EA018116B1 - Способ получения ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином, отличающемуся тем, что: а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля ацилируют галогенангидридом нитробензойной кислоты в безводном пиридине; б) нитрогруппу полученного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью хрома(II); в) полученный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента; г) активированный пегилирующий агент без выделения вводят в реакцию азосочетания с эритропоэтином в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 9,5; д) смесь продуктов пегилирования разделяют ионообменной хроматографией с получением монопегилированого эритропоэтина. Технический результат: расширение спектра эритропоэтинов с увеличенным временем циркуляции в кровотоке.

Description

Изобретение относится к химии полимеров и биотехнологии и обеспечивает способ получения ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином, в котором полимер присоединён к эритропоэтину посредством азогруппы.

Предшествующий уровень техники

Эритропоэтин (ЭПО) - гликопротеин, состоящий из 165 аминокислот, физиологически является основным регулятором эритропоэза, т.е. стимулирует образование эритроцитов из поздних клетокпредшественников и повышает выход ретикулоцитов из костного мозга. Он способствует пролиферации и дифференцировке клеток эритроидного ростка, а также препятствует их апоптозу. Для выполнения последней функции концентрация эритропоэтина должна поддерживаться на определенном, постоянном для каждого человека уровне. До тех пор пока не нарушена оксигенация тканей, концентрация эритропоэтина, так же как и объем циркулирующих эритроцитов, остаются постоянными (Виеш1 М., Νοκΐτο Ь., Вотео А. Егот 1йе охудеп ίο 1йе огдап ргсЛесЬоп: егу1йгоро1ебп ак рго1адошк1 ίη 1йегпа1 шебюше. Сагбюуакс НетаЮ Адейк Меб Сйет. 2006; 4(4): 299-311; Сообпоидй Ь.Т., 8к1кпе В., Вгидпага С Егу1йгоро1ейп, 1гоп, апб егу1йгоро1ек1к // В1ооб. 2000; 96: 823-833; Са1 Ζ., Мапа1о Ό.Ι, Уе1 С. е1 а1. Неайк кот гобейк ехрокеб Ю ш1егтй1ей йурох1а ог егу1йгоро1еЬп аге рго1ес1еб адашй 1ксйет1а герейикюп 1и)игу. СлгсикЛюп. 2003; 108: 79-85; Ермоленко В.М., Николаев А.Ю. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинике. Тер. арх. 1990;62(11):141-145; Егк1ет А.1., Саго 1., Капки Е., 8бгег В. Вепа1 апб ех!гагепа1 егу111горо1ебп ргобийюп ш апаетк га1к. Вг 1 НаетаФк 1980;45(1):65-72; Е1аке А.У., Наткоп М.В., Абхюк Ν.8., Ζаη^аη^ ЕЮ. Егу111горо1ебп ргобийюп Ьу 1йе Ге1а1 Йуег ш ап абиЙ епуйоптей. В1ооб. 1987;70(2):542545).

Клинически ЭПО применяется для лечения анемии при хронической почечной недостаточности (диализные и предиализные пациенты), при онкологических заболеваниях (цитостатическая терапия), при трансплантации органов и тканей, при комплексном лечении СПИД (терапия ВИЧ-инфекции зидовудином), при аутодонорстве, для лечения анемии и при хронических воспалительных заболеваниях, при анемии у ослабленных пациентов (пожилые люди, недоношенные дети, обожженные и т.д.) и при отказе от трансфузий аллогенных гемокомпонентов (Уейк С., Сообпоидй Ь.Т. Апет1а оГ Сйгойс Э|кеаке // №\ν. Епд. 1. Меб. 2005. уо1 352. №. 10. Р. 1011-1023; КаЙтаккег 1.Р., Кекк1ег и., Со11ксйа1к В. 81иск1 С., Мойег В. ЕГГес! оГ гесотЫпай йитап егу!йгоро1ейп апб шйауепоик 1гоп оп апет1а апб бкеаке ас!1У11у т гйеита1о1б аПйпЬк // 1. ВйеитаФк 2001; 28: 2430-2436; Меапк В.Т. Весей беуе1ортейк ш !йе апет1а оГ сйгойс б1кеаке // Сигг. НетаЮк Вер. 2003; 2: 116-121; Мигрйу 8.Т., РагГгеу Р.8. Тйе 1трай оГ апет1а соггейюп оп сагбюуаксйаг бкеаке т епб-к!аде гепа1 бйеаке // 8етт. №рйго1. 2000; 20: 350-355).

Биодоступность коммерческих препаратов на основе рекомбинантного эритропоэтина ограничена из-за короткого периода полураспада в плазме крови и склонности к деградации протеазами (Павлов А.Д., Морщакова Е. Ф. Регуляция эритропоэза: Физиологические и клинические аспекты. М: Медицина, 1987. 272 с; Вате А. Е. С., еб. Абуапсеб гепа1 тебюте. ОхГогб: ОхЕогб ийуегкйу ргекк, 1992. 484 р.; Сообпоидй Ь. Т., Мопк Т. С., Апбпо1е С Ь. Егу1йгоро1ейп 1йегару. №\ν Епд1. 1. Меб. 1997; 336 (13): 933938). В практической деятельности у данных препаратов была выявлена цепь недостатков: быстрое разрушение в организме вынуждает значительно увеличивать дозу и частоту введения, что вызывает побочные, в том числе аллергические, реакции. Это диктует необходимость поиска новых лекарственных форм эритропоэтина для достижения лучшего биологического эффекта.

Указанные недостатки могут быть преодолены химическим модифицированием молекулы эритропоэтина. Для этой цели известно применение полиэтиленгликоля (ПЭГ), а также монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), которые представляют нейтральные полиэфиры с различной молекулярной массой [Никитин И.Г. Пегилированные препараты: современное состояние проблемы и перспективы / Никитин И.Г., Сторожаков Г.И. // Вирусные гепатиты: достижения, перспективы. 2001. №3(13). С. 3-8.]

Поскольку ПЭГ и мПЭГ непосредственно с полипептидами не взаимодействуют, то в их молекулы вводят различные функциональные группы, получая соответствующие активированные ПЭГ-агенты |1<ох1о\\'кк| А. Оеуе1ортей оГ Реду1а1еб 1йегГегопк Гог 1йе Тгейтей оГ Сйгойс Нерай11к С / 1<ох1о\\'кк| А., Сйаг1ек 8.А., Натк 1. М. // ВюЭгидк. 2001. №15(7). Р. 419-429.]. К таким ПЭГ -агентам для пегилорования эритропоэтина относятся, в частности, бифункциональные производные ПЭГ с двумя терминальными альдегидными группами или терминальными альдегидной и малеимидной группами (УО 2004/081053, опубл. 23.09.2004), сложные сукцинамидоэфиры ПЭГ (УО 2001/002017, опубл. 11.01.2001; УО 2002/49673, опубл. 27.06.2002) и др.

В заявке УО 2006/050959 (опубл. 18.05.2006), относящейся к промотирующим гематопоэз ковалентным конъюгатам наскольких бивалентных пептидов с гидроксиалкилированным крахмалом, содержится следующее общее указание: если полимерная часть, несущая бивалентный пептид, не способна непосредственно сочетаться с пептидом, то определённые соединения могут быть использованы с целью модифицировать её таким образом, чтобы она могла реагировать по меньшей мере с одной реакционноспособной группой пептидной части. Например, её можно модифицировать введением диазогруппы, способной реагировать с фенольными группами пептида.

В заявке УО 2006/005667 (опубл. 19.01.2006) раскрыт способ увеличения полупериода нахождения молекулы (например, эритропоэтина) в плазме, включающий ковалентное связывание этой молекулы с

- 1 018116 гетероциклической изостерой карбоновой кислоты (например, с тетразолом). В описании указано, что спейсером, связывающим молекулу с тетразольным фрагментом, может быть олиго(этиленгликоль). В случае когда полипептиды содержат одно или более тирозиновых звеньев, они могут быть селективно функционализированы азосочетанием с солью арилдиазония, например, обработкой тирозинсодержащего полипептида солью арилдиазония с терминальным тетразольным фрагментом. Тем не менее примеры подобного превращения в описании указанного изобретения отсутствуют.

Как правило, активированные ПЭГ-агенты взаимодействуют со свободными аминогруппами полипептидов с образованием смеси позиционных изомеров, число которых не превышает количества свободных аминогрупп в протеине. Известно, что позиционные изомеры модифицированных протеинов имеют различную биологическую активность (И8 2004/0223950, опубл. 11.11. 2004). Это создаёт предпосылки для расширения арсенала таких средств за счёт различных вариантов модифицирования молекул. Например, изменение положений и способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров, а также получить новые типы конъюгатов, в которых, например, не затронуты аминогруппы полипептидов.

Применение активированных ПЭГ-агентов, содержащих в молекуле фрагмент парафенилендиазония, для модифицирования физиологически активного полипептида, в частности инсулина, раскрыто в публикации И8 4179337 (опубл. 18.12.1979). Получаемый таким образом модифицированный полипептид, в частности инсулин, имеет строение аминоазопроизводного формулы

где В представляет РЕ6-О-СН₂-, РЕ6-О-СН₂-СН(ОН)-СН₂-О- или РЕ6-0-С(=0)-, а представляет пептидную цепь. Недостатком таких производных является их невысокая стабильность в организме и связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности диазосоединений.

Наиболее близким по технической сущности рассматривается способ получения физиологически активной водорастворимой полипептидной композиции из полипептида, изначально обладающего физиологической активностью, раскрытый в ϋδ 4179337. Указанный способ включает стадии: (а) взаимодействия по меньшей мере одного концевого атома углерода, несущего гидроксигруппу, по существу, линейного полимера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, имеющего молекулярную массу от 500 до 20000 Да, где полимер является незамещённым или замещённым алкильными группами, имеющими менее 5 атомов углерода, с сочетающимся агентом с образованием активированного полимера, содержащего реакционноспособную концевую группу, и (Ь) взаимодействие физиологически активного полипептида с от 10 до 100 молями указанного активированного полимера путём сочетания полипептида с реакционноспособной концевой группой полимера с образованием физиологически активной водорастворимой полипептидной композиции.

В частности, на стадии (а) паранитробензилхлорид вводят в реакцию с гликолем (подходящим является ПЭГ с молекулярной массой 500-20 000 Да) в присутствии щёлочи в безводной среде, например в среде тетрагидрофурана, с получением паранитробензилового эфира ПЭГ, который затем восстанавливают до соответствующего амина. В случае простых бензиловых эфиров ПЭГ восстановление нитрогруппы осуществляют хлоридом титана(111). В случае сложных эфиров требуется проведение каталитического гидрирования водородом во избежание гидролиза сложноэфирной группы. Полученный О-ПЭГпарааминофениловый эфир диазотируют азотистой кислотой в водном растворе при 0°С и сочетают с 0,25% раствором инсулина при 0°С в течение 2 ч; для выделения целевого продукта реакционную смесь подвергают диализу при 5-10°С, что позволяет получить, по существу, неиммуногенный модифицированный полипептид, сохраняющий значительную часть активности исходного пептида.

В свете рассмотренных выше недостатков модифицированных эритропоэтинов, известных из уровня техники, существует потребность в разработке новых соединений и способов их получения.

Сущность изобретения

В результате проведённых исследований авторы неожиданно установили, что монопегилированный эритропоэтин (ЭПО) высокой степени чистоты может быть эффективно получен способом, в соответствии с которым:

а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля ¹ -¹ η где η - целое число в интервале от 455 до 1140, ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в безводном пиридине при температуре от 10 до 40°С и молярном соотношении хлорангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до 1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты

- 2 018116

О

где η принимает указанные выше значения, который выделяют из реакционной массы осаждением С₄-С₈-простым эфиром или С₆-С₈-алканом;

б) нитрогруппу метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью хрома(11) в водной или водно-органической среде с рН от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°С с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты

где η принимает указанные выше значения, который выделяют из реакционной массы осаждением С₄-С₈-простым эфиром или С₆-С₈-алканом;

в) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 10000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита с получением активированного ПЭГ -агента;

г) активированный ПЭГ -агент вводят в реакцию азосочетания с эритропоэтином в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 температуре от 0 до 30°С, по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосотавляющей с получением смеси монопегилированного, дипегилированого и немодифицированного эритропоэтина и блокированного ПЭГ-агента;

д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированого эритропоэтина.

При реализации заявленного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного ЭПО и увеличение времени циркуляции пегилированного ЭПО в кровотоке при низкой токсичности получаемого препарата, сохраняющего большую долю активности свободного ЭПО по сравнению с препаратом известного уровня техники Мирцера.

Повышение выхода пегилированного ЭПО является следствием повышения общего выхода активированного пегилирующего агента за счёт получения промежуточного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты с количественным выходом и промежуточного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с выходом 90-100%.

Увеличение времени циркуляции пегилированного ЭПО в кровотоке достигается за счёт способности его тирозиновых и гистидиновых звеньев вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных ЭПО.

В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) ацилирование проводят при комнатной температуре и для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир.

В другом предпочтительном варианте изобретения на стадии б) для создания и поддержания рН применяют ацетатный буферный раствор, в качестве восстановителя применяют Ст§0₄, а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир.

В ещё одном предпочтительном варианте изобретения на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии НС1 в тетрагидрофуране.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии г) поддерживают рН реакционной смеси равным 9,5±0,3, степень превращения эритропоэтина составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют тирозин.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии г) поддерживают рН реакционной смеси 7,0±0,3, степень превращения эритропоэтина составляет 70-75%, а в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют гистидин.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М ЫаС1.

В качестве хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты может быть использован любой из

- 3 018116 орто-, мета- или параизомеров. Предпочтительны мета- и параизомеры, наиболее предпочтительны параизомеры (хлорангидрид или бромангидрид 4-нитробензойной кислоты).

Ацилирование свободной гидроксильной группы монометоксиполиэтиленгликоля хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты проводят в безводном пиридине при температуре от 10 до 40°С. Молярное соотношение хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1:1 до 10:1.

Продукт реакции выделяют из раствора либо предварительным упариванием пиридина и растиранием остатка с С₄-С₈-простым эфиром, таким как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метилтретбутиловый эфир, либо осаждением из раствора в пиридине С₄-С₈-простым эфиром, таким как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метилтрет-бутиловый эфир или алканом, таким как пентан, гексан, гептан, петролейный эфир. В качестве простого эфира наиболее предпочтителен диэтиловый эфир, а в качестве алкана наиболее предпочтителен гексан или петролейный эфир.

Восстановление монометоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты в монометоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты осуществляют солями титана(Ш), ванадия(П) или хрома(П), наиболее предпочтительно солями хрома(П) в водной среде при рН от 1,0 до 6,5. Для создания и поддержания рН водной среды применяют органические кислоты, например уксусную, лимонную или винную кислоты, или неорганические кислоты, например хлористо-водородную, бромистоводородную или серную кислоты, а также смеси органических и/или неорганических кислот. Предпочтительно применение буферных растворов с рН от 1,0 до 6,5, более предпочтительно с рН от 4 до 6. Примерами таких растворов являются ацетатные, цитратные или тартратные буферные растворы. В качестве восстановителей применяют ацетат, хлорид, бромид или сульфат хрома(П). Предпочтительно применение ацетата, хлорида или сульфата хрома(П), более предпочтительно применение сульфата или ацетата хрома(П).

Для обеспечения полноты протекания реакции восстановления необходимо, чтобы по её завершении наблюдался небольшой избыток восстановителя, наиболее предпочтительно соли хрома(П). Завершение восстановления нитросоединения можно определить визуально по наличию характерного окрашивания реакционной массы, не исчезающего по меньшей мере в течение 5 мин после добавления восстановителя.

Оттенок зависит, в частности, от природы восстановителя и реагента, обеспечивающего поддержание кислотности реакционной массы, что известно среднему специалисту в данной области. Например, при использовании ацетатного буферного раствора избыток хрома(П) в начале реакции обусловливает карминово-красную окраску реакционной массы, переходящую в процессе восстановления в краснофиолетовую и затем, в случае доступа кислорода воздуха, в фиолетовую.

В сернокислой среде избыток хрома(П) обусловливает голубую окраску, переходящую в процессе восстановления в зеленовато-голубую и затем, в случае доступа кислорода воздуха, в изумрудную, медленно переходящую в фиолетовую.

Альтернативно, избыток соли хрома(П) можно определить качественной реакцией с резоруфином

дающей фиолетовое окрашивание. Условия проведения реакции известны среднему специалисту в данной области, например, из публикации Абатек 1., ΒιιζίοΚα Е. // М1ктосйеш. Ас1а. 1969. р. 764.

Необходимые для проведения восстановления соли хрома(11) получают либо растворением металлического хрома в соответствующих кислотах, либо восстановлением соединений хрома (VI) и/или хрома (III) металлическим цинком или амальгамами цинка или свинца, предпочтительно металлическим цинком, более предпочтительно цинковой пылью. Во избежание окисления хрома(П) полученный раствор сохраняют над несколькими гранулами металлического цинка под слоем несмешивающегося с водой органического растворителя, например петролейного эфира, бензина, керосина, гексана, бензола, толуола или их смесью, предпочтительно бензина, керосина, петролейного эфира или гексана, более предпочтительно петролейного эфира.

Полученный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты экстрагируют из водного раствора галогенированным органическим растворителем, таким как хлороформ, метиленхлорид, дихлорэтан или их смесь с последующим осаждением С4-С8-простым эфиром или алканом.

Диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водноорганической среде при температуре от -2 до 30°С. Наиболее предпочтительно температура диазотирования в водной среде находится в пределах от 0 до 5°С. Кислую среду в данном варианте создают с помощью органических кислот, например уксусной или лимонной, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому

- 4 018116 эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1.

Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты.

Альтернативно, указанную реакцию проводят действием на аминосоединение органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С. Наиболее предпочтительно температура диазотирования в органической среде находится в интервале от -20 до 0°С. Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно трет-бутилнитрит. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1.

Кислую среду при использовании полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, создают растворами НС1 или НВг в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1.

По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде или не более 24 ч в полярной органической среде. Термин пониженная температура означает температуру от -2 до 5°С в случае применения водной или водно-органической среды и от -40 до 0°С в случае применения полярной органической среды.

Перед применением активированного ПЭГ -агента для пегилирования ЭПО требуется удаление избытка нитрит-ионов, для чего применяют мочевину или сульфаминовую кислоту. Альтернативно применяют азиды щелочных или щелочно-земельных металлов.

Пегилирование ЭПО осуществляют, проводя реакцию азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с ЭПО в слабокислой, нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0 до 30°С.

Интервал рН при пегилировании выбирают в зависимости от предпочтительных положений присоединения ПЭГ-агента к ЭПО. В слабокислой и нейтральной среде (рН 6,0-8,0) пегилирование преимущественно идет по аминокислотным остаткам гистидина. В данном варианте предпочтительно устанавливать и стабилизировать рН, применяя фосфатный, ацетатный или цитратный буферный раствор. В слабощелочной среде (рН 8,0-10,0) пегилирование происходит как по аминокислотным остаткам гистидина, так и тирозина. В данном варианте предпочтительно устанавливать и стабилизировать рН, применяя ацетатный, боратный или боратно-карбонатный буферный раствор. Молярное соотношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты к ЭПО составляет от 1:1 до 20:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 8:1.

Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращено-фазовой ВЭЖХ. По достижении степени превращения ЭПО по меньшей мере 70% реакцию пегилирования останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосотавляющей, в качестве которой применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества имеющие природу ароматических аминов или вещества имеющие гетероциклическую природу, у которых гетероцикл способен выступать в качестве азосотавляющей в реакции азосочетания. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин.

Выделение монопегилированного ЭПО из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Концентрацию белка определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя значение А₂₈₀, равное 0,743, для раствора с концентрацией ЭПО 1 мг/мл.

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.

Пример 1. Монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-нитробензойной кислоты (М.м. 30 кДа).

В раствор 30 г (1 ммоль) монометоксиполиэтиленгликоля (М.м. 30 кДа) в 70 мл безводного пиридина вносят 1,9 г (10 ммоль) 4-нитробензоилхлорида и перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Далее реакционную массу упаривают на роторном испарителе до половины первоначального объема и продукт реакции осаждают добавлением пятикратного объема диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают под вакуумом, промывают несколько раз диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. Выход 30 г (100%).

Пример 2. Монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа).

А) Приготовление раствора сульфата хрома(11).

К 100 мл 5% раствора К₂Сг₂О₇- в 20% Н₂§0₄ порциями около 0,5 г вносят цинковую пыль до приобретения реакционной массой зеленого цвета, после чего к реакционной массе приливают 30 мл петролейного эфира и продолжают вносить цинковую пыль до приобретения реакционной массой синей окраски. В процессе восстановления следят, чтобы среда оставалась кислой. Раствору дают отстояться, после

- 5 018116 чего переливают в сосуд для хранения, прибавляют несколько гранул металлического цинка и если требуется еще петролейного эфира, снабжают гидрозатвором и оставляют на ночь. На следующий день темно-синий раствор сульфата хрома (II) Ст§0₄ полностью готов к применению в качестве восстановителя и остается пригодным для этого в течение примерно 1 месяца.

Б) Восстановление монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-нитробензойной кислоты.

К раствору 3,0 г (0,1 ммоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-нитробензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученного в соответствии с примером 1, в 20 мл ацетатного буфера с рН 6 приливают избыток сульфата хрома(11), реакционная смесь тут же приобретает карминово-красный цвет, сосуд плотно закрывают крышкой и перемешивают 5 мин, при этом красный оттенок должен сохраниться. Далее водную фазу пятикратно экстрагируют равными порциями метиленхлорида (около 30 мл каждая). Органические экстракты объединяют и упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 40°С до 1/5 от первоначального объема, после чего полученный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4аминобензойной кислоты осаждают диэтиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. Выход 2,8 г (93%).

Пример 3. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа).

К охлажденному до 1°С раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученного в соответствии с примером 2, в 1 мл 0,1 М НВг приливают 1 мл охлажденного 0,01 М ΝαΝΟ₂ и выдерживают в ледяной бане 20 мин, после чего приливают 1 мл 0,01 М ΝΗ₂8Ο₃Η и сразу же используют для пегилирования или хранят в холодильнике не более 2 ч.

ЭСП (вода, рН 4) λ, нм (1д ε) : 203 (4,86), 256 (4,51), 275 (4,43, плечо).

Пример 4. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа).

К охлажденному до -35°С раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученного в соответствии с примером 2, в 0,5 мл 0,2 М раствора НС1 в тетрагидрофуране приливают 0,5 мл 0,01 М трет-бутилнитрита в тетрагидрофуране и оставляют при -35°С не менее чем на 30 мин (но не более чем на 24 ч), после чего прибавляют 0,5 мл 0,01 М ΝΗ₂8Ο₃Η и сразу же используют для пегилирования.

Пример 5. Получение монопегилированного ЭПО в слабощелочной среде.

К охлажденному до 3°С раствору 10 мг (0,5 мкмоль) ЭПО в боратно-карбонатном буфере с рН 9,5 приливают охлажденный раствор 0,077 г (2,5 мкмоль) диазотированного монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученный в соответствии с примером 3 или 4, поддерживая рН реакционной смеси 9,5±0,3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 3 ч, контролируя протекание превращений обращено-фазовой ВЭЖХ (колонка Ктошавй 300-5С4, 250x4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ до 80% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ). По достижении степени превращения ЭПО, равной 80-85%, приливают раствор тирозина, перемешивают 5 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного ЭПО, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1.0 М №С1. Выход очищенного монопегилированного ЭПО 4,2 мг (42%, считая на ЭПО).

Пример 6. Получение монопегилированного ЭПО в нейтральной среде.

К охлажденному до 1°С раствору 10 мг (0,5 мкмоль) ЭПО в фосфатном буфере с рН 7,0 приливают охлажденный раствор 0,077 г (2,5 мкмоль) диазотированного монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученный в соответствии с примером 3 или 4, поддерживая рН реакционной смеси 7,0±0,3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 5 ч, контролируя протекание превращений обращено-фазовой ВЭЖХ (колонка КтошавИ 300-5С4, 250x4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2 % ТФУ до 80% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ). По достижении степени превращения ЭПО, равной 70-75%, приливают раствор гистидина, перемешивают 5 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного ЭПО, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1.0 М №С1. Выход очищенного монопегилированного ЭПО 3,8 мг (38%, считая на ЭПО).

Пример 7. Исследование токсичности ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином.

Самцам мышей линии СВА вводят конъюгат полиэтиленгликоля с эритропоэтином в интервале доз от 50 до 500 МЕ/кг. Животных ежедневно в течение 5 дней подсчитывают, осматривают и собирают кровь на анализ. На пятый день животных умерщвляют для изучения состояния внутренних органов.

- 6 018116

За время исследования летальные исходы не отмечены. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии значимых изменений гематологических и биохимических показателей крови, а также патологических изменений во внутренних органах мышей. По результатам исследований конъюгат, полученный способом в соответствии с изобретением, является нетоксичным для человека при разовом введении в дозе до 500 МЕ/кг.

Пример 8. Исследование фармакокинетики ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином.

Самцам мышей линии СВА внутримышечно вводили по 1 мкг конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином, после чего собирали кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. Взятые пробы крови инкубировали в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяли тромб и повторно инкубировали при 4°С, полученную сыворотку центрифугировали и сохраняли при -65°С до проведения тестов. Содержание полиэтиленгликоля с эритропоэтином в образцах сыворотки крови определяли иммуно-ферментным анализом Вюшепса ЕРО ЕЫ8А (Вюшепса, США). Полученные сравнительные данные по фармакокинетике свободного ЭПО, препарата Мирцера и конъюгата, полученного способом в соответствии с изобретением, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Фармакокинетика свободного ЭПО, препарата Мирцера и конъюгата, полученного способом в соответствии с изобретением

День	Концентрации в сыворотке крови, МЕ/мл
свободного ЭПО	препарата «Мирцера»	конъюгата
1	2850	900	850
2	2800	1500	1200
3	2404	2911	3300
4	1814	3713	4050
5	901	3600	4100
6	536	3424	3820
7	200	3000	3100
8	10	2000	1700
9	НПО	1200	1300
10	НПО	700	850

нпо - ниже предела определения иммуно-ферментным анализом.

Пример 9. Исследование специфической активности ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином.

Специфическую активность конъюгата полиэтиленгликоля с эритропоэтином оценивают по увеличению количества эритроцитов после его парентерального введения нормоцитемическим мышам линии В_&Э₂Т₁, возрастом от 7 до 15 недель. Животным вводят ранжированные дозы, вызывающие измеряемое увеличению числа ретикулоцитов. Подсчет количества ретикулоцитов в цельной крови осуществляют методом микрофлуориметрии в проточном цитометре. Активность исследуемых образцов ίη νίνο рассчитывают методом параллельных линий по сравнению с биологической активностью стандартного образца. Показатели биологической активности приведены в табл. 2.

Таблица 2. Биологическая активность свободного ЭПО, препарата Мирцера и конъюгата, полученного способом в соответствии с изобретением

Препарат	Удельная активность, МЕ/мг	% активности
Свободный ЭПО	100-103	100
Конъюгат	17-Ю3	24
«Мирцера»		14

Данные исследований показывают, что конъюгат, полученный способом в соответствии с изобретением, сохраняет значительную часть биологической активности немодифицированного ЭПО и превосходит по активности препарата Мирцера.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, отличающийся тем, что:

   а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля где η - целое число в интервале от 455 до 1140, ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в безводном пиридине при температуре от 10 до 40°С и молярном соотношении хлорангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до 1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты где η принимает указанные выше значения, который выделяют из реакционной массы осаждением С₄-С₈-простым эфиром или С₆-С₈-алканом;

   б) нитрогруппу метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью хрома(11) в водной или водно-органической среде с рН от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°С с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты где η принимает указанные выше значения, который выделяют из реакционной массы осаждением С₄-С₈-простым эфиром или С₆-С₈-алканом;

   в) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 10000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита с получением активированного ПЭГ-агента;

   г) активированный ПЭГ -агент вводят в реакцию азосочетания с эритропоэтином в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30°С, по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси монопегилированного, дипегилированного и немодифицированного эритропоэтина и блокированного ПЭГ-агента;

   д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированного эритропоэтина.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии а) ацилирование проводят при комнатной температуре и для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир.
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на стадии б) для создания и поддержания рН применяют ацетатный буферный раствор, в качестве восстановителя применяют Сг§0₄, а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой.
5. 5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии НС1 в тетрагидрофуране.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на стадии г) поддерживают рН реакционной смеси равным 9,5±0,3, степень превращения эритропоэтина составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин.
7. 7. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на стадии г) поддерживают рН реакционной смеси 7,0±0,3, степень превращения эритропоэтина составляет 70-75%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют гистидин.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что на стадии д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М ИаС1.