KR101183856B1 - 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

의약품 원체로서 유용한 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (PC-SOD) 조성물 및 그 제조 방법을 제공한다.
특정 SOD 의 아미노기의 1 개 이상이 하기 일반식 (Ⅰ) 로 표시되는 레시틴 잔기로 치환된 PC-SOD 를 함유하고, 상기 아미노기의 m 개 [m 은 1～4 의 정수이고, 또한 m 의 평균치는 1.5～2.4 이다.] 가 상기 레시틴 잔기로 치환된 PC-SOD(A) 를 주성분으로 하고, 그 PC-SOD(A) 는, m=1 인 PC-SOD (a1) 와, m=2 인 PC-SOD(a2) 와, m=3 인 PC-SOD(a3) 와, m=4 인 PC-SOD(a4) 로 이루어진다.
Figure 112007022957488-pct00011
디스뮤타아제, 레시틴

Description

레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물 및 그 제조 방법{LECITHINIZED SUPEROXIDE DISMUTASE COMPOSITION AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은, 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (이하, SOD 라고 약칭한다.) 는, 동물, 식물, 미생물 등의 생체 내에 넓게 분포하는 효소이다. SOD 는, 반응성이 풍부한 유리 (프리) 의 활성 산소인 수퍼옥사이드 음이온 라디칼을 불균화 분해하는 활성을 갖는다. SOD 는, 항류머티즘제, 자기 면역성 질환 치료제, 심근 경색 치료제, 장기 이식시의 사용, 뇌경색 후의 항혈전제의 사용시에 생체 내에서 발생하는 라디칼의 제거를 목적으로 하는 사용, 및 다양한 염증에 대한 적용 등이 기대되고 있다 (비특허 문헌 1 참조).
SOD 에 대해서는, 여러 가지 유도체가 제안되어 있다. 예를 들어, 표적이 되는 환부로의 집적성, 생체 내에서의 안정성 등이 현격히 향상된, 특정한 SOD 를 레시틴화한 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (이하, 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 PC-SOD 라고 약칭한다.) 를 이용한 제제가 제안되어 있다 (특허 문헌 1 참조).
특허 문헌 1:일본 특허공보 제3070980호
비특허 문헌 1:타니구치 나오유키편, 「활성 산소의 임상에 대한 전망」, 의약 저널사, 도쿄 61-111 페이지 (1994년)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
그러나, 그 PC-SOD 를 의약품으로서 이용하기 위해서는, 실용상, 몇 가지의 문제가 있다. 예를 들어, 그 PC-SOD 는, 특정한 SOD 와 레시틴 유도체를 반응시키는 방법에 의해 제조된다. 그러나, 종래의 방법으로 제조하는 PC-SOD 의 효소 활성은 반드시 안정적이라고 할 수 없는 문제가 있어, 제제화 공정 및 제제에 영향을 줄 가능성이 있었다. 또, 종래 방법의 수율도 충분하다고는 말할 수 없었다.
본 발명은, 의약품 원체로서 유용하고, 또한 안정성이 우수한 PC-SOD 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 특정 SOD 의 아미노기의 1～4 개가 레시틴 잔기로 치환된 PC-SOD(A) (이하, PC-SOD(A) 라고 기재한다) 를 주성분으로 하는 PC-SOD 조성물에 의해 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 그 PC-SOD 조성물을 제조하기 위한 조건에 대해 검토한 바, 레시틴 유도체와 특정 SOD 를 특정한 비율로 반응시키고, 특정한 정제 방법을 이용하여 정제함으로써, 그 PC-SOD 조성물을 고수율로 얻을 수 있는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은, 구리 및/또는 아연이 배위된, 111 위치 시스테인의 메르캅토기가 히드록시에틸티오화된 인간 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 아미노기의 1 개 이상이 하기 일반식 (I)
Figure 112007022957488-pct00001
(식 중, R 은 탄소수 8～30 의 알킬기이며, n 은 2～10 의 정수이다.)
로 표시되는 레시틴 잔기로 치환된 PC-SOD 를 함유한 조성물이고,
그 PC-SOD 가, 상기 아미노기의 m 개 (m 은 1～4 의 정수이고, m 의 평균치는 1.5～2.4 이다.) 가 상기 PC-SOD(A) 를 주성분으로 하고, 그 PC-SOD(A) 가, m=1 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a1) 25～40 몰% 와, m=2 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a2) 35～50 몰% 와, m=3 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a3) 10～20 몰% 와, m=4 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a4) 5～15 몰% 로 이루어지 것을 특징으로 하는 PC-SOD 조성물이다.
또, 본 발명은, 하기 일반식 (Ⅲ)
Figure 112007022957488-pct00002
(식 중, R 은 탄소수 8～30 의 알킬기이며, Z 는 수산기, 또는 활성 에스테르를 형성하는 기에서 카르보닐기를 제외한 기이며, n 은 2～10 의 정수이다.)
로 표시되는 레시틴 유도체의 1 몰에 대해, 구리 및/또는 아연이 배위된, 111 위치 시스테인의 메르캅토기가 히드록시에틸티오화된 인간 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 0.05～0.4 배 몰을 반응시켜 미정제 PC-SOD 를 얻는 레시틴화 공정을 실시하고, 다음으로, 그 미정제 PC-SOD 를, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 정제 공정을 실시함으로써 청구항 1～7 중 어느 하나에 기재된 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물을 제조하는 것을 특징으로 하는 PC-SOD 조성물의 제조 방법이다.
발명의 효과
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 효소 활성의 안정성 및 생체 내에서의 안정성이 우수하고, 제제화도 용이한 우수한 조성물이기 때문에, 의약품 원체로서 유용하다. 또한, 본 발명의 제조 방법에 의해, 상기 PC-SOD 조성물을 고수율로 제조할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 PC-SOD 조성물, 구리 및/또는 아연이 배위된, 111 위치 시스테인의 메르캅토기가 히드록시에틸티오화된 인간 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (이하, 인간 유래 SOD 라고 약칭하는 경우가 있다.) 의 아미노기의 1 개 이상이, 하기 일반식 (I) 로 표시되는 레시틴 잔기에 의해 치환된 구조를 갖는 PC-SOD 를 함유한다.
그 PC-SOD 의 제조에 이용하는 SOD 의 입수 방법은 특별히 한정되지 않고, 인간 유래의 것이어도 되고, 다른 기원을 유래로 하는 것이어도 된다. 즉, 본 발명에 있어서의 인간 유래 SOD 는, 인간에게 유래하는 SOD 와 동일 구조를 갖는 것이면, 어떠한 기원이어도 된다.
또한, 본 발명에 있어서, PC-SOD 는 후술하는 PC-SOD(A) 와, 인간 유래의 SOD 의 아미노기의 5 개 이상이 레시틴 잔기 (I) 에 의해 치환된 PC-SOD(B) (이하, PC-SOD(B) 라고 기재한다) 로 이루어지고, PC-SOD 의 총량이란 PC-SOD(A) 와 PC-SOD(B) 의 합계량을 의미한다.
Figure 112007022957488-pct00003
일반식 (I) 로 표시되는 레시틴 잔기 (이하, 레시틴 잔기 (I) 이라고 기재한다.) 에 있어서, R 은 탄소수 8～30 의 알킬기이며, 탄소수 14～22 의 알킬기가 바람직하다. R 은 직쇄 구조 또는 분기 구조가 바람직하며, 직쇄 구조가 특히 바람직하다. R 로는, 탄소수 13, 15, 또는 17 의 직쇄 알킬기가 바람직하며, 탄소수 15 의 직쇄 알킬기가 특히 바람직하다.
n 은 2～10 의 정수이고, 2～6 이 바람직하며, 3 이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, PC-SOD 조성물 중에 함유되는 PC-SOD 는, 인간 유래 SOD 의 아미노기의 1 개 이상이 레시틴 잔기 (I) 에 의해 치환된 화합물의 총칭이다. 인간 유래 SOD 중에는 아미노기가 12 개 존재한다고 되어 있는 점에서, PC-SOD 중의 레시틴 잔기 (I) 수는 1～12 이다.
또한, 「레시틴 잔기 (I) 에 의해 치환되었다」란, 아미노기 (-NH2) 의 수소 원자 중 하나가 레시틴 잔기 (I) 로 치환되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 그 레시틴 잔기 (I) 수 (m) 가 1～4 의 정수이며, 또한 m 의 평균이 1.5～2.4 인 PC-SOD(A) 를 주성분으로 한다. m 은, PC-SOD(A) 중에 존재하는 아미노기에 결합한 레시틴 잔기 (I) 의 결합 수이다.
「PC-SOD(A) 를 주성분으로 한다」란, PC-SOD 조성물 중에 함유되는 PC-SOD 의 양비 중, PC-SOD(A) 의 비율이 최대인 것을 의미한다. PC-SOD 조성물 중에 함유되는 PC-SOD 의 총량에 대한 PC-SOD(A) 의 비율은, 75 질량% 이상이 바람직하며, 85～100 질량% 가 특히 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, PC-SOD(A) 는, m 의 값이 1, 2, 3 또는 4 인 4 종의 PC-SOD 를, 각각 특정한 비율로 함유한다. 즉, PC-SOD(A) 는, m 이 1 인 PC-SOD(a1) 25～40 몰% 와, m 이 2 인 PC-SOD(a2) 35～50 몰% 와, m 이 3 인 PC-SOD(a3) 10～20 몰% 와, m 이 4 인 PC-SOD(a4) 5～15 몰% 로 이루어진다.
그리고 m 의 평균치는 1.5～2.4 이다. m 의 평균치는 몰 평균치로서 계산되는 값이며, PC-SOD(a1), (a2), (a3), 및 (a4) 의 총량에 대한 각각의 몰비로부터 산출할 수 있다.
PC-SOD 는, 레시틴 잔기의 결합 수가 많은 경우에는, 소수성이 높아지기 때문에, 세포로의 접착성이 높아져, 지방 조직 등에 흡수되기 쉬워진다. 또한, 생체 내에서의 안정성도 높아진다. 한편, PC-SOD 의 레시틴 잔기의 결합 수가 적은 경우에는 친수성이 높아지기 때문에, 주사제 등의 수성 제제에 대한 응용이 용이해진다. 또, 생체 내에서의 효소 활성도 높아지기 때문에, 생체 내에서 항원으로서 인식될 가능성이 낮아지는 등의 이점이 있다.
PC-SOD 를 의약품으로 하는 경우에는, 생체 내에서의 동태, 안정성, 제제화의 용이함 등의 밸런스가 잡혀 있는 것이 필요하다. 이들 요인을 고려한 결과, 본 발명자들은, PC-SOD 에 있어서의 레시틴 잔기 (I) 의 결합 수의 평균치가 1.5～2.4 인 경우가 최적인 것을 발견하였다. 또한, 본 발명의 PC-SOD 조성물의 안정성을 고려했을 경우에는, 간단하게 PC-SOD 에 있어서의 레시틴 잔기 (I) 의 결합 평균 수를 1.5～2.4 로 하면 되는 것이 아니라, 어느 정도의 레시틴 잔기 (I) 수를 갖는 PC-SOD 와, 레시틴 잔기 (I) 의 결합 수가 적은 PC-SOD 를 병존시키는 것이, 의약품 원체로서의 안정성의 향상으로 연결되고, 또한 의약품 원체 및 제제의 제조에 있어서도 효율적인 것을 발견하였다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, PC-SOD(A) 이외에 PC-SOD(B) 를 함유하고 있어도 된다.
PC-SOD(B) 중에 존재하는 레시틴 잔기 (I) 수 (r) 은, 5～12 개이다. PC-SOD 중의 입체 구조의 내부에 존재하는 아미노기는 치환되기 어렵기 때문에, 통상의 경우, r 은 5～8 이 바람직하다.
PC-SOD 조성물 중에 PC-SOD(B) 가 함유되는 경우의 PC-SOD(B) 의 양은, PC-SOD 조성물 중에 함유되는 PC-SOD 의 총량에 대해서 25 질량% 미만이 바람직하고, 15 질량% 미만이 바람직하다. 그 양이 25 질량% 이상이면 상기의 이유에 의해 본 발명의 효과가 손상될 우려가 있다.
본 발명에 있어서, PC-SOD 는, 인간 유래 SOD 중의 아미노기의 1 개 이상이, 레시틴 잔기 (I) 로 치환된 화합물이지만, 또한 그 아미노기의 하나 이상이, 레시틴 잔기 (I) 이외의 기로 치환되어 있어도 된다. 그 기로는, 레시틴 잔기 (I) 의 일부가 분해되어 생성된 기, 또 PC-SOD 의 합성시에 이용하는 레시틴 유도체 중에 함유되는 레시틴 유도체의 분해물이 아미노기로 치환된 기 등을 들 수 있다.
그 레시틴 잔기 (I) 이외의 기의 구체예로는, 이하의 기를 들 수 있다. 단, 하기식 중의 n 은, 레시틴 잔기 (I) 에 있어서의 의미와 동일한 의미를 나타낸다.
Figure 112007022957488-pct00004
Figure 112007022957488-pct00005
Figure 112007022957488-pct00006
한편, PC-SOD 중의 아미노기가, 레시틴 잔기 (I) 를 함유하지 않고, 상기의 기 (IV)～(VI) 등의 레시틴 잔기 (I) 이외의 기로 치환된 화합물은, 본 발명에 있어서의 PC-SOD 의 개념에는 포함되지 않는다.
본 발명의 PC-SOD 조성물 중에 함유되는 PC-SOD(A) 의 비율은, 다양한 관점에서 관리되는 것이 바람직하다.
예를 들어 고속 액체 크로마토그래피 (이하, HPLC 라고 약칭한다.) 에서 측정되는 PC-SOD(A) 의 비율은, PC-SOD 의 총량에 대해서 85% 이상 (단, 단위는 크로마토그램의 면적%) 인 것이 바람직하고, 85～100% 인 것이 특히 바람직하며, 90～100% 인 것이 그 중에서도 바람직하다.
또, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 측정되는 PC-SOD(A) 의 비율은, PC-SOD 의 총량에 대해서 80% 이상 (단, 단위는 크로마토그램의 면적%) 인 것이 바람직하고, 85～100% 인 것이 특히 바람직하다.
HPLC 및 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법의 측정 조건은, 후술하는 실시예에 기재한 조건을 채용할 수 있다.
PC-SOD(A) 의 비율이 상기 특정한 비율이 되도록 관리했을 경우에는, 효소 활성의 안정성 및 생체 내에서의 안정성이 우수한 PC-SOD 조성물을 항상 얻을 수 있다. 또, 그 분석 방법에 의한 관리는 보다 효율적이다. 또한, 얻어진 PC-SOD 조성물은, 안정성으로부터 우수하기 때문에 제제화도 용이하다.
본 발명의 PC-SOD 조성물에 있어서, PC-SOD 의 주성분인 PC-SOD(A) 는, m 이 동일 또는 상이한 PC-SOD(A) 의 2 분자가 회합(會合)하여 이루어지는 2 량체로서 함유되는 것이 바람직하다. 이로써, PC-SOD 조성물의 효소 활성이 충분히 발현된다. 그 2 량체로는, PC-SOD(a2) 의 2 분자에서 형성되는 2 량체, PC-SOD(a1) 의 1 분자와 PC-SOD(a3) 1 분자에서 형성되는 2 량체 등이 예시될 수 있다.
또, PC-SOD 중에 PC-SOD(B) 가 함유되는 경우, 그 PC-SOD(B) 와 PC-SOD(A), 및/또는 PC-SOD(B) 끼리가 회합하여 2 량체를 형성하고 있어도 된다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, PC-SOD(A) 및 PC-SOD(B) 이외의 화합물 (이하, 다른 화합물이라고 한다.) 을 함유하고 있는 경우가 있다.
다른 화합물로는, 하기 일반식 (Ⅱ) 로 표시되는 지방산을 들 수 있다.
RCOOH … (Ⅱ)
[단, R 은 상기 일반식 (I) 에 있어서의 R 과 동일하다.]
일반식 (Ⅱ) 로 표시되는 지방산의 양은, PC-SOD 의 총량 1㎎ 당 0.01～0.15㎚ol 인 것이 바람직하다.
PC-SOD 조성물 중의 지방산의 정량법으로는, 가스 크로마토그래피, HPLC, 매스 스펙트로메트리 등의 수법을 들 수 있다. 또, 라벨화 시약에 의해 라벨화하여, HPLC 로 정량하는 방법도 들 수 있다. PC-SOD 조성물 중의 지방산 농도가 낮은 경우에는, 라벨화 시약을 이용하는 방법이 바람직하다.
또, 다른 화합물로는, 인간 유래 SOD 의 아미노기의 1 개 이상으로, 상기 일반식 (IV), (V) 또는 (VI) 로 표시되는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이 치환되며, 레시틴 잔기 (I) 이 치환되지 않는 화합물도 들 수 있다.
본 발명의 PC-SOD 조성물이, 다른 화합물을 함유한 경우의 양은, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 측정되는 비율로서, 20% 이하가 바람직하고, 0～15% (단, 단위는 크로마토그램의 면적% 이다.) 가 특히 바람직하다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제로서의 활성 (SOD 활성) 을 갖는다. SOD 활성은, PC 화 되어 있지 않은 SOD, 즉 인간 유래 SOD 를 기준으로 한 비활성치로서 구하는 것이 바람직하다.
PC-SOD 조성물의 비활성치의 측정 방법으로는, 시토크롬 C 법, 니트로블루?테트라졸륨법, 에피네프린법, 아질산법 등이 알려져 있고, 시토크롬 C 법을 이용하여 비활성치를 측정하는 것이 바람직하다. 시토크롬 C 법에 의한 측정은, Y.Oyanagi (SOD 와 활성 산소 조절제, p.95(1989)), J.M.McCord (J.Biol.Chem., Vol.224, p.6049(1969)), K.Asada (Agr.Biol.Chem., Vol .38, p.471(1974)) 등의 문헌에 기재되는 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 제제화의 용이함, 생체 내에서의 안정성, 효율적인 약효 발현면으로부터, 시토크롬 C 법에 의해 측정되는 비활성치가, PC-SOD 의 총량 1㎎ 당 2000 유닛 이상인 것이 바람직하고, 2300～7000 유닛인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 하기 일반식 (Ⅲ) 으로 표시되는 레시틴 유도체에 대해, 특정량의 인간 유래 SOD 를 반응시켜 미정제 PC-SOD 를 얻는 레시틴화 공정을 실시하고, 다음으로, 그 미정제 PC-SOD 를, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 정제 공정을 실시하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure 112007022957488-pct00007
일반식 (Ⅲ) 중, R, n 은 상기 일반식 (I) 의 R, n 과 동일하다.
Z 는, 수산기, 또는 활성 에스테르를 형성하는 기에서 카르보닐기를 제외한 기를 나타낸다. 후자의 기로는, 예를 들어, p-니트로페놀, 1,3,5-트리클로로페놀, 펜타플루오로페놀, 2,4-디니트로페놀, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시피페리딘, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실산이미드, 8-히드록시퀴놀린, 2-히드록시피리딘 등의 수산기 함유 화합물의 수산기의 수소 원자를 제외한 기를 들 수 있다. 활성 에스테르체의 합성법에 대해서는 공지된 방법을 이용할 수 있다 (특허 문헌 1, 및 「펩티드 합성의 기초와 실험」(이즈미야들, 1985 년, 마루젠 (주) 발행) 등을 참조).
[레시틴화 공정]
본 공정은, 인간 유래 SOD 를 적당한 용매에 용해하여 얻은 SOD 용액에, 상기 일반식 (Ⅲ) 으로 표시되는 레시틴 유도체를 적당한 용매에 용해하여 얻은 레시틴 유도체 용액을 첨가하는 방법에 의해 실시하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 레시틴 유도체 1 몰에 대해, 0.05～0.4 배 몰, 바람직하게는 0.1～0.25 배 몰의 인간 유래 SOD 를 반응시킴으로써, 본 발명의 PC-SOD 조성물을 고수율로 얻을 수 있다.
이때, 첨가 속도, 교반 속도, 반응 온도, 반응 시간, 반응 압력 등의 다양한 반응 조건을 조절함으로써, 본 발명의 PC-SOD 조성물을 더욱 고수율로 얻을 수 있다.
레시틴 유도체 용액의 SOD 용액 중으로의 첨가 속도는, 레시틴 유도체가 단시간 동안 반응계 내에 분산될 수 있는 속도이면 되고, 통상 20～100mL/분이 바람직하며, 40～80mL/분이 특히 바람직하다.
교반 속도는, 레시틴 유도체가 단시간 동안 반응계 내에 분산될 수 있는 교반 속도이면 되고, 통상 50～500rpm 이 바람직하며, 100～300rpm 이 특히 바람직하다.
반응 온도는, 고온이 되면 될수록 SOD1 분자당 레시틴 유도체의 도입 수가 많아지기 때문에, 상한은 +20℃ 로 하는 것이 바람직하다. 반응 온도의 하한으로는, 반응액이 동결되지 않는 온도이면 된다. 반응 온도로는, 0～+10℃ 가 바람직하다.
반응 시간은, 0.5 시간～72 시간이 바람직하고, 2～24 시간이 특히 바람직하다.
반응 압력은, 0.05～0.2MPa 가 바람직하고, 대기압 부근의 압력이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명의 PC-SOD 조성물을, 더욱 안정된 품질로, 고수율로 제조하기 위해서는, SOD 용액 중에 함유되는 인간 유래 SOD 의 농도, 레시틴 유도체 용액의 첨가 방법 등에 대해서도, 보다 엄밀한 조건을 설정하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 인간 유래 SOD 를 100～2000 배량의 용매로 희석하여 SOD 용액을 조제하고, 그 용액에 레시틴 유도체를 20～100 배량의 유기 용매로 희석한 레시틴 유도체 용액을 첨가하는 것이 바람직하다.
SOD 를 용해시키는 용매로는, 물, 또는, 물과 유기 용매의 혼합 용매를 들 수 있고, 물과 유기 용매의 혼합 용매가 바람직하다. 그 혼합 용매를 이용함으로써, 레시틴 유도체 용액을 첨가할 때에, 반응계를 균일하게 할 수 있어 침전물의 발생을 방지할 수 있다. 또, 이들의 용매에는 붕산 등을 용해시켜, 완충능을 갖게 하는 것이 바람직하다.
물로는, 정제수, 이온 교환수, 증류수, 또는 주사용 물이 바람직하다 (이하, 이들을 총칭하여 간단히 「물」이라고도 한다.). 유기 용매로는, 이소프로필알코올, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, N,N-디메틸아세트아미드, 술포란, 디메틸술폭사이드, 아세톤, 1,4-디옥산, 및 메탄올 등을 들 수 있고, 이소프로필알코올이 바람직하다.
레시틴 유도체의 희석에 이용되는 유기 용매로는, SOD 용액의 조제에 이용되는 유기 용매와 동일한 용매를 예시할 수 있고, 이소프로필알코올이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어지는 반응액 (미정제 PC-SOD) 중에는, PC-SOD(A) 의 외에, PC-SOD(B), 미반응의 인간 유래 SOD, 미반응의 레시틴 유도체, 및 그 외의 성분이 공존하고 있다. 그 외의 성분으로는, 레시틴 유도체의 합성에 이용되는 시약에 유래하는 미반응물 등을 들 수 있다.
[정제 공정]
다음으로, 상기 레시틴화 공정에서 얻어진 미정제 PC-SOD 를, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 정제 공정을 실시한다. 본 정제 공정을 실시함으로써, 고수율로 본 발명의 PC-SOD 조성물을 얻을 수 있다.
정제 공정은, 이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 상기 미정제 PC-SOD 를 충전하여 흡착시킨 후, 무기염을 함유하는 완충액을 함유한 용매를 이용하여, 목적으로 하는 PC-SOD 조성물을 용출시킴으로써 실시할 수 있다.
이온 교환 수지로는, 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지 중 어느 것이어도 사용할 수 있다.
용출에 이용하는 용매에 함유되는 완충액으로는, 무기염을 함유하고, 완충능을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 단, 인산계 완충액을 이용하는 경우에 있어서는, PC-SOD 가 불용화되는 경우가 있기 때문에, 사용 전에 용해성을 충분히 확인할 필요가 있다. 완충액의 pH 는, 정제시에 있어서의 PC-SOD 의 안정성이 유지되는 점에서, 6～9 인 것이 바람직하다.
무기염으로는, 염화 나트륨, 황산암모늄 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 이용해도, 임의의 비율의 혼합물로서 이용해도 된다.
또, 용출에 이용하는 용매는, PC-SOD 의 용해성 향상을 목적으로 하여, 유기 용매를 함유하는 것이 바람직하다.
유기 용매로는, 이소프로필알코올, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, N,N-디메틸아세트아미드, 술포란, 디메틸술폭사이드, 아세톤, 1,4-디옥산, 메탄올 등을 들 수 있다. 이들 중, PC-SOD 의 용해성이 양호하고, 정제 효율이 좋은 점에서, 메탄올이 바람직하다.
그 용매 중에 함유되는 유기 용매의 양은, PC-SOD 를 불용화시키지 않고, 또한 이온 교환 수지로의 PC-SOD 의 흡착을 방해하지 않는 양으로 하는 것이 바람직하다. 유기 용매의 비율은, 용매의 총용량에 대해 10～80 용량% 가 바람직하고, 20～70 용량% 가 특히 바람직하며, 40～60 용량% 가 특히 바람직하다.
목적으로 하는 PC-SOD 조성물은, 용매에 함유되는 완충액의 무기염 농도를 변경함으로써 용출시킬 수 있다.
구체적으로는, 미정제 PC-SOD 를 칼럼에 충전한 후에, 미흡착의 물질을 용출시킨다. 다음으로 하기 용매 (A) 를 이용하여 미반응의 SOD 를 용출시키고, 다음으로 하기 용매 (B) 를 이용하여 본 발명의 PC-SOD 조성물을 용출시킴으로써 실시하는 것이 바람직하다.
용매 (A):무기염 농도가 5～100mM 인 pH6～9 의 완충액 (a1) 과, 메탄올로 이루어지고, 용매 (A) 에 대한 그 완충액 (a1) 양이 20～90 용량% 이며, 메탄올 양이 10～80 용량% 인 용매.
용매 (B):무기염 농도가 150～400mM 인 pH6～9 의 완충액 (b1) 과, 메탄올로 이루어지고, 용매 (B) 에 대한 그 완충액 (b1) 양이 20～90 용량% 이며, 메탄올 양이 10～80 용량% 인 용매.
상기의 제조 방법에 따라 얻어진 PC-SOD 조성물을 함유하는 획분은, 한외여과를 실시하여 그 획분에 함유되는 무기염 및 유기 용매 등을 제외하는 것이 바람직하다. 한외여과를 실시함으로써, PC-SOD 조성물 및 물을 함유한 PC-SOD 조성물의 수성액이 얻어진다. 또한 그 수성액을 건조시킴으로써 PC-SOD 조성물을 정제해도 되지만, PC-SOD 조성물의 제제화는 통상의 경우에는 수성액을 이용하여 실시되기 때문에, 수성액으로서 얻는 것이 바람직하다. 그 수성액에 있어서의 PC-SOD 조성물의 농도는 0.1～300㎎/mL 가 바람직하며, 1～50㎎/mL 가 특히 바람직하다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 의약품 원체로서 유용하고, 다양한 첨가제를 첨가하고, 희석하는 등의 조작을 실시함으로써 제제로 할 수 있다.
제제 형태로는, 주사제 (용액, 현탁액, 유탁액, 용시(用時) 용해용 고형제 등), 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 액제, 리포화제, 겔제, 외용산제, 스프레이제, 흡입산제, 좌제 등을 들 수 있다.
투여 방법은, 주사 (근육내, 피하, 피내, 정맥내 등), 경구, 흡입 등의 투여 방법을 채용할 수 있다. 투여량은, 제제의 조제 방법, 제형, 질환의 종류, 당해 제제의 투여 방법, 투여 형태, 사용 목적, 환자의 체중 등에 의해 개별적으로 설정되고, 예를 들어, 성인 1 일당, 0.5～200㎎ 을 들 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 한정되지 않는다.
[예 1] PC-SOD 조성물의 제조예
20L 의 플라스크에 주사용 증류수 (오오츠카 제약사 제조, 상품명:오오츠카 증류수, 이하 동일.) (9000mL) 를 첨가하고, 붕산 (27.7g), NaOH (3.6g), KCl (33.7g) 을 순차 첨가하여 용해하였다. 다음으로, SOD 수용액 (100g , SOD 농도 113.6㎎/mL) 을 첨가한 후, 210rpm 에서 교반하면서, 크로마토 챔버 내에서 8℃ 로 해 놓았던 이소프로필알코올 (2000mL) 을 33mL/분으로 적하하여, SOD 용액을 조제하였다.
일본 특허공보 제3070980호에 기재된 방법에 따라 제조한 하기 레시틴 유도체 (15.7g) 를 이소프로필알코올 (500mL) 에 용해하였다. 다음으로, 소수성 필터로 여과하여, 불용물을 제거하였다. 여과액에 이소프로필알코올을 첨가하고, 총용량을 8000mL 로 하여 레시틴 유도체 용액을 조제하였다. 용액 온도는 8℃ 이었다. 다음으로, 이 레시틴 유도체 용액 (8000mL) 을, 상기 SOD 용액 중에 66mL/분으로 적하하여, 210rpm 에서 4 시간 교반한 액을 반응액으로 하였다.
Figure 112007022957488-pct00008
붕산 완충액 (50mmol/L, pH8.5±0.2) 과 메탄올의 1:1 (용량비) 혼합 용액에서 미리 평형화한 이온 교환 수지 (Cellulofine sf A-500) 를 충전한 칼럼에, 반응액 전체량을 담지시켰다. 상기 혼합 용액에서 미흡착 물질을 용출하고, N-히드록시숙신이미드, 1H-테트라졸, 및 디시클로헥실카르보디이미드를 함유한 획분을 얻었다.
다음으로, NaCl 을 용해시킨 50mmol/L 의 붕산 완충액 (pH8.5±0.2, NaCl 농도=25mmol/L) 과 메탄올의 1:1 (용량비) 로 이루어지는 용출 용매를 이용하여, 미 수식 SOD 를 용출시켰다.
다음으로, NaCl 을 용해시킨 50mmol/L 의 붕산 완충액 (pH8.5±0.2, NaCl 농도=200mmol/L) 과 메탄올의 1:1 (용량비) 로 이루어지는 용출 용매를 이용하여 용출한 획분을 PC-SOD 조성물 획분으로 하였다.
PC-SOD 조성물 획분을 한외여과함으로써 염류 및 메탄올을 제외하고, 주사용 증류수로 치환하여, 농도를 조정하기 위해 농축하였다. 한외여과막에는, 밀리포아사의 PLGC0005 (분획 분자량 10,000, 막 면적 0.5㎡) 를 이용하였다. 한외여과 투과측의 전기 전도도가, 주사용 증류수와 동일하게 되었을 때 여과 조작을 종료하고, 추가로 용액 중의 PC-SOD 농도를 약 40㎎/mL 로 조정하여 PC-SOD 조성물의 수성액 (Lot.001) 을 얻었다. 여기까지의 조작은, 4℃ 로 보냉(保冷)한 크로마토 챔버 내에서, 액온을 측정하면서 실시하였다.
분취용 HPLC 에 의해, PC-SOD 조성물 중의 PC-SOD 의 각 피크에 대응하는 획분을 분취하였다. HPLC 의 칼럼에는, Phenyl 5PW-RP (75㎜×4.6㎜, 토소사 제조) 를 이용하고, 이동상으로서 0.1% 트리플루오로아세트산과 20% 아세토니트릴의 수용액, 0.075% 트리플루오로아세트산과 90% 아세토니트릴의 수용액을 농도 기울기에 따라 0.8mL/분으로 흘렸다. 검출기로서는 UV 검출기 (파장 220㎚) 를 이용하고, 칼럼 온도는 실온으로 하였다.
얻어진 획분에 대해 MALDI TOF-MS 분석을 실시하여, PC-SOD 의 분자량, 및 프래그먼트를 측정하였다. PC-SOD 의 1 분자에 결합하는 레시틴 유도체의 결합 수 (m) 와, 각 결합 수에 상당하는 PC-SOD 의 비율 (몰%), m 의 평균치, 및 PC-SOD 2 량체당 m 의 평균치를 구한 결과를, 하기 표 1 에 나타낸다.
수성액 (Lot.001) 에 함유되는 PC-SOD 에는 1～4 분자의 레시틴 유도체가 결합되어 있고, m 의 평균치는 2 였다.
[예 2, 3]
예 1 과 동일한 조작을 실시하고, PC-SOD 조성물의 수성액 (Lot.002 및 003) 을 얻었다. 각 수성액 중의 PC-SOD 의 1 분자에 결합하는 레시틴 유도체의 결합 수 (m), 각 결합 수에 상당하는 PC-SOD 의 비율 (몰%), m 의 평균치, 및 PC-SOD 2 량체당 m 의 평균치를 구한 결과를 하기 표 1 에 정리하여 나타낸다.
예 1: Lot.001 예 2: Lot.002 예 3: Lot.003
m=1 31 몰% 31 몰% 32 몰%
m=2 43 몰% 43 몰% 43 몰%
m=3 16 몰% 16 몰% 15 몰%
m=4 10 몰% 10 몰% 10 몰%
m 의 평균치 2 2 2
2 량체당 m 의 평균치 4 4 4
[예 4] HPLC 에 의한 순도 시험예 (1)
예 1 에서 제조한 수성액 (Lot.001, 500μL) 에 주사용 증류수를 첨가하고, PC-SOD 의 농도를 30㎎/mL 로 한 액 (500μL) 에 주사용 증류수 (2500μL) 를 첨가하여 분석용 샘플을 얻었다. 분석용 샘플에 대해 HPLC 분석을 실시한 결과, PC-SOD 의 총량에 대한 PC-SOD(A) 의 비율은 96.7% (단위는 크로마토그램의 면적% 이다.) 이었다.
HPCL 의 분석에는, 칼럼으로서 YMC A-502 S-5 120A CN (150㎜×4.6㎜, YMC사 제조) 를 이용하고, 이동상에는, 0.1% 트리플루오로아세트산과 20% 아세토니트릴의 수용액 및 0.075% 트리플루오로아세트산과 90% 아세토니트릴의 수용액을, 농도 기울기에 따라 0.8mL/분으로 흘렸다. 검출기는 UV 검출기 (파장 220㎚) 를 이용하고, 칼럼 온도를 실온으로 하였다.
[예 5] HPLC 에 의한 순도 시험예 (2)
예 1 과 동일한 방법으로 얻은 PC-SOD 조성물을 함유한 수성액 (Lot.005) 에 대해, 예 4 와 동일하게 HPLC 측정을 실시한 결과, PC-SOD 의 총량에 대한 PC-SOD(A) 의 비율은 97.3% (단위는 크로마토그램의 면적% 이다.) 이었다.
[예 6] 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 순도 측정예
예 1 에서 제조한 수성액 (Lot.001, 500μL) 을 물로 희석하여 농도를 30㎎/mL 로 한 액 (100μL) 에 물 (2900μL) 을 첨가하여 시료 용액으로 하였다.
또한, 시료 용액 (100μL) 에 물 (900μL) 을 첨가한 액을 비교 시료 용액으로 하였다.
시료 용액 및 비교 시료 용액의 각각 20μL 에 샘플 버퍼 (8μL) 를 첨가하여, 95℃ 에서 3 분간 가열하였다. 샘플 버퍼는, 글리세린 (10g), 도데실황산나트륨 (2g), 브롬페놀블루 (100㎎) 를 트리스?염산 완충액 (50mmol/L) 에 용해하여 100mL 로 하고, 이 용액으로부터 95μL 를 취하여 2-메르캅토에탄올 (5μL) 을 추가하여 조제하였다.
상기에서 처리한 시료 용액 및 비교 시료 용액의 각각 4μL 에 대해 전기 영동을 실시하였다. 영동 종료 후, 즉시 겔을 염색용 챔버로 옮겨 염색하였다. 염색 종료 후, 30 분간 보호액에 담근 후, 겔을 건조시켰다. 보호액은, 글리세린 (20mL) 에 물을 첨가하여 500mL 로서 조제하였다.
시료 용액의 메인 밴드 이외의 밴드의 크기와, 비교 시료 용액의 메인 밴드의 크기를 비교한 결과, PC-SOD 조성물에 함유되는 PC-SOD(A) 의 비율은 90% (단위는 크로마토그램의 면적% 이다.) 이상이었다.
[예 7] 비활성치의 측정예
비활성치는, 시토크롬 C 법을 이용하여 측정하였다. 측정 방법은, Y.Oyanagi (SOD 와 활성 산소 조절제, p.95(1989)), J.M.McCord (J.Biol.Chem., Vol.224, p.6049(1969)), 및 K.Asada (Agr.Biol.Chem., Vol .38, p.471(1974)) 등의 문헌에 기재되는 방법에 따랐다. 또한, 비활성치가 4500～5500 의 범위에 있는 인간 유래 SOD 를 표품으로서 이용하였다.
상기 예에서 얻은 PC-SOD 조성물을 상이한 농도로 조제한 시료에 크산틴옥시다아제 용액을 넣어, 자외광 (550㎚) 에 대한 흡광도를 측정하였다. 농도와 흡광도의 데이터로부터, 최소 제곱법에 의해 검량선을 얻어, 1 분당 흡광도 증가율로부터 시료의 비활성치를 구한 바, Lot.001 중의 PC-SOD 조성물의 비활성치 (U/㎎-SOD) 는 3400 이었다. 또한, 비활성치의 단위 「U/㎎-SOD」는 SOD 의 총량 (1㎎) 에 대한 값인 것을 의미한다.
[예 8] 지방산의 정량예
팔미트산 (256㎎) 을 에탄올에 용해하여 20mL 로 한 액을 50mmol/L 표준 원액으로 하였다. 그 표준 원액을 에탄올로 희석하여, 0.1mmol/L, 0.05mmol/L, 및 0.01mmo1/L 의 팔미트산 표준 시료를 각각 조정하였다. 또한, (팔미트산의 칭량값)/(팔미트산 분자량=256.43) 값을 팩터 (FP) 로 하였다.
한편, 마르가르산 (27㎎) 을 에탄올에 용해하여 200mL 로 한 액을 0.5mmol/L 내부 표준 용액으로 하였다.
팔미트산 표준 시료 (각 100μL), 예 1 에서 얻은 수성액 (Lot.001), 예 1 과 동일한 방법으로 얻은 수성액 (Lot.005, Lot.008) 의 각각 (100μL) 에, 상기 내부 표준 용액 (100μL) 을 추가하였다. 블랭크로서 에탄올 (100μL) 을 이용하였다.
각각에 A 액～C 액으로 이루어지는 장쇄?단쇄 지방산 라벨화 시약 (와이엠씨사 제조) 의 A 액 및 B 액을 추가하여, 60℃ 의 항온조에서 20 분간 교반하였다. 게다가 C 액 (200μL) 을 추가하여, 60℃ 의 항온조에서 15 분간 교반한 액을, HPLC 측정 시료로 하였다.
HPLC 의 측정에는 칼럼으로서 YMC A-512 S-5 120A CN (150㎜×6.0㎜, YMC 사 제조) 을 이용하였다. 이동상에는, 0.01% 트리플루오로아세트산과 20% 아세토니트릴의 수용액, 및 0.01% 트리플루오로아세트산 및 20% 아세토니트릴의 수용액을 농도를 변화시키면서 1mL/분으로 흘렸다. 검출기는 UV 검출기 (파장 230㎚) 를 이용하고, 칼럼 온도는 실온으로 하였다.
얻어진 HPLC 크로마토그램으로부터 팔미트산의 면적% 를 구하고, 또한, 내부 표준 용액의 측정치로 환산함으로써, 팔미트산의 함유량을 구하였다. PC-SOD 총량에 대한 팔미트산 농도는, Lot.001 에 있어서는 0.074㎚ol/㎎, Lot.005 에 있어서는 O.094㎚ol/㎎, Lot.008 에 있어서는 0.067㎚ol/㎎ 이었다.
본 발명의 PC-SOD 조성물은, 효소 활성의 안정성 및 생체 내에서의 안정성이 우수하고, 제제화도 용이한 우수한 조성물이 될 수 있다. 따라서, 항류머티즘제, 자기 면역성 질환 치료제 등의 다양한 치료제로 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 2004년 10월 12일에 출원된 일본 특허출원 2004-297519호의 명세서, 특허 청구의 범위 및 요약서의 전체 내용을 여기에 인용하여, 본 발명의 명세서의 개시로서 받아들인다.

Claims (9)

  1. 구리, 아연, 또는 구리 및 아연이 배위된, 111 위치 시스테인의 메르캅토기가 히드록시에틸티오화된 인간 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 아미노기의 1 개 이상이 하기 일반식 (I)
    Figure 112012007615242-pct00009
    [식 중, R 은 탄소수 8～30 의 알킬기이며, n 은 2～10 의 정수이다.]
    로 표시되는 레시틴 잔기로 치환된 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 함유한 조성물이고,
    그 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제가, 상기 아미노기의 m 개 [m 은 1～4 의 정수이고, m 의 평균치는 1.5～2.4 이다.] 가 상기 레시틴 잔기로 치환된 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (A) 를 75 질량% 이상 100 질량% 이하로 함유하고, 그 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (A) 가, m=1 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a1) 25～40 몰% 와, m=2 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a2) 35～50 몰% 와, m=3 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a3) 10～20 몰% 와, m=4 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (a4) 5～15 몰% 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 아미노기의 5 개 이상이 상기 일반식 (Ⅰ) 로 표시되는 레시틴 잔기로 치환된 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (B) 를 함유하는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    고속 액체 크로마토그래피에서 측정되는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (A) 의 비율이, 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 총량에 대해서 85% 이상 (단위는 크로마토그램의 면적% 이다.) 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 측정되는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (A) 의 비율이, 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 총량에 대해서 80% 이상 (단위는 크로마토그램의 면적% 이다.) 인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    시토크롬 C 법에 의해 측정되는 비활성치가, 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 총량 1㎎ 당 2000 유닛 이상인 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    하기 일반식 (Ⅱ)
    RCOOH … (Ⅱ)
    [식 중의 R 은, 탄소수 8～30 의 알킬기이다.]
    로 표시되는 지방산을, 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 총량 1㎎ 당 0.01～0.15㎚ol 함유하는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (A) 가, m 이 동일 또는 상이한 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (A) 의 2 분자가 회합하여 이루어지는 2 량체로서 함유되는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물.
  8. 하기 일반식 (Ⅲ)
    Figure 112012007615242-pct00010
    [식 중, R 은 탄소수 8～30 의 알킬기이고, Z 는 수산기, 또는 활성 에스테르를 형성하는 기에서 카르보닐기를 제외한 기이며, n 은 2～10 의 정수이다.]
    로 표시되는 레시틴 유도체의 1 몰에 대해, 구리, 아연, 또는 구리 및 아연이 배위된, 111 위치 시스테인의 메르캅토기가 히드록시에틸티오화된 인간 유래의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 0.05～0.4 배 몰을 반응시켜 미정제 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 얻는 레시틴화 공정을 실시하고, 다음으로, 그 미정제 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 정제 공정을 실시함으로써 제 1 항에 기재된 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물을 제조하는 것을 특징으로 하는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    정제 공정을, 레시틴화 공정에서 얻어진 미정제 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 이온 교환 수지에 흡착시키고, 다음으로, 하기 용매 (A) 를 이용하여 미반응의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 용출시키고, 다음으로, 하기 용매 (B) 를 이용하여 제 1 항에 기재된 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물을 용출시킴으로써 실시하는 레시틴화 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 조성물의 제조 방법.
    용매 (A):무기염 농도가 5～100mM 인 pH6～9 의 완충액 (a1) 과, 메탄올로 이루어지고, 용매 (A) 에 대한 그 완충액 (a1) 양이 20～90 용량% 이며, 메탄올 양이 10～80 용량% 인 용매.
    용매 (B):무기염 농도가 150～400mM 인 pH6～9 의 완충액 (b1) 과, 메탄올로 이루어지고, 용매 (B) 에 대한 그 완충액 (b1) 양이 20～90 용량% 이며, 메탄올 양이 10～80 용량% 인 용매.
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