EA032383B1 - Новый сульфат декстрана - Google Patents

Abstract

Сульфат декстрана, который характеризуется среднечисленной молекулярной массой, Mn, определяемой с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса, ЯМР, в пределах интервала от 1850 до 2000 Да; средним количеством сульфата на остаток глюкозы в пределах интервала от 2,6 до 2,7 и средней степенью сульфатирования положения С2 в остатках глюкозы указанного сульфата декстрана, которая составляет по меньшей мере 95%, или его фармацевтически приемлемая соль натрия. Сульфат декстрана имеет улучшенные биологические эффекты и/или уменьшенную токсичность по сравнению с аналогичными молекулами сульфата декстрана, доступными на рынке. Также изобретение относится к применению указанного сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия в качестве лекарственного средства.

Description

Изобретение относится к сульфату декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия и, в частности, к новому сульфату декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия, имеющему улучшенный биологический эффект и низкую токсичность, а также к применению указанного сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия в качестве лекарственного средства.

Уровень техники

Декстран представляет собой сложный разветвленный глюкан, т.е. полисахарид, образованный из остатков глюкозы, состоящий из цепей различной длины, обычно от одного или нескольких тысяч до нескольких сотен тысяч Дальтон (Да).

Прямая цепь декстрана состоит из α-1,6 гликозидных связей между остатками глюкозы, в то время как ветви начинаются, как правило, с α-1,3 связей. Декстран синтезируют из сахарозы с помощью некоторых молочнокислых бактерий, таких как Ьеисоио81ос тс5сп1сгснбс5. §1гср1ососси8 тн1ан5 и ЬасГоЬасй1ц§ ЬгСУ18.

Сульфат декстрана представляет собой полианионное производное декстрана, в котором некоторые из С₂-С₄ и С₁ и С₆ положений концевых групп сульфатированы. Сульфат декстрана известен в течение десятилетий и, в частности, в качестве потенциальной замены гепарина в антикоагулянтной терапии.

Молекулы сульфата декстрана доступны в различных молекулярных массах, различных уровнях разветвления и различных содержаниях сульфатов и паттернах сульфатирования. Эти физические и химические различия между молекулами сульфата декстрана вызывают различные биологические и токсические эффекты.

Существует потребность в сульфате декстрана, обладающего улучшенными биологическими эффектами, в то же время не токсичного в фармацевтически релевантных дозах.

Краткое описание сущности изобретения

Основной задачей является обеспечение сульфата декстрана, обладающего улучшенными биологическими эффектами, в то же время не токсичного в фармацевтически релевантных дозах.

Эта и другие задачи удовлетворяются вариантами реализации изобретения, как описано в настоящем документе.

Аспект вариантов реализации изобретения относится к сульфату декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия, имеющему среднечисленную молекулярную массу (МД что измеряют с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в интервале от 1850 до 2000 Да. Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия также имеют среднее количество сульфатов на остаток глюкозы в пределах интервала от 2,6 до 2,7. Более того, средняя степень сульфирования положения С2 в остатках глюкозы сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия составляет по меньшей мере 95%.

Сульфат декстрана по вариантам реализации изобретения имеет улучшенные биологические эффекты и/или уменьшенную токсичность по сравнению с аналогичными молекулами сульфата декстрана, доступными на рынке.

Краткое описание графических материалов

Варианты реализации изобретения, вместе с дополнительными объектами и преимуществами, лучше всего могут быть понятыми, ссылаясь на следующее описание, взятое вместе с прилагаемыми графическими материалами, в которых показано следующее.

Фиг. 1 представляет собой детализацию ЯМР спектра 1Ό ¹Н исходного материала декстрана, сфокусированную на области с сигналами декстрана.

Фиг. 2 представляет собой сравнение ЯМР спектров 1Ό ¹Н исходного материала декстрана и сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения (партия № 3).

Фиг. 3 иллюстрирует 2Ό ¹³С-^!Н Н8СС спектр сульфата декстрана по вариантам реализации изобретения (партия № 1) при 25°С, наложенный на соответствующий спектр исходного материала сульфата декстрана.

Фиг. 4 иллюстрирует ЯМР спектр 1Ό ¹Н сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения (партия № 3) при 25°С.

Фиг. 5 иллюстрирует 2Ό ¹³С-^!Н Н8СС спектр сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения (партия № 3) при 25°С. Каждый пик соответствует связи С-Н с различным химическим окружением. Площади пиков примерно пропорциональны заселенности каждой связи С-Н.

Фиг. 6 иллюстрирует сравнение области спектра 1Ό ¹Н ЯМР сульфата декстрана в случае молекул сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения (сверху - партия № 1, посередине - партия № 2, снизу - партия № 3).

Фиг. 7 иллюстрирует 2Ό ¹³С-^!Н Н8СС спектр сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения (партия № 3) при 25°С.

Фиг. 8 иллюстрирует эффекты сульфата декстрана на белые кровяные тельца в периферической крови. Животных лечили однократной в/в инъекцией сульфата декстрана различных средних молекулярных масс в дозах 50 мг/кг. Забуференный физиологический раствор (ЫаС1) применяют в качестве кон

- 1 032383 троля растворителем. Некоторых животных усыпляли с применением успокоительного средства с помощью пента-натриевого барбитала (ΡΝΒ) вместо изофлурана для сравнения эффектов различных способов анестезии. Столбики ошибок демонстрируют стандартную ошибку среднего (СОС). ΐ-Критерий Стьюдента применяют для оценки статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).

Фиг. 9 иллюстрирует эффективность сульфата декстрана при мобилизации гемопоэтических клеток-предшественников в периферической крови. Животных лечили однократной в/в инъекцией сульфата декстрана различных средних молекулярных масс или с носителем (Ν;·ιΟ1). Столбики ошибок демонстрируют СОС. ΐ-Критерий Стьюдента применяют для оценки статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой (* р<0,05).

Фиг. 10 иллюстрирует эффективность сульфата декстрана при повышении уровней ФРГ в периферической крови. Животных лечили однократной в/в инъекцией сульфата декстрана различных средних молекулярных масс или с носителем (ЯаС1). Столбики ошибок демонстрируют СОС. ΐ-Критерий Стьюдента применяют для оценки статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой (*** р<0,001).

Фиг. 11 иллюстрирует эффекты введенного сульфата декстрана 5 Н§ (30,0 мг/кг), сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения (партия № 3, 30 мг/кг) и носителя на совокупный индекс заболеваемости.

Фиг. 12 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую производственный процесс получения сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения.

Фиг. 13 иллюстрирует спектр 1Ό ¹Н ЯМР сульфата декстрана в соответствии с известным уровнем техники.

Фиг. 14 иллюстрирует 2Ό ¹³С-^!Н НЗЦС спектр сульфата декстрана в соответствии с известным уровнем техники.

Подробное описание изобретения

Настоящие варианты реализации изобретения, как правило, относятся к сульфату декстрана и, в частности, к новому сульфату декстрана, имеющему улучшенный биологический эффект и низкую токсичность.

Настоящие варианты реализации изобретения основаны на неожиданном открытии, что молекулы сульфат декстрана имеют существенно различающиеся биологические эффекты, хотя молекулы сульфата декстрана имеют довольно похожие химические и физические свойства. Сульфат декстрана, таким образом, был изготовлен с такими среднечисленной молекулярной массой, содержанием сульфата и структурой, которые приводят к улучшенным биологическим эффектам и низкой токсичности по сравнению с аналогичными молекулами сульфат-декстрана, доступными на рынке.

Традиционно, молекулы сульфата декстрана были исследованы с учетом молекулярно-весовых параметров с применением эксклюзионной хроматографии (ЭХ), такой как эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или эксклюзионная ВЭЖХ, для краткости. В данной области техники ЭХ также известна как гель-фильтрационная хроматография, гельпроникающая хроматография (ГПХ) или хроматография на молекулярных ситах. Другими общими технологиями, применяемыми для измерения молекулярно-весовых параметров сульфата декстрана и родственных глюканов, являются светорассеивание, такое как статическое светорассеивание (ССР) или технологии, основанные на вязкости.

Однако эти технологии определения молекулярно-весовых параметров сульфата декстрана сообщают скорее о молекулярном объеме и функции формы, чем о его молекулярной массе. Это означает, что если молекулы сульфата декстрана образуют агрегаты или комплексы во время измерений, то определяется более высокая средняя молекулярная масса.

Более того, на среднюю молекулярную массу молекулы сульфата декстрана влияют несколько факторов и настроек, применяемых в измерении, таких как выбор хроматографической колонки и элюента, параметры расхода, способ калибровки, в том числе стандартный образец декстрана, применяемый в методике калибровки, заряд сульфата декстрана и т.п.

Кроме того, косвенные способы скорее сообщают о молекулярном объеме и форме, что может существенно отличаться не только от партии к партии, но также от образца к образцу в пределах одной партии, в зависимости, например, от того, каким образом хранили сульфат декстрана перед измерением и т.д.

Более точная технология была применена для определения молекулярно-весовых параметров сульфата декстрана, которая дает истинные молекулярно-весовые параметры, а не зависящие от размера параметры. Эту технологию дополнительно сравнивают с традиционными применяемыми технологиями, упомянутыми выше.

Чтобы иметь возможность прямого сравнения значений молекулярной массы/размера различными способами, важно понять часто применяемые определения молекулярного размера, как указано ниже. Параметр Ν₁ показывает количество молекул сульфата декстрана, имеющих молекулярную массу М₁, в образце или партии.

- 2 032383

Среднечисленную молекулярную массу ^ΣΛί' обычно получают с помощью анализов концевой группы, например, спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или хроматографии. Если предполагают нормальное распределение, то по обе стороны от М_п возможно найти то же самое количество молекул сульфата декстрана, т.е. количество молекул сульфата декстрана в образце, имеющем молекулярную массу ниже М_п, эквивалентно количеству молекул сульфата декстрана в образце, имеющем молекулярную массу выше М_п.

ιινινν/·

Среднемассовая молекулярная масса Σ^ιΝι типична для способов, чувствительных скорее к молекулярному размеру, чем к численному значению, например, светорассеиванию и способам ЭХ. Если предполагают нормальное распределение, то одна и та же масса находится по обе стороны от М„, т.е. общая масса молекул сульфата декстрана в образце, имеющем молекулярную массу ниже М„, является эквивалентной общей массе молекулы сульфата декстрана в образце, имеющем молекулярную массу выше М„.

Средние или усредненные по величине молекулярные массы ’ типичны для способов измерения движения молекул как способ диффузии или седиментации. Как правило, более чувствительны к полимерам с высокой молекулярной массой. В частности, п=0 дает М_п, а п=1 дает М„.

Коэффициент полидисперсности (КПД) (М„/М_п) общая мера широты распределения молекулярных масс. Величина 1 подразумевает монодисперсный полимер от 1,02 до 1,10 является общим для очень контролируемых синтетических полимеров, от 1,5 до 2 является общими для продуктов цепной реакции, а ~2 является общим для продуктов ступенчатой полимеризации.

Вид распределения молекулярных масс (М_р) представляет молекулярную массу самого высокого пика на хроматограмме жидкостной хроматографии (ЖХ). Часто указывают для узких распределений стандартных полимеров и определяют с помощью ГПХ/ЭХ или светорассеивания.

Аспект вариантов реализации изобретения относится к сульфату декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия, исследованному с помощью среднечисленной молекулярной массы (Мп), которую измеряют с помощью ЯМР-спектроскопии, в пределах интервала от 1850 до 2000 Да. Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия также имеют среднее количество сульфатов на остаток глюкозы в пределах интервала от 2,6 до 2,7, а средняя степень сульфирования положения С2 в остатках глюкозы сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия составляет по меньшей мере 95%.

Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия по вариантам реализации изобретения имеют очень узкий диапазон величин молекулярно-весового параметра, т.е. среднечисленной молекулярной массы (М_п). Эту среднечисленную молекулярную массу (М_п) измеряют с помощью анализа конечной группы методом ЯМР-спектроскопии, как описано далее в настоящем документе. Измерения с помощью ЯМР-спектроскопии дают более последовательные результаты по отношению к определению молекулярно-весового параметра, чем традиционно применяемые способы ГПХ, ЭХ и светорассеивания. Более того, измерения с помощью ЯМР-спектроскопии дают верную или правильную среднечисленную молекулярную массу (Мп) молекул сульфата декстрана, на которые не влияет агрегация или комплексообразование, что является обычной проблемой в традиционно применяемых способах.

В конкретном варианте реализации изобретения сульфат декстрана имеет среднечисленную молекулярную массу (Мп), которую измеряют с помощью ЯМР-спектроскопии, в пределах интервала от 1891 до 1957 Да. В конкретном варианте реализации изобретения сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия (исключая противоионы) имеют среднечисленную молекулярную массу (М_п), которую измеряют с помощью ЯМР-спектроскопии, в пределах интервала от 1850 до 2000 Да.

В конкретном варианте реализации изобретения натриевая соль сульфата декстрана, содержащая противоионы Να', имеет среднечисленную молекулярную массу (М_п), которую измеряют с помощью ЯМР-спектроскопии, в пределах интервала от 2192 до 2276 Да.

В варианте реализации изобретения сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия предпочтительно имеют среднее количество остатков глюкозы в пределах интервала от 4,0 до 6,0. В предпочтительном варианте реализации изобретения сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия имеют среднее количество остатков глюкозы в пределах интервала от 4,5 до 5,5, более предпочтительно в пределах интервала от 5,0 до 5,2, например около 5,1.

В варианте реализации изобретения сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия имеют среднее количество сульфата на глюкозу в пределах интервала от 2,6 до 2,7.

Среднее количество остатков глюкозы в пределах интервала от 4,0 до 6,0 и среднее количество сульфата на остаток глюкозы в пределах интервала от 2,6 до 2,7 приводит к общему количеству атомов сульфатов в сульфате декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия в пределах интервала от 10,4 до 16,2. В варианте реализации изобретения сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия, предпочтительно, имеют общее количество атомов сульфатов в пределах интервала от 11,25 до 15,4, предпочтительно, в пределах интервала от 13,0 до 14,0.

- 3 032383

В общем молекула сульфата декстрана предложенного в вариантах реализации изобретения, имеющая в среднем 5,1 остатков глюкозы и среднее количество сульфата на остаток глюкозы от 2,6 до 2,7, обычно характеризуется среднечисленной молекулярной массой (М_п), которую измеряют с помощью ЯМР-спектроскопии, в пределах интервала от 1850 до 2000 Да.

Формула, приведенная ниже, схематически представляет собой молекулу сульфата декстрана с тремя остатки глюкозы и максимальным количеством атомов серы, т.е. каждый участок или положение в ядре декстрана, которое может быть сульфатировано, в структурной формуле было сульфатировано. Следовательно, неконцевой остаток глюкозы проиллюстрирован как сульфатированный в положениях С2, С3 и С4, а концевой остаток глюкозы со свободным положением С1 сульфатируют в положениях С1, С2, С3 и С4 и концевой остаток глюкозы со свободным положением С6 сульфатируют в положениях С2, С3, С4 и С6.

Средняя степень сульфатирования положения С2 в остатках глюкозы сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия составляет по меньшей мере 95%.

В варианте реализации изобретения среднее количество сульфатов в положениях С2, С3 и С4 в остатках глюкозы сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия составляет от 2,0 до 2,6, предпочтительно в пределах интервала от 2,2 до 2,6, например в пределах интервала от 2,3 до 2,5.

В варианте реализации изобретения средняя степень сульфатирования положения С3 в остатках глюкозы сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия составляет от 80 до 90%, предпочтительно в пределах интервала от 84 до 87%.

Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия предложенные в вариантах реализации изобретения, таким образом, имеют высокую степень сульфатации в положениях С2, С3 и С4 в остатках глюкозы в ядре декстрана. В конкретном варианте реализации изобретения по меньшей мере 70% этих положений сульфатированы и более предпочтительно по меньшей мере 75% этих положений. В конкретном варианте реализации изобретения от 75 до 85% общего количества положений С2, С3 и С4 в ядре декстрана сульфатированы.

В варианте реализации изобретения средняя степень сульфатирования концевой группы С6 составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%.

Концевая группа С1 может принимать α-конфигурацию или β-конфигурацию. В общем между этими двумя конфигурациями концевой группы существует равновесие.

Кажется, что С1 концевой группы легче сульфатируется, если принимает β-конфигурацию, по сравнению с α-конфигурацией. Следовательно, в конкретном варианте реализации изобретения сульфатирование С1 концевой группы является более высоким, когда находится в β-конфигурации, по сравнению с α-конфигурацией. В варианте реализации изобретения средняя степень сульфатирования С1 концевой группы в β-конфигурации составляет по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80% или по меньшей мере 85%. Соответственно, в варианте реализации изобретения средняя степень сульфатирования С1 концевой группы в α-конфигурации предпочтительно составляет по меньшей мере 15%, предпочтительно в пределах интервала от 15 до 75%, более предпочтительно в пределах интервала от 15 до 50%, например в пределах интервала от 15 до 45%.

В варианте реализации изобретения положение С1 концевой группы сульфатировано или связано с -ОН. Следовательно, сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия предпочтительно не имеет любой иной модификации концевой терминальной группы, отличной от сульфатации (-8О3).

Как упоминалось в описании уровня техники, прямая цепь декстрана состоит из α-1,6 гликозидных связей между остатками глюкозы. Молекула декстрана может быть прямой цепью, просто состоящей из остатков глюкозы в неразветвленной цепи. Молекулы декстрана также могут разветвляться, обычно через α-1,3 связи.

В варианте реализации изобретения сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия имеют среднюю степень разветвления остатков глюкозы, которая составляет менее 5,0%, например менее 3,0%, предпочтительно менее 1,5%, например менее 1,0%. Следовательно, сульфат декстрана

- 4 032383 или его фармацевтически приемлемая соль натрия по вариантам реализации изобретения является предпочтительно очень прямой молекулой с несколькими ветвями, если таковые вообще присутствуют.

Конкретный вариант реализации изобретения относится к натриевой соли сульфата декстрана, имеющей среднечисленную молекулярную массу (М_п), которую измеряют с помощью ЯМРспектроскопии, в том числе противоион Να', в пределах интервала от 2192 до 2276 Да. Натриевая соль сульфата декстрана имеет в среднем от 5,0 до 5,2 остатков глюкозы, а среднее количество сульфатов на остаток глюкозы составляет от 2,6 до 2,7. В конкретном варианте реализации изобретения средняя степень сульфирования положения С2 составляет по меньшей мере 95%. Среднее количество сульфата в положениях С2, С3 и С4 в остатках глюкозы составляет более предпочтительно в пределах интервала от 2,2 до 2,6.

Сульфат декстрана, предложенный в вариантах реализации изобретения, имеет улучшенные биологические эффекты и/или более низкую токсичность по сравнению с аналогичными молекулами сульфата декстрана, доступными на рынке, как показано в следующих экспериментах. Эти различия в биологических эффектах и токсичности были весьма неожиданными, учитывая тот факт, что молекулы сульфата декстрана имеют довольно схожие молекулярную массу и параметры сульфатирования. Например, существуют определенные диапазоны величин молекулярных параметров и величин параметров сульфатации, которые придают молекулам сульфата декстрана эти выгодные эффекты по сравнению с другими молекулами сульфата декстрана, имеющими молекулярно-весовые значения и/или значения параметров сульфатации вне определенных интервалов или интервалов предложенных в вариантах реализации изобретения.

Сульфат декстрана получают путем сульфатирования исходного материала декстрана в реакции этерификации. Для получения сульфата декстрана существуют различные способы получения, раскрытые в известном уровне техники. Примеры документов, раскрывающих такие способы получения, включают Ктскейз, Вюсйеш1са1 1оигпа1, 51: 129-133 (1952); патент Швеции № 165090; патенты США № 2715091; 3141014; 3498972 и 4855416. Различные способы получения применяют отличное сульфатирующее средство, например, концентрированную серную кислоту (Н₂8О₄), триоксид серы (8О₃) или хлорсульфоновую кислоту (С18О₃Н); различные растворители, например, пиридин (С₅Н₅Ц), формамид (ΝΗ_;ί.ΌΗ) или ацетамид (СН₃СОПН₂); и различные параметры способа. Эти различия могут влиять на химические и физические свойства конечного продукта сульфата декстрана.

Предпочтительный на данный момент способ получения описан в данном документа ниже со ссылкой на фиг. 12. Сульфат декстрана получают путем сульфатирования исходного материала декстрана. Отделение сульфата декстрана с соответствующей молекулярной массой осуществляют с помощью фракционирования этанолом, в котором сначала осаждаются молекулы с самым большим молекулярным весом.

На первом этапе исходный материал декстран добавляют к растворителю формамиду при перемешивании. Содержимое емкости перемешивают и осторожно нагревают, затем охлаждают, когда смесь переносят в скруббер.

В реакции этерификации хлорсульфоновую кислоту добавляют в течение 5-6 ч при охлаждении с помощью раствора соли. Температуру поддерживают постоянной <34°С и, при необходимости, нагревают с помощью водяного пара под давлением 1 атм. Смесь переносят в другой сосуд посредством скруббера, а затем промывают очищенной водой. Перемешивание проводят до первого осаждения этанолом.

В альтернативном варианте реализации изобретения хлорсульфоновую кислоту добавляют к части формамида в течение примерно 3 ч при охлаждении с помощью раствора соли. Смесь декстрана и оставшегося формамида затем переносят в сосуд, содержащий смесь хлорсульфоновой кислоты и формамида, при поддержании температуры <34°С.

На этапе осаждения этанольно-водную смесь закачивают в смесь сульфата декстрана, которую перемешивают. Смесь оставляют на ночь при охлаждении с помощью раствора соли. На следующий день удаляют верхнюю фазу, супернатант (фазу этанола). Нижнюю фазу промывают этанолом, перемешивают, оставляют выпадать в осадок и удаляют супернатант. Эту методику осуществляют пять раз. Охлаждение достигают с помощью раствора соли и добавляют гидроксид натрия до рН 9,5. После второго и четвертого этапа осаждения осадок растворяют в воде. После третьего этапа осаждения осадок и, возможно, динатрийгидрофосфат и дигидрофосфат натрия, растворяют в воде. Пятый этап осаждения осуществляют с абсолютным этанолом. Смесь сульфата декстрана прокачивают через фильтр в емкость с этанолом, при охлаждении с помощью раствора соли или охлаждающей воды (при приблизительно 10°С). Насос промывают очищенной водой, перемешивают и оставляют для осаждения. Супернатант на основе этанола удаляют в емкость, а к продукту при перемешивании добавляют абсолютный этанол. Смесь охлаждают с помощью охлаждающей водой.

Вышеуказанная методика осаждения в описании является предпочтительной методикой в получении сульфата декстрана в соответствии с вариантами реализации изобретения. Однако возможны варианты методики осаждения, например, уменьшение или увеличение количества этапов осаждения. Хотя этанол является предпочтительным спиртом, применяемым в методике осаждения, могут быть примене

- 5 032383 ны другие спирты, такие как метанол.

На этапе центрифугирования смесь переносят в центрифугу. После центрифугирования центрифугат удаляют. Его помещают в пластиковые контейнеры, выложенные двойными пластиковыми пакетами. Центрифугат растворяют в этаноле. Затем его центрифугируют еще раз, а центрифугат промывают этанолом в центрифуге.

Центрифугат помещают в накрытые фильтром стаканы в БАР 5, а затем стаканы помещают в вакуумный сушильный шкаф. После высушивания порошок сульфата декстрана пропускают через сито 710 мкм в пластиковые контейнеры, выложенные мешками из полиэтилена.

Для получения около 10-13 кг сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения обычно применяют следующие материалы и количества.

Компонент	Формула Количество (кг)
Декстран 1 (РКагтасовтов А/8)	(СбНюОб)п 9,2
Формамид (ΙΙηίνθΓ А/8)	ΝΗ2ΟΟΗ 69,4
Хлорсульфоновая кислота (Мегск-8сОиспагс11)	С180зН 25,8
Гидроксид натрия 27,7% (СОетагк)	№0Н 20,7
Очищенная вода	Н20
Этанол ([Шаг А/8)	С2Н5ОН 135
Дигидрат моногидрофосфата натрия (Мегск)	№2НРО4-2Н2О 0,2493
Дигидрат дигидрофосфата натрия (Мегск)	№Н2РО4-2Н2О 0,2144
Продукт
Натриевая соль сульфата декстрана	(СбНюОб)п-8Оз- №+ -10-13

Основная реакция в синтезе:

ΝΗ₂ΟΟΗ +С180зН θ Η₃Ν⁺ΟΟΗ +С180з^_ (СбНюОб)п + ΝΗ₂ΟΟΗ (СбНюОб)п.. ..νη₂οοη (Η₃Ν⁺ΟΟΗ + С180з) + (СбНюОб)п.. ..ΝΗ2ΟΟΗ -> (СбНюОбКЗОз- + Η3Ν⁺ΟΟΗ +С1(С6НюОб)п-8Оз- + Η₃Ν⁺ΟΟΗ + №⁺0Н- -> (С6НюО6)п ЗОз №⁺ + ΝΗ2ΟΟΗ + №⁺ (Н₂0 + С₂Н₅ОН) (СбНюОб)п-80з №⁺ (СбНюОб)п-8ОзМа⁺ + №₂НРО₄ + №Н₂РО₄ (С₆НюОб)п-8ОзМа⁺ + РОЕ

Другой аспект вариантов реализации изобретения относится к применению сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия, в соответствии с вариантами реализации изобретения в качестве лекарственного средства.

Дополнительный аспект вариантов реализации изобретения относится к применению сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия, в соответствии с вариантами реализации изобретения в случае использования в различных областях медицины, в том числе с целью мобилизации клеток-предшественников и/или стволовых клеток в периферическую кровь субъекта, в том числе мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и/или мезенхимальных стволовых клеток (МСК); с целью мобилизации целевых белых кровяных тельца, в частности, лимфоцитов, в поток крови субъекта; с целью снижения легочного поглощения внутривенно инъектированных клеток у субъекта; с целью индуцирования фактора роста гепатоцитов (ФРГ) у субъекта и в качестве антикоагулянта. Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия в соответствии с вариантами реализации изобретения также пригоден для лечения, ингибирования или профилактики различных демиелинизирующих заболеваний, в том числе демиелинизирующих заболеваний ЦНС, таких как миелинокластические расстройства, например, рассеянный склероз (РС) и болезнь Девика, острый диссеминированный энцефаломиелит (ОДЭМ), лейкодистрофические расстройства, например, невропатии ЦНС, центральный понтинный миелинолиз, миелопатии, лейкоэнцефалопатии и лейкодистрофии и периферические демиелинизирующие заболевания, такие как синдром Гийена-Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия и периферические невропатии.

Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия согласно вариантам реализации изобретения может также быть полезным при лечении, подавлении и/или профилактике мгновенной медиированной кровью воспалительной реакции (ММКВР) и отторжения трансплантата органов, тканей и в имплантатах конкретных клеток, таких как островки Лангерганса.

Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемую соль натрия согласно вариантам реали

- 6 032383 зации изобретения вводят субъекту, предпочтительно, с помощью инъекции и, в частности, с помощью внутривенной (в/в) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или (в/б) внутрибрюшинной инъекции, предпочтительно, в/в или п/к инъекции. Другие пути парентерального введения, которые могут быть применены, включают внутримышечную и внутрисуставную инъекцию.

Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия согласно вариантам реализации изобретения составляют, предпочтительно, в виде водного раствора для инъекций с выбранным растворителем или вспомогательным веществом. Растворитель, преимущественно, является водным растворителем и, в частности, буферным раствором. Не ограничивающим примером такого буферного раствора является буфер лимонной кислоты, такой как буфер моногидрата лимонной кислоты (ЛК) или фосфатный буфер. Например, сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия согласно вариантам реализации изобретения может быть растворен в физиологическом растворе, таком как 0,9% №1С1. а затем необязательно буферизирован с помощью 75 мМ ЛК и доводя рН до 5,9 с применением гидроксида натрия. Также возможны небуферизованные растворы, в том числе водные растворы для инъекций, такие как физиологический раствор, то есть №1С1 (водн.). Более того, другие буферные системы, отличные от ЛК или фосфатного буфера, могут быть применены, если желателен буферный раствор.

Варианты реализации изобретения не ограничиваются инъекциями, а альтернативно могут применяться другие способы введения, в том числе перорально, назально, буккально, ректально, дермально, трахеально, бронхиально или местно. Затем активное соединение, сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия, составляют с подходящим вспомогательным веществом или носителем, которые выбирают на основе конкретного пути введения.

Подходящие диапазоны доз для сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия согласно вариантам реализации изобретения могут варьироваться в зависимости от размера и массы субъекта, состояния, которому подвергается субъект, и других соображений. В частности, для людей возможный диапазон дозировки может составлять от 1 мкг/кг до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно, от 10 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела.

В предпочтительных вариантах реализации изобретения, сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия составляют для введения в дозировке в диапазоне от 0,05 до 50 мг/кг массы тела субъекта, предпочтительно, от 0,1 до 40 мг/кг массы тела субъекта, и, более предпочтительно, от 0,1 до 30 мг/кг или от 0,1 до 15 мг/кг массы тела субъекта.

Введение сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия необязательно должно быть ограничено лечением текущего состояния здоровья, а может альтернативно или дополнительно применяться для профилактики.

Сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия согласно вариантам реализации изобретения может быть введен при однократном введении, например, в виде однократной болюсной инъекции. Эта болюсная доза может быть введена пациенту достаточно быстро, но ее, предпочтительно, вводят в течение времени, таким образом, что раствор сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия вводят пациенту в течение нескольких минут, например, в течение 5-10 мин.

Альтернативно, сульфат декстрана или его фармацевтически приемлемая соль натрия согласно варианту реализации изобретения в течение периода лечения может быть введен многократно, т.е., по меньшей мере, дважды. В общем, при острых заболеваниях продолжительность периода лечения может представлять собой однократное введение, но является предпочтительным в виде нескольких введений в течение периода лечения продолжительностью, например, в неделю, в несколько недель или в месяц. Более длительные периоды лечения до трех месяцев или даже года могут дополнительно улучшить заживление и выздоровление.

Субъект является субъектом-животным, предпочтительно млекопитающим и более предпочтительно человеком.

Эксперименты

Исследование декстрана и сульфата декстрана.

Основная цель исследования - исследовать новый сульфат декстрана и сравнить физические и химические различия между сульфатом декстрана и другими подобными молекулами сульфата декстрана.

ЯМР-спектроскопия.

В выполненных экспериментах ЯМР применяли спектрометр 500 МГц Уапап 1поуа, оборудованный 5 мм датчиком тройного резонанса ¹Н/¹³С/¹⁵И. Следующие типы спектров регистрировали с применением стандартных версий градиентной КС (корреляционной спектроскопии) 1Ό ^!Н, 2Ό ^!Н, СГОВ (спектроскопии гетероядерного одноквантового взаимодействия) ^!Н-¹³С, ГКСНС (гетероядерной корреляционной спектроскопии через несколько связей) 'Н-^|3С и СЯЭОВСК (спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат) 2Ό ¹Н-¹Н с адиабатической циклической блокировкой, соответствующей времени перемешивания 200 миллисекунд. Для регистрирования спектров 1Ό ¹³С применяли спектрометр 400 МГц Уапап 1поуа, оборудованный 5 мм переключаемым датчиком резонанса ¹Н/¹³С (внутренняя катушка ¹³С). Спектры регистрировали при комнатной температуре (25°С). Количественные 1Ό ¹Н ЯМР спектры получали с применением задержки полного затухания между сканированиями в 60

- 7 032383 секунд со временем экспозиции 3 секунды и шириной спектров 14,5 ч./млн. Остаточный сигнал ΗΌΘ соответствовал 4,75 ч./млн по координате ¹Н, в то время как непрямую привязку к химическому сдвигу применяли по координате ¹³С с применением гиромагнитных отношений для ¹³С и ¹Н.

Все ЯМР спектры обрабатывали и анализировали с применением Мез1геКоуа 9.0.0. Обработку спектров 1Ό ¹Н осуществляли с применением уширения лоренцевой линии 1 Гц и коррекции нулевой линии (автоматической функции Ш1л1акег или полиномиальной функции 3 порядка). Интегрирование осуществляли с применением пикового режима Ме81геИоуа спектров 1Ό с применением следующих областей в качестве репортеров для различных структурных элементов:

Область (диапазон ч./млн.) Представляющие интерес атомы в области (пики могут присутствовать или отсутствовать)

6.11.. 5,93 сульфатированная концевая С1 в а-конфигурации

5.63.. 5,50 несульфатированная концевая С1 в α-конфигурации вслед за сульфатированной С2

5.43.. 5,22 неконцевая С1 вслед за концевой С2 + несульфатированная концевая С1 в α-конфигурации вслед за несульфатированной С2

5.17.. 4,87 неконцевая С1 вслед за несульфатированной С2 + сульфатированная концеваяС1 в β-конфигурации

4.70.. 3,54 С2-С6 (обе сульфатированы или несульфатированы)

2Ό спектры ГКСНС подвергали смодулированным синусоидальным квадратичным функциям в обоих координатах и осуществляли интегрирование выбранных прямоугольных спектральных областей, см. фиг. 5.

Диапазон химического сдвига ¹Н Диапазон химического сдвига

13_С

Группа Н1/С1 6,30-4,40 ч./млн.

Сульфатированная Н2/С2, НЗ/СЗ, Н4/С4 4,84 - 3,77 ч./млн.

Н5/С5, Н6/С6 и несульфатированная 4,56 - 3,08 ч./млн.

Н2/С2, НЗ/СЗ, Н4/С4 (2 области) 3,77 - 3,08 ч./млн.

105,2-86,2 ч./млн.

85,4-73,0 ч./млн.

72,6-58,3 ч./млн.

77,8-72,6 ч./млн.

Химические вещества и материалы ЯМР

Название	Код №	Партия	ϋ-чистота	Поставщик
ϋ2Ο	166301000	А0319250	99,8%	Асгоз Огдагнсз, САЗ 7789-20-0
ϋ2Ο	151882-1006	8ΤΒϋ4348ν	99,9%	8|дта АИпсп, СА8 7789-20-0

Ампулы для ЯМР-спектроскопии ШИтаб, диаметр 5 мм, Ζ565229-100ΕΑ, партия 3110.

Валидация экспериментов.

Для оценки эффективности анализа концевой группы на основе ЯМР, эксперименты 1Ό ¹Н ЯМР выполняли на множестве коммерчески доступных стандартных образцов молекулярной массы декстрана с применением набора параметров для полностью количественного анализа (задержки рециркуляции в 60 с). В частности, стандарты декстрана обычно также применяются в качестве стандартных образцов для определения молекулярных размеров сульфата декстрана, поскольку отсутствуют какие либо коммерчески доступные стандартные образцы молекулярных размеров сульфата декстрана.

Бех1гап 81апбагб 1000 (продукт № 31416, Ийка, партия № ВСВМ6794У, номер в реестре СА8 900454-0), полученный от Геиеопо81ое Ме8еп1его14е8; аналитический стандарт для ГПХ, М. 1000 Да.

Бех1гап 81апбагб 5000 (продукт № 31417, Ника, партия № ВСВЬ9398У, номер в реестре СА8 900454-0), полученный от Геиеопо81ое Ме8еп1его1бе8; аналитический стандарт для ГПХ, М. 5000 Да.

□е\1гап 81апбагб 12000 (продукт № 31418, Ника, партия № ВСВЖ032У, номер в реестре СА8 900454-0), полученный от Геиеопо81ое Ме8еп1его14е8; аналитический стандарт для ГПХ, М. 12000 Да.

В табл. 1 ниже сравнивали величины М_п (Да), полученные из измерений с помощью ЯМРспектроскопии, с величинами М_п, полученными от поставщика. В таблице также приведены величины М. и М_р (Да), которые получены от поставщика.

- 8 032383

Таблица 1 Молекулярно-весовые параметры для стандартных образцов декстрана

Стандартный образец декстрана	Мп (ЯМР)	Мп (поставщик)	Мда (поставщик)	кпд	Мр (поставщик)
1000	1055	1010	1270	1,26	1080
5000	2850	3260	5220	1,60	4440
12000	8105	8110	11600	1,43	9890

Существует хорошее согласование между величинами Мп, которые измеряли с помощью ЯМРспектроскопии, с данными, полученными от поставщика. Величины Мп, измеренные с помощью ЯМРспектроскопии, соответствуют 6,4, 17,4 и 49,9 остаткам глюкозы, соответственно, для трех стандартных образцов декстрана.

Исследование ЯМР исходного материала декстрана.

Изучение с помощью ЯМР-спектроскопии проводили на исходном материале декстрана, применяемом для получения сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения.

Декстран (Рйагшасозшоз, 1)ех1гап 1, партия № 345349) получали с помощью фермента декстрансахарозы из Ьеисопо81ое Мезеп1ого1йе8 В512Б.

Образец декстрана для ЯМР получали в И₂О и детально анализировали с помощью ЯМРспектроскопии 2Ό ¹Н/¹³С. Почти полное отнесение химического сдвига ¹Н/¹³С получали из набора ЯМР спектров 2Ό, полученных при 25°С в И₂О, см. табл. 2. Результаты показали, что декстран, по существу, является неразветвленным, т.е. состоит почти исключительно из колец глюкозы, соединенных вместе с помощью а-(1х6)-гликозидных связей. Могли наблюдать а-(1х3)-гликозидное разветвление, подразумевая, что любое такое разветвление составляет менее 0,5%. Более того, данные показывают, что общее разветвление составляет <1%, в том числе α-(1 ^2)-, α-(1χ3)- и а-(1х4)-разветвление.

Таблица 2

Отнесение химического сдвига ¹Н и ¹³С декстрана 1 (25°С, И₂О) ,

		Химические сдвиги (ч./млн.)
Относит ельная интенси вность		1	2	3	4	5	6
Срединный остаток глюкозы (неразветвленный) а(Х6)*2	58%	1Н	4,95	3,55	3,70	3,49	3,89	3,95, 3,74
13С	97,7	71,3	73,2	69,5	70,1	65,5
С1-терминальный остаток глюкозы с β-конфигурацией С1	12%	1Н	4,65	3,23	3,46	3,62	3,50	3,94
13С	96,0	74,0	75,9	74,1	69,4	65,5
С1-терминальный остаток глюкозы с а-конфигурацией С1	8%	1Н	5,21	3,51	3,68	3,49	3,99	3,99, 3,68
13С	92,1	69,9	72,9	69,5	69,9	65,7
Сб-терминальный остаток глюкозы с а-конфигурацией С1	22%	1Н	4,94	3,53	3,69	3,40	3,69	3,83, 3,74
13С	97,6	71,3	71,8	69,4	73,0	60,4
Неопознанная циклическая система	<0,1%	1Н	5,30
13С	99,2

В частности, терминальное кольцо глюкозы со свободным аномерным углеродом (терминальное кольцо С1) существует и в α-конфигурации (42%), и в β-конфигурации (58%), основываясь на наблюдаемых химических сдвигах ¹Н/¹³С. Среднее количество остатков глюкозы в каждой молекуле декстрана определяли как 5,1 остатков глюкозы, с применением интегральных величин различных групп Н1 в спектре 1Ό ¹Н, а среднюю молекулярную массу определяли как 852 Да. Степень разветвления определяли как менее 1%. Фиг. 1 иллюстрирует детализацию спектра 1Ό ¹Н, сфокусированную на области с сигналами декстрана.

Исследование сульфата декстрана с помощью ЯМР.

В настоящем исследовании три партии (партии № 1, 2 и 3) сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения сравнивали с тремя продуктами сульфата декстрана, полученными от ТйВ Сопзийапсу: сульфат декстрана 5 Б8 (продукт № ΌΒ005, партия № 20288, с низким содержанием сульфата, молекулярная масса 5 кДа), сульфат декстрана 5 Н8 (продукт № ΌΒ004, партии № 20281 и 20300, с высоким содержанием сульфата, молекулярная масса 5 кДа) и сульфат декстрана 3 (партия № 20341, с высоким содержанием сульфата, молекулярная масса 3 кДа).

- 9 032383

Образцы для ЯМР/

ΡΝ004-83-01. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 33,91 мг партии № 1 сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения в 500 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-83-02. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 49,80 мг партии № 2 сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения в 500 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-83-03. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 35,45 мг партии № 3 сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения в 500 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-95-01. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 34 мг сульфата декстрана 3 от ΤάΒ СоишИаису АВ (партия № 20341) в 520 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-95-02. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 54,4 мг сульфата декстрана 5 Ь8 от ΤάΒ ОоплШапсу АВ (партия № 20228) в 520 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-33-03. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 54,4 мг сульфата декстрана 5 Н8 от ΤάΒ СопыШапсу АВ (партия № 20281) в 520 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-33-02. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 54,4 мг сульфата декстрана 5 Н8 от ΤάΒ СопыШапсу АВ (партия № 20300) в 520 мкл Ό₂Θ.

Общие комментарии к ЯМР.

Сульфат декстрана состоит из распределения похожих, но не идентичных молекул с различными паттернами сульфата, разветвлением и размерами, а также различиями в конфигурации конечной группы и химии. Это приводит к структурным анализам высокой сложности. ЯМР спектры сульфата декстрана являются комплексными, см. фиг. 2, иллюстрирующую сравнение ЯМР спектров 1Ό ¹Н исходного материала декстрана и сульфата декстрана. По этой причине может оказаться необходимым также применение количественных данных 2Ό спектров, хотя количественные характеристики ЯМР 2Ό обычно являются менее надежными и точными по сравнению с количественными ЯМР технологиями 1Ό ¹Н.

По этой теме существует совсем немного публикаций о ЯМР (Νβνίΐΐβ с1 а1., 1. Ρΐιαηη. 8с1., 80(3): 239244 (1991) и Ειιάλνίβ-ΒαχΙΟΓ с1 а1., 1. Ρΐιαηη. 8ск, 80(7): 655-660 (1991)). В сульфатированной глюкозе, химические сдвиги ¹Н, в общем, сдвинуты в сторону слабого поля (более высокие химические сдвиги) с все большим расстоянием до каждой введенной сульфатной группы. С другой стороны, химические сдвиги ¹³С ведут себя по-разному, а эффект зависит от того, сколько ковалентных связей находится между углеродной и сульфатной(ыми) группой(ами). Химический сдвиг ¹³С углерода увеличивается до 4-10 ч./млн, если сульфат связан с этим углеродом, а если сульфат связан с соседним углеродом, то эффект химического сдвига меньше, но является противоположным. Для сульфатных групп, связанных с углеродом дальше, эффект обычно является минутным. Аналогичные эффекты на химические сдвиги ¹³С ожидали после разветвления. Вкратце, химические сдвиги ¹³С являются более полезными репортерами, поскольку они, в основном, зависят от локальной геометрии, такой как торсионные углы, а также близкие ковалентно связанные типы атомов (обычно от 2 до 4 связей).

Исследование концевой группы.

По сравнению с декстраном, ЯМР спектры сульфата декстрана являются более сложными из-за значительно увеличенного количества сигналов ЯМР, происходящих из различных химических сред для всех комбинаций сульфатированных/несульфатированных концевых групп С2, С3 и С4, а также С1 и С6.

Концевые группы С1 (свободный аномерный углерод) анализировать более легко, чем концевые группы С6, в соответствии со спектральными характеристиками, даже если концевая группа С1 осложнена, например, перекрытием между пиками сульфатированной С1 в β-конфигурации и неконцевой группой С1 без сульфатированной С2. Большой сигнал остаточной воды, расположенный в области С1 спектров 1Н, также усложняет анализ.

Фиг. 3 иллюстрирует 2Ό ¹³С-^!Н НЗЦС спектр сульфата декстрана из партии № 1 при 25°С, наложенный на соответствующий спектр исходного материала декстрана (Декстран 1). Фигура иллюстрирует предварительное отнесение каждой группы Н1/С1 к определенному состоянию сульфатирования. Фигура показывает пики, относящиеся к С1-терминальному остатку глюкозы, и пики, относящиеся к имеющимся в избытке срединным и С6-терминальным кольцам глюкозы. Эффектами, обусловленными возможным сульфатированием С6 в С6-терминальных кольцах глюкозы, пренебрегают.

Фиг. 4 иллюстрирует ЯМР спектр 1Ό ¹Н сульфата декстрана из партии № 3 при 25°С. Эта фигура иллюстрирует предварительное отнесение каждого пика Н1 к определенному состоянию сульфатирования. Фигура показывает пики, относящиеся к С1-терминальному остатку глюкозы, и пики, относящиеся к имеющимся в избытке срединным и С6-терминальным кольца глюкозы. Отнесение является предварительным, в частности, по отношению к сульфатированию С3 и С4, и этими эффектами, связанными с возможным сульфатированием С6 в С6-терминальных кольцах глюкозы, пренебрегают.

Фиг. 6 иллюстрирует сравнение области сульфата декстрана в ЯМР спектрах 1Ό ¹Н сульфата декстрана из партий № 1-3 при 25°С.

Все образцы ΤάΒ, за исключением низкосульфатированного сульфата декстрана, модифицированы по С1-концу. Химические сдвиги ЯМР ¹³С С1 находятся около 74-80 ч./млн. Это показывает, что модификация должна включать замещение гидроксильной группы и что замещающая группа не связана посредством кислорода. Таким образом, эта С1-модификация не может представлять собой сульфат или

- 10 032383 фосфат и не может быть хлором, исходя из химических сдвигов.

Таблица 3

Характеристики концевой группы С1

Образец сульфата декстрана	аконфигурация концевой группы С1	βконфигурация концевой группы С1	Модифицированная концевая группа С1
Сульфат декстрана 3	-	-	>98%
Сульфат декстрана 51_δ	26%	74%	Не наблюдается
Сульфат декстрана 5 Ηδ партия № 20281	-	-	>98%
Сульфат декстрана 5 Ηδ партия № 20300	-	-	>98%
Партия сульфата декстрана № 1	46%	54%	Не наблюдается
Партия сульфата декстрана № 2	49%	51%	Не наблюдается
Партия сульфата декстрана № 3	51%	49%	Не наблюдается

Разветвление.

Данные не исключают, что в образцах сульфата декстрана присутствует разветвление декстрана. Однако если какое-либо подобное разветвление присутствует, оно находится на очень низких уровнях, <1-2%.

Степень сульфатирования и другие химические модификации сульфата декстрана/

Сульфатирование было определено с применением, в первую очередь, данных 2Ό ¹Н-¹³С, Н8РС спектров, Н8рС спектр дополненных данными ЯМР 1Ό ¹Н. Что касается общей степени сульфатирования С2, С3 и С4, оценка может быть получена на основе интегрирования пиков 2Ό в ¹Н-¹³С Н8РС спектре. Оценки средних индивидуальных уровней сульфатов С2 и С3 проводили на основе комбинированных данных 1Ό и 2Ό с пиками С1 в качестве репортеров на этих трех соседях. Сульфатирование С4 может быть не определено, но, используя данные полного сульфатирования С2-С4, средняя степень сульфатирования С4 должна быть значительно ниже, определенно <70%.

Таблица 4

Степень сульфатирования сульфата декстрана

Образец сульфата декстрана	Сульфат ирование С2-С4Т	Индивидуальное сульфатирование	Сульфат ирование концевой группы а-С1	Сульфат ирование концевой группы β- С1	Сульфат ирование концевой группы С6
С2	СЗ	С4
Сульфат декстрана 3	68% (2,0)	89%	Н/О	Н/ 0	Н/О*	Н/О*	83%
Сульфат декстрана 5 ЬС	35% (1,1)	42%	26%	н/ 0	13%	74%	73%
Сульфат декстрана 5 Ηδ партия № 20281 Сульфат декстрана	65% (2,0)	93%	-50%	н/ 0 н/ 0	Н/О*	Н/О*	82%
5 Ηδ партия № 20300	76% (2,3)	>95%ΐ	-50%	Н/О*	Н/О*	Н/О
Партия сульфата декстрана № 1	80% (2,4)	>95%	-86%	н/ 0	41%	>95%	96%
Партия сульфата декстрана № 2	76% (2,3)	>95 %	-85%	н/ 0	16%	93%	89%
Партия сульфата декстрана № 3	79% (2,36)	>95%	-86%	н/ 0	30%	83%	91%

* Не определено из-за модифицированного конца С1.

Т Из-за перекрывания спектров только расчетная величина в качестве точного интегрирования не допускается.

Т Приведено в процентах и общее количество сульфатов на остаток С2-С4.

Помимо изучения сульфатирования С2-С4, характеристика степени сульфатирования концевой группы также описана в табл. 4 выше. В частности, сульфатирование является значительно более высо

- 11 032383 ким, если присутствует концевая группа р-С1, что согласуется с меньшим стерическим препятствием по отношению к сульфату в экваториальном положении.

Обратите внимание, что α- и β-конфигурации находятся в равновесии посредством открытого альдегидного состояния, которое, однако, не всегда легко обнаруживается, но всегда присутствует на очень низких уровнях.

Молекулярная масса и размер.

Все протоколы анализа для различных партий сульфата декстрана рассматривали предоставленную М„ в качестве меры молекулярного размера. Кроме того, данные светорассеивания, см. Приложение, определяли на партиях сульфата декстрана № 1-3, предоставляя М„ и М_п. Текущие данные ЯМР предлагают М_п в качестве выхода, основанного главным образом на анализе концевой группы, то есть соотношения между областями пика концевых групп относительно таковых для срединных групп (области пика ЯМР). Среднее количество остатков глюкозы определяли на исходном материале декстрана и подтверждали полностью в соответствии с данными ЯМР на соответствующей партии сульфата декстрана.

Таблица 5 Характеристики молекулярного размера (Да) образцов сульфата декстрана

Образец сульфата декстрана	Среднее количество остатков глюкозы	Среднее количество сульфатов на остаток глюкозы	Мп (без №+)	Мп (с №+)
Сульфат декстрана 3	3,5	2,3	1223	1406
Сульфат декстрана 5 ЬЗ	5,1	1,3	1378	1531
Сульфат декстрана 5 НЗ партия № 20281	5,1	2,1	1706	1954
Сульфат декстрана 5 НЗ партия № 20300	5,1	2,4	1827	2109
Партия сульфата декстрана № 1	5,1	2,7	1957	2276
Партия сульфата декстрана № 2	5,1	2,6	1891	2192
Партия сульфата декстрана № 3	5,1	2,7	1929	2241

Данные образцов сульфата декстрана (за исключением сульфата декстрана 3) полностью согласуются со средним молекулярным размером ~ 5 остатков глюкозы на молекулу сульфата декстрана.

Т аблица 6

Сравнение данных молекуля	рной массы в Да из различных способов
Образец сульфата декстрана	(протокол анализа)	Мщ (светорассеивание)	Мп (светорассеивание)	Мп (ЯМР)
Сульфат декстранаЗ	3300			1406
Сульфат декстрана 5	3200			1531
Ι_δ Сульфат декстрана 5 Н8	4016			1954
партия № 20281 Сульфат декстрана 5 Н8	4645			2109
партия № 20300 Партия сульфата декстрана № 1	5699	2757	2487	2276
Партия сульфата декстрана № 2	5897	3999	3192	2192
Партия сульфата декстрана № 3	7118	9713	6757	2241

(протокол анализа) получали с применением ЭХ.

- 12 032383

Это большое несоответствие между молекулярно-весовым параметром, определенным с помощью ЯМР, и другими молекулярно-весовыми параметрами, перечисленными в табл. 6, может быть объяснено тем, что молекулярную массу сульфата декстрана обычно определяли с применением более косвенных способов, таких как гель-эксклюзионная/проникающая хроматография, светорассеивание или вязкость. Все эти способы скорее сообщают о молекулярном размере. Это означает, что если молекулы сульфата декстрана образуют различные агрегаты или комплексы, то определяется более высокая средняя молекулярная масса.

Эти косвенные способы скорее сообщают о молекулярном объеме и форме, которые могут существенно отличаться не только от партии к партии, но также от образца к образцу в пределах одной партии, в зависимости, например, от того, как хранился сульфат декстрана перед измерением и т.д.

Углубленное структурное исследование сульфата декстрана.

Далее, на основе тщательного анализа набора данных 1Ό и 2Ό ЯМР, полученных на партии сульфата декстрана № 3, предприняли серьезную попытку понять паттерн сульфатирования при атомном разрешении этого сульфат-декстрана. Учитывая близкое сходство 1Ό ¹Н и 2Ό ¹³С-¹Н Н8ОС спектров сульфата декстрана партий № 1 и 2, результаты, представленные в этом разделе, считали действительными для партий сульфата декстрана согласно вариантам реализации изобретения в целом.

Общая степень сульфатирования и композиция образца.

Начиная с общего вида, ¹³С-'Н Н8ОС спектр позволяет определить относительно точную оценку степени сульфатирования, см. фиг. 7. Партия сульфата декстрана № 3 имеет в среднем 2,4+0,1 сульфатных групп на остаток глюкозы в положениях С2, С3 и С4. Каждый пик на фиг. 7 соответствует связи С-Н с различным химическим окружением. Площади пиков примерно соответствуют заселенности каждой связи С-Н. Наблюдаются три различных области, позволяющие количественно оценить общую степень сульфатирования декстрана. В верхней части соответствующую область спектра 1Ό ¹Н выравнивали.

Применяя среднюю величину в 2,66 сульфата на остатки глюкозы и 5,1 остатков глюкозы, расчетный мас.% серы составляет около 19%, считая, что образец состоит из 100% сульфата декстрана.

Изучение сульфатирования по С2, С3 и С4.

Ввиду сильно перекрывающихся областей, паттерны сульфатирования изучали почти исключительно с применением химических сдвигов ¹Н/¹³С и соответствующих областей пиков групп Н1/С1, расположенных в разных видах остатков глюкозы. Основываясь на отнесениях химического сдвига ¹Н/¹³С декстрана, литературных данных и, не в последнюю очередь, полученных данных 2Ό ЯМР, сигналы Н1/С1 были ориентировочно отнесены к конкретным С1-группам с различным химическим окружением и степенью сульфатирования. Это отнесение проиллюстрировано на фиг. 3 и 4.

Основываясь на отнесениях и измерении пиков 1Ό ¹Н и связанных с ними пиковых интегралов, оказалось, что популяция конфигурации аномерной С1-группы С1-терминальной глюкозы смещена в сторону более равного соотношения 0,49:0,51, для α:β конфигурации предполагая, что средняя длина самого декстрана не изменилась, исходя из химической методики сульфатирования. Свободную группу а-С1 сульфатировали до ~30%, тогда как степень сульфатирования β-Ο1. по оценкам, является значительно более высокой и составляет около 83%.

Что касается определения степени сульфатирования С2, С3 и С4, анализ является наиболее простым в случае С2, которая определенно сильно сульфатирована, >95%, и считая, что соотношение правильно оценено в случае α:β конфигурации С1-терминальной глюкозы, рассчитывали степень сульфатирования в ~99%. С3 сульфатировали до 82% в случае остатков глюкозы С1, вовлеченных в α(1^6) гликозидные связи, т.е. срединных и С6-терминальных колец, а также С1-терминальных остатков глюкозы со свободной С1. В случае С1-терминальных остатков глюкозы с сульфатированной С1, сульфатирование С3 оказывается выше, -86%. Расчет количества сульфатов на С4 более труден, но с учетом общего отношения

2,4 сульфатов на кольцо глюкозы и сульфатирования 99% в случае С2, сульфатирования 82% в случае С3, степень сульфатирования оценивали в ~60%.

ЯМР исследование декстрана и сульфата декстрана от Мейо.

Применяя ранее разработанную 1Ό ¹Н и 2Ό ¹³С-¹Н Н8ОС ЯМР методологию для структурного исследования декстрана и сульфата декстрана, изучали образцы декстрана и сульфата декстрана, полученные от Мейо 8апдуо Со., Ыб.

Образцы для ЯМР.

ΡΝ004-99-04. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 43,4 мг декстрана от Мейо 8аидуо Со., Ыб. (партия № ТЬ-2385) в 520 мкл Ό₂Θ.

ΡΝ004-99-05. Образец для ЯМР получали с помощью растворения 58,7 мг сульфата декстрана 8и1£ит 18 от Мейо 8апдуо Со., Ыб. (партия № N-3188) в 520 мкл Ό₂Θ.

Результаты ЯМР.

Среднее количество остатков глюкозы в декстране определяли как 11,7 с М_п в 1920 Да. М_п сульфата декстрана 8и1£ит 18 определяли в пределах от 4120 до 4200 Да, исключая любой противоион натрий, и в пределах от 4710 до 4790 Да с противоионом натрий. Степень концевой группы С1 в α-конфигурации составляла 59%, а степень разветвления оценивали в 4,8%.

- 13 032383

Степень сульфатирования положений С₂-С₄ определяли в 76% (2,29 сульфатных групп на остаток глюкозы). Степень сульфатирования положения С2 оценивали в 93%. Степень концевой группы С1 в αконфигурации составляла 71%, а степень сульфатирования а-С1 концевых групп составляла 83%. Степень сульфатирования концевой группы С1 в β-конфигурации составляла >90%. Никаких иных химических модификаций концевых групп С1, кроме сульфатирования, не обнаружено.

Сравнения биологических эффектов различных молекул сульфата декстрана

В настоящих исследованиях сравнивали различные биологические эффекты различных молекул сульфата декстрана, показывающие, что сульфат декстрана согласно вариантам реализации изобретения, обладает превосходными биологическими эффектами, одновременно с этим не являясь токсичным.

Сравнение мобилизации гемопоэтических клеток с помощью сульфата декстрана, основываясь на молекулярной массе, с различными средними молекулярными массами.

Животные.

Самочек БВЛ/2О1а мышей (Наг1ап, Голландия) содержали в виварии Иррза1а Цтуегы1у, размещали в стандартных условиях и снабжали продуктами питания и водой аб ИЫ1иш. Применяли животных массой 17-22 г.

План исследования.

Самок ΌΒΑ/2 группировали в четыре группы: 1) носитель (водн. №С1) (п=8), 2) 50 мг/кг сульфата декстрана 3, Ό83, (п=5), 3) 50 мг/кг партии сульфата декстрана № 3 (п=5) и 4) 50 мг/кг сульфата декстрана партии № 3, ΡΝΒ, (п=5). Группу 4) усыпляли с применением успокоительного средства с помощью пента-натриевого барбитала (ΡΝΒ) вместо изофлурана, для оценки, влияет ли изменение протокола анестезии на мобилизацию.

Введение вещества.

Сульфат декстрана согласно вариантам реализации изобретения (партия № 3) и сульфат декстрана 3 (ТбВ Соп8и11апсу, партия № 20341, Ό83) растворяли в 0,9% №С1 (Ггезепшз КаЫ) до 20 мг/мл и отфильтровывали через 20 мкм фильтр для получения стерильного раствора. Животные получали 2,5 мл/кг (около 50 мкл) внутривенно через хвостовую вену.

Гематологический анализ.

Результаты приведены на фиг. 8 и в табл. 7. Сульфат декстрана 3 не выявил каких-либо существенных изменений в БКК и лимфоцитах, в то же время сообщалось о небольшом снижении нейтрофилов.

Таблица 7

Гематологические показатели в периферической крови после введения веществ сульфата декстрана

	Остаток	Носитель	ЭВЗ	ЭВ партия	ЭВ партия
				№3	№ 3 ΡΝΒ
Тромбоциты	109/л	943±40	925±30	950±31	980±11
Гемоглобин	г/л	128±2	128±4	129±3	135±2*
Эритроциты	1012/л	10±0,1	9,6±0,2	9,7±0,2	10,1±0,2*
Гематокрит (ЕЕУ)		0,42±0,005	0,42±0,008	0,43±0,008	0,44±0,01*
СОЭ	фл	44±0,3	44±0	44±0,4	44±0,3
СКГЭ	г/л	308±1	302±6	305±1	304±4
Ретикулоциты	109/л	3±0,4	3±0,4	4±0,6	4±0,4
Лейкоциты (БКК)	109/л	3±0,2	3,0±0,4	10,1±1,0***	8,5±0,7***
Нейтрофилы	109/л	1,0±0,1	0,7±0,Г	1,4±0,2*	0,8±0,2
Эозинофилы	109/л	0,1±0,02	0,1 ±0	0,1 ±0	0,1 ±0
Базофилы	109/л	0,1 ±0	0,1 ±0	0,1 ±0	0,1 ±0
Лимфоциты	109/л	2±0,1	2,2±0,4	8,5±0,9***	7,4±0,7***
Моноциты	109/л	0,05±0,02	0,02±0,02	0,1 ±0	0,06±0,02
Время отбора образца крови после ЭВ	мин.	31±0,3	32±0,4	31±0,2	33±1,4

СОЭ=Средний объем эритроцитов; СКГЭ=средняя концентрация гемоглобина в эритроците Гематологические показатели по сравнению с носителем (ИаС1): * р < 0,05, ** р < 0,01. *** р < 0,001.

Сульфат декстрана 3 не вызывал значительного увеличения количества СГС, как показано на фиг. 9. Партия сульфата декстрана № 3 вызывала значительное увеличение ФРГ, независимо от применения анестезии, тогда как вещество 3 с низкой молекулярной массой не демонстрировало значительного увеличения ФРГ, см. фиг. 10. Представленные в настоящем документе данные демонстрируют, что сульфат декстрана 3 является плохим мобилизующим средством, по сравнению с сульфатом декстрана согласно

- 14 032383 вариантам реализации изобретения. Сульфат декстрана 3 не повышал ФРГ в какой бы то ни было степени больше, чем носитель.

Сравнение профилактической обработки сульфатом декстрана, основываясь на молекулярной массе, при индуцированном МОО_М25 хроническом ЭАЭ.

Целью данного исследования было сравнение эффектов профилактического лечения сульфатом декстрана согласно вариантам реализации изобретения (партия № 3) с сульфатом декстрана 5 Н8 (ТбВ Сопзи11апсу, партия № 20300) при индуцированном МОО_М25 экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ).

Животные.

Все эксперименты на животных проводили в соответствии с инструкциями №1юпа1 ЫзйШе оГ Неа1Ф (ΝΙΗ) по уходу и применению лабораторных животных и утвержденными Ρίηηίδή №1юпа1 Ашша1 Ехрепшеп! Воагб. Всего в эксперименты применяли 90 самок крыс 1)агк АцоиЧ массой 120-170 г, приобретенных в Наг1ап ЕаЬога1опез, Великобритания. Животных содержали при стандартной температуре (22±1°С) и в среде с контролируемым освещением (освещение с 7:00 до 20:00) с доступом аб ИЬбиш к пище (Наг1ап 2016) и воде. Животных группировали следующим образом:

Группа 1:15 крыс с ЭАЭ обрабатывали п/к один раз в день, три раза в неделю носителем (солевым раствором), начиная с 0 дня после инокуляции МОО ЭАЭ, и продолжали в соответствии с графиком дозирования до конечной точки.

Группа 2:15 крыс с ЭАЭ обрабатывали п/к один раз в день, три раза в неделю сульфатом декстрана 5 Н8 (ТбВ Сопзи11апсу, партия № 20300) (30,0 мг/кг), начиная с 0 дня после инокуляции, и продолжали в соответствии с графиком дозирования до конечной точки.

Группа 3: 15 крыс с ЭАЭ обрабатывали п/к один раз в день, три раза в неделю сульфатом декстрана согласно вариантам реализации изобретения (партия № 3) (30,0 мг/кг), начиная с 0 дня после инокуляции, и продолжали в соответствии с графиком дозирования до конечной точки.

Индукция и клиническая оценка ЭАЭ.

ЭАЭ индуцировали введением 100 мкл инокулята внутрикожно у основания хвоста. Инокулят состоял из 20 мкг рекомбинантного МОО_Ы25 Аогб1сВю8йе) в РВ8 (0,01 М), эмульгированного с неполным адъювантом Фрейнда (ΙΕΆ) (8щша Р5506) (1:1), содержащим 200 мкг инактивированных нагреванием туберкулезных микобактерий (штамм Н 37 КА; Ойсо, Детройт, Мичиган).

Клиническое оценивание выполняли каждый день в течение 36 дней изучения, начиная с 0 дня, и продолжали до конечного 35-го дня. Клиническое оценивание выполняли вслепую в ходе исследования и согласно СНтса1 8сопп§ Рппс1р1ез, перечисленным ниже.

Результат Проявления

О Нормальное состояние

0,5 Частичная слабость хвоста

1,0 Полный паралич хвоста (весь хвост тащили за собой)

2,0 Частичная слабость в одной конечности (обычно задняя конечность)

2.5 Полный паралич одной конечности - (в пораженной конечности не сохраняется никакое движение).

3,0 Частичная слабость в обеих задних конечностях

3.5 Полный паралич обеих задних конечностей (отсутствие движения задних конечностей) или частичная слабость в конечностях на одной стороне тела (гемипарез).

Частичная слабость во всех четырех конечностях или полная слабость на одной стороне тела (гемиплегия).

Полный паралич всех четырех конечностей (тетраплегия), агония.

Совокупный индекс заболевания (СИЗ) показывает в качестве совокупного бремени болезни, сумму величин С11шса1 8соге в ходе исследования. Начало заболевания (НЗ) показывает день исследования, когда видимые симптомы ЭАЭ наблюдали впервые (величина С11шса1 8соге >0,5).

Все крысы в исследовании получали сульфат декстрана или соответствующий носитель между днями 0 и 34, в соответствии со следующим графиком дозирования:

Группа 1 получала носитель (раствор соли, 9 мг/мл, Вах1ег), введенный подкожно (п/к), три раза в неделю (Пн-Ср-Пт) между 7:00 и 11:00. Дозировочный объем для носителя составлял 5,0 мл/кг. Введение носителя начинали в день 0 после введения МОО ЭАЭ и продолжали до 32-го или 33-го дня исследования в зависимости от дня недели прививки и дозирования.

Группа 2 получала сульфат декстрана 5 Н8 (ТбВ СопзиНапсу, партия № 20300) с дозой 30,0 мг/кг, введенный подкожно (п/к), три раза в неделю (Пн-Ср-Пт) между 7:00 и 11:00. Дозировочный объем составлял 5,0 мл/кг. Введение начинали в день 0 после введения МОО ЭАЭ и продолжали до 32-го или 33го дня исследования, в зависимости от дня недели прививки и дозирования.

- 15 032383

Группа 3 получала сульфат декстрана согласно вариантам реализации изобретения (партия № 3) с дозой 30,0 мг/кг, введенный подкожно (п/к), три раза в неделю (Пн-Ср-Пт) между 7:00 и 11:00. Дозировочный объем составлял 5,0 мл/кг. Введение начинали в день 0 после введения МОС ЭАЭ и продолжали до 32-го или 33-го дня исследования, в зависимости от дня недели прививки и дозирования.

Сбор ткани и плазмы в конечной точке.

В конечной точке, в день 35, всех крыс глубоко анестезировали с помощью пентобарбитала (МеЬипа1®, 60 мг/мл, Опоп Рйатта). После этого образцы крови собирали с помощью сердечной пункции. Всего 800-1000 мкл крови собирали в микроампулы с Ы-гепарином и центрифугировали 2000\\\С в течение 10 мин при 4°С. Две 200 мкл аликвоты плазмы собирали в две отдельные плазмособирающие матричные полипропиленовые ампулы, замороженные на сухом льду и хранили при -80°С до тех пор, пока они не будут применены для дальнейшего анализа.

Для гистологических образцов крыс транскардиально перфузировали в течение 10 мин холодным гепаринизированным (2,5 МЕ/мл) раствором соли, после чего проводили по крайней мере 10 мин перфузии с холодным 4% параформальдегидом в 0,1 М фосфатном буфере. Мозжечок и остальную часть головного мозга и С- и Т-сегменты спинного мозга (по 1 см каждого) вырезали и фиксировали путем погружения в 4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере при 4°С в течение 24 ч. Затем образцы помещали в 0,01 М РВ8, содержащий 0,001% азида натрия (8щта) в качестве консерванта, хранили при 4°С до возможного применения в гистологическом анализе.

Общий статус здоровья и гуманные конечные точки.

Животных лабораторный персонал наблюдал два раза в день (8:00 и 16:00). В случае, если общее состояние здоровья животного значительно ухудшилось, крысу подвергали эвтаназии с помощью передозировки СО₂ и скручивания шеи. Подвергнутых эвтаназии крыс или крыс, обнаруженных мертвыми, подвергали макроскопическому исследованию как можно скорее после смерти. Когда вскрытие не было немедленным, тушки охлаждали при ~4°С до тех пор, пока не проводили вскрытие в Сйат1е8 Ктует ΌΚ8, Финляндия. Определения приемлемых конечных точек включали: отсутствие спонтанных движений и неспособность пить или есть в течение 24 ч наблюдения, массовое кровотечение, самопроизвольное воспаление, без препарирования, опухания или опухолей.

Конкретные конечные точки модели (ЭАЭ), оправдывающие эвтаназию крысы, включали клинический балл, достигший уровня 4 (частичная слабость во всех конечностях или гемиплегия), рефлекс выпрямления >30 с и снижение массы тела на более чем 25% от исходного уровня.

Статистический анализ.

Все величины представляли как среднее значение ±стандартное отклонение (с.о.) или стандартная ошибка среднего (СОС), а различия считали статистически значимыми на уровне Р<0,05. Статистический анализ осуществляли с применением статистического программного обеспечения 81а1&Э1тес1. Различия между способами анализировали с применением однофакторного дисперсионного анализа, а затем критерия Даннетта (сравнения с группой, обработанной носителем). Непараметрические данные анализировали с помощью дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса (между группами).

Масса тела.

Массу тела крыс контролировали ежедневно, начиная со дня 0, и продолжали до конечной точки в 35 день. Все крысы в группах 2 и 3 в ходе исследования набирали массу, сходную с группой 1, получающей носитель (р> 0,05).

Заболеваемость и выживаемость.

Для всех крыс в исследовании смертность по группам была следующей: группа 1:40% (6/15); группа 2: 20% (4/15) и группа 3: 7% (1/15).

Совокупный индекс заболевания.

Совокупный индекс заболевания (СИЗ) показывает сумму величин С11п1са1 8соге в течение 36 дней; от инокуляции в 0 день до конечного дня 35. Высокая величина индекса представляет собой прогрессирующее заболевание, а низкое значение индекса показывает слабые симптомы.

Эффекты подкожно вводимых соединений сульфата декстрана и носителя на совокупный индекс заболевания представлены на фиг. 11. Существенных различий в совокупном индексе заболевания между животными группы, получающей носитель (группой 1), и группой 2 не было. Тем не менее, обработка сульфатом декстрана в группе 3 снижала средний СИЗ на 31% по сравнению с носителем.

Следовательно, сульфат декстрана, в соответствии с вариантами реализации изобретения (партия № 3), улучшал биологические эффекты по оценке СИЗ, по сравнению с сульфатом декстрана 5 Η8, для субъектов с ЭАЭ.

ЭАЭ - животная модель воспалительных демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Она широко изучается как модель животных демиелинизирующих заболеваний ЦНС человека, в том числе рассеянного склероза (РС) и острого рассеянного энцефаломиелита (ОРЭМ). Следовательно, сульфат декстрана по вариантам реализации изобретения, по-видимому, оказывает благотворное влияние с точки зрения лечения или, по меньшей мере, уменьшения симптомов РС и ОРЭМ.

- 16 032383

Сравнение токсичности молекул сульфата декстрана

Токсичность однократной дозы сульфата декстрана, вводимой с помощью в/в инъекции крысам 8ргадие-1)а\у1еу, оценивали в течение 2 недельного периода наблюдения. Носитель, применяемый в этих экспериментах, представлял собой 75 мМ САМ в 0,9% ЫаС1.

В данном исследовании сульфат декстрана по вариантам реализации изобретения (партия № 3) и сульфат декстрана (Ό8-18), полученный Мейо Бапдуо Со., ЬМ. (партии № N-3188 и N-3190) давали самцам крыс Бргадие 1)а\у1еу путем однократного введения болюса в дозах 70 и 140 мг/кг с периодом наблюдения 14 дней. Исследование включало в общей сложности 7 групп следующим образом; один контроль; Ό8-818, партия № N-3188; Ό8-818 партия № N-3190; и партия сульфата декстрана № 3, см. табл.

8. В каждую дозовую группу включали пять животных, за исключением партии сульфата декстрана № 3, 70 мг/кг, в которую включали 10 животных. Патологическое исследование выполняли на легких у всех животных в исследовании и на отдельных органах в группах, обработанных партией сульфата декстрана № 3 (надпочечники, бедренная кость с костным мозгом, сердце, почки, печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка, тимус и место инъекции).

Таблица 8

План исследования

Группа	1	2	3	4	5	6	7
Доза (мг/кг)	0	70	140	70	140	70	140
Соединение (партия №)	носитель	ϋ8-818 (N-3188)	08-818 (N-3190)	ϋ8 партия № 3
Количество животных	5	5	5	5	5	10	5

В ходе исследования смертей не наблюдали. В день введения дозы (день 1) у животных, получавших сульфат декстрана, отмечали одышку, примерно через 10 мин после введения, во всех группах с определенной связью с дозой. Наибольшая заболеваемость наблюдалась у животных, получавших 140 мг/кг. Тяжесть, наблюдаемая у большинства животных, была незначительной, за исключением тех, кто получал 140 мг/кг Ό8-818, партия N-3188, которые демонстрировали у четырех из пяти животных умеренную одышку. В течение оставшегося периода наблюдения (дни 2-15) у большинства животных, получавших 140 мг/кг Ό8-818, в обеих партиях, наблюдали одышку. Одно животное, получавшее партию сульфата декстрана № 3, демонстрировало одышку в течение дней 6-15.

При гистологическом исследовании наблюдали связанные с лечением изменения у животных, которым вводились исследуемые соединения, в легких, состоявшие из альвеолярного гистиоцитоза и утолщения альвеолярных перегородок/повышенной насыщенности клетками. Повышенную частоту и тяжесть этих изменений отмечали у большинства животных, получавших 140 мг/кг обеих партий исследуемого соединения Ό8-818. Только одно животное из десяти, получавших 70 мг/кг сульфата декстрана партии № 3, показало минимальные изменения, а три из пяти, получавших 140 мг/кг, показали минимальные или умеренные результаты. Помимо легких, в селезенке отмечали незначительное увеличение степени экстрамедуллярного гематопоэза во всех дозовых группах, однако считается, что они имеют сомнительное токсикологическое значение.

Таблица 9

Частота и тяжесть микроскопических изменений в легких обработанных животных

Группа	1	2	3	4	5	6	7
Доза (мг/кг)	0	70	140	70	140	70	140
Соединение (партия №)	носитель	08-818 (N-3188)	08-818 (N-3190)	08 партия № 3
Количество животных	5	5	5	5	5	10	5
Альвеолярный гистиоцитоз легких
-минимальный очаг	0	0	1	2	0	1	2
-минимальный с множеством очагов	0	0	0	1	0	0	0
-слабовыраженный	0	0	3	0	3	0	1
Общая заболеваемость	0	0	4	3	3	1	3
Утолщение альвеолярных перегородок/повышенная насыщенность клетками

- 17 032383

-минимальный очаг	0	0	0	1	0	1	1
-минимальный с множеством очагов	0	0	0	0	0	0	0
-слабовыраженный	0	0	0	0	0	0	0
-умеренный	0	0	3	0	3	0	1
Общая заболеваемость	0	0	3	1	3	1	2
Альвеолярные кровоизлияния
-минимальный очаг	0	0	0	1	0	2	2
-минимальный с множеством очагов	0	0	0	0	1	0	0
-слабовыраженный	0	0	1	0	0	0	0
Общая заболеваемость	0	0	1	1	1	2	2

Из соединений, исследованных в настоящем исследовании, партия №3 сульфата декстрана продемонстрировала менее выраженную легочную токсичность, чем Ό8-18.

ЯМР анализ сульфата декстрана от 81§та-А1йг1сЬ

Структурные характеристики натриевой соли сульфата декстрана (НССД) от 81§та-Л1бпсй (продукт № 31404) определяли используя 1Ό ¹Н и 2Ό ¹³С-¹Н 118ЦС ЯМР-спектроскопию. Протоколы анализа от 81§та-Л1бпсй, по сульфату декстрана (продукт № 31404), продемонстрировали молекулярную массу в (М_г) 5000 Да, а среднее содержание серы составляло 17%, что эквивалентно около 2,3 сульфатных групп на глюкозильный остаток.

Образец для ЯМР получали с помощью растворения 35,9 мг сульфата декстрана от 81§та-Л1бпсй (продукт № 31404) в 510 мкл Ό₂Θ.

Результаты.

Количество остатков глюкозы: 26-50.

Мп: 8600-16900 Да.

Степень С1 в α-конфигурации: не определена, но >50% (а-конфигурация >> β-конфигурация).

Степень сульфатирования С2-С4: 74%.

Степень сульфатированной концевой группы а-С1:49%.

Степень сульфатированной концевой группы в-С1: не определена.

Наиболее надежным способом определения количества остатков глюкозы в молекулах сульфата декстрана является одновременный анализ соответствующего декстрана, применяемого в качестве исходного материала для получения сульфата декстрана. Без данных ЯМР о соответствующем декстране, перекрывание спектров в области 4,8-5,2 ч./млн в 2Ό ¹³С-¹Н 118ЦС спектре, см. фиг. 14, препятствует количественному определению фракции концевой С1 в конфигурации β-аномера, а также степени сульфатированных концевых групп β-СР Фиг. 13 иллюстрирует ЯМР спектр 1Ό ¹Н сульфата декстрана от 81§та Л1с1пс1т (продукт № 31404).

Таким образом, рассчитанное количество остатков глюкозы в образце сульфата декстрана (продукт № 31404) сообщали в виде интервала, со степенью терминальной С1 в α-конфигурации в диапазоне от 50% до 100%. Данные 2Ό ¹³С-¹Н 118ЦС спектра не отображали сигналы в ожидаемой области концевой группы в-С1, из чего можно заключить, что количество остатков глюкозы лежит в верхней части указанного интервала.

Обсуждение.

Результаты ЯМР показали, что молекулярная масса сульфата декстрана с молекулярной массой М_г 5000 Да от 81§та-Л1бпсй (продукт № 31404) на самом деле имеет среднечисленную молекулярную массу Мп, которую измеряли с помощью ЯМР-спектроскопии в пределах интервала от 8600 до 16900 Да.

Функциональное исследование сульфата декстрана от разных производителей

Целью данного исследования было исследование и сравнение функционального эффекта сульфата декстрана от разных производителей на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) в сх у1уо анализе на людях.

АЧТВ является медицинским исследованием, которое характеризует свертывание крови. Помимо выявления нарушений свертывания крови, это также показатель эффективности как внутреннего пути активации свертывания крови, так и общих каскадов коагуляции.

Способ и оборудование.

АЧТВ измеряли в плазме крови человека с применением 81аг1® 4 от БхадпозРса 81а§о в соответствии с инструкцией производителя. Сульфат декстрана растворяли до 1 мг/мл в 75 мМ цитратного буфера с начальным значением рН 5,9, а затем добавляли в плазму человека до конечной концентрации сульфата декстрана 10 мкг/мл.

Анализировали четыре различных партии сульфата декстрана от Мсйо 8ап§уо Со., Ыб., Япония (Ν

- 18 032383

3178, Ν-3179, Ν-3180, Ν-3181), одну партию сульфата декстрана от 8щта-А10псй, США (средняя молекулярная масса 5000 Да, продукт № 31404) и две партии сульфата декстрана (партия № 1 и партия № 2) в соответствии с вариантами реализации изобретения. Из каждой партии обрабатывали четыре отдельно взвешенные образцы, а на каждом из этих образцов АЧТВ измеряли дважды. Все операции с образцами выполняли параллельно и в один и тот же день. Для получения сопоставимых результатов, все измерения АЧТВ проводили на всех образцах на следующий день.

Применение плазмы вместо цельной крови в анализе АЧТВ делает анализ более надежным, а результаты меньше меняются.

Результаты.

Результаты анализа АЧТВ представлены в табл. 10 ниже. Точкой отсчета для АЧТВ была плазма, измеренная как отрицательный контроль.

Таблица 10

АЧТВ в плазме после обработки сульфатом декстрана

Сульфат декстрана	АЧТВ (с)	Среднее	СОС
Отрицательный контроль	27,5
Мейо N-3178	56,3	59,5	1,1
Мейо N-3179	60,2
Мейо N-3180	62,2
Мейо N-3181	59,1
3|дта АМпсИ 31404	78,6
Партия № 1	49,1	51,8	2,7
Партия № 2	54,5

Существовала значительная разница в АЧТВ, измеренная для сульфата декстрана по вариантам реализации изобретений и сульфатом декстрана от других производителей. В частности, сульфат декстрана (5000 Да, продукт № 31404) от 81§та-АИпсй приводил к значительно более высокому АЧТВ по сравнению с сульфатом декстрана по вариантам реализации изобретения.

Варианты реализации изобретения, описанные выше, следует понимать как несколько иллюстративных примеров настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в варианте реализации изобретения могут быть сделаны различные модификации, комбинации и изменения без отклонения от объема настоящего изобретения. В частности, различные частичные решения в разных вариантах реализации изобретения могут сочетаться в других конфигурациях, где это технически возможно. Однако объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.

Приложение

Эксперименты по светорассеиванию проводили на системе эксклюзионной хроматографии с детектированием рассеивания лазерного излучения с кратными углами (8ЕС-МАЬЬ8), состоящей из ВЭЖХ системы Адйеп! серий 1260 1пйпйу и с присоединенным детектором светорассеивания ΜιπιΟΛΑΝ ТКЕ08 (ШуаИ Тесйпо1о§1е§). В экспериментах по светорассеиванию применяли следующие параметры анализа:

поток = 1,00 мл/мин;

температура колонки/άΚΙ детектора = 40°С;

интервал между взятием проб = 0,5 с;

объем вводимой пробы = 10 мкл;

□п/бс = 0,1470 мл/г;

длина волны МАЬЬ8 = 656 нм;

калибровочная постоянная (МАЬЬ8) = 4,7303 х10^Л-5 1/(В-см).

Образец сульфата декстрана растворяли в 2 мл 0,1 М нитрата натрия (ΝΝΟ₃) с 400 ч./млн азида натрия (Ν8Ν₃) в качестве подвижной фазы (элюента).

- 19 032383

Claims (22)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Сульфат декстрана, который характеризуется среднечисленной молекулярной массой, М_п, определяемой с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса, ЯМР, в пределах интервала от 1850 до 2000 Да;

   средним количеством сульфата на остаток глюкозы в пределах интервала от 2,6 до 2,7 и средней степенью сульфатирования положения С2 в остатках глюкозы указанного сульфата декстрана, которая составляет по меньшей мере 95%, или его фармацевтически приемлемая соль натрия.
2. 2. Сульфат декстрана по п.1, где указанная Мп, определяемая с помощью ЯМР-спектроскопии, составляет от 1891 до 1957 Да.
3. 3. Сульфат декстрана по п.1, где указанная фармацевтически приемлемая соль натрия имеет указанную М_п, определяемую с помощью ЯМР-спектроскопии, в пределах интервала от 2192 до 2276 Да.
4. 4. Сульфат декстрана по любому из пп.1-3, где среднее количество сульфата в положениях С2, С3 и С4 в указанных остатках глюкозы составляет от 2,2 до 2,6.
5. 5. Сульфат декстрана по п.4, где указанное среднее количество сульфатов в указанных положениях С2, С3 и С4 составляет от 2,3 до 2,5.
6. 6. Сульфат декстрана по любому из пп.1-5, где указанный сульфат декстрана имеет среднее количество остатков глюкозы в пределах интервала от 4,0 до 6,0.
7. 7. Сульфат декстрана по п.6, где указанное среднее количество остатков глюкозы составляет от 4,5 до 5,5.
8. 8. Сульфат декстрана по п.7, где указанное среднее количество остатков глюкозы составляет от 5,0 до 5,2.
9. 9. Сульфат декстрана по любому из пп.1-8, где указанный сульфат декстрана имеет среднюю степень разветвления остатков глюкозы, которая составляет менее 3,0%.
10. 10. Сульфат декстрана по п.9, где указанная средняя степень разветвления составляет менее 1,5%.
11. 11. Сульфат декстрана по любому из пп.1-10, где положение С1 концевой группы сульфатировано или связано с -ОН.
12. 12. Применение сульфата декстрана или его фармацевтически приемлемой соли натрия по любому из пп.1-11 в качестве лекарственного средства.
13. 13. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения, подавления и/или профилактики мгновенной медиированной кровью воспалительной реакции (ММКВР).
14. 14. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения, подавления и/или профилактики отторжения трансплантата органов, тканей и/или имплантатов клеток.
15. 15. Применение по п.14, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения, подавления и/или профилактики отторжения трансплантата островков Лангерганса.
16. 16. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для мобилизации клеток-предшественников и/или стволовых клеток в периферическую кровь субъекта.
17. 17. Применение по п.16, где указанное лекарственное средство предназначено для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и/или мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в периферическую кровь субъекта.
18. 18. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для мобилизации целевых белых кровяных телец в периферическую кровь субъекта.
19. 19. Применение по п.18, где указанное лекарственное средство предназначено для мобилизации лимфоцитов в периферическую кровь субъекта.
20. 20. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для снижения легочного поглощения внутривенно инъецированных клеток у субъекта.
21. 21. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для применения в качестве антикоагулянта.
22. 22. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения, подавления и/или профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из рассеянного склероза (ΡΟ). болезни Девика, острого диссеминированного энцефаломиелита (ОДЭМ), невропатии ЦНС, центрального понтинного миелинолиза, миелопатии, лейкоэнцефалопатии, лейкодистрофии, синдрома ГийенаБарре, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии и периферических невропатий.

    - 20 032383

    ΡΝ004-85-01_Η500

    Η1 (1—>6-СВЯЗАННАЯ, сс-конеиг)

    НПО

    Η Б, НЗ

    Η2, Η4

    3000

    2000

    Н1 (НЕСВЯЗАННАЯ С1, β-КОН