PT1567171E - Utilização de sulfato de dextrano para o tratamento de reacção inflamatória instantânea veiculada pelo sangue (riivs). - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DE SULFATO DE DEXTRÃH© PM®; O THâTlMUTO

DE HllCÇfe INFL&M&TÓRIA INST«ft«. TOCUMà FILO S»m (RIIVS) :v ,n a ·:·:· ·:·:·: ·:·:·. nova utilização A presente hniffmçÁo lt·t = por f,b)f:ct de sulfato de dextrano.

Hoje em dia, cerca de 10 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de diabetes do tipo L, que também é referida como diabetes mellitus dependente de insulina. Contudo, estima-se que o número de pesscas afectadas aumente dramaticamente e que possa afectar, em s 25 milhões de pesscas. Presentemente, realizam-se investigações para tentar conseguir uma normalização permanente da glicémia em pacientes com diabetes do tipo I, por meio da introdução de células t que produzem insulina. Os dois processos principais têm sido a transplantação quer de enxertos pancreáticos vascularizados, quer de ilhéus de Langerhans isolados. Embora se tenha tido apgom stcosff com os enxertos vascularizados (pâncreas inteiro), ainda há problemas principalmente devido ao risco cirúrgico e às complicações post-operatórias. disso, M ' um problema com a escassez de dadores de enxertos ϊνον fõ td-'d pi ;*'ç:-f% :b: çt : :ν·; ;:·ν;ν·:: p: ; çp r- ·*· tfvp \ :;p y): pv-pç·;·. .··> .itãitftrtf os I. f f f; Õt ο n d O tf :ff pp; o?

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Si t '·. ! t df dOíál

Um o alo-transplantação num paciente [2]. Como resultado, espera-se que o fornecimento de ilhéus u; pode tornar-se a;:·; factor limitativo no tratamento, que ser encontradas fontes alternativas de células que produzem insulina. Uma opção é utilizar ilhéus preparados a partir de tecido animal, sendo cs ilhéus de porco os principais candidatos.

Um dos principais e íxHm a ser resolvida antes da xeno-transplantação dos ilhéus se tornar possível, é a reacção inflamatória prejudicial que os ;U.Ms.zs de porco provocam quando são expostos a sangue humano fresco in vitro o in Ψ·ίΨό ; 3: . Também os ilhéus iuzmstmr induzem uma reacção inflamatória prejudicial quando são expostos a sangue combinado com ABO do paciente ao momento da transplantação intrapcrtal [4] . A arruo:;: in inflamatória é caracterizada por um consumo rápido e uma actívação das plaquetas que aderem à superfície do ilhéu o que promove a actívação tanto da coagulação corno de do complemento. Além disso, os ilhéus ficam embebidos em coágulos e infiltram-se por máà-a dos iBhtctci tos CD 11 b+, o e , rada junto, resulta numa destruição da morfologia das células e numa da dos pacientes [3-4], Mém disso, a inflamação pode acelerar a resposta imunitária especifica.» mediada pelas ítéluiBo:, ora se segue, zurra rudu jurazoular: [Ibobo A árrat :3::

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Dois estudos recentes et al. e CMu;.:í· cd; et al, [6] ifeite;;'; st; kúí tec: oa s .Lt ii..:;:· oe pcuyco :SíiC 1 C í? S ΐί-O C 'C-':ft’ΐ-5 C- :ii t.‘ tOít'0. tt ds.vis:;:; S d O ,S 0 -.: ¾ O :¾¾ S ,:;yss ;í;.Cg;:;: c. :V.:d Çt:;ã 0::0.:: -ίφ'ΏΤϊ (7.:.¾¾¾¾ paps- o fígado de ç:\i::tocao nào ha:a.:i.aaa a:a«iaa eis; s - ·: : o.: χ.:>ϊ·οΐΐ.·. os ;í:: ;: Ç λ;-*» :¾. lÀxl.t ei: :·: : ::: ,· dlIrS, eu d P': ·*·- o Os: ti scssj. s e :7:: :' ; S: -::: 7..77.7 Λ Λ7 S . Ο:::::':;:: O si: Ο :::.1:- t l::;: :-0-0:..¾ ^:-¾¾¾ 01¾ ;ΐ: p oõ:.;õõγÇõíip^í ;1;. '· ç:õ; fõ o ãt* :::P Ϊ* ò ; afectada pelos fármacos .iídaao-^íprdí destruição 30s ilhéus xenogeneicos. Fíorante et al. estudaram a utilização de sulfato de dextrano na prevenção de rejeição híper-aguda (RHA) dcs xeno-enxertos discordantes vascularizados [9]. Pulmões de porco que foram perfundidos com sangue humano anti-coagulado com citrato, experimentaram RHA passados 30 min no modelo de xeno-transplantaçãc. Contudo, a âdlçfe de sulfato de dextrana a 2 mg/mL prolongou a sobrevivência do pulmão em cerca de 200 mio, a RHA de órgão completamente vascularizados é mediada através da acção de anticorpos no sangue humano, que identificam e se ligam aos antigénios expostos nas células endoteliais aos vasos sanguíneos dos órgãos transplantados. Esta reacção de RHA mediada por anticorpos é potenciada pelos componentes do sistema do complemento [E, 10, 11]. Dado que o sulfato de dextrano á também conhecido por inibir a activação do complemento [9, 12], a sobrevivência prolongada do pulmão, quando se iioiXiOsi o sulfato do dextrano no modelo de xeno-t i «: o pl S:ot S: f !-0 iitiLil-pddiip ::t: oque doolve ieute? efeito teti··coo;.:: 1 eise::ti) do sulfato de dootιοί:·::)> v' ··: ·:Ρ: P> Ρ·:··Ρ·ί· £ O:: uie κοκ d οfeu.:, to de iii e consequentemente o FCH foi sdM.írititta-iít intraperitoneal-rsinifo ao raro te· te pê::,;:::·;::' fus ο:ογρ: ooíod mm ααϊαάααα de de>dv iVát; ie, •ooio odólniot C:: ,ρ·:η; ,;ç; gvd 'isolo· i. i,: n ιοοιοροι ic&iiA 00; tfoliO OS :í0 ·fc?o e #o :::> rodo .p: o ser investigados. Iisoif do ·.. ... ..· o..·..·........·::. .. ; pf : ή d ó;;!, .·.. .·.; 1. nalguns o íii i i m ·;·> ·.·. ·. i.is :fi:d:· mas ssitf: St OtO'ft.it -:'it it it f. i vy-;,!.ρρό'ο'ο o espaço sub- l..f hiái.ffiií .o capsular renal foi tratamento adicional dos anticorpí os anti-FCH com o sulfato de do ftOftOUiO ti;: 0«:ff 100::01 r ; fdií acç ratos oò;:-o.1 f.ú totalmente o oroit SÓ OOf: éfldS do sulfato de dextrano , indicando que o efeito do sul fato de dextrano neste modelo de rransplantação

alogéníca de ilhéus em ratos e mediada por via do FCH endógeno.

Thomaç et al. [14] demonstraram que os derivados de dextrano solúvel inibem a activação do complemento e cs danos mediados pelo complemento ín vitro. As células endotelíais da aorta de porcos incubadas em soro humano resultaram no consume do oottplogriito e na depor ::.cdo dos fragmentos rnpifgdos C3, C5 e do complexo de ataque da membrana, C5b-9, nas células endoetliais. A adição de 25 mg/ml, de sulfato de dextrano Pid-d21 inibiu a activação do complemento e a deposição do complexo citolitico nas células. 0 dextrano natural não tem esse efeito. vf f

. òo:'l-;OddO :t.tt ss:s = lar vos ístiísatíí para a uo:::·rof;: -mrnml m â oo1o omm ·.; o {M1V2 s . S.agigtitui um outro objecto di; vivívvid;t ilidis ivvvv .;.· denciar um tratamento para o tSsdrtítPotd -d S; t 0 0.0 V Λ V V: 0 W 1:Ζ.: . :: :: :J :: .:.:¾ ;: .:. Λ .

vivdv -:m vutvv ofej vcPv fia p-rd-Psi? prvvddo0:3.1 ar to:· Ptvtdmd&tv· pèvv: a ooledpic ;; raasaploudoo Pv cáiçiví;: esus*í|a pvlv dl ϊ V!,

Estes s oatzo% objectos são conseguidos peia presente invenção, conforme definido pelas ' da pvtivrts em anexo.

Em resumo, a presente invenção envolve a utilização de sulfato de dextrano e dos seus derivados, para o tratamento de papínfpip inflamatória instantânea ΐΐ&ίΡνΙ&άν pelo sangue (RIIVS). Esta forma recentemente caracterizada é activada quando as células ou cs conjuntos de células são expostos a sangue estranho ín vitro e in vivo. Um exemplo muito importante da RIIVS verifica-se quando os transplantes alogenei cos ou xenogeneícos de células são transplantados para o corpo de um mamí fero receptor, especialmente um ser humano, paciente. A RIIVS levará então a um rompimento morfológico e a destruição das células mi dos conjuntos de células transplantados, o que se manifesta na perda de estrutura e de forma. Além disso, a RIIVS também resulta geralmente na rejeição de enxertos de transplantes de h •:i; - ;-P· .·; rlilhtdp Ρ';ί pV Ç: v; f&tá ;iv dvpdtlpr:;; dv d:v·; :i’;p:Vi:, ,P: &zí.v-àác il .>: : ilímlVíP Ít. vi.vi.:::; ; v:vvi vd i : iaf d;; vlU: ./.¾ iviviiiv t Ϋ : : PP; V ;;; :is tt ; .i d';:; v : ;· >' :r:: ρρρρρ ρ; 1111111:1:1 ^dkãoç Pdl. I Vi :'· ii p ih; i';. 11..1 Pi! èlfiivl':, P X pi ;; v d:v PJít .VIVI λ Χ·:;: V vciiiv .-::::1: .¾ ip IVvíPíIv :p:;v ivnpâvc. 11-::11 :· td.i: V V ·ν·:;ΐ:«ϊ;:;

:PS íf (SD-BPM) P íkç:?' exemp.lo, ai::;:;:;:: a n.i ou milhares de

OhlZOíi hyhih; slui ís&Iftpular iry-hvrih < gera.Isente eoe sr: pese &M.eeu!-sr egeerieí is lém 100 Shltbíií per irwMhlr > ::; 000 Oííl Dâ, O ur^r·-V .s f;. u .3. j 0: S O d S S U1 f a t o eere p 111:^01:11:0 ísss 'IsxiOl;;:; 3¾ Pê o :.p.... ;; gP.í:iiias ;í.y.iy de administração de seuféte de dextrano som ura peso í»eleep.la.r esis a Pires;:!:;;, C; úlMitt teev.ejeie de s;rr;lss.iss rotosas de sulfato de dextrano na RIIVS de acordo com a presente invenção pode ser pote;:;:siòd;.; aumentando o teor de enxofre, isto e, o itiooPO: de grupos sulfato por resíduo de glicosilo na cadeia de dextrano. 0 SD-BPM geralmente r. t.t um peço molecular médio inferior a 20 000 Da, tal como abaixo de 10 000 Da e, por exemplo, cerca de 5.000 De, 3 teor rMio de enxofre para o SD-BPM pode ser de cerca de 10 a 25 , tal como 15 a 20 I, correspondendo a cerca de dois grupos sulfato por resíduo de glicosilo. Para o sulfato de dextrano com um peso molecular médio superior a 20 000 Da, pode-se utilizar um teor de enxofre maior. O sulfato de dextrano e os seus derivados podem ser administrados por libertação sistémica para o risio de RIIVS ou para a transplantação da célula ou; pode ser administrado por libertação diPíátta (localmente) nesse sitio. Assim, de acordo com a presente invenção, 2 sulfato de dextrano e os seus derivados podem ser administrados oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutaneamente, bucalmente, dermicaraente, nasalmente, pç;; ips.rga.iSt soros viu

M quantidades de sulfato de dextrano ou dos seus do paciente c ser tratado, assim comc da formulação «cfíái e da via de sd&lfdM'!utilizada e pode ser determinada, rem ser no âmbito da presente invenção, por um especialista na matéria. A do sulfato do dextrano ou dos seus derivados administrados, do acordo com a presente invenção, não deve ser demasiado alta para minimizar quaisquer efeitos colaterais associados com o sulfato de dextrano. Na ísoior parte das situações clinicas as doses apropriadas de sulfato de dextrano ou dos seus derivados, nu tratamento terapêutico a/oo profiláctico de mamíferos, especialmente de seres humanos, são os que dão uma média no sangue inferior a 5 mg/mL, piou iPslmoutâ menos do que 2 mg/mL e especialmente menos do que i mg/mL. Um int ervalo de concentração preferido é entre 0,01 e 1 mqddlí de

sulfato de dextrano, tal como mais do que iípCbi mg/mL, mais do que 0,8 menos do que C, 6 apídid. menos do que 0,4 mg/mL ou menos do que 0,2 mg/mL, por exemplo, fedtna -io intervalo de concentração dú /g d/ :if/iaL e 0,2 mg/ííiL adir:;; míd? md/dm e 0,2 mg/mL. de I:. Nesses pacientes, podem-se i :raT;SpÍât ter LâSPaíParis de uuUmuc seres ?:. isttnct t: n ou de ititéct na veia portal dos pacientes. CrctoltiL: uma vs-t os da concentração terapêutica de ítii icici de dextrano ou dos seus dem/vmdoím aunge-se, preferencialmente, peto menue localmente, no sítio do transplantação, uma coo realizada a transplantação das células ou dos conjuntos de células. Isto pode obter-se por administração do sulfato de dextrano antes da transplantação actual. Alternativamente, podem injectar-se os ilhéus numa solução que compreende o sulfato de dextrano de acordo com a presente , de modo a inibir a RIIVS e a prevenir qualquer tulçho ou rejeição dos ilhéus, tornando possível a n _i ' _icémia nos pacientes. A concentração de sulfato de dextrano nessa célula e a solução de sulfato de dextrano i preferencialmente suficientemente elevada, de tal modo que se pode obter uma concentração terapêutica de sulfato de dextrano, isto é, preferencialmente inferior a 5 mg/mL, mais preferencialmente 0,01 mg/mL a 1,0 mg/mL e especialmente 0,01 mg/mL a 0,2 mg/mL, peio menos localmente, no sítio da 1 para as primeiras horas no seguimento da tran _ ' . C sulfato de dextrano vai então difundir-se c partir do sitio da transplantação, baixando a concentração local do sulfato de dextrano.

Nalgumas aplicações, alo é necessário mais sulfato de dextrano para inibir a RIIVS, o rompimento ítCíffológito e/ou a dec/irtsttp por exemplo, intravenosamente, íntraperitonealmente um 0 sulfato da damrmno sn.í doa Ι'ί i s ddbl vinií: d podddS td.O s@r díçnbinsçdçç com outros agentes np-ã:t' que são dt dia [l0 tratamento do tdj: dlça·:·.;: de βΠΧ€ r tos de fpp. Y ^ansplantado. Eteoopi-os apropri ados mas nã c limítati vos j@sses agentes imuno-supressores que podem ser utilizados em r0njunto com sulfato de dextrano para o tratamento de rejeição de enxertos são a d íOdpí - ^ ' · o ' idKtrçIidVdtí os r0rticoesteroides, a rapamicina ísirolímus) e o micofenolato je mofetilo. A administração de sulfato de dextranc, de acordo com a presente 1 'írdPtppUp pode também ser coordenada com a administração de anticorpos anti-TF e/ou o factor Vila inactivado no sitio, que também têm alguma funcionalidade na inibição da RIIVS.

BREVE DtiíiltiÇdO DOS DESENHOS A presente invenção, em çoçi.írççõ com outros objectos e vantagens, pode ser melhor entendida com rs-fprêncáá à descrição se segue, considerada em çíjçcuçxo com os desenhos que a acompanham, em que: a fig. 3 ή diagrama que .UíábCrS: o efeito directc no sistema de eesídídeseíate quando se faz a iqegbrsçdds de soro be:&&.?vO 0:¾ preÇíõC®ç« úé it'li'd: d fiç:, d d® íu ilhas d a a st :r-:â a :ii dd:tiioiiçdo de ietitdttoe sa linsus de tar ia.a a o mom sangue ta«;is não contendo

d fig. d litedra s áidtridaie.de de I^usofci ia:· de suínos depois da perfusão acsr; sangue humano mg/mL de SD-BPM; A fig. 6 ilustra a distribuição de plaquetas nos ilhéus da suínos depois da perfusão com sangue humano não contendo SD-BPM;

A fíg. 7 ilustra a distribuição de plaquetas nos ilhéus de suínos depois da perfusão com sangue humano contendo I

Sq/Mi de SD-BPM; A fig. 8 Ilustra a expressão de insulina em ilhéus de suínos depois da transplantação intraportal em rates atímícos diabéticos sem tratamento com SD-BPM; A fig. 9 ilustra a expressão de insulina em ilhéus de suínos depois da transplantação iíabMMatral orr rabas diabéticos asm lsuar-rrd:o ata.': Sd-BFhd

d- i *:b>; dç mui n-çs dopoi ;fe ;:....·: sabpX s>:X a çl ο I u ttmmyt tiú. ··>·· ,:v r·’ -:b; ç- >' :;v •f·· T. :-:í'ívi;í: l‘:: f ···; :· .·:·:· A presente invenção, de uma teucs* ύχχχνΧχ: tem ρ-οτ is ίΐ'.ί:Oi.it-õ χχχηχχ} x; sx:m:X>u0¾aíUuxt.Xí do xxxlxõxbxx; de dextrano no reacção inflamatória i a s t dX; XIxxxxx: χχχίχχ y X a xxx p a .1 o a a y q ao (RIIVS) e ο χχχχχρχmw\00 χ·όοχρ:χ:/ΧχΧ§Χχχχ; e a rejeição de enxertos dos transplantes de células causados pela RIIVS. A RIIVS é uma reacção inflamatória identificada h6 relativamente pouco tempo provocada pela exposição ou contacto das cuiedso ou conjuntos de células com sangue estranho. A RIIVS e caracterizada pela expressão de factor de crescimento de tecido em células, o que provoca a geração local de trombina. Em seguida, as plaquetas activadas aderem à superfície das células promovendo a activação tanto da coagulação cu® dos sistemas do complemento. disso, os leucócitos sãc atraídos e infiltram as células. Estes efeitos em conjunto causam um rompimento e a destruição da morfologia das células nas primeiras poucas horas depc-ís do contacto com sangue estranho. h RIIVS também acelera a subsequente resposta imunitária especifica, mediada pelas células, numa fase posterior.

Um exemplo multo importante de RIIVS acontece xxxyyxbx; s:s uéloloo ou conjunto de células são c.u p:Z&£&z%t;CÍêiÀWmntà um yyyxi f xu® e x-yçxm-Xy Χχ-.χ·η\ o um :·.cu humano. bc clubud íS G χοχύΧχΧχχχχΧχΧ'Χ: na 1 ftl.xnio <30 çnxeu: PO do X :0Χοηη1 xoXl X;

A de tát: o p iMí t :;;i CÈ alogeneica .2!§,im:ê£ de um dador com sangue compatível como de células, em que as com ABO são iítrs s:í:S:í:ac::í:í e áv porco smío::; ονΐ n; :0000 e cte ;otie loé o/eo d» iPOO 'í ortáít oí Í0;i 000 U ÍÍS .. A epppessj-ò "transplante de PálulaP" λ · - o ·: <· ·ο.ο.gooá/l··· mente, na presente iúmoplíp a uma única to h: / ea várias còártos dtriuúu ou a um ctniasís de muitas células transplantadas para o corpo do receptor, prete reto: a oterto de um mamífero e especialmente de um paciente humano. Também conjuntos de células maiores, de tecidos não vascularizados, estão compreendidos na expressão do transplante de células, tal como se utiliza aqui. Um exemplo de transplantes de células, de acordo com a presente invenção, são ilhéus de Langerhans alogeneicos e xenogeneicos transplantados na veia portai do fígado de pacientes que sofrem de diabetes do tipo I. Um outro exemplo, pode ser a transplantação de tecido/células neurais xenogeneícas, embriónicas nostriatum de pacientes com a doença de Parkinson.

Tal como foi brevemente discutido na vçgççp de antecedentes, um processo promissor para a obtenção de normoglícémia em pacientes com diabetes do tipo I, consiste em transplantar células p que produzem insulina, per exemplo, na veia portal. As células apropriadas que produzem insulina, por e soba a forma de ί·ΙΜ&£ de Langerhans, podem o.ít';;θ ':£ o a vttt.i r tanto oo: tttoietoç s noqe rn.no:o;Oí Cismo o·:: .OoOOg.ínooPOtsO.. UéciO mm Páíí netáOióápSutíi ot i .ÍPÁttíi d® :oá.p jo>í dadores para se obter áOíOoSoá:Poíássiç e Pá falta de dadores

té;;:/ çv y::;>ío\ ^ ç......p- o-; t ' : : o paciente receptor. Como consequência, no espaço se seguiu a perda de M??il disso, a RIIVS também causa rejeição d-s enxerto dos transplantes de células. A administração de fármacos Isivravsqptes sores convencionais que previnem a produção de anticorpos e a rejeição de órgãos, não tem efeito na RIIVS ou na rejeição de enxertos de transplantes de células causados por RIIVS. Isto indica que o mecanismo principal da RIIVS e da rejeição de enxertos dos transplantes de células difere do mecanismo da rejeição verificado na transplantação de órgãos completos e de tecido vascularizado.

Aqui a seguir db-se uma visão mais detalhada dos sintomas de RIIVS e, em particular do consumo de plaque tas, coagulação e activação do compl emento e infiltração de leucócitos. Além disso, dá i-se uma visão dos efeitos do sulfato de dextrano nos ;;; respectívos. Para uma discussão V ode detalhada destes efeitos do eoifatí;; Ç Õ dextrano, fzz-se referência secção dos exemplos. aderem às células, resultando numa ορρή^όρρρ de plaquetas, do seguimento da adesão às células, as plSfiK-aa libertam eêrias '·. λ;'·' : ,λ; «1 .1 dic.-dÍ.l·: P- nÍi-in,:' .i. 1. ò-r- i,i·. õ-llc-ll t.o’:: >..·-.:.-1.7- Pé -:11111 :-..-11: 11· .· ip,; lg içpò imporií :·: io·: pii. ΐ'-ϊί Z&tmiÇMO bte vVGlg::l.i<.:-:V· $ ii diCT 1 d ··. >: ..1: :eisoe:e..a de o .··. ··. ·:· -‘í ix- mnii.·:··:;· -\,·;ν v-yw-v.' , dextrano, de acordo com a presente invenção, idildt o consumo de plaquetas, como se gado teu: pelo um aumento ria contagem de plaquetas no sangue, ípa; volta para c valor medido nc sangue antes da exposição a células ou a conjuntos de células estranhos. J disso, as plaquetas que aderem às células são consideravelmente diminuídas pelo ayMafcé de dextrans, embora se possam observar ainda quantidades de traços de plaquetas a rodear os ilhéus. 0 efeito destas plaquetas remanescentes não é contudo, necessariamente, uma desvantagem. Estudos em animais mostraram que, após a passa pelo menos uma semana antes de se detectar a angiogénese [15, 16]. As plaquetas contêm um certo :;r;bee.ep de factores de crescimento importantes, tais essao factor do crescimento ãtov-ív&d® de plaquetas (FCDP), factor de crescimento endotelíal vascular (FCEVj e factor de crescimento do fibroblasto (FCF) [17, 18], que pode suportar a re-vascularização e o enxerto de ilhéus no corpo do paciente. Na caso da transplantação cliedod de ilhéus, qo-ondo os ilhéus são embolizados na veia portal, uma coroa de plaquetas aderentes pode, de uma ícota similar, suportar o seu enxerto e o sttevvieboeis no recibo pp: iiiooòo. Àéy iill: n-Mii : lí- i-‘ illi: >1!0-111 '•-è li* éi ?: iç di l· · y :: : e d | : sloe οοΐρορΙίΡΡ ea;: o eieidnaa de ορορορο-::ρ lo, eibiOi'a ;···:·::·.·;-··;·:·'· ··:-·· -7-1:-1 ·!· idddei Poio bíoiiino OS -O iepldo OeS Odiei:S.s: e ,:1 :>· v sede de ·. ·· y.· o ·?e ο οι t e de s ç;i In -::11: ç·- - :1: /1 ·:·· ,:1 1·ί:ϊ:: :i>.li il de piageee se. de: i:>;·uidib <· ;0 .í ii ·:: g: , Pi de VII™ de coagulação do sangue e actua enzimaticamente no

va ;· 0«:,!* Si O W i V- ife - .·'I;. V. X CbuiX _L I gX ,·. x j. d-.ràimitv vv fibras n·.:· llho: iras coio us: l:\b.V ,· VOV ííjSÍS I 10.100 1:¾¾ toàmú.w de IXbvbris V v: eoalaeclVoe pelos especialistas oa matéria. A trombina [«se moí.Iio::; s Via iiiiiili:v.:vvio.i para ίονον::.:· a vaaapolVçVo dv sangue, 0® q o ::;i 0 fã.l:;o::;r VII IfliCLOt OV VVVVbVV ; 1.10:-3 ::01:1.1¾¾¾ SO j IV T ϊ a : e, por sua vez, activa, sob o ponto de vista ινινo factor XI (antecedente de trombc-plastina) , resultando em FXIa, a forma activada do factor XI. Também esta via resulta, eventualmente, na geração ae trombina a partir de protrcmbina, corno para a via extrínseca activada por FT. A coagulação do sangue pode ser inibida por anti-trombina, iiv inibidor de serina protease em circulação, que inactiva FXlla, FXIa e trombina, formando o factor Xlla anti-trombina (FXIIa-AT), factor Xla-antitrombina a e complexos de trombina - mm ο-ο mmi-.;..vv (TAT) . Mte disso, c inibidor da esterase Cl é um inibidor conhecido (FXIa-C I INH) e complexos do inibidor da esterase do factor Xlla-Cl (FXIIa-Cl INB).

Ite: vez formado o voáíiivlv de fibrína h volta das vVIViao ou dos ticv'1 jiiiíih-Q-h dv ονΙιιΧιχ, o lo pode ser vliiiiviofe ννίο soidio de ΧΙοοιιΙ.νν do ovotoiii tib;iXi;feIIfeifeoo A xbísvvvivn (ViigiiiVa o coágulo de r '' em VX diioiiiidiivvv de fibrína, orevenindo o i: viso que se 111¾¾¾¾¾ vvlv coágulos. f, que oo Vigi e :1:1:111.1:::.111 a iilfeviolb» l.ivxo formando 0 VÒOsITí: 0

7\ FXlia-AlÇ 7âC e PAP. A RIIVS ou ÍSbíOVOObSOO OS í -Λ .. ·" :... ... SiOS .: SSStd5OO,.0. λ SS ·.· Λ 0 ÍSSS. !U S S O OUSO SU; ooe: mssstSdouC:: efectiva ou soolfato de bsxtobSbo,, Co ís coxeio ccíc :... priUiosxCs ioeossçsuí ab-roga o efeito áâ B1T-IB os isccxsspiik; ir iimpúMÇ Itu· o que se manifesta num íisçréioicrb bs-: ousCsisisos de F i a - FXIIa-AT, TAT e PAP detectados o o sangue. 0 efeito do st; 1 x ;oos de dextrano os i&otixsiçSio d* us&fc!:t:xçc<? pode ser mediado stxso^uis do sistema do xsxssrispâo per se, através do efeito iniMÚOt dc sulfato do dosisosno: os isexossuçss; das plaquetas ou em ambos.

No seguimento da activação das plaquetas e da coagulação, segue-se na RIIVS uma cascata do complemento. Um dcs componentes do sistema do complemento é C3 que, quando activado é clivado em pequenos fragmentos de C3, um péptido mediador da inflamação e o fragmento maior C3b. C3b, por sua vez, liga-se a outros componentes do sistema do complemento ioomsrobo: convertase C5, que cliva CS em C5a, mos se difunde e a forma activa C5b, que se liga & superfície da célula. O C5b ligado liga-se então a maís quatro componentes do complemento formando o complexo de ataque da mor-Ct t dc5b-9. Este complexo desloca os fosfoiípidos da membrana formando grandes canais da que rompe a membrana e qs™ psxibxto que iões e osiS oculos pequenas se difundam lívremente. Assim,

:S: CSSO.iií bC:C Conde XOdOOS S XUS O Ó S ÇÓí Ç i :1.-3-SS íj OSSObOSOS: O A rnsior parte do consumo Seu obsoss; S:ot.SS Sou oCosssío moorCsb; ·::*: we : .0 orcóf C : :v::o:· ^ '' /!: : :\L : - i : 1. ;;; O v1.- : ii:; j v - ' :: de o:o as'

Sw uma significativa , as um aumento do C3a e do complexo ooliasi de d« aviatdaa::: • ····· >·::: w .'0 asm0:pm> d. aíÉsdoJ.ata vim ífe < VW .S; f: ç ^ -¾¾ ^ :¾ £ :£*5 de ·:ΐ; :.·:Λ'ί 0.6 dóid :¾ ÍVO í de <iOO- reduz a quantidade destes çoa^amsrm ss às sangue, de uma maneira dependente da dose. II lallvS é I:. à:;tbém pela i.ac;tllla;;ac;;aia> da

Ivúcéeltéà nas células os nos conjuntos de célisiási A infiltração das: ctiuias jisb ixtvcf aa:as;así acossa a Oasólb' e do monócitos nas células d claramente detectada por poied&v&t; ímnno-hístoguímica. As análises imuno-histoquímicas mostraram que a dos leucócitps foi totalmente eliminada peia administração de sulfato de dextrano.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, providencia-se a utilização de sulfato de dextrano ou de um seu derivado aceitável sob c ponto de vista farmacêutico, nc fabrico de um medicamento para o tratamento da reacção inflamatória instantânea mediada pelo sangue (RIIVS).

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, providencia-se a utilização de sulfato de dextrano ou de um lo;.:: aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, m; fabrico de um medicamento para 3 tratamento do rompimento morfológico dos transplantes de células ifSllbiiS a utilização de sulfato de dextrano o:~;da: um ao:,; derivado aceitável sob o ponto de vista no fabrico de um para o t:mzsúm&Zú da .eleição da sasscorto-s: dos ttatiatliaitss aác oélotss tatá alma a ssa ala labcóat; da da ρ:ΡΓ.όο:;Ιό·οla. dsts tlVi;.i.óas nas células tm mos scislpfttc?.® de paciente mamífero :.5 ti O O: 0 í. S 1,-:.- V'.:'. :V’ xÇ s l tm itaidd o •d: o y': '·; p ^ ·:f (: .1 '1 sa ·. t ív .:. ·-.;· y'·.·',.;. -.-:- ·-.·,· ds- OÍSilO; S* 00. ..q,-;a·; ítÇ: SOS tOd ÍSs tó SO -: 1:00:000: OSOO- ; à 'Γ i. 'v il n ir C 10¾.. :///;// ΐΟ: :O.;:tlitS.0:Í:.; : .-ç >':· : d ir '1 ,0 1 mõ-uUvO p:,y: y-y-õ? ;> 0: USO-,:.: S O v ÒUOOU • -'0: y V :¾¾.¾ ·: ramo: is:;:;: t ssosís,: t :; aso v a r;s,a1-;;:0 0 t- ;o 0i, ·-:: U ,, ã,, isiso I-sís a 1 ο,νΟΟο: ooO, loo-st , aáO y-s:- òo a ·.: ooei tooo dúvidas, tal cot;® se ooososts: aqui, o :,,1:.1:-:.,: ra t-imti'nta* 1--:1-::1: o rratamento terapêutico efm; profiláctico de RIIVS. "Derivados aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico" incluem sais e solvatados. 0 sulfato de oloot,::0:00 ou os seus Φ-ti-οοΟοϊοf utilizados de acordo com a presente pode ter um peço molecular desde sulfato ae dextrano de baixo peso molecular (SD-BPM), por exemplo, desde algumas centenas ou milhares de DAlton (Da), ãfê sulfato de dextrano de elevado peso molecular (SD-EPM), geralmente com um peso molecular superior â 500 000 Da, por exemplo 1 000 000 Ca. O efeito vantajoso de sulfato de dextrano é especialmente proeminente para SD-BPM, mas o efeito positivo ê também visto por administração de sulfato de dextrano com « peso molecular mais elevado. Contudo, moléculas de sulfato de dextrano maiores podem octitsts FXII resultando nalguns efeitos oslatçrgip, o que se d ;cem mai.s òodoouh-o a seguir. O efeito vantajoso de de suliate de dextrano maiores na Β,ροι,χ;:; . op acordo ^ presente pode ser aumentado aumentando ο de enxofre, isto é, o de msor:----:, T ,W:, na Cdaeia de dextrano. y SD-BPM geralmente tem 00 s 20 :··.· :···:: . ·>·::· :· ·····.····'·:·::···.· ··: v :· .«* .Ν'. .·. .. o ··. .·.·' ·. t Ddt d.-:. o.: tíO::;o: mtãsíul.o 'tí: os io ;3 25 %, oos zm*' 3 resíduo de glicosilo. Para o sulfato de dextrano com um raso :??··i som: ·; r méliis: PtíPPlior a to til) Da, smis -:?>··- stcliisss ms t-&m de enxofre maior. 1® O:'".': > 1® 0i ®d®: os® OU 1 ®:® S®0®o: t1Ό :®0®V1 t:®:®o:la·" ®O o® :··.;. :;>-n a o a ·:.· s® t a a torta na n da Ο) J!aD o®® : · ; a. a a a :aoaladaraçáia de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de sulfato de dextrano ou um seu derivado ®o®:o::oiv®:\l soib o misoi® do tti,.t;:trdl':-tíf.Hl;!f:.d:¢::íta um paciente que necessita desse tratamento.

Outros aspectos da presente invenção são um processo de tratamento de rejeição de enxertos de transplantes de cêlu.l«a que compreende a administração do uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de sulfato de dextrano ou de um seu derivado aceitável sob o toou::.® de vista farmacêutico, a um paciente o®®· necessita desse tratamento e um processo de tratamento do rompimento morfológico de transplantes de células transplantadas que compreende a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de sulfato de dextrano ou de um seu derivado aceitável sob o ponto de vista farmacêucico, a um paciente que necessita desse tratamento. 0 sulfato de dextrano e os seus derivados podem ser Ãdsalt.Pãippdss ροή libertação ai®ti®.:,çí r® si 11¾ da RIIVS to de transplantação das células ou podem ser administrados por libertação directa (localmentc) nesse sítio, stiiisasaô «ii® apropriados de administração que são conhecidos pelos s sp#mi & l i,s l a® na ®® t.é .11 t sei ;-X >·. . \·· ·.^;. ·:··; ·>· ·}: ···; >v ;ν·;·:ν cm- ·- ·:^ ί· neamente, bucalmente, rectalmente, dermicamente, nasalmente, traqueaImente, bronquicsmente, topicamente por qualquer tttts via psa«;·; S’:. \i:0...:0 S ou r asa de iáád sob a forma p .as pa moa d. s fa :; a,: í'S>aa x. í xx a-rs camaro líimrpPiamf s ,η:;;: mw ::· ····. -:-· ·: · ;·;<·:·. χ··:·χ ··.· ·.·. Sus da d: a ífâas: a ;-.-r ·.·.·· :·.·: a pp&tf de '> 'v <>· v> f iSfíSaOê ÍSXí, lana ffifi s 0 forma de f. .d;aa.apI'Si:f a.o.a' 0 das células, 0 sit i 0 de f ais. aspll safai ala e 0 paciente a ser >· xf:·:·,:·-· .--1 ·>·: ·;. v:·;' x·-.;· c assim aamí: í a ais de sa.a:i. ; ... ,. .. .. ÇS.ÍS, as: aaosja . '·': ·;·?·. ·'·;· >'· .·;·; ;:· acsdqa ser a dmi n i 31 r ado s em várias doses.

No tratamento terapêutico de mamíferos e especialmente de seres humanos, o sulfato de dextrano e os seus derivados podem ser administrados corno uma formulação farmacêutica misturada com adjuvantes, diluentes ou ytii sttlms aceitáveis sob o ponto de vista iszmt&v&k&ç, 1¾ se podem seleccionar tendo em vista a via pretendida de administração e ã prática farmacêutica normaiizada.

.1/:: quantidades de ;ΡχΓ.ϊλΟο de dextrano ou dos seus derivados dependerão da severidade da condição e do ' eata a ser tratado, assim como da formulação actual e da fia de administração utilizada e podem ser determinadas sem ser pelos requerentes, por especialistas na matéria. A concentração do sulfato de dextrano or; dos seus derivados a serem administrados, de acordo com a presente não deve ser demasiado elevada de modo a quai.rípor efeitos colaterais associados com sulfato de doari imiu dl: maior oardo das slssssaças sl.ínj -00 as doses aaasiaaaisass; de de dextrano ou dos sams derivados no xzàtsxmilx •?:.g:&§]aêufeico profiláctico da pacientes xxxxtxxxx.

IddCi .:¾. d ·’ϊ: :11:-¾.Ν' * ·:" ,-:¾ Ν· humanos, :¾ :a ;··. :: :::-: j :::: >:·. ··': :· :'v·:: ç^,:¾ /·; :: S nu:.::-0 ahoi.v •a áx 5 tmj fníaaí.:;.xx a 2 sao ara iia/ad.., Um íaaalra de χχχχψχχζ^^Λο preferida safa entre 'bidol s os/ssl, :οοό::; do sons 0,08 ísu/ísÍ ou mais 62 0:,:0 0,1 ::::::0/:0:0 :0/00.:: ;:x:s::;::s co que 0, 8 mg/mL, menos do que 0,6 00:::/:::::1, ísosos do qoo: 3,4 00 menos do que 0,2 oso/o:/, por Písompi;::·,, dentro do ΟΟροΟη. e 0,2 00:0.0:::i, Estas ::::::0:000000: ;:S: :::0::0O: 0 000; ροοοοορ:;:: serem sufii oo: oodo os para píssooos 0 ou,: .Oorohooo a 0:1100:0 e a ::ls/S/0;o..;:Pp:Ps: morfológica e a 0::00 aoopa -o do enxerte sboo transplantes de o:/·.: s/fsrp mas são ainda sufi cientemente baixas para minimizar q:::S 1 ::0: ::¾. :00:: efeitos colaterais normaimente associados o; administração de sulfato de dextrano. filé::·':: disso, os iiéus em ;:o ti too ooo: em SD-BPM não ito: qualquer efeito adverso na função dos ilhéus a concentrações que variam de 0,01 c 1 ssp/isl,,, Em qualquer circunstância, o médico ou um especialista na matéria serão capazes de determinar a dose actual que será a mais apropriada para oooor paciente, a qual pode variar som a idade, o peso e a resposta do paciente 0:00 particular. As doses identificadas antes são exemplos de dosagens preferidas do caso médio. Contudo, pode haver exemplos individuais em que são necessários intervalos de doses mais elevadas ou mais baixas e essas estão também dentro do âmbito dâ presente invenção.

Hoje em dia, o sulfato de dextrano já tem sido utilizado em estudos clínicos para a terapia antí-virai contra 0 V/H., o tratamento de enfarte cerebral agudo em combinação :0:::0 urocínase e uma terapia anti-hiperlípidémica, 00: qm. o sulfato de dextrano está acoplado a soío: faPs só: li dosi Pr d sós primeiros tipos do estudos, a taxa :ís lov/Mould foi 00 000:.:::::.:

cerca

tratamento p«s:u:Mos 3 dias de tratamento o a alopécía foi referida em cerca de metade dos pacientes. Contudo, ambos estes efeitos Sís UU O Í5 0 CÚÍ: Ο:Ϊi 100:0U ·:.Ul O de OUtltUlb í g / ou «; do buguuggo dobs tf:ãnfpXòdt::;#:S do; cubuilggs í normalmente feita durante até i-í q: sduunss dias. Por Χηο;.ρ mo efeitos . . „ idd.ifd bágulit durante um período de administração curto (alguns dias ípggutdo comparado com. as 2-3 semanas). Já se sabe há muito tempo que o sulfato de dextrano induz hipotensão por via da libertação de bratííquina resultante da activação da calícreína no plasma. Cmtwifn esta observação foi feita, pela primeira vez, quando c SD-EPM tinha sido imobilizado em colunas de plasmaferese para o tratamento de hiperlipidémia e não durante a ínjecção de sulfato de dextrano. Este efeito I: uma consequência da directa de FXII com FXIIa. Contudo, no presente documento dá-se suporte ao facto de o factor XII não ser dírectamente activado por YD-BPM. Tal como se mencionou antes, cs níveis de FXIIa-AT e de LAP são elevados quando as células estão expostas a sangue estranhe sem SD-BPM. Contudo, estes ele-;iados níveis ficãm normalizados quando se adiciona SD-BPM. rn.r. íis«, enxerto V o'-.0:· :·'··': dextrano 0: difí ffg.:gb1 00:::1 para paciente podem ser ..si compreende o sulfato de dextrano de acordo

dissolvidas a ae que uma 5 e prererencialiriente dentro de 0,01 (I oca linent e) no sítio aa t ron sp la u: a 1 para as primeiras heras que se sequem à transplantação. Como um especialista na matéria compreenderá, a concentração actual de sulfato de dextrano ou dos seus derivados pode temporariamente ser mais elevada do que a concentração óptima no sangue do paciente são as células ou os conjuntos de transplantados dissolvidos numa solução com o sulfato de difundido a dextrano. Em seguida, o sulfato de dextrano partir do sítio da transplantação baixando a concentração local de sulfato de dextrano. Nalgumas aplicações, não é necessário mais nenhum sulfato de dextrano para inibir a RIIVS, o rompimento morfológico e/ou a do enxerto dos transplantes das células, dado que a concentração terapêutica do sulfato de dextrano pode ser necessária apenas ate às primeiras 24- 48 heras apões a transplantação. Contudo, quando necessário, pode-se mais sulfato de dextranc, por exemplo, intravei - , intraperitonealmente ou por alguma via de administração identificada antes. rei como será entendido por um especialista no muspíç o transplantadas pode ser ,iS£:PyCl.3 ·> ?'i ^ '« ·:·

.;··: >/' .g: ··: bòfj :o'if 1 «;f j.âodo 33 :;b

«0:03 0-0:--: ,¾ ·· ··,.·.·. oíOí: J: 0:::0 00 m B.1I7S, 333' !: :,; .. .:. ::: :.:::: ..:3: .3 . .. :;:/.. ponotíí oo: -.- .* *.· £ o aooocoo h p-í-ooooooo invenção t-sp toísbfe pos pbisppc --sp :3:-::.33:: vi: 3.3- 33: 3: - -3 : 3: 3 3 3: .3.’ 3- 3 -::: 3: 3 333 :...: 3 : .:3::::.33::3 33::: 3 3 3: 33:3333: 3 :3 :3 3 rejeição de enxertos do transplantes de 041-«.:«, compreendendo :::33¾ quantidade efectiva de sulfato de 3:3.3-:.33333 ou de um seu derivado aceitável sob o ponto de vista ÍMZtâà&ê&llCú e uma formulação farmacêutica para ser utilizada no tratamento do rompimento morfológico dos transplantes dar células transplantadas, compreendendo uma quantidade efectiva de sulfato de dextrano ou de um seu derivado aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 0 sulfato de dextrano e os seus derivados podem também ser combinados com outros agentes terapêuticos que são úteis no tratamento da rejeição de enxertos de tecido transplantado. Exemplos apropriados mas não limitativos desses agentes írnuno-supressores que podem ser utilizados em conjunto com sulfato de dextrano para o tratamento da rejeição de enxertos são còoIob&põ£-l-n4> tacrolimus, rapamícina (sirolimus) e micofenolato de mofetilo. A &é£&Líúde sulfato de dextrano ou dos seus 3Ú33;:.3:33Íooí. de acordo com a presente invenção podem também sei o3n/i 33·:! 3 -.33 0 33-:3 3 π 3 3:::.-::3-3 03 -o: 1 3 --í 3-33: ΡπΙΧ-ΤίΓ 3/00 'C> .0-·- â& 0OV30

Reagentes : 5 000 Da s im zmot 0¾ enxofre de aproximadamente 17 % na Sigma Chemicals (St. peso molecular (SD-EPM) com cm peso molecular móblo > 1 000 000 Da e um teor de enxofre de i6 - 19 % ria Bioscience (ffpps-èXa, s’; . Obteve-se dextrano de baixo peso molecular i00 5 0 0 0 Da) e dextrano de elevado peso molecular tD"'DFàD PM > 1 000 000 Da) na Fluka Cíiemical (Buchs, Suiça) e Sigma Chemicals (St. Louis, MC, EUA), respectivamente.

Tratamento com heparina

Todos os materiais que estiveram em contacto com o sangue completo foram fornecidos com uma superfície de heparina Corline (Corline Systems AB, Uppsala, Suécia), de acordo com as recomendações do fabricante. A concentração de heparina na superfície foi de 0,5 çg/çgeç correspondendo a aproxímadamente C, 1 U/cm2, com uma capacidade de Xlgsçis snt.i-t rombina de 2 - 4

Preparação do sangue rer-se uma smxl bxd ts: do cangoe bxxbo.ac; fresco, obtido de :x x? ca r f í ,xx x. e {4 i Mm B:m 10, Microlance; d d t: to ;x g x o d.) q $. o ç, :X; :

Liqaram-se as à [dtptkta ç.:.:i e .£;.®:ρί:£Χr:Msç. r:a ;::i ;i : : r " ·χ;' ; η ΟΟΖΟ ίΟίΟΤ ® ' \ :í:í--τ-ϋ'-ίΊίϊΐϊ'··"ís/::.::.::,5.ίί'ΐ'ϊ-ίϊ?· CÓdc' f;:J lí 1¾C K df kzísík c-S ) PT; :ρο:"ΡΡ3Ρ·>:· Çuot:;::;:: v,. dOddot 08 Píldodls LdgU®;i:.:i:J ά^ΟΟάο ;:: íus,:*: ;tH:o: a pMiOOo :¾ aí:

Isolamento dos ilhéus

Isolaram-se ilMu::; de porcos d G U -1 t O S i λ 1-! .é -j do pâncreas de porcas Landrace da Cldroci; com 2- â 3 anos de idade (200 a kU; kg) por meio de processa de digestão pancreática enzimática e seguido de filtração e separação ds* ilhéus em gradientes á® Ficoii, conforme sugerido por Ricordi et al. [19, 20]. Fez-se uma suspensão dos ilhéus num meio de cultura Ml 9 9 (GIBCO, BRL, Life Technologies LTD., Paislev, Escócia] com 13 % de soro de suino (GIBCO, BRL), nitrato de cálcio I mM, selénic· 0,02 μΜ, nicotinamida 20 mM, HEPES 25 mM, Fungizone (500 μσ/L) , e gentamicina (50 oti/tç e fez-se uma cultura em frascos de 250-mL a 37 °C em C02 a E % e ar humidificado durante 1 a 4 dias. Mudou-se o meio de cciτ®®a no primeiro dia e depois todos os dias 3 seguir. D ccdstEí:® dos iiloèua e s sim porezii foram determinados and oo' ftittkiSd-òpio invertido e corou-se com dkdczom® (Sigma C0:;tíii:í:;rdl:sf St. t>ÒÚX 8, cto

Indução de diabtes em ratos atímicos

(Paio Alto, CJtf EUA) de acordo com (çaanbeao et a( do-ad dm ®·.§·ϊ.#Ρ:€οϊ£θ£.ί5;ίϊίΐ'ϊί5 foi d a ISO mtiudrng dia pdmm: :mm rm os i S t o ~àt. iitdcdm: λ Coíis.í.dsaara^aíí m;m tmaUmmi úi

Transplantação de API para ratos atímicos diabéticos tratados com ou sem SD-BPM

Depois da terem estado em ctdcrtrm durante 4 dias, transplantou-se 5 μΐ., de API (-5000 lEQs) resultantes de cinco isolamentos, para o fígado, por via da veia portal de ratos machos atímicos, diabéticos, recém-nascidos, que tomam anestesiados durante a cirurgia com ísofluoreno. Trataram-se cinco ratus i.v. com SD-BPM. Injectou-se 0,15 mg de minutos antes da transplantação e ir:jectou-se mais 0,3 mg, 6 horas depois da transplantação. Depois, administou-se SD-BPM duas vezes por dia nos dias 1-2, 3-4 e 5-6 dias após â transplantação, declinando as doses de 0,5 e 0,25 mg, respectivamente. Injectaram-se seis ratos (não tratados) com um volume equivalente de solução salina, da mesma mom-oiro..

Análise estatística

Todos os valores foram expressos como a média t: DPM (desvio padrão da média) e compararam-se utilizando o teste de Friedman ANCVA (quadro 1) , combinado mm® c teste t de

StudSídt (φ,Άάηί 3) , o mpmts!;: dg |:t;m;ad:t;®çdn assinalada mm dm i ctiíttUi Çdtttttttt 4K m o teste dm (ddCdui ii:tm:bt:tt dm 1. dm mimo md; , Pdgtdt;® do ittsbtm pô&t dimm dm :dmbtiddm dtmmmbio 5) . do UO .. ..i. UOO.: O.;,.i i. :; iii ii. i. i.i ; .i:'. .i; ; ; t :iii ii- O ; Vti t! v? f. P i O: ύβ*· ί::: !ídÃ::dtOu:; -V I'· >>· ··; ;sj. ❖··.·! ..··: χ.:w£:;r:. Óç ,:¾ < ;Γ·->-?·: Ç

Qualidade dos ilhéus ΡΕοΕΡ corno um teste í:ddB;:;PoO:iI ssuts âPt. PotiPtiΡοο-ΒΡ OpOPpíp ilhêiiíi is agitaram-se cuidadosamente mu seio :'.ví Pt -1 <:'< -n í·.·· ί-ΡΟ iòt de ' - ' . :: 37 í;T:ç durante Pd minutos. Depois, mudou-se a concentração de glicose para 16,7 mM durante mais PO minutos. Recolheram-se os sobrenadantes e armazenaram-se a -2 0 "€ até se fazer t analise. Analisou-se o teor de insulina nos sobrenadantes por ELISA (DAKO Diagnostics, Ltd., Ely, RU). Calculou-se o índice estimulador com uma relação entre a concentração de insulina com alto í.v:·,.:.i. de glicose e baixo teor de glicose, respectivamente. A pureza de API utilizada neste estudo variou de 81 a 95 % (média, 88,5 ± 2,2 %) . O índice de estimulação no teste de estimulação de glicose estática estava entre 0,8 e 7, (3,4 ± m <·: , e o teor médio de insulina foi de 85,5 6,2 pmole/gg de ADN.

Além disso, mediu-se a relação de ADP/ATP para avaliar a piábilidads :0p API em cultura, utilizando o kit Pr:f:ddc::ap:': (LumiTech, Ltd., Nottingham, Bdl, Em resumo, Lavaram-se equivalente íit: 75 ilhéus (EQI) de API no veio de SBL c depois aduto:ytttm-te com 100 pL de reagente goo liberta durante tu dpo;· P temperatura ambiente. Depois, adicionou-se s stiutçsn ,;u md de reagente u-ts monitoriza o nucleôtído e t:td ;mu:íí:’:·''·so cu; i. .·. v... ;> o.u PP u r. 111 uiooPP; um 1 nõmer t -u PB Pt ΡιΒΡλ ituiOtut f iõt POmPO Pu ·: uoulsm PVuPuPu 0.001., PPotdi* Pu,

PdomarpBÇ u uxjJueaídiSimee :1:010 o OiPsuto àe unidades Po Luz •-•v.yg i 5 ÚÇ converte ADP e depois mediu-se 3 dl:

Era seguida, d:'.alou - si is aDd/ài;> ,ι+κ âFlr ficn-i: ;idípbrdÂ:! por Í:l2idbli.0l? ót ai. b-cL; , 11 2: e lio;:.: pç αρα? ::;:! Idíd/dSrD 211 APi r d.·. Síisvd.'·.dll 71:1 ΟΟ-Ι:,:!,:;!:: ilijli';: diSSarídiS d’d: tt t 0 d ί;.·;, calculada como uma percentagem, ΐίΐιΐ; οΐοοι,ιιιΐ; íi-a EÇI ébiliilau rio dia 3, comparados com os do dia 0, fazendo a ddltura de h?t de três pâncreas diferentes, na presença ^CKoil* 0,1, ou 1 diípotidi ox na ausência de dlõ-HiM, durante 3 dias. Os resultados da taxa de mbwTi^ênci&> do índice de estimulação, da relação ADP/ATP e a relação de insulina/ADN pãra as amostras de controlo e para as amostras com as três concentrações diferentes de :10·· 0ΓΟ estão apresentadas no quadro 1 a seguir. O SD-BPM não mostrou efeitos adversos na função, viabilidade ou taxa de sobrevivência de ALI para qualquer uma das concentrações ensaiadas. Méis disso, nlo houve diferença entre a morfologia da API SD-BPM. tratada com SD-BPM s a AEL de cultura, na Quadro I ausência de AFI em cultura APx em OCíe ;!i.;C em cultura API í;:Â?;; :VV:.:, VàliVU ser? com d!--0555 :.-.- 12'-'2:11; (0,c? mí&l·} (0,1 rç/wc; ÍV!V«: lll·:-1 lll ]1 Taxa de 2 5,2 43,5 i 1. Ϊ lll, -Ί - 4,3 68,9 i 2,5 de EQI) ;OliOs de •uis-t-s de EcE 1,7"+ 0,17 2,26 2 0,51 3,22 - : ' ·.. ;··: ··> 1,2.1: a 0,35 12::.1:55:-¾¾ ΙΡΪΙΜ Ϊ 1 :À 1:,112 1 3,03 (,.li 1,11 1 2.:21 79,0 2 11,4 66,1 ΐ à 7 i, Ϊ 2 7,4

Tempo de coagulação

Ctí:&wã-íMí ítmuuuo de quatro s smo: :do.i.l>ò::;v: VàdP&ãi:b#.:í"?? contendo extrato. o luuoguo

U Oti.tj. St O !;t\í:5í μί.ΐ CDx X ui. dU Í\ÍXÍ :S 31 x S;í: X X·;': U :¾ ÚU amostragem «« propò lato mm 'ííkíMxX^ò XfexiiooíTM: PlUtoa 1

Haemostasis B^êxiã] o udxcçao to coagulação miciou-se pela adição de 20 pL de C,eCi,1M no presença ou na ausência de diferentes tipos de dextrano (SE-i&CM., - D-BPM e D-EPM) . D® 6 em 6 s, colocou-se a taça numa oscilação isenta de teuvSç a volta do seu eixo vertical e registou-se g amortecimento e a frequência das oscilações. Identificou-se o tempo de coagulação como s ponto de amortecimento máximo.

Os resultados cbtidos das experiências do tempo de coagulação estão indicados no quadro L a seguir. O ÃH incubado em sangue humano citrado induziu imediatamente ã formação de coágulos, a uma média de 6,1 ± C,3 min depois da calcificação. A formação de coágulos foi totalmente anulada na presença de SD-BPM em todas as doses ensaiadas, enquanto o SD-EPM inibiu a formação de coágulos apenas a 0,1 mg/mL. Tanto o D-BPM sono o D-EPM aumentaram o tempo de coagulação para apenas um menor grau comparado com as amostras de controlo (sem aditivo) . Assim, a sulfatação sio SD parece ser ô»«&&!. para a capacidade inibidora observada.

Quadro 2 ís !··$:. o: dl !.;s'.j/;ííhí ·>- . V:··; ;.y -çç: ifiimsn- V· ÇO >:·. ç iy s;í;;,-.:í:: :?·'? 0.:1:. íSSiyÇiO:: .dini itl, S: V Μ,ΰ 0 S SSÇ.OSSii; .íiO:· V 20 , SIS :> dg D-BPM Si mg/mL) 19,2 : .1 . 3 is-ii m .: KW·/®.;..) 25,2 d v .· U· (0 01 /'SU·...:: 19,8 >. , :?í D-EPM (0 1 :¾¾ ds.li: 14,2 âs ; 2

Inibição de RIIVS por SD-BPM

Utilizou-se a perfusão de f.l.:háus de suínos adultos em anéis de tubos de PVC hepariní zados corno um modele para avaliar o efeito do SD-BPM na RIIVS e da tóiUwi: de suínos para humanos. Este protocolo realiza-se basicameuLe como se descreveu antes [4, 23] com algumas modificações, Em palavras genéricas, utilizaram-se os anéis feitos de PVC (diâmetro de 6,3 mm, comprimento de 390 ££:?}.> cuja superfície mais interna foi fornecida com. imobilizada. Manteve- se a tubagem em conjunto com uma peça de ligação heparinízada especíalmente designada. Um anel guando as extremidades da peça de ligação foram totalmente empurradas para dentro do lúí&i&n das extremidades da tubagem. Utilizou-se um aparelho de cskulucidíu numa òo:<uççíg:òcr;:ç c 37 "C, para gerar um fluxo de sangue dentro dos anéis. A oscilaçao cieoçíns; snfds zui iÍK&dii de mndiis g prevenir ¢,¾¾¾ g çooíaío ficasse em contacto com ao peças ae

«çilwylví oalte-t sem API 3:50:033 um controlo. Em duas experiências, um sanque te^ato fresco 1

Mftei r* te-te-Pif sem API. ít:; 3333 íí mr: >v ter:te. ",-,χ. <·>·.;<.·. ··..· ;f fez-se « trt'· irtilbiiçi·::; 0* 3500-.0.:-3 :-; sMisi-u com 1 :33::5: fO 5 v : i Sy riu :::ntr .3 .sit-ííterte aue ··· "· .-·:· 0 >·· <·: ;; <;· ;:v.:·-·· » ; ·;;··..·* ·#.'. u . -: 3: ·: ·. :· v# »·«·..·;· ·. .·. ·.·.·.·.·. ·..··.·.* .*· que foi rtrrate te;:;!; 1; ); ;;v; Ct Ç.VCtte i te 1. o r .. Elo cada tí adícionou-se, a cada anel, 7 v:.f de sangue tetesat fresco do m&$mz indivíduo. Colocarara-se então ua durante 5 oTte -003:0 roo: SD~ BPM, quer com uma solução salina. Depois, abrirum-se os anéis r c o.;· c ooror.oi " o o ..*]uL .r:03:00:00300- .0 3... :. r.3 00.·: 3:3:33-, 5 o-oo 000 -.---03- . ; . - 5.000 EQI) sos anéis e em seguida por meio de outra incubação de 60 min, no dispositivo oscilante, a 37 "C. Mediram-se os níveis de glicose no sangue com um glicómetro (Glucometer Elite; Bayer Diagnostics, Leverkusen, Alemanha) antes da perfusão.

Depois de cada perfusão, filtrou-se o conteúdo dos anéis através de filtros com diâmetro de 70 μπι (Filcons, Cuptype; DAKO, Dinamarca). Tanto os coágulos de sangue como cs tecidos macroscópicos recuperedos no filtro foram separados por congcteç-te no seio de isopentano para a a 1 imuno-

factor XIIa- antr -tcombina 3.3-.:"· (ο :.:35::0 foo tc te; ó: te: te i ca .teor:;:: te; do ítetepO. oo teite::. ç: .te '·· : f· ç; Ιού: C i- \ X te :-:9 J; 0.1:003: de ~ci te •i ; ; , te te C te 1 ; ); q:· teff -:· lte;::te;T -teii-úoi··;*: te ·< :Ó:; :f. OÍO histoquímica. Recolheu-se o sangue filtrado remanescente no seio de EDTA 1,4 M (concentração final) e utilizou-se para análise hematológica (plaquetas, linfócitos, monócitos e granuiócitos) e ensaios de activação da co-tfulaçat (trombina-anti-trombina [fâfv, complexos de factor Xla - itelteistebi-ai [FXIa-AT], e complexos c Ml), teiivseM te fitei olasmina alfa 2 [PAP]), 9e ;sc:333.vr-c-Síí r-r : :-;: 3 33-::: -:- 3- : -::: ---.3:33: 3'3 : --: 3:33.3.::::::: Qa *3X333:33. f3;S: do factor i; 33. 30 30 ui.:;.*: :.::3::::.33 ν>·:r di.u^s-Wí imediatamente para os 55555555:55 dvvç5.1as amostras de sangue a 4 °C a 32 90 x g 5.5 í; ts 20 5::1.0 5; 5 5:1:55:15-55 5 plíi.5.'55 5 5 55:55 55555---55 5 -70 :-Ç até serem analisados. Os níveis de giiddst no sangue antes da 515,1 1 5-5555 51:': :v. : .. 1:1 1 .5 1 5 55 4 , 'V: . .: ::5::551.5:1:/1- -.

Analisou-se as contagens das 555555555 e as contagens :55.:515.5 55l5:55 / 5 dcs .ilíí/Í55l:5.1 ΐί/ΐ/ 5:.55 5:5.-5 i.5 5 5--55 5 55/1-5 55.5 5-iCl (Beckman Coulter, 1¾ EUA) utilizando tratado com 5155:¾, 0/5/;titi 555:---551 T55' 5 CÃ5 555/1.5515ildo 5,.:15:/ 55 ..1.::515::55 -- ensaios de enzimas (IEE) disponíveis comercialmente (Enzygnost TA , Behringswerke, Marburg, Alemanha; Irauclone© PAP, American Diagnostica Inc., Greenwich, EUA). Analisou-se FXIa-AT, FXIIa-AT, EXIa-C 1 TNH, e FXIIa-Cl INH de acordo com o processo 20 de Sanchez et al. 134], Analisou-se C3a como foi ύνΜΐ/ιΙιο previamente por Nilsson Ekdahl et al. [25], e analisou-se sC5b-9 utilizando uma modificação de IEE descrito por Mollnes et al. [25, 26].

Nos anéis dos tubos 555-^551.5:5 sangue humano fresco sem API, as contagens de células de sangue, a 5 -.:-55 i 555·-, e os parâmetros do complemento alteraram-se apenas Ligeiramente, como se pode ver no quadro 3 a seguir. Todas estas sitdiVHçdvi: são consideradas como alterações normais em relação ao antecedente, resultando da interacção do sangue com a superfície da tubagem e a interface fluido-ar. 0 SD-BPM r vv;':; « 5155.55::5-:5 das

i;\· V /5:../.-si5: de .1 /: Í5 do 5::5555 j. 5 3) . Ps&fe-.j /5 5:515 5 5' 5 t/li:.': ι5)-5ί-55, 1 /5/.5:5 5 5: 5 / :5 55: / 5 - 5 555 da contagens células

5Í 1;; das dm: mm-amií de 80- mi; .· íMi iodom sabliaS-í X-i:Sei.r-s^-rd::f í 3 , :; ; 1:((11((: :¾¾¾ Z: (.v .. l:":./:; \ .. ::: '".::(: ::::: :.(::: : ( : ·· em doses que variam de C, i a 1 &%/Bl 0 SD-BPM reduz a serrmvte do complemento conforma ensaiado por smmits de C3a e o complexo de íitmpd:? da membrana solúvel sC5b-S, conforme se ((-ia no amaia·! 3. A figura 1 ilustra, com (lidis detalhe, c efeito de SD-BPM na geração de C3a durante &G min de perfusão de ALI com sangue humano fresco no modelo do anel da tubagem. Nas amostras a que se adicionou SD-BPM, c: sulfato de dextrano foi pré-incubado com sangue humano fresco durante 5 min antes da de API com sangue. Os círculos brancos correspondem a 3 mg/mL de CmBim os círculos pretos representam 0,01 mg/mL de SD-BPM e os quadrados brancos e os quadrados pretos correspondem a 0,1 mg/mL e 1 mg/rnL de r8"-BpH:f respectivamente. Um diagrama correspondente ao efeito de SD-BPM na geração de sC5b-9 esta indicado na fig. l. Como se m claramente no diagrama das figs 1 e 2, a principal do complemento ocorreu cerca de 30 min depois da perfusão de API. A administração de 0,1 mg/mL e 1 mg/mL de SD-BPM inibem totalmente a geração tanto de C3a como ao complexo de ataque da membrana sC5b-9, enquanto a mais baixa de SD- BPM OQv/i rsif/sld reduz signifícatívamente a geração de C3a. Não se gímii PXia-~€i INH em nenhum dos anéis de tubagem â tlah i s ú ihsí iltáhín t vs dd SI d do pdí 'iV d :td d pntitCtdd di(d: Sttã tddtíi:0ã; , dXId-Ci INH mia se alterou nem na presença mas na assomai a de ddmamd ai ( .( (:-:0 dl ;a

Quadro 3 χχίνχΐχ ::ίχ 1:-1: :·. 1:1 ΙΙ- 1 : fi v.; ΪΜ , :f í 1; -x i;í: :·: x ·:·; 11:1: i 1.x :· :xi 1.· : :· x·' 1·ί· .:··;··· x 1, iv :> il ::í :> -x ·> X:P :: P P Cp X ·; _ y v ' Λν,ύί-.νρ-ρχ,ν .;.·· ·:· ·> .v ii® ·: a, :··* • <:· .·· X :· x. d-p ΐ x, >:11 :Ívxi; 1 x\: IO·' í. 1:1: i :Í, : ; xi·;' : xf: '·>. .·:·:·. ·> S . ··· -····:···-· ·-·. · aà-1..11- ç v.y. v /llí. : :-· li·' ο·:;.;.1 i-xlixpp 1: 1:1.; Ú ' 1. ϊ·-· VI. x x i.xi o. k:í j pa .·. :·:· -X: ·: Pi::: ·:· x-_ d d' 1; x- :i _ d ; xy. lx:: >: : ··. íx ·: . -x Ç: d ; -ρύΐ :: dx í, -i :: ®. SX :>.Wv :-·-·· ix SíipSí : Ρ.ϊ: -ρ·ρ:ϊ i pp® ; . > 1 : -i •iXÍ-x.í· :11:/1:1.-:-1- '1;':· x,::·.,.·>··' lllv;. 1:. i·-:' yò: :·:;:;··ν Μ--Λ--Ϊ i : ;-x> - ç : d . í'sí,i i o; >. O.-i V. õ,r. . • > :::W:v:iíí:íMÇ; a®·: f. pp. Í::. dl ·:· -y ·;.;·· > xx-::;:·!' i,:.'! :;- . Ipl Ιίϊ.:! ΐ lX;':-;· ' ΐ:- d:·-V: 1:1::1: χχχ x d Ρΐ: . ;Xv X v.\vx :yÇx.xl<:>·· íxxx χχχΐ-;: Xi: v:·:..:. ·:··:··ν:νΛ:ν o:-:> x 0 efeito de dextrano de BPM na contagem das células do sangue, na coagulação e nos parâmetros do complemento passados 60 mín da perfusão de Ml com sangue humano foi investigado por meio do modelo de anel de tubo similar ao de SD-BPM, conforme discutido antes. Uma comparação entre D-BPM e SD-BPM nos sintomas da RIIVS está indicada no quadro 4. C dexcranc de BPM, que não está sulfatado, tem apenas um efeito marginal na Estes dados indicam que a Patoçta parece crucial cara o efeito „ „ : ' provocada, mar APT.

Quadro 4

í:x ;:5"í: í v-jj comparada com as ansas de API v-sm D-BPM í.>ssy í: ·>:: ’ ‘ ‘ " f .i :V. nx; p:f Ç: οχ: χ^ν;' :.‘o :·

Efeito directo de SD-BPM no sistema do complemento no soro humano 0 efeito directo de SD-BPM na a§,#e«tâ do complemente foi. investigado por incubação de soro humano no tubo de polípropileno. Adicionou-se scro (1 mL) a cada tubo em conjunto com oD-BFe até a uma comocoirepão final de 0, 0, π j. 0,1, ou 1 mg/mL. Aos 5, 10, 15, 30, 45 e 60 min depois da incubação do soro, a 3/ "C, transferiu-se 100 μΐ de soro para os tubos contendo EDTA 10 mM. Armazenaram-se estas amostras a — ?0 :fC; antes da análise dos componentes do complemento C3a e sC5b-9.

síí ui·; efeito inibi dor. B&boxa os efeitos no sangue completo e no soro ido ser directamente comparados, o SD-BPM, por prcooipmifurõc11? .tirídii a activação do cooolmím-tv mOS liis-iç: i:illi 1:1ΡΧ11\: tpi i 0.0.001 . Coto v'0;:BCvvOvt.t'O :1:11,1 Mliidásç o iióilli i ívibi^CiP pdildPllvi . sobrevivência do enxerto em ratos atimicos diabéticos

Me d iram-se os níveis de glicose no sangue iiitildi áà's caudas dos receptores utilizando um instrumento de medição de glicose B Glucometer Elite (Bayer AB, Gothenburg, Realizaram-se as medições diariamente antes das 12 am e foram expressas como mmole/L :,l mml&fXi = if mg/dL) _ Considerou-se que a perda da função do enxerto tinha ocorrido se os níveis de íplicicoc B excediam 11,1 (> 200 pç/dLi durante 2 ou mais dias consecutivos. Definia-se a duração da normoglicémia (< 200 mg/dL) após a transplantação como 0 período de sobrevivência do enxerto.

Todos os ratos atimicos diabéticos induzidos com estreptozotocina ficaram severamente hiperglicémicos antes da transplantação, não se vendo diferenças dos níveis de glicose B entre os vários grupos de receptores. Os níveis de glicose B sem ser em jejum foram imediatamente reduzidos após a transplantação em todos os receptores dlAbétXspç em que se implactcú inyraperitonealmente API. bontudçç ps ratos não tratados permaneceram n0rmog1ic émic 0 s duranre apenas um e 1 p i ç® 1.1 t: ifipo 1.1 ií t a d iç iir pádrb 5. As lllliiiã il lliplll 1; mil: 1:: 1 :;:í (8 1:::i;; v. /8 dlllltd 1:1 lll.iill: 111 3 dl 11 lilDlis: dl í: ri-mâpi ::8-: fjppp·;; QU&tx 1 dos seis latia í :s 11 t-litlllll. :11:1:1 ;u::.p:ç pirii, a 1 íiii ilidiptcila durante um líiid-iiài liicul 1:S 1 íiiil 11 lltOs 1::11 lldls; 1¾¾¾ Ιι-Ιιΐϊ cii ::1::: 111 lii 1.1:1:11111111 (8,8 dias, p

Cii: ,$ Mi 0 ; ·;. íf ί!ΐΐ|··:Ι '1 V 000¾¾. ; i: :i i ; ;; C: Ç ii: \ i’l I'?ι: ο.υ;ί1$.ϊ6:8 s t is R Uti «1: Ss®! -S ΐ fi diabéticos quando se transplan-ÇiXitO''isi» so.b o espaço κ:ΐΐ;ο·":^ί¥ρ®'ί.ΐί:·.:»τ iit comportando o enxerto ηο£;ήί.ΐ':·οο de glicose no

Quadro 5 as; :'-i - Ή:: l 5 i p :·: r 1 f Sai. E 1 , o . d;. 6 Λ:·:-ίίΡΜ 4, 6, S, 14

Experiências imuno-histoquímicas

Recuperaram-se os ilhéus e os coágulos macroscópicos ncs filtros passador 60 min de perfusão com sangue e com SD-3PM (0,1 mg/mL e 1 mg/rriL) ou sem SD-BPM (controlo), depois recolheu-se em de embeber (Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN, EUA) e congelou-se no seio de isopentano, seccionaram-se os ilhéus e em seguida coraram-se com CD41a (R&D Systems, Abigdon, M;6 anti-humano de rato conjugado com peroxidase de rábano (PRB) e anti-CDll b+ (Clone 2LPM 19c, DAKO, Carpinteria, CA, EUA) . 6b estudo in vivo, os fígados de rato contendo API foram recuperados 10 dias após a transplantação e congelados no seio de isopentano. Seccionaram-se as amostras e coraram-se com ent 6v·::· inc.b.iós de porquinho da Guiné (cobaia) (DAKA, carpinteria, CA, SUá; e CD11 b·*· anti-murganho de rato íSerotec Ltd. Scandinavia, Oslo, Noruega). puiibabísb 6(3 ?b n, to?, η-'; η οού s os llhi obC: b:tMbb:í:ÍD.s ·£; .'. 3 : A "' v>: '-.i >-Ç: 00:0ei :·'t«:0toes:StS S mcint.LÇ:. -¾ òc;‘Ç; íÇcnSSçtiol: , 6 .biibSb ii 61 seó-6i.: i.silae Píos b; :M:i oO O o6|ísu Xb és fibfibb b pliSpobi:? :: :..oU:il PP U'.bib.:.v: ·. :·:<· 6 : ·:ν ·.; ·.·.· ... λ •1 IX t; Si tbS b ss:.·; Oèl U £ ··..;;·. ..y bb Si os Siçobcs/ÇSíS ::¾¾¾ 3116¾¾¾ ré:;:; iog verificou-se coo: T; :¾ 1 olhe pio aa :l10 5í o ή-^iM-ò dm cènsioo CD11 b+ de

mg/mL. As amestras de éhtvirdld apresentam também orno camada espessa de plaquetas que admrmm: às células, como se vê na figura 6. Observou-se uma camada multo sis fina de plaquetas que aderem aos ilhéus nas amostras tratadas com SD-BPM, conforme ilustrado na fig. 1. Os ilhéus de controlo não expostos ao sangue foram negativos em todos os corantes A maior parte dos ilhéus recuperados dos ratos não tratados ficaram enclasuradcs nos coágulos, conforme ilustrado na fig. 8. Nesta fig. 8, a seta representa a formação de trombos com ilhéus de suínos enclausurados. Contudo, apenas alguns ilhéus dos ratos tratados com SD-BPM ficaram retidos, conforme ilustrado na fig. 9. A coloração imuno-histoquímica mostrou uma infiltração de leucócitos CD ilb+ C - nos ilhéus recuperados dos ratos não tratados, como se pode ver na fig. 10. Pelo contrário, houve marcadamente menos infiltração de déltiidr CD llb+ (MAC-1 + ) em ratos tratados com SD-BPM, ilustrado na fíg. 11. é frequência da fgrmdyõo de c:uégcioc e a intensidade da infiltração de Vsdoòoitos foram signifícativamente mais baixas nos roccpAmcec éhdtcrdC:S com SD-BPM do que nos dõiddtdosdc:? não sretadeo (p = 0,034). és Figs. 4 m 9 tè de

i'.:A

Shapiro d, et al. " .. :'Í xo l«t. transpiantation ':· '1 S :· w: ί >'·· :*-T -:'v 1' in seven f ::¾¾¾^ V Mipl J &ft tal. 34 3, Ics» 4, pp, 230-238 (2000} [2] Nyer E. A. et al., "Clititsi ta té 0:¾. o and insulin secretion after islet transpiantation with the Edmonton protocol", Diabetes, Voi. 50, No. 4, pp. 710-719 (2001; [3] Bennet W. et al., "Damage to porcine islets of Langerhans after exposure to human blood in vitro, or after íntraportal transpiantation to cynomologus rnonkeys: protective effects of sCRl and heparin", Transpiantation, Vol. 69, No, 5, pp. 711- 719 (2000) [4] Bennet 10 tt a , "Incompatibility between human blood and isoiated islets of Langerhans: a finding with implications for clinicai íntraportal islet transpiantation?", Diabetes, Vol. 48, No. 10, pp. 1907-1914 (1999) [5] Buhier L. et al., "Adult porcine islet transpiantation in baboons treated with conventional immunesuppressicn sr a non-myeioablative regímen and CD154 blockade", Xenotransplantation, Vol. 9, No. 1, pp. 3-13 (2ϋ02) [6] Cantarovich D. et al., "Rapid failure of pig islet transpiantation in non human primates", Xenotransplantation, Vol. 9, No. I, pp. 25-35 (2002) "carroll I, C. e Físcher Μ. B. "Complement and the immune response", Purr Opin 1 wmssml< toi., 9, dcc 1, pp. 64-69 (1997) [8] Pratt J. i.. et ai., "Effects of complement ínhibition sdth ttxLdblò rtceptor ·?. on çstsctlo t inóvtf lád intlitmmttiPXí úotuiÇí tmmi iú. t mi cc tido XO th;:·! íéslrp ϋίϊ J. râthp-lf Vol, 14% dó, 6, pp . d d: ii S· - d d V v:.. nditt; r et ,, ,:íLow molecular xeaght dextran sulfate t «·>*«£ iofs in pig-to-human xenotransplantation models", oofotiioo, Vol. 8, No. I, pp. 21-35, :,· m f: Λ ; [ICO; BfliiU tln W. PI, et 1 <·> :···· f v„o ompieípept: in :1 v-· :f -,ν V.·- .· · :ia 1 i DÍV, ferrl r ibitelf; 1 ÍQ ίΐΐχϊϊ tl: viV.í. ff 8 .< . - and rejection", x’' .-:1: r: 00 P J f t( :.;i ,x ff 1 1 1» Vol. 59, No. 6, PP · (1995) [11] Braue. R. B. et al., .·· ___________ ·'<- y :>·:·:: ·>'· ·> ;··; x·.··:·;··>.·;· .;·. ·;·.·'.· .· of fgi;:' XÍÍ.M.i· complement components to acute and f ffstraf fi ri; f rejection .1 o the rat", fr.vxt. IxlePtPtió/ts V&l. 59, fò. 2, PP · 288-293 (1995) I Wuíllemin W. A. et al., "Potentiation of Cl inhibitor by glyeosamínoçlycans: dextran sulfate species ire effective inhibitors of in vitro complement actlaíitiaa:: in plasma", ã Immunolr Vol. 159, No. 4, pp. 1953-1960 (1997) [13] Nakano M, et ai., "Hepatocyte growth factor is essential for amelioration of hyperglycemia in streptozotocininduced diabetic mice receiving a marginal mass of intrahepatic islet g r a f t s", T. m n m l ã ti t ã t i o a, Vol. 69, No. 2, p p. 214-221 [2000) [14] Thomas H. et al., "Sulfonated dextran inhibits complement activaticn and complement- dependent cytotoxicity in an in vitro model of hyperacute xenograft rejection", MoJ Immunol, Vol. 33, No. 7-8, pp. 643-648 (1996) [15] Korsgren O. et al., "Angiogenesis and angioarchitecture of transplanted fetal porcine islet-like cell clusters",

Transplantation, Vol. 68, No. 11, pp. 1761-1766 [Ifff [ff] Menger M. i?. et al "Kevascularization and microcírculation of freely grafted isiets of Langerhans", ftrlf J fitrg, Vol. 25, foi 4, pp, 509-515 (2001) Π;Ί] a&mMi V 1, ifrLicpvmf p of glioi íimss: o rooieif, ôo-og

Pffroff feio 49, fio 2, pp. 189-195, fisc:oooio 196 [18] Dunn I. if et al., factor s in aligoo J nf o, 50, 1-2, pp. 121-137 ifOCf: Π.';·;· RicordI C. et al., "A method for the atam imdstim of íslets froiii the mhhit píg pancreas", Diabetes, Vol, 35, No. 6, pp. 649-653 (1986) (iU: íbtíttiUt: tt.í b , :5 t , !< (li ,¾ ha;; 11 0 Tcts til' à tiSib· 1 ii f 1 tdd: Wl th â a2.11 Pΐίΐ:e : Cê i 31 et s tt d ί;ίύ;UΠd 3yyf > rym ãd wíth t:DD'1 OòíX? ··' lde A, mofetil, ara lef 1 atiadida remam ter up to 100 days", vol. 71,

No. 8, pp. 1024-1033 í20011 [21] Bradbury D. A. et ti,.* "Measurement of the ADP:ATP ratio

Ln human leukaemíc cell lines can be used us an indicator of cell viabilíty, necrosis and apoptosis", J Immune/ Methods,

Vol. 240, No. 1-2, pp. 79-92 (2000) [L.2 ] Wen nberg L. et al., "Effects of iirinunosuppressive treatment on host responses against intracerebral porcine neural tissue xenografts in rats", Transplantation, Vol. 71, No, 12, pp. 1797-1806 (2001) [23] Gong J. et al., "Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model", J Clín lmmunol, Vol. 16, No. 4, pp. 222-229 (1996) [24] Sanchez J. et al., "Studies of adsorption, activation, and inhibition of factor XII on immobilized heparin", Thromb

Res, Vol. 89, No. 1, pp. 41-50 (1998) [25] Nilsson Ekdahl K. et al., "Generation of iC3 at fbs interface between blood and gas", Scand J lmmunol, Vol. 35,

No. I, pp. 85-91 (1992) [Mj Mollnes T. E, tt al,, "A new model for evaluation of biocompatibi Iity: combined οΐ'ίοιίίΐΐΐοίνΐίΐο of tdped i:t 1 t j-y y 1 j 1 >> ;t;. y-:. gf ορ. ::y m. d·1;'^ (y x-V;- ;· 19 909-917 (1995)

Claims (4)

1. IrgiSçi&ví de um Siilõ&ro as dextrano ou de um seu supitdml Stfe ο ponto de umsça caracterizada pelo facto de se doíoftaur d iicaoltudld de um medicamento para c tratamento da Reacção Inflamatória Poiumlauio Ovííõ Sangue (RIIVS) . l. Utilização de um sulfato de dextrano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a referida RIIVS ser causada pela exposição de um transplante de célula para o sangue, no seguimento da transplanração do referido transplante de célula para um corpo receptor estranhe.

3, Utilit&çilíí de tuiiarr de dextrano ou de um seu derivado aceitável sob c ponto de vista farmacêutico, caracterizada. pelo facto de se destinar a produção de um medicamento para o tratamento do rompimento morfológico de eransplantes de ciudloç transplantadas.

4. Utilização de sulfato de dextrano, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de o referido rompimento morfológico dos transplantes de células ser a uma Reacção Inflamatória Instantânea Veiculada pdlç Sangue (RIIVS) . aceitável tdzb o de: virdua farmacêutico, caracteriza da pelo facto de se destinar à produção de um dl,:;. Idiuooosd-o de sulfato de dextrano, de ϊτοτϊτγοοο C OT 0 T CíOT/COiCSC: 5, 0000000-00¾ 1 tosto pálo· facto to: o oe rejeição de enxertos de transplantes de coo o i.o ti UITíâ doe > v çrc Issf .ISOiOOdT :,S> .O..TS. st TO:uca V:#T com pelo Sangue :dldddi. ·.;· T: · · 00: j. d: ΟΟί COTÍ T COt·· · .· d O SUTCUOO? COCO OiCOiS qualquer õ'a.s ^^.vr%^áiciãç.éBB 2 a % caracterizada pelo facto o referido transplante do sêlolts ser transplan-Ltídív! para um receptor que é um corpo humano. Utilização de sulfato de dextrano, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo facto de o referido transplante de células ser seleccionado de uma lista de: - transplante de células alogeneícas; ou - transplante de células xenogeneicas. Utilização de sulfato de dextrans, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 8, caracterizada ptlv facto de o referido transplante de células osc seleccionado de uma lista de: - ooiolt* inoivid; oi*; - coTdad · òo :v ό i c 1 cc ; ο·τ; - tocdoo não vascularizado. OS. i 1 T: C Λ :"· Cl·' SClCOT TcSOiOcO.T 000: 0:Oio::i;OtOOCOÇf 1' O 0, :1o Oosoc TO'::.,, Oo ÍTOOsCOdí iOCOí: Õí 0 0 S. 0 f Ç 0 i. O C O 0 ST O TOO ··: ç 1 Ά C íí- O·? OOoooo STO o xodco y'Ç Ç;Ç : :y, y> y‘y.;;y. y'· ;>> ·>'. \‘y

11. Utilização de sulfato de dextrano, de acordo com cata xuxçltqxxer úàs ç c x trl d di/Cu; :> anteriores, cl xxoxxcoí ri rxuiç pelo facto de o referido saifmtt· de dextrano ter um peso 12. t·tili.tsçào de sulfato de dextrano, e acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo Facto de o referido sulfato dt xtecixrddxx ter xxc teor de enxofre de 10-25 tf preferencialmente de 15 - 20 %. Lisboa, 27 de Junho de 2007