BRPI0316666B1 - novo uso de sulfato de dextrano - Google Patents

Abstract

"novo uso de sulfato de dextrano". a presente invenção se refere ao uso de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento da imediata reação inflamatória mediada pelo sangue (ibmir). além disso, a invenção se refere ao uso de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo na fabricação de um medicamento para o tratamento da ruptura morfológica de transplantes de células e de rejeição a enxerto de transplantes de célula causados pela ibmir. a invenção pode ser aplicada em pacientes que sofrem de diabetes tipo i, em que ilhotas de langerhans de suínos são transplantadas na sua veia portal. a administração de sulfato de dextrano de acordo com a invenção, inibe e previne a rejeição e destruição das ilhotas transplantadas, tornando possível a normoglicemia nos pacientes.

Description

(54) Título: NOVO USO DE SULFATO DE DEXTRANO (51) Int.CI.: A61K 31/721; A61P 37/06 (30) Prioridade Unionista: 28/11/2002 SE 0203526-9 (73) Titular(es): TX MEDIC AB (72) Inventor(es): NILSSON, BO; KORSGREN, OLLE (85) Data do Início da Fase Nacional: 25/05/2005

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NOVO USO DE SULFATO DE DEXTRANO

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um novo uso de sulfato de dextrano.

Antecedentes da Invenção

Nos dias de hoje, 10 milhões de pessoas no mundo sofrem de diabetes do tipo I, que também é referida como diabetes melitus dependente de insulina. Entretanto, o número de pessoas afetadas é estimado de aumentar dramaticamente, podendo chegar a afetar cerca de 25 milhões de pessoas por volta de 2010. Atualmente, são realizadas pesquisas na tentativa de se obter uma normoglicemia permanente em pacientes com diabetes tipo I, mediante introdução de células β produtoras de insulina. Os dois principais procedimentos foram transplantados de enxertos pancreáticos vascularizados de ilhotas isoladas de Langerhans. Embora algum sucesso tenha sido obtido com os enxertos vascularizados (pâncreas inteiro), os problemas ainda permanecem devido ao risco cirúrgico e às complicações pós-operatórias. Além disso, existe também um problema com a diminuição de doadores de adequados enxertos pancreáticos. Ao contrário disso, o transplante de ilhotas pancreáticas isoladas é convencionalmente realizado mediante injeção das ilhotas trans-hepaticamente dentro da veia portal, pelo que as ilhotas se embolizam na árvore portal do fígado.

Um novo protocolo de aiotransplante de ilhotas que foi recentemente introduzido por Shapiro e colaboradores [1], irá indubitavelmente ser benéfico para

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Um dos principais obstáculos a serem resolvidos antes dos xenotransplantes de ilhotas pancreáticas se tornarem possíveis é a reação inflamatória danosa que as ilhotas suínas proporcionam quando expostas ao sangue fresco humano, nas condições in vitro e in vivo [3]. Também, as ilhotas humanas induzem uma reação inflamatória danosa quando expostas ao sangue comparado ao tipo ABO do paciente, no momento do transplante intraportal [4], A reação inflamatória é caracterizada por um rápido consumo e ativação das plaquetas, que se aderem à superfície da ilhota, promovendo a ativação da coagulação e cascatas do complemento. Além disso, as ilhotas se tornam envolvidas em coágulos e infiltradas de leucócitos CDllb⁺, que no conjunto, resulta numa destruição da morfologia das células e perda da normoglicemia dos pacientes [3-4]. Além disso, a inflamação pode acelerar a resposta imune específica seguinte, mediada por célula, em uma fase posterior [5-8]. Conseqüentemente, a inibição da Imediata Reação

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- sigla em Inglês

Reaction), como a aparece como sendo e xenotranspiantes

Inflamatória Mediada pelo Sangue (IBMIR de Instant Blood-Mediated Inflammatory inibição da reação inflamatória danosa, crítica ao sucesso dos alotransplantes de ilhotas pancreáticas.

Dois recentes estudos de Buheler e outros [5] e Cantarovich e outros [6], demonstraram que as ilhotas de suínos adultos são imediatamente destruídas quando transplantadas pela rota intraportal dentro do fígado de primatas não-humanos, mesmo sob condições de acentuada imunossupressão convencional descrita no estado da técnica. Nesses estudos, os autores concluíram que uma potente inata resposta imune, IBMIR, que não é afetada pelas drogas imunossupressoras, está envolvida na destruição das ilhotas xenogênicas.

Fiorante e outros, estudaram o uso de sulfato de dextrano na prevenção da rejeição hiperaguda (HAR) de xenoenxertos vascularizados discordantes [9]. Os pulmões de porcos que se submeteram à perfusão com sangue humano anticoagulado com citrato experimentaram da HAR depois de 30 minutos do modelo de xenotransplante. No entanto, a adição de sulfato de dextrano numa concentração de 2 mg/ml prolongou a sobrevivência do pulmão em cerca de 200 minutos. A rejeição hiperaguda (HAR) de órgãos totalmente vascularizados é mediada através da ação de anticorpos no sangue humano, que se identificam e se aglutinam aos antígenos expostos nas células endoteliais dos vasos sangüíneos dos órgãos transplantados. Essa reação HAR mediada por anticorpos é intensificada pelos componentes do

Γ

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.» .4 · ·· V sistemas de complemento [8, 10, 11], Uma vez que o sulfato de dextrano é também conhecido como inibidor da ativação do complemento [9, 12], a prolongada sobrevivência do pulmão quando do uso de sulfato de dextrano no modelo de 5 xenotransplante usado, é acreditada como sendo derivada de seu efeito anti-complemento do sulfato de dextrano.

Nakano e colaboradores transplantaram ilhotas singênicas isoladas em fígados de camundongos diabéticos induzidos por STZ, a fim de pesquisar o papel do fator de 10 crescimento de hepatócito (HGF) na melhoria da hiperglicernia [13]. O sulfato de dextrano é conhecido como intensificador do efeito do HGF e, consequentemente, o HGF foi administrado pela via intraperitoneal nos camundongos receptores, em conjunto com o sulfato de dextrano. Tal 15 administração produziu normoglicemia camundongos sob investigação. Também, individual de sulfato de dextrano mostrou algum efeito benéfico em cinco camundongos, mas não quando o espaço subcapsular renal foi o local do transplante da ilhota.

Um adicional tratamento com anticorpo anti-HGF ao do sulfato de dextrano administrado em camundongos, aboliu totalmente o efeito benéfico do sulfato de dextrano, indicando que o efeito do sulfato de dextrano nesse modelo de transplante de ilhota alogênica em camundongos é mediado 25 através de HGF endógeno.

Thomas e outros [14] demonstraram que os derivados solúveis de dextrano inibem a ativação do complemento e os danos mediados do complemento in vitro. As em todos os a administração células endoteliais aórticas suínas incubadas no soro

5/48 ·>· ·· ·· • * · ·· ·· *· ·····* ··*«·· « « * humano resultaram no consumo de complemento e deposição de fragmentos ativados C3, C5 e no ataque da membrana complexa C5b-9 das células endoteliais. A adição de 25 mg/ml de sulfato de dextrano CMDB25 inibiu a ativação do complemento e a deposição do complexo citolitico nas células. 0 dextrano nativo não produziu tal efeito.

Resumo da Invenção

A presente invenção supera esses e outros inconvenientes das disposições encontradas no estado da técnica.

Constitui um objetivo geral da presente invenção, proporcionar o tratamento para a Imediata Reação Inflamatória Mediada pelo Sangue (IBMIR).

Constitui outro objetivo da invenção, 15 proporcionar o tratamento para a ruptura morfológica de transplantes de células causados pela IBMIR.

Ainda outro obj etivo da invenção é proporcionar o tratamento para rejeição de enxerto de transplantes de células causada pela IBMIR.

Esses e outros objetivos são alcançados pela invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Resumidamente, a presente invenção envolve o uso de sulfato de dextrano e derivados do mesmo, para o tratamento da Imediata Reação Inflamatória Mediada pelo

Sangue (IBMIR). Essa forma de inflamação recentemente caracterizada é disparada quando as células ou grupamento de células são expostas a um sangue estranho, nas condições in vitro e in vivo. Um exemplo bastante importante da IBMIR é quando transplantes de células alogênicas e xenogênicas

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são transplantados para dentro do corpo de um mamífero receptor, especialmente um paciente humano. A IBMIR irá então proporcionar a ruptura morfológica e destruição das células ou grupamento de células transplantadas, conforme manifestado pela perda de estrutura e forma. Além disso, a IBMIR também produz resultados na rejeição de enxerto de transplantes de células.

A administração de sulfato de dextrano ou de derivados do mesmo, elimina o efeito prejudicial da IBMIR e efetivamente previne a rejeição de enxertos e a ruptura morfológica dos transplantes de células. O sulfato de dextrano de acordo com a invenção pode apresentar um peso molecular variando de sulfato de dextrano de baixo peso molecular (LMW-DS), por exemplo, de algumas centenas ou milhares de Daltons (Da), a um sulfato de dextrano de alto peso molecular (HMW-DS) , geralmente com um peso molecular acima de 500.000 Da, por exemplo, superior a 1.000.000 Da. 0 efeito vantajoso do sulfato de dextrano é especialmente propiciado pelo LMW-DS, mas um efeito positivo é também observado mediante a administração do sulfato de dextrano com um peso molecular mais alto. 0 efeito vantajoso de maiores moléculas de sulfato de dextrano sobre a IBMIR de acordo com a invenção, pode ser intensificado mediante aumento do teor de enxofre, isto é, o número de grupos sulfato por resíduo glicosílico na cadeia do dextrano. O LMW-DS geralmente apresenta um peso molecular médio abaixo de 20.000 Da, tal como, abaixo de 10.000 Da, por exemplo, cerca de 5.000 Da. O teor de enxofre médio do LMW-DS pode ser de cerca de 10 a 25%, tal como, de 15 a 20%,

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correspondendo a cerca de dois grupos sulfato por resíduo glicosílico. Para o sulfato de dextrano com um peso molecular médio superior a 20.000 Da, pode sr empregado um teor de enxofre mais alto.

0 sulfato de dextrano e derivados do mesmo, podem ser administrados por liberação sistêmica no local da IBMIR ou do transplante das células ou podem ser administrados por liberação direta naquele local (localmente) . Assim, de acordo com a invenção, o sulfato de dextrano e derivados do mesmo, podem ser administrados pelas vias oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, bucal, retal, dérmica, nasal, traqueal, bronquial, tópica, por qualquer outra rota parenteral ou através de inalação, na forma de uma preparação farmacêutica, compreendendo o ingrediente ativo numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável.

No tratamento terapêutico de mamíferos, especialmente de seres humanos, o sulfato de dextrano e seus derivados podem ser administrados por si próprios, mas, geralmente, serão administrados como uma formulação farmacêutica em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitáveis, que podem ser selecionados adequadamente em relação à rota de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão.

As quantidades de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo na formulação, irão depender da gravidade do condicionamento do paciente a ser tratado, assim como da formulação em questão e rota de administração empregada, podendo ser determinadas de modo não-inventivo por algum especialista versado na técnica. A concentração

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^líp administrada do sulfato de dextrano ou de derivados do mesmo, de acordo com a presente invenção, não deve ser demasiadamente alta, a fim de minimizar quaisquer efeitos colaterais associados ao sulfato de dextrano. Na maioria das situações clinicas, adequadas doses de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, quando do tratamento terapêutico e/ou profilático de mamíferos, especialmente de seres humanos, são aquelas que proporcionam uma concentração média no sangue abaixo de 5 mg/ml, preferencialmente, inferior a 2 mg/ml e, especialmente, inferior a 1 mg/ml. Uma faixa de concentração preferida é entre 0,01 mg/ml e 1 mg/ml de sulfato de dextrano, tal como superior a 0,05 mg/ml, superior a 0,08 mg/ml ou superior a 0,1 mg/ml e/ou inferior a 0,8 mg/ml, inferior a 0,6 mg/ml, inferior a 0,4 mg/ml ou inferior a 0,2 mg/ml, por exemplo, dentro da faixa de concentração de 0,01 mg/ml e 0,2 mg/ml e/ou da faixa de concentração de 0,05 mg/ml e 0,2 mg/ml.

sulfato de dextrano de acordo com a presente invenção é especialmente adequado para prevenção da rejeição a enxertos de células β produtoras de insulina, transplantadas em pacientes que sofrem de diabetes do tipo I. Nesses pacientes, as ilhotas pancreáticas de Langerhans de outros seres humanos ou mamíferos, preferencialmente ilhotas de suínos, podem ser transplantadas mediante injeção das ilhotas dentro da veia portai dos pacientes. Entretanto, uma vez as ilhotas sejam expostas ao sangue do paciente, a IBMIR é disparada e a funcionalidade de regulação de insulina das ilhotas será destruída e as ilhotas serão rejeitadas. Portanto, uma concentração

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terapêutica de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo é preferencialmente alcançada, pelo menos localmente no local do transplante, uma vez o transplante das células ou dos grupamentos de células tenha sido executado. Isso pode ser obtido mediante administração do sulfato de dextrano antes do transplante em questão. Alternativamente, as ilhotas podem ser injetadas dissolvidas em uma solução compreendendo sulfato de dextrano conforme a presente invenção, a fim de inibir a IBMIR e prevenir qualquer destruição da rejeição das ilhotas, tornando a normoglicemia possível nos pacientes. A concentração do sulfato de dextrano em tal célula e solução de sulfato de dextrano é, preferencialmente, suficientemente alta, de modo que uma concentração terapêutica de sulfato de dextrano, isto é, preferencialmente inferior a 5 mg/ml, mais preferencialmente, de 0,01 mg/ml a 1,0 mg/ml, e especialmente de 0,01 mg/ml a 0,2 mg/ml, pode ser obtida, pelo menos localmente no local do transplante, durante as primeiras horas após o transplante. 0 sulfato de dextrano irá então se difundir a partir do local do transplante, reduzindo a concentração local do sulfato de dextrano. Em algumas aplicações, nenhuma quantidade extra de sulfato de dextrano é necessária para inibir a IBMIR, a ruptura morfológica e/ou a rejeição ao enxerto de transplantes de células, uma vez que a concentração terapêutica do sulfato de dextrano é provavelmente apenas necessária durante as primeiras 24-48 horas após o transplante. Entretanto, sempre que necessário, pode ser adicionada uma quantidade extra de sulfato de dextrano, por exemplo, pela rota

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intravenosa, intraperitoneal ou qualquer outra rota de administração. Conforme é entendido por um especialista versado na técnica, a administração de uma solução de sulfato de dextrano compreendendo as células ou grupamento de células a serem administradas, pode ser também combinada com a administração de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, antes do transplante em questão.

O sulfato de dextrano e derivados do mesmo podem ser combinados com outros agentes terapêuticos que são de utilidade no tratamento de rejeição a enxertos de tecido transplantado. Adequadamente, porém de modo não-limitativo, exemplos de tais agentes imunossupressores que podem ser usados j untamente com o sulfato de dextrano para o tratamento de rejeição a enxertos, incluem, ciclosporina, tacrolimus, corticosteróides, rapamicina (sirolimus) micofenolato mofetil. A administração de sulfato de dextrano de acordo com a presente invenção pode também ser coordenada com a administração de anticorpos anti-TF e/ou fator de local inativo Vila, que também apresenta alguma funcionalidade na inibição da IBMIR.

Breve Descrição dos Desenhos

A invenção juntamente com adicionais objetivos e vantagens da mesma, pode ser melhor entendida fazendo-se referência à descrição seguinte tomada em conjunto com os desenhos em anexo, em que:

- a figura 1 representa um diagrama que ilustra o efeito do LMW-DS na geração de C3a, durante a perfusão de ilhotas de suínos com sangue humano;

- a figura 2 representa um diagrama que ilustra o efeito do

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LMW-DS na geração de sC5b-9, durante a perfusão de ilhotas de suínos com sangue humano;

- a figura 3 representa um diagrama que ilustra o efeito direto de LMW-DS sobre o sistema de complemento, quando o soro humano é incubado na presença de LMW-DS;

a figura 4 ilustra a distribuição de leucócitos nas ilhotas de suínos após a perfusão com sangue humano contendo o LMW-DS;

a figura 5 ilustra a distribuição de leucócitos nas ilhotas de suínos após a perfusão com sangue humano contendo 1 mg/ml de LMW-DS;

a figura 6 ilustra a distribuição de plaquetas nas ilhotas de suínos após a perfusão com sangue humano, não contendo LMW-DS;

- a figura 7 ilustra a distribuição de plaquetas nas ilhotas de suínos após a perfusão com sangue humano contendo 1 mg/ml de LMW-DS;

- a figura 8 ilustra a expressão de insulina em ilhotas de suínos após o transplante intraportal em camundongos diabéticos atímicos, sem nenhum tratamento com LMW-DS;

- a figura 9 ilustra a expressão de insulina em ilhotas de suínos após o transplante intraportal em camundongos diabéticos atímicos, com tratamento com LMW-DS;

a figura 10 ilustra a distribuição de leucócitos nas ilhotas de suínos após o transplante intraportal em camundongos diabéticos atímicos, sem nenhum tratamento com LMW-DS;

a figura 11 ilustra a distribuição de leucócitos nas suínos após o transplante intraportal ilhotas de em

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camundongos diabéticos atimicos, com tratamento com LMW-DS;

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere, de um modo geral, ao novo surpreendente efeito de sulfato de dextrano sobre a

Imediata Reação Inflamatória Mediada pelo Sangue (IBMIR) e ruptura morfológica e rejeição a enxertos de transplantes de células, causados pela IBMIR.

A IBMIR é uma reação inflamatória identificada relativamente recente, disparada pela exposição ou contato de células ou grupamento de células com um tipo de sangue estranho. A IBMIR é caracterizada pela expressão do fator de tecido nas células, que dispara uma geração local de trombina. Em seguida, plaquetas ativadas se aderem à superfície da célula promovendo a ativação da coagulação e dos sistemas de complemento. Além disso, os leucócitos são recrutados e infiltrados na células. Esses efeitos em conjunto provocam um rompimento e destruição da morfologia celular dentro das primeiras horas após o contato com o sangue de tipo estranho. A IBMIR também acelera a subseqüente específica resposta imune mediada pela célula numa fase posterior.

Um exemplo bastante importante da IBMIR é quando as células ou o grupamento de células são transplantadas em um corpo preferencialmente de um mamífero, especialmente de um paciente humano. Após o contato com o sangue do paciente receptor, as células disparam a IBMIR, o que resulta no rompimento da morfologia celular e, geralmente, na rejeição ao enxerto do transplante de célula. A IBMIR foi detectada tanto no transplante de célula alogênica, onde as células

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de um doador com sangue comparado ao tipo ABO são transplantadas em um paciente, como no transplante de célula xenogênica, incluindo o xenotransplante de células e/ou grupamento de células de porco para macaco e de porco para o ser humano.

A expressão transplante de célula na presente invenção, geralmente se refere a uma única célula, a diversas células únicas ou a um grupamento de diversas células transplantadas em corpo receptor, preferencialmente, de um mamífero, especialmente, de um paciente humano. Também, os grupamentos de células maiores de tecidos não-vascularizados são compreendidos na expressão transplante de célula, conforme aqui usada. Um exemplo de transplante de célula de acordo com a presente invenção são as ilhotas alogênicas ou xenogênicas de Langerhans, transplantadas dentro da veia portal do fígado de pacientes que sofrem de diabetes do tipo I. Um outro exemplo pode ser o transplante de tecidos/células embriônicas xenogênicas neurais no estriado de pacientes com doença de Parkinson.

Conforme foi resumidamente discutido na seção

Antecedentes da Invenção, um procedimento de grande expectativa para obtenção de normoglicemia em pacientes com diabetes do tipo I é o transplante de células β produtoras de insulina, por exemplo, na veia portal. Adequadas células produtoras de insulina, por exemplo, na forma de ilhotas de Langerhans, podem ser obtidas de doadores alogênicos e xenogênicos. Uma vez que as ilhotas de diversos doadores são necessárias para se obter a normoglicemia, na falta de

14/48 adequados doadores humanos, as ilhotas xenogênicas, preferencialmente de suínos, podem ser usadas. No entanto, ambas as ilhotas alogênicas e xenogênicas extraem a IBMIR quando expostas ao sangue do paciente receptor. Como consequência, dentro de poucas horas após o transplante, a morfologia das células se torna rompida e destruída, geralmente manifestada na perda de integridade, estrutura e forma das células. Isso resulta em uma liberação inicial de insulina acentuadamente aumentada proveniente das ilhotas de Langerhans, seguido da diminuição ou perda da liberação de insulina. Em outras palavras, a perda da normoglicemia se segue logo após o transplante. Além disso, a IBMIR também provoca a rejeição aos enxertos de transplantes de células.

A administração de drogas imunossupressoras convencionais gue previnem a produção de anticorpos e rejeição a órgãos não proporcionam nenhum efeito em relação à IBMIR ou à rejeição de enxertos de transplantes de células causada pela IBMIR. Isso indica que os principais mecanismos da IBMIR e rejeição a enxertos de transplantes de células diferem do mecanismo de rejeição encontrado no transplante de órgãos inteiros e tecido vascularizado.

A partir de agora segue um panorama mais detalhado dos sintomas da IBMIR, em particular, do consumo de plaquetas, coagulação e ativação do complemento e infiltração de leucócito. Além disso, os efeitos do sulfato de dextrano em relação aos respectivos sintomas são avaliados. Para uma discussão mais detalhada desses efeitos do sulfato de dextrano se faz referência à seção

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posteriormente descrita de Exemplos.

Iniciando com o consumo de plaquetas, a IBMIR afeta a contagem de plaquetas do sangue exposto às células ou grupamento de células alogênicas ou xenogênicas. Uma significativa diminuição na circulação livre de plaquetas pode ser detectada no sangue, após o contato célula-sangue, As plaquetas se tornam ativadas e aderem às células, resultando em uma agregação de plaquetas. Após a aderência às células, as plaquetas liberam diversas substâncias,

10 incluindo os	fosfolipídios	da	plaqueta, que	são	importantes
para a formação de coágulo	e ativação	do	sistema de
coagulação.
A	administração	de	uma efetiva	quantidade de

sulfato de dextrano de acordo com a invenção, inibe o consumo de plaquetas, visto como um aumento na contagem de plaquetas no sangue, que retorna ao valor medido no sangue antes da exposição à células ou grupamento de células estranhas. Além disso, a aderência da plaqueta às células é consideravelmente diminuída pela presença de sulfato de dextrano, embora possam ser ainda observadas quantidades de traços de plaquetas circundando as ilhotas. O efeito dessas plaquetas restantes, no entanto, não é necessariamente uma desvantagem. Estudos em animais têm demonstrado que após o transplante, decorre pelo menos uma semana antes da angiogênese ser detectada [15, 16]. As plaquetas contêm um número de importantes fatores de crescimento, tais como, o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), o fator de crescimento endoteiial vascular (VEGF) e o fator de crescimento de fibroblasto (FGF) [17, 18], que podem

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suportar revascularização e enxerto da ilhota no corpo do paciente. No caso de transplante clinico de ilhotas, quando as ilhotas são embolizadas dentro da veia portal, uma coroa de plaquetas aderentes deve, de modo similar, suportar seu enxerto e sobrevivência no tecido do fígado.

Após contato com o sangue, as células estranhas ativam o sistema de coagulação, através da expressão de fatores de tecido nas células e através de substâncias liberadas pelas plaquetas de aderência e de agregação. Em resumo, o fator de tecido (TF) produzido pelas células se completa com o fator de coagulação do sangue Vila e atua enzimaticamente no fator X, para formar o fator ativado X (FXa) . Após isso, segue uma cascata de ativação de diferentes fatores, que eventualmente resulta na geração de trombina a partir da protrombina. A trombina, por sua vez, provoca a polimerização das moléculas de fibrinogênio em fibras de fibrina, formando um coágulo de fibrina em volta das células, que também é bem conhecido para um especialista versado na técnica. A trombina também ativa o percurso intrínseco para a início da coagulação do sangue, em que o fator XII (fator de Haqeman) se torna ativado (FXIIa) e, por sua vez, ativa o fator XI (tromboplastina antecedente), resultando em FXIa, a forma ativada do fator XI. Também, esse percurso resulta na geração de trombina a partir de protrombina, como para o percurso extrínseco ativado por TF.

A coagulação do sangue pode ser inibida pela antitrombina, um inibidor de circulação de protease serina, que inativa FXIIa, FXIa e trombina, formando o fator

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antitrombina XIIa (FXIIa-AT), fator Xla-antitrombina (FXIaAT) e complexos de trombina-atitrombina (TAT) . Além disso, o inibidor Cl estearase é um inibidor conhecido de FXIa e

FXIIa, formando complexos do inibidor do fator Xla-Cl estearase (FXIa~Cl INH) e inibidor do fator Xlla-Cl estearase (FXIIa-Cl INH).

Um coágulo de fibrina uma vez formado em torno das células ou grupamento de células pode ser removido pela ação de plasmina do sistema fibrinolítico. A plasmina decompõe o coágulo de fibrina em produtos de decomposição de fibrina, evitando, dessa forma, uma posterior coagulação. No entanto, a ação da plasmina é inibida pela alfa-2-antiplasmina, que se liga e inativa a plasmina livre, formando um complexo de plasmina/alfa-2-antiplasmina (PAP) .

A IBMIR é caracterizada pela formação de coágulos de fibrina em torno de células expostas a um sangue de tipo estranho, nas condições in vitro e in vivo. Além disso, é detectado um aumento em FXIa-ΑΤ, FXIIa-ΑΤ, TAT e PAP. A

IBMIR não apresenta nenhum efeito em relação à quantidade de FXIa-Cl INH ou FXIIa-Cl INH. A administração de uma quantidade efetiva de sulfato de dextrano de acordo com a invenção elimina o efeito da IBMIR em relação à ativação da coagulação, que é manifestado na forma de uma diminuição na quantidade de FXIa-AT, FXIIa-AT, TAT e PAP detectados no sangue. O efeito do sulfato de dextrano sobre a ativação da coagulação pode ser mediado através do sistema de autocoagulação ou através do efeito inibitório do sulfato de dextrano em relação à ativação da plaqueta, ou ambos.

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Após a ativação da plaqueta e a coagulação, uma cascata de complemento segue a IBMIR. Um dos componentes do sistema de complemento é C3, que quando ativado, é clivado em um pequeno fragmento C3a, um peptídeo mediador de inflamação, e no fragmento maior C3b. C3b, por sua vez, se liga a outros componentes do sistema de complemento, formando C5 convertase, que cliva C5 em C5a, que se difunde, e a forma ativa C5b, que se fixa à superfície da célula. A forma ativa C5b aglutinada então se une a mais quatro componentes de complemento, formando_j o complexo de ataque de membrana c5b-9. Esse complexo desloca os fosfolipídios da membrana formando grandes canais através da membrana, que rompem a membrana, possibilitando aos íons e pequenas moléculas se difundirem livremente. Dessa forma, a célula não pode manter sua estabilidade osmótica, sendo lisada por um influxo de água e perda de eletrólitos.

A maior parte do consumo de plaquetas já ocorreu antes dos efeitos da IBMIR mediados pelo complemento poderem ser detectados, sugerindo que a reação de coagulação pode induzir a ativação do complemento. A IBMIR provoca uma significativa ativação do complemento, conforme pode ser aferido por um aumento de C3a e pelo complexo solúvel de ataque de membrana sC5b-9 no sangue. A administração de uma quantidade efetiva de sulfato de dextrano de acordo com a invenção, reduz a quantidade desses componentes de complemento, de um modo dependente da dose, no sangue.

A IBMIR é também caracterizada pela infiltração de leucócitos dentro das células e grupamento de células. A

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infiltração de células polimorfonucleares CDllb⁺ e de monócitos dentro das células, é claramente detectada pelo procedimento de coloração imunoistoquímico. A análise imunoistoquímica mostrou que a infiltração de leucócito foi totalmente anulada pela administração de sulfato de dextrano.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado o uso de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento da Imediata Reação Inflamatória Mediada pelo Sangue (IBMIR).

De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado o uso de sulfato de dextrano ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento de ruptura morfológica de transplante de células transplantadas. Também, o uso de sulfato de dextrano ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo na fabricação de um medicamento para o tratamento de rejeição a enxertos de transplante de células, está dentro do escopo da presente invenção. Esses dois efeitos, isto é, rompimento da morfologia da célula e rejeição a enxertos em células transplantadas, grupamento de células ou tecido não-vascularizado em um mamifero, preferencialmente um paciente humano, se devem ao efeito prejudicial da IBMIR. O efeito mediado pela IBMIR no transplante de célula ocorre no transplante de humano para humano, com doadores comparados ao tipo ABO, usando outros mamíferos, preferencialmente, doadores suínos. Assim, o sulfato de dextrano apresenta um vantajoso efeito

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terapêutico nos transplantes de célula alogênica e xenogênica.

Para evitar dúvidas, conforme aqui usado, o termo tratamento inclui o tratamento terapêutico e/ou profilático da IBMIR. Derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais e solvatos.

O sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, utilizados de acordo com a invenção, podem apresentar um peso molecular variando de sulfato de dextrano de baixo peso molecular (LMW-DS), por exemplo, de algumas centenas ou milhares de Daltons (Da), a um sulfato de dextrano de alto peso molecular (HMW-DS), geralmente com um peso molecular acima de 500.000 Da, por exemplo, superior a 1.000.000 Da. 0 efeito vantajoso do sulfato de dextrano é especialmente propiciado pelo LMW-DS, mas um efeito positivo é também observado mediante a administração do sulfato de dextrano com um peso molecular mais alto. O efeito vantajoso de maiores moléculas de sulfato de dextrano sobre a IBMIR de acordo com a invenção, pode ser intensificado mediante aumento do teor de enxofre, isto é, o número de grupos sulfato por resíduo glicosílico na cadeia do dextrano. O LMW-DS geralmente apresenta um peso molecular médio abaixo de 20.000 Da, tal como, abaixo de 10.000 Da, por exemplo, cerca de 5.000 Da. O teor de enxofre médio do LMW-DS pode ser de cerca de 10 a 25%, tal como, de 15 a 20%, correspondendo a cerca de dois grupos sulfato por resíduo glicosílico. Para o sulfato de dextrano com um peso molecular médio superior a 20.000 Da, pode sr empregado um teor de enxofre mais alto.

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De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um método de tratamento da IBMIR que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com necessidade de tal tratamento.

Adicionais aspectos da invenção incluem um método de tratamento de rejeição a enxertos de transplante de células, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente em necessidade de tal tratamento, e um método de tratamento da ruptura morfológica de transplante de células transplantadas, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente em necessidade de tal tratamento.

O sulfato de dextrano e derivados do mesmo, podem ser administrados por liberação sistêmica no local da IBMIR ou do transplante da célula ou podem ser administrados por liberação direta no local (localmente), usando apropriados meios de administração, que são conhecidos para os especialistas versados na técnica.

Assim, de acordo com a invenção, o sulfato de dextrano e derivados do mesmo podem ser administrados pelas vias oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, bucal, retal, dérmica, nasal, traqueal, bronquial, tópica, por qualquer outra rota parenteral ou através de inalação, na forma de uma preparação farmacêutica, compreendendo o

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ingrediente ativo numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendo da forma de transplante da célula, do local do transplante e do paciente a ser tratado, assim como da rota de administração, as composições podem ser administradas em doses variáveis.

No tratamento terapêutico de mamíferos, especialmente de seres humanos, o sulfato de dextrano e seus derivados podem ser administrados por si próprios, mas, geralmente, serão administrados como uma formulação 10 farmacêutica em mistura com um adj uvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitáveis, que podem ser selecionados adequadamente em relação à rota de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão.

de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo na formulação, irão depender da gravidade do condicionamento do paciente a ser tratado, assim como da formulação em questão e rota de administração empregada, podendo ser determinadas de modo não-inventivo por algum especialista versado na técnica. A concentração administrada do sulfato de dextrano ou de derivados do mesmo, de acordo com a presente invenção, não deve ser demasiadamente alta, a fim de minimizar quaisquer efeitos colaterais associados ao sulfato de dextrano. Na maioria das situações clínicas, adequadas doses de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, quando do tratamento terapêutico e/ou profilático de mamíferos, especialmente de

As quantidades seres humanos, são aquelas concentração média no sangue que proporcionam uma abaixo de 5 mg/ml, preferencialmente, inferior a 2 mg/ml e, especialmente,

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>· • ♦ inferior a 1 mg/ml. Uma faixa de concentração preferida é entre 0,01 mg/ml e 1 mg/ml de sulfato de dextrano, tal como superior a 0,05 mg/ml, superior a 0,08 mg/ml ou superior a 0,1 mg/ml e/ou inferior a 0,8 mg/ml, inferior a 0,6 mg/ml, inferior a 0,4 mg/ml ou inferior a 0,2 mg/ml, por exemplo, dentro da faixa de concentração de 0,01 mg/ml e 0,2 mg/ml e/ou da faixa de concentração de 0,05 mg/ml e 0,2 mg/ml. Essas concentrações provaram ser suficientemente elevadas para prevenir ou inibir a IBMIR e a ruptura morfológica e rejeição a enxertos de transplante de células, mas é ainda suficientemente baixa para minimizar quaisquer efeitos colaterais normalmente associados com a administração de sulfato de dextrano. Além disso, as ilhotas de cultura no LMW-DS não apresentam quaisquer efeitos adversos do funcionamento das ilhotas em concentrações variando de 0,01 a 1 mg/ml. Em qualquer caso, o médico ou o especialista versado na técnica, serão capazes de determinar a dosagem em questão, que será mais adequada para um paciente individual, podendo variar com a idade, peso e resposta do paciente, em particular. As dosagens acima identificadas são exemplos de dosagens preferidas da média de casos. No entanto, podem ocorrer casos individuais, onde faixas de dosagem mais altas ou mais baixas sejam admitidas e estas se encontram também dentro do escopo da presente invenção.

Atualmente, o sulfato de dextrano já foi usado em estudos clínicos para terapia antiviral contra HIV, no tratamento de infarto cerebral· agudo em combinação com urocinase e na terapia anti-hiperlipidêmica, em que o sulfato de dextrano é acoplado a uma fase sólida. Nos dois

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primeiros tipos de estudo, a velocidade de injeção foi de cerca de 45 mg/h, que foi mantida por um período de 2-3 semanas, mediante injeção contínua de sulfato de dextrano (peso molecular (MW) de 8.000 Da), sendo encontrada uma concentração no sangue de aproximadamente 0,01 mg/ml. Em todos esses pacientes, foi observado o surgimento de trombocitopenia (algumas vezes associado com hemorragia), após 3 dias de tratamento e a alopecia foi registrada em cerca de metade dos pacientes. Entretanto, ambos esses efeitos foram reversíveis. É estimado que a administração de sulfato de dextrano para inibição da IBMIR, ruptura morfológica e/ou rejeição a enxerto de transplante de células, é normalmente realizada para até 1-2 ou poucos dias. Portanto, os efeitos colaterais identificados acima serão bastante brandos durante tal curto período de administração (poucos dias pode ser comparado a 2-3 semanas).

De há muito é conhecido que o sulfato de dextrano induz a hipotensão através da liberação da bradicinina, resultante da ativação da kallikrein do plasma. Entretanto, essa observação foi feita principalmente quando o HMW-DS havia sido imobilizado nas colunas de plasmaferese, para tratamento de hiperlipidemia e não durante a injeção de sulfato de dextrano. Esse efeito é uma consequência da ativação direta de FXII a FXIia. Entretanto, no apoio ao presente documento, é indicado que o fator XII não é diretamente ativado pelo LMW-DS. Conforme mencionado anteriormente, os níveis de FXIIa-AT e PAP são elevados quando as células são expostas a um sangue de tipo

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estranho, sem a presença do LMW-DS. No entanto, esses altos níveis são normalizados quando se adiciona o LMW-DS.

A fim de impedir a IBMIR após o transplante de célula e/ou ruptura morfológica e rejeição a enxerto de transplante de células, é preferencialmente obtida uma concentração terapêutica de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, pelo menos localmente, no local do transplante, uma vez o transplante da célula tenha sido realizado. Isso pode ser obtido mediante administração do sulfato de dextrano antes do transplante em questão. Alternativamente, as células ou grupamento de células a serem transplantadas em um paciente, podem ser injetadas dissolvidas em uma solução que compreende o sulfato de dextrano de acordo com a presente invenção. A concentração do sulfato de dextrano em tal célula e solução de sulfato de dextrano é, preferencialmente, suficientemente alta, de modo que uma concentração terapêutica de sulfato de dextrano, isto é, preferencialmente inferior a 5 mg/ml, mais preferencialmente, de 0,01 mg/ml a 1,0 mg/ml, pode ser obtida (localmente) no local do transplante, durante as primeiras horas após o transplante. Como um especialista na técnica é capaz de entender, a concentração em questão do sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, pode temporariamente ser superior à concentração ótima no sangue do paciente, quando as células ou grupamento de células são transplantadas dissolvidas em uma solução com sulfato de dextrano. Em seguida, o sulfato de dextrano irá se difundir do local de transplante, abaixando a concentração local do sulfato de dextrano. Em algumas aplicações, nenhuma

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quantidade extra de sulfato de dextrano é necessária para inibir a IBMIR, a ruptura morfológica e/ou a rejeição a enxerto de transplantes de células, uma vez que a concentração terapêutica do sulfato de dextrano pode provavelmente apenas ser necessária durante as primeiras 24-48 horas após o transplante. Entretanto, sempre que necessário, pode ser adicionada uma quantidade extra de sulfato de dextrano, por exemplo, pela rota intravenosa, intraperitoneal ou qualquer outra rota de administração identificada acima. Conforme é entendido por um especialista versado na técnica, a administração de uma solução de sulfato de dextrano compreendendo as células ou grupamento de células a serem transplantadas, pode ser também combinada com a administração de sulfato de dextrano ou derivados do mesmo, antes do transplante em questão.

De acordo com um adicional aspecto da invenção, é proporcionada uma formulação farmacêutica para uso no tratamento da IBMIR, compreendendo uma quantidade efetiva de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo.

A presente invenção é também dirigida a uma formulação farmacêutica para uso no tratamento de rejeição a enxertos de transplante de células, compreendendo uma quantidade efetiva de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo e uma formulação farmacêutica para uso no tratamento da ruptura morfológica de transplantes de células transplantadas, compreendendo uma quantidade efetiva de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo.

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sulfato de dextrano e derivados do mesmo podem ser combinados com outros agentes terapêuticos, que são de utilidade no tratamento de rejeição a enxertos de tecido transplantado. Adequadamente, porém de modo não-limitativo, exemplos de tais agentes imunossupressores que podem ser usados juntamente com o sulfato de dextrano para c tratamento de rejeição a enxertos, incluem, ciclosporina, tacroiimus, corticosteróides, rapamicina (sirolimus) micofenolato mofetil. A administração de sulfato de dextrano de acordo com a presente invenção pode também ser coordenada com a administração de anticorpos anti-TF e/ou fator de local inativo Vila, que também apresenta alguma funcionalidade na inibição da IBMIR.

Exemplos

Reagentes

Sulfato de dextrano de baixo peso molecular (LMWDS) , com um peso molecular médio de 5.000 Da e um teor de enxofre de aproximadamente 17%, foi obtido da Sigma Chemicals {St. Louis, MO, USA). Sulfato de dextrano de alto peso molecular (HMW-DS) , com um peso molecular médio superior a 1.000.000 Da e um teor de enxofre de 16-19%, foi adquirido da Amersham Bioscience (Uppsala, Suécia). Dextrano de baixo peso molecular (LMW-D; peso molecular de 5.000 Da) e dextrano de alto peso molecular (HMW-D; peso molecular superior a 1.000.000 Da) foram obtidos da Fluka Chemical (Buchs, Suiça) e Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA), respectivamente.

Tratamento com Heparina

Todos os materiais que estiveram em contato com a

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quantidade total de sangue foram fornecidos com uma superfície de heparina Corline (Corline Systems AB, Uppsala, Suécia), de acordo com as recomendações do fabricante. A concentração da superfície de heparina foi de

0,5 pg/cm², correspondendo a aproximadamente 0, 1 U/cm², com uma capacidade de ligação à antitrombina de 2-4 pmol/cm².

Preparação do Sangue

Sangue fresco humano, obtido de voluntários saudáveis que não receberam qualquer medicamento durante pelo menos 14 dias, foi coletado em seringas de 60 ml, de superfície heparini zada (calibre 18, Microlance; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . As cânulas das seringas foram conectadas a um tubo de silicone de superfície heparinizada. Durante a amostragem, as seringas foram giradas continuamente.

Animais

Camundongos machos, atímicos e congênitos (nu/nu Black-6, BomMice) da Bomholt Gaard Breeding and Research Centre Ltd. (Ry, Dinamarca) ) , de 20-25 g, foram usados como receptores. Todos os animais tiveram livre acesso a uma dieta padrão e água.

Isolamento da Ilhota

Ilhotas de suínos adultos (API - sigla em Inglês de Adult Porcine Islets) foram isoladas do pâncreas de porcas de 2-3 anos (200 a 300 kg) da Landrace Swedish, por meio de um procedimento de digestão pancreática enzimático e mecânico, seguido de filtração e separação das ilhotas em gradientes de Ficoll, conforme sugerido por Ricordi e outros [19, 20]. As ilhotas foram suspensas em um meio de

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• · cultura Ml 99 (Gibco BRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Escócia), suplementado com soro de suíno a 10% (Gibco BRL), nitrato de cálcio 1 mM, selênio 0,02 μΜ, nicotinamida 20 mM, HEPES 25 mM, Fungizone (500 pg/l) e gentamicina (50 mg/1) e cultivadas em frascos de 250 ml, à temperatura de

37°C em CO₂ a 5% e ar umidificado, durante 1 a 4 dias. O meio de cultura foi trocado no dia 1 e em todos os outros dias seguintes. O volume e pureza da ilhota foram determinados sob um microscópio invertido, após um procedimento de coloração com um composto de ditizona (Sigma Chemicals, St. Louis, MO).

Indução de Diabetes em Camundongos Atímicos

A diabetes foi induzida em camundongos atímicos por meio de injeção intravenosa (i.v.) de esteptozotocina, da Sigma Chemicals (Paio Alto, CA, USA), de acordo com Wennberg e outros [20] . A dose de esteptozotocina foi de 250 mg/kg de peso do corpo dos camundongos atímicos. Um animal foi considerado diabético se seu nível de glicose do sangue (glicose B) excedeu 20 mmol/1 (>360 mg/dl) durante 2 ou mais dias consecutivos.

Transplante de Ilhotas de Suínos Adultos (API) em

Camundongos Diabéticos Atímicos Tratados ou Não-tratados com LMW-DS

Após cultura de 4 dias, 5 μΐ de API (-5.000 IEQs) de 5 isolamentos, foram transplantados no do fígado através da veia portal de 11 camundongos machos atímicos, diabéticos e congênitos, os quais foram anestesiados durante a cirurgia com isoflureno. Cinco camundongos foram tratados i.v. com LMW-DS. 0,15 mg de LMW-DS foram injetadas

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minutos antes do transplante e uma quantidade adicional de 0,3 mg foi injetada 6 horas após o transplante. Após isso, o LMW-DS foi administrado duas vezes ao dia, nos dias 1-2, 3-4 e 5-6 depois do transplante, em doses decrescentes de 1,0, 0,5 e 0,25 mg, respectivamente. Seis camundongos (não-tratados) foram injetados com um volume equivalente de solução salina, da mesma maneira.

Análise Estatística

Todos os valores foram expressos como média ± SEM e comparados, usando ANOVA de Friedman (Tabela 1), o teste t casado de Student (Tabela 3) , o teste de classificação de Wilcoxon, e ANOVA de fatorial único, segundo o teste post hoc de Scheffe (Tabela 5). No estudo morfológico das ilhotas transplantadas, a frequência da formação de coágulos e a intensidade de infiltração de leucócitos foram avaliados usando o teste total de graduação de Wilcoxon. Os valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Qualidade da Ilhota

Um teste estático de estimulação de glicose (SGS - sigla em Inglês de Static Glucose Stimulation) foi realizado como um teste funcional para ilhota de suínos adultos (API). Quinze ilhotas foram apanhadas manualmente e suavemente agitadas em bicarbonato de Krebs-Ringer, contendo glicose 1,6 mM à temperatura de 37°C durante 60 minutos. Após isso,a concentração de glicose foi mudada para 16,7 mM durante um período adicional de 60 minutos. O material sobrenadante foi coletado e armazenado à temperatura de -20°C até ser feita a análise. O teor de

31/48 α,Ι ·« ·· ·· ·· II * · · · j • · «· * · · · insulina no material sobrenadante foi analisado pelo procedimento ELISA (DAKO Diagnostics Ltd, Ely, UK) . 0 índice de estimulação foi calculado como uma proporção da concentração de insulina em alto teor de glicose e baixo teor de glicose, respectivamente. A pureza da API usada nesse estudo variou de 81% a 95% (média ± 2,2%) . 0 índice de estimulação no teste estático de estimulação de glicose foi entre 0,8 e 7,8 (3,4 ±1,2) e o teor médio de insulina foi de 85,5 ± 6,2 pmol/pg DNA.

Além disso, a proporção ADP/ATP foi medida para avaliar a viabilidade da API cultivada usando o kit ApoGlow™ (LumiTech Ltd., Nottingham, UK) . Em resumo, 7 5 equivalentes de ilhotas (IEQ) de API foram lavadas em PBS e depois misturadas com 100 μΐ de reagente de liberação de nucleotídeo, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Após isso, 20 μΐ de reagente de monitoramento de nucleotídeo foram adicionados à solução e os níveis de ATP foram medidos usando um luminômetro (Luminômetro FB12, Berthold Detection Systems GmbH, Pforzheim, Alemanha) e expresso como número relativo de unidades luminosas (RLU sigla em Inglês de Relative Light Units). Após 10 minutos, o ADP na solução foi convertido em ATP mediante adição de 20 μΐ de reagente conversor de ADP e depois medido como número de RLU. Em seguida, a proporção ADP/ATP na API foi calculada conforme sugerido por Bradbury e outros [21]. A proporção de insulina/DNA na API foi medida de acordo com Wennberg e outros [22] e expressa como ρτηοΐ/μς. A taxa de sobrevivência da API cultivada foi calculada como uma percentagem de valores de IEQ obtidos no

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dia 3, comparado ao dia 0.

Qualquer possível toxicidade de LMW-DS foi examinada mediante cultura da API de três diferentes pâncreas, na presença (0,01, 0,1 ou 1 mg/ml) ou ausência de

LMW-DS durante 3 dias. Os resultados da taxa de sobrevivência, índice de estimulação, proporção de ADP/ATP e proporção de insulina/DNA para as amostras de controle e para as amostras de três diferentes concentrações de LMW-DS se encontram apresentados na Tabela 1, abaixo. O LMW-DS não mostrou efeito adverso quanto à funcionalidade, viabilidade ou taxa de sobrevivência da API em quaisquer das concentrações testadas. Além disso, não houve diferença entre a morfologia da API tratada com o LMW-DS e aquela da API cultivada na ausência do LMW-DS.

¹⁵ Tabela 1

	Cultura da API sem LMW-DS	Cultura da API com LMW-DS (0,01 mg/ml)	Cultura da API com LMW-DS (0,1 mg/ml)	Cultura da API com LMW-DS (1 mg/ml)
Taxa de sobrevivência (% IEQ)	57,0 ± 5,2	43,6 ±6,7	58,4 ±4,3	68,9 ± 2,6
índice de estimulação no teste SGS	1,77 ±0,17	2,26 ±0,51	3,22 ±0,89	1,42 ±0,35
Proporção ADP/ATP	0,11 ±0,03	0,08 ± 0,03	0,10 ±0,03	0,11 ±0,01
Proporção Insulina/DNA (pmol/pg)	79,0 ± 11,4	66,1 ±5,8	69,1 ± 9,6	71,6 ±7,4

Tempo de Coagulação

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Um procedimento de extração de sangue de quatro voluntários saudáveis foi realizado em tubos Vacutainer™ contendo citrato. Ά quantidade total de sangue (980 μΐ) foi incubada com 2 μΐ de API à temperatura de 37 °C em taças de amostras de polipropileno em um reômetro ReoRox™ (Global Haemostasis International, Gotemburgo, Suécia). A reação de coagulação foi iniciada mediante adição de 20 μΐ de CaCl2 1M, na presença ou ausência de diferentes tipos de dextrano (LMW-DS, HMW-DS, LMW-D e HMW-D). A cada 6 segundos, a taça foi ajustada para uma oscilação de torção livre em torno de seu eixo vertical e foi registrado o amortecimento e freqüência da oscilação. O tempo de coagulação foi identificado como o ponto de máximo amortecimento.

Os resultados obtidos dos experimentos do tempo de coagulação são apresentados na Tabela 2, abaixo. A API incubada no sangue humano contendo citrato induziu prontamente a formação de coágulo, numa média de 6,1 ± 0,3 minutos após a calcificação. A formação de coágulo foi totalmente anulada na presença de LMW-DS em todas as doses testadas, enquanto o HMW-DS inibiu a formação de coágulo apenas em 0,1 mg/ml. Ambos LMW-D e HMW-D prolongaram o tempo de coagulação para apenas um grau menor, comparado às amostras de controle (sem aditivos). Assim, a sulfatação de sulfato de dextrano (DS) parece ser crucial para a capacidade inibitória observada.

Tabela 2

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• * *· • · ·· ·· • · · · * · · · • ·

	Experimento 1	Experimento 2	Experimento 3	Experimento 4
Sem aditivo	5,6	6,3	6,9	5,5
LMW-DS (0,01 mg/ml)	>60	>60	>60	>60
LMW-DS (0,1 mg/ml)	>60	>60	>60	>60
HMW-DS (0,01 mg/ml)	15,8	36,9	21,0	38,3
HMW-DS (0,1 mg/ml)	>60	>60	>60	>60
LMW-D (0,01 mg/ml)	19,2	11,3
LMW-D (0,1 mg/ml)	25,2	25,8
HMW-D (0,01 mg/ml)	19,8	13,8
HMW-D (0,1 mg/ml)	14,2	33,2

Inibição da IBMIR pelo LMW-DS

A perfusão de ilhota de suíno adulto em alças tubulares de PVC heparinizado foi usada como modelo para avaliar o efeito de sulfato de dextrano de baixo peso molecular (LMW-DS) sobre a IBMIR e xenotransplante de porco para ser humano. Esse protocolo é basicamente executado conforme previamente descrito [4, 23], com algumas modificações. De um modo geral, foram usadas alças feitas de PVC (diâmetro de 6,3 m, comprimento de 390 mm), cuja superfície interna foi fornecida com heparina imobilizada. Os tubos foram mantidos junto com um conector heparinizado

35/48 • * especialmente modelado. Uma alça circular foi formada quando as extremidades do conector foram empurradas firmemente dentro do lúmen das extremidades dos tubos. Um dispositivo de balanço, colocado em uma incubadora à temperatura de 37°C foi usado para gerar um fluxo de sangue dentro das alças. As alças foram balançadas em uma tal disposição que evitou o sangue de entrar em contato com os conectores.

Sete experimentos com ilhotas em períodos de 60 minutos foram realizados, usando API isolada de quatro diferentes porcos. O LMW-DS dissolvido em solução salina foi testado nas concentrações de 0, 0,01, 0,1 e 1 mg/ml (concentração final). Para cada experimento, foi incluída uma alça contendo sangue fresco humano e solução salina sem

API, como controle. Em dois experimentos, foi incluída uma alça contendo sangue fresco humano e 1 mg/ml de LMW-DS sem API. Simultaneamente, a pré-incubação de sangue humano com 1 mg/ml de LMW-D (dextrano de baixo peso molecular) que não foi sulfatado, foi testada em cinco experimentos. Em cada experimento, 7 ml de sangue fresco humano do mesmo doador foram adicionados à cada alça. As alças foram depois colocadas sobre o dispositivo de balanço durante 5 minutos com LMW-DS ou solução salina. Após isso, as alças foram abertas e 100 μΐ de solução salina com ou sem 5 μΐ de API (aproximadamente 5.000 IEQ) foram adicionados às alças, seguido de outra incubação de 60 minutos sobre o dispositivo de balanço, à temperatura de 37°C. Os níveis de glicose no sangue foram medidos com um glicômetro (Glucometer Elite; Bayer Diagnostics, Leverkusen, Alemanha)

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antes da perfusão.

Após cada perfusão os conteúdos da alça foram filtrados através de filtros de diâmetro de 70 pm (Filcons, Cuptype; DAKO, Dinamarca) . Os coágulos de sangue macroscópicos e o tecido recuperado dos filtros foram congelados instantaneamente em isopentano para coloração imunoistoquímica. O sangue filtrado restante foi coletado em EDTA 4,1 mM (concentração final) e usado para análise hematológica (plaquetas, linfócitos, monócitos e granuócitos) e ensaios de ativação de coagulação (trombinaantitrombina [TAT], complexos do fator Xla-antitrombina [FXIa-AT] e complexos do fator XIIa-antitrombina [FXIIaAT]), ativação de fibrinólise (complexos de plasmina-alfa-2 antiplasmina - [PAP]), ativação de complemento (C3a e sC5b15 9) , e ativação do inibidor de Cl estearase (inibidor do fator Xla-Cl estearase [FXIa-Cl INH] e inibidor do fator Xlla-Cl estearase [FXIIa-Cl INH] . As amostras retiradas em 0, 15 e 30 minutos foram também analisadas. Nas amostras de 0 minuto, o sangue não foi adicionado à alça tubular, ao invés disso foi imediatamente transferido para os tubos contendo EDTA. As amostras de sangue foram centrifugadas à temperatura de 4°C em 3290 x g, durante 20 minutos e o plasma foi coletado e armazenado à temperatura de -70°C até ser analisado. Os níveis de glicose no sangue antes da perfusão da API variaram de 4,8 a 6,2 mmol/1.

A contagem das plaquetas e a contagem diferencial de leucócitos foram analisadas em um analisador Coulter

ACT-diff (Beckman Coulter, FL, USA) usando sangue tratado com EDTA. Os complexos de TAT e PAP foram quantificados

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·······<

usando kits de imunoensaios de enzimas comercialmente disponíveis (EIA) (Enzygnost TAT, Behringswerke, Marburg, Alemanha; Imuclone® PAP, American Diagnostica Inc., Greenwich, USA). FXIa-AT, EXIIa-AT, FXIa-Cl INH e FXIIa-Cl

INH foram analisados de acordo com o método de Sanchez e outros [24]. C3a foi analisado conforme previamente descrito por Nilsson Ekdahl e outros [25] e sC5b-9 foi analisado usando uma modificação do EIA descrito por Mollnes e outros [25, 26],

Nas alças dos tubos contendo sangue fresco humano sem API, a contagem das células do sangue e os parâmetros de coagulação e do complemento foram apenas um pouco alterados, conforme pode ser visto na Tabela 3, abaixo. Todas essas alterações são consideradas como sendo modificações de fundo normal, resultantes da interação do sangue com a superfície dos tubos e também com a interface fluido-ar.

O LMW-DS preveniu a coagulação macroscópica, inibiu o consumo de células do sangue e reduziu a coagulação e a ativação do complemento de uma maneira dependente da dose (ver a Tabela 3) . Um significativo aumento nas plaquetas no sangue tratado com LMW-DS pode ser observado numa concentração de 0,01 mg/ml de LMW-DS, demonstrando uma restauração da contagem de células do sangue para níveis praticamente normais, já nessa baixa concentração de LMW-DS. Os produtos de ativação de coagulação, TAT, FXIa-AT e EXIIa-AT foram suprimidos na concentração de 0,01 mg/ml de LMW-DS, mas FXIa-AT novamente pouco aumentou nas dosagens variando de 0,1 a 1 mg/ml de

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LMW-DS.

sulfato de dextrano de baixo peso molecular (LMW-DS) reduz a ativação do complemento, conforme analisado pela geração de C3a e pelo complexo solúvel de ataque de membrana sC5b-9, como pode ser visto na Tabela 3. A figura 1 ilustra em maiores detalhes, o efeito do LMW-DS na geração de C3a durante 60 minutos de perfusão de API com sangue fresco humano no modelo de alça de tubo. Nas amostras onde o LMW-DS foi adicionado, o sulfato de dextrano foi previamente incubado com sangue fresco humano durante 5 minutos, antes da perfusão da API com o sangue. Na figura 1, os circulos brancos correspondem a 0 mg/ml de LMW-DS, os círculos negros representam 0,01 mg/ml de LMW-DS e os quadrados braços e quadrados negros correspondem a 0,1 mg/ml e 1 mg/ml de LMW-DS, respectivamente. Um diagrama correspondente do efeito de LMW-DS sobre a geração de sC5b9 é encontrado na figura 2. Como pode ser claramente observado dos diagramas das figuras 1 e 2, a principal ativação de complemento ocorreu cerca de 30 minutos após a perfusão da API. A administração de 0,1 mg/ml e 1 mg/ml de LMW-DS inibe totalmente a geração de C3a e do complexo de ataque da membrana sC5b-9, enquanto a concentração mais baixa de LMW-DS (0,01 mg/ml), reduz de forma significativa a geração de C3a.

FXIa-Cl INH não foi gerado em nenhuma das alças de tubos testadas durante 60 minutos de perfusão (dados não mostrados). FXIIa-Cl INH não se modificou tanto na presença como na ausência de LMW-DS.

O complexo de plasmina-2-alfa-antiplasmina (PAP)

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foi aumentado na ausência de LMW-DS, enquanto foi significativamente suprimido na concentração de 0,01 mg/ml de LMW-DS.

Tabela 3

Antes da perfusão	Depois da perfusão
Sem API	API com LMW-DS (mg/ml)
	0	0,01	0,1	1
	(n=7)	(n =7)	(n =7)	(n =7)	(n =7)	(n =7)
Plaquetas	252,7 ±	141,8	+	6,4 ± 5,6		108,2 ±	146,1	±	; 162,3 ±8,9*
(x 109/l)	9,9	11,8				12,9*	8,1*
Linfócitos	2,15 ±	2,04	±	1,66	±	1,90 ±0,11	1,91	±	1,89 ±0,10
(x 109/l)	0,09	0,10		0,21			0,12
Monócitos	0,39 ±	0,31	±	0,15	±	0,48 ±0,10	0,40	+	0,31 ±0,05*
(x 109/l)	0,06	0,02		0,03			0,07*
Granulócitos	2,90 ±	2,66	±	1,17	±	2,20 ± 0,40	2,80	+	2,92 ± 0,37*
(x 109/l)	0,35	0,36		0,34			0,50*
TAT	9,0 ± 3,7	144,0	±	7042,5	±	645,3 ±	61,0	+	15,0 ±5,6*
(pg/ml)		63,8		1314,1		177,4*	8,6*
FXIa-AT	0,03 ±	0,10	+	3,00	±	0,13 ±0,01*	0,08	±	1,17 ± 0,41*
(pmol/l)	0,01	0,03		0,60			0,01
FXIIa-AT	0,05 ±	0,06	+	2,02	±	0,08 ± 0,02*
(pmol/l)	0,01	0,01		0,63
C3a	63,0 ±7,8	590,2	±	1122,5	±	630,6 ±	191,7	+	215,6 ± 52,2
(ng/ml)		105,3		132,0		103,4	36,6*
sC5b-9	24,0 ± 2,7	104,7	+	182,1	±	151,4 ±27,9	61,9	±	53,9 ±7,1*
(AU/ml)		20,7		33,4			6,5*
FXIIa-Cl INH	0,07 ±	0,09	±	0,06	±	0,10 ±0,03
(pmol/ml)	0,01	0,03		0,01
PAP	585,7 ±	443,6	+	1012,5	±	398,2 ±
(ng/ml)	240,9	179,4		224,0		60,7*

* Diferença significativa comparado às alças de API sem

LMW-DS, mediante uso do teste t de Student.

O efeito de LMW-D (dextrano de baixo peso

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molecular) sobre a contagem de células e parâmetros de coagulação e complemento depois de 60 minutos da perfusão da API com sangue fresco humano foi pesquisado por meio do modelo de alça de tubo similar ao do LMW-DS, conforme discutido acima. Uma comparação entre LMW-D e LMW-DS nos sintomas da IBMIR é encontrada na Tabela 4. O LMW-D, que não é sulfatado, apresentou apenas um efeito marginal sobre a IBMIR. Esses dados indicam que a sulfatação parece ser crucial para o efeito inibidor do dextrano sobre a IBMIR disparada pela API.

Tabela 4

	LMW-DS (1 mg/ml, n=5)	LMW-D (1 mg/ml, n=5)
Plaquetas (x 109/l)	181,1 ± 16,3*	44,9 ± 18,7
Linfócitos (x 109/l)	1,94 ±0,12	2,14 ±0,32
Monócitos (x 109/l)	0,38 ±0,10	0,29 ± 0,08
Granulócitos (x 109/l)	3,23 ±0,21*	1,90 ±0,43
TAT (pg/ml)	12,8 ±4,9*	4429,2 ± 2002,5
FXIa-AT (pmol/I)	1,56 ±0,82	1,09 ±0,08
C3a (ng/ml)	171,5 ±72,4*	1490,3 ±406,4
sC5b-9 (AU/ml)	41,6± 11,5*	157,3 ±19,1

* Diferença significativa comparada às alças de API com LMW-D mediante uso do teste de classificação de Wilcoxon.

Efeito Direto de LMW-DS sobre o Sistema do Complemento no

Soro Humano

0	ef eitt	s direto de LMW-DS	sobre a cascata do
complemento	foi	pesquisado mediante	incubação do	soro
humano em	tubo	de polipropileno.	Em cada tubo	foi
adicionado	soro	{1 ml), junto com o LMW-DS	numa
concentração	final	de 0, 0,01, 0,1 ou	1 mg/ml. Depois	de 5,

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10, 15, 30, 45 e 60 minutos de incubação do soro à temperatura de 37°C, 100 μΐ do soro foram transferidos para os tubos contendo EDTA 10 mM. Essas amostras foram armazenadas à temperatura de -70°C antes da análise dos componentes do complemento C3a e sC5b-9.

A figura 3 ilustra o efeito do LMW-DS na presença de C3a e sC5b-9 do sistema do complemento no soro humano. Os valores são expressos como percentual· da quantidade de C3a e sC5b-9 nas amostras de controle (sem o LMW-DS). As barras cheias representam a geração de C3a e as barras nãocheias correspondem ao sC5b-9. Na concentração de 0,01 mg/ml de LMW-DS, foi refletido um aumento da ativação do complemento em um aumento na geração de C3a e sC5b-9, mas na concentração de 1 mg/ml, nenhum efeito inibidor foi observado. Embora os efeitos sobre todo o sangue e soro não possam ser diretamente comparados, o LMW-DS por si só provavelmente induz a ativação do complemento nas doses mais baixas do LMW-DS aplicado. Nas concentrações mais elevadas prevalece o efeito inibidor.

Sobrevivência a Enxertos em Camundongos Atímicos Diabéticos

Os níveis de glicose no sangue foram medidos no sangue obtido de caudas de receptores usando o instrumento de medição de glicose B, Glucometer Elite® (Bayer AB, Gotemburgo, Suécia). As medições foram tomadas diariamente ao meio-dia e foram expressas em mmol/1 (1 mmol/1 = 18 mg/dl). A perda da função de enxerto foi considerada como tendo ocorrido se os níveis de glicose B tivessem excedido 11,1 mmol/1 (>200 mg/dl) por 2 ou mais dias consecutivos. A duração do pós-tratamento da normoglicemia (<200 mg/dl) foi

42/48 • ··«. · ·· • · · · · · * · · · ·· • « · · · · « « « · · · · • · ·· * · definida como o período de sobrevivência ao enxerto.

Toda a estreptozotocina induzida nos camundongos atimicos diabéticos foi acentuadamente hiperglicêmica antes do transplante, sem nenhuma diferença observada nos níveis de glicose B entre os diversos grupos de receptores. Os níveis de glicose foram reduzidos imediatamente após o transplante em todos os receptores diabéticos nãosubmetidos ao jejum, implantados pela via intraportal com API. Entretanto, os camundongos não-tratados permaneceram normoglicêmicos por apenas um tempo limitado (ver a Tabela 5). Os níveis de glicose B aumentaram novamente durante os primeiros 3 dias depois do transplante em quatro dos seis camundongos não-tratados. Ao contrário, a normoglicemia foi mantida por um período significativamente maior nos camundongos tratados com LMW-DS do que em relação aos camundongos não-tratados (8,8 ± 1,9 dias, versus 3,5 ± 1,2 dias, p=0,045, Tabela 5). Toda a API usada no presente estudo foi mostrada como para a cura dos camundongos atimicos diabéticos, guando quantidades equivalentes foram transplantadas sob o espaço subcapsular renal (remoção do rim enxertado resultou prontamente em um elevado nível de glicose no sangue).

Tabela 5

Local de Implantação	Tratamento	N	Sobrevivência ao Enxerto Individual (dias)	Sobrevivência Média ao Enxerto (dias)
Fígado	Solução salina	6	l, 1,2,3,6,8	3,5 ± 1,2*
LMW-DS	5	4, 6,8, 12, 14	8,8 ± 1,9*
Subcápsula do rim	-	5	>56 (x5)	>56*

* Significativo entre todos os grupos Experimentos Imunoistoquímicos

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Ilhotas e coágulos macroscópicos foram recuperados de filtros após 60 minutos de perfusão com sangue e LMW-DS (0, 1 mg/ml e 1 mg/ml) ou sem LMW-DS (controle), depois coletados em um meio absorvente (Tissue5 Tek; Miles, Sckhart, IN, USA) e congelados instantaneamente em isopentano. As ilhotas foram secionadas e subseqüentemente manchadas com peroxidase de rábano silvestre (HRP - sigla em Inglês de Horseradish Peroxidase) conjugado com CD41a anti-humano de camundongo (R&D Systems, Abigdon, UK) e anti-CDllb⁺ (Clone 2LPM 19c, DAKO, Carpinteria, CA, USA) . No estudo in vivo, os fígados de camundongos contendo API foram recuperados 10 dias após o transplante e congelados instantaneamente em isopentano. As amostras foram secionadas e manchadas com anti-insulina de porquinho-da-índia (DAKO, Carpinteria, CA, USA) CDllb⁺ anti-camundongo de rato (Serotec Ltd., Scandinavia, Oslo, Noruega).

Após 60 minutos, as ilhotas recuperadas das alças de controle não-tratadas foram consistentemente encontradas como sendo envolvidas em coágulos. A coloração imunoistoquímica mostrou uma cápsula de fibrina e plaquetas envolvendo as ilhotas. A figura 4 ilustra a infiltração de células polimorfonucleares CDllb⁺ e de monócitos nas ilhotas de controle. Ao contrário, quando 1 mg/ml de LMW-DS foi adicionado durante a incubação, foi observada uma completa inibição da formação de coágulo e o número de células de infiltração CDllb⁺ diminuiu consideravelmente, o que é ilustrado pela figura 5. Um efeito similar foi também observado com 0,1 mg/ml. As amostras de controle também

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«. · · · /Ρ apresentaram uma camada mais espessa de plaquetas aderentes às células, como pode ser observado na figura 6. Uma camada muito mais fina de plaquetas aderentes às ilhotas foi observada nas amostras tratadas com LMW-DS, conforme ilustrado na figura 7. As ilhotas de controle não expostas ao sangue foram negativas em todo o procedimento de coloração usado.

A maioria das ilhotas recuperadas de camundongos não-tratados foram aprisionadas em coágulos, conforme ilustrado na figura 8. Nessa figura, a seta representa a formação de trombo com ilhotas de suínos aprisionadas. No entanto, apenas algumas ilhotas de camundongos tratados com LMW-DS foram aprisionadas, conforme ilustrado na figura 9. O procedimento de coloração imunoistoquímico mostrou uma infiltração de leucócitos CDllb⁺ (MAC-1⁺) dentro das ilhotas recuperadas de camundongos não-tratados, conforme pode ser observado na figura 10. Ao contrário, nos camundongos tratados com LMW-DS, ocorreu uma infiltração de células CDllb⁺ (MAC-1⁺) acentuadamente menor, conforme ilustrado na figura 11. A freqüência de formação de coágulo e a intensidade de infiltração de leucócitos foram significativamente menores nos receptores tratados com LMWDS do que nos receptores não-tratados (p=0,034). As figuras 4 a 9 apresentam uma ampliação de 200x e as figuras 10 e 11 uma ampliação de lOOx.

Deverá ser entendido por um especialista na técnica que diversas modificações e alterações poderão ser feitas na presente invenção sem que seja afastado o escopo da mesma, o qual é definido pelas reivindicações anexas.

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1/2

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de sulfato de dextrano ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento para o tratamento da Imediata Reação Inflamatória Mediada pelo Sangue (IBMIR).
2. 2. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a dita IBMIR é causada pela exposição de um transplante de célula ao sangue, após o dito transplante de célula ser transplantado para um corpo receptor estranho.
3. 3. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que dito medicamento é para tratamento de ruptura morfológica de um transplante de célula devido a dita IBMIR.
4. 4. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que dito medicamento é para tratamento de rejeição a enxerto de um transplante de célula devido a dita IBMIR.
5. 5. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado em que o dito transplante de célula é transplantado para um corpo receptor humano.
6. 6. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado em que o dito transplante de célula é selecionado de uma lista de:

   - transplante de célula alogênica; ou

   - transplante de célula xenogênica.
7. 7. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com de 10/06/2016, pág. 14/16

   2/2 qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado em que o dito transplante de célula é selecionado de uma lista de:

   - célula individual;

   - grupamento de células; ou

   - tecido não-vascularizado.
8. 8. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado em que o dito transplante de célula compreende as ilhotas de Langerhans.
9. 9. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado em que o dito sulfato de dextrano apresenta um peso molecular inferior a 20.000 Da, preferencialmente, um peso molecular inferior a 10.000 Da.
10. 10. Uso de sulfato de dextrano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado em que o dito sulfato de dextrano apresenta um teor de enxofre de 10-25%, preferencialmente, de 15-20%.

    Petição 870160027369, de 10/06/2016, pág. 15/16 í

    1/6

    C3a (ng/ml)