EA010409B1 - Применение декстрансульфата для ингибирования немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарства для лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (IBMIR, instant blood-mediated inflammatory reaction). Кроме того, изобретение относится к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарства для лечения морфологического разрушения клеточных трансплантатов и отторжения клеточных трансплантатов, вызванных IBMIR. Данное изобретение можно применять для пациентов, страдающих диабетом I типа, которым в воротную вену трансплантируют островки Лангерганса свиньи. Введение декстрансульфата по изобретению подавляет и предотвращает отторжение и разрушение трансплантируемых островков и обеспечивает возможность нормогликемии у пациентов.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новому применению декстрансульфата.

Предшествующий уровень техники

На сегодняшний день около 10 млн людей во всем мире страдают диабетом I типа, который также называется инсулинозависимым сахарным диабетом. Однако, по приблизительным подсчетам, количество пораженных людей заметно увеличивается и к 2010 году может затронуть до 25 млн человек. В настоящее время проводится исследование, чтобы попытаться достичь долговременной нормогликемии у пациентов с диабетом I типа путем введения инсулинпродуцирующих β-клеток. Двумя основными методами являлась трансплантация либо васкуляризированных трансплантатов поджелудочной железы, либо изолированных островков Лангерганса. Хотя был достигнут некоторый успех с васкуляризированными трансплантатами (целой поджелудочной железой), все же остаются проблемы, главным образом, из-за хирургического риска и послеоперационных осложнений. Кроме того, также существует проблема нехватки подходящих доноров трансплантатов поджелудочной железы. Напротив, трансплантацию изолированных панкреатических островков традиционно осуществляют путем чреспеченочной инъекции островков в воротную вену, в силу чего островки закупоривают воротное дерево печени.

Новый протокол аллотрансплантации островков, который был недавно представлен 8йар1го и коллегами [1], несомненно, будет полезен для целого ряда пациентов с диабетом I типа. Однако даже при этом новом подходе оказывается, что трансплантации островков поджелудочной железы одного донора недостаточно для создания нормогликемии у пациента [2]. В результате ожидается, что обеспечение островками человека станет лимитирующим фактором в лечении. В таком случае должны быть найдены альтернативные источники инсулинпродуцирующих клеток. Одной из возможностей является использование островков, полученных из тканей животных, причем основным кандидатом являются островки, полученные от свиней.

Одним из основных препятствий, которые необходимо преодолеть до того, как ксенотрансплантация островков станет возможной, является неблагоприятная воспалительная реакция, которую вызывают свиные островки при воздействии свежей крови человека ίη νίίτο и ίη νίνο [3]. Островки человека также вызывают неблагоприятную воспалительную реакцию при воздействии на них крови пациента, соответствующей по системе АВО, во время интрапортальной трансплантации [4]. Воспалительная реакция характеризуется быстрым расходованием и активацией тромбоцитов, которые прикрепляются к поверхности островка, способствуя активации каскадов коагуляции и комплемента. Кроме того, островки включаются в сгустки и инфильтруются СЭ11Ь' лейкоцитами, что в совокупности приводит к деструкции морфологии клеток и к потере нормогликемии у пациентов [3-4]. Более того, воспаление может ускорить следующий клеточно-опосредованный специфический иммунный ответ на более поздней фазе [5-8]. Следовательно, подавление немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (ΙΒΜΙΚ, ίηκίαηί Ыоой-тсШа1сй тПаттаЮгу геасбоц), как называют неблагоприятную воспалительную реакцию, оказывается решающим для успеха аллотрансплантации и ксенотрансплантации островков.

Два недавних исследования Ви11с1сг еί а1. [5] и СаЩаго\зс11 еί а1. [6] показали, что островки от взрослых свиней сразу же разрушаются при интрапортальной трансплантации в печень нечеловекообразных приматов даже в условиях традиционной для предшествующего уровня техники широкой иммуносупрессии. В этих исследованиях авторы сделали заключение, что мощный врожденный иммунный ответ, 1ВМ1Я, на который не влияют иммуносупрессивные лекарственные средства, вовлечен в деструкцию ксеногенных островков.

РюгаЛе еί а1. изучали применение декстрансульфата в предупреждении сверхострого отторжения (НАЯ) васкуляризированных дискордантных ксенотрансплантатов [9]. В модели ксенотрансплантации НАЯ легких свиньи, перфузируемых кровью человека, обработанной цитратом для предотвращения коагуляции, происходило через 30 мин. Однако добавление декстрансульфата в концентрации 2 мг/мл продлило выживание легкого до приблизительно 200 мин. НАЯ васкуляризированных целых органов опосредовано действием антител в крови человека, которые идентифицируют и связываются с экспонированными антигенами на эндотелиальных клетках кровеносных сосудов трансплантированных органов. Такая опосредованная антителами НАЯ реакция усиливается компонентами системы комплемента [8, 10, 11]. Так как известно также, что декстрансульфат подавляет активацию комплемента [9, 12], предполагается, что длительное выживание легкого при применении декстрансульфата в используемой модели ксенотрансплантации происходит в результате такого антикомплементного действия декстрансульфата.

Какапо и сотрудники трансплантировали изолированные сингенные островки в печень мышей с 8Т2(стрептозотоцин)-индуцированным диабетом с целью изучения роли фактора роста гепатоцитов (НОР) в уменьшении интенсивности гипрегликемии [13]. Известно, что декстрансульфат усиливает действие НОР, и поэтому НОР вводили мышам-реципиентам внутрибрюшинно вместе с декстрансульфатом. Такое введение вызывало нормогликемию у всех мышей, включенных в исследование. Введение одного декстрансульфата также продемонстрировало некоторый благоприятный эффект у нескольких мышей, но не в тех случаях, когда местом трансплантации островков было субкапсулярное пространство почек. Дополнительная обработка анти-НОР антителами мышей, которым вводили декстрансульфат, полностью аннулировала благоприятный эффект декстрансульфата, это означало, что эффект декстрансульфата в

- 1 010409 этой модели аллогенной трансплантации островков мышам опосредован эндогенным НСЕ.

Тйошак с1 а1. [14] показали, что растворимые производные декстрана подавляют активацию комплемента и опосредованное комплементом повреждение ίη νίίτο. Инкубация эндотелиальных клеток аорты свиньи в сыворотке человека приводила к расходованию комплемента и отложению активированных фрагментов С3, С5 и атакующего мембрану комплекса С5Ь-9 в эндотелиальных клетках. Добавление 25 мг/мл декстрансульфата СМЭВ25 подавляло активацию комплемента и отложение цитолитического комплекса на клетках. Чистый декстран не оказывал подобного действия.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение преодолевает эти и другие недостатки средств предшествующего уровня техники.

Основной целью настоящего изобретения является предложение лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (ΙΒΜΙΚ).

Другой целью изобретения является предложение лечения морфологического разрушения клеточных трансплантатов, вызываемого ΙΒΜΙΚ

Еще одной целью изобретения является предложение лечения отторжения клеточных трансплантатов, вызываемого ΙΒΜΙΚ

Изобретение, как оно определено в прилагаемой формуле изобретения, удовлетворяет этой и другим целям.

Кратко, настоящее изобретение включает применение декстрансульфата и его производных для лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (ΙΒΜΙΚ). Эта недавно описанная форма воспаления инициируется, когда клетки или клеточные кластеры подвергаются действию чужой крови ίη νίίτο и ίη νίνο. Очень важным примером ΙΒΜΙΒ является случай, когда аллогенные или ксеногенные клеточные трансплантаты трансплантируют в тело млекопитающего пациента-реципиента, особенно человека. В таком случае ΙΒΜΙΒ приводит к морфологическому разрушению и деструкции трансплантируемых клеток или клеточных кластеров, проявляющимся в потере структуры и формы. Кроме того, ΙΒΜΙΒ также обычно приводит к отгоржению клеточных трансплантатов.

Введение декстрансульфата или его производных аннулирует вредное действие ΙΒΜΙΒ и эффективно предотвращает отторжение трансплантата и морфологическое разрушение клеточных трансплантатов. Декстрансульфат по изобретению может иметь молекулярную массу от низкомолекулярного декстрансульфата (ΕΜν-08), например от нескольких сотен или тысяч дальтон (Да), до высокомолекулярного декстрансульфата (ΗΜ\ν-Ω8). обычно с молекулярной массой более 500000 Да, например более 1000000 Да. Благоприятное действие декстрансульфата особенно заметно для ΕΜν-08, но положительный эффект также виден при введении декстрансульфата с более высокой молекулярной массой. Благоприятное действие более крупных молекул декстрансульфата на ΙΒΜΙΒ по изобретению может быть усилено путем увеличения серосодержания, т. е. числа сульфатных групп на гликозильный остаток в цепи декстрана. ΕΜν-08, как правило, имеет молекулярную массу ниже 20000 Да, например ниже 10000 Да и например около 5000 Да. Среднее серосодержание для ΕΜν-08 может составлять от приблизительно 10 до 25%, например от 15 до 25%, что соответствует приблизительно двум сульфатным группам на гликозильный остаток. Для декстрансульфата со средней молекулярной массой выше 20000 Да может использоваться большее серосодержание.

Декстрансульфат или его производные можно вводить для системной доставки к месту ΣΒΜΙΒ или клеточной трансплантации или можно вводить для доставки непосредственно (локально) в это место. Таким образом, согласно изобретению декстрансульфат или его производные можно вводить перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, защечно, ректально, кожно, назально, трахеально, бронхиально, местно, любым другим парентеральным путем или посредством ингаляции, в виде фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент в фармацевтически приемлемой лекарственной форме.

При терапевтическом лечении млекопитающих, и особенно человека, декстрансульфат и его производные могут быть введены сами по себе, но, как правило, будут вводиться в виде фармацевтического препарата в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, который может быть выбран с учетом предполагаемого пути введения и общепринятой фармацевтической практики.

Количества декстрансульфата или его производных в препарате будут зависеть от тяжести состояния и от пациента, подлежащего лечению, а также от фактического препарата и используемого способа введения и могут быть традиционным образом определены специалистом. Концентрация вводимого декстрансульфата или его производных по настоящему изобретению не должна быть слишком высокой, чтобы минимизировать любые побочные эффекты, связанные с декстрансульфатом. В большинстве клинических ситуаций подходящими дозами декстрансульфата или его производных в терапевтическом и/или профилактическом лечении пациентов-млекопитающих, особенно человека, являются те дозы, которые обеспечивают среднюю концентрацию в крови менее 5 мг/мл, возможно менее 2 мг/мл и особенно менее 1 мг/мл. Предпочтительный интервал концентраций находится между 0,01 и 1 мг/мл декстрансульфата, например более 0,05, более 0,08 или более 0,1 мг/мл и/или менее 0,8, менее 0,6, менее 0,4 или менее 0,2 мг/мл, например в интервале концентраций от 0,01 до 0,2 мг/мл и/или от 0,05 до 0,2 мг/мл.

- 2 010409

Декстрансульфат по настоящему изобретению особенно подходит для предотвращения отторжения инсулинпродуцирующих β-клеток, трансплантируемых пациентам, страдающим диабетом I типа. Таким пациентам островки Лангерганса других людей или млекопитающих, предпочтительно островки свиньи, можно трансплантировать посредством инъекции этих островков в воротную вену пациентов. Однако при воздействии крови пациента на островки инициируется ΙΒΜΙΚ и инсулинрегулирующая функция островков инсулина ликвидируется, а островки отторгаются. Поэтому, когда осуществляют трансплантацию клеток или клеточных кластеров, предпочтительно достичь терапевтической концентрации декстрансульфата или его производных, по меньшей мере, в месте трансплантации. Этого можно добиться путем введения декстрансульфата перед фактической трансплантацией. Альтернативно, можно инъецировать островки, разведенные в растворе, содержащем декстрансульфат по настоящему изобретению, с целью подавить ΙΒΜΙΚ и предупредить любое разрушение или отторжение островков, делая возможной нормогликемию у пациентов. Концентрация декстрансульфата в таком растворе клеток и декстрансульфата предпочтительно является достаточно высокой, так чтобы можно было достичь терапевтической концентрации декстрансульфата, т.е. предпочтительно менее 5 мг/мл, более предпочтительно от 0,01 до 1,0 мг/мл и особенно от 0,01 до 0,2 мг/мл, по меньшей мере, местно, в месте трансплантации в течение первых часов после трансплантации. Затем декстрансульфат диффундирует от места трансплантации с понижением местной концентрации декстрансульфата. В некоторых применениях для подавления ΙΒΜΙΚ, морфологического разрушения и/или отторжения клеточных трансплантатов не требуется дополнительного декстрансульфата, так как терапевтическая концентрация декстрансульфата возможно требуется только в течение первых 24-48 ч после трансплантации. Однако, когда требуется, может быть добавлен дополнительный декстрансульфат, например, внутривенно, внутрибрюшинно или каким-либо другим способом введения. Специалисту очевидно, что введение раствора декстрансульфата, содержащего клетки или клеточные кластеры, подлежащие введению, можно также комбинировать с введением декстрансульфата или его производных перед фактической трансплантацией.

Декстрансульфат или его производные можно также комбинировать с другими терапевтическими агентами, которые полезны в лечении отторжения трансплантируемой ткани. Подходящими, но не ограничивающими примерами таких иммуносупрессивных агентов, которые могут быть использованы совместно с декстрансульфатом для лечения отторжения трансплантата, являются циклоспорин, такролимус, кортикостероиды, рапамицин (сиролимус) и микофенолата мофетил. Введение декстрансульфата по настоящему изобретению может также быть согласовано с введением анти-ТЕ(тканевого фактора) антител и/или фактора УПа с инактивированным сайтом, которые также в некоторой степени обладают функцией подавления ΙΒΜΙΚ.

Краткое описание графических материалов

Изобретение вместе с его дополнительными объектами и преимуществами легче всего понять, обращаясь к следующему описанию и прилагаемым графическим материалам, где фиг. 1 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую действие ΤΜ^-Όδ на генерацию С3а во время перфузии островков свиньи с кровью человека;

фиг. 2 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую действие ΤΜ^-Όδ на генерацию §С5Ь-9 во время перфузии островков свиньи с кровью человека;

фиг. 3 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую прямое действие ΤΜ^-Όδ на систему комплемента при инкубации сыворотки в присутствии ΤΜ^-Όδ;

фиг. 4 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, не содержащей ΤΜ^-Όδ;

фиг. 5 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, содержащей 1 мг/мл ΤΜ^-Όδ;

фиг. 6 иллюстрирует распределение тромбоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, не содержащей ΤΜ^-Όδ;

фиг. 7 иллюстрирует распределение тромбоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, содержащей 1 мг/мл ΤΜ^-Όδ;

фиг. 8 иллюстрирует экспрессию инсулина в островках свиньи после интрапортальной трансплантации диабетическим бестимусным мышам без обработки ΤΜ^-Όδ;

фиг. 9 иллюстрирует экспрессию инсулина в островках свиньи после интрапортальной трансплантации диабетическим бестимусным мышам с обработкой ΤΜ^-Όδ;

фиг. 10 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после интрапортальной трансплантации диабетическим бестимусным мышам без обработки ΤΜ^-Όδ и фиг. 11 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после интрапортальной трансплантации диабетическим бестимусным мышам с обработкой ΤΜ^-Όδ.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение, в целом, относится к новому неожиданному действию декстрансульфата на немедленную воспалительную реакцию, опосредованную кровью (ΙΒΜΙΚ), и морфологическое разрушение и отторжение клеточных трансплантатов, вызываемые ΙΒΜΙΚ.

ΙΒΜΙΚ представляет собой относительно недавно идентифицированную воспалительную реакцию,

- 3 010409 инициируемую при воздействии на клетки или клеточные кластеры или при контакте с ними чужеродной крови. ΙΒΜΙΚ характеризуется экспрессией тканевого фактора на клетках, который инициирует местную генерацию тромбина. Затем активированные тромбоциты прикрепляются к клеточной поверхности, способствуя активации систем коагуляции и комплемента. Кроме того, накапливаются лейкоциты и происходит инфильтрация клеток. Вместе эти эффекты вызывают разрушение и уничтожение клеточной морфологии в течение первых нескольких часов после контакта с чужеродной кровью. ΙΒΜΙΚ также ускоряет последующий клеточно-опосредованный специфический иммунный ответ на более поздней фазе.

Очень важным примером ΙΒΜΙΚ. является случай, когда клетки или клеточные кластеры трансплантируют в организм предпочтительно млекопитающего пациента, и особенно человека. При контакте с кровью пациента-реципиента клетки инициируют ΙΒΜΙΚ, что приводит к разрушению клеточной морфологии и, как правило, к отторжению клеточного трансплантата. ΙΒΜΙΚ была обнаружена как при аллогенной клеточной трансплантации, когда клетки донора с кровью, соответствующей по системе АВО, трансплантируют пациенту, так и при ксеногенной клеточной трансплантации, включая ксенотрансплантацию клеток и/или клеточных кластеров от свиньи обезьяне и от свиньи человеку.

Выражение клеточный трансплантат в общем случае относится в настоящем изобретении к одиночной клетке, нескольким одиночным клеткам или кластеру из многих клеток, трансплантируемым в организм реципиента, предпочтительно млекопитающего, и особенно человека. Также выражение клеточный трансплантат в данном контексте включает более крупные клеточные кластеры неваскуляризированных тканей. Примерами клеточных трансплантатов по настоящему изобретению являются аллогенные или ксеногенные островки Лангерганса, трансплантируемые в воротную вену печени пациентов, страдающих диабетом Ι типа. Еще одним примером может являться трансплантация эмбриональной ксеногенной нервной ткани/клеток в полосатое тело пациентов с болезнью Паркинсона.

Как кратко обсуждалось в разделе Предшествующей уровень техники, перспективной процедурой для достижения нормогликемии у пациентов с диабетом Ι типа является трансплантация инсулинпродуцирующих β-клеток, например, в воротную вену. Подходящие инсулинпродуцирующие клетки, например в виде островков Лангерганса, могут быть получены как от аллогенных, так и от ксеногенных доноров. Из-за того, что для достижения нормогликемии требуются островки от нескольких доноров, и из-за нехватки подходящих доноров-людей могут быть использованы ксеногенные, предпочтительно свиные островки. Однако как аллогенные, так и ксеногенные островки вызывают ΙΒΜΙΚ при воздействии крови пациента-реципиента. В результате в течение нескольких часов после трансплантации морфология клеток разрушается и уничтожается, что, как правило, проявляется в потере целостности, структуры и формы клеток. Это приводит сначала к сильному увеличению высвобождения инсулина из островков Лангерганса с последующим уменьшением или прекращением высвобождения инсулина. Другими словами, вскоре за трансплантацией следует потеря нормогликемии. Кроме того, ΙΒΜΙΚ также вызывает отторжение клеточных трансплантатов.

Введение традиционных иммуносупрессивных лекарственных средств, которые предотвращают продуцирование антител и отторжение органов, не оказывает влияния на ΙΒΜΙΚ или на отторжение клеточных трансплантатов, вызываемое ΙΒΜΙΚ. Это свидетельствует о том, что основные механизмы ΙΒΜΙΚ и отторжения клеточных трансплантатов отличаются от механизма отторжения, обнаруженного в трансплантации целых органов и васкуляризированной ткани.

Далее в описании следует более подробный обзор симптомов ΙΒΜΙΚ, и в частности расходования тромбоцитов, активации коагуляции и комплемента и инфильтрации лейкоцитов. Кроме того, рассматриваются влияния декстрансульфата на соответствующие симптомы. Для более детального обсуждения таких влияний декстрансульфата сделана ссылка на раздел Примеры.

Начинаясь с расходования тромбоцитов, ΙΒΜΙΚ оказывает влияние на число тромбоцитов в крови, подвергаемой воздействию аллогенных или ксеногенных клеток или клеточных кластеров. В крови после контакта кровь-клетка может быть обнаружено значительное снижение свободно циркулирующих тромбоцитов. Тромбоциты активируются и прикрепляются к клеткам, что приводит к агрегации тромбоцитов. После прикрепления к клеткам тромбоциты высвобождают некоторые вещества, включая фосфолипиды тромбоцитов, которые важны для образования сгустка и активации системы коагуляции.

Введение эффективного количества декстрансульфата по изобретению подавляет расходование тромбоцитов, что видно по увеличению количества тромбоцитов в крови, которое возвращается к значению, определенному в крови до воздействия чужеродных клеток или клеточных кластеров. Кроме того, декстрансульфат значительно уменьшает прикрепление тромбоцитов к клеткам, хотя все-таки могут наблюдаться следовые количества тромбоцитов, окружающих островки. Действие этих оставшихся тромбоцитов, однако, не обязательно является неблагоприятным. Исследования на животных показали, что после трансплантации проходит по меньшей мере 1 неделя до того, как обнаруживается ангиогенез [15,16]. Тромбоциты содержат ряд важных факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста (ΡΌΟΕ), фактор роста эндотелия сосудов (УЕСЕ) и фактор роста фибробластов (ЕСЕ) [17, 18], которые могут поддерживать реваскуляризацию и приживление островков в организме пациента. В случае клинической трансплантации островков, когда островки вводят в воротную вену, гирлянда прикрепленных тромбоцитов может, подобным образом, поддержать их приживление и выживание в ткани печени.

- 4 010409

При контакте с кровью чужеродные клетки активируют систему коагуляции посредством экспрессии тканевых факторов на клетках и посредством высвобождения веществ прикрепленными и агрегирующими тромбоцитами. Кратко, тканевый фактор (ТР), продуцируемый клетками, образует комплекс с фактором коагуляции крови УПа и энзиматически действует на фактор X с образованием активированного фактора X (РХа). После этого следует каскад активации разных факторов, который, в конечном счете, приводит к образованию тромбина из протромбина. Тромбин, в свою очередь, вызывает полимеризацию молекул фибриногена в фибриновые волокна, образующие фибриновый сгусток вокруг клеток, как хорошо известно специалистам в данной области. Тромбин также активирует внутренний путь инициации свертывания крови, по которому фактор XII (фактор Хагемана) активируется (РХ11а) и, в свою очередь, энзиматически активирует фактор XI (предшественник тромбопластина) с получением РХ1а, активированной формы фактора XI. Этот путь также, в конечном счете, приводит к образованию тромбина из протромбина, как и по внешнему ТР-активируемому пути.

Свертывание крови может ингибировать антитромбин, циркулирующий ингибитор сериновых протеаз, который инактивирует РXIIа, РXIа и тромбин, образуя комплексы фактор XIIа-антитромбин (РXIIаАТ), фактор XIа-антитромбин (РXIа-ΑТ) и тромбин-антитромбин (ТАТ). Кроме того, ингибитор С1-эстеразы является известным ингибитором РXIа и РXIIа, образующим комплексы фактор XIа-ингибитор С1эстеразы (РXIа-С1 ΓΝΗ) и фактор XIIа-ингибитор С1-эстеразы (РXIIа-С1 ΓΝΗ).

Образовавшийся вокруг клеток или клеточных кластеров фибриновый сгусток может быть удален под действием плазмина фибринолитической системы. Плазмин расщепляет фибриновый сгусток до продуктов расщепления фибрина, таким образом предупреждая дальнейшее свертывание. Однако действие плазмина ингибируется альфа-2-антиплазмином, который связывается со свободным плазмином и инактивирует его, образуя комплекс плазмин-альфа-2-антиплазмин (РАР).

ИВМ®, характеризуется образованием фибриновых сгустков вокруг клеток, подвергаемых воздействию чужеродной крови ίη νίίτο или ίη νίνο. Кроме того, обнаруживается увеличение РXIа-АТ, РXIIаАТ, ТАТ и РАР. ИВМЖ. не оказывает влияния ни на количество РXIа-С1 ΓΝΗ, ни на РXIIа-С1 ΓΝΗ. Введение эффективного количества декстрансульфата по изобретению аннулирует влияние ЕМЕ. на активацию коагуляции, что проявляется в снижении количества РXIа-АТ, РXIIа-АТ, ТАТ и РАР, обнаруживаемых в крови. Действие декстрансульфата на активацию коагуляции может быть опосредовано системой коагуляции самой по себе, ингибиторным действием декстрансульфата на активацию тромбоцитов или обоими из них.

За активацией тромбоцитов и коагуляции в ЕЖ следует каскад комплемента. Одним из компонентов системы комплемента является С3, который при активации расщепляется на небольшой фрагмент С3а, пептидный медиатор воспаления, и более крупный фрагмент С3Ь. С3Ь, в свою очередь, связывается с другими компонентами системы комплемента с образованием С5-конвертазы, которая расщепляет С5 на С5а, диффундирующий в сторону, и активную форму С5Ь, которая прикрепляется к клеточной поверхности. Связанный С5Ь затем связывается еще с четырьмя компонента комплемента, образуя комплекс атаки мембраны с5Ь-9. Этот комплекс вытесняет фосфолипиды мембраны, образуя большие трансмембранные каналы, что разрушает мембрану и дает возможность ионам и маленьким молекулам свободно диффундировать. Таким образом, клетка не может поддерживать осмотическую стабильность и лизируется посредством притока воды и потери электролитов.

Большая часть расходования тромбоцитов происходит до того, как могут быть обнаружены опосредованные комплементом влияния ЕМЕ, это означает, что реакция свертывания может индуцировать активацию комплемента. ЕЖ вызывает значительную активацию комплемента, определяемую по увеличению С3а и растворимого комплекса атаки мембран §С5Ь-9 в крови. Введение эффективного количества декстрансульфата по изобретению снижает количество этих компонентов комплемента в крови дозозависимым образом.

ЕЖ также характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в клетки или клеточные кластеры. Инфильтрация СИ 11Ь⁺ полиморфноядерных клеток и моноцитов в клетки ясно обнаруживается иммуногистохимическим окрашиванием. Иммуногистохимические анализы показали, что инфильтрация лейкоцитов полностью подавлялась введением декстрансульфата.

Согласно первому аспекту изобретения предложено применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного в изготовлении лекарства для лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (ΣΒΜΣΚ.).

Согласно другому аспекту изобретения предложено применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного в изготовлении лекарства для лечения морфологического разрушения трансплантированных клеточных трансплантатов. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного в изготовлении лекарства для лечения отторжения клеточных трансплантатов также входит в объем настоящего изобретения. Эти два действия, т.е. разрушение клеточной морфологии и отторжение трансплантата, оказываемые на трансплантированные клетки, клеточные кластеры или неваскуляризированную ткань у пациентов-млекопитающих, предпочтительно человека, являются следствием неблагоприятного влияния ЕЖ. ЕМШ-опосредованное влияние на клеточную трансплантацию имеет место как при трансплантации от человека человеку с донорами, соответст

- 5 010409 вующими по системе АВО, так и при использовании в качестве доноров других млекопитающих, предпочтительно свиней. Таким образом, декстрансульфат оказывает благоприятное терапевтическое действие как на аллогенную, так и на ксеногенную клеточную трансплантацию.

Во избежание сомнений, в данном контексте термин лечение включает терапевтическое и/или профилактическое лечение ΙΒΜΙΚ.. Фармацевтически приемлемые производные включают соли и сольваты.

Декстрансульфат или его производные, применяемые по изобретению, могут иметь молекулярную массу от низкомолекулярного декстрансульфата (ЬМ^-08), например от нескольких сотен или тысяч дальтон (Да), до высокомолекулярного декстрансульфата (НМ^-Όδ), как правило, с молекулярной массой более 500000 Да, например более 1000000 Да. Полезное действие декстрансульфата особенно заметно у ЬМ^-08, но положительное действие также наблюдается при введении декстрансульфата с более высокой молекулярной массой. Однако более крупные молекулы декстрансульфата могут активировать ΤΧΙΙ, вызывая некоторые побочные эффекты, что более подробно обсуждается ниже. Полезное действие более крупных молекул декстрансульфата, оказываемое на ΙΒΜΙΚ, согласно изобретению может быть усилено увеличением серосодержания, т. е. числа сульфатных групп на гликозильный остаток в цепи декстрана. ЬМ^-08, как правило, имеет среднюю молекулярную массу ниже 20000 Да, например ниже 10000 Да и например приблизительно 5000 Да. Среднее серосодержание для ЬМ^-08 может составлять от приблизительно 10 до 25%, например от 15 до 25%, что соответствует приблизительно 2 сульфатным группам на гликозильный остаток. Для декстрансульфата со средней молекулярной массой выше 20000 Да может быть применимо большее серосодержание.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ лечения ГВМГК, который включает введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Другими аспектами изобретения являются способ лечения отторжения клеточных трансплантатов, который включает введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком лечении, и способ лечения морфологического разрушения трансплантированных клеточных трансплантатов, который включает введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Декстрансульфат или его производные можно вводить для системной доставки в место ГВМГК. или клеточной трансплантации или можно вводить для доставки непосредственно (локально) в это место, используя соответствующие способы введения, известные специалистам.

Таким образом, согласно изобретению декстрансульфат и его производные можно вводить перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, защечно, ректально, кожно, назально, трахеально, бронхиально, местно, любым другим парентеральным путем или посредством ингаляции, в виде фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. В зависимости от вида клеточной трансплантации, места трансплантации и пациента, подлежащего лечению, а также от способа введения, композиции можно вводить в варьируемых дозах.

При терапевтическом лечении млекопитающих, и особенно человека, декстрансульфат и его производные можно вводить сами по себе, но, как правило, их вводят в виде фармацевтического препарата в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, который может быть выбран в соответствии с предполагаемым путем введения и общепринятой фармацевтической практикой.

Количества декстрансульфата или его производных в препарате будут зависеть от тяжести состояния и от пациента, подлежащего лечению, а также от фактического препарата и применяемого пути введения и могут быть традиционным образом определены специалистом. Концентрация вводимого декстрансульфата или его производных по настоящему изобретению не должна быть слишком высокой, чтобы минимизировать любые побочные эффекты, связанные с декстрансульфатом. В большинстве клинических ситуаций подходящими дозами декстрансульфата или его производных в терапевтическом и/или профилактическом лечении пациентов-млекопитающих, особенно человека, являются те дозы, которые обеспечивают среднюю концентрацию в крови менее 5, возможно менее 2 мг/мл и особенно менее 1 мг/мл. Предпочтительный интервал концентраций составляет от 0,01 до 1 мг/мл декстрансульфата, например более 0,05, более 0,08 или более 0,1 мг/мл и/или менее 0,8, менее 0,6, менее 0,4 или менее 0,2 мг/мл, например в интервале концентраций от 0,01 до 0,2 мг/мл и/или от 0,05 до 0,2 мг/мл. Доказано, что эти концентрации достаточно велики для предупреждения или подавления ГВМГК. и морфологического разрушения и отторжения клеточных трансплантатов, но все же достаточно низки, чтобы минимизировать любые побочные эффекты, обычно связанные с введением декстрансульфата. Кроме того, культивирование островков в ЬМ^-08 не оказывало никаких неблагоприятных эффектов на функцию островков в концентрациях в интервале от 0,01 до 1 мг/мл. В любом случае, врач или специалист способен определить фактическую дозировку, которая будет наиболее подходящей для отдельного пациента, которая может варьироваться в зависимости от возраста, массы и реакции конкретного пациента. Указанные выше дозировки являются примерами предпочтительных дозировок усредненного случая. Однако могут иметь место отдельные случаи, когда будут уместными более высокие или более низкие интервалы дозировок, и они также входят в объем данного изобретения.

- 6 010409

На сегодняшний день декстрансульфат уже применялся в клинических исследованиях для противовирусной терапии против ВИЧ (вируса иммунодефицита человека), для лечения острого ишемического инсульта в комбинации с урокиназой и в антигиперлипидемической терапии, где декстрансульфат связывали с твердой фазой. В двух предшествующих видах исследований скорость инъекции составляла приблизительно 45 мг/ч, и ее поддерживали в течение 2-3 недель посредством постоянной инъекции декстрансульфата (молекулярная масса (М\У) 8000 Да), и обнаруженная концентрация в крови составляла приблизительно 0,01 мг/мл. У всех этих пациентов после 3 суток обработки наблюдалась тромбоцитопения (иногда объединенная с кровотечением), и сообщалось об алопеции у приблизительно половины пациентов. Однако оба этих эффекта были обратимыми. По приблизительным оценкам, введение декстрансульфата для подавления ΙΒΜΙΚ, морфологического разрушения и/или отторжения клеточных трансплантатов обычно осуществляется в течение 1-2 или нескольких суток. Следовательно, указанные выше побочные эффекты будут очень слабыми в течение такого короткого периода введения (несколько дней по сравнению с 2-3 неделями).

Давно известно, что декстрансульфат вызывает гипотонию через высвобождение брадикинина в результате активации калликреина плазмы. Однако это наблюдение, главным образом, было сделано, когда ΗΜ^-Όδ был иммобилизован на колонках для плазмафереза для лечения гиперлипидемии, а не в процессе инъекции декстрансульфата. Этот эффект является результатом прямой активации ΕΧΙΙ в ЕХПа. Однако в настоящем документе приведено подтверждение того, что фактор XII не активируется прямо ЬМ^-Όδ. Как было упомянуто выше, уровни ЕХПа-АТ и РАР повышаются при воздействии на клетки чужеродной крови без ЬМ^-Όδ. Однако эти высокие уровни нормализуются при добавлении ЬМ^-Όδ.

Для предупреждения ΙΒΜΙΚ после клеточной трансплантации и/или морфологического разрушения и отторжения клеточных трансплантатов при проведении клеточной трансплантации предпочтительно достигают терапевтической концентрации декстрансульфата или его производных, по меньшей мере, местно, в месте трансплантации. Ее можно достичь путем введения декстрансульфата перед фактической трансплантацией. Альтернативно, клетки или клеточные кластеры, подлежащие трансплантации пациенту, можно инъецировать разведенными в растворе, содержащем декстрансульфат по настоящему изобретению. Концентрация декстрансульфата в таком растворе клеток и декстрансульфата предпочтительно достаточно высока, чтобы можно было достичь (местно) терапевтической концентрации декстрансульфата, т.е. предпочтительно менее 5 мг/мл и более предпочтительно от 0,01 до 1,0 мг/мл, в месте трансплантации в течение первых часов после трансплантации. Специалисту очевидно, что фактическая концентрация декстрансульфата или его производных временно может быть выше оптимальной концентрации в крови пациента, когда клетки или клеточные кластеры трансплантируют разведенными в растворе декстрансульфата. Впоследствии декстрансульфат диффундирует от места трансплантации с понижением местной концентрации декстрансульфата. В некоторых применениях не требуется дополнительного декстрансульфата для подавления ΙΒΜΙΚ, морфологического разрушения и/или отторжения клеточных трансплантатов, так как терапевтическая концентрация декстрансульфата, возможно, будет требоваться только в течение первых 24-48 ч после трансплантации. Однако при необходимости дополнительный декстрансульфат может быть добавлен, например, внутривенно, внутрибрюшинно или каким-либо другим способом введения, указанным выше. Специалисту очевидно, что введение раствора декстрансульфата, содержащего клетки или клеточные кластеры, подлежащие трансплантации, можно также объединять с введением декстрансульфата или его производных перед фактической трансплантацией.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложен фармацевтический препарат для применения в лечении ΙΒΜΙΚ, содержащий эффективное количество декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного.

Настоящее изобретение также направлено на фармацевтический препарат для применения в лечении отторжения клеточных трансплантатов, содержащий эффективное количество декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного, и фармацевтический препарат для применения в лечении морфологического разрушения трансплантированных клеточных трансплантатов, содержащий эффективное количество декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного.

Декстрансульфат или его производные можно также комбинировать с другими терапевтическими агентами, которые полезны в лечении отторжения трансплантируемой ткани. Подходящими, но не ограничивающими примерами таких иммуносупрессивных агентов, которые можно применять совместно с декстрансульфатом для лечения отторжения трансплантата, являются циклоспорин, такролимус, кортикостероиды, рапамицин (сиролимус) и микофенолата мофетил. Введение декстрансульфата или его производных по изобретению может быть также согласовано с введением анти-ТЕ антител и/или фактора УПа с инактивированным сайтом, которые, как было показано, в некоторой степени обладают функцией подавления ΙΒΜΙΚ.

Примеры

Реагенты.

Низкомолекулярный декстрансульфат (ΕΜ^-Όδ) со средней молекулярной массой 5000 Да и серосодержанием приблизительно 17% был получен от 81дша Сйешюак (δί. Ьош8, ΜΟ, ϋδΑ). Высокомолекулярный декстрансульфат (ΗΜ^-Όδ) со средней молекулярной массой более 1000000 Да и серосодер

- 7 010409 жанием 16-19% был приобретен в Ашегейат В1О8С1епее (Ирр8а1а, 8\\'ебеп). Низкомолекулярный декстран (ЬМФ-О; МФ 5000 Да) и высокомолекулярный декстран (НМФ-Ό; МФ более 1000000 Да) были получены от Ника Сйетка1 (Виске, 8\\'Цхег1апб) и 81дта СйеткаИ (81. Ьоше, МО, И8Л), соответственно.

Обработка гепарином.

Все материалы, контактировавшие с цельной кровью, обрабатывали гепариновым покрытием Согйпе (Согйпе йерапп ешГасе) (Согйпе 8у81еш5 АВ, Ирр8а1а, 8\\'ебеп) согласно рекомендации изготовителя. Поверхностная концентрация гепарина составляла 0,5 мкг/см², что соответствует приблизительно 0,1 Ед./см², с антитромбинсвязывающей способностью 2-4 пмоль/см².

Препарат крови.

Свежую кровь человека, полученную от здоровых добровольцев, которые не принимали лекарства в течение по меньшей мере 14 дней, собирали в 60-мл шприцы с гепаринизированной поверхностью (18 размер; Мюго1апсе; Вес1оп О|ск|п8оп. Ргапкйп Ьакее, N1). Канюли шприцов присоединяли к силиконовым трубкам с гепаринизированной поверхностью. Во время отбора образцов шприцы непрерывно вращали.

Животные.

В качестве реципиентов использовали инбредных самцов бестимусных мышей (пи/пи В1аск-6, ВотМюе) из Вотйо11 Оаагб Вгеебтд апб Веееагсй Сеп1ге, Ь1б. (Ву, Оептагк), массой 20-25 г. Все животные имели свободный доступ к стандартной пище и воде.

Выделение островков.

Островки взрослых свиней (АР1) выделяли из поджелудочной железы 2- или 3-летних свиноматок породы шведский ландрас (от 200 до 300 кг) посредством процедуры ферментативного и механического расщепления поджелудочной железы, после которой следовали фильтрация и отделение островков на градиентах плотности фиколла, как предложено Вюогбэ е1 а1. [19, 20]. Островки суспендировали в культуральной среде М199 (01Ьсо, ВВЬ, Ь1Ге Тесйпо1од1е8 Ь1б., Ра181еу, 8со11апб) с добавлением 10% сыворотки свиней (01Ьсо, ВВЬ), 1 мМ нитрата кальция, 0,02 мкМ селена, 20 мМ никотинамида, 25 мМ НЕРЕ8 (гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислоты), фунгизона (500 мкг/л) и гентамицина (50 мг/л) и культивировали в 250 мл колбах при 37°С в атмосфере 5%-ного СО₂ и увлажненного воздуха в течение от 1 до 4 дней. Культуральную среду меняли в 1 сутки и затем каждые сутки. Объем и чистоту островков определяли с помощью инвертированного микроскопа после окрашивания дитизоном (8фта СйеткаИ, 81. Ьоше, МО).

Индукция диабета у бестимусных мышей.

У бестимусных мышей индуцировали диабет посредством внутривенной (в/в) инъекции стептозотоцина от 8фта Сйеткак (Ра1о А11о, СА, И8А) согласно ФеппЬегд е1 а1. [20]. Доза стептозотоцина для бестимусных мышей составляла 250 мг/кг массы тела. Животное считалось диабетическим, если уровень глюкозы в крови (В-глюкозы) превышал 20 ммоль/л (более 360 мг/дл) в течение 2 или более последующих суток.

Трансплантация АР1 диабетическим бестимусным мышам, обработанным ЬМФ-08 или без него.

После культивирования в течение 4 дней 5 мкл АР1 (приблизительно 5000 1Ефе (1е1е1 едшуа1еп1, островковых эквивалентов) из 5 изолятов трансплантировали в печень через воротную вену 11 инбредных самцов диабетических атимических мышей, которым во время операции проводили анестезию изофлюреном. 5 мышей в/в обрабатывали ЬМФ-08. 0,15 мг ЬМФ-О8 инъецировали за 10 мин до трансплантации и дополнительные 0,3 мг ЬМФ-08 инъецировали через 6 ч после трансплантации. Затем ЬМФ-08 вводили 2 раза в сутки на 1-2, 3-4 и 5-6 сутки после трансплантации в уменьшающихся дозах 1, 0,5 и 0,25 мг, соответственно. 6 (необработанным) мышам аналогично инъецировали эквивалентный объем физиологического раствора.

Статистический анализ.

Все величины выражали в виде среднего ±8ЕМ (стандартная ошибка среднего) и сравнивали, используя АNОVА (дисперсионный анализ) Фридмана (табл. 1), парный 1-тест Стьюдента (табл. 3), знаково-ранговый тест Вилкоксона (табл. 4) и однофакторный АNОVА после рое1 кос (ретроспективного) теста Шеффе (табл. 5). В морфологическом исследовании трансплантированных островков частоту образования сгустка и интенсивность инфильтрации лейкоцитов оценивали, используя тест суммы рангов Вилкоксона. Статистическими значимыми считались значения Р менее 0,05.

Качество островков.

В качестве функционального теста для АР1 проводили тест статической стимуляции глюкозой (808). 15 островков отбирали вручную и аккуратно встряхивали в бикарбонатном буфере КребсаРингера, содержащем 1,6 мМ глюкозы при 37°С в течение 60 мин. После этого концентрацию глюкозы меняли до 16,7 мМ в течение еще 60 мин. Надосадочные жидкости собирали и хранили до анализа при -20°С. Содержание инсулина в надосадочных жидкостях анализировали при помощи ЕЫ8А (твердофазного иммуноферментного анализа) (ОАКО О1адпо8Йс8, Ь1б., Е1у, ИК). Индекс стимуляции вычисляли как отношение концентрации инсулина при высоком и низком уровне глюкозы, соответственно. Чистота АР1, используемых в данном исследовании, колебалась от 81 до 95% (среднее 88,5±2,2%). Индекс стимуляции в тесте статической стимуляции глюкозой находился между 0,8 и 7,8 (3,4±1,2), и среднее содержа

- 8 010409 ние инсулина составляло 85,5±6,2 пмоль/мкг ΌΝΑ (дезоксирибонуклеиновой кислоты).

Кроме того, для того, чтобы оценить жизнеспособность культивируемых ΑΡΙ, измеряли соотношение ΑΌΡ/ΑΤΡ (аденозиндифосфорная кислота/аденозинтрифосфорная кислота), используя набор ΑροΟΙο^™ (ЬитТГеей, Ь1б., №йтдйат, ИК). Кратко, 75 островковых эквивалентов (ΙΕΟ) ΑΡΙ промывали ΡΒ3 (фосфатным буферным солевым раствором) и затем смешивали с 100 мкл нуклеотидвысвобождающего реагента в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем к раствору добавляли 20 мкл реагента для отслеживания нуклеотидов, и измеряли уровни АТР, используя люминометр (ΕΒ 12 ЬитшотеГег, Вег11ю1б Эе1ес11оп Зуйетз СтЬН, ΡίοΓζΙκίιη. Сегтаиу), и выражали их как число относительных световых единиц (ЯЬи). Через 10 мин ΑΌΡ в растворе превращали в АТР путем добавления 20 мкл ΑΌΡ-конвертирующего реагента и затем измеряли как число КЕИ. Затем вычисляли соотношение ΑΌΡ/ΑΤΡ в ΑΡΙ, как предложено ВгабЬигу е1 а1. [21]. Отношение инсулин/ΌΝΑ в ΑΡΙ измеряли согласно АеииЬегд е1 а1. [22] и выражали в пмоль/мкг. Уровень выживания культивируемых ΑΡΙ вычисляли как процент от значений ΙΕΟ, полученных на 3 сутки по сравнению с 0 сутками.

Любую возможную токсичность ЬМА-ЭЗ оценивали, культивируя ΑΡΙ из трех различных поджелудочных желез в присутствии (0,01, 0,1 или 1 мг/мл) ЬМА-ЭЗ или в его отсутствие в течение 3 суток. Результаты по проценту выживания, индексу стимуляции, отношению ΑΌΡ/ΑΤΡ и отношению инсулин/ΌΝΑ для контрольных образцов и для образцов с тремя различными концентрациями ЬМА-ЭЗ представлены в табл. 1 ниже. ЬМА-ЭЗ не продемонстрировал никаких вредных эффектов на функцию, жизнеспособность или процент выживания ΑΡΙ в любых исследованных концентрациях. Кроме того, не было никакой разницы в морфологии ΑΡΙ, обработанных ЬМА-ЭЗ, и культивируемых при отсутствии ЬМА-Όδ.

Таблица 1

	ΑΡΙ, культивируемые без ЕМУУ-ЦЗ	ΑΡΙ, культивируемые с Ι_Μνν-Οδ (0,01 мг/мл)	ΑΡΙ, культивируемые с ΐΜ/ν-ϋδ (0,1 мг/мл)	ΑΡΙ, культивируемые с ΐΜ\Λ/-οδ (1 мг/мл)
Процент выживания (% ΙΕΟ)	57,0±5,2	43,6±6,7	58,4±4,3	68,9+2,6
Индекс стимуляции в тесте 5С5	1,77±0т17	2,26±0,51	3,22+0,89	1,42±0,35
Соотношение ΑΌΡ/ΑΤΡ	0,11+0,03	0,08±0,03	0,10±0,03	0,11±0.01
Соотношение
инсулин/ΌΝΑ	79,0±11,4	66,1 ±5,8	69,1±9,6	71,6±7,4

(пмоль/мкг)

Время образования сгустка.

Кровь 4 здоровых добровольцев отбирали в пробирки УасиШиег™, содержащие цитрат. Цельную кровь (980 мкл) инкубировали с 2 мкл ΑΡΙ при 37°С в полипропиленовых чашках для образцов в реометре КеоКох™ (О1оЬа1 НаетоЦамх Шетайоиа! СоЛеиЬигд, Зтебеи). Реакцию коагуляции начинали добавлением 20 мкл 1М СаС1₂ в присутствии различных типов декстрана (ЬМА-ЭЗ, НМА-Όδ, ЬМА-Ό и НМА-Ό) или при их отсутствии. Каждые 6 с осуществляли свободные крутильные колебания чашки вокруг ее вертикальной оси и регистрировали затухание и частоту колебаний. Время образования сгустка определяли как точку максимального затухания.

Результаты, полученные из экспериментов по времени образования сгустка, представлены в табл. 2 ниже. ΑΡΙ, инкубируемые в цитратной крови человека, быстро индуцировали образование сгустка, в среднем, через 6,1±0,3 мин после кальцификации. Образование сгустка полностью подавлялось в присутствии ЬМА-ЭЗ во всех испытываемых дозах, в то время как НМА-ЭЗ ингибировал образование сгустка только при 0,1 мг/мл. Как ЬМА-Ό, так и НМА-Ό увеличивали время образования сгустка лишь в незначительной степени по сравнению с контрольными образцами (без добавок). Таким образом, представляется, что сульфатирование Ό8 является ключевым для наблюдаемой ингибиторной способности.

- 9 010409

Таблица 2

	Эксперимент 1	Эксперимент 2	Эксперимент 3	Эксперимент 4
Без добавок	5,6	6,3	6,9	5,5
Ι-Μνν-Όδ (0,01 мг/мл)	>60	>60	>60	>60
1_МУУ-О8(0,1 мг/мл)	>60	>60	>60	>60
ΗΜνγ-ϋδ (0,01 мг/мл)	15,8	36,9	21,0	38,3
ΗΜνν-Όδ (0,1 мг/мл)	>60	>60	>60	>60
ЬМУАЭ (0,01 мг/мл)	19,2	11,3
ЬМУУ-О (0,1 мг/мл)	25,2	25,8
ΗΜνν-Ό (0,01 мг/мл)	19,8	13,8
ΗΜνν-Ό (0,1 мг/мл)	14,2	33,2

Подавление ΙΒΜΙΚ с помощью ЬМ^-Όδ.

В качестве модели для оценки влияния ЬМ^-Όδ на ΙΒΜΙΒ и на ксенотрансплантацию от свиньи к человеку использовали перфузию островков взрослых свиней в гепаринизированных петлях из поливинилхлоридных трубок (РУС). Этот протокол выполняют, по существу, как описано ранее [4, 23], с некоторыми модификациями. В общих чертах, использовались петли, изготовленные из РУС (диаметр 6,3 мм, длина 390 мм), внутренняя поверхность которых была обработана иммобилизованным гепарином. Трубки соединяли специально разработанным гепаринизированным соединителем. Замкнутая петля образовывалась, когда концы соединителя плотно вставляли в просвет концов трубок. Для создания потока крови внутри петель использовали раскачивающий аппарат, помещенный в 37°С инкубатор. Петли раскачивали в условиях, при которых предотвращался контакт крови с соединителями.

Было проведено 7 60-минутных экспериментов с островками с использованием ΑΡΙ, выделенных из разных свиней. ЬМ^-Όδ, растворенный в физиологическом растворе, испытывали при концентрации 0, 0,01, 0,1 и 1 мг/мл (конечная концентрация). В каждый эксперимент в качестве контроля включали одну петлю, содержащую свежую кровь человека и физиологический раствор без ΑΡΙ. В 2 эксперимента включали одну петлю, содержащую свежую кровь человека и 1 мг/мл ЬМ^-Όδ без ΑΡΙ. Одновременно в экспериментах исследовали преинкубацию крови человека с 1 мг/мл ЬМ^-декстрана, который не был сульфатирован. В каждом эксперименте к каждой петле добавляли 7 мл свежей крови человека от одного и того же донора. Петли затем помещали на раскачивающее устройство на 5 мин либо с ЬМ^-Όδ, либо с физиологическим раствором. После этого петли открывали и в петли добавляли 100 мкл физиологического раствора с 5 мкл ΑΡΙ (приблизительно 5000 ΙΕΟ) или без них, после чего следовала другая 60-минутная инкубация на раскачивающем устройстве при 37°С. Уровни глюкозы в крови измеряли глюкометром (О1исоте1ег Е1йе; Вауег ЭхадпоШск, Бсусгки^сп. Оегтапу) перед перфузией.

После каждой перфузии содержимое петель фильтровали через фильтры с диаметром отверстий 70 мкм (Ейсопк, Сир1уре; ΌΑΚΟ, Эептагк). Как макроскопические сгустки крови, так и ткань, извлеченные с фильтров, мгновенно замораживали в изопентане для иммуногистохимического окрашивания. Оставшуюся отфильтрованную кровь собирали в 4,1 мМ ΕΌΤΑ (этилендиаминтетрауксусную кислоту) (конечная концентрация) и использовали для гематологического анализа (тромбоциты, лимфоциты, моноциты и гранулоциты) и анализов активации коагуляции (тромбин-антитромбин [ТАТ], комплексы фактор ΧΙαантитромбин |ΕΧΙα-ΑΤ| и комплексы фактор ХПа-антитромбин [РХПа-ΑΤ]), активации фибринолиза (комплексы плазмин-альфа-2-антиплазмин [РАР]), активации комплемента (С3а и кС5Ь-9) и активации ингибитора С1-эстеразы (фактор ХН-ингибитор С1-эстеразы [ЕХН-С1 ΙΝΗ], фактор ХПа-ингибитор С1-эстеразы [ЕХПа-С1 ΙΝΗ]). Также анализировали образцы, отобранные на 0, 15 и 30 мин. В 0-минутных образцах кровь не добавляли в трубочные петли, а, вместо этого, немедленно переносили в пробирки, содержащие ΕΌΤΑ. Образцы крови центрифугировали при 4°С и 3290/д в течение 20 мин и плазму собирали и хранили при -70°С до анализа. Уровни глюкозы в крови перед перфузией ΑΡΙ колебались от 4,8 до 6,2 ммоль/л.

Число тромбоцитов и дифференциальное число лейкоцитов определяли на анализаторе СоиИег Λί.’Τ-6ίίΤ (Весктап СоиИег, ЕЬ, υδΑ), используя кровь, обработанную ΕΌΤΑ. Количество ТАТ и РАР определяли, используя коммерчески доступные наборы для иммуноферментного анализа (ΕΙΑ) (Бпгудпок! ΤΑΤ, Вейппдотегке, МагЬигд, Оегтапу; Ттис1опе® ΡΑΡ, Λте^^саη ЭхадпокИса Шс., СгеепМсй, υδΑ). ΕΧΕι-ΑΤ, ЕХПа-ΑΤ, ΕΧΕι-ί'Ί ΙΝΗ и ЕХПа-С1 ΙΝΗ анализировали в соответствии со способом 8апсйех е! а1. [24]. С3а анализировали, как было описано ранее Мккоп ЕкбаЫ е! а1. [25], и кС5Ь-9 анализировали, используя модификацию ΕΙΑ, описанную Мо11пе§ е! а1. [25, 26].

В трубочных петлях, содержащих свежую кровь человека без ΑΡΙ, числа клеток крови и параметры коагуляции и комплемента изменялись лишь незначительно, как можно видеть в табл. 3 ниже. Все эти изменения можно расценивать как нормальные фоновые изменения, возникающие из-за взаимодействия

- 10 010409 крови с поверхностью трубок и границей раздела фаз жидкость-воздух.

ΌΜΨ-Όδ предотвращал образование макроскопических сгустков, замедлял расходование клеток крови и снижал активацию как коагуляции, так и комплемента дозозависимым образом (см. табл. 3). Значительное увеличение тромбоцитов в крови, обработанной ΌΜΨ-Όδ, можно видеть при концентрации 0,01 мг/мл ΌΜΨ-Όδ, что свидетельствует о восстановлении числа клеток крови почти до нормальных уровней даже при такой низкой концентрации ΌΜΨ-Όδ. Продукты активации коагуляции ТАТ, РХ1а-АТ, РХ11а-АТ подавлялись при 0,01 мг/мл ΌΜΨ-Όδ, но РХ1а-АТ снова немного повышался при дозах в интервале от 0,1 до 1 мг/мл ΌΜΨ-Όδ.

ΌΜΨ-Όδ уменьшает активацию комплемента, оцениваемую по генерации С3а и растворимого комплекса атаки мембран бС5Ь-9, как видно из табл. 3. На фиг. 1 более подробно показано влияние ΌΜΨ-Όδ на генерацию С3а в течение 60 мин перфузии АР1 со свежей кровью человека в модели трубочной петли. В образцах, в которые добавляли ΌΜΨ-Όδ, декстрансульфат предварительно инкубировали со свежей кровью человека в течение 5 мин перед перфузией АР1 с кровью. Белые кружки соответствуют 0 мг/мл ΌΜΨ-Όδ, черные кружки представляют 0,01 мг/мл ΌΜΨ-Όδ, а белые квадраты и черные квадраты соответствуют 0,1 и 1 мг/мл ΌΜΨ-Όδ, соответственно. Соответствующая диаграмма влияния ΌΜΨ-Όδ на генерацию бС5Ь-9 показана на фиг. 2. Как ясно видно из диаграмм на фиг. 1 и 2, основная активация комплемента происходит через приблизительно 30 мин после перфузии АР1. Введение 0,1 и 1 мг/мл ΕΜΨ-Όδ полностью ингибирует генерацию как С3а, так и комплекса атаки мембран бС5Ь-9, в то время как более низкая концентрация ΕΜΨ-Όδ (0,01 мг/мл) значительно уменьшает генерацию С3а.

РХ1а-С1 ΙΝΗ не образовывался ни в одной из трубочных петель, исследуемых в течение 60 мин перфузии (данные не показаны). РХ11а-С1 ΙΝΗ не менялся ни в присутствии ΕΜΨ-Όδ, ни при его отсутствии.

РАР был увеличен в отсутствие ΕΜΨ-Όδ, в то время как концентрация 0,01 мг/мл ΕΜΨ-Όδ значительно подавляла его.

Таблица 3

	Перед перфузией (п=7)	После перфузии
Без ΑΡΙ (п=7)	ΑΡΙ с ЬМУУ-ОЗ (мг/мл)
0 (п=7)	0,01 (п=7)	0,1 (п=7)	1 (л=7)
Т ромбоциты (х109/1)	252,719,9	141,8111,8	6,415,6	108,2+12,9'	146,1+8,1'	162,3+8,9’
Лимфоциты (х109/1)	2,1510,09	2,0410,10	1,6610,21	1,9010,11	1,9110,12	1,8910,10
Моноциты (х10э/1>	0,3910,06	0,3110,02	0,15+0,03	0,4810,10	0,4010,07	0,3110,05*
Г ранулоциты (х109/1)	2,9010,35	2,66+0,36	1,1710,34	2,2010,40	2,8010,50'	2,92+0,37*
ТАТ (мкг/мл)	9,013,7	144,0163,8	7042,511314,1	645,31177,4’	61,018,6'	15,0+5,6
РХ1а-АТ (мкмоль/л)	0,0310,01	0,1010,03	3,0010,60	0,1310,ОТ	0,0810,01	1,17+0,41'
РХ!1а-АТ (мкмоль/л)	0,0510,01	0,06+0,01	2,0210,63	0,0810,02'
СЗа (нг/мл)	63,017,8	590,2+105,3	1122,51132,0	630,61103,4	191,7136,6*	215,6152,5
зС5Ь-9 (УЕ/мл) (условных единиц/мл)	24,012,7	104,7120,7	182,1133,4	151,4127,9	61,9+6,5*	53,917,1*
рхпа-С1 1пь (мкмоль/мл)	0,0710,01	0,09+0,03	0,0610,01	0,1010,03
РАР (нг/мл)	585,71240,9	443,6+179,4	1012,51224,0	398,2+60,7

*3начительная разница по сравнению с петлями с АР1 без ΕΜΨ-Όδ при использовании 1-теста Стьюдента.

- 11 010409

Влияние Б-МХУ-декстрана на числа клеток в крови, параметры коагуляции и комплемента через 60 мин после перфузии ΑΡΙ со свежей кровью человека исследовали с помощью модели трубочных петель, аналогичной ЬМУ-08, как обсуждалось выше. Сравнение между влиянием ЬМУ-Ό и ЬМУ-08 на симптомы ΙΒΜΙΚ. представлено в табл. 4. Б-МХУ-декстран, который не сульфатирован, оказывает лишь незначительное влияние на ΙΒΜΙΚ.. Эти данные показывают, что сульфатирование, видимо, является ключевым для подавляющего действия декстрана на ΙΒΜΙΚ, инициируемую ΑΡΙ.

Таблица 4

	1МУУ-03 (1 мг/мл, п=5)	БМУУ-ϋ (1 мг/мл, п=5)
Тромбоциты (х109/1)	181,1116,3	44,9118,7
Лимфоциты (х109/1)	1,9410,12	2,1410,32
Моноциты (х1О9/1)	0,3810,10	0,2910,08
Гранулоциты (х10э/1)	3,2310,21'	1,9010,43
ТАТ (мкг/мл)	12,8+4,9*	4429,212002,5
ЕХ1Э-АТ (мкмоль/л)	1,5610,82	1,0910,08
СЗа (нг/мл)	171,5172,4*	1490,3+406,4
зС5Ь-9 (УЕ/мл)	41,6111,5’	157,3119,1

*Значительная разница по сравнению с петлями с ΑΡΙ с ЬМУ-Ό при использовании знаково-рангового теста Вилкоксона.

Прямое действие БМХУ-Э8 на систему комплемента в сыворотке крови человека.

Прямое влияние ЬМУ-08 на каскад комплемента исследовали посредством инкубации сыворотки человека в полипропиленовой пробирке. Сыворотку (1 мл) добавляли в каждую пробирку вместе с ЬМУ-Όδ в конечной концентрации 0, 0,01, 0,1 или 1 мг/мл. Через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после инкубации сыворотки при 37°С 100 мкл сыворотки переносили в пробирки, содержащие 10 мМ ΕΌΤΑ. Эти образцы хранили при -70°С до анализа компонентов комплемента С3а и §С5Ь-9.

На фиг. 3 показано влияние ЬМУ-08 на присутствие С3а и зС5Ь-9 системы комплемента в сыворотке крови человека. Значения выражены как процент от количества С3а и зС5Ь-9 в контрольных образцах (без ЬМУ-08). Заполненные столбики представляют генерацию С3а, а пустые соответствуют зС5Ь-9. При концентрации ЬМУ-08 0,01 мг/мл усиленная активация комплемента выражалась в усиленной генерации как и С3а, так и зС5Ь-9. но при 1 мг/мл наблюдался ингибиторный эффект. Хотя нельзя прямо сравнивать влияния на цельную кровь и сыворотку, ЬМУ-08 сам по себе возможно индуцирует активацию комплемента при самых низких применяемых дозах БМХУ-Э8. При более высоких концентрациях преобладает подавляющее действие.

Выживание трансплантата у диабетических бестимусных мышей.

Уровни глюкозы в крови определяли в крови, полученной из хвостов реципиентов, используя измеритель глюкозы в крови С1нсошс1сг Е1йе® (Вауег АВ, Со1йеиЬигд, 8\\'сбсп). Измерение проводили ежесуточно до 12 ч дня и выражали в ммоль/л (1 ммоль/л «18 мг/дл). Считалось, что произошла потеря функций трансплантата, если уровни глюкозы в крови превышали 11,1 ммоль/л (более 200 мг/дл) в течение 2 или более следующих друг за другом дней.

Длительность посттрансплантационной нормогликемии (менее 200 мг/дл) определяли как период выживания трансплантата.

Все бестимусные мыши с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, имели тяжелую гипергликемию перед трансплантацией без каких-либо различий в уровнях глюкозы в крови, наблюдаемых среди различных групп реципиентов. Уровни глюкозы в крови не натощак после трансплантации немедленно понижались у всех диабетических реципиентов, которым интрапортально имплантировали ΑΡΙ. Однако необработанные мыши сохраняли нормогликемию только в течение ограниченного времени, см. табл. 5. Уровни глюкозы в крови снова повышались в течение первых 3 суток после трансплантации у 4 из 6 необработанных мышей. В противоположность этому, нормогликемия поддерживалась в течение значительно более длинного периода у мышей, обработанных ЬМУ-08, по сравнению с необработанными мышами (8,8±1,9 суток по сравнению с 3,5±1,2 сутками, р=0,045, табл. 5). Было показано, что все ΑΡΙ, используемые в настоящем исследовании, излечивают диабетических бестимусных мышей при трансплантации эквивалентных количеств в субкапсулярное пространство почки (удаление почки, несущей трансплантат, немедленно приводило к повышенному уровню глюкозы в крови).

- 12 010409

Таблица 5

Место имплантации	Обработка	п	Индивидуальное выживание трансплантата (сутки)	Среднее выживание трансплантата (сутки)
Печень	Физиологический	6	1,1,2, 3,6,8	3,511,2
раствор
	ьмм-об	5	4, 6, 8,12, 14	8,811,9*
Субкапсулярное
пространство	-	5	>56 (х5)	>56*
почки

*Значительное среди всех групп.

Иммуногистохимические эксперименты.

Островки и макроскопические сгустки выделяли на фильтрах после 60 мин перфузии с кровью и с ΕΜν-Όδ (0,1 и 1 мг/мл) или без ΕΜν-Όδ (контроль), затем собирали в среду для заливки (Тйкие-Тек; Μίΐβδ, ЕскНагк ΙΝ, И8Л) и мгновенно замораживали в изопентане. Изготавливали срезы островков и затем окрашивали их конъюгированными с пероксидазой хрена (ΗΚΡ) антителами мыши против СЭ41а человека (Κ&Ό ЗуЧепъ, АЫдбоп, ИК) и анти-СЭ11Ь' (С1опе 2ΕΡΜ 19с, ΌΆΚΘ, Сагр1п(ег1а, СА, И8А). В исследовании ίη νίνο печень мышей, содержащую ΑΡΙ, через 10 дней после трансплантации извлекали и мгновенно замораживали в изопентане. Изготавливали срезы образцов и окрашивали антителами морской свинки против инсулина (ΌΑΚΑ, Сагр1п(ег1а, СА, И8А) и антителами крысы против СЭ11Ь' мыши (8его1ес Б(б. 8сапб1пау1а, О§1о, №г\уау).

Через 60 мин было обнаружено, что островки, извлеченные из необработанных контрольных петель, были постоянно включены в сгустки. Иммуногистохимическое окрашивание показало, что островки окружает капсула из фибрина и тромбоцитов. На фиг. 4 показана инфильтрация ί.Ό11ό' полиморфноядерных клеток и моноцитов в контрольные островки. В противоположность этому, наблюдались полное ингибирование образования сгустка и значительное уменьшение числа инфильтрующих ί.Ό11 Ь' клеток при добавлении во время инкубации 1 мг/мл ΕΜν-Όδ, как показано на фиг. 5. Аналогичный эффект также наблюдался при 0,1 мг/мл. В контрольных образцах также присутствовал толстый слой тромбоцитов, прикрепившихся к клеткам, как это видно на фиг. 6. Значительно более тонкий слой тромбоцитов, прикрепившихся к островкам, наблюдался в образцах, обработанных ΕΜν-Όδ, как показано на фиг. 7. Контрольные островки, не подвергнутые воздействию крови, имели во всех случаях отрицательное окрашивание.

Большинство островков, извлеченных из необработанных мышей, было заключено в сгустки, как показано на фиг. 8. На фиг. 8 стрелка указывает на образование тромба с захваченными островками свиньи. Однако, как показано на фиг. 9, были захвачены только несколько островков мышей, обработанных ΕΜΧν-Ωδ. Иммуногистохимическое окрашивание показало инфильтрацию ί.Ό11Ε ^АС-Й) лейкоцитов в островки, извлеченные из необработанных мышей, как видно на фиг. 10. В противоположность этому, было значительно меньше инфильтрованных ί.Ό11Ε (ΜΑС-1⁺) клеток у мышей, обработанных Б-ΜXVΌδ, как показано на фиг. 11. Частота образования сгустка и интенсивность инфильтрации лейкоцитов были значительно ниже у реципиентов, обработанных ΕΜν-Όδ, чем у необработанных реципиентов (р=0,034). Фиг. 4-9 получены при 200-кратном увеличении, а фиг. 10 и 11 - при 100-кратном увеличении.

Специалисту в данной области очевидно, что могут быть сделаны различные модификации и изменения настоящего изобретения, не выходящие за рамки его объема, который определен прилагаемой формулой изобретения.

Литературные источники [1] δΙιαρίΐΌ АМ, е( а1., ’Ч81е1 1гап5р1ап1аСоп ίη 5е\^геп ра(1еп1з \νί(1ι (у ре 1 б1аЬе(ез теШ(н5 ттд а д1исосоП1со1б-Ггее 1ттипо8иррге88гуе гед1теп, Ν. Епд1. ί. Μеб., Уо1. 343, №. 4, рр. 230-238 (2000).

[2] Куап Е.А., е( а1., СБшса1 отсотех апб шкиБп кесгебоп айег 1з1е( 1гап5р1ап(а(1оп \νί(1ι (Не ЕбтопФп ргоФсоГ, П1аЬе1е8, Уо1. 50, №. 4, рр. 710-719 (2001).

[3] Βеηηеί V., е( а1., Эатаде (о рогсше ЫеФ оГ БапдегНапх айег ехроыие (о Питан Ь1ооб ш ^йго, ог айег тйарог1а1 (гап5р1ап(а(юп (о супото1одн5 топкеук: рго(ес(Ае еГГес(5 оГ §СК1 апб Нерапп, Тгап§р1ап1абоп, Уо1. 69, №. 5, рр. 711-719 (2000).

[4] Βеηηеί V., е( а1., 'ЧпсотраиЬПЦу ЬеЕхееп Нитап Ь1ооб апб №1а(еб Ые(5 оГ БапдегНапх: а йпбтд \νί(1ι трксабопк Гог сБшса1 тйаройа1 181е( 1гап8р1ап1а11оп?, П1аЬе1:е8, Уо1. 48, №. 10, рр. 1907-1914 (1999).

[5] БнН1ег Ь., е( а1., Аби1( рогсте 181е( (гап5р1ап(а(юп ш ЬаЬоопх (геа(еб \\ί(1ι соп\'еп(юпа1 ттшпоыфргебоп ог а поп-туе1оаЫа(Б'е гедипеп апб СЭ154 Ь1оскабе, Хепойап§р1ап1а11оп, Уо1. 9, №. 1, рр. 3-13 (2002).

[6] Сап(аго\'1сН Ό., е( а1., Кар1б ГаПте оГ р1д Ые( (гап5р1ап(а(юп ш поп Нитап рг1та(е5, Хепо1гапзр1ап1а11оп,

- 13 010409 νοί. 9, Νο. 1, рр. 25-35 (2002).

[7] Сагго11 М.С., апб РксЬег М.В., Сотр1стсп1 апб !Ье пптипе гекропке, Сигг. Ορίη. Iттиηο1., νοί. 9, Νο. 1, рр. 64-69 (1997).

[8] Рга!! кК., е! а1., ЕГГес!к οΓ ^тр^тек ίηΠίόίΙίοη \νί!1ι юкШе ^тр^тек гесерЮг-1 οη уакси1аг пушу апб тГ1атта!кп биппд гепа1 а1кдгаГ! ге_)ес!юп ίη !Ье га!, Ат. ί. Рабюк νοί. 149, Νο. 6, рр. 2055-2066, (1996).

[9] Рюгап!е Р., е! а1., 'Έο\ν птоксЫаг \\Όί§1ι! бех!гап ки1Га!е ргеуеШк ^шркшей: ас!гоа!кп апб бе1аук Ьурегасик гексГюп ш рщ-Ю-11итап xсηο!^аηкρίаη!а!^οη шοбсίк, Xсηο!^аηкρίаη!а!^οη, νο1. 8, Νο. 1, рр. 24-35 (2001).

[10] Ва1б\\ап ^.М., е! а1., Сοшρίсшсηΐ ш ο^даη 1^аηкρίаη!а1^οη. СогипЬшкпк ίο ^ηΠатта!^οη. щ)игу, апб ге_)ес!юп, Тгапкр1апГа!юп, νο1. 59, Νο. 6, рр. 797-808 (1995).

[11] Вгаиег К.В., е! а1., ТЬе οΓ !егтша1 сοшρίсшсηΐ сοшροηсη!к ίο аси!е апб Ьурегаси!е аίίοд^ай ге_)ес!юп ш Не га!, Т^аηкρ1аη!а!^οη. νο1. 59, Νο. 2, рр. 288-293(1995).

[12] \Уи11епшп ХУА., е! а1., Ρο^ι·!^^!·! οΓ С1 шЫЫЮг Ьу дίусοкат^ηοдίусаηк: бех!гап ки1Га!е крескк аге еГГесбуе хпЫЫкгк οΓ ш νίΐτο сοшρίсшсηΐ ас!ка!кп ш р1акта, 1. Iшшиηοί., νο1. 159, Νο. 4, рр. 19531960 (1997).

[13] Nакаηο М., е! а1., НераЮсуЮ дго\\Й1 ГасЮг 1к еккепйа1 Γοτ ашсί^ο^а!^οη οΓ Ьурегд1усет1а ш к1^сρ!οζο!οс^η-^ηбиссб б1аЬейс тке гесеМпд а тагдша1 такк οΓ ш!гаЬера!к 1к1е! дгайк, Тгапкр1ап!а!юп, νο1. 69, Νο. 2, рр. 214-221 (2000).

[14] Т1ютак Н., е! а1., 8иίΓοηа!сб бехГгап 1пЫЬ1!к сοшρίсшсη! ас!гоа!кп апб сοшρίсшсη!-бсρсηбсη! суЮЮхкбу 1п ап ш νίΓτο шοбсί οΓ Ьурегасик хегюдгаГ! ге_)ес!юп, Μοί. Iтшиηοί., νο1. 33, Νο. 7-8, рр. 643648 (1996).

[15] ΚοίΈβαι Ο., е! а1., Апдюдепекк апб апдюагсЫ!ес!иге οΓ !гапкр1ап!еб Ге!а1 ρο^с^ηс 1к1е!-11ке се11 с1ик!егк, Т^аηкρ1аη!а!^οη. νο1. 68, Νο. 11, рр. 1761-1766 (1999).

[16] Мепдег М.Э., е! а1., Ке\'акси1апха!юп οΓ Ггее1у дгайеб 1к1е!к οΓ ЬапдегЬапк, ΧΥοιΉ 1. 8игд., νο1. 25, Νο. 4, рр. 509-515 (2001).

[17] кпкеп К.Ь., е! а1., Сго\\И1 ГасЮг-теб1а1еб апдюдепекй ш Не таНдпап! ргодгеккюп οΓ д11а1 !ишο^к: а гстют, 8игд. №иго1., νο1. 49, Νο. 2, рр. 189-195, бксиккюп 196 (1998).

[18] Эипп Ι.Ρ., е! а1., Сго\\Й1 ГасЮгк ш д1юта апдюдепекк: РСРк, РИСЕ, ЕСР, апб ТСЕк, 1. ΝαποοιΧΌΕ νο1. 50, Νο. 1-2, рр. 121-137 (2000).

[19] Κχοιύί С., е! а1., А те!1юб Γοτ Не такк ^кοίа!^οη οΓ 1к1е!к Ггот !1е аби1! р1д рапсгеак, И1аЬе!ек, νο1. 35, Νο. 6, рр. 649-653 (1986).

[20] ^еппЬегд Ь., е! а1., О1аЬе!1с га!к !гапкр1ап!еб \νί!1ι аби1! ιοοΓαικ 1к1е!к апб ^тшиηοкиρρ^скксб \νί!1ι сусЬ^^е А, шусορЬсηοίа!с шοΓс1^^, апб ίсйиηοт^бс гетат ηο^шοдίусст^с Γοτ ир !ο 100 баук, Т^аηкρ1аη!а!^οη. νο1. 71, Νο. 8, рр. 1024-1033 (2001).

[21] ВгабЬигу Э.А., е! а1., Меакигетеп! οΓ Не АИР:АТР γ3!ιο ш Ьитап 1еикаетк се11 1шек сап Ье икеб ак ап шбкаФг οΓ се11 ν^аЬ^1^!у. песгок1к апб аρορ!οк^к, 1. ^тигок Мебюбк, νο1. 240, Νο. 1-2, рр. 79-92 (2000).

[22] ХУеппЬегд Ь., е! а1., ЕГГес!к οΓ ^тшиηοкиρρ^скк^νс !геа!теп! οη 1юк! те^пкек адашк! ш!гасегеЬга1 ]:>οΐΌίι·κ пеига1 Йккие хегюдгаПк ш га!к, Тгапкр1апГа!юп, νο1. 71, Νο. 12, рр. 1797-1806 (2001).

[23] ^пд 1., е! а1., ТиЬшд ^рк ак а шοбсί Γοτ са^б^ορиίшοηа^у Ьуракк сйсибк: Ьο!Ь !1е Ькта!епа1 апб Не Ьίοοб-дак рЬаке шкгГасек шбисе сοшρίсшсη! ас!ка!кп ш ап ш νίΓτο шοбсί, 1. С1ш. Iтшиηοί., νο1. 16, Νο. 4, рр. 222-229 (1996).

[24] 8апсЬех 1., е! а1., 8!ибкк οΓ аб^^Гю^ ас!^νа!^οη. апб шЫЬНюп οΓ ГасЮг ΧΙΙ οη ^тшοЬ^ί^ζсб 1ерапп, ТЬгошЬ Кек., νο1. 89, Νο. 1, рр. 41-50 (1998).

[25] Νι1$$οιι ЕкбаЫ Κ., е! а1., Сепега!кп οΓ 1С3 а! Не шкгГасе ЬеЕхееп Ε1οο6 апб дак, 8сапб. 1. Iтшиηοί., νο1. 35, Νο. 1, рр. 85-91 (1992).

[26] Μοίίηскк Т.Е., е! а1., А пе\у шοбсί Γοτ е\'а1иа!юп οΓ Ь^οсοтρа!^Ь^1^!у: тотЬтеб бе!епшпа!кп οΓ п^ерх^^ 1п Μοο6 апб οη аг!1Г1с1а1 кигГасек бстοηк!^а!ск гебисеб сοшρίсшсη! ас!гоа!юп Ьу ^тшοЬ^ί^ζа!^οη οΓ Ьерапп, АгйГ. Огдапк, νο1. 19, Νο. 9, рр. 909-917 (1995).

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарственного препарата для ингибирования немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (ТВМЖ - шк!ап! Ьίοοб-шсб^а!сб шПаттаЮгу геасГюп), вызванной воздействием крови на клеточный трансплантат после его трансплантации в чужеродный организм реципиента.
2. 2. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарственного препарата для ингибирования морфологического разрушения трансплантированного клеточного трансплантата, вызванного ГВМГК..
3. 3. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарственного препарата для ингибирования отторжения клеточного трансплантата, вызван

   - 14 010409 ного ΙΒΜΙΚ.
4. 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат трансплантируют в организм реципиента-человека.
5. 5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат выбран из аллогенного клеточного трансплантата или ксеногенного клеточного трансплантата.
6. 6. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат выбран из индивидуальных клеток, кластера клеток или неваскуляризованной ткани.
7. 7. Применение по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат представляет собой островки Лангерганса.
8. 8. Применение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что указанный декстрансульфат имеет молекулярную массу менее 20000 Да, предпочтительно менее 10000 Да.
9. 9. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что содержание серы в декстрансульфате составляет 10-25%, предпочтительно 15-20%.
10. 10. Способ ингибирования ΙΒΜΙΚ, вызванной воздействием крови на клеточный трансплантат после его трансплантации в чужеродный организм реципиента, включающий введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного реципиенту, нуждающемуся в таком ингибировании.
11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный реципиент является человеком.
12. 12. Способ ингибирования отторжения клеточного трансплантата, вызванного ΙΒΜΙΚ, включающий введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком ингибировании.
13. 13. Способ ингибирования морфологического разрушения клеточного трансплантата, вызванного ΙΒΜΙΚ, включающий введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком ингибировании.
14. 14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что указанный пациент является человеком.
15. 15. Способ по любому из пп.10-14, отличающийся тем, что указанное терапевтически эффективное количество декстрансульфата обеспечивает концентрацию декстрансульфата в крови указанного реципиента (пациента) менее 5 мг/мл, предпочтительно 0,01-1 мг/мл и более предпочтительно 0,05-0,2 мг/мл.
16. 16. Способ по любому из пп.10-15, отличающийся тем, что декстрансульфат вводят в организм реципиента (пациента) путем инъекции клеточного трансплантата в растворе декстрансульфата.
17. 17. Способ по любому из пп.10-16, отличающийся тем, что декстрансульфат имеет молекулярную массу менее 20000 Да, предпочтительно менее 10000 Да.
18. 18. Способ по любому из пп.10-17, отличающийся тем, что содержание серы в декстрансульфате составляет 10-25%, предпочтительно 15-20%.