JP2020533281A - デキストラン硫酸の新規使用 - Google Patents

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Abstract

デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体が、グリア細胞およびニューロンの分化を誘導するために使用される。デキストラン硫酸の細胞分化誘導は、神経変性疾患、脱髄性疾患、神経虚血性疾患および神経筋疾患を含む神経疾患を罹患している対象に対し好ましい効果を有する。【選択図】図１２

Description

本実施形態は、一般に、神経学的および線維性状態に関し、特に、このような状態との闘いにおけるデキストラン硫酸の使用に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および多発性硬化症（ＭＳ）などの神経疾患、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中およびくも膜下出血（ＳＡＨ）などの中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）への損傷では、乏突起膠細胞およびシュワン細胞などのニューロンおよびグリア細胞の分化の喪失は、最初の疾患ステージの１つであり、その後細胞死が続く。代謝機能およびミトコンドリアのエネルギー代謝の低下および酸素ストレスの上昇に見られるように、細胞の機能も同様に損なわれる。損傷ニューロンはさらに、近くのニューロンに対する興奮毒性作用を有するグルタミン酸を放出し、次に、さらなる細胞損傷および細胞死を引き起こす。
よって、神経疾患、障害および状態で発生する多数の有害な機序が存在する。従って、このような有害な機序と闘うのに効果的で、それにより、このような神経疾患、障害および状態を罹患している患者にとって有益であり得る薬物の一般的必要性が存在する。
米国特許出願公開第２０１１／００１４７０１号は、前駆細胞の生存率を改善するためのポリ硫酸化ポリサッカライドの使用に関する。この米国特許出願は、前駆細胞の分化を調節するためのポリ硫酸化ポリサッカライドの使用も開示している。種々のポリ硫酸化ポリサッカライドが試験された。ポリ硫酸化ポリサッカライドの多硫酸デキストラン（Ｍｗ＝５，０００Ｄａ）は、前駆細胞の分化を下方制御または抑制すると結論付けられた。
神経学的および／または線維性状態に罹患している患者に有用な薬物を提供することが一般的な目的である。
これおよびその他の目的は、本明細書で定義の実施形態により実現される。
本発明は、独立請求項により定められる。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項で定められる。
本実施形態は、神経学的および／または線維性疾患、障害または状態に罹患している患者に対するいくつかの有利な効果を有するデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体に関する。
デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体は、特に、グリア細胞およびニューロンの分化の誘導、ニューロンおよびグリア細胞の酸化ストレスの低減、グルタミン酸興奮毒性の低減、ニューロンおよびグリア細胞のミトコンドリアの代謝機能およびエネルギー代謝の改善、ならびに身体の内因性修復機序の活性化を行うことができる。デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体はまた、ＴＧＦ−βなどの線維形成因子を抑制し、繊維分解を活性化して、それにより、既存の瘢痕組織を分解して、組織リモデリングおよび組織の治癒の実現を誘導することにより線維形成を防止できる。デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体はまた、免疫または炎症反応を消散させることにより、神経炎症状態を含む種々の炎症性および自己免疫性状態にも効果があった。
そのさらなる目的および利点と一緒に、いくつかの実施形態は、添付図面とともに、以下の説明を参照することにより最も良く理解され得る。
図１は、マウス皮質ニューロンのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）含量を示す。細胞は、ＤＮＡに結合するＰＩで染色された。ＤＮＡ含量に基づいて、細胞を細胞周期の異なる期に分類できる。ＤＮＡ含量は細胞周期中に変化するので、ＰＩ染色は、細胞周期の進行を示すことができる。データは、ほとんどの細胞が細胞周期のＧ１期に留まる（点線の矢印）が、低分子量デキストラン硫酸（ＬＭＷ−ＤＳ）は、Ｇ２／Ｍ期の細胞の数を増加させるように見える（実線の矢印）ことを示した。 図２は、ヒト運動ニューロンのＰＩ含量を示す。データは、ほとんどの細胞が細胞周期のＧ１期に留まる（点線の矢印）が、ＬＭＷ−ＤＳは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の数を増加させるように見える（実線の矢印）ことを示した。 図３は、ヒトシュワン細胞のＰＩ含量を示す。データは、ほとんどの細胞が細胞周期のＧ１期に留まる（点線の矢印）が、ＬＭＷ−ＤＳは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の数を増加させるように見える（実線の矢印）ことを示した。 図４は、マウス皮質ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリン発現の代表的な写真である。 図５Ａおよび５Ｂは、マウス皮質ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリン発現に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。グラフは、陽性細胞の全体強度（図５Ａ）および平均サイズ（図５Ｂ）を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、マウス皮質ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリン発現に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。グラフは、陽性細胞の全体強度（図５Ａ）および平均サイズ（図５Ｂ）を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ヒト運動ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリン発現に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。グラフは、陽性細胞の全体強度（図６Ａ）および平均サイズ（図６Ｂ）を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ヒト運動ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリン発現に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。グラフは、陽性細胞の全体強度（図６Ａ）および平均サイズ（図６Ｂ）を示す。 図７は、ヒト運動ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリン発現の代表的な写真である。 図８Ａおよび８Ｂは、ヒトシュワン細胞中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）発現に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。グラフは、陽性細胞の全体強度（図８Ａ）および平均サイズ（図８Ｂ）を示す。 図８Ａおよび８Ｂは、ヒトシュワン細胞中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）発現に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。グラフは、陽性細胞の全体強度（図８Ａ）および平均サイズ（図８Ｂ）を示す。 図９は、ヒトシュワン細胞中のＭＢＰ発現の代表的な写真である。 図１０は、陰性対照（ビークル）、陽性対照シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏ）およびＬＭＷ−ＤＳに対するマウスのＥＡＥ誘導後の平均実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）重症度スコアを示す図である。 図１１は、陰性対照（ビークル）およびＨＧＦに対するマウスのＥＡＥ誘導後の平均ＥＡＥ重症度スコアを示す図である。矢印は、治療の開始を示す。 図１２は、脳グルタミン酸レベルの変化を示す図である。 図１３Ａ〜１３Ｄは、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ）およびＡＴＰ／ＡＤＰ比の変化レベルをミトコンドリアのリン酸化能力として示す図である。 図１３Ａ〜１３Ｄは、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ）およびＡＴＰ／ＡＤＰ比の変化レベルをミトコンドリアのリン酸化能力として示す図である。 図１３Ａ〜１３Ｄは、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ）およびＡＴＰ／ＡＤＰ比の変化レベルをミトコンドリアのリン酸化能力として示す図である。 図１３Ａ〜１３Ｄは、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ）およびＡＴＰ／ＡＤＰ比の変化レベルをミトコンドリアのリン酸化能力として示す図である。 図１４Ａ〜１４Ｄは、酸化型および還元型ニコチンコエンザイムの変化レベルを示す図である。 図１４Ａ〜１４Ｄは、酸化型および還元型ニコチンコエンザイムの変化レベルを示す図である。 図１４Ａ〜１４Ｄは、酸化型および還元型ニコチンコエンザイムの変化レベルを示す図である。 図１４Ａ〜１４Ｄは、酸化型および還元型ニコチンコエンザイムの変化レベルを示す図である。 図１５Ａ〜１５Ｃは、酸化ストレスを表すバイオマーカーの変化レベルを示す図である。 図１５Ａ〜１５Ｃは、酸化ストレスを表すバイオマーカーの変化レベルを示す図である。 図１５Ａ〜１５Ｃは、酸化ストレスを表すバイオマーカーの変化レベルを示す図である。 図１６は、ＮＯ媒介ニトロソ化ストレスの測定値としての硝酸塩の変化レベルを示す図である。 図１７Ａ〜１７Ｃは、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）およびその基質の変化レベルを示す図である。 図１７Ａ〜１７Ｃは、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）およびその基質の変化レベルを示す図である。 図１７Ａ〜１７Ｃは、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）およびその基質の変化レベルを示す図である。 図１８は、ミトコンドリアの機能（不全）に対する酸化ストレスの効果を模式的に示す。 図１９は、グルタミン酸シグナル伝達経路に関与する分子を模式的に示す。 図２０は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）を罹患し、生理食塩水対照またはＬＭＷ−ＤＳで治療した対象の角度におけるラミニン免疫反応性の変化を示す図である。 図２１は、ＰＯＡＧを罹患し、生理食塩水対照またはＬＭＷ−ＤＳで治療した対象の角度におけるフィブロネクチン免疫反応性の変化を示す図である。 図２２は、アミロイドβモノマーおよびオリゴマー調製物を示す。アミロイドβ（１−４２）Ａまたはアミロイドβビオチン（Ｂ）のオリゴマー（レーン１、２、５〜７）またはモノマー（レーン３および４）の調製物。それぞれのペプチド調製物の５０ｐｍｏｌｅ（レーン５）、１００ｐｍｏｌｅ（レーン１、３および６）または２００ｐｍｏｌｅ（レーン２、４および７）をゲルにロードした。進行中のウェスタンブロットのタンパク質を抗アミロイドβで免疫標識した。予測オリゴマーおよび分子量マーカーを示している。 図２３は、アミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用に対するデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳＳ）およびＬＭＷ−ＤＳ競合を示す。 図２４は、外傷誘導の３０分後に実施した漸増用量のＬＷＭ−ＤＳ（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ体重）の単回投与の有無の場合の、ＴＢＩの２日後に屠殺したラットの脱タンパク脳ホモジネート中で測定したＮＡＡの濃度を示す。対照は、シャム手術された動物である。値は１２匹の動物の平均である。標準偏差は、垂直バーで表される。＊対照に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。＊＊ｓＴＢＩ ２日後に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。 図２５は、漸増用量のＬＷＭ−ＤＳの投与（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ 体重の単回投与および１５ｍｇ／ｋｇ体重の反復投与）の有無の場合の、ｓＴＢＩの７日後に屠殺したラットの脱タンパク脳ホモジネート中で測定したＡＴＰの濃度を示す。対照は、シャム手術された動物である。値は１２匹の動物の平均である。標準偏差は、垂直バーで表される。＊対照に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。＊＊ｓＴＢＩ ２日後に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。 図２６は、漸増用量のＬＷＭ−ＤＳの投与（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与および１５ｍｇ／ｋｇ体重の反復投与）の有無の場合の、ｓＴＢＩの７日後に屠殺したラットの脱タンパク脳ホモジネート中で測定したアスコルビン酸の濃度を示す。対照は、シャム手術された動物である。値は１２匹の動物の平均である。標準偏差は、垂直バーで表される。＊対照に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。＊＊ｓＴＢＩ ２日後に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。 図２７は、漸増用量のＬＷＭ−ＤＳの投与（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与および１５ｍｇ／ｋｇ体重の反復投与）の有無の場合の、ｓＴＢＩの７日後に屠殺したラットの脱タンパク脳ホモジネート中で測定したグルタチオン（ＧＳＨ）の濃度を示す。対照は、シャム手術された動物である。値は１２匹の動物の平均である。標準偏差は、垂直バーで表される。＊対照に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。＊＊ｓＴＢＩ ２日後に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。 図２８は、漸増用量のＬＷＭ−ＤＳの投与（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与および１５ｍｇ／ｋｇ体重の反復投与）の有無の場合の、ｓＴＢＩの７日後に屠殺したラットの脱タンパク脳ホモジネート中で測定したＮＡＡの濃度を示す。対照は、シャム手術された動物である。値は１２匹の動物の平均である。標準偏差は、垂直バーで表される。＊対照に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。＊＊ｓＴＢＩ ２日後に対し、ｐ＜０．０１で有意差有り。
本実施形態は、一般に、神経学的および線維性状態に関し、特に、このような状態との闘いにおけるデキストラン硫酸の使用に関する。
神経障害は、身体神経系、すなわち、それらを結びつける脳、脊椎および神経の何らかの障害である。脳、脊髄またはその他の神経中の構造的、生化学的または電気的異常が一連の症状を生じ得る。脳および脊髄は強靭な膜により取り囲まれ、頭蓋骨および脊椎骨の骨中に閉じ込められ、また、血液脳関門により化学的に隔離されているが、それらは、危険にさらされると、極めて影響を受けやすい。神経は、皮膚下の深い位置にあると思われがちであるが、それでも、損傷にさらされる場合がある。個別のニューロン、ならびにニューラルネットワークおよびそれらが形成する神経は、電気化学的および構造的破壊を受けやすい。神経再生は、末梢神経系で発生し得、従って、ある程度損傷の周りで克服または機能するが、それは脳および脊髄では希であると考えられている。
神経学的な問題の具体的な原因は様々であるが、遺伝性障害、先天性異常または障害、感染、生活習慣、栄養障害を含む環境的な健康問題、および脳損傷、脊髄損傷または神経損傷が含まれ得る。問題は、神経系と相互作用する別の身体系で始まる場合もある。例えば、脳血管障害は、血管、すなわち、脳に供給する心臓血管系に関連する問題による脳損傷を含む；自己免疫障害は、身体自身の免疫系により引き起こされる損傷を含む；ニーマン・ピック病などのリソソーム蓄積症は神経症候増悪に繋がる場合がある。
神経変性疾患、障害または状態は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造および／または機能の進行性消失を引き起こす疾患、障害または状態である。
このような神経変性疾患、障害、または状態の非限定的例には、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。
ＡＤは、大脳皮質および皮質下領域でのニューロンおよびシナプスの消失を特徴とする。ＡＤの古典的な神経病理学的知見には、アミロイド斑、神経原線維濃縮体、およびシナプスおよび神経細胞死が含まれる。白質疾患（ＷＭＤ）は、神経病理学的検査で、ＡＤに高頻度に認められる。ミエリン、軸索および乏突起膠細胞の減少を伴うほぼ全体に近い組織消失、ならびにアストロサイト増加として定義される。
ＰＤは、ＣＮＳの神経変性疾患である。ＰＤの運動症状は、黒質中のドーパミン生成細胞の死に起因する。罹患神経では、軸索の周りのミエリン鞘が侵食され始める。神経炎症は、ＰＤの病理学的特徴であり、ニューロン損傷の部位での活性化ミクログリアおよび浸潤性Ｔ細胞を特徴とする。
ＨＤは、筋協調に影響を与え、認知機能低下および精神学的問題に繋がる神経変性疾患である。この疾患は、ハンチンチンと呼ばれる遺伝子の常染色体優性変異により引き起こされる。この遺伝子の一部は、トリヌクレオチド反復と呼ばれる反復部であり、これは、個体間で長さが変化する。この反復部の長さが特定の閾値に達すると、それは、変化した形態のタンパク質を生成する。ハンチンチン遺伝子によりコードされたタンパク質（Ｈｔｔ）は、１００個を超える他のタンパク質と相互作用し、複数の生物学的機能を有する。Ｈｔｔの変異型は、特に、脳中の特定の細胞型に毒性である。ＨＤは、神経上のミエリン鞘に対する損傷を特徴とする。末梢血中の増大した活性化Ｔ細胞がＨＤ患者中で特定された。
ルー・ゲーリック病とも呼ばれるＡＬＳは、様々な病因を伴う消耗性疾患であり、急速進行性の脱力、筋萎縮および線維束形成、筋痙縮、構音障害、嚥下障害および呼吸困難を特徴とする。ＡＬＳは最もよくある運動ニューロン疾患である（ＡＬＳ、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）および仮性球麻痺）。ＡＬＳの病状の基本的特性は、脊髄の前角中および脳幹の運動核中の運動神経細胞の消失である。これにより、対応する筋肉の二次的萎縮が生じる（筋萎縮症）。神経炎症は、ＡＬＳの病理学的特徴であり、ニューロン損傷の部位での活性化ミクログリアおよび浸潤性Ｔ細胞を特徴とする。「側索硬化症」は、皮質脊髄路変性（脊髄の部位の側面）を意味する。実際に、ミエリン消失は皮質脊髄路で起こる。硬化症であるＡＬＳの硬化は、側索、または皮質脊髄路を含み、二次的現象である。
神経疾患、障害または状態は、脱髄性疾患、障害または状態であり得る。脱髄性疾患、障害または状態は、ニューロンのミエリン鞘が損傷される神経系の疾患である。このような損傷は、罹患神経のシグナル伝導を低下させ、それにより、損傷に関与する神経に応じて、感覚、運動、認知およびその他の機能の欠損を生じさせる。
このような脱髄性疾患、障害、または状態の非限定的例には、多発性硬化症（ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、中枢神経系（ＣＮＳ）神経障害、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、脊髄症、白質脳症および白質ジストロフィー（全てＣＮＳを冒す）、ならびにギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、末梢神経障害およびシャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病（全て末梢神経系（ＰＮＳ）を冒す）が挙げられる。
ＭＳは、炎症性疾患で、脳および脊髄の軸索の周りの脂肪質ミエリン鞘が損傷を受け、脱髄および瘢痕形成ならびに広範囲の徴候および症状に繋がる。ＭＳは、脳および脊髄の白質に対する免疫応答を誘導するＴ細胞が関与する。ＭＳは、ミエリンの疾患であり、元来、神経細胞の疾患ではない。ミエリンは神経系全体にわたり発生するので、病変は複数の部位で発生する可能性があり、通常、複数の部位に存在する。しかし、疾患は中枢神経系ミエリンのみを冒し、末梢神経のミエリンを冒さない。従って、症状はＣＮＳ特異的障害である。
ＡＤＥＭは、脳の免疫媒介疾患である。これは、ウイルス、細菌または寄生虫感染後に発生する、あるいは、自然発生的に出現する。ＡＤＥＭは、ＣＮＳの神経を攻撃し、それらのミエリン絶縁体に損傷を与え、これは、結果として、白質を破壊する。それは、自己免疫性脱髄を伴うので、ＭＳに類似しており、ＭＳ領域疾患の一部と見なされる。ＡＤＥＭは脳および脊髄中、特に白質中に複数の炎症性病変を生成する。ＡＤＥＭは、ミエリン反応性Ｔ細胞により分泌されるサイトカインを必要とする。
ＣＮＳ神経障害および末梢神経障害を含む神経障害は、一群の罹患神経に対する損傷または神経を冒す疾患であり、罹患神経の種類に応じて、感覚、運動、腺または器官機能、またはその他の健康状態を低下させ得る。共通の原因には、糖尿病またはハンセン病などの全身性疾患；ビタミン欠乏；薬物、例えば、化学療法剤、一般に処方される抗生物質；外傷；虚血；放射線療法；過剰な飲酒；免疫系疾患；セリアック病；またはウイルス感染が挙げられる。神経障害は急性であり得るまたは急性である。急性神経障害は緊急の診断を要する。筋肉を制御する運動神経、感覚神経、または心拍数、体温、および呼吸などの自律機能を制御する自律神経が罹患し得る。２つ以上の神経が同時に罹患し得る。
ＣＰＭは、脳幹、より正確には、主に医原性病因の脳橋と呼ばれる領域における神経細胞のミエリン鞘の重度損傷により引き起こされる神経疾患である。これは、急性麻痺、嚥下障害、および構音障害、およびその他の神経学的症状を特徴とする。
脊髄症は、脊髄に関連する何らかの神経障害を言う。外傷による場合、それは一般に、脊髄損傷（ＳＣＩ）として知られ、炎症性の場合、それは一般に、脊髄炎として知られ、および性質上血管性である場合、それは血管性脊髄症として知られる。ヒトで最もよくある形態の脊髄症の頸椎症性脊髄症（ＣＳＭ）は、頸部脊椎の関節炎変化（脊椎症）により引き起こされ、これは、脊柱管の狭小化（脊柱管狭窄）が起こり、最終的に脊髄の圧迫をもたらす。
白質脳症は、白質ジストロフィー様疾患の広義語である。それは、分子的原因が既知であるか否かにかかわらず、全ての脳白質疾患に適用される。白質脳症は、具体的には、進行性多巣性白質脳症、中毒性白質脳症、白質消失病、神経軸索スフェロイドを伴う白質脳症、可逆性後白質脳症症候群、皮質下嚢胞を伴う大頭型白質ジストロフィーを意味する。
白質ジストロフィーは、脳内の白質の変性を特徴とする一群の障害の１つである。白質ジストロフィーは、神経線維の周りの絶縁体として機能する脂肪被覆である、ミエリン鞘の不完全な成長または発生が原因である。白質に損傷が発生すると、免疫応答が、ミエリンの消失と共に、ＣＮＳ中で炎症をもたらし得る。白質ジストロフィーは、運動機能、筋肉剛性の低下、および最終的に視力および聴力の低下を含む特定の症状を特徴とする。特定の種類の白質ジストロフィーには、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、遺伝性ＣＮＳ脱髄性疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハ病、カナバン病、白質消失病、副腎白質ジストロフィーおよびレフスム病が挙げられる。
ランドリー麻痺またはＧｕｉｌｌａｎ−Ｂａｒｒｅ−Ｓｔｒｏｈｌ症候群（ギラン・バレー症候群）とも呼ばれるＧＢＳは、ＰＮＳを冒す急性多発性神経障害である。ＧＢＳでは、免疫細胞がミエリン鞘（神経線維を覆う脂肪物質）を攻撃する。上行性麻酔は、一般的な症状である。ＧＢＳは、感染により誘発された異常なＴ細胞応答を伴う免疫媒介疾患であると考えられている。おそらく、細胞性および体液性免疫機序がその発生に関与しているのであろう。ほとんどの患者は、ＧＢＳの発症の数週間前の感染性疾病を報告している。多くの特定された感染病原体が、ＧＭ１およびＧＤ１ｂなどの特定のガングリオシドおよび糖脂質と交差反応する抗体の産生を誘導し、これが末梢神経系のミエリン全体にわたり分配されると考えられている。
ＣＭＴは、身体の種々の部分にわたる筋組織および触覚の進行性消失を特徴とする一群の様々な末梢神経系の遺伝性障害である、遺伝性運動感覚ニューロパシーの１つである。ＣＭＴは、以前には、筋ジストロフィーのサブタイプとして分類されていた。
神経障害では、ニューロンならびに乏突起膠細胞およびシュワン細胞などのグリア細胞の分化の消失が疾患進行の第１の段階の１つである。一般に、この障害では、その後、このようなニューロンおよびグリア細胞の細胞死が進行する。
したがって、神経細胞およびグリア細胞の分化を促進できる薬物が、神経疾患、障害、または状態を罹患している患者にとって有益であろう。このような分化誘導薬物は、神経保護性であり得、例えば、神経疾患、障害、または状態の治療に有用であり得る。
本明細書で提示される実験データは、実施形態のデキストラン硫酸が、ニューロンおよびグリア細胞の分化を誘導できることを示す。このデキストラン硫酸の効果は、皮質ニューロンおよび運動ニューロンの両方に対し認められ、また、マウスおよびヒト起源の両方由来のニューロンに対しても認められる。それに対応して、デキストラン硫酸は、グリア細胞の１種を構成するシュワン細胞の分化を誘導できる。
実施形態のデキストラン硫酸はさらに、ＣＮＳの炎症性脱髄性疾患インビボモデルで好ましい効果を示した。このモデルは、現在最も広く受け入れられているＭＳおよびＡＤＥＭの動物モデルである。
実施形態のデキストラン硫酸によるニューロンおよびグリア細胞の細胞分化の誘導に関するこれらの結果は、デキストラン硫酸（Ｍｗ＝５，０００Ｄａ）が前駆細胞の分化を誘導せず、むしろ下方制御または抑制すると述べている米国特許出願公開第２０１１／００１４７０１号を考慮すると、極めて意外であった。従って、実施形態のデキストラン硫酸の細胞分化能力は、細胞型特異的であり、それにより、潜在的にニューロンおよびグリア細胞に限定され得ると思われる。先行技術データは、デキストラン硫酸が実際に、上述の米国特許出願における前駆細胞により示されている、他の細胞型に対しては逆の効果を有することを示している。
神経細胞とも呼ばれるニューロンは、電気的および化学的シグナルを介して情報を処理および伝達する電気的に興奮性の細胞である。ニューロン間のこれらのシグナルは、シナプスの他の細胞との特殊結合を経由して発生する。ニューロンは、相互に結合してニューラルネットワークを形成できる。ニューロンは、ＣＮＳの脳および脊髄のコア成分であり、ＰＮＳの神経節のコア成分である。特殊なタイプのニューロンには、後でシグナルを脊髄および脳に送る感覚器官の細胞に影響を与える、接触、音、光およびその他の全ての刺激に応答する感覚ニューロン；脳および脊髄からシグナルを受信し、筋肉収縮を生じ、腺出力に影響を与える運動ニューロン；およびニューロンをニューラルネットワーク中の同じ脳または脊髄領域内の他のニューロンに結合させる介在ニューロンが含まれる。
典型的なニューロンは、細胞体（神経細胞体）、樹状突起、および軸索からなる。用語の神経突起は、特にその未分化段階の、樹状突起または軸索を表現するために使用される。樹状突起は、細胞体から生じる細い構造体で、多くの場合数百マイクロメートル伸び、複数回分岐して、複雑な「樹状突起樹」を生じる。軸索はまた、ミエリン化されると、神経線維とも呼ばれ、軸索小丘と呼ばれる部位で細胞体から生じ、一定距離伸びる特殊な細胞伸長部である。神経線維は、多くの場合、線維束に束ねられ、ＰＮＳでは、線維の束が神経を構成する。大部分のシナプスでは、シグナルが１つのニューロンの軸索から別の樹状突起に送られる。
ニューロンは、細胞分裂を受けない。ほとんどの場合、ニューロンは、特殊なタイプの幹細胞により生成される。星状膠細胞は、幹細胞に特徴的な多能性のためにニューロンに変わることが同様に観察された星形グリア細胞である。ヒトでは、ニューロン新生は成人期の間ほとんど停止されるが、２つの脳領域の海馬および嗅球では、実質的な数の新規ニューロンの生成の強力なエビデンスが存在する。
実施形態のデキストラン硫酸は、β−チューブリン中、特にβＩＩＩ−チューブリン中でニューロンの発現の増加を誘導できる。
βＩＩＩ−チューブリンはまた、クラスＩＩＩβ−チューブリンとも呼ばれ、もっぱらニューロン中で発現される微小管要素である。微小管細胞骨格は、ニューロンの発生と生存に不可欠である。微小管は、チューブリンヘテロダイマーから構築され、これは、異なるチューブリンアイソタイプを含む。微小管は分極され、ニューロン中でそれらの「マイナス末端」は通常、細胞体中の中心体の方を向いており、一方、それらの「プラス末端」は軸索の先端に向かって突き出ている。微小管の極性は、分化および成体ニューロンの両方で重要な機能を果たす。分化の間、チューブリンは細胞中で増加し、分化しているニューロンを、シナプス後標的に向けた方向性成長を維持するために、ガイダンス合図に応じて成長している軸索を延長または後退させる微小管を構築する。それらの活性は、細胞遊走、軸索発生およびガイダンスにとって不可欠であり、成体ニューロンの機能および生存能力にとっても必要である（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１０），３０：３１９−３３０）。
ニューロン中のβＩＩＩ−チューブリンの増加した発現は、実施形態のデキストラン硫酸がこれらの細胞の分化因子として機能することを示す。
ある実施形態では、ニューロンは、皮質ニューロンおよび運動ニューロンからなる群から選択される。
運動ニューロンは、細胞体が脊髄中に位置し、軸索が脊髄の外側に突き出て、直接的にまたは間接的にエフェクター器官、主に筋肉および腺を制御する神経細胞である。運動ニューロンの軸索は、脊髄からエフェクターシグナルを運び、効果を生成する遠心性神経線維である。
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、選択的に運動ニューロンに影響を与える神経障害である。これらのＭＮＤは、ＡＬＳ、ＨＳＰ、ＰＬＳ、ＰＭＡ、ＰＢＰ、仮性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）およびポリオ後症候群（ＰＰＳ）である。それらは、本来、神経変性的であり、身体障害を漸増させ、最終的に死を引き起こす。
遺伝性痙性対麻痺、家族性痙性対麻痺、Ｆｒｅｎｃｈ ｓｅｔｔｌｅｍｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ、またはストランペル−ロレイン病とも呼ばれるＨＳＰは、主な特徴が進行性歩行障害である一群の遺伝性疾患である。この疾患は、進行性硬直（痙直）および下肢の収縮を呈する。この症状は、脊髄中の長い軸索の機能障害の結果である。罹患細胞は、一次運動ニューロンであり、従って、疾患は上位運動ニューロン疾患である。ＨＳＰは、タンパク質、構造タンパク質、タンパク質を維持している細胞、脂質、および他の物質の細胞を通る輸送の障害により引き起こされる。
ＰＬＳは、随意筋中の進行性筋力低下を特徴とする希な神経筋疾患である。ＰＬＳは、上位運動ニューロンのみを冒す。
デュシェンヌ−アラン型筋萎縮症としても知られる、ＰＭＡは、下位運動ニューロンのみを冒すＭＮＤの希なサブタイプである。
ＰＢＰは、延髄筋肉の神経を攻撃する疾患である。これらの障害は、大脳皮質、脊髄、脳幹、および錐体路中の運動ニューロンの変性を特徴とする。これは特に、舌咽神経（ＩＸ）、迷走神経（Ｘ）、および舌下神経（ＸＩＩ）を含む。
仮性球麻痺は、咀嚼および発声などの顔面運動の制御不能を特徴とする病状であり、種々の神経障害により引き起こされる。咀嚼および嚥下の困難を経験した患者は、舌および延髄領域の反射および痙直が増大し、不明瞭発語を示し、時には無制御感情的爆発も示す。この状態は通常、脳幹のニューロン、特に皮質延髄路（脳神経運動核への上位運動ニューロン路）への損傷、両側性の変性により引き起こされる。
常染色体劣性遺伝近位の脊髄性筋萎縮症および５ｑ脊髄性筋萎縮症とも呼ばれるＳＭＡは、運動ニューロン消失および進行性筋消耗を特徴とし、多くの場合、早期死亡に繋がる希な神経筋障害である。障害は、全ての真核細胞で広く発現し、運動ニューロンの生存に必要なタンパク質である、ＳＭＮをコードするＳＭＮ１遺伝子の遺伝的欠陥により引き起こされる。より低レベルのこのタンパク質は、脊髄の前角の神経細胞の機能の消失および続いて生じる組織全体にわたる骨格筋萎縮を生じる。
ポリオ後症候群またはポリオ後遺症とも呼ばれる、ＰＰＳは、以前の小児麻痺（神経系のウイルス感染）の最初の感染による急性攻撃から生存した人の凡そ２５〜４０％を冒す状態である。症状には、急性または増大した筋力低下、筋肉疼痛、および疲労が含まれる。同じ症状は、非麻痺性ポリオ（ＮＰＰ）感染後数年で発症する場合もある。ＰＰＳを起こす正確な機序は未知である。その多くの特徴が、慢性疲労症候群と共通するが、その障害と異なり、進行する傾向があり、筋肉強度の低下を起こす可能性がある。
皮質ニューロンは、脳の大脳皮質の細胞である。思考、知覚作用、および随意運動を可能とするほとんどの脳の複合体活性は、皮質ニューロンの活性に関連付けられている。
皮質ニューロン消失は、ＡＤなどのいくつかの神経変性疾患で発生する。
神経膠細胞とも呼ばれることがある、グリア細胞は、恒常性を維持し、ミエリンを形成し、ＣＮＳおよびＰＮＳ中のニューロンの支持および保護を提供する非ニューロン細胞である。グリア細胞は、次記の４種の重要な機能を有する：ニューロンを取り囲みそれらを所定位置で保持すること；栄養素および酸素をニューロンに供給すること；相互からニューロンを絶縁し、病原体を破壊すること；および死んだニューロンを除去すること。
ＣＮＳまたはＰＮＳ中に存在する多くのタイプのグリア細胞がある。ＣＮＳ中に存在するグリア細胞型には、星状膠細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリアおよびミクログリアが挙げられる。ＰＮＳ中に存在するグリア細胞型には、シュワン細胞、衛星細胞および腸管グリア細胞が挙げられる。
アストログリアとも呼ばれる星状膠細胞は、ＣＮＳ中の最も豊富なタイプのマクログリア細胞である。星状膠細胞は、ニューロンをそれらの血液供給路に固定する多数の突起部を有する。それらは、過剰イオンを除去し、シナプス伝達中に放出された神経伝達物質を再利用することにより、ニューロンの外部化学的環境を調節する。星状膠細胞は、代謝物が血管作用性であるアラキドン酸などの物質を生成することにより、血管収縮および血管拡張を調節し得る。
乏突起膠細胞は、ＣＮＳ中で軸索をそれらの細胞膜でコートする細胞であり、ミエリンと呼ばれる特殊な膜分化を形成し、いわゆるミエリン鞘を生成する。ミエリン鞘は、電気シグナルをより効率的に伝達することを可能とする、軸索に対する絶縁を提供する。
脳室上衣細胞とも呼ばれる上衣細胞は、脊髄および脳室系を覆う。これらの細胞は、脳脊髄液（ＣＳＦ）の生成と分泌に関与し、それらの繊毛を撹拌し、ＣＳＦの循環を支援し、血液−ＣＳＦ関門を構成する。それらはまた、神経の幹細胞として機能するとも考えられている。
放射状グリア細胞は、ニューロン新生の開始後、神経上皮細胞から生ずる。それらの分化能力は、神経上皮細胞と比べて、制限がより多い。神経系の発生では、放射状グリアは、神経前駆細胞および新生ニューロンがその上を移動する骨格の両方として機能する。成熟脳では、小脳および網膜が特徴的放射状グリア細胞を保持する。小脳では、これらはバーグマングリアであり、これは、シナプス可塑性を調節する。網膜では、放射状ミュラー細胞は、主要なグリア細胞であり、ニューロンとの双方向性通信に関与する。
ミクログリアは、脳および脊髄全体に位置する一種の神経膠細胞である。常在性マクロファージ細胞として、それらはＣＮＳ中で最初の、主要な形態の能動免疫防御として機能する。ミクログリアは、全体脳維持で重要な細胞であり、それらはＣＮＳを掃除して、プラーク、損傷または不要ニューロンシナプス、ならびに感染病原体を常に除去している。
シュワン細胞は機能的には乏突起膠細胞に類似であるが、ＣＮＳ中ではなく、ＰＮＳ中に存在している。従って、シュワン細胞は、ＰＮＳ中の軸索に対しミエリン形成を可能にする。それらはまた、食作用活性を有し、細胞残屑を除去して、ＰＮＳニューロンの再生を可能とする。
サテライトグリア細胞は、感覚性、交感神経、および副交感神経神経節中のニューロンを取り囲む小細胞である。これらの細胞は、外部化学的環境を調節するのを支援する。それらは、損傷および炎症に対し極めて感受性であり、慢性疼痛などの病理学的状態の一因となるように見える。
腸管グリア細胞は、消化器系の内因性神経節中に認められる。それらは、腸管系で多くの役割を有し、一部は、恒常性および筋性消化過程に関連していると考えられている。
実施形態のデキストラン硫酸は、グリア細胞中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）発現をさらに増大させる。
ＭＢＰは、神経系の神経のミエリン形成過程で重要なタンパク質であり、乏突起膠細胞およびシュワン細胞のミエリン鞘の主要な構成成分である。ＭＢＰは、ミエリンの適切な構造体を維持し、ミエリン膜中の脂質と相互作用する。ＭＢＰへの関心は、脱髄性疾患における、特にＭＳにおけるその役割に重点が置かれている。
軸索ミエリン形成は、脊椎動物ＣＮＳの正常な機能動作には、不可欠な過程である。ＰＮＳでは、ミエリンはシュワン細胞の細胞膜の分化により形成される。神経損傷後に起こる軸索接触の消失は、ミエリン遺伝子発現の下方制御に繋がる（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），６１：２６７−３０４）。シュワン細胞の分化と損傷末梢神経中でのＭＢＰの増加は、損傷後の再生にとって不可欠である（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５），９：Ａｒｔｉｃｌｅ ２９８，１−１３）。
グリア細胞中のＭＢＰの発現の増加は、実施形態のデキストラン硫酸がこれらの細胞の分化因子として機能することを示す（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００１），８１（２）：８７１−９２７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１３），１２５（３）：３３４−３６１）。
ある実施形態では、グリア細胞は、有髄化細胞、すなわち、隣接するニューロンの１つまたは複数の軸索の周りに巻き付けられたミエリン鞘を形成する細胞である。従って、特定の実施形態では、グリア細胞は、シュワン細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される。
実施形態のデキストラン硫酸は、ＣＮＳおよびＰＮＳの細胞の分化を誘導するだけでなく、神経疾患、障害および状態にも有益である。本明細書で提示された実験データは、実施形態のデキストラン硫酸が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）などの神経疾患、障害および状態で認められる代謝変化との闘いで好ましい効果を有することを示す。従って、多くの神経疾患、障害および状態は、細胞エネルギー状態およびミトコンドリアの機能に関連する種々の代謝物の調節を特徴とする。さらに、アミノ酸代謝における調節は、多くの神経疾患、障害および状態で認められる。これらの代謝変化は、酵素活性ならびに病理学的組織応答を示す遺伝子およびタンパク質発現の変化に影響を与える初期細胞シグナルである。実施形態のデキストラン硫酸は、損傷組織中の細胞代謝をよい方向に調節するように機能し、それにより、有害転帰の一因となるその後の酵素活性ならびに遺伝子およびタンパク質発現のいずれかの調節を阻害するかまたは少なくとも抑制する。
より詳細には、実施形態のデキストラン硫酸は、グルタミン酸興奮毒性のレベルを低減させることができ、代謝恒常性の有害な変化を回復し、それにより、ミトコンドリアの機能を効率的に保護し、神経保護効果を提供する。実施形態のデキストラン硫酸は、エネルギー代謝およびミトコンドリア機能に関連する種々の化合物に対しよい影響を与えた。特に興味深いのは、ミトコンドリアのリン酸化能力の測定値としてのアデニンヌクレオチドの濃度およびＡＴＰ／ＡＤＰ比である。
実施形態のデキストラン硫酸はまた、酸化ストレスの有意な減少に繋がった。特に、主要な水溶性脳抗酸化剤としてのアスコルビン酸のレベル、および主要な細胞内スルフヒドリル基（ＳＨ）ドナーとしてのグルタチオン（ＧＳＨ）が有意に改善された。加えて、膜リン脂質の多価不飽和脂肪酸の最終生成物としての、および、従って、活性酸素種（ＲＯＳ）媒介脂質過酸化のマーカーとして用いられるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルは、デキストラン硫酸投与後、有意な減少を示した。デキストラン硫酸治療後に、上記酸化ストレスマーカーは全て、抗酸化剤状態の回復の改善を示した。
デキストラン硫酸投与はまた、急性および慢性期両方の神経疾患、障害および状態における硝酸塩濃度を有意に低減した。したがって、実施形態のデキストラン硫酸は、ＮＯ媒介ニトロソ化ストレスに対し好ましい効果を有する。
Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）は、脳特異的代謝物であり、ＴＢＩなどの神経疾患、障害および状態後の悪化または回復をモニターするための有用な生化学的マーカーである。ＮＡＡは、アスパラギン酸およびアセチル−ＣｏＡからアスパラギン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼによりニューロンで合成される。実施形態のデキストラン硫酸は、ＮＡＡレベルの有意な改善を示した。
本明細書で提示の実験データはそれにより、実施形態のデキストラン硫酸が、疾患および損傷神経系中の酸化ストレスおよび／またはグルタミン酸興奮毒性により発生する細胞消失に対して保護できることを示す。細胞代謝を保護することにより、実施形態のデキストラン硫酸は、脳卒中、ＡＬＳ、ＭＮＤ、ＭＳ、認知症、ＴＢＩ、ＳＣＩ、網膜損傷、などの虚血性、酸化性または外傷性損傷により細胞が進行性に失われる多くの変性状態の有用な保護治療薬であり得る。これらの神経疾患、障害および状態は、全ての状態で発生するニューロンの神経機能の死および損傷の観点から共通の関連性を有する。このニューロン死の原因には共通性がある。特に関連性があるのは、瀕死ニューロンから放出される高レベルの神経伝達物質グルタミン酸が原因の毒性である。実施形態のデキストラン硫酸は、グリア細胞中の放出されたグルタミン酸の除去作用を誘導し、それにより、神経細胞間隙での毒性量のグルタミン酸の蓄積を防止する。これは、ニューロンが瀕死状態にある、急性および慢性両方の全ての神経変性疾患、障害および状態で有用であろう。
興奮毒性は、神経細胞が神経伝達物質、特にグルタミン酸による過剰の刺激により損傷を受けるまたは死滅する病理過程である。これは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体などの興奮性神経伝達物質グルタミン酸に対する受容体が、グルタミン酸作動性ストームによりまたはニューロンが損傷を受けるか死に、それらのグルタミン酸含量を放出する際に過剰活性化される場合に起こる。
興奮毒性は、ＳＣＩ、脳卒中、ＴＢＩ、難聴（ノイズへの過剰暴露または聴器毒性による）、およびＭＳ、ＡＬＳ、ＰＤ、アルコール中毒またはアルコール離脱および特に、極めて急速なベンゾジアゼピン離脱などのＣＮＳの神経変性疾患、ならびにＨＳにも関与し得る。ニューロン周辺で過剰のグルタミン酸濃度を生じる他の一般的な状態は、低血糖症である。
正常な状態中は、グルタミン酸濃度は、シナプス間隙中で１ｍＭまで増大し得、これは、数ミリ秒の経過で急速に低下する。シナプス間隙周辺のグルタミン酸濃度が低減できない、または高レベルに到達する場合、ニューロンは、アポトーシスと呼ばれる過程によりそれ自身を殺す。この病理学的現象は、ＴＢＩ、およびＳＣＩなどの脳損傷後にも発生し得る。損傷の数分内に、病変部位中の損傷神経細胞がグルタミン酸を細胞外間隙に流出させ、そこで、グルタミン酸はシナプス前のグルタミン酸受容体を刺激し、さらなるグルタミン酸の放出を高める。脳外傷または脳卒中は、虚血を引き起こし得、その場合、血流が不適切なレベルまで低下する。虚血に続いて、細胞外液中でグルタミン酸の蓄積が起こり、細胞死を引き起こし、これは酸素およびグルコースの欠乏により悪化する。虚血および関連する興奮毒性から生じる生化学的カスケードは、虚血性カスケードと呼ばれる。虚血およびグルタミン酸受容体活性化から生じたイベントが原因で、脳損傷の患者で、脳の代謝率、酸素およびグルコースの必要性を下げるために、およびグルタミン酸を積極的に除去するのに使用されるエネルギーを節約するために、深い化学的昏睡が誘導される場合がある。
さらに、増大した細胞外グルタミン酸レベルは、ミエリン鞘および乏突起膠細胞上のＣａ２＋浸透性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の活性に繋がり、Ｃａ２＋流入およびそれに続く興奮毒性が生じやすい乏突起膠細胞を残す。サイトゾル中での過剰カルシウムの有害な結果の１つは、切断型カスパーゼプロセシングによるアポトーシスの開始である。サイトゾル中での過剰カルシウムの別の有害な結果は、ミトコンドリア透過性遷移孔（オルガネラが過剰なカルシウムを吸収する場合に開口するミトコンドリア膜中の孔）の開口である。孔の開口により、ミトコンドリアが膨張し、活性酸素種および種々のタンパク質を放出させ、アポトーシスにつながり得る。孔はまた、ミトコンドリアにさらに多くのカルシウムを放出させ得る。さらに、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の産生が停止され、ＡＴＰシンターゼが、ＡＴＰの産生ではなく、実際にＡＴＰの加水分解を始め得る。
脳外傷から生じた不十分なＡＴＰ産生により、特定のイオンの電気化学的勾配が除去され得る。グルタミン酸トランスポーターは、グルタミン酸を細胞外間隙から除去するために、これらのイオン勾配の維持を必要とする。イオン勾配の消失は、グルタミン酸取り込みの停止のみでなく、トランスポーターの逆転も生じる。ニューロンおよび星状膠細胞上のＮａ＋グルタミン酸トランスポーターは、それらのグルタミン酸輸送を逆転させ、興奮毒性を誘導できる濃度でグルタミン酸の分泌を開始する。これは、グルタミン酸の蓄積およびグルタミン酸受容体のさらなる有害な活性化をもたらす。
分子レベルでは、カルシウム流入は、興奮毒性により誘導されるアポトーシスに関与する唯一の因子ではない。近年、グルタミン酸曝露または低酸素性／虚血状態の両方に誘発されて、シナプス外のＮＭＤＡ受容体活性化によりｃＡＭＰ応答エレメント結合（ＣＲＥＢ）タンパク質遮断が活性化され、これが次に、ミトコンドリア膜電位の消失およびアポトーシスを引き起こすことが明らかになっている。
従って、毒性レベルのグルタミン酸の蓄積を防止または少なくとも抑制するための、グリア細胞中での実施形態のデキストラン硫酸によるグルタミン酸トランスポーターの活性化は、グルタミン酸の興奮毒性から効果的に周辺ニューロンを保護することになる。その結果、実施形態のデキストラン硫酸は、これを用いない場合にこのグルタミン酸興奮毒性の結果として起こる損傷および細胞死からニューロンを保護する。
また、酸素／エネルギー供給の変化に特に感受性が高いＣＮＳおよびＰＮＳ、および脳を含む任意の組織は損傷または罹患すると、細胞へのエネルギー供給が損なわれる。その結果、ＣＮＳ、ＰＮＳまたは脳などの組織中の細胞は、効率的に機能できない。したがって、実施形態のデキストラン硫酸による酸化ストレスの低減、すなわち、ミトコンドリアのエネルギー供給の保護は、生存細胞がより効率的に機能することを可能とし、さらに、損なわれたニューロンをアポトーシスによる死から保護する。
従って、実施形態のデキストラン硫酸は、重度ＴＢＩ（ｓＴＢＩ）などの脳損傷があるしている対象の極めて不均衡なミトコンドリア関連エネルギー代謝の回復に効果的であり、三リン酸プリンおよびピリミジンヌクレオチドの濃度に対し好ましい効果があった。特に、ＡＴＰレベルは、対照である健康な対象の値より１６％だけ低く、一方、未治療ｓＴＢＩ対象では３５％の低下が認められた。注意すべきは、デキストラン硫酸で治療したｓＴＢＩ対象中のＮＡＡ濃度は、対照である健康な対象の値より１６％だけ低く、一方、ｓＴＢＩ対象ではこの化合物の４８％低い値が認められた。この知見は、再度、ＮＡＡの恒常性と適切なミトコンドリアのエネルギー代謝との間の厳密な関連を強く確証し、ミトコンドリアの機能動作に対し、好ましい方向に作用できる薬理学的介入の重要性を強調するものである。
デキストラン硫酸投与により生成された脳代謝の全般的回復はまた、ニコチンコエンザイムおよび遊離ＣｏＡ−ＳＨおよびＣｏＡ−ＳＨ誘導体の代謝を伴った。これは、デキストラン硫酸治療対象は、ｓＴＢＩに罹患しているにもかかわらず、正確な酸化還元反応を補償し、ＴＣＡサイクルの良好な機能動作を可能とする準正常コエンザイムを有していたことを意味する。
さらに、上述の脳代謝の改善は、他の顕著なデキストラン硫酸効果、すなわち、グルタミン酸興奮毒性の消滅の一因であった。さらに、デキストラン硫酸は、硫黄含有アミノ酸に影響を与えた。おそらく、この効果は、Ｓ原子を含むデキストラン硫酸分子に関連する可能性がある。この原子のバイオアベイラビリティの増大は、これらのアミノ酸の生合成で純増加をもたらした。その内の１つの（ＭＥＴ）は、メチル化反応および所謂メチルサイクルで極めて重要である。
さらなる記録された好ましい効果は、デキストラン硫酸の投与を受けたｓＴＢＩ対象における抗酸化剤の増加および酸化／ニトロソ化ストレス生化学的痕跡の減少であった。デキストラン硫酸の効果がｓＴＢＩの２日後よりもｓＴＢＩの７日後にさらに明らかになったことは、妥当なことである。これは、デキストラン硫酸投与による脳代謝の全般的回復は、一過性の現象ではなかったことを強く示唆する。
実施形態のデキストラン硫酸はさらに、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用で競合する親和性を有し、これは、ＡＤ、プリオン病またはアミロイドーシスを罹患している対象で有益な効果を有するであろう。
本明細書で提示される遺伝子発現データは、実施形態のデキストラン硫酸が、アポトーシスに対する保護；血管新生の誘導（ＨＵＶＥＣ中で）；細胞の増大した遊走および移動；増大した細胞生存率および生存；ならびに細胞分化の誘導に関して、シュワン細胞、ニューロンおよびヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中で一定の役割を有することを示す。
ＨＵＶＥＣ細胞モデルからの結果は、実施形態のデキストラン硫酸は、細胞損傷に対し保護でき、脳卒中またはその他の虚血状態後などの損傷または患部組織中で新規血管の発生を促進することを示す。
重要な分子経路の分析は、デキストラン硫酸が、ミトコンドリアに対する酸化ストレス効果を低減し、シュワン細胞中の有害なグルタミン酸の取り込みを増大させたことを示した。その結果、遺伝子発現データにより、ＴＢＩの動物モデル中で認められた結果が確証された。特に興味深いのは、実施形態のデキストラン硫酸は、複合体ＩＩＩを阻害したという知見であった。複合体ＩＩＩの阻害は、次にミトコンドリアの酸化ストレスの低減に繋がる。さらに、実施形態のデキストラン硫酸はまた、カルモデュリン（ＣＡＬＭ）（多官能性中間体カルシウム結合メッセンジャータンパク質）；Ｇベータ−ガンマ複合体（Ｇβγ）（１つのＧβと１つのＧγサブユニットからなる、堅く結合したダイマーＧタンパク質複合体）；代謝型グルタミン酸受容体７（ＧＲＭ７）；およびＣキナーゼ１と相互作用するタンパク質（ＰＩＣＫ１）のタンパク質複合体の発現を誘導した。図１９に模式的に示すように、このタンパク質複合体は、次に、シナプス前ニューロンからのグルタミン酸放出を抑制する。
シュワン細胞での結果は、実施形態のデキストラン硫酸が、疾患および損傷神経系中の酸化ストレスおよび／またはグルタミン酸興奮毒性により発生する細胞消失に対して保護できることを示し、これは、例えば、神経変性疾患およびＴＢＩに該当する。
ニューロンからの結果は、実施形態のデキストラン硫酸が、アポトーシスの防止および抑制、アミロイドβおよびレビー小体病態ならびにミトコンドリアのフラグメント化および機能障害に対するその負の効果、およびその後の損傷の防止、ならびに阻害性脂肪酸酸化の抑制を行うことができることを示す。実施形態のデキストラン硫酸はまた、ミトコンドリア機能を改善し、Ｈ２Ｏ２および活性酸素種のミトコンドリアレベルを低減した。
デキストラン硫酸により調節された遺伝子の上流制御因子の分析は、実施形態のデキストラン硫酸が細胞上の既存の成長因子の効果を高めたことを示した。表１２〜１４に示すように、実施形態のデキストラン硫酸は、いくつかの成長因子の効果を、それらの活性化を高めることにより、またはそれらの阻害を減らすことにより、調節できた。これは、実施形態のデキストラン硫酸が、これらの成長因子の活性の増大または阻害の低減が患者に有益であり得る疾患、障害および状態に使用できる可能性があることを意味する。このような疾患、障害および状態の非限定的例には、ＡＬＳ；脳卒中；ＳＣＩ；うつおよび気分障害および双極性疾患などのその他の精神障害；および代謝障害が挙げられる。
仮説としてはは、デキストラン硫酸が成長因子分子に結合し、それらの受容体への結合を促進するということである。この仮説はまた、ＨＵＶＥＣ中のデキストラン硫酸誘導差次的遺伝子発現（正常対照培地は既にヘパリンを含む）は、シュワン細胞中（正常対照培地はヘパリンを含まない）より相対的に少なかったという観察により裏付けられる。この作用機序はまた、成長因子が存在する場合には、ＴＢＩの急性段階でデキストラン硫酸が主として効果的であるが、初期の修復の試みが既に縮小されている場合に、もっと後の段階では効果が少ないのはなぜかを説明する。
従って、実施形態のデキストラン硫酸の少なくとも一部の治療効果は、デキストラン硫酸により増幅される既存の修復機序に依存する可能性がある。このような場合では、組織に十分な修復潜在能力がある場合、いずれの神経変性疾患、障害または状態においても、デキストラン硫酸は、疾患、障害または状態の初期段階で投与されることが一般に推奨される。
細胞代謝を保護することにより、実施形態のデキストラン硫酸は、虚血性、酸化性または外傷性損傷により細胞が進行的に失われる多くの変性状態の有用な保護治療薬であり得る。このような変性状態の非限定的例には、脳卒中、ＡＬＳ、ＭＳ、認知症、ＴＢＩ、ＳＣＩ、網膜損傷、ＡＤ、などが例示される。実施形態のデキストラン硫酸は、残っている内因性修復機序を高めながら、損傷組織を支援して、一部の失われた機能を回復し得る。
従って、遺伝子発現データにより、デキストラン硫酸がニューロン生存、分化および最終的に修復を促進し得る場合、神経変性疾患、障害および状態のために、血行再建の促進、二次的組織損傷の低減、および修復促進による、損傷された状態のＣＮＳおよびＰＮＳにおける実施形態のデキストラン硫酸の潜在的治療有用性が確証される。
実施形態のデキストラン硫酸のさらなる興味深い効果は、細胞接着に影響を与えるということである。細胞接着は、ニューロンおよびシュワン細胞において主に影響を受け、実施形態のデキストラン硫酸が細胞剥離および移動を促進した。細胞接着に対する効果は、主として、メタロプロテイナーゼ型酵素の発現による。この知見は、実施形態のデキストラン硫酸の抗瘢痕形成効果も説明する。この結果は、組織リモデリングを支援し、損傷組織中の線維形成性（瘢痕形成）シグナルを遮断する分解酵素を活性化することにより、抗瘢痕形成効果が、実施形態のデキストラン硫酸により媒介されることを示唆する。
実施形態のデキストラン硫酸により活性化されるメタロプロテイナーゼ型酵素が瘢痕を形成する線維状分子を分解することにより具体的に作用する。表１０〜１１を参照されたい。これらの酵素は、損傷組織中に遊走する細胞により放出される。したがって、実施形態のデキストラン硫酸は、これらの細胞をより移動性にして、それらの細胞の接着性を低減することにより、より良好な修復のために、それらの細胞より良好に遊走させて、瘢痕分解酵素を放出させ、組織を再構築させる。
従って、実施形態のデキストラン硫酸の抗瘢痕形成作用は、線維増殖性（瘢痕形成）状態の治療への使用可能性を示す。これらには、例えば、緑内障、増殖性硝子体網膜症、脳脊髄外傷性傷害、脳のくも膜下出血、侵襲的外科手術、術後癒着、腱板損傷、火傷、再建手術、潰瘍状態（糖尿病）などが含まれる。その他の線維性疾患および状態には、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、進行性塊状線維症および癌治療後の放射線誘発肺損傷などの肺の線維症；肝硬変および胆道閉鎖症などの肝臓の線維症；心房線維症、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞などの心臓の線維症；グリア性瘢痕などの脳の線維症；膵炎；関節線維症；クローン病；デュピュイトラン拘縮；ケロイド；縦隔線維症；骨髄線維症；ペロニー病；腎性全身性線維症；後腹膜線維症；強皮症または全身性硬化症が挙げられる。
線維症はまた、腎臓、肺、肝臓、心臓、などの臓器移植に関連して、およびランゲルハンス島、肝細胞、インスリン産生細胞、幹細胞、前駆細胞などの細胞療法および細胞移植に関連して発生し得る。
興味深いことに、遺伝子発現データはまた、実施形態のデキストラン硫酸は、デコリンと呼ばれる天然の瘢痕低減分子の産生を活性化し、これは、線維芽細胞による瘢痕形成を刺激する成長因子を「後片付けする」により瘢痕作製をさらに阻止することを示す。
デコリンは、９０〜１４０ｋＤの平均分子量の糖タンパク質である。これは、小さいロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーに属し、コンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸からなるグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有するロイシン反復を含むタンパク質コアからなる。これは、デコリンＩ型コラーゲン結合領域を介して、Ｉ型コラーゲンフィブリルに結合する。
デコリンは、形質転換増殖因子ベータ１または２（ＴＧＦβ１／２）アンタゴニストとして作用し、瘢痕形成を低減する。報告は、急性瘢痕形成では、デコリンの主要な効果は、ＴＧＦβ１／２の中和による炎症性線維症の抑制を介した抗線維形成性であることを示している。デコリンはまた、コラーゲンに直接結合し、その機能の１つは、創傷治癒中にコラーゲンの組織化に対し影響を与えることである。
デコリンは、脳病変、水頭症、および慢性脊髄創傷のモデルで瘢痕形成の抑制に関して記載された。デコリンはまた、緑内障モデルの既存の線維柱帯網瘢痕の線維分解を誘導する。
まとめると、実施形態のデキストラン硫酸の抗瘢痕形成作用は、瘢痕形成が問題となっている全ての臨床状態の治療への使用可能性を示す。デキストラン硫酸は、新旧の瘢痕に有効に機能するはずである。これは、実施形態のデキストラン硫酸が、緑内障の眼中の線維柱帯網中の既発生瘢痕要素の分解を誘導できたことを示す実験データで確認される。デキストラン硫酸が線維症および有害な瘢痕形成を阻害または少なくとも抑制するのに使用できるのみではなく、既に確定した瘢痕も分解できるので、これは、実施形態のデキストラン硫酸の重要な利点である。これは、実施形態のデキストラン硫酸が、より良好な修復を行うために、瘢痕分解および組織リモデリングを可能とすることを意味する。
デキストラン硫酸は、複合組織ならびに疾患生物学および一般組織生物学をモデル化するヒト一次細胞ベースアッセイのパネルで評価された。アッセイからの結果は、炎症および創傷治癒生物学において、デキストラン硫酸が免疫活性化および／または免疫消散応答の調節に関与することを示す。
炎症性のマーカーの調節は、ＡＬＳなどの炎症性の成分を含む複数の慢性および急性炎症状態および疾患の治療におけるデキストラン硫酸の有用性を示す。
損傷後の最初に、自然／炎症促進性応答および後天性免疫応答免疫応答の選択成分が上昇制御され、外来性病原体に対し防御を維持し、損傷部位に存在する組織残屑を除去し、創傷応答に関連する組織リモデリング、細胞増殖および血管新生過程を組織化する。しかし、適切な創傷治癒を進行させるためには、この最初の炎症反応は、マトリックスの再建、再細胞化および組織リモデリングを可能とするように、調節または停止される必要がある。このような免疫消散活性は、デキストラン硫酸により誘導され、ＭＭＰ−１、ＰＡＲ−１およびｕＰＡＲの活性化を含み、こうしなければ有害な線維症形成を生じたはずの神経外傷を含む外傷により損傷を受けた組織の治療に有用性を有する誘導免疫消散を示す。
実験データに示すデキストラン硫酸の炎症消散における効果は、デキストラン硫酸が自己免疫疾患、特に、中枢および／または末梢神経系に影響を与える自己免疫疾患の予防、治療または少なくとも抑制に有用であり得ることを示す。デキストラン硫酸による炎症消散は、線維形成を阻止する観点からも重要である。さらに、実験データから認められる炎症の消散およびミクログリア応答の抑制は、神経変性疾患、障害および状態においても重要である。
したがって、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体は、神経炎症および神経炎症状態の予防、治療または少なくとも抑制に有用であろう。このような神経炎症状態の例には、ＰＤ、ＡＬＳ、ＭＳ、ＡＤＥＭ、脊髄炎およびＧＤＳが挙げられる。
結論として、デキストラン硫酸は、外傷または疾患後の組織中に存在する炎症を正常化および消散させるように見え、それにより、これらの結果は、遺伝子アレイおよび動物研究で認められたデキストラン硫酸の効果と一致する。
一般に、神経系の機能は、神経細胞の数、神経細胞の健全なエネルギー代謝および神経細胞間の健全な結合に依存する。神経変性疾患および障害、ならびに神経変性を生ずる損傷は通常、異なる誘因および原因を有するが、全ては、同じ最終結果、すなわち、神経変性に繋がる。このような疾患、障害または損傷の機能的効果は、多くの場合、比較的大きな数の神経細胞が死んだ後にのみ認められるが、一方、疾患または障害の誘因は、症状が発生する数年前に存在し得る。
したがって、神経変性を治療または抑制するための新規手法が必要である。このような手法は、神経細胞の健全なエネルギー代謝および神経細胞間の健全な結合を含む神経系の実行可能な機能を強化することを含むべきである。また、ニューロン死に繋がる誘因を低減することにより、および誘因が存在する場合でも、さらなる病状を予防することにより、さらなる神経変性は防止または少なくとも減速されるべきである。加えて、神経系の再生能は強化されるべきである。
従って、神経変性および損傷の間、全てがニューロンの欠損の一因となるニューロンアポトーシスの複数の誘因が存在する。これらの誘因には、グルタミン酸興奮毒性に繋がる神経伝達物質の調節不全およびミトコンドリア機能障害に繋がる酸化ストレスが含まれ、それにより、ニューロンへのエネルギー供給が制限される。また、調節不全神経フィラメントは、運動性の低減およびニューロン生存に必要な因子の供給の制限に繋がる。さらなる誘因には、二次的細胞損傷および瘢痕形成を引き起こす炎症メディエータの放出が含まれる。さらに、血管障害は、神経変性の状態に一般的に見られる。
グルタミン酸はニューロン中で産生され、ニューロンにおける学習と記憶を支えるシグナル伝達機序に重要である。健全な脳組織中で放出された過剰グルタミン酸は、グリア細胞により除去され、毒性レベルになるのを防ぐ。デキストラン硫酸は、グリア細胞によるグルタミン酸取り込みの増大を誘導し、一方、ニューロン中でのグルタミン酸産生は、デキストラン硫酸により変化しなかった。従って、学習および記憶に必要なグルタミン酸は、デキストラン硫酸投与により影響を受けないが、一方、グルタミン酸の有害な毒性量は、グリア細胞により除去される。したがって、デキストラン硫酸は、グルタミン酸興奮毒性に繋がる神経伝達物質の調節不全を弱める。
神経変性の酸化ストレスは、ミトコンドリア機能障害に繋がり、それにより、ニューロンへのエネルギー供給が制限される。デキストラン硫酸は、アミロイドβおよびレビー小体を含む、酸化ストレスを誘導する分子の産生を低減し、酸化ストレスを少なくした。従って、デキストラン硫酸は、酸化ストレスにより誘導されたニューロン死を防止し、ニューロン中のミトコンドリア機能障害を防ぐ。これは、酸化ストレスの存在下で、デキストラン硫酸がミトコンドリア機能の正常化を促進し、このような酸化ストレスの存在下でのニューロンのエネルギー危機を防止することを意味する。したがって、デキストラン硫酸は、これをしなければミトコンドリア機能障害をもたらしたはずの神経変性の酸化ストレスを弱める。
神経変性におけるさらなる誘因は、調節不全神経フィラメントであり、これは、運動性の低減および生存因子の供給の制限に繋がる。デキストラン硫酸は、ニューロン中に存在する成長因子の効果を強化し、神経細胞の遊走および移動を増大させ、変性関連タンパク質生成物の産生を低減し、細胞分化を誘導する。したがって、デキストラン硫酸は、調節不全神経フィラメントを少なくする。
神経変性はまた、二次的細胞損傷および瘢痕形成を引き起こす炎症メディエータの放出を誘導する。このような瘢痕形成は、炎症性サイトカイン、特にＴＧＦ−βにより促進される。デキストラン硫酸は、メタロペプチダーゼ発現を誘導し、天然の抗瘢痕形成分子デコリンの発現を誘導し、ＴＧＦ−β活性を抑制する。さらに、デキストラン硫酸は、過剰のＴＧＦ−βの存在下であっても、免疫細胞接着、細胞凝集、細胞活性化および線維症を抑制する。したがって、デキストラン硫酸は、炎症メディエータ放出に起因する瘢痕形成を含む負の効果を小さくする。デキストラン硫酸はまた、線維形成を抑制ならびに線維分解を活性化するように作用し、これらを合わせて、瘢痕の減少化あるいは瘢痕の分解においてデキストラン硫酸により認められる有益な効果をもたらす。
デキストラン硫酸は、内皮細胞のアポトーシス、誘導血管新生および増大した遊走および移動に対しＨＵＶＥＣを保護する。したがって、デキストラン硫酸は、神経変性疾患、障害または損傷により引き起こされた低酸素組織中の生理学的修復応答を強化するが、健常な血管系には影響を与えない。
したがって、実施形態の態様は、グリア細胞およびニューロンからなる群から選択された細胞の分化を誘導する方法に関する。方法は、細胞をデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容可能な誘導体と接触させて、細胞の分化を誘導することを含む。
ある実施形態では、方法はインビトロによる方法である。このような場合、細胞への接触は、細胞をインビトロでデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体と接触させることを含む。従って、細胞は、インビトロでデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体で処理され、それと相互作用する。
ある実施形態では、ニューロンは幹細胞から、すなわち、幹細胞のニューロンへの分化により得られ、このニューロンはデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体により処理され、さらに分化され得る。
このようなインビトロによる方法は、研究および診断において重要な用途があり得、この分野では、ニューロンおよび／またはグリア細胞はインビトロで培養される。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、このようなニューロンまたはグリア細胞培養物に、例えば、本明細書に記載のように、細胞の分化を誘導するために培地に添加され得る。
方法はまた、エクスビボによる方法であり得、この場合、ニューロンおよび／またはグリア細胞は対象から抽出され、対象の身体外で、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体と接触させることになる。
上記のインビトロまたはエクスビボによる方法で、分化を誘導するために、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体で処理したニューロンおよび／またはグリア細胞を対象に移植し得る。分化したニューロンおよび／またはグリア細胞は、その後、対象の身体中でそれらの目的の機能を発揮するはずである。この手法では、さらに本明細書で記載のように、対象は神経疾患を罹患していてよい。
代替的実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、神経疾患、障害または状態を罹患している対象などの対象に投与される。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体はその後、対象の身体内のニューロンおよび／またはグリア細胞と接触して細胞分化を誘導する。この実施形態では、方法はインビボによる方法である。
実施形態の別の態様は、グリア細胞およびニューロンからなる群から選択された細胞の分化の誘導における使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体に関する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、神経疾患、障害または状態を罹患している対象における細胞の分化の誘導に使用するためのものである。
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、神経変性疾患、障害または状態；脱髄性疾患、障害または状態；神経虚血性疾患、障害または状態；神経筋疾患、障害または状態；外傷性神経損傷および術後神経学的状態からなる群から選択される神経疾患、障害または状態を罹患している対象における細胞の分化の誘導に使用するためのものである。
ある実施形態では、対象は、ＡＤ、ＰＤ、ＨＤおよびＡＬＳからなる群から選択される神経変性疾患、障害または状態を罹患しているヒト対象である。
ある実施形態では、対象は、ＭＳ、ＡＤＥＭ、ＣＮＳ神経障害、ＣＰＭ、脊髄症、白質脳症、白質ジストロフィー、ＧＢＳ、末梢神経障害およびシャルコー・マリー・トゥース病からなる群から選択され、好ましくは、ＭＳ、ＡＤＥＭ、ＣＰＭおよびＧＢＳからなる群から選択される脱髄性疾患、障害または状態を罹患しているヒト対象である。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は同様に、または、代わりに、他のタイプの神経疾患、障害、または状態における細胞の分化の誘導に使用され得る。このような他のタイプの神経疾患、障害、または状態の非限定的例には、脳卒中、脳虚血性状態および重症虚血肢（ＣＬＩ）などの神経虚血性疾患；ＡＬＳ、ボツリヌス症、先天性筋無力症候群、先天性ミオパチー、有痛性攣縮・線維束性収縮症候群、脳性麻痺、クレアチンキナーゼ上昇、線維束形成、封入体筋炎、ランバート・イートン症候群、ミトコンドリア筋症、運動ニューロン疾患、筋障害、筋ジストロフィー、重症筋無力症、筋強直性ジストロフィー、神経筋接合部障害、神経性筋強直症、末梢神経障害および多発性筋炎などの神経筋障害；外傷性神経損傷および術後神経学的状態が含まれる。
実施形態のさらなる態様は、対象のグルタミン酸興奮毒性の治療、抑制または予防における使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体に関する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、対象のニューロン中のグルタミン酸興奮毒性の治療、抑制または予防に効果的である。
特定の実施形態では、対象は、以前記載したように、ニューロンに対し細胞損傷および／または細胞死を引き起こす神経疾患、障害または状態を罹患している。
この態様はまた、グルタミン酸興奮毒性を治療、抑制または予防する方法にも関する。方法は、グルタミン酸興奮毒性を治療、抑制または予防するために、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体を対象に投与することを含む。
実施形態の他の態様は、神経疾患、障害または状態により誘導された酸化ストレスからニューロンの保護に使用するための、神経疾患、障害または状態により誘導されたニューロンの代謝恒常性の有害な変化の回復に使用するための、神経疾患、障害または状態に罹患している対象のニューロンのミトコンドリアの機能およびミトコンドリアのエネルギー代謝の保護に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体に関する。
それにより、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体を使用して、本明細書に記載の神経疾患、障害または状態を治療、抑制または予防できる。
また、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体を使用して、脳卒中、ＡＬＳ、ＭＮＤ、ＭＳ、認知症、ＴＢＩ、ＳＣＩ、網膜損傷などのニューロンおよびＣＮＳ、またはＰＮＳに対する虚血性、酸化性または外傷性損傷を治療、抑制または予防できる。
さらなる態様は、対象の線維症の治療、抑制または予防に使用するための、および特に、線維症または線維性疾患、障害または状態に罹患している対象の確定した瘢痕を分解することによるなどの、治療または抑制に使用するための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体に関する。
従って、抗瘢痕形成効果を有する実施形態のデキストラン硫酸は、創傷治療および組織リモデリングに効果的であり得、その場合、適切な創傷治癒を可能とするために、既に確定された瘢痕を分解する必要がある。実施形態のデキストラン硫酸のこの抗瘢痕形成効果は、例えば、デコリンの誘導を介した、細胞接着の抑制、細胞動員の誘導、メタロプロテアーゼおよび瘢痕分解酵素の誘導、およびＴＧＦβ、特にＴＧＦβ１の阻害を含む、以前に記載されたデキストラン硫酸の作用機序の結果であると考えられる。実施形態のデキストラン硫酸で得られたこの後者の効果は、さらに、デコリンの誘導を介した線維症および瘢痕形成の予防または少なくとも抑制に関連する。
別の態様は、対象の、特に、神経炎症を引き起こす神経疾患、障害または状態に罹患している対象の神経炎症の治療、抑制または予防に使用するための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体に関する。
実施形態の関連態様は、本明細書で開示の種々の医療用途、例えば、本明細書で開示のいずれかの疾患、障害、または状態の治療、抑制または予防用の薬物の製造のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体の使用を規定する。
さらなる態様は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体の様々な使用のための上記種々の疾患、障害または状態を治療、抑制または予防する方法に関する。このような方法では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体を対象に投与して、本明細書で開示の疾患、障害または状態が治療、抑制または予防される。
以下では、言及されるデキストラン硫酸の（平均）分子量および硫黄含量は、任意のデキストラン硫酸の薬学的に許容可能な誘導体にも当てはまる。従って、デキストラン硫酸の薬学的に許容可能な誘導体は、好ましくは、以下の実施形態で考察の平均分子量および硫黄含量を有する。
実施形態の好ましい範囲外のデキストラン硫酸は、細胞または対象に対する低い効果および／または負の副作用を有すると考えられている。
例えば、１０，０００Ｄａ（１０ｋＤａ）を超える分子量のデキストラン硫酸は通常、より低い分子量のデキストラン硫酸に比べて、より低い効果対副作用プロファイルを有する。これは、安全に対象に投与できるデキストラン硫酸の最大投与量が、より大きなデキストラン硫酸分子（＞１０，０００Ｄａ）では、好ましい範囲内の平均分子量を有するデキストラン硫酸分子に比べて、より少ないことを意味する。結果として、デキストラン硫酸が対象にインビボで投与される予定の場合、このようなより大きなデキストラン硫酸分子は、臨床使用では、適切性がより劣る。
デキストラン硫酸は、硫酸化ポリサッカライド、特に硫酸化グルカン、すなわち、多くのグルコース分子から作製されたポリサッカライドである。本明細書で定義の平均（ａｖｅｒａｇｅ）分子量は、個々の硫酸化ポリサッカライドが、この平均分子量（ａｖｅｒａｇｅ）とは異なる分子量を有し得るが、平均（ａｖｅｒａｇｅ）分子量は、硫酸化ポリサッカライドの平均（ｍｅａｎ）分子量を表すことを示す。これは、この平均分子量の近傍にデキストラン硫酸試料の分子量の天然分布が存在すると思われることをさらに意味する。
デキストラン硫酸の平均分子量、またはより正確には、重量平均分子量（Ｍｗ）は通常、ゲル排除／浸透クロマトグラフィー、光散乱または粘度などの間接的な方法を用いて決定される。このような間接的方法を用いた平均分子量の決定は、カラムおよび溶出液、流量、較正手順、などの選択を含む多くの因子に依存する。
重量平均分子量（Ｍｗ）：
Figure 2020533281
 、例えば、光散乱およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法などの数値法ではなく、分子サイズに敏感な方法として典型的な方法である。正規分布が仮定される場合、Ｍｗの両側で同じ重量、すなわち、Ｍｗ未満の分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の総重量が、Ｍｗを超える分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の総重量に等しい。パラメーターＮｉは、試料またはバッチ中のＭｉの分子量を有するデキストラン硫酸分子の数を示す。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１０，０００Ｄａ以下のＭｗを有する。特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、２，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲内のＭｗを有する。
別の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、２，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲内、好ましくは３，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲内のＭｗを有する。特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、３，５００Ｄａ〜９，５００Ｄａの範囲内、例えば、３，５００Ｄａ〜８，０００Ｄａの範囲内のＭｗを有する。
別の特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、４，５００Ｄａ〜７，５００Ｄａの範囲内、例えば、４，５００Ｄａ〜５，５００Ｄａの範囲内のＭｗを有する。
従って、いくつかの実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１０，０００Ｄａ以下、９，５００Ｄａ以下、９，０００Ｄａ以下、８，５００Ｄａ以下、８，０００Ｄａ以下、７，５００Ｄａ以下、７，０００Ｄａ以下、６，５００Ｄａ以下、６，０００Ｄａ以下、または５，５００Ｄａ以下のＭｗを有する。
いくつかの実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１，０００Ｄａ以上、１，５００Ｄａ以上、２，０００Ｄａ以上、２，５００Ｄａ以上、３，０００Ｄａ以上、３，５００Ｄａ以上、４，０００Ｄａ以上、または４，５００Ｄａ以上のＭｗを有する。これらの実施形態のいずれかは、いずれかの上記で提示のＭｗの上限値を規定する実施形態と組み合わせ得、これらは、１０，０００Ｄａ以下の上限値と組み合わせ得る。
特定の実施形態では、上記で提示のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体のＭｗは、平均Ｍｗであり、好ましくは、ゲル排除／浸透クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、光散乱または粘度ベース法により決定される。
数平均分子量（Ｍｎ）：
Figure 2020533281
 、通常、末端基アッセイ、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法またはクロマトグラフィーにより得られる。正規分布が仮定される場合、同じ数のデキストラン硫酸分子をＭｎの両側に認めることができ、すなわち、Ｍｎ未満の分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の数が、Ｍｎを超える分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の数に等しい。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１，８５０〜３，５００Ｄａの範囲内のＮＭＲ分光法測定によるＭｎを有する。
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１，８５０Ｄａ〜２，５００Ｄａの範囲内、好ましくは１，８５０Ｄａ〜２，３００Ｄａの範囲内、例えば、１，８５０Ｄａ〜２，０００Ｄａの範囲内のＮＭＲ分光法測定によるＭｎを有する。
従って、いくつかの実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、３，５００Ｄａ以下、３，２５０Ｄａ以下、３，０００Ｄａ以下、２，７５０Ｄａ以下、２，５００Ｄａ以下、２，２５０Ｄａ以下、または２，０００Ｄａ以下のＭｎを有する。さらに、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１，８５０Ｄａ以上のＭｎを有する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、２．５〜３．０の範囲内のグルコース単位当たりの平均硫酸数を有する。
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、２．５〜２．８の範囲内、好ましくは２．６〜２．７の範囲内のグルコース単位当たりの平均硫酸数を有する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、４．０〜６．０の範囲内の平均グルコース単位数を有する。
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、４．５〜５．５の範囲、好ましくは５．０〜５．２の範囲内の平均グルコース単位数を有する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、１，８５０〜３，５００Ｄａの範囲内のＮＭＲ分光法測定によるＭｎ、２．５〜３．０の範囲内のグルコース単位当たりの平均硫酸数を有し、デキストラン硫酸のグルコース単位中のＣ２位置の平均硫酸化は少なくとも９０％である。
ある実施形態では、デキストラン硫酸は、約５．１の平均グルコース単位数、２．６〜２．７の範囲内のグルコース単位当たりの平均硫酸数および１，８５０Ｄａ〜２，０００Ｄａの範囲内のＭｎを有する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸の薬学的に許容可能な誘導体は、デキストラン硫酸のナトリウム塩である。特定の実施形態では、デキストラン硫酸のナトリウム塩は、約５．１の平均グルコース単位数、２．６〜２．７の範囲内のグルコース単位当たりの平均硫酸数および２，１００Ｄａ〜２，３００Ｄａの範囲内のＮａ＋対イオンを含むＭｎを有する。
ある実施形態では、デキストラン硫酸は、５．１の平均グルコース単位数、２．７のグルコース単位当たりの平均硫酸数、約１，９００〜１，９５０ＤａのＮＭＲ分光法測定によるＮａ＋不含平均Ｍｎおよび約２，２００〜２，２５０ＤａのＮＭＲ分光法測定によるＮａ＋含有平均Ｍｎを有する。
実施形態によるデキストラン硫酸は、デキストラン硫酸の薬学的に活性な誘導体などのデキストラン硫酸の薬学的に許容可能誘導体として提供できる。このような薬学的に許容可能な誘導体には、デキストラン硫酸の薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な溶媒和物、例えば、ナトリウムまたはカリウム塩が挙げられる。
対象は、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくは霊長類および特に、ヒト対象である。しかし、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、獣医学用途にも使用できる。動物対象の非限定的例には、霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、マウス、ラットが挙げられる。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、好ましくは、注射により、特に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射または腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、好ましくはｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射により対象に投与される。その他の使用できる非経口的投与経路には、筋肉内および関節腔内注射が挙げられる。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体の注射は、代わりに、または追加して、例えば、目的とする効果が生ずるべき対象の身体の組織または器官またはその他の部位に直接行われる。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、代わりに、または追加して、くも膜下腔内に投与され得る。例えば、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、好適な水性担体または溶液と共に、脊柱管中、またはくも膜下腔中に注射できる。さらなる投与経路は、眼内投与である。
実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、好ましくは、選択された溶媒または賦形剤を用いて水性注射溶液として製剤化される。溶媒は、水性溶媒、特に緩衝液が好都合である。このような緩衝液の非限定的例は、クエン酸一水和物（ＣＡＭ）緩衝液などのクエン酸緩衝液、またはリン酸緩衝液である。例えば、実施形態のデキストラン硫酸は、０．９％ＮａＣｌ生理食塩水などの生理食塩水中に溶解でき、その後、任意選択で、７５ｍＭのＣＡＭで緩衝化され、および水酸化ナトリウムを用いてｐＨが約５．９に調節される。また、非緩衝液が可能であり、これには、生理食塩水、すなわち、ＮａＣｌ（水溶液）などの水性注射溶液が含まれる。さらに、緩衝液が望ましい場合、ＣＡＭ以外の緩衝系も使用し得る。
実施形態は注射に限定されず、経口、経鼻的、口腔内、直腸内、経皮、経気管支、または局所を含む他の投与経路を代わりに使用できる。活性化合物のデキストラン硫酸はその後、特定の投与経路に基づいて選択される好適な賦形剤または担体を用いて製剤化される。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体の好適な投与量範囲は、インビトロとインビボなどの用途、対象の大きさと体重、対象が治療される状態、およびその他の考慮すべきことによって変化し得る。ヒト対象に対しては特に、可能な投与量範囲は、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であろう。
好ましい実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、０．０５〜５０ｍｇ／対象のｋｇ体重、好ましくは０．０５または０．１〜４０ｍｇ／対象のｋｇ体重、およびより好ましくは０．０５または０．１〜３０ｍｇ／対象のｋｇ体重、または０．１〜２５ｍｇ／対象のｋｇ体重、または０．１〜１５ｍｇ／対象のｋｇ体重、または０．１〜１０ｍｇ／対象のｋｇ体重の範囲の投与量で投与されるように製剤化される。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体の投与は、現在の疾患、障害または状態の治療または抑制に限定されず、代わりに、または追加して、予防のために使用可能である。換言すれば、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、神経傷害または損傷および／または線維症を生ずる可能性のある手術などの医療処置を受ける予定の対象に投与され得る。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体はまた、手術および／または線維症などの医療処置を受けようとしている対象の術後神経学的合併症および状態を予防、抑制または軽減するために使用され得る。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、単一ボーラス注入の形態などの単回で投与できる。このボーラス投与は、対象に極めて迅速に注入できるが、好都合にも、デキストラン硫酸溶液が５〜１０分間などの数分間にわたり患者に注入されるように、一定の期間にわたり注入される。
あるいは、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、治療期間中に複数回、すなわち、少なくとも２回投与できる。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、順次に、同時に、またはデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体および少なくとも１つの他の活性薬剤を含む組成物の形態で、他の活性薬剤と共に投与できる。少なくとも１つの活性薬剤は、上記疾患、障害、または状態のいずれかに有用な任意の薬剤から選択できる。少なくとも１つの活性薬剤はまた、限定されないが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を含む幹細胞などの細胞療法の細胞の形態であり得る。
例えば、パーキンソン病、ＭＳ、ＡＬＳ、およびアルツハイマー病におけるような、脳変性の動物モデルに対する幹細胞の効果について研究が行われている。さらに、ＴＢＩの症例での幹細胞の使用に関する臨床および動物試験が行われている。
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、実験データで示されるように、インビトロで細胞に対し有益な効果を有する。例えば、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、酸化ストレスから細胞を保護し、細胞の代謝恒常性を回復し、これは、細胞のエネルギー代謝に有益であり、細胞に対する分化因子として作用し得る。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体のこれらの有益な効果はまた、他のタイプの細胞療法にも使用され得、すなわち、必ずしも幹細胞療法に限定されない。このような他のタイプの細胞療法の非限定的例には、心筋細胞、肝臓細胞、結合組織細胞、視神経細胞、リンパ球、マクロファージ、グリア細胞、シュワン細胞、ニューロン、などが例示される。このような場合、細胞は、対象への投与の前にインビトロでデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体で処理され得る。代わりに、または追加して、細胞は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体と共に投与され得る。また、組織および器官のインビトロまたはエクスビボでのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体による治療は、実施形態のデキストラン硫酸の好ましい効果、例えば、酸化ストレスに対する保護および代謝恒常性の回復から利益を受けるために有用であり得る。さらに、細胞、組織および器官の治療は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体の移植後に、追加してまたは代わりに、可能になり得る。
ある実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体は、好都合にも、ＴＢＩなどの疾患、障害または状態を引き起こす損傷後の初期または急性状態で、または疾患、障害または状態の診断後の初期または急性状態で、対象に投与される。実施形態のデキストラン硫酸により認められるいくつかの有益な効果は、ＣＮＳおよびＰＮＳ中の内因性修復機序を高めるおよび増幅するその能力であるので、これは、特に好都合である。これは特に、神経疾患の治療または抑制に重要である。しかし、実施形態のデキストラン硫酸で認められた抗瘢痕形成効果は、デキストラン硫酸が既存の瘢痕組織および要素を分解するのにも効果があると思われることを示している。従って、線維症および線維性状態に対し、実施形態のデキストラン硫酸は後期または慢性状態の間にも治療効果があると思われる。
実施例
次の実施例では、低分子量デキストラン硫酸（ＬＭＷ−ＤＳ）と本明細書で表記されるデキストラン硫酸のナトリウム塩を用いた（Ｔｉｋｏｍｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ，ＷＯ ２０１６／０７６７８０）。
実施例１
調査の目的は、ＬＭＷ−ＤＳの細胞生存および分化タンパク質の発現に対する効果について、３種の細胞型：大脳皮質ニューロン、運動ニューロンおよびシュワン細胞を２種の濃度０．０１および０．１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳを用いて評価することであった。
材料および方法
細胞培養
全ての細胞をその細胞型に好適する専用培地中で培養した。プラスチック器物を特定の接着性因子で処理して、細胞の接着性を向上させた。
Figure 2020533281
ニューロンをウェル当たり４０，０００細胞として、およびシュワン細胞をウェル当たり３，０００細胞として培養した。細胞を２４時間後に処理した。ウェル当たりの細胞の数は、成長表現型、増殖能力、などに依存した。
組織培養皿のコーティング
９６ウェルプレートをウェル当たり１００μｌの５０μｇ／ｍｌのポリ−ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ）の溶液をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ）中に加え、暗所中、３７℃で一晩インキュベートすることによりコートした。プレートを細胞培養水（Ｆｉｓｈｅｒ）で洗浄し、暗所中３０分間風乾した。ウェル当たり７５μｌの培地中１５μｇ／ｍｌのラミニン溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えることによりプレートをコートし、暗所中、３７℃で１時間インキュベートした。培地は次のように各細胞型専用とした：皮質ニューロン（Ｌｏｎｚａ）用としてＰＮＧＭ（商標）（一次ニューロン基本培地、Ｌｏｎｚａ）、運動ニューロン（Ｌｏｎｚａ）用としてＮｅｕｒｏＢｌａｓｔ（Ｌｏｎｚａ）およびシュワン細胞（ＡＴＣＣ）用として高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）。ラミニンは、細胞播種の直前にプレートから除去された。
皮質ニューロン
ＰＮＧＭはＰＮＧＭ Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ（Ｌｏｎｚａ）をＰＮＢＭ培地に添加することにより作製し、３７℃に予熱した。細胞を３７℃の水浴中で２分以下の時間解凍し、１５ｍｌのチューブに静かに移した。５ｍｌの培地を静かに滴加した。細胞懸濁液をチューブを注意深く２回反転させることにより混合した。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ ＡＵＴＯ Ｔ４（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞を計数した。４０，０００細胞／ウェルを予めコートした９６ウェルプレートに播種した。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、８０μｌの培地を取り出し、８０μｌの新しい培地と置換し、薬物処理の前に細胞を２４時間沈降させた。
運動ニューロン
ＮｅｕｒｏＢｌａｓｔを３７℃に予熱した。細胞を３７℃の水浴中で２分以下の時間解凍し、１ｍｌの培地を静かに滴加した。細胞を再懸濁し、９ｍｌの培地を含む１５ｍｌのチューブに移した。細胞を２００相対遠心力（ＲＣＦ）で５分間遠心分離した。ペレットを５ｍｌの培地に再懸濁し、細胞をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒで計数した。４０，０００細胞／ウェルを予めコートした９６ウェルプレートに播種した。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。薬物処理の前に細胞を２４時間沈降させた。２４時間後、ＮｅｕｒｏＢｌａｓｔ培地をＭｏｔｏｒＢｌａｓｔ（Ｌｏｎｚｏ）で置換した。
シュワン細胞
１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）を高グルコースＤＭＥＭに加えることにより、シュワン細胞増殖培地を作製し、３７℃に予熱した。細胞を３７℃の水浴中で２分以下の時間解凍した。細胞を１０ｍｌの培地含有チューブに静かに移し、２００ＲＣＦで５分間遠心分離した。ペレットを５ｍｌの培地に再懸濁し、細胞をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒで計数した。３，０００細胞／ウェルを予めコートした９６ウェルプレートに播種した。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。薬物処理の前に細胞を２４時間沈降させた。
薬物処理およびプレート準備
ＬＭＷ−ＤＳを各細胞株に最適な培地中で調製し、それぞれのウェルに０．０１および０．１ｍｇ／ｍｌの投与量で加えた。細胞生存アッセイのために、２４および４８時間後に細胞を、８つの同一のウェル／投与量／時点で分析した。分化およびタンパク質発現アッセイに関し、４８時間後に同様に８重の測定値で分析した。
ＰＩおよび免疫染色 ＰＩヒストグラムシフトの調節なし
細胞をウェル中で固定した。ヨウ化プロピジウムを生存率アッセイに用いた。免疫組織化学的分析のために、ニューロンを、ニューロン特異的チューブリンであるβＩＩＩ−チューブリンで染色した。シュワン細胞のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を染色した。陰性対照としては、一次抗体ではなく、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ１００）を適用した。
Ａｃｕｍｅｎサイトメトリ
Ａｃｕｍｅｎサイトメーターは、事前の剥離なしで、付着細胞の直接サイトメトリ解析を可能とする。従って、細胞をインサイツ画像化して、ＤＮＡ含量（ＰＩ）に基づいて異なる期の細胞周期に分類するか、またはアポトーシス死または倍数体と見なした。細胞のタンパク質含量も直接測定でき、「総タンパク質含量」または「平均タンパク質含量」として表現できる。
統計
データは８重の測定値の平均値プラス標準偏差（ＳＤ）として表されている。群間の比較をスチューデントのｔ検定（両側、等分散；Ｅｘｅｌソフトウエア）を用いて実施した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意であると見なした（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
結果
マウス皮質ニューロン
図１のＤＮＡヒストグラムは、細胞のＰＩ取り込みが変化し、ヒストグラムが右側へシフトし、ＬＭＷ−ＤＳ処理が皮質ニューロンに対し効果を有することを示した。分裂を開始した細胞集団（Ｇ２／Ｍ期）を図に示している。
細胞数は、ＬＭＷ−ＤＳで処理後、有意に低減した。アポトーシス細胞の比率はわずかに増大したが、これは、細胞消失の全てに対する説明ではなく、細胞剥離による可能性がより高い。
ヒト運動ニューロン
運動ニューロンに対するデータは皮質ニューロンと類似であり、ＰＩ取り込みのシフト（図２）および非常に小さい細胞集団内の増殖の増大があった。
これらの培養物では同様に大きな細胞消失があった。これに対する説明は、皮質ニューロンの場合とおそらく同じである。
シュワン細胞
シュワン細胞は、ニューロンほどはＬＭＷ−ＤＳにより影響を受けたようには見えない。類似のＰＩシフトがあった（図３）。
細胞数および細胞剥離に対する効果は、ニューロンと比較して、シュワン細胞では、明らかでなかった。ニューロンと対照的に、アポトーシス細胞の比率は、ＬＭＷ−ＤＳでの処理時に低減した。
分化関連タンパク質発現
マウス皮質ニューロン中のチューブリン発現
細胞の形態は処理培養物中で変化し、細胞はより丸く、より大きくなった（図４）。
チューブリンは、細胞の細胞骨格中の重要な構成単位であるタンパク質のファミリーである。βＩＩＩ−チューブリンは、ニューロンによってのみ発現される。チューブリンの強度は、ＬＭＷ−ＤＳで処理した細胞中で有意に増大した（図５Ａ）。陽性細胞の分析は、これらの細胞が、対照培養物中の陽性細胞より大きいことを示した（図５Ｂ）。
ヒト運動ニューロン中のチューブリン発現
βＩＩＩ−チューブリンの発現は、ＬＭＷ−ＤＳによりで有意に増大した（図６Ａ）。細胞形態は、ＬＭＷ−ＤＳにより劇的に変化した。大部分の陽性細胞は、対照培養物より小さい（図６Ｂ）が、一部の細胞は、長大な神経突起有して、極めて大きくなった（図７）。
ヒトシュワン細胞中のＭＢＰ発現
ＭＢＰの発現は、シュワン細胞のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中で有意に増大した（図８Ａ）。細胞サイズの分析は、ＭＢＰ陽性細胞はＬＭＷ−ＤＳ処理後、対照と比較してより大きいことを示した（図８Ｂおよび９）。
結論
マウス皮質ニューロンおよびヒト運動ニューロン
細胞中のβＩＩＩ−チューブリンの増大した発現および形態学的な変化は、ＬＭＷ−ＤＳが分化因子として機能することを示した。運動ニューロンに対する効果は、特に顕著であった。
ＬＭＷ−ＤＳにより誘導された変化は、マウスおよびヒト細胞の両方で明らかであり、この効果が種とは無関係であることを示した。
ＬＭＷ−ＤＳ処理は、培養物中の明らかな細胞消失に繋がった。このＬＭＷ−ＤＳ処理の効果は、毒作用によるものではないと考えられた。これは、ＬＭＷ−ＤＳが神経細胞接着に影響を与えたことの方がより可能性が高い。例えば、アポトーシス死の比率の最大測定値（ＰＩシフトの調節後）が培養物中の細胞の消失をこれまで説明しなかったとしても、明らかな細胞消失がＰＩ調製物中よりも免疫染色された調製物（より多くの洗浄回数）中で遙かに大きかった。
ヒトシュワン細胞
細胞中のＭＢＰの増大した発現および形態学的な変化は、グリア細胞中でＬＭＷ−ＤＳが分化因子として機能することを示した。
分裂シュワン細胞では、ＬＭＷ−ＤＳ処理による細胞剥離の徴候は、神経細胞培養物の場合ほど劇的ではなかったが、それらを視認できた。
したがって、ＬＭＷ−ＤＳは、非常に短い時間（４８時間）内で、神経およびシュワン細胞の両方の分化を促進するように見えた。
外傷関連神経変性、ＡＤ、脳卒中後の認知症を含む、神経変性疾患は、ニューロンの細胞周期関連現象の再活性化に関連していることが広く受け入れられるようになっている。これに関して、分化誘発薬物が神経保護的であると提案されてきた。シュワン細胞の分化支援薬物はまた、脱髄に関連する疾患の治療のための良好な候補となるであろう。
実施例２
本試験は、マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおけるＬＭＷ−ＤＳのインビボ効果を調査するために実施された。
実験的アレルギー性脳脊髄炎と標記されることもあるＥＡＥは、ＣＮＳの炎症性脱髄性疾患であり、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に媒介される。マウスのＥＡＥモデルは、現在最も広く受け入れられているヒトのＭＳおよびＡＤＥＭの動物モデルである（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６０：１２−２１，２００６）。一般に、ＥＡＥは、マウスへの、ミエリンに対する免疫反応を誘発する、アジュバントで乳化されたミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）を含むペプチドおよびタンパク質の単回注射で誘導される。注射は、注射後約１週間で、高度に再現可能なＥＡＥの発症をもたらす。末梢神経麻痺を引き起こすＣＮＳの炎症性病変は、マウスのＥＡＥの特徴である。マウスにおける疾患進行は、よく認識され、評価された採点システムを用いて病徴の毎日の評価により追跡される（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：３３３−３４０，１９９８）。
材料と方法
・フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ）
・結核菌Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）
・ＭＯＧ３５−５５げっ歯類（ＭＤＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）
・百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・ダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）
・０．９％食塩水（９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ、オートクレーブ処理）（Ｓｃｈａｒｌａｕ）
・シクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）
・０．９％食塩水に溶解したＬＭＷ−ＤＳ
・肝細胞成長因子（ＨＧＦ）組み替えマウス（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・Ｉｓｏｂａ ｖｅｔ ３．５％（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）
・メチルブタン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｃ５７Ｂ１．６マウス（雌、８〜１０週齡）をＨａｒｌａｎ Ｅｕｒｏｐｅから入手した。マウスを従来の動物施設（Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｗｅｄｅｎ）に収容し、経木を含むポリスチレンケージ（タイプＩＩＬケージ、ケージ当たり最大７匹のマウス）中で、１２時間の明暗周期下、保持し、標準的げっ歯類固形飼料および水を自由に与えた。
疾患誘導および追加免疫
０日目に、マウス当たり１００μｌの体積中の１５０μｇのＭＯＧ３５−５５および３００μｇのＨ３７ＲＡを含む乳剤の側腹部への皮下注射によりＥＡＥを誘導した。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（６ｍｇ／ｍｌの濃度のＩＦＡ中のＨ３７ＲＡ）およびＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解）を氷上で混合することにより、乳剤を調製した。マウスを免疫化中に麻酔して、注射の正確な位置を確認した。百日咳毒素（ＰＴＸ）をｍｑＨ２Ｏ中に５０μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。マウスは、０日目および２日目に２００ｎｇのＰＴＸの腹腔内ブースター注射を受けた。
投与調製物
群３に対し、ＬＭＷ−ＤＳ希釈物を０日目および１４日目に調製した。下表２に記載の投与量に従って、ＬＭＷ−ＤＳを０．９％食塩水中に希釈し、０．２μｍフィルターを通して濾過滅菌した。投与ビークルは、０．９％食塩水であった。組換えＨＧＦを１ｍｌのＰＢＳ中０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２５μｇ／ｍｌの濃度で再構成し、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌにさらに希釈した。シクロスポリンＡの５０ｍｇを１ｍｌの７０％エタノール中に溶解し、ＨＰＭＣ中で０．９８ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈することによりシクロスポリンＡを調製した。
Figure 2020533281
実験群およびＬＭＷ−ＤＳの投与
治療は、群２〜３に対しては０日目に開始し、群２では腹腔内に、群３では皮下に、毎週３回投与した。残りの群では、１８日目に治療を開始した。群４の動物は１日おきに合計３回静注投与された。治療群はケージ中で混合して、ケージ効果および不均等な収容による系統誤差を回避した。
疾患評価
疾患進行を実験を通して追跡した。実験の終わり、すなわち、疾患誘導の２８日後に血漿を収集した。
臨床疾患を毎日監視し、０〜８の尺度により疾患を等級分類する。
０＝健康
１＝尾部脱力
２＝尾部運動麻痺
３＝尾部運動麻痺および軽度のよたよた歩き
４＝尾部運動麻痺および重度のよたよた歩き
５＝尾部運動麻痺および四肢の１本の運動麻痺
６＝尾部運動麻痺および四肢の１対の運動麻痺
７＝四肢不全麻痺または四肢の３本の運動麻痺
８＝発病前または死亡
グラフおよび統計
Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、グラフおよび統計解析を実施した。全ての統計データを片側ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を用いて計算し、ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊、＃はｐ＜０．０５、＊＊、＃＃はｐ＜０．０１を表す。
結果および考察
図１０は、対照群（ビークルおよびシクロスポリンＡ）およびＬＭＷ−ＤＳ皮下注射週３回による治療群中のマウスのＥＡＥ発症を示す。シクロスポリンＡは、ビークル対照に比べて、１３、１４、１６、２０、２１日目、および２５〜２７日目に有意に（＊）低い平均スコアを有した。１０ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸の皮下注射週３回で治療された動物は、ビークル対照に比べて、１３、１４、１６、１７、１９、２１および２６日目に有意に（＃）低い平均スコアを有した
図１１は、ビークルおよび１００ｎｇ／用量 ＨＧＦの１日おき静注を１８日目（矢印参照）に開始して５日間治療したマウスを示す。ＨＧＦは、ビークルと比較して、何らの有意差も生じなかった。
従って、ＬＭＷ−ＤＳは、ＥＡＥモデルにおいて、ビークル対照と比較して、有意に低い平均スコアを生じた。したがって、結果は、ＬＭＷ−ＤＳがＣＮＳのＭＳおよびＡＤＥＭなどの神経変性および脱髄性疾患に好ましい効果を有することを示している。
実施例３
重度外傷性脳損傷（ｓＴＢＩ）後のラットにおける、グルタミン酸興奮毒性およびミトコンドリア機能に対するＬＭＷ−ＤＳの毎日の皮下注射の効果を、凍結脳試料の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により評価した。結果は、ＬＭＷ−ＤＳがミトコンドリアのエネルギー代謝を改善する機能を妨害し、また、グルタミン酸興奮毒性を低減することを示唆する。
材料および方法
ｓＴＢＩの誘導および薬物投与プロトコル
この調査に用いた実験プロトコルは、動物飼育のための国際標準およびガイドラインに従って、Ｃａｔｈｏｌｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｍｅの倫理委員会による承認を受けた。３００〜３５０ｇ体重（ｂ．ｗ．）の雄ウィスターラットに、制御された環境中で標準的実験食および水を自由に与えた。
ラットを、３つの群に分けた：
１）ｓＴＢＩを受けたｎ＝６匹の動物、３０分後、薬物投与を受け、ＴＢＩの２日後屠殺された（急性期１）。
２）重度ＴＢＩを受けたｎ＝６匹の動物、３０分後、薬物投与を受け、ＴＢＩの７日後屠殺された（急性期２）。
３）重度ＴＢＩを受けたｎ＝６匹の動物、ＴＢＩの３日後に薬物投与を受け、ＴＢＩの７日後屠殺された（慢性期）。
動物は、麻酔剤混合物として、３５ｍｇ／ｋｇ体重のケタミンおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ体重のミダゾラムを腹腔内注射により受けた。「重量落下」衝撃加速度モデル（Ｍａｒｍａｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９４；８０：２９１−３００）に従って、予め頭蓋骨上に固定された金属ディスクにより保護されているラットの頭の上に４５０ｇの重りを２ｍの高さから落とすことによりｓＴＢＩを誘導した。頭蓋骨骨折、発作、経鼻出血した、またはその衝撃に生存しなかったラットは、調査から除外された。各治療期間の終わりに、ラットは再度麻酔され、その後直ちに屠殺された。
薬物治療は、０．５ｍｌのＬＭＷ−ＤＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射により、上述の概略プロトコルに従って投与された。
脳組織処理
全ての動物でインビボ骨切除開頭術を麻酔の間に行い、ラットの頭蓋骨を注意深く取り除き、脳を露出させ、手術用スパチュラで取り除き、素早く液体窒素中に入れた。湿重量（ｗ．ｗ．）測定後、組織調製を以前に開示のように行った（Ｔａｖａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００５；５６：５８２−５８９；Ｖａｇｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎｓ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ−ｐａｒｔ Ｉ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００７；６１：３７９−３８８；Ｔａｖａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎｓ：ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓｅｓ−ｐａｒｔ ＩＩ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００７；６１：３９０−３９５；Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１７；２１：５３０−５４２）。手短に説明すると、全脳ホモジナイゼーションを７ｍｌの氷冷、窒素飽和した沈殿溶液（ＣＨ３ＣＮ＋１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４０（３：１；ｖ：ｖ）と共に、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘセット（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２４，０００ｒｐｍ／分を用いて実施した。２０，６９０ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離後、透明上清を保存し、ペレットに３ｍｌの沈殿溶液を補充し、上述のように再度ホモジナイズした。２回目の遠心分離を実施し（２０，６９０ｘｇ、４℃で１０分間）、ペレットを保存し、上清を前に得たものと合わせて、２倍の量のＨＰＬＣグレードＣＨＣｌ３と共に強く撹拌することにより抽出し、上記のように遠心分離した。水溶性低分子量化合物を含む上層の水相を収集し、さらに２回のクロロホルム洗浄に供し（この手順は、緩衝化組織抽出物から全ての有機溶媒および任意の脂質可溶性化合物の除去を可能とする）、体積を最終的に水性の１０％組織ホモジネートを得るように１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４０で調節し、アッセイするまで−８０℃で保存した。
プリン−ピリミジン代謝物のＨＰＬＣ分析
一定分量の各脱タンパク組織試料を０．４５μｍのＨＶ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通して濾過し、それ自体のガードカラムを備えたＨｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ−１８、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ粒径カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｄａｎｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）に充填し（２００μｌ）、高感度ダイオードアレイ検出器（５ｃｍ光路フローセルを備えた）を有し、２００〜３００ｎｍの波長で設定された、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｄａｎｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）からなるＨＰＬＣ装置に連結した。データ取得および分析は、ＨＰＬＣ製造業者から提供されたＣｈｒｏｍＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアパッケージを用いて、ＰＣで実施した。
プリン−ピリミジンプロファイル（下に記載）に属する代謝物、組織エネルギー状態、ミトコンドリア機能に関連する代謝物、および酸化−ニトロソ化ストレスに対する代謝物を、わずかに修正した既存のイオン対ＨＰＬＣ法に従って、１回のクロマトグラフィーを行って分離した（Ｌａｚｚａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｄｏｘ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｓｔａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３；３２２：５１−５９；Ｔａｖａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅｓ，ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ａｎｄ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５；３８：９９７−１００８）。組織抽出物のクロマトグラフ実験での目的の化合物の帰属および計算を、適切な波長（２０６、２３４および２６０ｎｍ）で、ピークの保持時間、吸収スペクトルおよび面積を、既知の濃度を有する新たに調製した超純度標準混合物のクロマトグラフィー実験のピークのものと比較することにより実施した。
化合物のリスト：シトシン、クレアチニン、ウラシル、ベータプソイドウリジン、シチジン、ヒポキサンチン、グアニン、キサンチン、シチジン二リン酸−コリン（ＣＤＰ−コリン）、アスコルビン酸、ウリジン、アデニン、亜硝酸塩（−ＮＯ２−）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、イノシン、尿酸、グアノシン、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、チミジン、オロチン酸、硝酸塩（−ＮＯ３−）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型（ＮＡＤ＋）、アデノシン（ＡＤＯ）、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）、ＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン二リン酸−グルコース（ＧＤＰ−グルコース）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ＵＤＰ、ＧＤＰ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型（ＮＡＤＰ＋）、アデノシン二リン酸−リボース（ＡＤＰ−リボース）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ＡＤＰ、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型（ＮＡＤＨ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型（ＮＡＤＰＨ）、マロニル−ＣｏＡ、コエンザイムＡ（ＣｏＡ−ＳＨ）、アセチル−ＣｏＡ、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）。
遊離アミノ酸およびアミノ基含有化合物のＨＰＬＣ分析
一級遊離アミノ酸（ＦＡＡ）およびアミノ基含有化合物（ＡＧＣＣ）（以下に記載）の同時測定を、試料のオルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）と３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）の混合物によるプレカラム誘導体化を用いて実施した。この方法は、別の文献に詳細に記載されている（Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１７；２１：５３０−５４２；Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ａｓ ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｅｔａｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２；３５９：２０５−２１６）。手短に説明すると、２５ｍｍｏｌ／ｌのＯＰＡ、１％のＭＰＡ、２３７．５ｍｍｏｌ／ｌのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．８から構成される誘導体化混合物を毎日調製し、オートサンプラーに導入した。試料（１５μｌ）のＯＰＡ−ＭＰＡを用いた自動化プレカラム誘導体化を、２４℃で実施し、その後のクロマトグラフ分離のために、２５μｌの誘導体化混合物をＨＰＬＣカラム（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ−１８、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ粒径、サーモスタットで２１℃に温調）に充填した。グルタミン酸の場合には、脱タンパク脳抽出物の誘導体化手順の前にＨＰＬＣグレードＨ２Ｏで２０倍に希釈し、続けて注入した。２種の移動相（移動相Ａ＝２４ｍｍｏｌ／ｌのＣＨ３ＣＯＯＮａ＋２４ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４＋１％のテトラヒドロフラン＋０．１％のトリフルオロ酢酸、ｐＨ６．５；移動相Ｂ＝４０％ＣＨ３ＯＨ＋３０％ＣＨ３ＣＮ＋３０％Ｈ２Ｏ）を用いて、１．２ｍｌ／分の流量で、適切な段階勾配を使って、ＯＰＡ−ＡＡおよびＯＰＡ−ＡＧＣＣの分離を実施した（Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１７；２１：５３０−５４２；Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ａｓ ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｅｔａｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２；３５９：２０５−２１６）。
全脳抽出物のクロマトグラフ実験でのＯＰＡ−ＡＡおよびＯＰＡ−ＡＧＣＣの帰属および計算を、３３８ｎｍの波長で、ピークの保持時間および面積を、既知の濃度を有する新たに調製した超純度標準混合物のクロマトグラフィー実験のピークのものと比較することにより実施した。
ＦＡＡおよびＡＣＧＣ化合物のリスト：アスパラギン酸（ＡＳＰ）、グルタミン酸（ＧＬＵ）、アスパラギン（ＡＳＮ）、セリン（ＳＥＲ）、グルタミン（ＧＬＮ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、グリシン（ＧＬＹ）、トレオニン（ＴＨＲ）、シトルリン（ＣＩＴＲ）、アルギニン（ＡＲＧ）、アラニン（ＡＬＡ）、タウリン（ＴＡＵ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン（ＴＹＲ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、Ｌ−シスタチオニン（Ｌ−Ｃｙｓｔａｔ）、バリン（ＶＡＬ）、メチオニン（ＭＥＴ）、トリプトファン（ＴＲＰ）、フェニルアラニン（ＰＨＥ）、イソロイシン（ＩＬＥ）、ロイシン（ＬＥＵ）、オルニチン（ＯＲＮ）、リシン（ＬＹＳ）。
統計分析
正規データ分布をコルモゴルフ・スミルノフ検定を使用して検定した。群をまたがる差異は、反復測定に対する２元配置分散分析により推定した。フィッシャーの制約付き最小二乗法を事後検定として使用した。０．０５未満の両側ｐ値のみを、統計的に有意であると見なした。
結果
２４種の標準的および非標準的アミノ酸および一級アミノ基含有化合物の脳値で、最も明らかな結果は、ＬＭＷ−ＤＳ治療が、ｓＴＢＩにより誘導されたグルタミン酸（ＧＬＵ）の増大の顕著な抑制を示し（図１２）、従って、この化合物の過剰の結果生じる興奮毒性の低減を確実にもたらすことであった。
しかし、この効果は、薬物が損傷後の早期に投与された場合にのみ認められ（ｓＴＢＩ後３０分）、ＬＭＷ−ＤＳがｓＴＢＩ３日後に注射された場合にはこの興奮毒性マーカーに対する有効性はなかった。また、ＬＭＷ−ＤＳは、いわゆるメチルサイクルに関与する化合物（Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓｔａｔ、ＳＡＨ、表３参照）に対しては著しく有益な効果を有したことは強調に値する。

Figure 2020533281
Figure 2020533281
ａｐ＜０．０１（対照と比較）、ｂｐ＜０．０５（対照と比較）、ｃｐ＜０．０１（ＴＢＩ ２日後と比較）、ｄｐ＜０．０５（ＴＢＩ ２日後と比較）、ｅｐ＜０．０１（ＴＢＩ ５日後と比較）、ｆｐ＜０．０５（ＴＢＩ ５日後と比較）、ｇｐ＜０．０１（急性期２と比較）、ｈｐ＜０．０５（急性期２と比較）、ｉｐ＜０．０１（慢性期と比較）、ｊｐ＜０．０５（慢性期と比較）
表３は、μｍｏｌ／ｇ（ｗ．ｗ．）単位で化合物を記載。
表４で認められるように、ＬＭＷ−ＤＳは、エネルギー代謝およびミトコンドリアの機能に関連して、種々の化合物によい方向に影響を与えた。特に興味深いのは、ミトコンドリアのリン酸化能力の測定値としてのアデニンヌクレオチドの濃度およびＡＴＰ／ＡＤＰ比である（図１３）。

Figure 2020533281
Figure 2020533281
Figure 2020533281
ａｐ＜０．０１（対照と比較）、ｂｐ＜０．０５（対照と比較）、ｃｐ＜０．０１（ＴＢＩ ２日後と比較）、ｄｐ＜０．０５（ＴＢＩ ２日後と比較）、ｅｐ＜０．０１（ＴＢＩ ５日後と比較）、ｆｐ＜０．０５（ＴＢＩ ５日後と比較）、ｇｐ＜０．０１（急性期２と比較）、ｈｐ＜０．０５（急性期２と比較）、ｉｐ＜０．０１（慢性期と比較）、ｊｐ＜０．０５（慢性期と比較）
表４は、ｎｍｏｌ／ｇ（ｗ．ｗ．）単位で化合物を記載。
酸化型および還元型ニコチンコエンザイムの顕著な変化も観察された（図１４）。
酸化ストレスに関連するパラメーターも測定し、ＬＭＷ−ＤＳの投与後に酸化ストレスの有意な低減が検出された。特に、主要な水溶性脳抗酸化剤としてのアスコルビン酸、および主要な細胞内ＳＨドナーとしてのＧＳＨが測定された。結果は、表４および図１５で示されるように、ＬＭＷ−ＤＳの投与後、それらのレベルの有意な改善を示した。
加えて、膜リン脂質の多価不飽和脂肪酸最終生成物としての、および、従って、ＲＯＳ媒介脂質過酸化のマーカーとして用いられるＭＤＡも測定された。ＭＤＡレベルは、ＬＭＷ−ＤＳの投与後、有意な低減を示した。ＬＭＷ−ＤＳで治療後に、上記酸化ストレスマーカーは全て、抗酸化状態の回復の改善を示した（図１５）。
ＮＯ媒介ニトロソ化ストレス（亜硝酸塩および硝酸塩）を表す指数も分析された。ＬＭＷ−ＤＳ投与は、急性および慢性期両方のｓＴＢＩにおける硝酸塩濃度を有意に低減した（図１６）。
ＮＡＡは、脳特異的代謝物であり、ＴＢＩ後の悪化または回復をモニターするための有用な生化学的マーカーである。ＮＡＡは、アスパラギン酸およびアセチル−ＣｏＡからアスパラギン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼによりニューロンで合成される。ＮＡＡ代謝回転を確保するために、この分子は、細胞内区画間を移動して、乏突起膠細胞に到達する必要が有り、そこで、それは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）により酢酸塩およびアスパラギン酸に分解される。基質アスパラギン酸の利用能を提供するために、異化酵素ＡＳＰＡおよびＮＡＡの上方制御は低下し、アセチル−ＣｏＡは、代謝障害の状態の指標である。この調査では、ｓＴＢＩ後、ＮＡＡおよびその基質が測定され、ＬＭＷ−ＤＳ投与後、レベルの有意な改善が示された（図１７）。
エネルギー代謝物に対するこれらの効果は、動物が損傷後初期（３０分）にＬＭＷ−ＤＳ投与を受けた場合に、特に明らかであった。動物がｓＴＢＩの２日後に屠殺されたか、またはｓＴＢＩの７日後に屠殺を行った場合に、ＬＭＷ−ＤＳの全体的に有益な効果が観察されたことに留意することは重要である。この動物群では、ＡＧＣＣおよびエネルギー代謝物に関連する代謝の全般的回復がより明らかであり、脳代謝に対するＬＭＷ−ＤＳ投与の持続する好ましい効果を示唆した。
考察
ＴＢＩは、寿命の最初の４０年での死亡および身体障害の主要な原因である。英国の経済単独に対するコストは、年当たり８０億ポンドであると推定されており、比較すると、脳卒中よりも経済に対するコストは大きい。米国では、ＴＢＩの保健医療および社会経済を合わせたコストは、軍用支出を除いて、年当たり６００億ドルを超えると推定されている。加えて、最近の数年は、大西洋の両側で、スポーツ脳振盪への関心が急激に高まっている。
明白な臨床的必要性にもかかわらず、現在、ＴＢＩのための承認された薬理学的治療は存在しない。ＴＢＩに関連する一次侵襲（挫傷）は、外科的処置を適用し得るが、その後の周囲脳組織（ペナンブラ）の二次的非機械的な損傷の低減は、より大きな治療機会を提供する可能性がある。
ＴＢＩのびまん性軸索損傷を特徴とする、重度外傷性脳損傷（ｓＴＢＩ）の十分に確立されたげっ歯類モデルを使って、重度損傷動物が、持続性の細胞エネルギー状態およびミトコンドリアの機能（Ｖａｇｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１９９９；１６：９０３−９１３；Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ−Ａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｉｎｊｕｒｙ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉｆｆｕｓｅ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２００１；１８：９７７−９９３；Ｔａｖａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００５；５６：５８２−５８９；Ｖａｇｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎｓ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ−ｐａｒｔ Ｉ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００７；６１：３７９−３８８；Ｔａｖａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎｓ：ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓｅｓ−ｐａｒｔ ＩＩ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００７；６１：３９０−３９５）ならびにアミノ酸代謝に関連する種々の代謝物の変化を有することが以前に示された（Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１７；２１：５３０−５４２）。ＴＢＩ誘導脳損傷を引き起こす複合体分子機序では、代謝変化は、病理学的組織応答を示す酵素活性ならびに遺伝子およびタンパク質発現の変化に影響を与える初期細胞シグナルである（Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｌｄ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３；３７５：１８５−１９８；Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒａｄｅｄ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１４；２０：１４７−１５７；Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｘｉｄａｎｔ／ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｂａｌａｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｇｒａｄｅｄ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１４；６９：２５８−２６４；Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｙｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｆｔｅｒ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｍｏｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓ．２０１６；１８６２：６７９−６８７）。これは、損傷組織中の細胞代謝をよい方向に調節するように機能する薬剤が、有害転帰の一因となる酵素活性ならびに遺伝子およびタンパク質発現におけるその後のＴＢＩ関連変化を低減させ得ることを意味する。
本明細書で提示のデータは、ＬＭＷ−ＤＳの初期投与が、グルタミン酸興奮毒性のレベルを低減し、ミトコンドリア機能を保護することにより代謝恒常性の有害変化を回復し、重度ＴＢＩ後の化合物の神経保護効果を示すことを示唆する。したがって、ＬＭＷ−ＤＳは、ｓＴＢＩを含む、ＴＢＩの治療または抑制に使用される可能性を有する。
実施例４
ＬＭＷ−ＤＳにより誘導された遺伝子発現の変化の分析をいくつかの細胞株で調査した。
材料および方法
実験計画
各細胞株に対し、ｎ＝８ｘ２５ｃｍ２の培養フラスコを準備した。処理の日（播種の２４時間後）に、２個のフラスコにそれぞれの細胞型を採取した。これは、０日目の時点を表す。残りのフラスコから、３個のフラスコを対照培地で処理し、３個をＬＭＷ−ＤＳ含有培地（ＣＭ）で処理し、０．０１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。４８時間後に、処理フラスコから細胞を収集した。従って、収集データは、（ａ）未処理細胞（０日目対照および２日目対照）および（ｂ）ＬＭＷ−ＤＳで４８時間処理した細胞（２日間ＬＭＷ−ＤＳ処理）を表す。
全ての細胞に対する組織培養皿のコーティング
２５ｃｍ２フラスコを、フラスコ当たり２ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の５０μｇ／ｍｌのポリ−ｄ−リシンの溶液を加え、暗所中、３７℃で一晩インキュベートすることによりコートした。フラスコを細胞培養水で洗浄し、暗所中３０分間風乾した。フラスコ当たり１ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２５μｇ／ｍｌのラミニンの溶液を加え、暗所中、３７℃で２時間インキュベートすることによりフラスコをコートした。細胞の播種前に、ラミニンフラスコをＰＢＳで３回洗浄した。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
培地２００＋Ｌａｒｇｅ Ｖｅｓｓｅｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｍ２００＋ＬＶＥＳ）添加物（１：５０）を調製し、３７℃に予熱した。細胞を３７℃の水浴中で２分以下の時間解凍し、２０ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地。栄養素混合物Ｆ１２（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）を含む５０ｍｌのチューブに静かに移した。細胞懸濁液をチューブを注意深く２回反転させることにより混合した。細胞を４００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１０ｍｌの培地（Ｍ２００＋ＬＶＥＳ添加物）に再懸濁させた。
細胞をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒで計数した。１，０００，０００細胞／フラスコを２５ｃｍ２のフラスコに播種し（ｎ＝８）、培地を加えて合計フラスコ当たり５ｍｌにした。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。ＬＭＷ−ＤＳ処理の前に、細胞を２４時間沈降させた。
ヒトシュワン細胞
１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を高グルコースＤＭＥＭに加えることにより、シュワン細胞増殖培地を調製し、３７℃に予熱した。細胞を３７℃の水浴中で２分以下の時間解凍した。
１２個のバイアルからの細胞を１０ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ培地含有チューブに静かに移し、４００相対遠心力場（ＲＣＦ）で１０分間遠心分離した。ペレットを培地中に再懸濁した。１２個のバイアルからの細胞を混合し、予めコートした２５ｃｍ２フラスコに均等に分配した（ｎ＝８）。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。ＬＭＷ−ＤＳ処理の前に、細胞を２４時間沈降させた。
マウス皮質ニューロン中（Ｌｏｎｚａ）
１０ｍｌのＢ−２７無血清補充剤および２．５ｍｌ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ補充剤を５００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に加えることにより培地を調製した。培地を３７℃に予熱した。１２個のバイアルからの細胞を３７℃の水浴中、２分以下の時間で順次解凍し、１５ｍｌのチューブに静かに移した。９ｍｌの培地をそれぞれに静かに滴加した。細胞懸濁液をチューブを注意深く２回反転させることにより混合した。
細胞を、２００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し（最後の０．５ｍｌまで）、細胞を摩砕により静かに再懸濁した。１２個のバイアルからの細胞を混合し、予めコートした２５ｃｍ２フラスコに均等に分配した（ｎ＝８）。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。
マウス運動ニューロン（Ａｒｕｎａ）
表５にしたがって培地を調製した。

Figure 2020533281
培地（表５参照）を３７℃に予熱した。細胞を３７℃の水浴中で２分以下の時間解凍した。９ｍｌの培地を静かに滴加した。細胞懸濁液をチューブを注意深く２回反転させることにより混合した。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを用いて細胞を計数した。細胞を、２００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し（最後の０．５ｍｌまで）、細胞を摩砕により静かに再懸濁した。８個のバイアルからの細胞を混合し、予めコートした２５ｃｍ２フラスコに均等に分配した（ｎ＝８）。処理前に、細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。
薬物処理
ＬＭＷ−ＤＳを２０ｍｇ／ｍｌのストック濃度で用意し、４℃の温度監視冷蔵庫で保持した。新しい１００Ｘ ＬＭＷ−ＤＳストック（１．０ｍｇ／ｍｌ）を無菌ＤＭＥＭ−Ｆ１２中で調製した。濃縮薬物ストックを濾過滅菌し、それぞれの培地（１９．６ｍｌのＣＭおよび０．４ｍｌのＬＭＷ−ＤＳストック溶液）に加えた。１９．６ｍｌのＣＭおよび０．４ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２を用いて対照を作製した。ＬＭＷ−ＤＳおよびＣＭをそれぞれのフラスコ（各５ｍｌ）に加え、それぞれ合計１０ｍｌのＣＭを含むディッシュ中で０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度のＬＭＷ−ＤＳになった。
培養物収集および細胞溶解
ＣＭを清浄な標識した１５ｍｌのファルコンチューブに吸引した。フラスコ（培地不含）を−８０℃の冷凍庫中に３０分間置いた。ファルコンチューブ中のＣＭを３０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、小さいペレットを室温（ＲＴ、約２２℃）で２．５ｍｌのトリゾール：水（４：１）溶液に再懸濁した。
凍結フラスコを冷凍庫から１つずつ取り出し、適切なチューブからトリゾール−水をフラスコへ移した。フラスコを室温に５分間放置した後、内容物を１５ｍｌのファルコンチューブに吸引して戻した（フラスコの底をその溶液で完全に洗浄後）。フラスコを顕微鏡で検査し、細胞の完全な除去を確実にした。１５ｍｌのファルコンチューブ中の収集した溶解物を−８０℃の冷凍庫に入れた。
ＲＮＡ抽出
ホモジネート含有ファルコンチューブを冷凍庫から取り出し、５分間室温で貯蔵し、核タンパク質複合体を完全に分解させた。
２つの１ｍｌの一定分量の溶解物を各試料から取り出し、２００μｌのクロロホルムをそれぞれに加え（１ｍｌのトリゾール試薬当たり０．２ｍｌのクロロホルムを細胞溶解ステップ中に使用した）、チューブを強く振盪させた。試料を室温で２〜３分貯蔵し、その後、４℃、１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。
混合物は３つの層：底部の赤色フェノールクロロホルム相、中間相および無色の上部水相、に分離した。ＲＮＡは上部の水相中に残り、ＤＮＡは白色中間相（中間相）に、およびタンパク質はピンク色の底部（有機）相に残った。上部の水相の３／４を新規清浄なエッペンドルフチューブに移した。
等量の１００％のエタノールを加えることにより、ＲＮＡを水相から沈殿させた。沈殿したＲＮＡをＳｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ上に固定し、２回洗浄し、乾燥した。ＲＮＡを５０μｌの温かいＲＮアーゼ不含水で溶出した。精製ＲＮＡの量と品質をＮａｎｏＤｒｏｐにより測定した。ＲＮＡを−８０℃で貯蔵した後、アレイ解析のためにＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに移送した。
発現データの解析計画
発現データを細胞株毎に別々のファイルにダウンロードした。「バックグラウンド補正」発現は、関連プローブの実際のシグナルから抽出したバックグラウンドシグナルの結果であるアレイの「ｇＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ」からのデータである。これは、アレイ解析で最もよく使われる変数である。バックグラウンド補正シグナルは、全試料に対し統計解析のために、ｌｏｇ２変換された。試料における偽陽性率を減らすために、「発現レベル」未満のシグナルは除去された。「発現未満」レベルは、ｌｏｇ２変換発現値の５に設定された。
統計解析
結果の変動を低減するために、解析前に、各アレイに対する対照プローブの発現パターンに基づいて、全アレイに対し中央値センタリングを実施することが決定された。データを細胞型で群化し、各細胞型を次のアルゴリズムを用いて解析した：
・Ｄ２対照試料に対するＤ０対照試料の比較−正常培養物中の細胞に認められる発現変化
・Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較−ＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中の細胞に認められる発現変化
・Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ２対照試料の比較−培養物中にＬＭＷ−ＤＳにより誘導される発現差異
予備的分析を実施し、３つのデータセットの任意の組み合わせの間で発現差異のなかった遺伝子を選別して除去した。単純な、非ストリンジェント分散分析（ｐ＜０．０５）を実施して発現パターンを探した。３つのデータセットを通して変化のないプローブを除去した。ボルケーノプロットを用いて、残りのプローブセットの倍率変化および有意性に関して解析した。発現パターンの検出を可能とするために、最初のケースでは、プローブの発現の２０％を超える変化（ＦＣ≧１．２またはＦＣ≦０．８４）を有意と見なした。
品質パラメーター
播種密度をシュワン細胞の細胞ストックから取り出した細胞数から計算した。ＨＵＶＥＣＳをそれらの最適密度で播種した。
アレイサービスプロバイダーからの追加の品質管理は、ＲＮＡが高品質（分解なし）で、量はＡｇｉｌｅｎｔからのＬｏｗ ｉｎｐｕｔ ＲＮＡマイクロアレイのパラメーター内であることを示した。
生データの解析は、予測通り、アレイ間で有意差が存在することを示した。しかし、これらの差異（全てのアレイ上に含まれた同じ対照試料中の差異を反映している）は、正規化技術で容易に除去された。選択されたアレイ間変動を除くデータの中央値センタリングは、ＲＮＡの異なる濃度を表す対照間で認められると予測される全体の差異に影響を与えなかった。
シュワン細胞の発現解析
前に記載のように、シュワン細胞中で発現しなかった遺伝子はデータ解析の前に除去された。「発現未満」レベルは、ｌｏｇ２変換発現値の５に設定された。これにより、シュワン細胞培養物中に１５，８４２個のユニークな分析プローブが残った。解析の次のステップでは、３つのセットのデータ（Ｄ２対照試料に対するＤ０対照試料の比較；Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較；Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳに対するＤ２対照試料の比較）を解析し、ＣＭの細胞に対する効果およびＬＭＷ−ＤＳにより誘導された相対変化を確定した。
Ｄ２対照試料に対してＤ０対照試料を比較すると、シュワン細胞培養物中で５８５個の遺伝子が差次的に発現した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞の運動（１．１４Ｅ−０７〜２．４９Ｅ−０３）；細胞形態（５．５６Ｅ−０７〜２．３６Ｅ−０３）；細胞の発生（７．３Ｅ−０６〜２．４８Ｅ−０３）；細胞の成長および増殖（７．３Ｅ−０６〜２．４８Ｅ−０３）；細胞のアセンブリおよび組織化（１．２３Ｅ−０５〜２．３６Ｅ−０３）；細胞機能および維持（１．２３Ｅ−０５〜２．４７Ｅ−０３）；細胞死および生存（１．５３Ｅ−０５〜２．５１Ｅ−０３）；脂質代謝（８．１４Ｅ−０５〜１．６Ｅ−０３）；小分子生化学（８．１４Ｅ−０５〜１．６Ｅ−０３）；分子輸送（１．１８Ｅ−０４〜２．２９Ｅ−０３）；タンパク質輸送（１．６２Ｅ−０４〜１．６Ｅ−０３）；糖代謝（３．２２Ｅ−０４〜１．７８Ｅ−０３）；遺伝子発現（３．９８Ｅ−０４〜２．２Ｅ−０３）；細胞内シグナル伝達（４．３９Ｅ−０４〜２．２５Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達および相互作用（５．０５Ｅ−０４〜２．４８Ｅ−０３）；細胞損傷（７．６９Ｅ−０４〜１．５８Ｅ−０３）；細胞周期（１．１２Ｅ−０３〜１．８Ｅ−０３）；アミノ酸代謝（１．６Ｅ−０３〜１．６Ｅ−０３）；および核酸代謝（１．６Ｅ−０３〜１．６Ｅ−０３）に関する。
上記に示した値は、異なる経路を有するこれらの遺伝子に関連する統計的有意性を表すｐ値である。２つのｐ値は、観察された統計的有意性の下限値と上限値を表す（ｐ＜０．０５が有意）。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳはシュワン細胞培養物中の１２４４個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞形態（１．４３Ｅ−０８〜８．３９Ｅ−０４）；細胞の運動（１．４Ｅ−０７〜９．６Ｅ−０４）；翻訳後修飾（３．９３Ｅ−０７〜６．７１Ｅ−０５）；タンパク質合成（３．９３Ｅ−０７〜１．０８Ｅ−０４）；タンパク質輸送（３．９３Ｅ−０７〜１．２６Ｅ−０６）；細胞死および生存（２．１３Ｅ−０６〜８．６５Ｅ−０４）；細胞のアセンブリおよび組織化（７．４６Ｅ−０６〜８．２４Ｅ−０４）；ＤＮＡ複製、組換え、および修復（７．４６Ｅ−０６〜７．４６Ｅ−０６）；細胞機能および維持（９．５３Ｅ−０６〜６．４６Ｅ−０４）；遺伝子発現（１．２７Ｅ−０５〜４．９２Ｅ−０４）；細胞の発生（１．２９Ｅ−０５〜９．０６Ｅ−０４）；細胞の成長および増殖（１．２９Ｅ−０５〜９．０６Ｅ−０４）；細胞間シグナル伝達および相互作用（１．９７Ｅ−０５〜８．８１Ｅ−０４）；アミノ酸代謝（４．２２Ｅ−０５〜８．２４Ｅ−０４）；小分子生化学（４．２２Ｅ−０５〜８．２４Ｅ−０４）；脂質代謝（４．８１Ｅ−０５〜３．６４Ｅ−０４）；分子輸送（３．６４Ｅ−０４〜３．６４Ｅ−０４）；および細胞周期（４．５３Ｅ−０４〜４．８６Ｅ−０４）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ２対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳは、シュワン細胞培養物中の７００個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞形態（１．４９Ｅ−０７〜５．６２Ｅ−０３）；細胞のアセンブリおよび組織化（１．４９Ｅ−０７〜５．９５Ｅ−０３）；細胞の運動（７．２４Ｅ−０７〜６．０６Ｅ−０３）；細胞死および生存（９．４１Ｅ−０６〜５．９５Ｅ−０３）；アミノ酸代謝（２．５６Ｅ−０５〜３．７Ｅ−０３）；翻訳後修飾（２．５６Ｅ−０５〜１．０５Ｅ−０３）；小分子生化学（２．５６Ｅ−０５〜３．７Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達および相互作用（５．０５Ｅ−０５〜５．７６Ｅ−０３）；遺伝子発現（７．１８Ｅ−０５〜４．９４Ｅ−０３）；細胞周期（１．０６Ｅ−０４〜５．９５Ｅ−０３）；細胞の発生（１．０６Ｅ−０４〜５．９５Ｅ−０３）；細胞機能および維持（１．９６Ｅ−０４〜５．９５Ｅ−０３）；細胞の成長および増殖（２．３５Ｅ−０４〜５．９５Ｅ−０３）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（２．７５Ｅ−０４〜５．９５Ｅ−０３）；細胞内シグナル伝達（５．９２Ｅ−０４〜２．５４Ｅ−０３）；細胞損傷（６．２６Ｅ−０４〜６．２６Ｅ−０４）；脂質代謝（６．２６Ｅ−０４〜１．８５Ｅ−０３）；分子輸送（６．２６Ｅ−０４〜５．９５Ｅ−０３）；タンパク質合成（１．０５Ｅ−０３〜１．９３Ｅ−０３）；治療薬に対する細胞応答（１．８５Ｅ−０３〜１．８５Ｅ−０３）；タンパク質輸送（２．６６Ｅ−０３〜５．９５Ｅ−０３）；およびＲＮＡ転写後修飾（４．３２Ｅ−０３〜４．３２Ｅ−０３）に関する。
機構分子ネットワークモデルは、ＬＭＷ−ＤＳによる差次的調節分子の効果をシミュレートし、これらの変化の機能的帰結を評価可能とする。インシリコモデルは、ＬＭＷ−ＤＳが神経細胞死；アポトーシス；およびタンパク質の合成を抑制し、血管新生；細胞の移動；細胞生存性；細胞生存；細胞運動；細胞の増殖；細胞の分化；細胞の恒常性；細胞周期進行；細胞変換；およびＲＮＡの発現を抑制することを示す。
表６は、培養したシュワン細胞の遺伝子発現の変化の結果をまとめたものである。
Figure 2020533281
２日間の対照培養物で発現が変化した２１個の遺伝子は、同じ２日間のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中では全く何の変化も示さなかった。対照培養物で発現が増大した１個の遺伝子は、同じ２日間のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中では下方制御された。対照培養物で下方制御された１３個の遺伝子は、２日間のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中では上方制御された。１２２個の遺伝子は、培地中で成長因子により有意に下方制御され、この下方制御は、ＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中よりさらに強力であった。４４１個の遺伝子は、対照培養物中で上方制御され、ＬＭＷ−ＤＳの添加は、この上方制御を有意に強力にした。
ＨＵＶＥＣの発現解析
前に記載のように、ＨＵＶＥＣ中で発現しない遺伝子は、なんらかの解析を試みる前に除去された。「発現未満」レベルは、ｌｏｇ２変換発現値の５に設定された。これにより、ＨＵＶＥＣ培養物中に１５，２３９個のユニークな分析プローブが残った。解析の次のステップでは、３つのセットのデータを解析し、ＣＭの細胞中の遺伝子発現に対する効果およびＬＭＷ−ＤＳにより誘導された差異を確定した。予備的分析を実施し、３つのデータセットの任意の組み合わせの間で発現差異のなかった遺伝子を選別して除去した。単純な、非ストリンジェント分散分析（ｐ＜０．０５）を実施して発現パターンを探した。３つのデータセットを通して変化のない遺伝子を除去し、合計１２，３１３個のプローブ（１０，３６８個の遺伝子）を分析のために残した。
Ｄ２対照試料に対してＤ０対照試料を比較すると、ＨＵＶＥＣ培養物中で１５５１個の遺伝子が差次的に発現した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞のアセンブリおよび組織化（２．５５Ｅ−１５〜１．２９Ｅ−０３）；細胞機能および維持（２．５５Ｅ−１５〜１．２９Ｅ−０３）；細胞周期（１．９８Ｅ−１１〜１．３２Ｅ−０３）；細胞形態（３．１８Ｅ−１０〜１．２９Ｅ−０３）；遺伝子発現（１．０５Ｅ−０８〜２．０１Ｅ−０４）；細胞の発生（１．６６Ｅ−０７〜１．３７Ｅ−０３）；細胞の成長および増殖（１．６６Ｅ−０７〜１．３７Ｅ−０３）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（２．０４Ｅ−０７〜９．８４Ｅ−０４）；細胞死および生存（２．０９Ｅ−０７〜１．３Ｅ−０３）；ＲＮＡ転写後修飾（４．８６Ｅ−０６〜６．５３Ｅ−０４）；細胞の運動（９．９Ｅ−０６〜１．１８Ｅ−０３）；翻訳後修飾（１．９２Ｅ−０５〜１．３４Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達および相互作用（２．１９Ｅ−０５〜９．１Ｅ−０４）；タンパク質合成（５．４９Ｅ−０５〜１．１４Ｅ−０３）；細胞損傷（８．１６Ｅ−０５〜８．１６Ｅ−０５）；分子輸送（６．２７Ｅ−０４〜６．２７Ｅ−０４）；タンパク質輸送（６．２７Ｅ−０４〜６．２７Ｅ−０４）；細胞内シグナル伝達（８．８６Ｅ−０４〜８．８６Ｅ−０４）；治療薬に対する細胞応答（９．８４Ｅ−０４〜９．８４Ｅ−０４）；およびタンパク質分解（１．１４Ｅ−０３〜１．１４Ｅ−０３）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳはＨＵＶＥＣ培養物中の１７７９個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞のアセンブリおよび組織化（４．１４Ｅ−１７〜９．７Ｅ−０４）；細胞機能および維持（４．１４Ｅ−１７〜８．０５Ｅ−０４）；細胞周期（５．８３Ｅ−１４〜９．８５Ｅ−０４）；細胞形態（１．６９Ｅ−１０〜７．４８Ｅ−０４）；遺伝子発現（７．９９Ｅ−０９〜８．６２Ｅ−０４）；細胞死および生存（２Ｅ−０８〜８．４Ｅ−０４）；細胞の発生（１．２８Ｅ−０７〜８．８８Ｅ−０４）；細胞の成長および増殖（１．２８Ｅ−０７〜８．８８Ｅ−０４）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（３．０７Ｅ−０７〜９．７Ｅ−０４）；ＲＮＡ転写後修飾（１．１３Ｅ−０６〜６．３１Ｅ−０４）；細胞の運動（１．４２Ｅ−０６〜８．３４Ｅ−０４）；翻訳後修飾（３．４Ｅ−０５〜９．１７Ｅ−０４）；細胞間シグナル伝達および相互作用（６．９７Ｅ−０５〜９．５６Ｅ−０４）；分子輸送（７．４３Ｅ−０５〜９．７Ｅ−０４）；タンパク質輸送（７．４３Ｅ−０５〜７．４３Ｅ−０５）；ＲＮＡ輸送（１．５７Ｅ−０４〜５．７２Ｅ−０４）；タンパク質合成（１．９２Ｅ−０４〜９．０２Ｅ−０４）；細胞損傷（２．４７Ｅ−０４〜６．２８Ｅ−０４）；および細胞内シグナル伝達（４．６４Ｅ−０４〜９．０２Ｅ−０４）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ２対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳはＨＵＶＥＣ培養物中の７６個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（９．６２Ｅ−０５〜２．５７Ｅ−０２）；細胞周期（１．２２Ｅ−０４〜２．４Ｅ−０２）；細胞の発生（１．５９Ｅ−０４〜２．６７Ｅ−０２）；細胞形態（４．６４Ｅ−０４〜２．４２Ｅ−０２）；細胞機能および維持（４．６４Ｅ−０４〜２．５７Ｅ−０２）；脂質代謝（９．４９Ｅ−０４〜１．０７Ｅ−０２）；分子輸送（９．４９Ｅ−０４−１．６１Ｅ−０２）；小分子生化学（９．４９Ｅ−０４−１．８７Ｅ−０２）；細胞損傷（１．６Ｅ−０３〜２．６２Ｅ−０２）；細胞死および生存（２．０６Ｅ−０３〜２．６７Ｅ−０２）；アミノ酸代謝（２．７Ｅ−０３〜２．７Ｅ−０３）；糖代謝（２．７Ｅ−０３〜１．０７Ｅ−０２）；細胞間シグナル伝達および相互作用（２．７Ｅ−０３〜２．４Ｅ−０２）；細胞のアセンブリおよび組織化（２．７Ｅ−０３〜２．５７Ｅ−０２）；細胞の成長および増殖（２．７Ｅ−０３〜２．４Ｅ−０２）；細胞の運動（２．７Ｅ−０３〜２．４Ｅ−０２）；エネルギー生成（２．７Ｅ−０３〜２．７Ｅ−０３）；核酸代謝（２．７Ｅ−０３〜１．０７Ｅ−０２）；翻訳後修飾（２．７Ｅ−０３〜１．６１Ｅ−０２）；遺伝子発現（５．３９Ｅ−０３〜２．３６Ｅ−０２）；ＲＮＡ転写後修飾（５．３９Ｅ−０３〜２．４Ｅ−０２）；薬物代謝（８．０７Ｅ−０３〜１．６１Ｅ−０２）；ビタミンおよびミネラル代謝（８．０７Ｅ−０３〜８．０７Ｅ−０３）；タンパク質合成（１．０７Ｅ−０２〜１．０７Ｅ−０２）；ＲＮＡ輸送（１．０７Ｅ−０２〜１．０７Ｅ−０２）；治療薬に対する細胞応答（１．２４Ｅ−０２〜１．２４Ｅ−０２）；およびフリーラジカル除去作用（１．４３Ｅ−０２〜１．４３Ｅ−０２）に関する。
２日間の処理後の対照とＬＭＷ−ＤＳ処理培養物間の全体差異は、大きいように直ぐには見えないが、ＬＭＷ−ＤＳの遺伝子発現変化に対する効果は、ＬＭＷ−ＤＳによる成長因子誘導遺伝子発現の調節を考慮すると特に、有意であった。
機構分子ネットワークモデルを使用すると、ＬＭＷ−ＤＳによる差次的調節遺伝子の効果をシミュレートし、これらの変化の機能的帰結を探すことが可能となる。インシリコモデルは、ＬＭＷ−ＤＳが神経細胞死；アポトーシス；およびタンパク質の合成を抑制し、血管新生；細胞の遊走；細胞生存性；細胞生存；細胞運動；細胞の増殖；細胞の分化；細胞の恒常性；細胞周期進行；細胞変換；およびＲＮＡの発現を活性化することを示す。
ＨＵＶＥＣ対照培養物は、成長因子を含む。処理培養物では、ＬＭＷ−ＤＳを成長因子を既に含んだ培地に加えた。
表７は、培養したＨＵＶＥＣの遺伝子発現の変化の結果をまとめたものである。２日間の対照培養物で発現が変化した（成長因子の効果で）６７個の遺伝子は、同じ２日間のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中では全く何の変化も示さなかった。成長因子を含む対照培養物で発現が増大した４個の遺伝子は、同じ２日間のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中では下方制御された。対照培養物で成長因子により下方制御された１１個の遺伝子は、２日間のＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中では上方制御された。１２０個の遺伝子は、成長因子により有意に下方制御され、この下方制御は、ＬＭＷ−ＤＳ処理培養物中でより強力であった。２２９個の遺伝子は、対照培養物中で上方制御され、ＬＭＷ−ＤＳの添加は、この上方制御を有意に強力にした。

Figure 2020533281
異なる病状および治療用途に重要ないくつかの分子経路に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を解析した。この解析のために、遺伝子発現に対するＬＭＷ−ＤＳ添加の効果を、ＣＭ中の細胞で認められるものと比較し、発現パターンの観察された変化に基づいて、機能的効果を予測した。
運動ニューロンの発現解析
前に記載のように、運動ニューロン中で発現しない遺伝子は、なんらかの解析を試みる前に除去された。「発現未満」レベルは、ｌｏｇ２変換発現値の５に設定された。これにより、シリーズ中で少なくとも３つの試料で発現閾値を満たした１２，２４０個のユニークなプローブが残った。次のステップでは、３つのセットのデータを解析し、ＣＭの細胞に対する効果およびＬＭＷ−ＤＳにより誘導された差異を確定した。
正常な培養条件下での遺伝子発現の変化は、それらが解離された一連の細胞から運動ニューロン表現型を発生させる場合、運動ニューロンの正常な発生過程を模倣する。正常な培地中の成長因子は、これらの細胞が分化するために必要なものである。これらの培養物中に存在するストレス因子は、酸化ストレス（組織培養条件では正常な）である。
Ｄ２対照試料に対してＤ０対照試料を比較すると、運動ニューロン培養物中で４８５個の遺伝子が差次的に発現した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞死および生存（１．９９Ｅ−１７〜１．９８Ｅ−０４）；細胞の運動（１．１４Ｅ−１６〜１．９１Ｅ−０４）；細胞のアセンブリおよび組織化（１．２２Ｅ−１６〜１．９３Ｅ−０４）；細胞機能および維持（１．２２Ｅ−１６〜１．９５Ｅ−０４）；細胞形態（６．４６Ｅ−１６〜１．７４Ｅ−０４）；細胞間シグナル伝達および相互作用（３．１６Ｅ−１２〜１．９５Ｅ−０４）；細胞の発生（１．５９Ｅ−１０〜１．９３Ｅ−０４）；細胞の成長および増殖（１．５９Ｅ−１０〜１．９Ｅ−０４）；分子輸送（４．２７Ｅ−１０〜１．８９Ｅ−０４）；タンパク質合成（９．８５Ｅ−０９〜５．０３Ｅ−０５）；脂質代謝（１．０８Ｅ−０８〜１．６１Ｅ−０４）；小分子生化学（１．０８Ｅ−０８〜１．８９Ｅ−０４）；遺伝子発現（８．４５Ｅ−０８〜３．８Ｅ−０５）；細胞周期（４．５５Ｅ−０７〜１．０９Ｅ−０４）；フリーラジカル除去作用（７．１２Ｅ−０７〜１．６５Ｅ−０４）；細胞内シグナル伝達（１．２３Ｅ−０５〜１．８９Ｅ−０４）；ビタミンおよびミネラル代謝（１．２３Ｅ−０５〜１．８９Ｅ−０４）；タンパク質分解（３．０７Ｅ−０５〜１．３１Ｅ−０４）；糖代謝（３．３２Ｅ−０５〜１．６１Ｅ−０４）；薬物代謝（４．１６Ｅ−０５〜４．１６Ｅ−０５）；翻訳後修飾（７．１Ｅ−０５〜１．３１Ｅ−０４）；およびタンパク質折り畳み（７．１Ｅ−０５〜７．１Ｅ−０５）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳは、運動ニューロン中の３１５個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞死および生存（６．５４Ｅ−０８〜９．０６Ｅ−０３）；細胞の運動（８．２１Ｅ−０８〜５．４２Ｅ−０３）；細胞のアセンブリおよび組織化（８．３６Ｅ−０８〜９．０１Ｅ−０３）；細胞機能および維持（８．３６Ｅ−０８〜９．０１Ｅ−０３）；細胞形態（２．９Ｅ−０６〜８．７５Ｅ−０３）；細胞の発生（１．０４Ｅ−０５〜９．０１Ｅ−０３）；細胞の成長および増殖（１．０４Ｅ−０５〜７．８３Ｅ−０３）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（２．７９Ｅ−０５〜８．０１Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達および相互作用（８．１８Ｅ−０５〜７．１１Ｅ−０３）；翻訳後修飾（１．３２Ｅ−０４〜７．５６Ｅ−０３）；タンパク質分解（１．３２Ｅ−０４〜４．３５Ｅ−０３）；タンパク質合成（１．３２Ｅ−０４〜５．０９Ｅ−０３）；遺伝子発現（１．９Ｅ−０４〜９．０１Ｅ−０３）；細胞損傷（３．５８Ｅ−０４〜９．０１Ｅ−０３）；細胞周期（６．０８Ｅ−０４〜９．０１Ｅ−０３）；フリーラジカル除去作用（７．４１Ｅ−０４〜７．３１Ｅ−０３）；アミノ酸代謝（７．６７Ｅ−０４〜６．６１Ｅ−０３）；小分子生化学（７．６７Ｅ−０４〜９．０１Ｅ−０３）；ビタミンおよびミネラル代謝（７．６７Ｅ−０４〜１．１３Ｅ−０３）；脂質代謝（１．０５Ｅ−０３〜９．０１Ｅ−０３）；分子輸送（１．０５Ｅ−０３〜９．０１Ｅ−０３）；細胞内シグナル伝達（１．１３Ｅ−０３〜５．０９Ｅ−０３）；および糖代謝（４．７１Ｅ−０３〜４．７１Ｅ−０３）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳは、運動ニューロン中の４２５個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞死および生存（２．８７Ｅ−０８〜６．２７Ｅ−０３）；細胞の運動（４．７３Ｅ−０７〜６．４７Ｅ−０３）；細胞形態（４．９５Ｅ−０７〜７．４７Ｅ−０３）；細胞の発生（１．０２Ｅ−０６〜７．１３Ｅ−０３）；細胞の成長および増殖（１．０２Ｅ−０６〜７．４８Ｅ−０３）；細胞のアセンブリおよび組織化（７．０３Ｅ−０６〜７．４７Ｅ−０３）；細胞機能および維持（７．０３Ｅ−０６〜７．４７Ｅ−０３）；遺伝子発現（１．９５Ｅ−０５〜６．１８Ｅ−０３）；細胞周期（２．８８Ｅ−０５〜７．４８Ｅ−０３）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（３．３９Ｅ−０５〜５．１６Ｅ−０３）；アミノ酸代謝（７．７５Ｅ−０５〜４．６８Ｅ−０３）；小分子生化学（７．７５Ｅ−０５〜４．６８Ｅ−０３）；細胞損傷（８．２３Ｅ−０５〜４．６１Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達および相互作用（３．２７Ｅ−０４〜７．４８Ｅ−０３）；ビタミンおよびミネラル代謝（３．２７Ｅ−０４〜３．２７Ｅ−０４）；タンパク質合成（８．９４Ｅ−０４〜５．２９Ｅ−０３）；翻訳後修飾（９．６７Ｅ−０４〜９．６７Ｅ−０４）；分子輸送（９．７Ｅ−０４〜４．６８Ｅ−０３）；タンパク質輸送（９．７Ｅ−０４〜９．７Ｅ−０４）；糖代謝（１．４４Ｅ−０３〜１．９２Ｅ−０３）；治療薬に対する細胞応答（１．９２Ｅ−０３〜１．９２Ｅ−０３）；および脂質代謝（４．６８Ｅ−０３〜４．６８Ｅ−０３）に関する。

Figure 2020533281
皮質ニューロンの発現解析
前に記載のように、運動ニューロン中で発現しない遺伝子は、なんらかの解析を試みる前に除去された。「発現未満」レベルは、ｌｏｇ２変換発現値の５に設定された。これにより、シリーズ中で少なくとも３つの試料で発現閾値を満たした１０，６５３個のユニークなプローブが残った。次のステップでは、３つのセットのデータを解析し、ＣＭの細胞に対する効果およびＬＭＷ−ＤＳにより誘導された差異を確定した。
正常な培養条件下での遺伝子発現の変化は、それらが解離された一連の細胞から皮質ニューロン表現型を発生させる場合、皮質ニューロンの正常な発生過程を模倣する。正常な培地中の成長因子は、これらの細胞が分化するために必要なものである。これらの培養物中に存在するストレス因子は、酸化ストレス（組織培養条件では正常な）である。
Ｄ２対照試料に対してＤ０対照試料を比較すると、運動ニューロン培養物中で１１０１個の遺伝子が差次的に発現した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞のアセンブリおよび組織化（３．５７Ｅ−２５〜６．６５Ｅ−０４）；細胞機能および維持（３．５７Ｅ−２５〜６．６５Ｅ−０４）；細胞形態（４．２８Ｅ−２２〜６．３６Ｅ−０４）；細胞の発生（４．２８Ｅ−２２〜６．５３Ｅ−０４）；細胞の成長および増殖（４．２８Ｅ−２２〜６．６Ｅ−０４）；細胞間シグナル伝達および相互作用（２．１６Ｅ−１３〜６．６５Ｅ−０４）；分子輸送（５．１８Ｅ−１２〜４．９５Ｅ−０４）；細胞の運動（１．８６Ｅ−１１〜６．６５Ｅ−０４）；細胞死および生存（３．３７Ｅ−１１〜６．４１Ｅ−０４）；遺伝子発現（１．２７Ｅ−０８〜８．９６Ｅ−０５）；タンパク質合成（３．８４Ｅ−０７〜８．６９Ｅ−０５）；小分子生化学（６．６５Ｅ−０７〜５．１８Ｅ−０４）；細胞損傷（７．１２Ｅ−０６〜４．５４Ｅ−０４）；タンパク質分解（１．６２Ｅ−０５〜１．６２Ｅ−０５）；アミノ酸代謝（２．１１Ｅ−０５〜４．２５Ｅ−０４）；タンパク質輸送（３．４Ｅ−０５〜３．４Ｅ−０５）；細胞内シグナル伝達（８．６９Ｅ−０５〜３Ｅ−０４）；翻訳後修飾（８．６９Ｅ−０５〜２．１５Ｅ−０４）；タンパク質折り畳み（２．１５Ｅ−０４〜２．１５Ｅ−０４）；細胞周期（２．６９Ｅ−０４〜３．０７Ｅ−０４）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（２．６９Ｅ−０４〜４．７７Ｅ−０４）；核酸代謝（２．６９Ｅ−０４〜２．６９Ｅ−０４）；脂質代謝（３．１２Ｅ−０４〜５．１８Ｅ−０４）；および糖代謝（５．１８Ｅ−０４〜５．１８Ｅ−０４）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳは、運動ニューロン中の６０９個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞のアセンブリおよび組織化（３．９１Ｅ−１５〜１．８３Ｅ−０３）；細胞機能および維持（３．９１Ｅ−１５〜１．８３Ｅ−０３）；細胞形態（２．５３Ｅ−１３〜１．４３Ｅ−０３）；細胞の発生（２．５３Ｅ−１３〜１．８１Ｅ−０３）；細胞の成長および増殖（２．５３Ｅ−１３〜１．８３Ｅ−０３）；細胞の運動（４．９５Ｅ−０９〜１．２Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達および相互作用（５．９６Ｅ−０９〜１．４７Ｅ−０３）；細胞死および生存（２．２５Ｅ−０８〜１．７７Ｅ−０３）；分子輸送（７．０８Ｅ−０８〜１．７９Ｅ−０３）；ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（３．０３Ｅ−０６〜１．７１Ｅ−０３）；細胞損傷（９．２３Ｅ−０６〜７．６５Ｅ−０４）；アミノ酸代謝（１．７５Ｅ−０５〜１．６４Ｅ−０３）；細胞周期（１．７５Ｅ−０５〜１．７７Ｅ−０３）；小分子生化学（１．７５Ｅ−０５〜１．７９Ｅ−０３）；タンパク質合成（２．７７Ｅ−０５〜１．５Ｅ−０３）；タンパク質輸送（２．７７Ｅ−０５〜１．９Ｅ−０４）；細胞内シグナル伝達（７．６５Ｅ−０５〜１．７３Ｅ−０３）；翻訳後修飾（３．０１Ｅ−０４〜１．４Ｅ−０３）；遺伝子発現（３．６５Ｅ−０４〜１．１５Ｅ−０３）；薬物代謝（６．４９Ｅ−０４〜６．４９Ｅ−０４）；糖代謝（６．９５Ｅ−０４〜７．６９Ｅ−０４）；ビタミンおよびミネラル代謝（１．０９Ｅ−０３〜１．０９Ｅ−０３）；および核酸代謝（１．４４Ｅ−０３〜１．７３Ｅ−０３）に関する。
Ｄ２ ＬＭＷ−ＤＳ処理試料に対するＤ０対照試料の比較により評価して、ＬＭＷ−ＤＳは、運動ニューロン中の２４７個の遺伝子の発現差異を誘導した。これらの遺伝子により影響を受ける分子機能は、細胞形態（６．０１Ｅ−０８〜１．０１Ｅ−０２）；細胞の発生（７．４６Ｅ−０８〜１．０１Ｅ−０２）；細胞の成長および増殖（７．４６Ｅ−０８〜１．０１Ｅ−０２）；細胞死および生存（４．２３Ｅ−０７〜１．０１Ｅ−０２）；細胞の運動（２．６９Ｅ−０６〜９．９１Ｅ−０３）；細胞のアセンブリおよび組織化（１．５７Ｅ−０５〜１．０１Ｅ−０２）；細胞機能および維持（１．５７Ｅ−０５〜１．０１Ｅ−０２）；細胞周期（１．０１Ｅ−０４〜１．０１Ｅ−０２）；細胞間シグナル伝達および相互作用（１．０１Ｅ−０４〜１．０１Ｅ−０２）；脂質代謝（１．５６Ｅ−０４〜１．０１Ｅ−０２）；小分子生化学（１．５６Ｅ−０４〜１．０１Ｅ−０２）；遺伝子発現（２．２８Ｅ−０４〜３．３８Ｅ−０３）；ＲＮＡ損傷および修復（２．２８Ｅ−０４〜２．２８Ｅ−０４）；ＲＮＡ転写後修飾（２．２８Ｅ−０４〜２．２８Ｅ−０４）；分子輸送（４．１８Ｅ−０４〜８．３２Ｅ−０３）；細胞損傷（４．４７Ｅ−０４〜２．２Ｅ−０３）；タンパク質合成（２．６６Ｅ−０３〜７．２９Ｅ−０３）；タンパク質輸送（４．１１Ｅ−０３〜８．３２Ｅ−０３）；タンパク質分解（５．６４Ｅ−０３〜７．２９Ｅ−０３）；およびＤＮＡ複製、組換えおよび修復（７．３１Ｅ−０３〜１．０１Ｅ−０２）に関する。

Figure 2020533281
ＬＭＷ−ＤＳのミトコンドリアの酸化ストレス経路に与える効果
ミトコンドリアで発生する酸化ストレス経路は、単に癌だけでなく、加齢および加齢関連変性疾患にも重要である。正常な成長状態は、細胞中の一定量の酸化ストレスの誘因となり、これは、インビボおよびインビトロ両方の老化過程の一因となる。
正常な状態で培養されたシュワン細胞では、図１８のＡとして記された複合体Ｉ（ＮＡＤＨ脱水素酵素）は阻害されたが、一方、図１８でＢとして記された複合体ＩＶ（チトクロムｃオキシダーゼ）は活性化された。ＬＭＷ−ＤＳが培養物に加えられると、図１８でＣとして記された複合体ＩＩＩ（チトクロムｂｃ１）は阻害された。複合体ＩＩＩの阻害は、癌および神経疾患の病因に関与する酸化ストレス現象を抑制する。
複合体ＩＩＩは、コエンザイムＱ：チトクロムｃ−酸化還元酵素またはチトクロムｂｃ１複合体と呼ばれることもあるが、これは、電子伝達系（ＥＣ１．１０．２．２）における第３の複合体であり、ＡＴＰ（酸化的リン酸化）の生化学的生成で重要な役割を果たす。複合体ＩＩＩは、ミトコンドリアの（チトクロムｂ）および核ゲノム（全ての他のサブユニット）の両方によりコードされる多サブユニット膜貫通タンパク質である。複合体ＩＩＩは、全ての動物および全ての好気性真核生物およびほとんどの真正細菌の内膜のミトコンドリア中に存在する。複合体ＩＩＩの変異は、運動不耐性ならびに多系統疾患を生ずる。ｂｃ１複合体は、１１個のサブユニット、３個の呼吸サブユニット（チトクロムＢ、チトクロムＣ１、Ｒｉｅｓｋｅタンパク質）、２個のコアタンパク質、および６個の低分子量タンパク質を含む。
ＨＵＶＥＣでは、ＬＭＷ−ＤＳで処理後、酸化ストレスのミトコンドリアに対する効果の有意な調節は検出されなかった。
正常な培養条件では、運動ニューロンは、かなりの酸化ストレスを受けているように見える。これは、図１８のＦとして記した一部のアポトーシス機序の活性化に繋がり、チトクロムＣ、ＡＩＦ、カスパーゼ３、８および９の活性化を伴う。さらに、運動ニューロンは、細胞中で、酸化ストレスおよびＦＩＡＳ１を介したミトコンドリアのフラグメント化をさらに悪化する図１８でＥとして記したアミロイドβの産生ならびに図１８のＧとして記した脂肪酸の酸化を特徴とする。さらに、図１８のＤとして記した複合体Ｖが活性化された。
培養物へのＬＭＷ−ＤＳの添加は、図１８のＦとして記した反応経路を遮断し、図１８のＥとして記した、アミロイドβ産生およびミトコンドリアのフラグメント化および機能障害に対するその負の効果、およびその後の損傷を防止することにより、および図１８のＧで記した脂肪酸酸化を抑制することによりアポトーシスを防止および抑制してこれらの負の効果を改善する。ＬＭＷ−ＤＳはまた、図１８のＨとして記したＴＲＡＫ１およびＰＩＮＫ１を含む反応経路を阻害し、それにより、ミトコンドリア機能の改善に寄与する。ＬＭＷ−ＤＳはさらに、図１８のＩで示されるＨ２Ｏ２のレベルを低減した。さらなる効果は、アポトーシスの抑制に寄与する図１８のＪで記されたＨｔｒＡ２の阻害であった。
正常な培養条件では、皮質ニューロンは、図１８のＫとして記された、シヌクレインαの活性化および増大したレベルのＲＯＳを伴うアミロイドβ産生およびレビー小体形成；図１８のＦとして記されたアポトーシス；図１８のＥとして記されたミトコンドリアのフラグメント化；および図１８のＬとして記された、Ｃ１６１を伴うミトコンドリアの機能の低下に繋がるかなりの酸化ストレスに曝露される。培養物へのＬＭＷ−ＤＳの添加は、アミロイドβおよびレビー小体の病変の蓄積（図１８のＥ、Ｋとして記す）、ミトコンドリアの機能障害（図１８のＬとして記す）などのこれらの有害作用のほとんどを防止および回復できた。機序を誘導する一部のアポトーシス（図１８のＦとして記す）は、培養物中の強力な活性化におそらく起因して活性なままである。
グルタミン酸興奮毒性に与えるＬＭＷ−ＤＳの効果
グルタミン酸は、長期増強（ＬＴＰ）、すなわち、学習と記憶機能に関与する不可欠な興奮性アミノ酸である。しかし、過剰なグルタミン酸はまた、興奮毒性に関連し、ニューロン死に繋がる。この後者の現象は、慢性神経変性状態において（ＴＢＩでも）引き起こされるニューロン死に関与していると想定されている。グルタミン酸シグナル伝達に関与する遺伝子は、ＨＵＶＥＣ中で発現しなかったが、この調査で用いたシュワンおよびニューロン細胞株中には存在する（図１９参照）。
グルタミン酸産生は、運動ニューロン培養物でのベースライン条件により抑制される。抑制は、ＬＭＷ−ＤＳによる影響を受けない。グルタミン酸産生は、ベースラインで皮質ニューロン中で上昇した。ＬＭＷ−ＤＳの添加は、これらの細胞中でグルタミン酸産生を変化させなかった。
シュワン細胞のＣＭに対するＬＭＷ−ＤＳの添加は、図１９でＡとして記されたタンパク質複合体（ＣＡＬＭ、Ｇβγ、ＧＲＭ７、ＰＩＣＫ１）の発現を誘導した。より重要なことは、ＬＭＷ−ＤＳは、シュワン細胞中のグルタミン酸トランスポーター、特にＳＬＣ１Ａ２／３の活性および／またはレベルを高め、それにより、シナプス前のニューロンにより産生され、放出されたグルタミン酸の除去作用をもたらしたことである。したがって、ＬＭＷ−ＤＳは、シュワン細胞をシナプス間隙から毒性グルタミン酸を除去するように誘導し、それにより、その興奮毒性が呈されるのを防止した。
溶質輸送体ファミリー１（グリア高親和性グルタミン酸トランスポーター）のメンバー３であるＳＬＣ１Ａ３は、ヒト中でＳＬＣ１Ａ３遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＳＬＣ１Ａ３はまた、グルタミン酸・アスパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）または興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）と呼ばれることも多い。ＳＬＣ１Ａ３は主に、細胞膜中で発現され、それがグルタミン酸を細胞外間隙から除去するのを可能にする。ＳＬＣ１Ａ３はまた、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの一部としてミトコンドリア内膜中に局在化している。ＳＬＣ１Ａ３はインビボでホモトリマーとして機能する。ＳＬＣ１Ａ３は、グルタミン酸およびアスパラギン酸の輸送を媒介し、３つのＮａ＋および１つのＨ＋カチオンを共輸送し、１つのＫ＋カチオンを対向輸送する。この共輸送カップリング（または等方輸送）は、濃度勾配に逆らってグルタミン酸の細胞中への輸送を可能にする。ＳＬＣ１Ａ３は、ＣＮＳ全体を通して発現され、小脳中の星状膠細胞およびバーグマングリアで高度に発現されている。網膜中では、ＳＬＣ１Ａ３はミューラーグリア細胞中で発現されている。ＳＬＣ１Ａ３はまた、心筋細胞を含む多くの他の組織中で発現されている。
溶質輸送体ファミリー１のメンバー２であるＳＬＣ１Ａ２は、興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）およびグルタミン酸トランスポーター１（ＧＬＴ−１）としても知られ、ヒト中でＳＬＣ１Ａ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＳＬＣ１Ａ２は、タンパク質の溶質輸送体ファミリーのファミリーメンバーである。この膜結合型タンパク質は、興奮性神経伝達物質グルタミン酸をＣＮＳ中のシナプスの細胞外間隙から除去する主要なトランスポーターである。グルタミン酸除去は、適切なシナプス活性化のために、およびグルタミン酸受容体の過剰な活性化による神経損傷を防ぐために必要である。ＳＬＣ１Ａ２は、脳内のグルタミン酸再取り込みの９０％超に関与する。
これらの知見は、ＬＭＷ−ＤＳが、ＴＢＩ後のような、その高い細胞外レベルが有害である条件下で、グルタミン酸興奮毒性の防止に有用であり得ることを示している。
細胞接着に与えるＬＭＷ−ＤＳの効果
ＬＭＷ−ＤＳの極めて顕著な表現型の効果の１つは、細胞接着に対する効果であり、これは、細胞型特異的であった。細胞接着は、ニューロンが最も強く影響を受け、次にシュワン細胞が影響を受けたが、ＨＵＶＥＣは影響を受けなかった。
遺伝子発現の解析は、これが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とも呼ばれるメタロペプチダーゼを含む細胞接着を調節する酵素の発現に対するＬＭＷ−ＤＳの影響が原因であることを示した（表１０参照）。
シュワン細胞中の細胞運動および付着を調節する経路に対するこれらの分子の凝集効果（１７分子、表１０参照）は、細胞接着が阻害され、同時に細胞運動が活性化され得るが、一方、ＨＵＶＥＣ（１分子、ＡＤＡＭ１１）では、接着は影響を受けないが、血管新生が活性され得るようなものであった。
Figure 2020533281
ニューロン中でＬＭＷ−ＤＳにより誘導された差次的遺伝子発現の効果を分析した。運動ニューロンでは、同じメタロペプチダーゼ依存性経路がシュワン細胞で認められる細胞剥離に関与し得る（表１１参照）。

Figure 2020533281
しかし、ＭＭＰ関連遺伝子のいずれも、皮質ニューロン中では発現差異が認められなかった。
この知見は、細胞接着に影響を与える全ての分子間相互作用ならびに４種の異なる培養物における接着性関連分子および細胞の接着に対するそれらの効果の再評価に繋がった。２１７個の接着関連分子（１９７個の遺伝子および２０個の薬物）の完全リストを以下に示す：
ＡＣＥ２、ＡＣＰ１、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＧＲＢ１、ＡＤＧＲＥ２、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧ４９０、ＡＭＢＮ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＴＸＲ１、ＡＲＡＰ３、ＡＲＭＳ２、バチマスタット、ＢＣＡＭ、ＢＣＡＰ３１、ＢＣＡＲ１、ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−アルデヒド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＴＣ、Ｃ１ＱＢＰ、Ｃａ２＋、ＣＡ９、ＣＡＤＭ１、ＣＡＬＲ、カリクリンＡ、カスパーゼ、ＣＢＬ、ＣＤ２０９、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤＨ１３、セリバスタチン、クロラムフェニコール、コンドロイチン硫酸、ＣＬＥＣ４Ｍ、コルヒチン、Ｉ型コラーゲン、コラーゲン、ＣＯＭＰ、ＣＲＫ、ＣＲＰ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＴＧＦ、クルクミン、ＣＸＣＬ１２、環状ＡＭＰ、ＤＡＢ２、ＤＡＧ１、ＤＣＮ、ＤＤＲ１、デスフェリエキソケリン７７２ＳＭ、ＤＯＣＫ２、ＤＳＧ２、ＤＳＧ４、デュラパタイト、Ｅｆｎａ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＢ、ＥＦＮＢ１、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＬＮ、ＥＮＧ、ＥＰ３００、Ｅｐｈ受容体、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、エプチフィバチド、エチレンジアミン四酢酸、ＥＴＳ１、Ｆ１１Ｒ、Ｆ３、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、Ｆｃ受容体、ＦＣＮ２、ＦＥＲＭＴ２、ＦＥＳ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、フィブリン、ＦＮ１、接着斑キナーゼ、ＦＳＨ、ＦＵＴ３、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＹＮ、ＨＡＣＤ１、ヘパリン、ヒストンｈ３、ヒストンｈ４、ＨＲＡＳ、ＨＳＰＧ２、ＨＴＮ１、ヒアルロン酸、ヒドロコルチゾン、過酸化水素、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、Ｉｇｇ３、ＩＬ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＬＫ、インテグリン、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンα、ＩＰＯ９、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ５、ＪＡＫ２、Ｊｎｋ、ＫＰ−ＳＤ−１、ＬＡＭＣ１、ラミニン、ラミニン１、レボチロキシン、ＬＧＡＬＳ３、ＬＩＦ、リポ多糖類、ＬＯＸ、ＬＲＰ１、ＬＲＰＡＰ１、ＭＡＤ１Ｌ１、マンノース、ＭＡＰＫ７、ＭＢＬ２、ＭＥＲＴＫ、メトロニダゾール、ＭＧＡＴ５、ＭＭＰ２、Ｍｎ２＋、ＮＣＫ、ＮＥＤＤ９、ＮＲＧ１、オカダ酸、ＯＬＲ１、Ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＤＧＦ ＢＢ、ホスファチジルイノシトール、ＰＫＭ、血小板活性化因子、ＰＬＤ１、ＰＬＧ、ＰＭＰ２２、ＰＯＤＸＬ、ＰＯＳＴＮ、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＺ１、ピロリジンジチオカルバメート、Ｒａｃ、ＲＡＬＢ、ＲＡＮＢＰ９、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＰＳＡ、ＳＤＣ３、ＳＥＬＥ、セレクチン、ＳＥＬＬ、ＳＥＭＡ３Ａ、シンバスタチン、ＳＩＲＰＡ、ＳＰＡＲＣ、スフィンゴシン−１−ホスフェート、ＳＰＩ１、ＳＰＰ１、ＳＰＲＹ２、ＳＲＣ、ＳＴＡＲＤ１３、ＳＷＡＰ７０、ＴＥＫ、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ２、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＭ２、ＴＨＢＳ２、ＴＨＹ１、甲状腺ホルモン、ＴＩＭＰ２、チロフィバン、ＴＬＮ１、ＴＬＮ２、ＴＮＦ、ＴＰ６３、トレチノイン、ＶＡＶ１、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＮ、Ｖｅｇｆ、ＶＨＬ、ＶＴＮ、ＶＷＦ、およびＷＲＲ−０８６。
ＨＵＶＥＣでは、１９７個の細胞接着を調節する遺伝子の内で、ＬＭＷ−ＤＳにより差次的に調節されるものは存在しない。シュワン細胞培養物では、差次的に発現した１７個の分子が総じて僅かに高い接着をもたらした。しかし、ニューロンでは、発現パターンがこれらの細胞における細胞接着の有意な阻害に繋がった。
この結果は、細胞接着に与えるＬＭＷ−ＤＳの細胞型特異的効果を説明する。この知見はまた、免疫細胞の組織線維症および接着のシグナルを低減することにより、ＬＭＷ−ＤＳの抗瘢痕形成効果（実施例５参照）に対しても該当する。
ＬＭＷ−ＤＳにより影響を受ける上流制御因子経路
表１２に示すように、シュワン細胞では、上流制御因子分析により、ＬＭＷ−ＤＳが、系中で成長因子の活性化を高めるまたはそれらの阻害を低減することにより、いくつかの成長因子の効果を調節したことが明らかになった。
Figure 2020533281
ＨＵＶＥＣでは、ＬＭＷ−ＤＳによりその効果が向上した成長因子の数は、相対的に少なかったが、それでも極めて有意であった（表１３参照）。
Figure 2020533281
表１４に示すように、運動ニューロンでは、上流制御因子分析により、ＬＭＷ−ＤＳが、系中に存在する成長因子の活性化を高めるまたはそれらの阻害を低減するいくつかの成長因子の効果に影響を与えたことが明らかになった。
Figure 2020533281
正常な培養条件の皮質ニューロンでは、ほとんどの経路依存性成長因子が正常な培地により有意に活性化された。ほとんどの場合、この活性化はＬＭＷ−ＤＳにより変化しなかった。しかし、ＬＭＷ−ＤＳは、ＧＤＦ７の下流エフェクターである分子を活性化し、この成長因子の効果は、ＬＭＷ−ＤＳにより強化されたことを示した。ＧＤＦ７はニューロンに対する強力な分化因子であり、これらの成長因子のＢＤＮＦおよびＮＴ３の活性化に対する追加の活性化は、培養中のこれらの細胞の向上した分化に対する良い説明を与える。
考察
ＨＵＶＥＣ用の正常な培養条件は、組織低酸素および再灌流後の環境を模倣し、ヘパリンを同様に補充した高栄養素含有物および成長因子を含む。ＬＭＷ−ＤＳ処理培養物は、低酸素および再灌流の２４時間後のＬＭＷ−ＤＳの効果を模倣した。これに関連する現実生活のシナリオは、脳卒中などの虚血状態後の血管新生のシナリオである。
シュワン細胞では、高栄養素含量物およびグルコースを含む対照培養物は、シュワン細胞の活性化を再現する。ＬＭＷ−ＤＳ処理培養物は、グリア活性化の２４時間後に添加されたＬＭＷ−ＤＳの効果を模倣した。これが再現する現実生活のシナリオは、ＴＢＩ後などの神経系損傷後のグリア活性化である。
ニューロン、運動ニューロンおよび皮質ニューロンの両方用の、高栄要素含量物および成長因子を含む正常な培養条件は、正常なニューロン分化中の環境を模倣する。これらの培養物中の唯一の負の効果は、細胞が受ける酸化ストレスである。これが関連する現実生活のシナリオは、十分な成長因子および分化因子の存在下で、酸化ストレスにより促進される変性状態である。これは、酸化ストレスが中心的な役割を果たす初期段階の神経変性疾患または状態に相当する。
シュワン細胞およびＨＵＶＥＣで認められる分子効果が、アポトーシスに対する保護；血管新生の誘導；細胞の増大した遊走および移動；増大した細胞生存率および生存；ならびに細胞分化の誘導における、ＬＭＷ−ＤＳの役割を裏付けることは細胞型から明らかである。重要な分子経路の分析により、ニューロンにおいて、ＬＭＷ−ＤＳがミトコンドリアに対する酸化ストレス効果を低減し、アミロイドβおよびレビー小体などの神経変性関連分子を低減するはずであることが示された。
したがって、ＨＵＶＥＣ細胞モデルからの結果は、ＬＭＷ−ＤＳが細胞損傷に対し保護でき、その後の脳卒中などの損傷または患部組織中で新規血管の発生を促進することを示す。シュワン細胞からの結果は、ＬＭＷ−ＤＳが、ＴＢＩまたは神経変性疾患に起因するなどの疾患または損傷神経系中の細胞消失に対し保護できることを示す。
重要な分子経路の分析により、シュワン細胞では、ＬＭＷ−ＤＳがミトコンドリアに対する酸化ストレスの効果を低減し、グルタミン酸の取り込みを増大したことが示された。シュワン細胞での結果は、ＬＭＷ−ＤＳが、疾患および損傷神経系中の酸化ストレスおよび／またはグルタミン酸興奮毒性により発生する細胞消失に対して保護できることを示し、これは、例えば、神経変性疾患およびＴＢＩに該当する。
特に重要なのは、シュワン細胞により示されたように、ＬＭＷ−ＤＳがグリア細胞のグルタミン酸取り込みを増大させたことである。しかし、ＬＭＷ−ＤＳは、ニューロンによるグルタミン酸の産生を変えなかった。グルタミン酸がＬＴＰ、すなわち、学習と記憶にとって必要なので、これは重要である。従って、グルタミン酸は、上述の処理における正常な神経伝達にとって必要であるので、ＬＭＷ−ＤＳがニューロンによるグルタミン酸の産生を変化させなかったことは有益である。しかし、損傷または瀕死細胞から放出される増大したレベルのグルタミン酸は、ＬＭＷ−ＤＳの効果により、周囲グリア細胞により効率的に取り込まれる。従って、グリア細胞中でＬＭＷ−ＤＳにより引き起こされたグルタミン酸トランスポーターの活性化により、神経間隙由来の損傷または瀕死ニューロンにより放出されたグルタミン酸が効果的に除去された。これが、次に、グルタミン酸が興奮毒性を呈するのを防ぎ、さらなるニューロンの損傷を防いだ。したがって、ＬＭＷ−ＤＳは、グリア細胞による潜在的に有害な神経毒性量のグルタミン酸の取り込みを誘導した。
従って、ニューロンのこの結果は、酸化ストレスによる二次的組織損傷を低減し、修復を促進し、変性関連タンパク質蓄積を低減することによる、神経変性疾患、障害および状態におけるＬＭＷ−ＤＳの潜在的な治療有用性を確証する。
まとめると、結果は、一般的にアポトーシスに対する保護および特に神経細胞死に対する保護、血管新生の誘導、細胞の増大した遊走および移動、増大した細胞生存率および生存、細胞分化の誘導、酸化ストレスの効果の低減、グルタミン酸興奮毒性の低減およびアミロイドβおよびレビー小体などの変性関連タンパク質生成物の産生の低減におけるＬＭＷ−ＤＳの役割を裏付ける。
細胞接着は、ニューロンおよびシュワン細胞において主に影響を受け、ＬＭＷ−ＤＳが細胞剥離および移動を促進した。ＨＵＶＥＣでは、細胞接着は影響を受けなかった。細胞接着に対する効果は、主として、メタロプロテイナーゼ型酵素の発現によるが、他の接着性分子の調節もこの効果に寄与する。
この知見は、実施例５で認められるように、ＬＭＷ−ＤＳの抗瘢痕形成効果も説明する。この結果は、組織リモデリングを支援し、損傷組織中の線維形成性（瘢痕形成）シグナルを遮断する分解酵素を活性化するＬＭＷ−ＤＳにより、実施例５で認められた抗瘢痕形成効果が媒介されることを示唆する。
病理学的反応としての瘢痕形成は、ＴＧＦβにより促進される。ＴＧＦβは、免疫細胞の接着、細胞の活性化、細胞運動、細胞の凝集、線維症およびＴＧＦβの誘導を生じさせる１７１個の分子の大きな相互接続ネットワークを誘導する。ＬＭＷ−ＤＳの投与は、免疫細胞接着、細胞の活性化、細胞の凝集、線維症およびＴＧＦβの自己活性化におけるＴＧＦβ誘導効果を完全に消滅させた。シュワン細胞でＴＧＦβにより促進される分子ネットワークに対するＬＭＷ−ＤＳのこれらの不活化効果はまた、ＴＧＦβが活性化されている場合でも、すなわち、過剰のＴＧＦβの存在下でも、認められる。
遺伝子発現データにより示された効果は、細胞接着に関して実施例１で認められた表現型の変化、ならびに分化および細胞生存に対する表現型の変化を裏付ける。
従って、これらの調査により、ＬＭＷ−ＤＳがニューロン生存、分化および最終的に修復を促進し得る場合、神経変性疾患、障害および状態のために、血行再建の促進、二次的組織損傷の低減、および修復促進による、虚血後の状態におけるＬＭＷ−ＤＳの潜在的治療有用性が確証される。
ＬＭＷ−ＤＳにより調節された遺伝子の上流制御因子の分析は、ヘパリンの効果と同様に、ＬＭＷ−ＤＳが細胞上の既存の成長因子の効果を高めたことを示した。仮説として、ＬＭＷ−ＤＳが成長因子分子に結合し、それらの受容体への結合を促進するということである。
この仮説はまた、ＨＵＶＥＣ中のＬＭＷ−ＤＳ誘導差次的遺伝子発現（正常ＣＭは既にヘパリンを含む）は、シュワン細胞中（正常ＣＭはヘパリンを含まなかった）より相対的に少なかったという観察により裏付けられる。
作用機序はまた、成長因子が存在する場合には、実施例３で認められるＴＢＩの急性段階でＬＭＷ−ＤＳが効果的であるが、初期の修復の試みが既に減少している場合に、後期段階では効果が少ないのはなぜかを説明する。
従って、ＬＭＷ−ＤＳの少なくとも一部の治療効果は、ＬＭＷ−ＤＳにより増幅される既存の修復機序に依存する可能性がある。このような場合では、組織に十分な修復潜在能力がある場合、いずれの神経変性状態においても、ＬＭＷ−ＤＳは、疾患または状態の初期段階で投与されることが一般に推奨される。
細胞代謝を保護することにより、ＬＭＷ−ＤＳは、虚血性、酸化性または外傷性損傷により細胞が進行的に失われる多くの変性状態の有用な保護治療薬であり得る。このような変性状態の非限定的例には、脳卒中、ＡＬＳ、ＭＳ、認知症、ＴＢＩ、ＳＣＩ、網膜損傷、ＡＤ、などが例示される。ＬＭＷ−ＤＳは、残っている内因性修復機序を高めながら、それらの損傷組織を支援して、一部の失われた機能を回復し得る。
ＬＭＷ−ＤＳの抗瘢痕形成作用は、線維増殖性（瘢痕形成）状態の治療への使用可能性を示す。これらには、例えば、緑内障、増殖性硝子体網膜症、ＳＡＨ、脳および脊椎外傷性傷害、侵襲的外科手術、術後癒着、腱板損傷、火傷、再建手術、潰瘍状態（糖尿病）などが含まれる。実験結果は、線維増殖性（瘢痕形成）状態の発生の防止およびこのような線維増殖性（瘢痕形成）状態での既発症線維化瘢痕の分解の両方におけるＬＭＷ−ＤＳの役割を裏付ける。
実施例５
本実験は、ＬＭＷ−ＤＳの緑内障眼上の線維柱帯網（ＴＭ）瘢痕形成に対する効果を調査した。
材料および方法
試験計画
形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）の反復週２回の前房内（ＩＣ）への注射をして眼圧（ＩＯＰ）を高めることにより、成体雄スプラーグドーリーラットラットに緑内障を誘発した。ＩＯＰの持続的増加（２週後）が網膜神経節細胞の死をもたらす（３０〜４０％）。実験の開始から、１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳを毎日の皮下注射により投与し、対照と比較して、ＲＧＣ保護を評価した。
群１：ｎ＝１２匹のラット；２４個の眼 ＩＯＰ＋ＩＣ ＴＧＦ−β（週２回２８日間）０日目〜２８日目＋１４日目〜２８日目にデキストラン硫酸の毎日の皮下投与。
群２：ｎ＝８匹のラット；１６個の眼 ＩＯＰ＋ＩＣ ＴＧＦ−β（週２回２８日間）０日目〜２８日目＋１４日目〜２８日目にビークル（生理食塩水）の毎日の皮下投与。
群３：ｎ＝８匹のラット；８個の眼 ＩＯＰ＋無処理（未損傷眼）および８個の眼 ＩＯＰ＋ＩＣ ＰＢＳを毎日２８日間。
測定評価項目
・ＩＯＰを０日目〜２８日目の試験期間を通して週２回測定；
・免疫組織化学的検査で、２８日目に脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ（Ｂｒｎ３ａ）に対し免疫反応性の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を計数（ＲＧＣ生存）；
・免疫組織化学的検査で、ラミニンおよびフィブロネクチンにより、２８日目に群１および２で線維柱帯網中の瘢痕形成を評価；
・前眼部光干渉断層撮影（ＯＣＴ）画像化を２８日目に実施し、ＲＧＣ軸索を含む網膜神経線維層の角度および厚さを検査；
・体重、２８日目。
動物および手術
１６匹の８〜１０週齢の雄１７５〜２００ｇ スプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を、食物と水を自由に摂取させ、１２時間の明暗周期下で収容し、これらの実験に使用した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｔで、１９８６年にＡｎｉｍａｌ Ａｃｔ（ＵＫ）で規定された内務省ガイドラインおよび眼科および視覚研究での動物使用に関するＡＲＶＯ声明（ｔｈｅ ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って手術を実施した。全ての眼の外科手術およびＩＯＰ測定を１．５ｌ／分の流速で２〜５％のイソフルラン／９５％Ｏ２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｓｔｏｋｅ，ＵＫ）を使った吸入麻酔下で行った。全てのラットの術後の健康を詳細に監視した。
０日目に、１５°の使い捨て型の刃を用いて、自作の使い捨て型無菌ガラスマイクロピペット（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）で形成したトンネルを通して、反復して週２回の（週２回）２８日間にわたる活性ヒト組換えＴＧＦβ１（５ｎｇ／μｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）の３．５μｌのＩＣ注射（毎月曜と木曜）を可能とする１カ所の自己閉鎖創を角膜を通して両眼の前眼房中へ形成した。
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）用の組織調製
漸増濃度のＣＯ２に曝露することによりラットを屠殺し、１００ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心的に潅流して、血液を洗い流した後、１００ｍｌのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）ｐＨ７．４でさらなる灌流を行った。ＩＨＣ用に切開した眼をＰＢＳ中の４％ＰＦＡ中、４℃で２時間の浸漬により後固定をした後、漸増濃度のスクロース溶液（１０％、２０％および３０％のスクロース含有ＰＢＳ；全て、Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫから入手）中に４℃でそれぞれ２４時間浸漬することにより凍結保護し、その後、剥離モールド容器（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）中の最適切断温度の包埋剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）中に包埋した。最適切断温度包埋剤中に浸漬した眼を粉砕ドライアイス中で急速凍結後、−８０℃で貯蔵し、しばらくした後で、Ｂｒｉｇｈｔクリオスタットミクロトーム（Ｂｒｉｇｈｔ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて、視神経乳頭を通る傍矢状面で−２２℃で１５μｍ厚に切断した。切片を正に帯電したスライドガラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＵＳＡ）上に取付け、３７℃で２時間放置し、−２０℃で貯蔵した。
免疫組織化学的検査
凍結切片を３０分間放置して解凍した後、ＰＢＳ中で３ｘ５分洗浄し、続けて、０．１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）で２０分間の透過処理を行った。切片を０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＰＢＳ中の０．３％のツイーン２０（全てＳｉｇｍａから入手）中で３０分間ブロッキングし、一次抗体（表１１）と共に一晩インキュベートした後、ＰＢＳ中で３ｘ５分洗浄し、二次抗体（表１１）と共に室温（ＲＴ；２０〜２５℃）で１時間インキュベートした。その後、切片をＰＢＳ中で３ｘ５分洗浄し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で取り付けた。二次抗体単独と共にインキュベートした対照組織切片を全てネガティブ染色した（図示せず）。
Figure 2020533281
免疫組織化学的検査の定量化
免疫蛍光染色後、切片をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２ 落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ）で観察し、各抗体に対し同じ暴露時間を使ってＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｃを用いて画像を取得した。ＩＨＣを以前に記載した方法により定量化した（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｃｏｒｉｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｌｏｓｓ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｉｂｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃａｒｒｅｄ ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１５，５６（６）：３７４３−３７５７）。手短に説明すると、ＴＭ線維症の定量化に使用する関心領域をＴＭ内の全ての眼／治療に対する同じ予め決められた大きさの象限により定義し、ＥＣＭ沈着をこの定義したＴＭの象限内で定量化し、規格化バックグラウンド閾値を超える％免疫蛍光ピクセルをＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を使って計算した。各抗体に対し、ＴＭの領域中の輝度の閾値レベルを無傷の非治療眼切片を用いて設定し、ピクセル強度の試験群分析に対する基準レベルを定義した。画像をランダム化した番号に割付けて、査定者による定量化の間の治療群の盲検化を確保した。
網膜切片中のＲＧＣの定量化のために、ＲＰＢＭＳ＋／ＤＡＰＩ＋ ＲＧＣを、視神経の両側の神経細胞層からの２５０μｍの直線部由来の１５μｍ厚の網膜の傍矢状切片で計数した。対照および治療群中の各眼由来の４つの網膜切片を定量化した。画像をランダム化した番号に割付けて、査定者による定量化の間の治療群の盲検化を確保した。
統計
全ての統計解析をＳＰＳＳ２０（ＩＢＭ、ＵＳＡ）を用いて実施した。正規分布試験を実施し、治療を比較するための最も適切な統計解析を決定した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５で決定した。＞２群比較±ＳＥＭに対してスチューデントｔ検定または一元配置分散分析を用いてＴＭ線維症の有意差を検定し、平均±ＳＥＭとしてテキストで示すか、または図表により表示する。
結果
ＬＭＷ−ＤＳ治療は、免疫反応性ラミニン（図２０）およびフィブロネクチン（図２１）の角度の有意に低減した（Ｐ＜０．００１ ラミニン；Ｐ＜０．０１ フィブロネクチン）レベルからも明らかなように、ＴＭ瘢痕形成を有意に減弱させた。
考察
デキストラン硫酸治療ラットの角度におけるラミニンおよびフィブロネクチンのレベルは有意に小さかったので、ＬＭＷ−ＤＳ治療は、既発症ＴＭ瘢痕要素の分解を誘導した。このことから、このＬＭＷ−ＤＳの抗瘢痕形成効果は、薬物が既発瘢痕の分解に使用でき、それにより、例えば、線維性状態の組織リモデリングおよび創傷治癒を可能とすることを示す。
実施例６
アルツハイマー病（ＡＤ）は、患者およびその家族にとって壊滅的であり、かなりの経済的資源を必要とし、健康管理システムに対する大きな負担である。症状の小さな、多くの場合一時的である改善を与えることを試みる現在の戦略により、患者に対しわずかな治療効果を提供できるが、多くの患者は全く効果を得ることができない。疾患修飾薬は治療を変容させ、市場に深く浸透する可能性がある。
ＡＤの病理学的特徴は、βアミロイドタンパク質から構成される老人斑の存在である。βアミロイドタンパク質は、オリゴマー化して生理学的神経伝達に悪影響を与え、加えて、神経毒性複合体を形成する。オリゴマーβアミロイドタンパク質の有害な作用の一部は、細胞性プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）とのタンパク質−タンパク質相互作用を介して媒介される。従って、このタンパク質−タンパク質相互作用を抑制する薬理学的戦略は、疾患修飾治療薬としての可能性を有する。
この試験は、ＡＤを治療する治療薬としての疾患修飾潜在力を明らかにするために、ＬＭＷ−ＤＳのオリゴマーβアミロイドとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を抑制する能力を調査した。
材料および方法
化学薬品および抗体
ストレプトアビジンＨＲＰをＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手；βアミロイド−（１−４２）−ビオチンをＩｎｎｏｖａｇｅｎから入手；正常なヒト細胞性プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）をＭｅｒｃｋから入手；ＴＭＢをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手；１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）をＳｉｇｍａから入手；抗アミロイドβ抗体クローン６Ｅ１０をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手；抗マウスＨＲＰをＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手；平均Ｍ．Ｗ．＞５００，０００Ｄａのデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳＳ）をＳｉｇｍａから入手；デキストラン（Ｍ．Ｗ．４５０，０００〜６５０，０００Ｄａ）をＳｉｇｍａから入手；ＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＳｉｇｍａから入手。
アミロイドβオリゴマーの調製
βアミロイドのオリゴマー化を以前の方法（Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１，６７０：１３−３２；Ａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５，１３４：６１１−６１７）に基づいて最適化した。手短に説明すると、アミロイドβをＨＦＩＰ中で１．０ｍＭの最終濃度に溶解し、保護超音波処理に供し、ＨＦＩＰを注意深く蒸発させた。生成したペプチドフィルムを密閉容器中、−２０℃で貯蔵した。使用前に、ペプチドフィルムをＤＭＳＯ中で５．０ｍＭの最終濃度にゆっくり溶解し、１０分間の保護超音波処理に供した。オリゴマーを調製するために、ＤＭＳＯ溶液を氷冷ＤＭＥＭ培地中で、１００μＭの最終濃度に希釈し、３７℃で１６時間インキュベートした（βアミロイド−ビオチン）。モノマーを調製するために、ＤＭＳＯ溶液を氷冷１８ＭＯｈｍ水中で、１００μＭの最終濃度に希釈し、直ちに使用した。
アミロイドβモノマーおよびオリゴマーの特定
アミロイドβのモノマーまたはオリゴマーの生成に最適化した調製物を５％のＳＤＳ含有還元剤不含ゲルサンプルバッファー中で可溶化した。還元剤不含ＭＥＳランニングバッファーを用いて、タンパク質を１５％ビス−トリスゲル上で測定した。ゲルをＰＶＤＦに移し、１０％脱脂乳中でブロッキングし、その後、抗アミロイドβ抗体と共に、４℃で一晩インキュベートし、抗マウスＨＲＰで、続けてＥＣＬで展開し、フィルムに露光した。
オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化するＥＬＩＳＡ法
ＰｒＰＣをカーボネートコーティング緩衝液中で１０ｘコーティング量に希釈し（１００μｌ；ウェル当たり５００ｎｇのＰｒＰＣの最終量）、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに塗布した。その後、プレートを密閉し、４℃で一晩置いた。コートしたプレートをＰＢＳ−ツイーン２０中で注意深く洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡでブロッキングした。プレートを洗浄し、１００μｌのオリゴマーアミロイドβ−ビオチンペプチド調製物（最終濃度２００ｎＭ）を試験化合物と注意深く混合し、各ウェルに添加した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、洗浄して、ストレプトアビジン−ＨＲＰで処理し、さらに洗浄後、ＴＭＢで発色させた（２ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止させた）。吸光度を４５０ｎｍで３０分以内に読み取った。
全ての条件を３回繰り返した実施した。ＰｒＰＣに対するアミロイドβ−ビオチン結合をＡｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５，１３４：６１１−６１７により記載のように計算した。
カーブフィッティング
フローティング４パラメータロジスティック式に対し反復カーブフィッティングにより定量的薬理学的分析を実施した。
結果
アミロイドβモノマーおよびオリゴマーの生成
最適化プロトコルによりアミロイドβモノマーおよびオリゴマーを調製し、オリゴマー化に成功して、Ａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５，１３４：６１１−６１７による記載の結果に比べて、より高い見かけの効率を得た（図２２）。
オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の定量的査定のためのＥＬＩＳＡ法の最適化
Ａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５，１３４：６１１−６１７により報告された方法は、ＥＬＩＳＡプレート上のウェル当たりのコートされるタンパク質の量を明記しなかったが、ウェル当たり５０ｎｇのＰｒＰＣを暗示した。しかし、この量をプレートにコートした場合、オリゴマーアミロイドβの特異的結合シグナルが明らかではなかった。より効果的なコーティング緩衝液を用いて実験を繰り返したが、それでもシグナルは明確にはならなかった。シグナルの欠如、およびＭａｘｉｓｏｒｐプレートの既知の理論的最大結合能力（６００〜６５０ｎｇ／ｃｍ２）は、コーティングレベルが最適ではないことを示した。従って、ＰｒＰＣコーティングレベルの範囲を評価した；ウェル当たり２５０ｎｇのＰｒＰＣでは、オリゴマーアミロイドβの比較的小さなシグナルが識別できたが、ウェル当たり５００ｎｇのＰｒＰＣのコーティングレベルで、より大きく、再現性のあるシグナルが明確であった。本コーティング量は、発表された文献（Ｂｅｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２００３，１２６：２０６５−２０７３： ５００ｎｇ／ｗｅｌｌ使用；Ｎａｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１８９：１５４０−１５４４：２５０ｎｇ／ｗｅｌｌ使用、Ｓｏｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，３１：２３３８−２３４６：様々なプリオンタンパク質構築物を１．０ μｇ／ｗｅｌｌ使用）と一致する。
オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用と競合するＤＳＳＳおよびＬＭＷ−ＤＳの能力
ＤＳＳＳは、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用に関し、ＬＭＷ−ＤＳと同様に濃度依存形式で競合した（図２３；表１２）。定量的薬理学的分析は、付き合わせて比較した場合のレベルでの競合結合およびヒル係数の明らかな差異にもかかわらず、ＬＭＷ−ＤＳはＤＳＳＳと同等の全体的親和性を呈することを示し、２つの化合物間の異なる相互作用を示唆する（図２３；表１２）。ＤＳＳＳとＬＭＷ−ＤＳとは対照的に、デキストランは、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用に関し、明確には競合できなかった。
Figure 2020533281
考察
高分子量デキストラン硫酸（ＤＳＳＳ）は、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用と、低μｇ／ｍｌ範囲の有効濃度で競合すると以前に報告された（Ａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５，１３４：６１１−６１７）。本調査では、方法の最適化により、Ａｉｍｉらの調査に比べて、明らかにより多くの比率のオリゴマーアミロイドβが生成された。タンパク質−タンパク質相互作用ＥＬＩＳＡの最適化により、より大きな程度の特異的タンパク質−タンパク質相互作用が得られ；競合のより大きなダイナミックレンジにより競合化合物による相互作用の定量的薬理学的分析が容易になった。従って、本調査は、Ａｉｍｉらによる報告の調査に比べて改善を示す。
ＤＳＳＳとＬＭＷ−ＤＳは、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用に関し、競合する同等の親和性を示し、それぞれ、０．６２±０．０７および０．４２±０．１６μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を得た。競合の性質のヒル分析は、ＤＳＳＳに関連する相対的に高いヒル係数に比較して、ＬＭＷ−ＤＳがより浅い競合曲線を呈することを示し、これは、ＤＳＳＳとＬＭＷ−ＤＳとの間の異なる薬理学的作用に関する証拠を提供する。
従って、ＬＭＷ−ＤＳは、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用に関し競合し、それにより、このタンパク質−タンパク質相互作用を防止する、または少なくとも抑制するために使用され得る。ＬＭＷ−ＤＳで認められるこの効果は、オリゴマーアミロイドβとＰｒＰＣとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を含むＡＤなどの疾患および障害に対し潜在能力を有する。
実施例７
この試験の目的は、ラットにおける閉鎖性頭部びまん性重度ＴＢＩ（ｓＴＢＩ）の実験モデルにより形成された生化学的、分子的および組織解剖学的損傷に対するＬＭＷ−ＤＳの潜在的神経保護効果を評価することであった。本調査では、結果は、治療動物の脳組織抽出物中の、エネルギー代謝、酸化／ニトロソ化ストレス、抗酸化剤および遊離アミノ酸に特有の低分子量代謝物のＨＰＬＣ分析により得た。
材料および方法
ｓＴＢＩの誘導および薬物投与プロトコル
３００〜３５０ｇ体重の雄ウィスターラット（ｎ＝１６０）をこの試験で使用した。それらに、制御された環境中で標準的実験食および水を自由に与えた。
動物は、麻酔剤混合物として、３５ｍｇ／ｋｇ体重のケタミンおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ体重のミダゾラムを筋肉内注射により受けた。Ｍａｒｍａｒｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９４，８０：２９１−３００により設定された、「重量落下」衝撃加速度モデルに従って、びまん性ｓＴＢＩを導入した。このモデルは、びまん性軸索損傷を引き起こし、ヒトのびまん性ＴＢＩの物理的および機械的特性を再現できる。
重度ＴＢＩを２ｍの高さから、機械的な力を脳に均一に分布させるためにヘルメット（歯科用セメントを用いて頭蓋骨上に予め固定された金属ディスク）で保護されたラットの頭上への４５０ｇの重りの落下により誘導した。ラットを特殊容器中に挿入した特殊ポリウレタン発泡体のベッド上に腹臥位で置き、この発泡体は位置エネルギー（機械的な力に由来する）の大部分を消散させ、脊椎損傷を生じ得る衝撃後の動物の全ての反発を防止する。
頭蓋骨骨折、発作、鼻出血した、またはその衝撃に生存しなかったラットは、調査から除外された。ＴＢＩ誘導の２または７日後に、ラットは再度麻酔され、その後直ちに屠殺された。これらの時点は、最悪の生化学的障害（２日）に一致し、またはわずかに損傷した脳の場合には、完全代謝回復（７日）と一致する。
薬物治療は、０．５ｍｌのＬＭＷ−ＤＳ（Ｔｉｋｏｍｅｄ）の皮下注射により、３種の異なる濃度（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ体重）で、以下に記載の概略プロトコルに従って投与した。
シャム手術された動物は、ＴＢＩを除いて麻酔の同一手順を受け、対照群として使用された。
実験計画
ＴＢＩ後の２つの異なる時点での３種の異なる濃度のＬＭＷ−ＤＳの有効性の試験を実施するために、この試験で使われるラットを４群に分けた。この後で指定されるように、各群では、以下に記載の手順に従って、動物を代謝分析のための特定の治療に供し、他の動物を組織形態学的試験用とした。
群１
対照（ｎ＝１２）生化学的評価専用とした。追加の４匹の動物を組織形態学的試験用に使用した。この群のラットの合計：ｎ＝１６
群２
ｓＴＢＩの導入を受け、薬理学的治療をしないラットを次の亜群に分けた：
１．ｓＴＢＩの導入を受け、ＴＢＩの２日後に屠殺された１２匹の動物
２．ｓＴＢＩの導入を受け、ＴＢＩの７日後に屠殺された１２匹の動物
各亜群に対する４匹の追加のラットを組織形態学的試験用に使用した。この群のラットの合計：ｎ＝３２。
群３
ｓＴＢＩの導入を受け、ＴＢＩの３０分後にＬＭＷ−ＤＳの単回投与を受け、ＴＢＩの２日後に屠殺されたラット。動物を次の亜群に分けた：
１．ｓＴＢＩの導入を受け、１ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの治療を受けた１２匹の動物
２．ｓＴＢＩの導入を受け、５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの治療を受けた１２匹の動物
３．ｓＴＢＩの導入を受け、１５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの治療を受けた１２匹の動物
各亜群に対する４匹の追加のラットを組織形態学的試験用に使用した。この群のラットの合計：ｎ＝４８。
群４
ｓＴＢＩの導入を受け、ＴＢＩの３０分後にＬＭＷ−ＤＳの単回投与を受け、ＴＢＩの７日後に屠殺されたラット。動物を次の亜群に分けた：
１．ｓＴＢＩの導入を受け、１ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの治療を受けた１２匹の動物
２．ｓＴＢＩの導入を受け、５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの治療を受けた１２匹の動物
３．ｓＴＢＩの導入を受け、１５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの治療を受けた１２匹の動物
各亜群に対する４匹の追加のラットを組織形態学的試験用に使用した。この群のラットの合計：ｎ＝４８。
群５
ｓＴＢＩの導入を受け、ＴＢＩの３０分、３日および５日後に最大投与量のＬＭＷ−ＤＳ（１５ｍｇ／ｋｇ体重）の反復投与を受け、ＴＢＩの７日後に屠殺されたラット（ｎ＝１２）。４匹の追加のラットを組織形態学的試験用に使用した。この群のラットの合計：ｎ＝１６。
生化学的および遺伝子発現分析のための脳組織処理
代謝物の損失を最小化するために、全ての動物でインビボ骨切除開頭術を麻酔の間に実施した。ラット頭蓋骨を注意深く取り除き、脳を露出させ、矢状溝に沿って素早く切り、２つの半球を分離した。生化学的分析専用とした半球を液体窒素中で予冷したアルミニウムトングにより凍結クランプし、液体窒素中に浸漬した。凍結クランプ手順を導入して、組織の凍結を加速し、それにより、代謝物損失の可能性を最小化した。
分子生物学分析専用の残りの半球を５〜１０倍量の、ＲＮＡを安定化し、ＲＮＡを分解から保護するＲＮＡ安定化溶液であるＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に入れた。脳試料を４℃で一晩貯蔵し、溶液を組織に完全に浸透させた。
代謝物分析用の組織ホモジナイゼーションを次のように行った。湿重量（ｗ．ｗ．）測定後、凍結した半球を７ｍｌの氷冷の窒素飽和した、ＣＨ３ＣＮ＋１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４０（３：１；ｖ：ｖ）からなる沈殿溶液中に入れ（１：１０ ｗ／ｖ）、ホモジナイゼーションをＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーセット（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２４，０００ｒｐｍ／分で実施した。２０，６９０ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離後、透明上清を保存し、ペレットに分取量の１０ｍｌのＫＨ２ＰＯ４を補充し、上述のように再度ホモジナイズし、組織からの水相の完全回収を行うために、−２０℃で一晩保存した。２回目の遠心分離を実施し（２０，６９０ｘｇ、４℃で１０分間）、上清を前に得たものと合わせて、２倍の量のＨＰＬＣグレードＣＨＣｌ３と共に強く撹拌することにより抽出し、上記のように遠心分離した。上層の水相（水溶性低分子量化合物を含む）を収集し、さらに２回のクロロホルム洗浄に供し（この手順は、緩衝化組織抽出物から全ての有機溶媒および任意の脂質可溶性化合物の除去を可能とする）、体積を最終的に水性の１０％組織ホモジネートを得るように１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４０で調節し、アッセイするまで−８０℃で保存した。
エネルギー代謝物、抗酸化剤および酸化／ニトロソ化ストレスバイオマーカーのＨＰＬＣ分析
一定分量の各脱タンパク組織試料を０．４５μｍのＨＶ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通して濾過し、それ自体のガードカラムを備えたＨｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ−１８、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ粒径カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｄａｎｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）に充填し（２００μｌ）、高感度ダイオードアレイ検出器（５ｃｍ光路フローセルを備えた）を有し、２００〜３００ｎｍの波長で設定された、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｄａｎｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）からなるＨＰＬＣ装置に連結した。データ取得および分析は、ＨＰＬＣ製造業者から提供されたＣｈｒｏｍＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアパッケージを用いて、ＰＣで実施した。
組織エネルギー状態、ミトコンドリア機能、抗酸化剤に関連する代謝物、および酸化／ニトロソ化ストレスに特有の代謝物（下に記載）を、わずかに修正した既存のイオン対ＨＰＬＣ法に従って、１回のクロマトグラフィーを行って分離した（Ｌａｚｚａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３；３２２：５１−５９；Ｔａｖａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５；３８：９９７−１００８）。組織抽出物のクロマトグラフ実験での目的の化合物の帰属および計算を、適切な波長（２０６、２３４および２６０ｎｍ）を用いて、ピークの保持時間、吸収スペクトルおよび面積を、既知の濃度を有する新たに調製した超純度標準混合物のクロマトグラフィー実験のピークのものと比較することにより実施した。
化合物のリスト：シトシン、クレアチニン、ウラシル、β−プソイドウリジン、シチジン、ヒポキサンチン、グアニン、キサンチン、ＣＤＰ−コリン、アスコルビン酸、ウリジン、亜硝酸塩（ＮＯ２）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、イノシン、尿酸、グアノシン、ＣＭＰ、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、硝酸塩（ＮＯ３）、ＵＭＰ、ＮＡＤ＋、ＡＤＯ、ＩＭＰ、ＧＭＰ、ＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）、ＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ）、ＡＭＰ、ＧＤＰ−グルコース、ＵＤＰ、ＧＤＰ、ＮＡＤＰ＋、ＡＤＰ−リボース、ＣＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤＨ、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、マロニル−ＣｏＡ、コエンザイムＡ（ＣｏＡ−ＳＨ）、アセチル−ＣｏＡ、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）。
遊離アミノ酸およびアミノ基含有化合物のＨＰＬＣ分析
一級遊離アミノ酸（ＦＡＡ）およびアミノ基含有化合物（ＡＧＣＣ）（以下に記載）の同時測定を、試料とＯＰＡとＭＰＡの混合物のプレカラム誘導体化を用いて、Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１７；２１：５３０−５４２；Ａｍｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２；３５９：２０５−２１６に記載のように実施した。手短に説明すると、２５ｍｍｏｌ／ｌのＯＰＡ、１％のＭＰＡ、２３７．５ｍｍｏｌ／ｌのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．８から構成される誘導体化混合物を毎日調製し、オートサンプラーに導入した。試料（１５μｌ）のＯＰＡ−ＭＰＡを用いた自動化プレカラム誘導体化を、２４℃で実施し、その後のクロマトグラフ分離のために、２５μｌの誘導体化混合物をＨＰＬＣカラム（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ−１８、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ粒径、サーモスタットで２１℃に温調）に充填した。グルタミン酸を正確に定量化するために、誘導体化手順およびその後の注入の前に、脱タンパク脳抽出物をＨＰＬＣグレードＨ２Ｏで２０倍に希釈した。２種の移動相（移動相Ａ＝２４ｍｍｏｌ／ｌのＣＨ３ＣＯＯＮａ＋２４ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４＋１％のテトラヒドロフラン＋０．１％のトリフルオロ酢酸、ｐＨ６．５；移動相Ｂ＝４０％ＣＨ３ＯＨ＋３０ ＣＨ３ＣＮ＋３０％Ｈ２Ｏ）を用いて、１．２ｍｌ／分の流量で、適切な段階勾配を使って、ＯＰＡ−ＡＡおよびＯＰＡ−ＡＧＣＣの分離を実施した。
全脳抽出物のクロマトグラフ実験でのＯＰＡ−ＡＡおよびＯＰＡ−ＡＧＣＣの帰属および計算を、３３８ｎｍの波長で、ピークの保持時間および面積を、既知の濃度を有する新たに調製した超純度標準混合物のクロマトグラフィー実験のピークのものと比較することにより実施した。
ＦＡＡおよびＡＧＣＣ化合物のリスト：アスパラギン酸（ＡＳＰ）、グルタミン酸（ＧＬＵ）、アスパラギン（ＡＳＮ）、セリン（ＳＥＲ）、グルタミン（ＧＬＮ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、グリシン（ＧＬＹ）、トレオニン（ＴＨＲ）、シトルリン（ＣＩＴＲ）、アルギニン（ＡＲＧ）、アラニン（ＡＬＡ）、タウリン（ＴＡＵ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン（ＴＹＲ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、Ｌ−シスタチオニン（Ｌ−Ｃｙｓｔａｔ）、バリン（ＶＡＬ）、メチオニン（ＭＥＴ）、トリプトファン（ＴＲＰ）、フェニルアラニン（ＰＨＥ）、イソロイシン（ＩＬＥ）、ロイシン（ＬＥＵ）、オルニチン（ＯＲＮ）、リシン（ＬＹＳ）。
組織形態学的分析のための脳組織プロセッシング
十分な麻酔後に、Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７，７（１）：９１８９に記載のようにしてラットを経心的に潅流した。手短に説明すると、開胸術を実施し、ヘパリン溶液を門脈に投与して全ての手術中の血液凝固を回避した。その後、右心房切開を実施し、還流ニードルを上行大動脈中に進めた。１００ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で灌流を実施し、血液を洗い流した後、ＰＢＳ溶液中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）ｐＨ７．４でさらなる灌流を行った。頭蓋骨からの迅速な取り出し後、各脳を１００ｍｌのＰＢＳ溶液中の４％ＰＦＡ、４℃で２時間の浸漬により後固定をした。漸増スクロース溶液（１０％、２０％および３０％）で富化したＰＢＳ中に全脳を２４時間浸漬することにより凍結保護を得た後、剥離モールド容器（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）中の最適切断温度の包埋剤（ＯＣＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）中に埋め込んだ。ＯＣＴ中に浸漬した脳を粉砕ドライアイス中で急速に凍結した後、−８０℃で貯蔵した。
統計解析
群をまたがる差異は、スチューデントのｔ検定により推定した。０．０５未満の両側ｐ値のみを、統計的に有意であると見なした。
結果
ｓＴＢＩの２日後に記録した生化学的データのまとめ
測定した脳エネルギー代謝に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１３は、リン酸化された高エネルギープリンおよびピリミジン化合物に関する値をまとめたものである。三リン酸ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ）の枯渇がｓＴＢＩにより引き起こされ、これに付随して、ＡＤＰの増大、およびＵＤＰグルコース（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）およびＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ）のＮ−アセチル化誘導体の増大があったことが特に明らかである。
損傷後のこの時点で、ＬＭＷ−ＤＳによる治療は、細胞エネルギー代謝の改善では部分的に効果的であるにすぎず、高エネルギーリン酸塩（ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰ）の有意に高い値は、試験した３種全ての薬物の投与量で記録された。ＵＴＰおよびＡＤＰの濃度に対しては、効果が認められなかった。ラットのＴＢＩ後の４８時間は、脳代謝にとって重要な時点であり、ミトコンドリアの品質管理の変化を含むミトコンドリアの機能の最大の変化に一致することは想起する価値がある。このＴＢＩの実験モデルでは、この時点は、脳代謝の回復または非回復が決定される一種の「ターニングポイント」であると考え得る。

Figure 2020533281
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表１３〜３１では、太字は、対照に対し有意差を示す（ｐ＜０．０５）；太字下線は、ＴＢＩに対し有意差を示す（ｐ＜０．０５）；および太字イタリックは、対照およびＴＢＩの両方に対し有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
ニコチンコエンザイムに対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
酸化型（ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）および還元型（ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）ニコチンコエンザイムの値を表１４にまとめている。この表１４はまた、計算されたＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の無次元値を報告する。これは、代謝が解糖またはミトコンドリアの酸化的リン酸化にどれほど依存しているかを評価するのに好適する。
以前に本明細書で観察したように、ｓＴＢＩは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比率を低減させた。この時点で、ＬＭＷ−ＤＳによる治療は試験した最大投与量（１５ｍｇ／ｋｇ体重）でのみ効果的で、ニコチンコエンザイムプールの有意な保護をもたらし、解糖の方向への代謝スイッチを回避し、それにより、全体的により良好なミトコンドリア機能を間接的に示唆する。
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ＣｏＡ−ＳＨ誘導体に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１５は遊離ＣｏＡ−ＳＨおよびＣｏＡ−ＳＨ誘導体に関するデータを報告する。特にアセチル−ＣｏＡは、ミトコンドリア代謝がトリカルボン酸サイクル（ＴＣＡサイクル）の正確な機能動作を可能とし、それにより、電子伝達鎖（ＥＴＣ）に対する連続的な電子供給を確保するために重要な化合物である。ＴＣＡは、還元型コエンザイム（ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２）の生成のための主要な細胞周期であり、還元型コエンザイムは、それらの電子をそれぞれミトコンドリア複合体ＩおよびＩＩに移すことによる、ＥＴＣおよび酸化的代謝のための燃料である。全ての化合物、とくにアセチル−ＣｏＡは、ｓＴＢＩにより有意に影響を受ける。この化合物の部分回復は、５または１５ｍｇ／ｋｇ体重の場合に観察された。ＬＷＭ−ＤＳは損傷の３０分後に動物に投与された。
Figure 2020533281
抗酸化剤および酸化／ニトロソ化ストレスバイオマーカーに対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１６は、主要水溶性脳抗酸化剤（アスコルビン酸およびＧＳＨ）および酸化（ＭＤＡ）およびニトロソ化ストレス（−ＮＯ２ −および−ＮＯ３ −）のバイオマーカーの濃度を示す。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、ＲＯＳ媒介脂質過酸化の結果としての膜リン脂質の不飽和脂肪酸の分解が起源である。亜硝酸塩（−ＮＯ２ −）および硝酸塩（−ＮＯ３ −）は、一酸化窒素（ＮＯ）代謝の安定な最終生成物であり、これは、病的状態下で誘導型の一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）により過剰に生成され、ＲＯＳとの反応を介して活性窒素種（ＲＮＳ）を生ずる。
衝撃の２日後に、ｓＴＢＩ導入ラットで両方の水溶性抗酸化剤の２５〜４５％の減少が起こった。結果としての酸化／ニトロソ化ストレスの痕跡の増大も同様に記録された。ＬＷＭ−ＤＳの投与は、アスコルビン酸および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）両方の濃度を有意に回復し、脳組織亜硝酸塩および硝酸塩の減少が明らかであった。これらの効果は、１５ｍｇ／ｋｇ体重が使用された場合により顕著であった。

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脱リン酸化プリンおよびピリミジンに対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１６で報告された大部分の化合物は、プリンおよびピリミジンヌクレオチドの分解経路が起源であり、細胞エネルギー代謝と間接的に結びついている。ｓＴＢＩを導入されたラットでは、ＣＤＰコリンを除き、全てのこれらの化合物はより高い脳中濃度であり、これらのほとんどは、薬物投与によりよい方向に影響を受けた。

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Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
ＮＡＡは、哺乳動物脳の最も豊富なＮ−アセチル化アミノ酸であり、その濃度は、ヒトの神経伝達物質グルタミン酸の濃度とほぼ等しい。ＮＡＡの生物学的役割がまだ完全には明らかにされていないにもかかわらず、我々は、前臨床および臨床試験の両方で、ＴＢＩがＮＡＡ濃度を減らし、頭部損傷後のその経時変化は、ＡＴＰの経時変化を反映することを明確に示した。特に我々は、ｓＴＢＩがＮＡＡ恒常性の不可逆的変化を引き起こすこと、ＮＡＡが脳エネルギー代謝の良好な代用マーカーであること、および脳振盪後のアスリートのＮＡＡレベルの減少および回復が症状除去よりも遙かに遅いことを見出した。従って、ＮＡＡは、ＴＢＩの研究に特別な関連性を有する。
ｓＴＢＩラットの全脳ＮＡＡ中で、衝撃の２日後に４０％の減少が観察された（図２４）。ＬＭＷ−ＤＳは、５または１５ｍｇ／ｋｇ体重を投与した場合に、ＮＡＡ濃度に対し有益な効果をもたらした。対照よりも有意に低いが、２種の薬物投与量のいずれか１つを投与されたラットのＮＡＡは、ｓＴＢＩラットで見出されるものより有意に高い値であり、最大のＮＡＡレベルは最大投与量のＬＭＷ−ＤＳを受けたラットで見出された。
神経伝達に関与する遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１７に記載の化合物は、神経伝達に直接的に（ＧＬＵ、ＧＡＢＡ）または間接的に（ＧＬＮ、ＡＳＰ、ＡＳＮ、ＧＬＹ、ＳＥＲ、ＴＨＲ、ＡＬＡ）関与するアミノ酸である。特に、ＧＬＵは、主要な興奮性アミノ酸であり、ＧＡＢＡによりその作用が打ち消される。ＧＬＵの興奮毒性は、ＳＥＲ、ＧＬＹ、ＴＨＲおよびＡＬＡにより調節され、これは、ニューロンおよび星状膠細胞を含むＧＬＵ−ＧＬＮサイクルの機能に関連している。以前の試験（１６）で示したように、我々は、ほとんどのこれらのアミノ酸が損傷の２日後のｓＴＢＩラット中で増加したことを見出した。ＬＭＷ−ＤＳの単回投与による動物の治療は、５または１５ｍｇ／ｋｇ体重の薬物を皮下に注入した場合、部分的に効果的であった。ほとんどの場合、これらの種々の化合物の値は、未治療ｓＴＢＩ動物群で認められた値よりも有意に良好であったが、対照の値よりも良好でなかった。

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メチルサイクルに関与する遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１８で報告された遊離アミノ酸は、細胞代謝でメチルドナーとして作用する化合物の恒常性を調節する所謂メチルサイクルに関与する、または、遊離−ＳＨ基を有する唯一のアミノ酸であるシステインの形成に関与する。重度頭部外傷は、この重要な代謝経路の主要な動作主体の有意な変化を引き起こした。メチオニンの回復は、試験したいずれかの投与量のＬＷＭ−ＤＳにより行われた。薬物治療は、その他のアミノ酸の正常化に関し部分的に効果的であった。Ｌ−シスタチオニン（Ｌ−Ｃｙｓｔａｔ）の変化に対する補足説明は、衝撃の７日後の対応する表中に示される。

Figure 2020533281
一酸化窒素（ＮＯ）の生成に関与する遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表１９は、３つのアイソフォーム：内皮ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）、神経ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）、誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）で存在する酵素ファミリーである一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）により触媒される反応で、ＮＯの生成に直接関与する遊離アミノ酸の濃度を示す。最後のアイソフォーム（ｉＮＯＳ）は、ニトロソ化ストレスに関与するものである。一酸化窒素は、アルギニン（ＡＲＧ）が部分的酸化を受けている窒素原子を提供し、シトルリン（ＣＩＴＲ）およびＮＯを生成する複雑な反応を介して生成される。ｓＴＢＩの２日後の動物は、安定なＮＯ最終生成物の亜硝酸塩および硝酸塩の増加を示すデータ（表１５）と一致して、Ａｒｇの減少およびＣＩＴＲの増加の同時発生を示した。ＬＭＷ−ＤＳの投与は、１５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が使用された場合に、特に効果的であった。
Figure 2020533281
長鎖遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２０で報告された遊離アミノ酸は、細胞がＴＣＡサイクルを補充するために使用するα−ケト酸の生成に有用な炭素骨格源である。これらの化合物の内で、イソロイシン（ＩＬＥ）のみがｓＴＢＩにより有意に影響を受け、薬物治療を受けたラット中で回復された。
Figure 2020533281
浸透圧調節物質として作用する遊離アミノ酸および芳香族遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２１にまとめた結果は、ｓＴＢＩが全てのこれらの遊離アミノ酸の濃度の増大をもたらすことを明確に示す。特に、タウリン（ＴＡＵ）の増大は、最も重要な脳浸透圧調節物質の１つのレベルを上昇させることにより、細胞浮腫の影響を弱める試みを示唆し得る。別々に、芳香族アミノ酸の増大は、神経伝達物質セロトニン（トリプトファンから形成）およびドーパミン（最初にフェニルアラニンからの、次にチロシンからの生体内変化により生成）生合成の低減を示唆し得る。衝撃後のこの時点ではＬＭＷ−ＤＳ投与の顕著な効果は観察されなかった。

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ｓＴＢＩの７日後に記録した生化学的データのまとめ
測定した脳エネルギー代謝に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２２は、リン酸化された高エネルギープリンおよびピリミジン化合物に関する値をまとめたものである。ｓＴＢＩの７日後に、三リン酸ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ）の枯渇の回復が観察されなかったことが特に明らかである。ＡＭＰおよびＡＤＰの同時増大が、ＵＤＰ誘導体（ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃおよびＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ）の濃度の有意な変化に付随して起こった。一般に、損傷後のより長い時間は、ｓＴＢＩにより誘導される生化学的、代謝的、分子的変化を悪化させることを特徴とする場合が多いことは強調されるべきである。
損傷後のこの時点で、薬物投与量が１ｍｇ／ｋｇ体重より高い場合に、ＬＭＷ−ＤＳによる治療により脳エネルギー代謝の全般的改善がより明確にもたらされた。１５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＷＭ−ＤＳの反復投与を受けたラットでさえ、対照との差異が記録されたが、有意により高い値のヌクレオチド三リン酸が薬物治療動物で認められた。特に該当するのは、ｓＴＢＩ動物に対する薬物投与の漸増用量により継続的に増大したＡＴＰ／ＡＤＰ比率の計算無次元値（これは、ミトコンドリアのリン酸化能力の良好な指標と見なされる）の漸進的回復である。

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薬物効果が薬物投与量に関連することをより良く示すために、我々は、図２５に図表によりＡＴＰに関する結果を報告した。ＡＴＰの増大が、何らかの形で投与量に関連すること、および試験したいずれの投与量でも、薬物投与が最も重要な高エネルギーリン酸の有意な増大をもたらしたことを観察できる。
ニコチンコエンザイムに対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
酸化型（ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）および還元型（ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）ニコチンコエンザイムの値を表２３にまとめている。この表２３はまた、計算されたＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の無次元値を報告する。これは、代謝が解糖またはミトコンドリアの酸化的リン酸化にどれほど依存しているかを評価するのに適する。
以前に観察したように、ニコチンコエンザイムおよびＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比率の極めて大きな減少が損傷の７日後のｓＴＢＩラットで記録された。最低の投与量を除いて、ＬＭＷ−ＤＳによる治療は、ニコチンコエンザイムの濃度の有意な改善をもたらした。特に、単回および反復投与の１５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳにより、対照動物中で測定して、ＮＡＤ＋レベルを正常化でき、適正なＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比率を回復できた。
Figure 2020533281
ＣｏＡ−ＳＨ誘導体に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２４は遊離ＣｏＡ−ＳＨおよびＣｏＡ−ＳＨ誘導体に関するデータを報告する。５または１５ｍｇ／ｋｇ体重の投与（この両投与量は、単回および反復投与としてのもの）の顕著な好ましい効果がＣｏＡ−ＳＨおよびアセチル−ＣｏＡの両方に対し検出され、ＴＣＡサイクルの機能動作のためのはるかに好ましい代謝条件を示唆する。
Figure 2020533281
抗酸化剤および酸化／ニトロソ化ストレスバイオマーカーに対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２５は、主要水溶性脳抗酸化剤（アスコルビン酸およびＧＳＨ）および酸化（ＭＤＡ）およびニトロソ化ストレス（−ＮＯ２ −および−ＮＯ３ −）のバイオマーカーの濃度を示す。衝撃の７日後に、ｓＴＢＩ導入ラットで両方の水溶性抗酸化剤の濃度の回復が起こらなかった。酸化／ニトロソ化ストレスの極めて高いレベルの痕跡も同様に記録された。ＬＷＭ−ＤＳの単回および反復投与の効果は、アスコルビン酸および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）両方の濃度の回復に特に有益で、脳組織亜硝酸塩および硝酸塩の減少が明らかであった。これらの効果は、５ｍｇ／ｋｇ体重が使用された場合にも顕著であった。

Figure 2020533281
薬物効果が薬物投与量に関連することのより良好な理解のために、我々は、図２６および２７に図表によりアスコルビン酸およびＧＳＨに関する結果を報告した。
脱リン酸化プリンおよびピリミジンに対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２６で報告された大部分の化合物におけるさらなる悪化は、プリンおよびピリミジンヌクレオチドの分解経路が起源であり、細胞エネルギー代謝と間接的に結びついていることが、ｓＴＢＩを導入されたラットの損傷の７日後に観察された。ほとんどのこれらの化合物は、薬物投与によりよい方向に影響を受けた。

Figure 2020533281
Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
前述したように、ｓＴＢＩはＮＡＡ恒常性の不可逆的変化を生じさせる。この試験でも、我々は、ｓＴＢＩの７日後、全脳ＮＡＡが、対照ラットでの測定値より約５０％低い（図２８参照）ことを見出した。興味深いことに、漸増用量の単回ＬＭＷ−ＤＳ投与または試験した最大投与量の反復投与を受けたラットで、ＮＡＡの用量依存性増大が検出された。
神経伝達に関与する遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２７に記載の化合物は、神経伝達に直接的に（ＧＬＵ、ＧＡＢＡ）または間接的に（ＧＬＮ、ＡＳＰ、ＡＡＳＮ、ＧＬＹ、ＳＥＲ、ＴＨＲ、ＡＬＡ）関与するアミノ酸である。ほとんどのこれらのアミノ酸は、対照と比較した場合、損傷の７日後のｓＴＢＩラットで、まだより多かった。この表から、ＬＭＷ−ＤＳの投与は、特に１５ｍｇ／ｋｇ体重の薬物を、単回または反復投与で皮下に注入した場合に効果的であったことが、明らかである。特に該当するのは、Ｇｌｕの正常化であり、従って、ｓＴＢＩ後に過剰Ｇｌｕ放出によりＬＭＷ−ＤＳは興奮毒性の原因を消滅させることができる。
Figure 2020533281
メチルサイクルに関与する遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２８に示すように、所謂メチルサイクルまたはシステインの形成に関与する遊離アミノ酸のレベルは、対照の対応する値と比較した場合、衝撃の７日後のｓＴＢＩラットでまだ異なっていた。最大投与量のＬＷＭ−ＤＳ（単回または反復投与の両方）を受けた動物でＭＥＴの増大が観察された。損傷の２日後で既に観察されたように、これらの薬物レベルは、Ｌ−シスタチオニン（Ｌ−Ｃｙｓｔａｔ）の有意な増大をもたらした。この化合物は、システイン（ＣＹＳ）の生成の中間体であるので、Ｌ−Ｃｙｓｔａｔの増大は結果としてＣＹＳの増大をもたらし得ることを仮定することが想定できる。ＣＹＳの測定は、二級アミンおよびＣＹＳと反応する蛍光化合物であるＦ−ＭＯＣを用いた追加の誘導体化を伴う特定の追加のＨＰＬＣアッセイを必要とすることは想起する価値がある。
Figure 2020533281
一酸化窒素（ＮＯ）の生成に関与する遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表２９は、ＮＯの生成に直接関与する遊離アミノ酸の濃度を示す。ｓＴＢＩの７日後の動物は、安定なＮＯ最終生成物の亜硝酸塩および硝酸塩を示すデータ（表１５）と一致して、ＡＲＧの減少およびＣＩＴＲの増加の同時発生を示した。ＬＭＷ−ＤＳの投与は、５または１５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量（単回および反復）が使用された場合に、特に効果的であった。
Figure 2020533281
長鎖遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
細胞がＴＣＡサイクルを補充するために使用するα−ケト酸の生成に有用な炭素骨格源である表３０で報告された遊離アミノ酸、および目的の薬物で治療された任意のその他の群の動物は、ｓＴＢＩの７日後に事実上正常であった。
Figure 2020533281
浸透圧調節物質として作用する遊離アミノ酸および芳香族遊離アミノ酸に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果
表３１にまとめた結果は、ｓＴＢＩが損傷の７日後にタウリン（ＴＡＵ）の濃度の増大をもたらしたことを明確に示す。ＬＭＷ−ＤＳ投与は、タウ濃度を正常化し、芳香族アミノ酸の増大をもたらした。
Figure 2020533281
考察
ＴＢＩは、最もよくある神経変性疾患の１つであり、西欧諸国で４５歳未満の死亡の主要な原因である。その発生率は増加中であり、２０２０年までに、世界保健機関は、ＴＢＩが世界中で最も大きな身体障害の原因となると推定している。ＴＢＩに関連する症状の重症度に依存して（グラスゴー昏睡尺度で評価して）、ＴＢＩの３つの異なるタイプ：軽度ＴＢＩ（ｍＴＢＩ）、中等度ＴＢＩおよび重度ＴＢＩ（ｓＴＢＩ）を特定することができる。ｍＴＢＩ：ｓＴＢＩの発生の比率は約２２：１であると計算されている。都合の悪いことに、ＴＢＩの結果は、多くの場合肢体不自由であり、場合により、認知、物理的および精神社会的な機能の永久的または一時的障害に繋がり、関連する意識状態の減少または変化が伴う。従って、患者は、適切に機能し、社会的関係を維持する重要ないくつかの状況、主として自活する能力において影響を受ける。
ＴＢＩは、脳細胞中で重度のミトコンドリアの機能不全を引き起こす生化学的、代謝的および分子的変化のカスケードを特徴とする、ほとんど予測できない二次的侵襲を直接的に誘導する一次侵襲（脳組織に対し作用する衝撃力）からなる複雑な病理過程であると考えられる。損傷の重症度は、脳組織に作用する衝撃力に依存し、実際に、この事象は、軸索および神経繊維の伸長を誘導し、生化学的および分子事象を誘発し、これは、臨床症状の暴動と同時ではない。
現在まで、死亡率を減らし、ＴＢＩ患者の回復を改善する十分な薬理学的治療は存在しない。推定薬理学的治療は通常、脳組織代謝に対し発生する生化学的および分子的変化、ならびに、組織損傷に厳密に相関付けられた血管および血流変化などの一次侵襲により誘発される神経代謝性カスケードを妨げるそれらの能力に関し試験される。
以前の試験は、ＴＢＩの重症度と、嫌気性代謝、ミトコンドリア機能障害、活性酸素（ＲＯＳ）および窒素種（ＲＮＳ）の産生増大ならびに興奮性アミノ酸放出の増強に関連するエネルギー欠損との間の有意な相関を実証した。さらに、Ｎ−アセチル化アミノ酸Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）は、インビボでエネルギー代謝の状態を監視するために有用な、信頼性の高い代用バイオマーカーである。実際に、ミトコンドリアのＮＡＡ生合成は、高い間接的なエネルギー消費を有するので、ＮＡＡ脳内濃度の変化は、エネルギー代謝に関連するいくつかのパラメーター（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、アセチル−ＣｏＡ、ＣｏＡ−ＳＨおよびＮＡＤ＋）およびミトコンドリアのリン酸化能力（ＡＴＰ／ＡＤＰ）に関連するいくつかのパラメーターの恒常性の変化に密接に関連している。
大きなパネルの損傷後の異なる時間にｓＴＢＩの導入を受けたラットの脳代謝物に対する漸増用量のＬＭＷ−ＤＳの効果を評価するために行われた試験は、この化合物の投与が脳代謝の全般的回復をもたらすことを立証した。
ＬＭＷ−ＤＳは、治療を受けていないｓＴＢＩ動物の極めて不均衡なミトコンドリア関連エネルギー代謝の回復に効果的であり、三リン酸プリンおよびピリミジンヌクレオチドの濃度に対し好ましい効果があった。特に、衝撃の７日後のＡＴＰレベルは、対照の値より１６％だけ低く、一方、ｓＴＢＩラットでは３５％の低下が認められた（表２１および図２５）。注意すべきは、同じ時点のＬＭＷ−ＤＳで治療した動物のＮＡＡ濃度は、対照の値より１６％だけ低く、一方、ｓＴＢＩ動物はこの化合物の４８％低い値を示した。この知見は、再度、ＮＡＡの恒常性と適切なミトコンドリアのエネルギー代謝との間の厳密な関連を強く確証し、ミトコンドリアの機能動作に対し、好ましい方向に作用できる薬理学的介入の重要性を強調するものである。
ＬＭＷ−ＤＳ投与により得られた脳代謝の全般的回復はまた、ニコチンコエンザイムおよび遊離ＣｏＡ−ＳＨおよびＣｏＡ−ＳＨ誘導体の代謝を伴った。これは、薬物治療動物は、ｓＴＢＩに罹患しているにもかかわらず、適切な酸化還元反応を確保し、ＴＣＡサイクルの良好な機能動作を可能とする準正常コエンザイムを有していたことを意味する。
上述の脳代謝の改善は、他の顕著な薬物効果、すなわち、ＧＬＵ興奮毒性の消滅の確実な一因であった。さらに、薬物は、硫黄含有アミノ酸に影響を与えた。おそらく、この効果は、Ｓ原子を含む薬物分子に関連するのであろう。この原子のバイオアベイラビリティの増大は、これらのアミノ酸の生合成で純増加をもたらした。その内の１つの（ＭＥＴ）は、メチル化反応および所謂メチルサイクルで極めて重要である。
この試験で記録されたさらに好ましい効果は、ＬＭＷ−ＤＳの投与を受けたｓＴＢＩラットにおける抗酸化剤の増加および酸化／ニトロソ化ストレス生化学的痕跡の減少であった。機能障害性ミトコンドリアは、ＲＯＳおよびＲＮＳ両方の主要な細胞内発生源であるので、この現象はミトコンドリア機能の正常化と極めて関連さえしているであろう。ＬＭＷ−ＤＳの効果がｓＴＢＩの２日後よりもｓＴＢＩの７日後にさらに明らかになったことは、妥当なことである。これは、薬物投与による脳代謝の全般的回復が一過性の現象ではないことを強く示唆する。また、現在の実験条件下では、薬物効果は多くの場合、投与される投与量に関係し、１５ｍｇ／ｋｇ体重の反復投与であっても、同じ投与量の単回投与に類似であることが多いことは強調する価値がある。即ち、薬物の投与の反復が必ずしも有利とは限らなかった。
この矛盾した結果は、次記により説明可能かもしれない：１）ｓＴＢＩが血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊を誘導することはよく知られている；２）ＢＢＢ変化／破壊の期間中のＬＭＷ−ＤＳの脳組織による取り込みが極めて好ましい可能性がある；３）ポイント２）の仮説が正しい場合には、損傷の３０分後に実施される投与は、ＢＢＢがまだ開いている／変化している間に行われた可能性がある；４）ポイント２）および３）の仮説が正しい場合には、損傷後早期の投与は、ＢＢＢがまだ開いている／変化している場合、化合物の脳コンパートメント内の通過が容易になり、薬物が、ＢＢＢの正常化を含む脳代謝および機能に対するその有益な効果を誘発できる可能性がある；５）ポイント４）で報告したことが正しい場合には、ｓＴＢＩ後の３０分での１５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＭＷ−ＤＳの投与が、脳代謝正常化の開始に加えて、さらに、ＢＢＢの閉止をもたらし、それにより、反復薬物投与プロトコルによる追加の効果を得る可能性を制限するように、第２（３日目の）および第３（５日目）の薬物投与がさらなる有意な脳コンパートメント内への通過に好ましくない条件下で行われたことを意味する。
実施例８
この試験では、ＬＭＷ−ＤＳは、ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルでのプロファイリングを特徴とする。ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）パネルは、人体の種々の態様をインビトロ形式でモデル化するように設計されたヒト一次細胞ベースシステムからなる。ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネル（表３２）の１２種のシステムは、種々のヒト疾患状態をモデル化する広範な一連のシステム全体にわたり偏りのない方法で試験薬剤の特性評価を可能とする。ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）システムは、ヒト組織または病的状態で天然で発生する関連シグナル伝達ネットワークを捕捉するために加えられたサイトカインまたは成長因子などの刺激物質を含む、健康なヒトドナー由来の１種または複数の一次細胞型で構築される。血管生物学は、Ｔｈ１（３Ｃシステム）およびＴｈ２（４Ｈシステム）の両方の炎症性環境、ならびに動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭ３Ｃシステム）に特異的なＴｈ１炎症状態でモデル化される。追加のシステムは、単球促進Ｔｈ１炎症（ＬＰＳシステム）またはＴ細胞刺激（ＳＡｇシステム）、マクロファージ活性化により促進される慢性Ｔｈ１炎症（IＭｐｈｇシステム）および胚中心で起こるＢ細胞のＴ細胞依存性活性化（ＢＴシステム）を含む全身性免疫応答の状況を再現する。ＢＥ３Ｃシステム（Ｔｈ１）およびＢＦ４Ｔシステム（Ｔｈ２）は、肺の気道炎症を表し、ＭｙｏＦシステムは、筋線維芽細胞−肺組織リモデリングをモデル化する。最後に、皮膚生物学は、Ｔｈ１皮膚炎症をモデル化するＫＦ３ＣＴシステムおよび創傷治癒をモデル化するＨＤＦ３ＣＧＦシステムで扱われる。
各試験薬剤は、個別のシステム環境中のタンパク質バイオマーカー読み値の変化から作成されるシグネチャーＢｉｏＭＡＰ（登録商標）プロファイルを生成する。バイオマーカー読み値（システム当たり７〜１７）が治療的および生物学的関連性で選択され、疾患転帰または特定の薬物効果が予測され、既知作用機序（ＭｏＡ）を有する試薬を用いて検証される。各読み値は、タンパク質を検出する免疫ベース法、例えば、ＥＬＩＳＡ、または増殖および生存率を測定する機能アッセイにより定量的に測定される。ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）読み値は多様であり、細胞表面受容体、サイトカイン、ケモカイン、マトリックス分子および酵素を含む。全体で、ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルは、特定のＢｉｏＭＡＰ（登録商標）システムの生理学的状況内で起きる生物学的変化を捕捉する１４８種のバイオマーカー読み値を含む。
材料および方法
ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルで４種の濃度のＬＭＷ−ＤＳ（１５０ｎＭ、４４０ｎＭ、１．３μＭ、４μＭ）をＥｕｒｏｆｉｎｓで調べた。
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳのための方法
初期継代（継代４またはそれ以前）でＢｉｏＭＡＰシステム中のヒト一次細胞を使用し、細胞培養条件に対する適応を最小限にし、生理学的シグナル伝達応答を維持する。全ての細胞は、複数のドナー（ｎ＝２〜６）のプール由来であり、商業的に購入し、製造者の推奨条件に従って取り扱った。／Ｍｐｈｇシステムに加える前に、ＣＤ１４＋単球由来のヒト血液をマクロファージにインビトロで分化させる。略語を以下のように使用する：ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびトール様受容体（ＴＬＲ）。
各システムで使用した細胞型および刺激物質は以下の通り：３Ｃシステム［ＨＵＶＥＣ＋（ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）］、４Ｈシステム［ＨＵＶＥＣ＋（ＩＬ−４およびヒスタミン）］、ＬＰＳシステム［ＰＢＭＣおよびＨＵＶＥＣ＋ＬＰＳ（ＴＬＲ４リガンド）］、ＳＡｇシステム［ＰＢＭＣおよびＨＵＶＥＣ＋ＴＣＲリガンド］、ＢＴシステム［ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＰＢＭＣ＋（α−ＩｇＭおよびＴＣＲリガンド）］、ＢＦ４Ｔシステム［気管支上皮細胞およびＨＤＦｎ＋（ＴＮＦαおよびＩＬ−４）］、ＢＥ３Ｃシステム［気管支上皮細胞＋（ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）］、ＣＡＳＭ３Ｃシステム［冠状動脈平滑筋細胞＋（ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）］、ＨＤＦ３ＣＧＦシステム［ＨＤＦｎ＋（ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＢＢ）］、ＫＦ３ＣＴシステム［ケラチノサイトおよびＨＤＦｎ＋（ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＴＧＦβ）］、ＭｙｏＦシステム［分化肺筋線維芽細胞＋（ＴＮＦαおよびＴＧＦβ）］および／Ｍｐｈｇシステム［ＨＵＶＥＣおよびＭ１マクロファージ＋ザイモサン（ＴＬＲ２リガンド）］。
システムは、単一細胞型または共培養システム由来である。接着細胞型は、９６または３８４ウェルプレートでコンフルエンスまで培養され、続けて、ＰＢＭＣを添加する（ＳＡｇおよびＬＰＳシステム）。ＢＴシステムは、ＰＢＭＣと同時培養されたＣＤ１９＋ Ｂ細胞からなり、ＢＣＲ活性化因子および低レベルのＴＣＲ刺激で刺激される。ＤＭＳＯ（小分子；最終濃度≦０．１％）またはＰＢＳ（生物製剤）中で調製された試験薬剤が、刺激の１時間前に、示した濃度で添加され、２４時間または次に示す時間（４８時間、ＭｙｏＦシステム；７２時間、ＢＴシステム（可溶物読み値）；１６８時間、ＢＴシステム（分泌ＩｇＧ））、培養物中に残存する。各プレートは、各システムに好適する薬物対照（例えば、１．１μＭのレガシーコントロール試験薬剤コルヒチン）、陰性対照（例えば、非刺激条件）およびビークル対照（例えば、０．１％ＤＭＳＯ）を含む。直接ＥＬＩＳＡを用いて細胞関連および細胞膜標的のバイオマーカーレベルを測定する。上清由来の可溶性因子は、ＨＴＲＦ（登録商標）検出、ビーズベースマルチプレックスイムノアッセイまたは捕捉ＥＬＩＳＡを用いて定量化される。細胞増殖および生存率（細胞傷害性）に与える試験薬剤の明白な有害作用は、接着細胞の場合はスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染色により、懸濁細胞の場合はａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）還元により検出される。増殖アッセイでは、個々の細胞型がサブコンフルエンスで培養され、各システムの最適化時点（４８時間：３ＣおよびＣＡＳＭ３Ｃシステム；７２時間：ＢＴおよびＨＤＦ３ＣＧＦシステム；９６時間：ＳＡｇシステム）で測定される。接着細胞に対する細胞傷害性は、示した時点で、ＳＲＢ（２４時間：３Ｃ、４Ｈ、ＬＰＳ、ＳＡｇ、ＢＦ４Ｔ、ＢＥ３Ｃ、ＣＡＳＭ３Ｃ、ＨＤＦ３ＣＧＦ、ＫＦ３ＣＴ、および／Ｍｐｈｇシステム；４８時間：ＭｙｏＦシステム）により、および懸濁細胞のａｌａｍａｒＢｌｕｅ染色（２４時間：ＳＡｇシステム；４２時間：ＢＴシステム）により測定される。
データ解析
試験薬剤処理試料中のバイオマーカー測定値を対照試料の平均値（同じプレート由来の少なくとも６つのビークル対照）で除算し、比率を生成した後、ｌｏｇ１０変換する。有意性予測エンベロープは、以前に採取したビークル対照データを９５％信頼区間で用いて計算される。
プロファイル分析
ビークル対照に対して同一方向に２つ以上の連続した濃度変化が有意性エンベロープの外側にあり、２０％を超える効果量（｜ｌｏｇ１０比｜＞０．１）を有する少なくとも１つの濃度を有する場合、バイオマーカー活性をアノテートする。これらの活性がいくつかのシステムで増大するが、他のシステムでは減少する場合、バイオマーカーの主要な活性は調節されていると呼ばれる。総タンパク質レベルが５０％を超えて減少する場合（ＳＲＢのｌｏｇ１０比またはａｌａｍａｒＢｌｕｅレベル＜−０．３）、細胞傷害性状態が記録され、Ｘ軸の上に細い黒色矢印で示される。細胞傷害性が３つ以上のシステムで検出される場合、化合物は広範な細胞傷害性を有すると見なされる。検出可能な広範な細胞傷害性を有する試験薬剤の濃度は、バイオマーカー活性アノテーションおよび下流のベンチマーキング、類似性探索およびクラスター分析から除外される。抗増殖性効果は、より低い密度で播種した細胞からのＳＲＢまたはａｌａｍａｒＢｌｕｅ ｌｏｇ１０比値＜−０．１により定義され、Ｘ軸の上に灰色矢印で示される。細胞傷害性および抗増殖性の矢印は、プロファイルアノテーションのための示した閾値に適合する１つの濃度を必要とするに過ぎない。
ベンチマーク分析
両方のプロファイルに対する読み値が、有意性エンベロープの外側にあり、同一方向で２０％を超える効果量である場合、共通のバイオマーカー読み値がアノテートされる。１つのプロファイルが、効果量＞２０％を有する有意性エンベロープの外側の読み値を有し、もう一つのプロファイルの読み値がエンベロープの内側にあるか、または逆方向である場合、分化バイオマーカーがアノテートされる。特に指定のない限り、試験薬剤およびベンチマーク薬剤の両方の最高非細胞傷害性濃度がベンチマークオーバーレイ分析中に含まれる。
相似解析
両方のプロファイルに対する読み値が、有意性エンベロープの外側にあり、同一方向で２０％を超える効果量である場合、共通のバイオマーカー読み値がアノテートされる。検出可能な細胞傷害性を有する３つ以上のシステムを有する試験薬剤の濃度は、相似解析から除外される。検出可能な細胞傷害性を有する１〜２つのシステムを有する試験薬剤の濃度は、試験薬剤の最高濃度と一致するデータベースのオーバーレイと共に、類似性探索分析に含められる。これに、検出可能な細胞傷害性およびそれぞれのデータベースマッチを有するシステムを含まない試験薬剤の次の最高濃度の追加のオーバーレイが続く。Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルで実施した化合物のＢｉｏＭＡＰ（登録商標）プロファイル間の類似性の程度を決定するために、我々は、試験した他の尺度（ピアソンおよびスピアマンの相関係数を含む）と比較した基準薬剤の機序分類における向上した性能を有するコンビナトリアル手法であるカスタム類似性尺度（ＢｉｏＭＡＰ Ｚ−Ｓｔａｎｄａｒｄ）を開発した。この手法は、データポイントの数、システム、活性バイオマーカー読み値およびＢｉｏＭＡＰ（登録商標）プロファイルの特徴であるバイオマーカー読み値変化の振幅の変動をより効率的に説明する。ピアソンの相関係数（ｒ）は、最初に、関係の方向と大きさの類似性に基づく２つのプロファイル間の線形連関を測定をするように生成される。ピアソンの相関は、いずれかのバイオマーカー活性の大きさにより影響を受け得るので、システム当たり加重平均Ｔａｎｉｍｏｔｏ尺度を、堅牢性の少ないシステムの提示不足を説明するためのフィルターとして用いる。Ｔａｎｉｍｏｔｏ尺度は、バイオマーカー活性の振幅を考慮しないが、システム当たりの基準で、同一性および読み値の数が荷重に対し共通であるかどうかを取り扱う。実数値Ｔａｎｉｍｏｔｏ尺度は、最初に、各プロファイルを単位ベクトル（例えば、
Figure 2020533281
 ）、に正規化することにより計算し、その後、次の式：
Figure 2020533281
 、を適用する。式中、ＡおよびＢは、２つのプロファイルベクトルである。次に、それは、次の計算：
Figure 2020533281
 でシステム加重平均実数値Ｔａｎｉｍｏｔｏ尺度に組み込まれる。計算は、ｉ番目のシステム（Ｔｉ）および各ｉ番目のシステム（Ｗｉ）のそれぞれの重みに対する実数値Ｔａｎｉｍｏｔｏスコアを使用する。Ｗｉは、各システムに対し、次式：
Figure 2020533281
 で計算され、ｌｒは比較される２つのプロファイルからの比率の最大絶対値である。ピアソンの相関係数（ｒ）≧０．７の場合、基準化合物の最適性能に基づいて、プロファイルは、機構的に関連する類似性を有すると判定される。最終的に、Ｆｉｓｈｅｒのｒ ｔｏ ｚ変換を用いて、ｚスコアを計算し、次式：
Figure 2020533281
 のようにショートテール分布を正規分布に変換する。その後、共通の読み値（ＣＲ）の数に対し調節するＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｚ−Ｓｔａｎｄａｒｄが次式：
Figure 2020533281
 に従って生成される。より大きなＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｚ−Ｓｔａｎｄａｒｄ値は、より高い信頼水準に対応し、これは、類似性結果をランク付けするために使用される尺度である。
クラスター分析
クラスター分析（機能類似性マップ）は、ペアワイズ相関分析の結果を使用して、薬剤プロファイルの「近似度」を多次元的空間から二次元に投影する。この分析中に生成される薬剤プロファイルの機能的クラスタリングは、各薬剤の各濃度に対するプロファイルのペアワイズ比較のためのピアソン相関値を使用し、その後、ペアワイズ相関データを多次元的尺度構成法に供する。ピアソンの相関係数（ｒ）≧０．７で類似性であるプロファイルは線により連結される。相互にクラスター形成しない薬剤は、機構的に異なると解釈される。この分析は、３つ以上の試験薬剤を含むプロジェクトに対し実施される。細胞傷害性濃度は、クラスター分析から除外される。
機構ヒートマップ分析
機構ヒートマップ分析は、試験化合物および全ての化合物濃度およびコンセンサス機構にわたるバイオマーカー活性の比較を可能とする１９のコンセンサス機構の可視化を提供する。機構ヒートマップ分析で使われる合成コンセンサスプロファイルは、構造上別々の化学的クラス由来の複数の化合物の平均の代表的ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）プロファイルである。プロファイルは、選択された全てのプロファイル（種々の濃度の複数薬剤）に対し各バイオマーカー評価項目値を平均化し、コンセンサス機構プロファイルを構築することにより計算された。バイオマーカー活性は、それらが有意性エンベロープの外側でビークル対照に比較して発現を有する場合、ヒートマップ中でコンセンサス機構および化合物に着色している。赤色は、増大したタンパク質発現を表し、青色は、低減した発現を表し、白色は不変であるか、またはフィルタリング条件内のレベルを示す。色の黒っぽい陰は、ビークル対照に比べてバイオマーカー活性のより大きな変化を表す。機構ヒートマップは、ＲおよびＲのためのｇｐｌｏｔパッケージを用いて作成した。
アッセイ許容基準
ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）アッセイは、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルを構成するシステムで試験される薬剤に対するＢｉｏＭＡＰ（登録商標）プラットフォームにより生成されたマルチパラメーターデータセットを含む。アッセイは、各システムに適した薬物対照（例えば、レガシーコントロール試験薬剤コルヒチン）、陰性対照（例えば、非刺激条件）およびビークル対照（例えば、ＤＭＳＯ）を含む。ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）アッセイは、プレートベースであり、データ許容基準は、プレート性能（ビークル対照ウェルの％ＣＶ）およびそのシステムのヒストリカルコントロール全体にわたるシステム性能の両方に依存する。最初にヒストリカル陽性対照の基準データセットから１％偽陰性ピアソンカットオフを設定することにより、ＱＡ／ＱＣピアソン検定を実施する。陽性対照基準データセット中のシステムバイオマーカー読み値の全てのプロファイルを通してプロセスを繰り返し、各プロファイルとデータセット中の残りのプロファイルの平均との間のピアソン値を計算する。１％偽陰性カットオフの決定に使用したピアソン値の総数は、基準データセット中に存在するプロファイルの合計数である。計算された全値の１つのパーセンタイルでのピアソン値は、１％偽陰性ピアソンカットオフである。実験プレートの陰性対照または薬物対照プロファイルと、基準データセット中のヒストリカルコントロールプロファイルの平均との間のピアソン値がこの１％の偽陰性ピアソンカットオフを超える場合、システムは検定に合格する。各個別のシステムがピアソン検定を通過し、全てのプロジェクトプレートの９５％が％ＣＶ＜２０％を有する場合、全体のアッセイが受け入れられる。
結果
ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルは、表３２に示す１２種の個別のＢｉｏＭＡＰヒト一次細胞ベース共培養システムを含んだ。

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ビークル対照に対して同一方向に変化した２つ以上の連続した濃度が、９５％有意性エンベロープの外側にあり、２０％を超える効果量（｜ｌｏｇ１０比｜＞０．１）を有する少なくとも１つの濃度を有する場合、バイオマーカー活性がアノテートされた。これらの活性がいくつかのシステムで増大したが、他のシステムでは減少した場合、バイオマーカーの主要な活性は調節されていると呼ばれた。
ＬＭＷ−ＤＳは、２５個のアノテートされた読み値で活性であった。ＬＭＷ−ＤＳは、この調査で試験された濃度でヒト一次細胞のいずれに対しても細胞傷害性ではなかった。重要なバイオマーカー活性におけるＬＭＷ−ＤＳ媒介変化には、低減した血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、可溶性腫瘍壊死因子アルファ（ｓＴＮＦα）、インターフェロン誘導性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、ガンマインターフェロンにより誘導されたモノカイン（ＭＩＧ）、ならびにインターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）および増大したエオタキシン３（Ｅｏｔ３）、およびインターロイキン８（ＩＬ−８）の形態の炎症関連活性が含まれた。ＬＭＷ−ＤＳはまた、分泌が低減した免疫グロブリンＧ（ｓＩｇＧ）およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ならびに増大した可溶性ＩＬ−１７Ａ（ｓＩＬ−１７Ａ）、および表面抗原分類６９（ＣＤ６９）の形態の免疫調節性活性を有した。ＬＭＷ−ＤＳはまた、増大したマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の形態の組織リモデリング活性、および増大したトロンボモジュリン（ＴＭ）の形態の止血関連活性を示した。表３３は、ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルでの１２種の異なるヒト一次細胞に対するＬＭＷ−ＤＳの効果をまとめたものである。

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ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅは、４，５００を超える生物活性剤（生物製剤、承認薬物、化学薬品および実験薬剤）のＢｉｏＭＡＰ（登録商標）プロファイルを含み、最も類似したプロファイルを分類および特定するために使用できる。
ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅの数学的に類似の化合物プロファイルに対する教師なし探索では、ＬＭＷ−ＤＳ（４Ｍ）は、クレキサン（３０μｇ／ｍｌ）に最も類似している（ピアソンの相関係数、ｒ＝０．７０１）。クレキサン（エノキサパリンナトリウム）は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を治療するために使用される抗凝固剤の低分子量ヘパリンである。次のシステム中でアノテートされている５種の共通の活性がある：ＢＴ（ｓＩｇＧ、ｓＩＬ−１７Ａ）、ＣＡＳＭ３Ｃ（ＭＩＧ）、およびＨＤＦ３ＣＧＦ（ＶＣＡＭ−１、ＩＰ−１０）。
考察
調査では、ＬＭＷ−ＤＳは、器官（血管系、免疫系、皮膚、肺）の複合組織および疾患生物学ならびに一般組織生物学をモデル化するヒト一次細胞ベースアッセイのＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルのプロファイリングにより特徴付けられた。ＢｉｏＭＡＰ（登録商標）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＬＵＳパネルは、インビボ転帰に関連する複雑なクロストークおよびフィードバック機構を維持する条件下でのＬＭＷ−ＤＳの生物学的影響を評価した。
ＬＭＷ−ＤＳは、この調査で試験された濃度で活性で、細胞傷害性ではなかった。ＬＭＷ−ＤＳは、最高濃度でのみ（４μＭ）、ヒト一次内皮細胞に対し、中程度のおよび選択的抗増殖性であった。ＬＭＷ−ＤＳプロファイルは、２５個のアノテートされた読み値を有し、免疫および炎症関連読み値ならびにマトリックス関連バイオマーカーの調節を示した。特異的活性には、低減した炎症関連ＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１、ｓＴＮＦα、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＩＧ、およびＩＰ−１０ならびに増大したＩＬ８が含まれた。中程度に増大したエオタキシン−３は、ＢＦ４Ｔシステムで、より低い濃度でのみ観察された。免疫調節性活性には、低減したｓＩｇＧならびにＢＴシステムのＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆが含まれたが、Ｂ細胞に対する抗増殖性効果はなかった。低減したＭ−ＣＳＦおよび増大したＣＤ６９も同様に特定された。ＬＭＷ−ＤＳはまた、増大したＭＭＰ−１、ＰＡＩ−１、ｕＰＡＲ、ＥＧＦＲおよび止血関連ＴＭを含む組織リモデリングバイオマーカーを調節した。ＭＩＧ、ＶＣＡＭ、ＩＰ−１０およびＩＴＡＣを含む重要な炎症バイオマーカーは、ＣＡＳＭ３ＣおよびＨＤＦ３ＣＧＦシステム中の試験した全濃度にわたり低下したが、走化性因子ＩＬ８の増大が複数のシステム中で確認された。まとめると、これらのデータは、炎症および創傷治癒生物学において、ＬＭＷ−ＤＳが免疫活性化および／または免疫消散応答の調節に関与することを示す。
炎症性のマーカーの調節は、ＡＬＳなど、炎症性の成分を含む複数の慢性および急性炎症状態および疾患の治療におけるＬＭＷ−ＤＳの有用性を示す。
損傷後、最初に、自然／炎症促進性応答および後天性免疫応答の選択成分が上方制御され、外来性病原体に対し防御を維持し、損傷部位に存在する組織残屑を除去し、創傷応答に関連する組織リモデリング、細胞増殖および血管新生過程を組織化する。しかし、適切な創傷治癒を進行させるためには、この最初の炎症反応は、マトリックスの再建、再細胞化および組織リモデリングを可能とするように、調節または停止される必要がある。このような免疫消散活性は、ＬＭＷ−ＤＳにより誘導され、ＭＭＰ−１、ＰＡＲ−１およびｕＰＡＲの活性化を含み、こうしなければ有害な線維症形成を生じたはずの神経外傷を含む外傷により損傷を受けた組織の治療に有用性を有する誘導免疫消散を示す。
ＬＭＷ−ＤＳは、ＨＤＦ３ＣＧＦシステムにおいて多くのバイオマーカー活性を調製したが、ＭｙｏＦシステムではＩＬ８のみを調節した。両システムは、線維芽細胞を含むが、ＨＤＦ３ＣＧＦは、創傷治癒およびこのような創傷治癒に関連してマトリックスリモデリングをモデル化し、一方、ＭｙｏＦは、それ以上の、コラーゲン沈着の線維症モデルである。そのため、結果は、ＬＭＷ−ＤＳが免疫調節性および組織リモデリング活性を有したが、有害な線維症沈着を生じ得る、望ましくないコラーゲン線維症を誘導しなかったことを示す。
結論として、ＬＭＷ−ＤＳは、外傷または疾患後の組織中に存在する炎症を正常化および消散させるように見え、それにより、これらの結果は、前述の実施例で認められたＬＭＷ−ＤＳの効果と一致する。
実施例９
この実施例の目的は、差次的に調節された遺伝子の遺伝子発現調査と、これに続く機能的分析を用いて、ｓＴＢＩにおける異なる投与量のＬＭＷ−ＤＳ（１、５および１５ｍｇ／ｋｇ）の神経保護効果を明らかにすることであった。
材料および方法
ｓＴＢＩの誘導および薬物投与プロトコル
この調査に用いた実験プロトコルは、動物飼育のための国際標準およびガイドラインに従って、Ｃａｔｈｏｌｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｍｅの倫理委員会による承認を受けた。３００〜３５０ｇ体重の雄ウィスターラットに、制御された環境中で標準的実験食および水を自由に与えた。動物は、麻酔剤混合物として、３５ｍｇ／ｋｇ体重のケタミンおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ体重のミダゾラムを腹腔内注射により受けた。「重量落下」衝撃加速度モデル（Ｍａｒｍａｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９４；８０：２９１−３００）に従って、予め頭蓋骨上に固定された金属ディスクにより保護されているラットの頭の上に４５０ｇの重りを２ｍの高さから落とすことにより重度外傷性脳損傷（ｓＴＢＩ）を誘導した。頭蓋骨骨折、発作、鼻出血した、またはその衝撃に生存しなかったラットは、調査から除外された。各治療期間の終わりに、ラットは再度麻酔され、その後直ちに屠殺された。
試験化合物
ＬＭＷ−ＤＳ（Ｔｉｋｏｍｅｄ ＡＢ）を２０ｍｇ／ｍｌのストック濃度で用意し、４℃の温度監視冷蔵庫で保持した。ＬＭＷ−ＤＳの分取量を無菌生理食塩水中で適切な投与濃度に希釈した後、単回皮下注射で送達した。
急性期−１
ＴＢＩの３０分後に、３種の投与量のＬＭＷ−ＤＳを皮下に投与した。ＴＢＩの２日後に動物を屠殺した。動物を次の亜群に分けた：
１．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、１５ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を受けた
２．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、５ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を受けた
３．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、１ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を受けた
急性期−２
ＴＢＩの３０分後に、３種の投与量のＬＭＷ−ＤＳを皮下に投与した。ＴＢＩの７日後に動物を屠殺した。動物を次の亜群に分けた：
４．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、１５ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を受けた
５．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、５ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を受けた
６．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、１ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を受けた
７．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入を受け、１５ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＭＷ−ＤＳの０．５ｍｌの皮下注射を３回繰り返して受けた
ｓＴＢＩ−処理なし
８．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入のみを受け、ＴＢＩの２日後屠殺された
９．ｎ＝４匹の動物が、ｓＴＢＩ導入のみを受け、ＴＢＩの７日後屠殺された
シャム手術（健康な対照）
１０．ｎ＝４匹の動物が麻酔のみを受けた。
脳組織処理
全ての動物でインビボ骨切除開頭術を麻酔の間に実施した。ラットの頭蓋骨を注意深く取り除き、脳を露出させ、手術用スパチュラで取り除き、素早くＲＮＡＬａｔｅｒに入れ、さらなる処理のために４℃で保存した。
ＲＮＡ抽出およびアレイ解析
ＲＮＡ抽出およびアレイ処理をＳｏｕｒｃｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより実施した。使用したアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｒａｔ発現アレイであった。
統計解析
統計解析を実施し、このモデルでｓＴＢＩの脳に与える効果を定量化した。後続解析により、異なる繰り返しおよびアルゴリズムを用いて、このモデルでのＬＭＷ−ＤＳの効果を調べた。Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔソフトウェアパッケージを用いて、統計解析を実施した。ｐ＜０．０５で、１０％の遺伝子発現変化を有意と見なした。
結果
ｓＴＢＩの２日後に見られた差次的遺伝子発現
ｓＴＢＩの２日以内に、脳遺伝子発現が有意に変化し、比較的小さな数の遺伝子（２２１個）が上方および下方制御された。
ｓＴＢＩの２日以内に、損傷後３０分以内の１ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの投与は３７２個の遺伝子のＴＢＩ特異的遺伝子発現を変化させ、ＴＢＩ後３０分以内の５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの投与は７０２個の遺伝子のＴＢＩ特異的遺伝子発現を変化させ、およびＴＢＩ後３０分以内の１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの投与は２４７個の遺伝子のＴＢＩ特異的遺伝子発現を変化させた。
ＬＭＷ−ＤＳ治療動物は、２０９個の遺伝子（１ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ）、２５８個の遺伝子（５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ）および４７個の遺伝子（１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ）が、健康な対照とは異なった。
ｓＴＢＩの７日後に見られた差次的遺伝子発現
ｓＴＢＩの７日以内に、脳遺伝子発現が有意に変化し、大きな数の遺伝子（２７３９個）が上方および下方制御された。
ｓＴＢＩの７日以内に、損傷後３０分以内の１ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの投与は３６０２個の遺伝子のＴＢＩ特異的遺伝子発現を変化させ、ＴＢＩ後３０分以内の５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの投与は３８５２個の遺伝子のＴＢＩ特異的遺伝子発現を変化させ、およびＴＢＩ後３０分以内の１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの投与は３９０１個の遺伝子のＴＢＩ特異的遺伝子発現を変化させた。
ＬＭＷ−ＤＳ治療動物は、２８２個の遺伝子（１ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ）、３９８個の遺伝子（５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ）および１５８個の遺伝子（１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ）の発現が、健康な対照とは異なった。ＬＭＷ−ＤＳ治療動物（１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの３回反復投与）は、２３４個の遺伝子の発現が、健康な対照とは異なった。
ＬＭＷ−ＤＳで見られた発現変化の比較分析
異なる統計を反復実行することによる有意に影響を受けた遺伝子の比較は、ＬＭＷ−ＤＳがどのようにして、ＴＢＩ誘導遺伝子発現を変化させたかに関する情報を提供した。
ＴＢＩの２日後の比較は、それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳが投与された場合、ＴＢＩ（２日）により調節解除された２２１個の遺伝子から、健康な対照動物に比べて、２２個（１０％）、５１個（２３％）および１９個（８．５％）のみが調節解除されたままであったことを示した。
ＴＢＩの７日後の比較は、それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳが投与された場合、ＴＢＩ（７日）により調節解除された２７４１個の遺伝子から、健康な対照動物に比べて、１２４個（４．５％）、１６９個（６．１％）および８５個（３．１％）のみが調節解除されたままであったことを示した。１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳの３回反復投与では、健康な動物に比べて、調節解除されたままである遺伝子の数は、健康な対照動物に比べ１１６個（４．２５％）の遺伝子であった。
経路分析および機構調査
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析パッケージを用いて、差次的に調節された遺伝子の経路分析を実施した。分析は、特に、経路および分子過程ならびに認知症、アルツハイマー病、ＡＬＳ、ＴＢＩおよび脳卒中、を含む神経変性疾患、ならびに緑内障およびくも膜下出血後の正常圧水頭症（ＮＰＨ）を含む瘢痕形成および線維症に関連する疾患について実施した。
２日以内にＴＢＩにより誘導された効果は比較的小さかったが、多くの神経変性および瘢痕形成関連標準経路における変化は有意であった。これらの経路の変化のほとんどは、ＴＢＩの３０分以内に投与されたＬＭＷ−ＤＳにより影響が弱められた（表３４および３５）。経路と同様に、ＴＢＩの２日以内に有意に影響を受けた分子過程および疾患の数は中程度であった。しかし、ＴＢＩの影響は、損傷の３０分後に投与されたＬＭＷ−ＤＳによりほとんど消滅した（表３６および３７）。

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＊不明瞭な効果

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＊不明瞭な効果


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＊不明瞭な効果

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＊不明瞭な効果
７日以内にＴＢＩにより誘導された効果は有意で、多くの遺伝子が調節解除された。従って、多くの神経変性および瘢痕形成関連標準経路における変化は、有意であった。これらの経路の変化のほとんどは、ＴＢＩの３０分以内に投与されたＩＬＢにより影響が弱められた（表３８および３９）。経路と同様に、ＴＢＩの７日以内に有意に影響を受けた分子過程および疾患の数は多く、効果は有意であった。しかし、ＴＢＩの効果は、損傷の３０分後に投与されたＬＭＷ−ＤＳによりほとんど消滅した（表４０および４１）。

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＊不明瞭な効果

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＊不明瞭な効果
考察
ＬＭＷ−ＤＳは、ほとんどの経路および分子過程でＴＢＩの作用の影響を弱め、回復できた。データは、ＬＭＷ−ＤＳがＴＢＩ後の組織遺伝子発現および機能を正常化できることを示した。調査した機能および経路は、神経変性疾患ならびに線維症および瘢痕形成に高度に関連した。結果から、たとえ混乱が激しい場合でもＬＭＷ−ＤＳがこれらの経路に有益な形で影響を与えることができることが明らかであった。
上述の実施形態は、いくつかの本発明の例示的実施例であると理解できよう。種々の修正、組み合わせおよび変更が本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくその実施形態に対しなされ得ることは、当業者に理解されよう。特に、技術的に可能な場合には、異なる実施形態中の異なる部分の方策を、他の構成に組み合わせることができる。

Claims (31)

  1. 対象のグルタミン酸興奮毒性の治療、抑制または予防に使用される、デキストラン硫酸または薬学的に許容可能な誘導体。
  2. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、前記対象のニューロンのグルタミン酸興奮毒性の治療、抑制または予防に使用される、請求項１に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体
  3. 前記対象が、ニューロンに対し細胞損傷および／または細胞死を引き起こす神経疾患、障害または状態を罹患している、請求項１または２に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  4. 神経疾患、障害または状態に罹患している対象において、前記神経疾患、障害または状態により誘導される酸化ストレスからのニューロンの保護に使用される、デキストラン硫酸または薬学的に許容可能な誘導体。
  5. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、前記神経疾患、障害または状態により誘導され、ニューロンでミトコンドリア機能障害を引き起こす酸化ストレスからの前記ニューロンの保護に使用される、請求項４に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  6. 神経疾患、障害または状態に罹患している対象のニューロンの代謝恒常性の回復に使用される、デキストラン硫酸または薬学的に許容可能な誘導体。
  7. 神経疾患、障害または状態の治療、抑制または予防に使用される、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  8. 前記神経疾患、障害または状態が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  9. 前記神経疾患、障害または状態が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  10. 前記神経疾患、障害または状態が、アルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  11. 前記神経疾患、障害または状態が、くも膜下出血（ＳＡＨ）である、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  12. 前記神経疾患、障害または状態が、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、および多発性硬化症（ＭＳ）からなる群より選択される、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  13. 前記神経疾患、障害または状態が、多発性硬化症（ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、中枢神経系（ＣＮＳ）神経障害、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、脊髄症、白質脳症および白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、末梢神経障害およびシャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病からなる群より選択される脱髄性疾患、障害または状態である、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  14. 前記神経疾患、障害または状態が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、仮性球麻痺 、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）およびポリオ後症候群（ＰＰＳ）からなる群より選択される運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である、請求項３〜７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  15. 対象の神経炎症の治療、抑制または防止に使用される、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  16. 線維症または線維性疾患、障害または状態に罹患している対象の確定した瘢痕の分解に使用される、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  17. 前記線維性疾患、障害または状態が、緑内障、増殖性硝子体網膜症、脳または脊椎外傷性傷害、脳のくも膜下出血、侵襲的外科手術、術後癒着、腱板損傷、火傷、再建手術、肺線維症、特発性肺線維症、進行性塊状線維症、癌治療後の放射線誘発肺損傷、肝硬変、胆道閉鎖症、心房線維症、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞、グリア性瘢痕、膵炎、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド、縦隔線維症；骨髄線維症、ペロニー病、腎性全身性線維症；後腹膜線維症、強皮症または全身性硬化症からなる群より選択される、請求項１６に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  18. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、前記対象への全身投与のために製剤化される、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  19. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、前記対象への静脈内または皮下投与のために製剤化され、好ましくは前記対象への皮下投与のために製剤化される、請求項１８に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  20. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、１０，０００Ｄａ以下の平均分子量を有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  21. 前記平均分子量が２，０００〜１０，０００Ｄａの範囲内、好ましくは３，０００〜１０，０００Ｄａの範囲内、より好ましくは３，５００〜９，５００Ｄａの範囲内にある、請求項２０までに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  22. 前記平均分子量が４，５００〜７，５００Ｄａの範囲内、好ましくは４，５００〜５，５００Ｄａの範囲内にある、請求項２１までに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  23. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  24. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、約１７％の平均硫黄含量を有する、請求項２３に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  25. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法で測定して、１，８５０〜３，５００Ｄａの範囲内、好ましくは１，８５０〜２，５００Ｄａの範囲内、およびより好ましくは１，８５０〜２，３００Ｄａの範囲内の数平均分子量（Ｍｎ）を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  26. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、ＮＭＲ分光法で測定して、１，８５０〜２，０００Ｄａの範囲内のＭｎを有する、請求項２５に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  27. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、２．５〜３．０の範囲内、好ましくは２．５〜２．８の範囲内、およびより好ましくは２．６〜２．７の範囲内のグルコース単位当たりの平均硫酸数を有する、請求項２５または２６に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  28. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、平均５．１のグルコース単位および２．６〜２．７のグルコース単位当たりの平均硫酸数を有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  29. 前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体が、注射用水溶液として製剤化される、請求項１〜２８のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  30. 前記薬学的に許容可能な誘導体が、デキストラン硫酸の薬学的に許容可能な塩である、請求項１〜２９のいずれかに記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。
  31. 前記薬学的に許容可能な誘導体が、デキストラン硫酸のナトリウム塩である、請求項３０に記載の使用のための、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容可能な誘導体。

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