SE525461C3 - Ny användning av dextransulfat - Google Patents

Description

20 25 _30 (_51 F Q (TI .fx C}\ ....\ trombocyter som fäster på öarnas yta, vilket startar aktivering av både koagulerings- och komplernentkaskaderna. Dessutom blir öarna inneslutna i blodkoagel och_'infiltreras .av CDl lÉ-leukocyter, vilket allt tillsammans resulterar i en förstörelse av cellmorfologin och efterföljande cellförmedlade specifika immunsvaret i ett senare skede [5-8]. Således verkar inhibering av omedelbar eblodförmedlad inflammatorisk reaktion (eng. ”Instant Blood- Mediated Inflammatory Reaction, IBMIR), som den skadliga inflammatoriska reaktionen ~ kallas, vara kritiskt för framgången för allo- och xenotransplantation av öar. _ Två nya studier av Buheler et al [5] och Cantarovich et [6] har visat att öar fiån vuxna grisar förstörs omedelbart då de transplanteras intraportalt i levem på icke mänskliga primater även under förhållande med omfattande konventionell immunosuppresion enligt känd teknik. ' förlust av normoglukemi hos patienterna [3-4]; Vidare kan inflammationen påskynda det- I dessa studier drog författarna slutsatsen attfett lcrafifullt medfött irnmunsvar, IBMIR,isom inte påverkades av immunosuppressiva läkemedel, är inblandat i förstörelsen av de xenogena öarna.

Fiorante et al har studerat användningen av: .dextransulfat att förebygga hyperakut avstötning (HAR) av vaskulära diskordanta' Vxenotransplantat [9]. Grislungor, utsatta för v peffneien med einet-nnnknegnxernt mänekugt med, .nndergiek HAR efter 30 minuter i xenotransplantationsmodellen. Tillsatts av dextransulfat vid 2V mg/ml förlängde emellertid lungöverlevnad med ungefär 200 minuter. HAR av vaskulära hela organ förmedlas av verkan hos antikroppar i_ det mänskliga blodet, vilka identifiera och binder till exponerade antigener på endotelcellerna i de transplanterade organens blodkärl. Denna antikroppsförmedlade HAR- reaktion förstärks av komponenter i komplernentsystemet [8, 10, ll]. Eftersom dextransulfat i även än känd för en innibern kemplemenmkfivefing [9, 1121, entee den. förlängde lungöverlevnaden vid användning av dextransulfat. i den använda xenotrarrsplantations- modellen häröra från denna antikomplementefifekt hos dextransulfat. - ' Nakano och medarbetare har transplanterat isolerade syngena öar in i i möss med STIL inducerad» diabetes för att undersöka hepatocyttillväxtfalctoms zs) roll i förbättringen av _ hyperglukerni [l3]. Det är 'känt att dextransulfat förbättrar. HGF:s effekt och följaktligen ndmimenefedee HGF intmpentenenlti de mottagande mdseen nueemmnne med dextmneulgfnt. g 'Sådan administrering genererade normoglukemi i allaÛ möss som undersöktes. .Även 10 »15 20 25 30 461 .3 administrering av dextransulfat själv uppvisade viss fördelaktig effekt i några få möss, 'men inte då njurkapselutrymmet var transplantationsstället för öar. Ytterliggare behandling med anti-HGF-antikroppar i de möss, till dextransulfat administrerades, upphåvde fullständigt dextransulfatets fördelaktiga effekt, vilket indikerar på att dextransulfatets effekt i - denna modell av allogen transplantation av öar i möss-förmedlas via endogent HGF.

Thomas et al har visat att lösliga dextranderivat inhiberar komplementaktivering och komplementförrnedlad skada in vitro. Endotelceller från grisaorta, inkuberade i mänskligt serum, resulterade i komplementförbrukning och avsättning av_ aktiverade C3-, CS-fiagment i i och membranattackkomplexet C5b-9 på endotelcellerna. Tillsats av 25 mg/ml' CMDB25- dextransulfat inhiberade komplementaktivering och* cytolytisk komplexavsätitning på cellerna.

Nativt deittran hade ingen sådan effekt.

SAMMANFATTNING Den föreliggande uppfinningen övervinner dessa och andra nackdelar med de tidigare kända' Det är ett allmänt syfie med den föreliggande uppfinningen att tillhandahålla behandling av omedelbar blodförmedlad inflammatorisk reaktion (eng. ”Instant Blood-Mediated Inflammatory Reaction, IBMIR).

Det är ett annat syfte med uppfinningen att tillhandahålla behandling av morfologisk upplösning 'av celltransplantat orsakad av IBMIR. i ' »Ännu ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla behandling av transplantatavstöming av celltransplaritat orsakad av IBMIR.

Dessa och andra syften uppnås genom uppfinningen såsom definieras i de medñljande patentkraven. i - ' .Den föreliggande uppfinningen innefattar kortfattat användningen av dextransulfat-och derivat därav för behandling av omedelbar blodförrnedlad inflarnmatorisk reaktion (BL/HR). Denna' nyligen karakteriserade form av inflammation utlöses då celler eller cellkluster utsätts för 10 15 20 25 30 -1 G aoonoø 0 o o oo oo oozn , I C .Ö .I o .Q 'o I g o Û I Ü ...I o o Û 0 C o IIÛ ' o Ü oo! u o o Û C Û a canon: _ fiämmande blod in vitro och in vivo. Ett mycket viktigt- exempel på IBMIR är allogena eller xenogena celltransplantat transplanteras in i kroppen på enmottagande däggdjurspatient, särskilt mänsklig patient. kommer' då att leda till morfologisk upplösning och förstörelse av de transplanterade cellerna eller cellklustrena, vilket manifesteras i förlust av struktur och form. Vidare resulterar även IMBIR i allmänhet i 'transplantatavstötning av celltransplantat. I Administrering av dextransulfat eller derivat därav upphäver lBMlRzs skadliga effekt och förebygger effektivt transplantatavstötriing och morfologisk upplösning av celltransplantat.

Dextransulfatet enligt uppfinningen kan ha en molekylvikt från lågmolekylärt dextranssulfat (LMW-DS), t.ex. fiån några hundra eller tusen Dalton, till högmolekylärt dextransulfat (HMW-DS), i allmänhet med en molekylvikt över 500 000 Da,t t.ex. V> 1 000 000 Da.

Dextransulfatets fördelaktiga effekt är särskilt framträdande för LMW-DS men positiv effekt upplevs “även vid administrering med dextransulfat med en högre molekylvikt. Den fördelaktiga effekten på lBMlR med större dextransulfatrnolekyler enligt uppfinningen kan .förstärkas genom att öka svavelhalten, dvs. antalet sulfatgrupper »per glukosrest i dexu-snkeajafi. LMw-Ds har i anmänhe: en medelmoiekyivim under zo ooo Da, såsom under 10 000 Da och t_.ex. under 5 000 Da Medelsvavelirmehället för LMW-DS kan vara ungefär 10 till 25 %, såsom 15 till 20 %, vilket motsvarar ungefär två sulfatgrupper per glukosrest." För dextransulfat med en medelrnolekylvikt högre än 20 000 Da skulle ett större svavelinnehåll i kunna användas.

Dextransulfat och derivat därav kan administreras för systemleverans till platsen för IBMIR eller celltransplantation eller* kan administreras för direkt leverans (lokalt) till den platsen.

Således kan dextransiflfat och derivat därav i enlighet med uppfinningen administreras oralt; intravenöst, intraperitonealt, isubkutant, buckalt, rektalt, dermalt, nasalt, trakealt, "bronkialg topikalt eller via någon annan parenteral väg eller via inhalering i fonn av en farmaceutisk ' beredning som innefattar den aktiva komponenten i en farmaceutiskt .acceptabel dosforin.

I terapeutisk behandling av däggdjur och särskilt människor kan dextmnsirlfat och derivat därav administreras ensamt men kommer i allmänhet att administreras som farmaceutisk i formulering i blandning med en farmaceutiskt acceptabel ladujuvans, lösningsmedel eller i 10 15 20 25 30 anno 00 U I 0 00 Olli I 0 0 nu 00 OO I 0 I 000000 _ 0 . 0 0 coli bärare, vilka kan väljas med hänsyn till den avsedda administreringsvägen och farmaceutisk standardpraxis. i Mängden dextransulfat eller derivat därav i formuleringen kommer att bero på hur allvarligt ~ i tillståndet är och på den patient som ska behandlas såväl som på den aktuella' formuleringen och den använda administreringsvägen, och 'kan bestämmas av fackmannen på _ett icke uppfinningsmässigt sätt. Koncentrationen av administrerad dextraiisulfat eller derivat därav' enligt den föreliggande uppfinningen bör inte vara för hög att minimera eventuella bieffekter som är associerade med dextransulfat. I de flesta kliniska situationer är lämpliga doser av dextransulfat och derivat därav i terapeutisk och/eller profylaktisk- behandling av idäggdjlurspatienter, särskilt mänskliga patienter, de som ger en medelblodkoncentration under 5 mg/ml, troligen mindre än 2 mg/ml och särskilt mindre än 1 mg/ml. Ett föredraget koncentrationsintervall är mellan 0,01 mg/mloch l mg/ml dextransulfat, såsom mer än 0,05 i mg/ml, mer än 0,08 myml eller mer än 0,1' mg/ml och/eller mindre än 0,8 mg/ml, än 0,6_ mg/ml, mindre än 0,4 mg/ml eller mindre _ än 0,2 ing/ml, i tex. inom koncentrationsintervallet 0,01 mg/ml och 0,2 mg/ml och/eller 0,05 mg/ml och 0,2 mg/ml.

Dextransxilfatet enligt den föreliggande uppfinningen 'särskilt lämpligt för att förebygga' transplantatavstötning av insulinprodueerande ß-celler transplanterade in i patienter som lider av typ I diabetes. I 'sådana patienter kan Langerhanska öar _fi'ån andra människor eller däggdjur, företrädesvis grisöar, transplanteras genom att injicera öarna in i patienternas portalven. När öarna emellertid utsätts för patientens blod utlöses IBMIR och öarnas insulinreglerande funktionalitet kommer att förstöras och öarna kommer att avstötas. Därför uppnås företrädesvis en terapeutisk koncentration av dextransulfat eller derivat därav' åtminstone lokalt vid transplantationsstället när transplantation av cellerna eller cellklustrena genomförs. Detta kan uppnås genom administrering av dextransulfat innan den faktiska " transplantationen. Alternativt kan öarna injiceras- lösta i en lösning som .innefattar i dextransulfat enligt den föreliggande uppfinningen för att inhibera IBMIR och förhindra eventuell förstörelse eller avstötning av öarna, vilket möjliggör normoglukemi i patientemal Ü Koncentrationen av dextransulfat i en sådan cell-och-dextransulfatlösning företrädesvis tillräckligt högså att en terapeutisk koncentration av. dextransirlfat, dvs. företrädesvisymindre än 5 mg/ml, ännu hellre 0,01 mg/ml till 1,0 mg/ml och särskilt0,0l mg/rnl till'0,2 mig/ml, kan uppnås åtminstone lokalt i i transplantationsstället "under i de första - timmarna efter :to 15 20 25 30 transplantationen. Dextransulfatet kommer därefter att diffundera från transplantationsstället, - vilket sänker den lokala dextransulfatkoncentrationen. I vissa tillämpningar behövs inget extra dextransiilfat för att inhibera morfologisk upplösning och/eller transplantatavstötrting av celltransplantat eftersom en terapeutisk koncentration av dextransulfat troligen endast erfordras under de första 24-48 timmarna efter transplantation. Närhelst det erfordras kan emellertid ytterliggare dextrarisulfat tillsättasr t.ex. intravenöst, intraperitonealt eller via någon man aaminisuafionsväg. såsom rummen förstår kan aaminisuermg av en dextransulfatlösning som innehåller celler eller cellkluster som ska administreras även kombineras med administrering av dextransulfat eller derivat därav innan den faktiska transplantationen.

Dextraiisulfat och derivat därav kan även kombineras med andra terapeutiska medel som är 'användbara i behandlingen av transplantatavstötning av transplanterad vävnad. Lämpliga men inte begränsande exempel på sådana immunosuppresiva medel 'som kan användas tillsammans med dextransulfat för behandling avg transplantatavstöming är cyklosporin, takrolimus, kortikosteroider, rapamycin (sirolimus) och mykofenolat-mofetil. Administrering av dextran- sulfat enligt den föreliggande uppfinningen kan även koordineras med administrering av anti- TF-arrtilaoppar och/eller site-inactivated factor VIIa, vilka även har viss fimktionalitet i ' inhibering av lBMlR.

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA g Uppfinningen, tillsammans med ytterligare syfien och fördelar med denna, kan bäst förstås genom hänvisning till följ ande beskrivning läst tillsammans med de medföljande i vilka: ' Fig. *l är ett diagram som illustrerar effekten av LMW-DS på genereringen av C3a vid V perfusion av grisöar med mänskligt blod; Fig.. 2 är ett diagram som illustrerar eñekten av LMW-DSA på genereringen av sC5b-9 vid perfusion av grisöar med mänskligt blod; Fig. 3 är ett diagrarn som illustrerar LMW-DS:s direkta effekt påkomplementsystemet när mänskligt serum inkuberas i närvaro av LMW-DS; 10 15 20 25 30 oo oo oo 'of o o o o u o o o 0 00 II' I I Ü I I o o o o U IQ CCI. o O O ÛÛÛ o o oooo oo I Fig. 4 illustrerar fördelningen av leukocyter i grisöar efter perifusionmed mänskligtblod som inte innehånef nagmLMw-Ds; l i Fig. 5 illustrerar fördelningen av leukocyter i grisöar efter perfusion med mänskligt blod som innehåller 1 mg/m1LMw-Ds; i Fig. 6 illustrerar fördehiingen av trombocyter i grisöar efter perfusion med mänskligt blod som inte innehåller något LMW-DS; samt ' Fig. 7 illustrerar fördelningen av trombocyter i grisöar efter perfusion* med mänskligt blod som innehåller 1 mg/rnl LMW-DS. i ' DETALJERAD BESKRIVNING I Den föreliggande uppfinningenlavser allmänt dextransulfats nya oväntade effekt på. omedelbar blodtörmedlad inflammatorisk reaktion (eng. ”Instant Blood-Mediated lnflammatory Reaction, lBMIR), och morfologisk upplösning och transplantatavstöming av celltransplantat orsakad av IBMIR. i IBMIR en relativt nyligen identifierad inflammatorisk reaktion som utlöses då celler eller cellkluster utsätts. för eller kommer i kontakt med främmande blod. IBMIR karakteriseras av uttryck av vävnadsfaktor_på cellerna; vilket sätter i gång en lokal generering av trombin.

Därefter fäster aktiverade trombocyter pä cellytan, »vilket gynnar -av både koagulerings- och komplementsystemen. Dessutom värvas och infiltrerar leukocyter cellemal Dessa effekter orsakar tillsammans en upplösning och förstörelse av cellrnorfologin inom de första få timmarna efter kontakt med det fifämmande blodet, IBMIR påskyndar även det efterföljande cellfönnedlade specifika immunsvaret i en senare fas.

Ett mycket viktigt exempel på IBMIR är när celler eller cellkluster transplanteras in i kroppen på företrädesvis en däggdjurspatient och särskilt en mänsklig patient. :Vid kontakt med den , mottagande patientens blod utlöser cellerna' IBMIR, vilket resulterar i förstörelse av cellmorfologin och i allmänhet transplantatavstömíng av celltransplantaten. IBMlR har detekterats både i allogen celltransplantation, därceller fiån-endonator med ABC-anpassat 10 15 20 25 30 000000 0 o O OO OO blod transplanteras in i en patient, och i xenogen celltrarxsplantation, _ innefattande xenotransplantation av celler och/eller cellkluster fiån gris till apa och från gris till människa; “ Uttrycket ”celltransplantat” avser allmänt i den föreliggande uppfinningen en enstaka cell, flera enstaka celler eller ett kluster av många celler som transplanteras in i en mottagande kropp hos företrädesvis en däggdjurspatient och särskilt en mänskligepatient. Även större cellkluster av icke-vaskulära vävnader innefattas av uttrycket celltransplantat såsom det i används hån". Ett exempel på celltransplantat enligt den föreliggande uppfinningen är-allogerta eller xenogena Langerhanska öar som transplanteras inei portalvenen i levern hos patienter som lider av typ I diabetes. Ett ytterligare exempel kan vara transplantation av embryonal xenogen neuaral vävnad/celler i striatum hos patienter med Parkinsons sjukdom.

Såsom kortfattat diskuterades i hakgrundsektionen är transplantation av insulinproducerande e ß-celler t.ex. in i portalvenen ett lovande tillvägagångssätt ñr ett uppnå normoglukemi hos patienter med typ I diabetes. Lämpliga insulinproducerande celler t.ex. i form av Langerhanska öar kan erhållas från både allogena och xenogena donatorer. På grund av att öar fi-ån flera donatorer krävs för attuppnå normoglukemi och bristen på lämpliga mänskliga' donatorer kan xenogena öar, företrädesvis grisöar, användas. Både allogena och xenogena öar fi-arnkallar emellertid IBMIR då de utsätts för den mottagande patientens blod. Följaktligen upplöses och förstörs cellmorfologin inom några få timmar efier transplantation, vilket i allmänhet manifesteras i förlust av cellemas integritet, struktur och form. Detta resulterar i en initialt starkt ökad insulinfrisläppning 'från de Langherhanska öarna, följt av minskad eller v i förlust av insulinfi-isläppning. Med andra ord följer förlust av normoglukemi snart efter transplantationen. Vidare orsakar IBMIR även transplantatavstötriing _av celltransplantaten.

Administrering av konventionella immunosuppressiva läkemedel som förebygger produktion av antikroppar och organavstötning har ingen efiekt på eller transplantatavstöming av eemranspnatntat ojrsnma» av mmm. Detta an nuvudmekanismm förnamn: och transplantatavstötning av , celltransplantat skiljer sig fi-ån den avstömingsmeloiism i som återfinns i transplantation 'av hela organ och vaskulär vävnad. _ Här nedan följer en mera detaljerad genomgång av symptomena av IMBIR och särskilt förbrukning av trombocyter, koagulerings- och kompelementalrtivering samt! leukocyt- lO 15 20 25 30 ' 525 »Fä- 61 9 inñltrering. Vidare gås dextransulfats effekter på de respektive symptomena igenom. För en mera detaljerad diskussion om dessa effekter hos dextransulfat hänvisas till exempelsektionen.

Med början vid förbrukning av trombocyter påverkar IBMIR trombocytvärdet hos blod som utsätts för allogena ellerxenogena celler eller cellkluster. En markant minskning i antalet fiitt cirkulerande trombocyter kan detekteras i blodet efter blod-cellkontakten. Trombocyterna aktiveras och faster på cellerna, vilket resulterar i en trombocytaggregation. Efier fastsättning på cellema frisläpper trombocytema flera substanser, innefattande trombocytfosfolipider, som är viktiga för blodkoagelbildning och aktivering av koaguleringssystemet.

Administrering av en effektiv mängd dextransulfat enligt uppfinningen inhiberar förbrukningen av trombocyter, vilket ses i en ökning av blodets trombocytvärde som återgår till det uppmätta värdet i blodet innan utsättandet för främmande celler eller cellkluster.

Dessutom minskas fastsättning av trombocyter på cellerna väsentligt av dextrarisiilfat fastän spår-mängder av trombocyter som omger öarna fortfarande kan observeras. Dessa återstående trombocyters effekt är emellertid inte nödvändigtvis en nackdel. Djurstudier har visar att efter transplantation går åtminstone en vecka innan angiogenes detekteras [l5, l6]. Trombocyter innehåller ett antal viktiga tillväxtsfaktorer, såsom PDGF (platelet-derived growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) och FGF (fibroblas growth factor) [l7, 18], vilka kan främja återvaskularisation och intransplantering av öar i patientens kropp. I fallet med klinisk transplantation av öar då öar emboliseras in i portalvenen skulle en ring av fasta trombocyter på liknande sätt kimna gynna deras intransplantering och överlevnad i levervävnaden.

Vid kontakt med blod aktiverar de främmande cellema koaguleringssystemet genom uttryck av vävnadsfaktorer på cellerna och genom substanser som frisläpps av de fastsatta och aggregerade trombocytema. Kortfattat bildar vävnadsfaktor (TF), producerad av cellema, komplex med blodkoaguleringsfaktor VHa och verkar enzymatiskt på faktor X för att bilda aktiverad faktor X (FXa). Därefter följer en kaskad av aktivering av olika faktorer som slutligen resulterar i generering av trombin från protrombin. Trombin orsakar i sin tur polymerisering av fibrinogenmolekyler till fibrinfibrer som bildar en fibrinpropp runt cellema, vilket är välkänt för fackmarmen. Trombin aktiverar även den inre vägen för iriitiering av 1.0 15 20 25 30 10 se e = blodkoagulering, i vilken faktor XII (Hageman-faktor) aktiveras (FXIIa) och i enzymatiskt aktiverar faktor XI (tromboplastinföregångare), vilket resulterar i FXIa, den aktiverade formen av faktor XI. Även denna _väg kommer slutligen att resultera i generering av trombin fi-ån protrombin såsom färden yttre TF-aktiverade vägen.

Blodkoagulering kan inhiberas av antitrombin, en cirkulerande serinproteasinhibitor, som inaktiverar FXIIa, FXIa och trombin genom bildande av faktor XlIa-antitrombin- (FXIIa-AT), faktor XIa-antitrombin- (FXIa-AT) samt trombin-antitrombinkomplex (TAT). Dessutom är' Cl esterasinhibitor en känd inhibitor av FXla och FXIIa genom bildande av faktor XIa-Cl esterasinhibitor- (FXIa-Cl INH) och faktor FXIIa-Cl esterasinhibitorkomplex (FXIIa-Cl En väl bildad fibrinpropp runt cellemai eller cellklustrenakan avlägsnas genom verkan hos pinennn i de: 'fibnnenyneke eyefeneef. Pleennn bryfef ned fibnnpneppen nu fibnnnedbfynnnge- i produkter, vilket därigenom förhindrar ytterliggare. koagulering. 'Plasmins verkan emellertid av alfa-Z-antiplasmin som binder och inaktiverar fi-i plasrnin genom bildning av plasmiri-alfa-Z-antiplasminkompleir (PAP).

»IBMIR karakteriseras av bildning av fibrinproppar runt celler som utsätts för frärnmande blod in vitro och in vivo. Dessutom detekterasen ökning i FXIa-AT,pFX1Ia-AT, TAT och PAP.

IBMIR her ingen effekt verken på mängden Fxre-ci INH ener FXIIa-Ci INH.

Administrering av en effektiv mängd dextransulfat enligt uppfinningen upphäver lMBlRs I effekter på koaguleringsaktivering, vilket manifesterasi en minskning i detekterad mängd Fxre-Ar, Finne-Ar, TAT een PAP i breder. Dexffeneuifefs effekt på xeegnieringeeiefivefing kan förmedlas via koagxileringssysternet självt, vila dextransulfats inhiberande efiekt på trombocytaktivering eller båda; i Efter nembeeyf- een keegtnenngeekfivefnfgfzsljef en kefnplemenfkeereed i LBMIR.. En ev komponenterna i komplementsystemet Aär.C3 som då den aktiveras klyvs till det mindre lC3a- fiagmentet, en peptidmediator för inflammation, och det större CSb-fragmentet. C3b binder i sin tur till andra komponenter i komplementsystemet och bildar CS-konvertas som klyver CS till CSa, som diffunderar iväg, och den aktiva formen C5b som fäster på cellytan. Den bundna C5b binder till fyra ytterligare komplementkomponenter »och bildar membranattack- 10 15 '20 25 3o_ 0 0 Br) 5 ,._,..:._u_. _..:¿ I g 0 0 0 0 000 000 0 0 0 I 0000 I 0 0 0 0 00 0 p 0 0 0 0 11 0 0 00 0 00 000 0 0 0 0000 0 0 0 0 000 000 I 0 0 O 000000 00000 komplexet c5b-9. Detta komplex tränger undan membranfosfolipidemaoch bildar stora transmembrankanaler som löser upp membranet och möjliggör att joner och små molekyler fi-itt kan diffundera. Cellen kan således inte bibehålla sin osmotiska stabilitet och lyseras “ genom inflöde av vatten och förlust av elektrolyter.

Den största delen av trombocytförbrulmingen har redan skett innan IBMIR:-s komplement-_ förmedlade effekter kan detekteras, vilket tyder på koaguleringsreaktionen kan inducera komplementaktivering. IBMIR orsakar markant komplementaktivering vilket mäts genomen ökning av C3a och lösligt membranattackkomplex sC5b-9 i blodet. Administrering av en effektiv mängd dextransulfat enligt uppfinningen minskar mängden av dessa komplement- komponenter i blodet på ett dosberoende sätt.

IBMIR karakteriseras även av infiltrering av leukocytertill cellerna eller cellklustrena. _ Infiltrering av CDlllf-polytnorfonukleära celler och monocyter in till cellerna kan tydligt ' detel-:teras med immunohistokemisk märkning. lmmunohistokemiska analyser »visade att leukocytinfiltreringen lupphävdes totalt vid administrering av dextransulfat Enligt en första aspekt av Auppfinningen tillhandahålls användning av dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav i fi-aniställning av ett läkemedel för behandlingen av i omeaeibar bmdrrsnnedlad inflammarofisk reaktion (IBMIR).

Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls användning av dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav i framställningen av ett läkemedel för behandlingen av morfologisk upplösning av transplanterade celltrarisplantat. Även användning av dextransulfat eller ett farmaceutiskt 'acceptabelt derivat därav i fi-amställningen av ett läkemedel för behandlingen av transplantatavstöming av celltransplantat - * inom den föreliggande uppfinningens omfattning. Dessa två effekter, dvs. upplösning av cellrnorfologin och » i _ transplantatavstöming, på transplanterade celler, cellkluster eller icke-vaskulär vävnad i en ' däggdjurspatient, företrädesvis mänsklig patient, beror på IBMIR:s skadliga effekt Den IBMIR-förmedlade 'effekten på celltransplantation sker både i transplantation från människa i till människa med AEG-anpassade donatorer och vid användning av andragdäggdjurs- . donatorer, företrädesvis grisdonatorer. Dextrarisiilfat har således' en fördelaktig terapeutisk effekt vid både allogen och xenogen celltransplantation." 10 15 20 25 30 0000 0 0 0 0000 000 I 0000 l 0 0000 0 0 O 0 0000 g 0 00 0 0 0 0 0 00 0 0000 « 0 0 000 0000 0 0 I 0 0 0 IICQÛI 0 0 030000 525 461» 12 ' För att undvika tvivel innefattar termen ”behandling” .såsom används häri den terapeutiska och/eller profylaktiska behandlingen av IBMIR. ”Farmaceutislct acceptabla derivat” innefattar salter och solvatiseringsprodukter. i Dextransulfat eller derivat därav som används enligt uppfinningen ha' en -molekylvikt från lågrnolekylärt dextranssulfat (LMW-DSL t.ex. fiån några hundra eller tusen Dalton, till I högrnolekylärt dextransulfat (I-IMW-DS), i allmänhet en molekylvikt över 500 000 Da, Lex. > _' l 000 OOODa. Dextransulfats fördelaktiga eñekt är särskilt framträdande för LMW-DS men positiv effekt upplevs även vid administrering med dextransulfat med en högre molekylvikt. större tieirtrensiiifenrieiekyier ker emeuettia aktivera Fxn, vilket resulterar i viser bieffekter i som diskuteras i mer detalj nedan. Den fördelaktiga effekten på med större dextran- sulfatrnolekyler enligt uppfinningen kan förstärkas genom att öka svavelhalten, dvs. antalet sulfatgrupper per glukosrest i dextrankedjan. LMW-DS har i allmänhet en medelmolekylvikt under 20 000 Da, såsom under 10 000 Da och tex. under 5000 Da Medelsvavelinnehållet .för LMW-Ds kan vara ungefär 10 tiu 25 %, Sagem is till zu v., vilket meteverer ungefär två sulfatgrupper per glukosrest, För dextmnsulfat med en rnedehnolekylvikt högre än 20 000 Da skulle ett större svavelirmehåll kunna användas.

Enligt ännu en aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett förfarande behandling av i IBMIR, vilket innefattar administrering av en' terapeutisk effektiv mängd av dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav till en patient som behöver sådan behandling.

Ytterligare aspekter av uppfinningen är ett förfarande för behandling av transplantatavstöming av celltransplantat, vilket innefattar administrering av en terapeutisk effektiv mängd av dextrarisulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav till en patient i behov av sådan behandling, samt ett förfarande för behandling 'av rnorfologisk upplösning av transplanterade celltransplantat, vilket innefattar administrering av en terapeutisk effektiv mängd dextran- sulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat .därav till en patient i. behov av beheritiiing. I ' I i i Dextransiilfat och derivat därav kan administreras för isysternleverans till platsen för IBMIR eller celltransplantation eller kan administreras för direkt leverans (lokalt) till den platsen genom användning av lärnpliga administrationsorgan som kända för fackmannen. 10 15 20 »25 30 13 Således kan dextransulfat och derivat därav i enlighet med uppfinningen administreras oralt, mmvmeet, maepefiteneeii, eubkumnf, buekeif, rekmn, aermen, men, mean, bmmaen, är topikalt eller via någon annan parenteral väg eller via inhalering i form av en farmaceutisk beredning som innefattar den aktiva komponenten i en farmaceutiskt acceptabel dosform.

Beroende på typen av celltransplantation, transplantationsstället och den patient som ska behandlas såväl som på administreringsvägen kan sammansättningarna administreras vid varierande doser.

I terapeutisk behandling av däggdjur och särskilt människor kan dextransulfat 'och derivat därav administreras ensamt men kommer i allmänhet att administreras som farmaceutisk formulering i blandning med en farmaccutiskt acceptabel adjuvans, lösningsmedel eller bärare, vilka kan väljas med hänsyn till den avsedda adminístreringsvägen och farmaceutisk standardpraxis. i i ' ' Mängden dextransulfat eller derivat därav i formuleringen kommer att bero på hur allvarligt tillståndet är och på den patient som ska behandlas-såväl som .påiden aktuella formuleringen och den använda adrninistreringsvägen, och kan bestämmas av fackmannen på ett icke uppfinningsmässigt sätt. Koncentrationen av administrerad dextransulfat eller derivat därav enligt den föreliggande uppfinningen bör inte vara för hög för att minimera eventuella bieffekter som är associerade med dextransulfat. I de flesta kliniska-situationer lämpliga doser av dextransulfat och derivat därav i den terapeutiska och/eller profylaktiska behandlingen av däggdjurspatienter, särskilt mänskliga patienter, de som .ger en medelblod- koncentration under 5 mg/ml, troligen mindre än 2 mg/ml och särskilt mindre än 1 mg/ml. _ föredraget koncentrationsintervall är mellan 0,01 mg/ml och l mg/ml _ dextransulfat, såsom I _ , mer än 0,05 mg/ml, mer än 0,08 mg/ml eller mer än 0,1 mg/ml och/eller mindre än 0,18 mg/ml, mmme än 0,6 mg/mi, mmme än 0,4 mg/mi eller -mmare än 0,2 mg/nfl, tex. imm . koncentrationsintervallet 0,01 mg/ml och 0,2 mg/n1l och/eller 0,05 mg/ml och 0,2 mg/ml.

' Dessa koncentrationer har visat sig: tillräckligt höga för att förebygga eller inhibera IBMIR ' samt morfologisk upplösning och transplantatavstötning av eellnansplantat men ändå .tillräckligt låga för att minimera eventuella bieffekter som är associerade med administrering av dextrarlsulfat. Dessutom hade inte odling av öar i LMW-DS någon skadlig effekt på öarnas funktion vid koncentrationer som sträcker sig från 0,01 till 1 mg/ml. Hur som helst kommer läkaren eller fackmannen att bestämma den aktuella dos somkommer att 10 15 20 25 30 (_71 i ,, LT1 4-61 =°-="-=..-' ft-"t "tszz . a. _14 ru '-.= =..= f =..=.=:.' vara mest lämplig för en enskild patient, vilken kan variera med den särskilda patientens ålder, vikt och gensvar. De ovan angivna doserna är exempel på föredragna *doser i medelfallet. Det kan emellertid finnas enskilda tillfällen då högre eller lägre dosintervall är berättigade och sådana är inom uppfinningens omfattning.

Idag hardextransulfat redan använts i kliniska studier för antiviralterapi mot behandling. av akut hjäminfarkt i kombination med urokinas- och i antihyperlipidemiterapi, i vilken dextransulfat kopplas till en fast fas.. I de två förra typerna av studier var injektionshastigheten ungefär 45 mg/timme, vilken bibehölls under en period av42-3 veckor genom kontinuerlig ' ' injektion av dextransulfat (MW 8 000 Da) ochblodkoncentrationen detekterades till ungefär 0,01 mg/ml. I alla dessa patienter observerades trombocytopeni (ibland associerad med blödning) efter 3A dagars behandling, och alopeci rapporterades i ungefär hälften av patientema Båda dessa effekter var emellertid reversibla. Det uppskattasatt administrering av dextransulfat för inhibering av' IBMIR, morfologisk upplösning och/eller transplantat- avstöming av celltrarisplantat utförs vanligtvis underiupp till 1-2 eller några få dagar. Därför kommer» de ovan identifierade biefiekterna att vara mycket milda under sådan kort administreringsperiod (några få dagar i jämförelse .med 2-3 veckor). i Det har länge varit käntatt dextransulfat inducerar hypotoni genom fi-isläppning av bradykinin som ett resultat av aktivering av plasmakallikrein. Denna observation har emellertid först och fiämst gjorts då HMW-DS har immobiliserats i plasma-aferesiskolonner för behandlingen av i hyperlipidemi och inte vid injektion av dextransulfat. Denna effekt är enkonsekvens av den 'direkta aktiveringen av FXII till FXIIa. I det föreliggande dokumentet ges stöd för att faktor XII inte direkt aktiveras av LMW-DS. FXlIa-AT- och PAP-nivåema är förhöjda när celler utsatts tet fiamnnanae bind ntan LMw-ns, vilket' han nämnts svan. Dessa antaga nivasf nnnnaiisatas emellertid då LMw-.Ds tillsätts. rFör att förhindra IBMIR efter celltransplantation och/eller morfologisk upplösning i och 'transplantatavstötning av celltransplantat är företrädesvis en terapeutisk koncentration av dextransulfat eller derivat därav uppnådd åtminstone lokalt vid »transplantationsstället när cells transplantationen utförs. Detta kan" erhållas genom administrering av derrtransulfat innan den faktiska transplantationen. Alternativt de celler eller cellkluster som ska transplanteras i en patient injiceras lösta i en lösning som innehåller dextransulfat enligt' den' föreliggande _ 10 15 20 25 30 uppfinningen. Koncentrafionen av dextransulfat i en sådan cell-och-dextransulfatlösning är företrädesvis tillräckligt hög så att en terapeutisk koncentration av dextransulfat; dvs. företrädesvis mindre än 5 mgi/ml och ännu hellre inom 0,01 mg/ml till 1,0 mg/ml, kantlokalt) uppnås i transplantationsstället under de första efter transplantationen. Såsom fackmannen förstår kan den faktiska koncentrationen av dextransulfat 'eller derivat därav tillfälligt vara högre än den optimalakoncentrationen i patientens blod då celler eller cell- kluster transplanteras lösta i en lösning med dextransulfat. Därefter kommer dextrarrsulfatet i att aimmdm från eanspiantafionsställer, vilket sänker den 10min aexmnsuifaz- koncentrationen. I- vissa tillämpningar behövs ingen extra 'dextransulfat för. att inhibera IBMIR, morfologisk upplösning och/eller transplantatavstötning av celltransplantat eftersom i en terapeutisk koncentration av dextrarisulfat erfordras troligen endast upp till de första 24-48 timmarna efter transplantation. Närhelst det erfordras kan emellertid ytterligare dextransulfat tillsättas, t.ex. intravenöst, intraperitonealt eller via i någon. arman administreringsväg identifierad ovan. Såsom fackmannen förstår kan administrering aven dextransulfatlösning som innehåller de celler eller cellkluster som ska. tansplanteras även kombineras med administrering av dextransulfat eller derivat därav innan den faktiska transplantationen. i Enligt eniytterligare aspekt av uppfinningen tillhandahålls en farmaceutisk formulering för användning i behandlingen av IBMIR, vilken innefattar en effektiv mängd av dextranstilfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav. i i Den föreliggande uppfinningen avser även en farmaceutisk formulering för användning i behandlingen av transplantatavstötning av celltransplantat, vilken-innefattar en effektiv mängd dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav, samt en farmaceutisk formulering för användning i behandlingen av morfologisk upplösning 'avtransplanterade cellÅ transplantat, vilken innefattar en effektiv mängd dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat ' i' I Dextransulfat och derivat därav kan även kombineras med andra terapeutiska ämnen som är i användbara ibehandlingen av transplantatavstötning av transplanterad vävnad. Lämpliga men inte- begränsande- exempel på sådana immunosuppresiva ämnen som kan »användas tillsammans med dextransulfat för .behandling 'av transplantatavstötning är cyklosporin, itakrolirnus, kortikosteroider, raparnycin (sirolimus) och mykofenolat-mofetil. Administrering 10 15 20 25 300 'Reagenser av dextransulfat eller derivat därav enligt den föreliggande uppfinningen kan även koordineras med administrering av anti-TF-antikroppar och/eller site-inactivated factor VlIa, vilka har i visats ha viss fimktionalitet i inhibering av IBMIR.

EXEMPEL _ Laginniekylän nexnaiinnlfni (LMw-Ds) nied en iiienehnniekyiviln på s ooo Da neh en svavelinnehåll på ungefär 1,7 %_ erhölls från Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).

Höginniekylm nexnensnifei (HMw-Ds) men en nienehnniehyiviki på > 1 ooo ooo Dn eeh svavelinnehåll på 16 - 19 % köptes fi-ån Amersharn Bioscience (Uppsala, Sverige).

Lågmolekylärt dextran (LMW-D; MW 5 000 Da) och högmolekyläit dextran -D; MW > 1 ooo ooo De) erhöne från Fhike cheniieni (Bnehs, sehweiz) respektive signie ichemienis ~ ' (St. Louis, MO, USA). _ Heparinbehandling , Alla material som var i kontakt med blod försågs med en Corline-heparinyta (Corline Systems AB, Uppsala, Sverige) enligt tillverkarens rekommendation. Ytkoncentrationen av heparin var 0,5 pg/cmz, vilket motsvarar ungefär 0,1 U/cmz, med en antitrombinbindande kapacitet på 2 - 4 pmol/emz.

Preparering av blod v Färskt mänskligt blod erhållet från fi-iska fiivilliga som inte hade mottagit någon medicinering under åtminstone i 14 dagar samlades in' i ythepariniserade 60, ml sprutor (l8-gauge, Mieniinnee; Beeien Dieinnsnn, Franklin Leken, NJ), spniiefnne » knnyief ansuiis nu ythepariniserad kiseltuber. Under provtagning roterades sprlutoma kontinuerligt.

Isolering av öar Öari från vuxna grisa (API) isolerades fiân pankreas hos 2- till 3-åriga svenska Landrace- ' suggor (200 till 300 kg) med hjälp av 'enzymatiskt och mekaniskt pankreasspjälknings- förfarande följt av filtrering och separering av» öarna på Ficoll-'gradienter såsom föreslås .av Rieenii ei "hi (19, 20). (ämne vn. 'isen i Missv-ediingnineninni (Gmcor BRL, Life ~ Technologies LTD., Paisley, Skottland) kompletterat med 10 % grisserum (GIBCO, BRL), 1 mM kalciumnitrat, 0,02 pMiselen, 20 »rnM nikotinamid, 25 mM HEPES, Fungizone '(500 lig/l) 10 15 20 25 30 525 4.61 och gentamicin (50) mg/l) och odlades i 250 flaskor vid 37 °C i 5 % C02 och fuktadlufi i 1 V till 4 dagar. Odlingsmediet byttes ut på 1 och därefter varannan dag. Öamas volym och renhet bestämdes under ett inverterat milcroskop efter märkning med ditison (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). I' i ' i Statistisk analys _) ,_ .

Alla värden uttrycktes som medelvärden i SEM och jämfördes genom användning av Friedman ANOVA (Tabell 1), Student parat t-test (Tabell 3) och Wilcoxon tecken-rangtest _ (Tabell 4). P-värden < 0,05 ansågs signifikanta.

Kvalitet hos öar _ _ _ Ett statiskt glukossimuleringstest (SGLS) utfördes som ett funktionstest för API-öar. Femton öar handplockades och skakades försiktigt i Krebs-Ringer-bikarbonat som innehöll 1,6 glukos vid 37 °.C i 60 minuter. Därefier ändrades glukoskoncentrationen till 16,7 mM i ytterligare 60 minuter. Supematanterna samladeslin och förvarades vid -20 °C tills analys; Insulininnehållet i supematanterna analyserades medELIÉA (DAKO Diagnostics, Ltd., Ely, UK). Simulatorindexet beräknades som kvot mellan insulinkoncentrationen vid hög glukos respektive låg glukos. R-enheten hos de API-öar som användes i denna studier sträckte sig från 81 till 95 % (medel 88,5 i 2,2 %). Simulatorindexet i det statiska glukossimuleringstestet var i mellan 0,8 och 7,8 (3,4 i 1,2), och medelinsuliriinnchållet var 85,5 i 6,2 pmol/ug DNA.

Dessutom mättes ADP/ATP-kvoten för att utvärdera de odlade gAPI-öarnas livsduglighet genom användning av ApoGlowm-ldtet- (LumiTech, ILtd., Nottingham, UK), Kortfattat wäuedee vs öekvivelenter (mo) av API-came .i PBs een blandades därefter med ioo in numeeiiafiielappande feegene i 10 minuter vid rumstemperatur. Däfefier fineenee zo in nukleotidövervakande reagens till lösningen och ATP-nivån, mättes genom användning av en luminometer (FB 12 Luminometer, Berthold Detection Systems iGmBH, Pforzheim, Tyskland) och uttrycktes som antalet relativa 'ljusenheter Efter 10 minuter omvandlades ADP i lösningen till ATP genom tillsatts av 20 nl ADP-omvandlande reagens och uppmättes sen som antalet RLU-Venheter. Därefter beräknades ADP/ATP-kvoten i ÅPIÅ öarna såsom föreslogs av et al [2l]. Insulin/DNA-kvoten i API-öarnamättes enligt Wennberg et al [22] och uttrycktes som nmol/pg. De odlade API-öarnas överlevnadsfrekvens _ beräknades som en procentsats av iIABiQ-värden erhållna dag 3 jämfört med dag 0.' 10 15 20 25 , ^ 525 461 is Eventuell möjlig toxicitet hos LMW-DS uppskattades genom att odla API-öar från tre olika pankreas i närvaro (0,01, 0,1 eller 1 mg/ml) eller frånvaro av LMW-DS under 3 dagar.

Resultaten över överlevnadsfrekvensen, stimuleringsindex, ADP/ATP-kvot och insulin/DNA- kvot fór kontrollprov och för prov med tre olika LMW-DS-koncentrationer presenteras i Tabell l nedan. LMW-DS uppvisade ingen skadlig effekt på API-öarnas fimktion, livsduglighet eller överlevnadsfrekvens vid någon av de testade koncentrationema. Vidare upptäcktes ingen skillnad i morfologin hos de LMW-DS-behandlade API-öarna och de API- öar som odlades i frånvaro av LMW-DS.

Tabell 1 API odlade med API odlade med API odlade API odlade utan LMW-DS LMW-DS med LMW-DS LMW-DS (0,01 Ina/ml) (0,1 Ing/ml) (1 IIIs/ml) överlevnaasfiekvens (% IEQ) 57,0 i 5,2 43,6 i 6,7 58,4 i 4,3 68,9 i 2,6 Stimuleringsindex i SGS-test 1,77 i 0,17 2,26 i 0,51 3,22 i 0,89 1,42 i 0,35 ADP/ATP-kvot 0,11 i 0,03 0,08 i 0,03 0,10 i 0,03 0,11 i 0,01 Insulín/DNA-lcvot (pmol/pg) 79,0 i 11,4 66,1 i 5,8 69,1 i 9,6 71,6 i 7,4 Koaguleringstid Blod togs från fyra friska frivilliga till VacutainerTM-tuber innehållande citrat. Blod (980 ul) inkuberades med 2 ul API-öar vid 37 °C i polypropenprovskålar i en ReoRoxTM-reometer (Global Haemostasis International, Göteborg, Sverige). Koaguleringsreaktionen startades genom tillsatts av 20 ul 1 M CaClg i närvaro eller frånvaro av olika typer av dextran (LMW- DS, I-IMW-DS, LMW-D och HMW-D). Var sjätte sekund sattes skålen i fri torsions- oscillation runt dess vertikala axel och dämpningen och frekvensen hos oscillationen registrerades. Koaguleringstid identifierades som den punkt med maximal dämpning.

De resultat som erhölls från koaguleringstidexperimenten presenteras i Tabell 2 nedan. API- öar inkuberade i mänskligt blod med citrat inducerade omedelbart koagelbildning med ett medelvärde på 6,1 i 0,3 minuter efter kalciumtillsats. Koagelbildning upphävdes totalt i närvaro av LMW-DS vid alla testade doser medan HWM-DS inhiberade koagelbildníngen endast vid 0,1 mg/ml. Både LMW-D och HMW-D förlängde koaguleringstiden endast till en mindre grad järniört med kontrollprov (inga tillsatser). Således verkar sulfatering av DS vara nödvändigt for den observerade inhibitoriska kapaciteten. 10 15 20 “ 525 4-61 19 Tabell 2 experiment 1 experiment 2 experiment 3 experiment 4 Inga tillsatser 5,6 6,3 6,9 5,5 LMW-DS (0,01 mg/ml) > 60 > 60 > 60 > 60 LMW-DS (0,1 mg/ml) > 60 > 60 > 60 > 60 HMW-DS (0,01 mg/ml) 15,8 36,9 21,0 38,3 HMW-DS (0,1 ing/ml) > 60 > 60 > 60 > 60 LMW-D (0,01 mg/ml) 19,2 11,3 LMW-D (0,1 mg/ml) 25,2 25,8 HMW-D (0,01 Ing/ml) 19,8 13,8 HMW-D (0,1 mg/ml) 14,2 33,2 Inhibering av IBMIR med LMW-DS Perfusion av öar från vuxna grisar i heparinbehandlade PVC-tubloopar användes som en modell för att analysera LMW-DS:s effekt på IBMIR och xenotransplantation från gris till människa. Detta protokol utfördes väsentligen såsom tidigare beskrivet [4, 23] med vissa modifieringar. I allmänna ordalag användes loopar tillverkade av PVC (diameter 6,3 mm, längd 390 mm), vars innerytor försågs med imrnobiliserad heparin. T uben hölls ihop med en speciellt konstruerad heparinbehandlad kopplare. En cirkulär loop bildades när kopplarens ändar trycktes tätt in i tubändarnas hål. En skakande apparat, placerad i en inkubator vid 37 °C, användes för att generera blodflöde inuti looparna. Looparna skakades vid en inställning som förhindrade blodet från att komma i kontakt med kopplarna.

Sju 60-minuters öexperiment utfördes med API-öar från fyra olika LMW-DS upplöst i salin testades vid 0, 0,01, 0,1 och 1 mg/ml (slutkoncentration). För varje experiment inkluderades en loop som innehöll färskt mänskligt blod och salin utan API-öar som en kontroll. I två experiment inkluderades en loop som innehöll färskt mänskligt blod och 1 mg/ml LMW-DS utan API-öar. Samtidigt testades förinkubering av mänskligt blod med l mg/ml LMW-dextran, som inte var sulfaterat, i fem' experiment. I varje experiment tillsattes 7 ml färskt mänskligt blod fiån samma donator till varje loop. Looparna placerades sedan på den skakande apparaten i 5 rninuter med antingen LMW-DS eller salin. Därefter öppnades looparna och 100 ul salin med eller utan 5 ul API-öar (ungefär 5 000 IEQ) tillsattes till looparna och följdes av ytterligare óO-minuters inkubering på den skakande apparaten vid 37 °C. Blodglukosnivåer mättes med en glukometer (Glucometer Elite, Bayer Diagnostics, Leverkusen, Tyskland) innan perfusion. 10 15 20 25 30 . Efter varje perfiision filnerades loopinnehållen genom filter med 70 um diameter (Filcons, Cuptype, DAKO, Danmark). Både makroskopiska blodkoagel 'och vävnad uppsamlad på filtrena snabbfrystes i isopentan för immunohistokemisk märkning. Det återstående filtrerade i blodes samlades in i 4,1 mM EDTA (slutkoncentration) och användes för hematologisk analys (trombocyter, lymfocyter, monocyter och granulocyter) och analys av koaguleringsaktivering (oombin-mfitfombin [TATL faktor mo-onfioombiokompiox [Emo-Ar] ooh faktor xno- antitrombinkomplex- [FXlla-ATD, fibrinolysaktivering (plasmin-alfa-Z-antiplasrninkomplex ,[PAP]), komplementaktivering (C3a och sCnA5b-9) och _C1 esterasinhibatoraktiveríng (faktor XIa-Cl esterasinhibitor [FXla-Cl INHL faktor XIIa-Cl esterasinhibitor [FXlITa-ICIIINHD.

Prov tagna vid O, 15k och 30 minuter analyserades också. I 0-minuters proven tillsattes inte blodet till tubloopen utan överfördes istället omedelbart till de EDTA-innehållande tubarna.

Blodproven centrifiigerades vid 4 °C vid 3290 x g i 20 minuter och plasman samlades in och íörvarades vid -70 °C tills analys. Blodglukosnivåer innan API-perfusion sträckte sig från 4,8 m1 6,2 mmol/i. I i c ' i Trombocytvärden och differentiella leukocytvärden analyserades på en Coulter ACT-diff. analysator (Beckman Coulter, FL, USA) med EDTA-behandlat blod. TAT' och PAP kvantifierades med användning av kommersiellt tillgängliga enzymimmunoprovkit (EIA-lcit) (Enzygnost TAT, BehringswerkqMarburg, Tyskland; Imuclone” PAP, American Diagnostica Inc., Greenwich, USA). FXIa-AT, FXIIaAT, FXI-Cl INH och FXIIa-Cl INH analyserades enligt förfarandet i Sanchez et al [24]. C3a analyserades såsom tidigare av Nilsson Ekdahl et al [25] och SCSb-É analyserades genom användning av enmodífierlng av EIA-testet beskriver ovMouoo; orfoi [2s, 261.

I tubloopar som innehåll färskt mänskligt blod utan API-öar ihrändrades blodcellvärdena och koagtllerings- och komplementparametrarna endast lite, vilket kan ses i Tabell 3 nedangAlla dessa förändringar anses vara normala bakgrundsförändringar som' resulterar från blodets i växelverkan med tubytan och vätska-luttgränssriittet.

LMW-DS förhindrade makroskopisk koagulering", inhiberade blodcellfórbrukriing .och minskade både koagulerings- och ikomplementaktivering på ett dosberoende sätt (se Tabell 3).

En markant ölcningi .trombocyter i det LMW-DS-behandlade blodet kunde upptäckas vid en o koncentration på 0,01 mg/ml LMW-DS, vilket visar ett återställande av blodcellvärdena till 10 15 20 25 30 0 0 ann oo 0 oo lo c"... n., oo coon 0 _ con 0 40 oo 0 0 oo v o 0 ao en 0 0 nu nu noen nästan normala nivåer redan vid denna låga LMW-DS-koncentration. Koagvulerings-V aktiveringsproduktema TAT, FXIa-AT och FXIIa-AT undertrycktes vid 0,01 mig/ml LMW- DS men FXIa-AT ökade något igen vid doser som sträcker sig från 0,1 till 1 mg/ml LMW-VDS.

LMW-DS reducerar komplementaktivering såsom analyserades av genereringen avC3a och lösligt membranattackkomplex sC5b-9, vilket ses i Tabell 3. Fig." 1 illustrerar i detalj f LMW-DS:s effekt på genereringen av C3a under 60 minuter av API-perfusion med färskt mänskligt blod i tubloopismodevllen. I prov där LMW-DS tillsattes íörinkuberades dextran- sulfatet med färskt blod 5 minuter innan API-perfusion med blodet. Vita cirklar motsvarar 0 mg/nu LMw-Ds, svarta cirklar representerar o,o1 mg/mi LMW-Ds och vita kvadrater och svarta kvadrater motsvarar 0,1 mg/ml respektive 1 mg/ml LMW-DS. Ett motsvarande diagram över LMW-DS:s effekt på genereringen av sC5b-9 hittas i Fig. 2.. Såsom tydligtses fi-ån diagrammen i Fig. 1 och 2 skedde den huvudsakliga komplementalctiveringen ungefär 30 i minuter efter API-perfusion. Administrering av 0,1 mg/ml och I mg/ml LMW-DS inhiberade' totalt 'genereringen av både C3a och rnembranattackkomplexet sC5b-9, medan den lägre koncentrationen av LMW-DS (0,01 mg/ml) minskade genereringen av C3a väsentligt.

FXIa-Cl INH genererades inte i några av de itubloopar som testades under A60 minuters- perfusion (data visas inte). FXIIa-Cl INH ändrades varken i närvaro eller frånvaro av LMW- Ds. ' i ' PAAP ökade i fiånvaro av LMW-DS men undertrycktes väsentligt vid 0,01 mg/ml LMW-DS. 5 5 4 f» 1 f; . f; . f: ärr. 4 b 0 u c 0 nu I cl 060: o; oc c _ I Tabell 3 Iman perfusion Efler perfusion Inga API API med LMW-DS (mg/ml) , _ 0 0,01 0,1 1 (11=7) - (11=7) (11=7) (11= _ (11=7) (P7) Trombocyter _ _ _ _ i . _ , 9 252,7 i 9,9 141,8 i 11,8 6,4 i 5,6 108,2 i12,9 146,1 i 8,1 _ 162,3 i 8,9 (xl0 Il) Lymfocyter ' - 9 2,15i0,09 2,04i0,l0 l,66i0,21 1,90i0,1l 1,91i0,l2 l,89i0,10 (xl0 /l) ' _ .I - Monocyter ' 1 ' i _ , ' _ 9 0,39 i 0,06 0,31 i 0,02 0,15 i 0,03 0,48 i 0,10 0,40 i 0,07 0,31 i 0,05 (x10 ll) , - ' Gxanulocyter i - _ _ . 9 2,90 i 0,35 2,66 i 0,36 1,17 i 0,34 ~ 2,20 i 0,40 2,80 i 0,50 2,92 i 0,37 _ (xl0 ll) _ A _ TAT _ _ _ 1 , 9,0 i 3,7 144,0 i 63,8 7042,5 i1314,1 645,3 i 177,4 61,0 i 8,6 15,0 i 5,6 (ug/Hfl) , ' . ma-AT * ' _ ' . 0,03 i 0,01 0,10 i 0,03 3,00 i 0,60 0,13 i 0,01 0,08 i 0,01 1,17 i 0,41 (wml/I) _ “ FXHa-AT _ _ 0,05 i 0,01 0,06 i 0,01 2,02 i 0,63 0,08 i 0,02 (umfll/l) “ C3a(ng/m1) “ 63,0 i 7,8 590,2 i 105,3 1122,5 i 132,0 630,6 i 103,4' 191,7 i 36,6' 215,6 i 52,2 scsb-9 ^ _ - _ _ _ 24,0 i 2,7 104,7 i 20,7 182,1 i 33,4 151,4 i 27,9 _ 61,9 i 6,5 53,9 i 7,1 (AU/mn Fxna-c1 mh ' 0,07 i 0,01 0,09 i 0,03 0,06 i 0,01 ~ 0,10 i 0,03 (umfll/ml) ~ _ - PAP ' _ ^ _ _ 585,7 i 240,9 443,0 i 179,4 1o12,5 i 224,0 398,2 i 60,7 (ng/ml) ' ' * i _ Signifikant skillnad jämfört medAPI-lobpar utan I -DS genom användning av Stndent t-test. I i ' i Vi _ I LMW-dextrans effekt på blodcellsvärdet, koagulerings- och komplementparametrar efter 60- minuters API-perfiision med färskt mänskligt blod ündersöktes med hjälp av tnbloopmodellen- på liknande sätt som för LMW-D$ sålsórn' diskuteradeš ovan. Enjämförelse mellan LMW-Dá och LMW -DS på lBMlRzs symptomer återfinns i Tabell 4. LMW-dextran Som inte är sulferad 10. 15, 20 25 4~ 23 Qfl CH -_å» ÜUÛOO 2 Ifizlflfl ICC :IDO Û .Û Ö I C .ÜÛI ':. Û.. hade endast en marginell effekt på IBMIR. Dessa data indikerar att sulfatering verkar vara avgörande för dextrans inhiberande eiïekt på lBMlR utlöst av API-öarna. i i Tabell 4 LMw-ns (1 mg/ml, n=s) LMw-D (1 mg/mi, n=s) rmmbocyrer (><1o”/1) 181,1 i 16,3' 44,9 i 18,7 Lymfocytef (9109/1) 1,94 i 0,12 2,14 i 0,32 Monocyter (><10°/1) _ 0,30 i 0,10 0,29 i 0,02 Gmnuiocyter (x1o°/1) - 3,23- i 0,21' 1,90 i 0,43 rar (pg/ml) 12,8 i 4,9' ' 4429,2 i 20025 FXIa-AT (pmm/i) 1,56 i 0,82 - 1,09 i 0,08 Cßflauls/ml) 171,5 172,4' 14903 í406,4' sC5b-9 (AU/ml) 41,5 i 11,5' . 157,3 i 19,1 'i Signifikant skillnad järniört med API-looparna med LMW-D genom användning av Wilcoxon tecken-rangtest.

Direkt effekt av LMW-DS på komplementsystemet i mänskligt serum LMW-DSzs direkta effekt på komplernentkaskaden undersöktes genom inkubering av mänskligt serum i polypropentuben. Serum (1 ml) tillsattes till vardera tub tillsammans med LMW-DS vid en slutkoncentration på 0, 0,01, 0,1 eller 1 mg/ml. Vid 5, 10, 15, 30, 45 och 60 minuter efier sefumnkubefmgvia 37 °c överfördes 100 111 56mm 1111 mha; sontinnehöli 10 mM EDTA, Dessa prov förvarades vid -70 °C innan analys av komplementkomponenterna C3a och sC5l9-9. I. ' Fig. 3 illustrerar LMW-DS:s effekt på närvaron av C3a och sC5b-9 hos komplement- systemetet i mänskligt serum. Värdena uttrycks som procent av mängden C3a och sC5b-9 i kontrollprov (utan LMW-DS). Fyllda staplar representerar generering av C3a och ofyllda motsvarar sC5b-9. Vid 0,01 mg/ml LMW-DS återspeglades en ökad komplementaktivering i ökad generering av både C3a och sC5b-9, men vid 1 mg/ml sågs en inhiberande effekt. Fastän “ effekterna på blod ochserurn intekan järnföras direkt inducerar LMW-DS själv troligen i komplementaktivering vid den lägsta tillförda LMW-DS-dosen. Vid en högre koncentration ta den inhiberande effekten över. 10 1 5A 20 c 9 00050 I n oc II 0 I o n 00 I o l I cc 0 .to 0000 s 6 -== 2 Immunohistokemiska experiment g v Öar och makroskopiska blodkoagel återvanns på filter efter 60 minuters perfusion med blod och med LMW-DS (0,1 mg/ml och 1 mg/ml) eller utan LMW-DS (kontroll), samlades därefier in inneslutande medium (Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN, USA) och snabbfrös i isopentan. Öar skars upp i sektioner och märktes därefter med pepparrotsperoxidaskonjugerad (HRP-konjugerad) mus anti-människa-'CD4la (R&D Systems, Adigdon, UK) och anti- cm w* (came 2LPM 190, DAKo). l i Efier 60 minuter konstaterades det att öar som togs obehandlade kontrolloopar var inneslutna i koagel. Immunohistokernisk märkning visade en kapsel av fibrin och trornbocyter som omgav öarna. Fig. 4 visar infiltreringen av CDl lbïpolymorfonukleära celler och ' monocyter i kontrollöarna. Tvärternot sågs en fullständig inhibering av koagelbildning och antalet infiltrerande CDI lbïceller minskade avsevärt då 1 mg/ml LMW-DS tillsattes under » . inkuberingen, vilket illustreras i Fig. 5. En liknande effekt observerades även vid 0,1 mg/ml.

Kontrollproven uppvisade även ett tjockt lager av trombocyter fästa på cellerna, vilket ses i Fig. 6. Ett mycket tunnare lager av trombocyter som fäster på öarna observerades i de LMW- DS-behandlade proven, vilket illustreras i Fig. 6. Kontrollöar som inte utsattes för* blod var negativa ßr all använd märkning.

Det kommer attinses av fackmannen att olika modifieringar och ändringar kan göras av den föreliggande uppfinningen utan att avvika fi-ån dess omfattning, som definieras av de bifogade patentkraven. 10 15 20 25 30 111 ' [2] [3] [4] [5] [6] 111 [3] [9]

[10]

[11] REFERENSER Shapiro A M, et al., “Islet transplantation in seven patients type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-fiee immunosuppressive regimen”, N Engl J Med, vol..- 343, of. 4, sioomo 230-238 (2000) I Ryan E A, et al., “Clinical outcomes and insulin secretion after islet transplantation Wim mo Edmonton pfotoooi", Diobofoo, vo1. so, of. 4, sidoma 710-719 “(2001) Bennet. W, et al., “Damage to porcine islets of Langerhans afier exposure to human blood in vitro, or after intraportal transplantation to cynomo-logus monkeys: nrotective effects of sCRl and heparin", Transplantation, vol. 69, nr. 5, sidoma 711-719 (2000) Bennet W, et al., ”IncompatibiIity between human blood and isolated islets of Langerhans: a finding implications for clinical intraportal islet transplantation?”, Diabetes, vol. 48, nr. 10, sidorna 1907-1914 (1999) Buhler L, et al., “Adult porcine islet transplantation in baboons treated with conventional imrnunosuppression or a non-niyeloablative regimen and CD154 _ blockade”, Xenotransplantatíon, vol. 9, nr. l, sidorna 3-13 (2002) _ Cantarovich D, et al., “Rapid failure' of pig' islet transplantation in non human, pnmoiosà Xonommopzonfoaon, voi. 9, of. 1, sidoma 25-35 (2002) ' Carroll M C, and Fischer M B, “Complement and the immune response”, Curr Opin Immunol, vol. 9, nr. 1, sidoma 64-69 (1997) Pratt J R, et al., “Effects of complement inhibition with soluble complement receptor-l i on vascular injury and inflammation during renal allografi rejection in the rat”, Am J Pathol, vol. 149, nr. 6, sidorna 2055-2066, (1996) . i Fiorante P, et al., “Low moleculartweight dextran sulfate prevents' complement activation and delays. hyperacute rejection in jaig-to-human oxenotransplantation models”, Xenotransplantation, vol. 8, nr 1, sidoma 24-35, (2001) Baldwin W M, et al., “Complement in. organ transplantation. Contributions to, inflammation, injiny, and rejection", Transplantation, vol. 59, nr. 6, sidorna 797-808 »(1995) I , Brauer R B, et al., “The contribution of terminal complement components to acute and' hyperacute allogutfi rejection in the ra1”, Transplantation, vol. 59, nr. 2, sidoma 288- 293 (1995) _ ~ - " i 10 15 '20 25 30

[12]

[13]

[14]

[15] .[16]

[17]

[13]

[19]

[20] -. [21]

[22] 1221 Wuillemin W A, et al., “Potentiation of Cl inhibitor by glycosarrrinoglycans: dextran sulfate species are effective ínhibitors of in vitro complement activation in plasma", J Immunol, vol. 159, nr. 4, sidoma 1953-1960 (1997) i Nakano M, et al., “Hepatocyte growth factor is essential for amelioration of ' hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic mice receiving a marginal mass of intrahepatic islet grafis”, Transplantation, vol. 69, nr. 2, sidoma 214-221 (2000) Thomas H, et al., “Sulfonated dextran inhibits complement activation and complement- dependent cytotoxicity in an in vitro model of hyperacute xenografi rejection", Mal Immunol, vol. 33, nr. 7-8, sidorna 643-648 (1996) i I Korsgren O, etal., “Angiogenesis and angioarchitecmre of transplanted fetal porcine islet-like cell clusters", T ransplantatíon, vol. 68, nr. 11, sidorna 1761-1766 (1999) Menger M D, et al., “Revascularization and microcirculation of freely grafied islets of Langerhans”, World .I Surg, vol. 25, nr. 4, sidorna 509-515 (2001) Jensen L, “Growth factor-mediated angiogenesis the malignant progression of glial tumors: a review”, Surg Neurol, vol. 49, nr. 2, sidorna 189-195, diskussion 196 (1998) . .

Duon 1 F, ot oi., “Growth ifootms to gfioma oogiogooosis; Fors, PDGF, EGF, and 1 rosor, JNouroonool, voi. so, m. 1-2, sioom1o121-1s7a00o) , Ricordi C, 'et al., “A method for the mass isolation of islets' fi-orn the adult pig pancreas”, Diabetes, vol. 35, nr. 6, sidoma 649-653 (1986) 'Wennberg L, 'et al., “Diabetic rats transplanted with adult norcine islets and immunosuppressed with cyclosporine A, mycophenolate mofetil, and leflunomide remain normoglycemic for up to 100_ days", Transplantation, vol. 71, nr. 8, 'sidorna - 1024-1033 (2001) Bradbury D A, et al., “Measurement of the ADPizATP ratio in human leukaernic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis", J Immunol Methods, vo1. 240, m. 1-2, sidoma 79-92 (2000) i Wennberg L, et, al., “Effects of imrnunosuppressive treatment on host responses i» against intracerebral porcine neural tissue xenografis in rats”, Transplantation, vol. 71, ' i m.712,s1<1omo 1797-1806 (2001) .

Gong J, et al., “Tubing loops-as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in _ vmo moder: .1 Clin Immunoz, vo1. 16, m. 4, sidoma 222-229 (1996) k) (Fl -ß- (JN ...x

[24] Sanchez J, et al., “Studies of adsorption, activafion, and inhibition of factor XII on immobilízed heparin", Ilzromb Res, vol. 89, nr. 1, sidorna 41~50 (1998)

[25] Nilsson Ekdahl K, et al., “Generation of iC3- at the interface between blood »and gas”_l, Scand J Immunal, vol. 35, nr, 1, sidorna 85-91 (1992)

[26] Mollnes T E, et al., “A new model for evaluation of biocompatibility: combined determination of neoepitopes in blood and on attificial surfaces demonstrates reduced complement activation by inunobilization of heparin”, Artzf Organs, vvol. 19, nr. 9, sidorna 9091-917 (1995) _

Claims (10)

10 15 20 25 30 000 zs PATENTKRAV

1. l. Användning av dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav för framställning av ett läkemedel för behandling av omedelbar blodfónnedlad inflammatorisk reaktion (IBMIR).

2. Användning av dextransulfat enligt patentkrav l, kännetecknad av att IBMIR orsakas av utsättande av ett celltransplantat för blod efter transplantation av celltransplantatet in i en främmande mottagande kropp.

3. Användning av dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav för framställning av ett läkemedel för behandling av inorfologisk upplösning av transplanterat celltransplantat orsakad av en omedelbar blodförmedlad infiammatorisk reaktion (IBMIR).

4. Användning av dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat därav för framställning av ett läkemedel för behandling av transplantatavstötning av celltransplantat.

5. Användning av dextransulfat enligt patentkrav 4, kännetecknad av att transplantatavstötningen av celltransplantat beror på en omedelbar blodíönnedlad ínflammatorisk reaktion (IBMIR).

6. Användning av dextransulfat enligt något av patentkraven 2 till 5, kännetecknad av att celltransplantatet väljs från en lista av: - allogent celltransplantat; eller - xenogent celltransplantat.

7. Användning av dextransulfat enligt något av patentkraven 2 till 6, kännetecknad av att celltransplantatet väljs fiån en lista av: - enskild cell ; - kluster av celler; eller - icke-vaskulär vävnad.

8. Användning av dextransulfat enligt något av patentkraven 2 till 7, kännetecknad av att celltransplantatet är Langerhanska öar. o o ooo o o oo o oo oo oo oo o o o o o o o o o o o o o o o o o o oo o o o o o o o o o o o o o o o o ooo o o I ooo ooo oo o ooooo oo o o oo oo o o o o o o oo o o o o o o o o o o o o o 29 . . . . Ü\ 525 4

9. Användning av dextransulfat enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknad av att dextransulfatet har en molekylvikt på mindre än 20 000 Da, företrädesvis mindre än 10 000 Da.

10. Användning av dextransulfat enligt något av de föregående patentlcraven, kännetecknad av att dextransulfatet har ett svavelinnehåll på 10 - 25 %, företrädesvis 15 - 20 %.