銅を含有している。1回量のMBは、この銅の量に対して等モルになるように選択された。D−PAの場合、投与された用量及び選択された適用経路が、LECラットにおいて長期の適用で肝炎の発症を成功裡に予防したと報告されている(Togashi et al.、同上)。ラットにおける亜慢性毒性試験より、飲料水を介した3000ppmの用量におけるTETAの毒性は全くないことが明らかとなった(Greenman et al., Fundam Appl Toxicol 29, 185-193 (1996))。250gの体重のラットにおける1日あたりの水分摂取量を40mlと仮定すると、これは480mg/kg(bw)/日の用量に換算される。85日齢のLPP−/−ラットにおける肝内銅含量平均値に関して、適用されたキレート剤のモル比は、それぞれ、MB 1:D−PA 4.3:TETA 17.4であった。MBの静脈内適用(150mg/kg(bw))のために、PinPort(商標)(インステック・ラボラトリーズ社、米国)に接続されたカテーテルを、ラットの大腿静脈に挿入し、非吸収性縫合糸で固定し、皮下トンネルを作り、肩間に作られた皮膚切開部を通して外に出した。
LPP−/−肝(動物の年齢は79〜83日齢)を、5mMのブドウ糖を含有しているクレブス−リンガー重炭酸塩溶液を1回通過させて灌流した(Beuers et al., J Biol Chem 278, 17810-17818 (2003))。媒体に95%O2/5%CO2を通気し、37℃で保持した。ラット肝を門脈を介して灌流し(Beuers et al.、同上)、右側面肝葉を結索し、その銅含量は灌流前対照としての役目を果たした(Beuers et al., Hepatology 33, 1206-1216 (2001))。胆管へのカニューレ挿入後、20分間の胆汁の試料を回収し、その後、銅キレート剤を灌流媒体に連続的に加えた。胆汁及び流出灌流液を、本明細書の何処かで記載のように10分間間隔で回収した(Beuers et al.、同上)。D−PA*HCl(20mg/108μmol)、TETA*2HCl(20mg/91μmol)、TTM*2NH4(10mg/38μmol)及びMB(40mg/35μmol)を各々、50mlの0.9%NaClに溶解し、灌流ポンプ(灌流器、ブラウン社、メルズンゲン)を介して2時間以内に灌流媒体に連続的に加えた。適用されたキレート剤のモル比は、MB 1:D−PA 3.1:TETA 2.6:TTM 1.1であった。流出灌流液中のLDHを、記載のように10分毎に測定した(Beuers et al.、同上)。対照灌流液は、クレブス・リンガー重炭酸塩溶液のみを用いて行なわれた。
ホルマリンで固定されパラフィン包埋された肝試料を4μm厚の切片へと切り出し、標準的な分析のためにヘマトキシリン及びエオシンを用いて、又は線維化組織の分析のためにマッソントリクロームを用いてのいずれかで染色した。動物血漿又は血清中のAST活性及びビリルビン濃度をレフロトロンシステム(ロシュ社)を用いて測定した。
ミトコンドリアは、WD患者から外植された凍結させた肝臓から、又は以前に記載されているように(Zischka et al., Anal Chem 80, 5051-5058 (2008))新たに調製されたラット肝ホモジネートからのいずれかから得られた。具体的には、ミトコンドリアを、パーコール(登録商標)又はニコデンツ(登録商標)のいずれかを使用して、分画・密度勾配遠心分離によって精製した。新鮮なラット肝ミトコンドリアを、呼吸測定、キレート剤による処置、膨潤分析(MPT)、膜内外電位差(ΔΨm)、分極実験、ATP合成のために使用し、その後の電子顕微鏡による分析のためにグルタルアルデヒドを用いて固定した。保存し凍結させたミトコンドリアを、呼吸複合体IV活性及び金属分析のために使用した。
を使用してmPolで計算された(Grebowski et al., Biochim Biophys Acta 1828, 241-248 (2013))。
増加した銅を有する新たに単離され密度勾配精製されたLPP−/−ミトコンドリアを、2mM D−PA、TETA、TTM、又はMBのいずれかを用いた30分間のキレート剤による処置にかけ、続いて、ニコデンツ(登録商標)勾配により再精製することにより、溶液中の銅を、ミトコンドリアに取り込まれた銅から分離した。検証実験では、対照ラット(LPP+/−)由来のミトコンドリアを、1mM DTTと共に室温で5分間インキュベートし、その後、Cu2+をさらに20分間かけて加えた(最終濃度は200〜600μM)。次いで、銅の負荷されたミトコンドリアをニコデンツ(登録商標)勾配遠心分離によって再精製し、続いて、上記のようなキレート剤を用いて処置した。
HepG2細胞を、2%FCSを含むMEM中に保持した。本発明者らは、Zn−MBが、金属非含有メタノバクチンとは対照的に37℃で時間に対して安定であることを発見した(図9C)。それ故、20mMのMB溶液を調製し、等モル濃度のZn溶液をpH制御下で加えることによって作製されたZn−MBを、細胞培養実験に使用した。
新たに供与された中間尿から膀胱上皮細胞を、400×gで10間かけてペレット化した(Zhou et al., J Am Soc Nephrol 22, 1221-1228 (2011))。細胞を、10%のウシ胎児血清(FBS、PAA)、0.1mMの非必須アミノ酸(NEAA、シグマ社)、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、1mMのグルタマックス(ライフテクノロジーズ社)、及びSingleQuotキットCC−4127REGM(ロンザ社)の補充された、ダルベッコ改変イーグル培地/HamのF−12培養培地(DMEM/F12、ロンザ社)からなる、膀胱細胞培地(UCM)中で培養した。膀胱上皮細胞を、Amaxa Basic Nucleofectorキット(ロンザ社、VPI−1005)を使用して、エピソーム発現ベクターpCXLE−hOCT3/4−shp53−F、pCXLE−hSK、及びpCXLE−hUL(アドジーン社)のヌクレオフェクションにより初期化した。iPS細胞(iPSC)を、mTeSR細胞培養培地中のマトリゲルでコーティングされたプレート上に維持し、1U/mlのディスパーゼ(ステムセルテクノロジーズ社)を用いて小さなクラスターへと解離し、5〜7日間毎に継代培養した。WD iPSCを、以前に報告された方法(Basma et al., Gastroenterology 136, 990-999 (2009))の改変によって肝細胞様細胞(HLC)へと分化させた。5×104個のiPSCの単一の細胞を、マトリゲルで予めコーティングされた6ウェルプレート上に蒔いた。翌日、培地を、100ng/mlの組換えアクチビン−A(ペプロテック社)、100ng/mlの線維芽細胞増殖因子−2(FGF2、ペプロテック社)と50ng/mlの組換えヒトWnt3a(R&Dシステムズ社)で強化されたDMEM/F12に交換した。続いて、培地を標準的なプロトコールに従って14日目までに交換した(Basma et al.、同上)。細胞を、フローサイトメトリーによって及びqRT−PCR分析によって特徴付けることにより、肝細胞系統の典型的なマーカーを評価した。
Lou/cラットを、オボアルブミンに結合させたMB(50μg)(Squarix社、マール、ドイツ)、5nmolのCPGオリゴヌクレオチド(TibMolbiol社、ベルリン)、500μlのPBS及び500μlの不完全フロイントアジュバントの混合物を用いて皮下及び腹腔内に免疫化した。アジュバントを用いないブーストを、最初の注射から6週間後に行なった。標準的な手順を使用して融合を実施した。組織培養上清(TCS)を、固相イムノアッセイで、BSAに結合させたMB、又はBSAでコーティングされたELISAプレートに結合させた関連性のないペプチドを4μg/mlの濃度で用いて試験した。MBに結合したTCS由来の抗体(mAb)を、ラットIgGアイソタイプに対するHRPにコンジュゲートさせたmAbを用いて検出し(TIB173 IgG2a、TIB174 IgG2b、TIB170 IgG1は全てATCCから、R−2c IgG2cは自家製)、これにより、IgMクラスのmAbは避けられる。HRPを、すぐ使用できるTMB(1工程のTM Ultra TMB-ELISA、Thermo社)を用いて可視化した。MBと特異的に反応した86個のハイブリドーマを凍結させ、抗体を含有しているTCSを、さらなる分析のために使用した。
肝ホモジネート、細胞溶解液、及びミトコンドリア調製物中の銅を、65%の硝酸を用いて試料を湿式灰化した後に、ICP−OES(Ciros Vision、SPECTRO Analytical Instruments GmbH社)によって分析した(Zischka et al.、同上)。
肝組織及び肝ミトコンドリアの電子顕微鏡検査は、以前に記載のように実施された32。単離されたミトコンドリアの構造分析のために、それらは、タイプ1:「凝縮した」タイプの正常な構造のミトコンドリア(Hackenbrock, J Cell Biol 37, 345-369 (1968))、タイプ2:僅かに増加したクリステのような小さな変化を有するミトコンドリア、タイプ3:大きく増加したクリステを有するミトコンドリア、及びタイプ4:大量のマトリックスの凝縮、マトリックスの空胞形成、内境界膜の脱離、及び重度のクリステ変形を有するミトコンドリア、に分類された。メタノバクチンは、以前に記載されているようにメチロサイナス・トリコスポリウムOB3bの使用済み培地から単離された(Bandow et al., Methods Enzymol 495, 259-269 (2011))。メタノバクチンにおける内毒素は、カイネティック比色法(チャールスリバー社、エキュリ、フランス)によって検出され、平均して4.5IU/mgであった。タンパク質の定量は、ブラッドフォードアッセイ(ブラッドフォード社、Anal Biochem 72, 248-254 (1976))によって実施された。単離されたミトコンドリアにおけるチトクロムCオキシダーゼ活性は、何処かに記載されているように決定された(Kiebish et al., J Neurochem 106, 299-312 (2008))。
D−ペニシラミン*HCl(D−PA)はHeyl Pharma社(ベルリン)からの寄贈品であり、トリエンチン*2HCl(TETA)はシグマ社(タウフキルヘン、ドイツ)製であり、テトラチオモリブデート*2NH4(純度98%)(TTM)はKT. Suzuki(千葉大学、日本)からの贈呈品であった。CCCPはシグマ社製であった。DPH及びTMA−DPHはライフテクノロジーズ社から入手した。
本研究全体を通して、Nは分析された動物の数であり、nは、技術的反復測定回数である。データは、平均値及び標準偏差として提示される。スチューデントt検定のために、図3I(対応のない及び片側)に提示されたもの以外は、データに対応のない検定及び両側検定を行なった。p値が0.05未満である場合には差異は統計学的に有意であると判断された。P値の平均値:*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
ATP7Bの完全な機能消失を引き起こす突然変異により、ヒトにおいて重度のWD表現型がもたらされる(Das & Ray, Nat Clin Pract Neurol 2, 482-493 (2006))。LPP−/−ラットは、その肝内銅輸送活性を完全に消失させるAtp7b突然変異を有する(Burkhead et al. Biometals 24, 455-466 (2011))。これらの動物は、銅の負荷された肝臓から肝不全及び死滅へと急速に進行する(Zischka、同上)。急性発症型WDを有する未処置患者(肝移植を受けたことがあった)に由来する疾患を有する肝臓を、進行疾患状態を有するLPP−/−ラット由来の肝臓と比較した(図1)。さらに、移植前に非成功裡のD−PA処置を受けていたことがあったWD患者の肝臓もこの試験に含めた(図6D)。
ミトコンドリア内の銅含量は、LPP−/−ラットの肝臓における疾患状態と共に進行的に増加する(図1C、図10A)。これは、新たに単離されたミトコンドリアのレベルで直接的に実証されるように重度な膜の異常の漸増に呼応する(図2):
新たに単離されたLPP−/−ミトコンドリアから銅を除去するメタノバクチン(MB)の能力と、既存の臨床的に認可されている銅キレート剤であるD−PA、TETA、及び候補薬のTTMの能力を比較した。MBペプチドは例外的に高い銅親和性を有し、銅の少ない環境で増殖させるとメタン酸化細菌によって生成される(Kim et al., Science 305, 1612-1615 (2004))。D−PA及びTETAとは対照的に、MB及びTTMは両方共に、LPP−/−ミトコンドリアに関連する銅を急速に減少させた(図3A)。類似の結果が、銅が人工的に予め負荷された野生型ラットのミトコンドリアを用いて得られた(図7A、B)。さらに、MBは、生命維持に必要な銅依存性ミトコンドリア呼吸複合体IVの障害を評価した場合にTTMよりも有意により毒性が低いことが判明した(図3B、7C)。
細胞レベルでは、MBによる一晩の処置は、基礎的な銅を有するか(図7D)又はほんの軽度の毒性を示す銅の量が予め負荷された(図3C、7E)HepG2細胞内の銅の50%の減少を引き起こした。さらに、WD患者試料に対するMBの有効性を試験する試みで、これらの患者由来の膀胱上皮細胞を、誘導性多能性幹細胞(iPSC)へと初期化し、肝細胞様細胞(HLC、図7F〜I)へと分化させた。MBによる処置時の同等な銅の除去が、銅が予め負荷されたHepG2及びHLCの両方に見られた(図3C)。
MBの銅除去効力を、全臓器レベルでさらに検証した(図3G〜I)。2時間のLPP−/−肝臓の灌流中に、TTMと比較してMBの存在下では10倍量の銅が、銅の主な生理学的排出経路である胆汁へと放出された(Ferenci, Clinical gastroenterology and hepatology : the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 3, 726-733 (2005))(図3G、図8A、B)。D−PA及びTETAは、胆汁への検出可能な銅の放出を誘起しなかった(図3G)。しかしながら、TTMを除く全てのキレート剤が、灌流液中の銅の存在の増加を引き起こし(図3H)、これは、TTMが細胞内で銅を沈殿させる能力に関連している可能性がある(Ogra et al., Toxicology 106, 75-83 (1996))。灌流液への銅の放出は、肝疾患状態に一部には依存していた。なぜなら、肝臓傷害マーカーのLDHが、銅放出曲線に呼応していたからである(図8C)。注記すべきことには、MBのみが、2時間以内の灌流中にLPP−/−肝臓の銅含量を有意に減少させた(図3I)。
短期間のMBによる処置計画の有効性を、肝疾患発症年齢時(85〜90日齢)にLPP−/−ラットにおいて評価した。動物は、MB(腹腔内)を3若しくは5日間、又は、経口投与された臨床的に使用される銅キレート剤であるD−PA若しくはTETAを4日間受けた。
1日2回の1週間のMB注射(すなわち合計して16回の腹腔内注射、図10D)からなる「緊急救出処方計画」によって、疾患を有するLPP−/−ラットを救出するMBの能力を評価した。強く上昇したASTレベルを有する4匹のLPP−/−ラットを処置した(図10D)。全ての動物が生き延び、体重を回復し、処置処方計画の終了時には正常な血清AST及びビリルビン並びに例外的に低い銅値を提示した(図10D)。この強力な治療効果は、3番の動物の症例によって最もよく例示されている(図10D)。進行的な体重減少及び8mg/dlより高いビリルビンレベルを呈する、疾患を有するLPP−/−ラットは(図10A)、瀕死と考えられなければならない。なぜなら、このような動物は通常、数日間以内に死亡するからである。これに対し、「緊急救出処方計画」後に、3番の動物は体重が29%回復し、AST及びビリルビンレベルが正常値まで下がるという劇的な減少、大量の構造的及び機能的なミトコンドリアの回復に伴う肝内銅除去を示した(図10D、図9D〜F)。
短期間のMBによる処置の有効性により、本発明者らは毎日のキレーション療法を、より長い観察サイクルが介在する反復処置サイクルからなる処方計画に置き換えることを目的とした最初の試験を実施した(図14)。5匹のLPP−/−ラット並びに5匹の年齢及び性別の一致したLPP+/−ラット対照を含めた。1対のラットを、それぞれ実験第1、8、29、36及び85日目に屠殺した。実験1日目に、全ての動物は健康であり、屠殺されたLPP−/−ラットは、そのLPP+/−対照(対1)と比較して、著しい肝臓内及びミトコンドリア内の銅負荷及び僅かに損なわれたミトコンドリア機能(87%のATP生成能)を示した。4匹の残りのLPP−/−ラットは、1日3回5日間のMB注射(i.p.)からなる1回目の処置サイクルを受けた。全ての動物は健康であり続け、これにより実験8日目に銅負荷量の40%の減少がもたらされ(対2)、これはさらなる3週間の観察後に開始レベルまで増加して戻った(29日目、対3)。2回目の処置サイクル時に銅負荷量は再度減少したが、今回は開始値の25%まで減少し、その結果、LPP−/−ミトコンドリア内の前例のない低い銅負荷量がもたらされた(36日目、対4)。75%というこの銅除去効率は、その後のさらなる7週間の観察期間を伴い、その間も残りのLPP−/−ラットは健康であり続けた。実験85日目に、肝臓内及びミトコンドリア内の銅負荷量は、処置開始前の値まで上昇して戻り(1日目)、そのLPP+/−対照(対5)と比較して損なわれたミトコンドリア機能(65%のATP生成能)を伴った。これは、未処置LPP−/−ラットが疾患を有するようなった時の年齢の2倍に相当する。
Claims (31)
- 被験者におけるウィルソン病の処置法に使用するための銅結合性メタノバクチンであって、該処置が、(a)メタノバクチンの投与という第一期、続いて(b)非処置の第二期(第二期は第一期より長い)という処置サイクルを少なくとも1回含む、銅結合性メタノバクチン。
- 第一期が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間又はそれ以上の連続した日数持続する、請求項1の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- メタノバクチンが、1日1回、1日2回、1日3回、1日4回、隔日、又は連続的に1回量で投与される、請求項1又は2の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- 第二期が、少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間又はそれ以上の期間に持続する、請求項1〜3のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- 処置サイクルの第二期の後に、少なくとも1回のさらなる処置サイクルが続く、請求項1〜4のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- 処置法が周期的処置サイクルを含む、請求項1〜5のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- ウィルソン病が急性期ウィルソン病を含む、請求項1〜6のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- 被験者における急性期ウィルソン病の処置法に使用するための銅結合性メタノバクチン。
- 急性期ウィルソン病が急性肝不全によって特徴付けられる、請求項1〜8のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- メタノバクチンが、少なくとも1mg/kg(体重)の用量で被験者に投与される、請求項1〜9のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- メタノバクチンが、以下の一般式(I):
R1−(X)2〜5−R2(I)
(式中、
R1及びR2は各々、Nを含みかつエネチオレートに結合している5員ヘテロ環であり;
各Xは、独立して任意のアミノ酸から選択される)
を含む、請求項1〜10のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。 - メタノバクチンが10−15又はそれ以下のKdでCu(I)に結合する、請求項1〜11のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- 処置が、10−15又はそれ以下のKdでCu(I)に結合するメタノバクチンの投与を含む少なくとも1回の処置サイクル、及び10−15又はそれ以上のKdでCu(I)に結合するメタノバクチンの投与を含む少なくとも1回の処置サイクルを含む、請求項1〜12のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- メタノバクチンが細菌に由来する、請求項1〜13のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- メタノバクチンが、(a)メチロサイナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)OB3bのメタノバクチン(mb−OB3b)、(b)メチロシスティス(Methylocystis)SB2株のメタノバクチン(mb−SB2)、(c)メチロコッカス・カプスラタス(Methylococcus capsulatus)Bathのメタノバクチン(mb−Bath)、(d)メチロマイクロビウム・アルブム(Methylomicrobium album)BG8のメタノバクチン(mb−BG8)、(e)メチロシスティスM株のメタノバクチン、(f)メチロシスティス・ヒルスタ(Methylocystis hirsuta)CSC1のメタノバクチン、(g)メチロシスティス・ロセア(Methylocystis rosea)のメタノバクチン(mb−ロセア)、(h)メチロサイナス属LW3株のメタノバクチン(mb−LW3)、(i)メチロサイナス属LW4株のメタノバクチン(mb−LW4)、(j)メチロシスティス属LW5株のメタノバクチン(mb−LW5)、(k)メチロサイナス属PW1株のメタノバクチン(mb−PW1)、(l)メチロシスティス・パルバス(Methylocystis parvus)OBBPのメタノバクチン(mb−OBBP)、(m)カプリアビダス・バシレンシス(Cupriavidus basiliensis)B−8のメタノバクチン(mb−B−8)、(n)シュードモナス・エクストリームアウストラリス(Pseudomonas extremaustralis)14−3のメタノバクチン(mb−14−3)、(o)アゾスピリルム(Azospirillum)属B510株のメタノバクチン(mb−B510)、(p)チストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)KA081020−065(mb−モビリス)のメタノバクチン、及び(q)コマモナス・コムポスティ(Comamonas composti)DSM21721のメタノバクチン(mb−21721)から選択される、請求項1〜14のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- mb−OB3bが、式R1GSCYR2SCM(II)で示され、ここでのR1が(N−2−イソプロピルエステル−(4−チオニル−5−ヒドロキシ−イミダゾール)及びN−2−イソプロピルエステル−(4−チオカルボニル−5−ヒドロキシ−イミダゾレート)から選択され、R2がピロリジン−(4−ヒドロキシ−5−チオニル−イミダゾール)及びピロリジン−(4−ヒドロキシ−5−チオカルボニル−イミダゾレート)から選択され、mb−SB2が式R1ASR2AA(III)で示され、ここでのR1が4−グアニジノブタノイル−イミダゾールであり、R2が1−アミノ−2−ヒドロキシ−オキサゾロンである、請求項15の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- mb−OB3bが、式(IV)
を有するか、又はmb−SB2が式(V)
を有する、請求項15又は16のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。 - mb−OB3bが以下の構造(VI)
(式中、
Yは、Zn(I)、Zn(II)、Cu(I)、及びCu(II)から選択される)
を含むか又はからなるか、
あるいは、mb−SB2が以下の構造(VII)
(式中、
Yは、Zn(I)、Zn(II)、Cu(I)、及びCu(II)から選択される)
を含むか又はからなる、請求項17の使用のための銅結合性メタノバクチン。 - メタノバクチンが安定化形で提供される、請求項1〜18のいずれか一項の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- メタノバクチンが、Zn(I)及び/又はZn(II)と錯体を形成する並びに/あるいはpH≧9で提供される、請求項19の使用のための銅結合性メタノバクチン。
- 安定化されたメタノバクチンを含む医薬組成物であって、前記メタノバクチンが、Zn(I)及び/又はZn(II)と錯体を形成する並びに/あるいは前記医薬組成物がpH≧9で提供される、医薬組成物。
- 1:1の比のZn(I)及び/又はZn(II)の量とメタノバクチンの量とを水溶液中で接触させることにより調製された、Zn(I)及び/又はZn(II)と錯体を形成している安定化されたメタノバクチンを含む、請求項21の医薬組成物。
- 37℃で少なくとも20、50、75、100、125、150時間又はそれ以上におよび本質的に安定である、請求項21又は22のいずれか一項の医薬組成物。
- ウィルソン病、がん、神経変性疾患、糖尿病、細菌感染症、炎症性疾患、線維症、肝硬変、家族性筋萎縮性側索硬化症、鉛中毒及び/又は水銀中毒の処置法に使用するための、請求項21〜23のいずれか一項の医薬組成物。
- がんが、細網肉腫、気管支原性及び喉頭扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、脳癌、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及びホジキンリンパ腫を含む、請求項24の医薬組成物。
- 神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、ハンチントン病、及び家族性筋萎縮性側索硬化症(fALS)を含む、請求項24の医薬組成物。
- 細菌感染症が、ヒト真菌病原体にとって好ましい、請求項24の医薬組成物。
- 前記ヒト真菌病原体がカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)である、請求項27の医薬組成物。
- 請求項21〜28のいずれか一項の医薬組成物を含むキット。
- 処置が、以下の(i)全肝内の銅レベル、(ii)全肝細胞内の銅レベル、及び/又は(iii)肝細胞ミトコンドリア内の銅レベルの少なくとも1つを減少させる、請求項1〜29のいずれか一項記載のウィルソン病の処置に使用するための、請求項1〜20のいずれか一項のメタノバクチン、又は請求項21〜28のいずれか一項の医薬組成物、又は請求項29のキット。
- 処置により胆汁を介して銅が排出される、請求項1〜30のいずれか一項記載のウィルソン病の処置に使用するための、請求項1〜20又は30のいずれか一項のメタノバクチン、又は請求項21〜28若しくは30のいずれか一項の医薬組成物、又は請求項29又は30のキット。
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