ES2862623T3 - Método de diferenciación de células progenitoras de mamíferos en células pancreáticas de los islotes productoras de insulina - Google Patents

Método de diferenciación de células progenitoras de mamíferos en células pancreáticas de los islotes productoras de insulina Download PDF

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Abstract

Método para diferenciar células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina, que comprende: (a) incubar células progenitoras hepáticas, donde las células progenitoras hepáticas son células madre hepáticas que expresan EpCAM, NCAM, albúmina, CK8/18, CK19 y CD133/1 en medio de preinducción sin suero que comprende un inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI); y, posteriormente, (b) incubar las células progenitoras hepáticas en medio de inducción que comprende sustituto de suero knock- out; durante un tiempo suficiente para diferenciar las células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de diferenciación de células progenitoras de mamíferos en células pancreáticas de los islotes productoras de insulina
[0001] Esta aplicación reivindica la prioridad sobre la solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/055,341 solicitada el 22 de mayo de 2008.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente invención se refiere en general a la diferenciación de células progenitoras de mamíferos de un tipo celular particular en otro tipo celular. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método de diferenciación de células progenitoras de mamíferos, incluidas las células madre, en células pancreáticas de los islotes productoras de insulina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La diabetes mellitus ("diabetes") es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos. Los pacientes que sufren de diabetes tienen trastorno(s) del metabolismo y niveles de azúcar en sangre anormalmente elevados (es decir, hiperglucemia), que resulta de unos bajos niveles de producción de insulina.
[0004] Las células beta halladas en los islotes de Langerhans en el páncreas ("células beta pancreáticas de los islotes") producen insulina. En la diabetes de tipo I y (en menor medida) de tipo II, una deficiencia en la producción de insulina se puede atribuir a una masa inadecuada de células funcionales de los islotes productoras de insulina. La causa de esta pérdida celular puede ser un ataque vírico, químico y/o autoinmune y la destrucción de las células.
[0005] Dada esta etiología, se ha intentado revertir o prevenir el comienzo de la diabetes reponiendo las células perdidas o dañadas con células pancreáticas de donantes. Aunque las terapias celulares de esta clase han resultado ser prometedoras, el suministro de células pancreáticas, particularmente células pancreáticas humanas, es siempre escaso, tanto en cuanto a cantidad como en cuanto a calidad, para la investigación y/o el trasplante. La presente invención proporciona un método para aumentar este suministro escaso, en parte, permitiendo el uso de células progenitoras para llegar a células pancreáticas productoras de insulina.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0006] La presente invención proporciona un método de diferenciación de células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina, que comprende: (a) incubar progenitores hepáticos, donde las células progenitoras hepáticas son células madre hepáticas que expresan EpCAM, NCAM, albúmina, CK8/18, CK19 y CD133/1 en medio de preinducción sin suero que comprende un inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI); y, posteriormente, (b) incubar las células progenitoras hepáticas en medio de inducción que comprende sustituto de suero knock-out; y durante un tiempo suficiente para diferenciar las células progenitoras en células pancreáticas productoras de insulina. El inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI) se puede seleccionar del grupo que consiste en butirato de sodio, fenilbutirato, ácido retinoico, ácido valproico, compuesto APHA 8, apicidina, (-)-depudecina, Scriptaid, sirtinol y tricostatina. Preferiblemente, el inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI) es butirato de sodio. Las células progenitoras hepáticas pueden ser células progenitoras hepáticas humanas. El medio de inducción puede comprender además aproximadamente sustituto de suero knock-out al 2 %.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0007]
La figura 1 proporciona los resultados de un análisis PCR de ADNc tomado de células madre hepáticas humanas que han sido diferenciadas en células pancreáticas tipo p de los islotes conforme a la presente invención. Carril 1 (Pdx), carril 2 (insulina), carril 3 (glucagón), carril 4 (somatostatina), carril 5 (glut2), carril 6 (GADPH, control).
La figura 2 muestra la tinción inmunohistológica de la producción de insulina de células UCM humanas que han sido diferenciadas en células pancreáticas tipo p de los islotes conforme a la presente invención. La tinción marrón (oscura) indica la presencia de insulina. (Aumento 10X)
La figura 3 proporciona los resultados de un análisis PCR de ADNc tomado de células UCM humanas que han sido diferenciadas en células pancreáticas tipo p de los islotes conforme a la presente invención. De izquierda a derecha: carril 1-Pdx-1; carril 2-glucagón; carril 3-insulina; carril 4-glut 2; carril 5-somatostatina; carril 6-GAPDH (control).
La figura 4 es un gráfico que muestra la cantidad de insulina secretada en el medio (día 5) por las células UCM humanas que han sido diferenciadas en células pancreáticas tipo p de los islotes conforme a la presente invención. UNE: unión no específica (control).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0008] La presente invención proporciona un método de diferenciación de células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina. Se pueden inducir a que se diferencien las células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina usando las instrucciones de la presente invención.
[0009] El término célula "progenitora" se usa es este caso en términos generales para definir cualquier célula que tenga la capacidad para diferenciarse en una célula más "madura". Por lo tanto, el término "diferenciar(se)" se refiere no solo a la "maduración" de una célula dentro de un único tipo celular/linaje (por ejemplo, de célula madre hepática a hepatoblasto), sino alternativamente, también a la "conversión" de una célula de un tipo/linaje a otro (por ejemplo, de célula hepática a célula pancreática).
[0010] A modo de ejemplo, el término "progenitores hepáticos", como se utiliza en este caso, se define en términos generales para incluir cualquier célula que no sea un hepatocito o una célula biliar completamente maduros (es decir, diferenciados). Por lo tanto, "progenitores hepáticos" abarca tanto células madre hepáticas como su descendencia inmadura. "Descendencia" puede incluir tanto células madre hepáticas de replicación autónoma, hepatoblastos, progenitores bipotentes de los mismos y progenitores comprometidos a diferenciarse en un tipo celular particular (por ejemplo, un progenitor celular biliar o hepatocito comprometidos). Según la presente invención, un progenitor hepático puede "diferenciarse" también en una célula pancreática.
[0011] Aunque la mayor parte, si no todo, de la discusión y los ejemplos de progenitores incluidos en la presente serán con referencia a poblaciones celulares de origen humano (tanto adultas como fetales), las instrucciones incluidas en la presente no deberían limitarse a los seres humanos. De hecho, se puede esperar que una persona experta en la materia aplique las instrucciones incluidas en la presente al aislamiento y la diferenciación de los progenitores de mamíferos, en general (por ejemplo, ratones, ratas, perros, etc.). Por consiguiente, el alcance de la presente invención pretende incluir progenitores de todos y cada uno de los mamíferos.
Células progenitoras hepáticas
[0012] Cada una de las poblaciones anteriormente mencionadas de células progenitoras hepáticas (por ejemplo, "células madre", "hepatoblastos" o "hepatocitos”) se puede identificar por su respectivo tamaño y/o su disposición específica de marcadores única para las respectivas poblaciones. Véase la tabla 1, a continuación.
Figure imgf000003_0001
[0013] Las células madre hepáticas (HSC) son células pluripotentes halladas en las placas ductales (también denominadas placas limitantes) en los hígados fetales y neonatales y en los canales de Hering en los hígados pediátricos y adultos y que muestran evidencias de autorreplicación con expresión de telomerasa y que son capaces de formar células hepáticas maduras cuando se trasplantan. Estas células son EpCAM+, NCAM+, ALB+, CK8/18+, CK19+, CD133/1+, y son negativas para todos los marcadores hematopoyéticos evaluados (por ejemplo, CD34, CD38, CD45, CD14), marcadores celulares mesenquimales (CD146, VEGFr, CD31) y para la expresión de los P450 o la alfa-fetoproteína. Se ha descubierto que las HSC dan lugar a hepatoblastos y a progenitores biliares (unipotentes) comprometidos.
[0014] Los hepatoblastos (HB) son células pluripotentes halladas por todo el parénquima de los hígados fetales y neonatales y como células únicas o pequeños agregados de células unidos a los extremos de los canales de Hering. Los HB derivan de las HSC. Los HB comparten muchos antígenos presentes en las HSC, pero con distinciones importantes. Por ejemplo, los HB no expresan NCAM sino ICAM1 y expresan cantidades significativas de alfa-fetoproteína y formas fetales de los P450. Estos HB dan lugar a los progenitores unipotentes, los progenitores hepatocíticos y biliares comprometidos.
[0015] Los progenitores comprometidos hepáticos son progenitores unipotentes de los linajes hepatocítico y biliar. Su perfil antigénico se superpone con el de los HB; sin embargo, los progenitores comprometidos biliares expresan CK19 pero no AFP o ALB, mientras que los progenitores comprometidos hepatocíticos expresan AFP y ALB pero no CK19. Los progenitores biliares comprometidos derivan directamente de las células madre hepáticas y también de los hepatoblastos.
[0016] Las células mesenquimales (MC) incluyen células en varias fases del linaje de los muchos tipos diferentes de células mesenquimales (enumerados como las células maduras y, entre paréntesis, sus precursores): incluyendo el estroma (células madre mesenquimales), endotelios (angioblastos), células estrelladas (precursores de las células estrelladas) y varias células hematopoyéticas (células madre hematopoyéticas).
Aislamiento de células progenitoras hepáticas
[0017] Los progenitores hepáticos adecuados para el aislamiento y la diferenciación in vitro conforme a la presente invención no se limitan a los aislados o los identificados por ningún método particular. A modo de ejemplo, se han descrito métodos para el aislamiento y la identificación de los progenitores hepáticos en, por ejemplo, la USP n.° 6,069,005 y las solicitudes de USP n.os 09/487,318; 10/135,700; 10/387,547 y 11/560,049.
[0018] Las células madre hepáticas y los hepatoblastos tienen perfiles antigénicos característicos y se pueden aislar mediante protocolos descritos previamente. Por ejemplo, las células madre hepáticas y los hepatoblastos comparten numerosos antígenos (por ejemplo, las citoqueratinas 8, 18 y 19, albúmina, CD133/1 y molécula de adhesión celular epitelial ("EpCAM")) y son negativos para marcadores hematopoyéticos (por ejemplo, glicoforina A, CD34, CD38, Cd45, Cd 14) y marcadores celulares mesenquimales (por ejemplo, CD146, CD31, VEGFr o KDR).
[0019] Alternativamente, las células madre hepáticas y los hepatoblastos se pueden distinguir entre sí por el tamaño (las células madre tienen 7-9 jm ; los hepatoblastos tienen 10-12 jm ), por la morfología en los cultivos (las células madre forman colonias densas morfológicamente uniformes, mientras que los hepatoblastos forman estructuras tipo cordón intercaladas con canales claros, presuntos canalículos), por distinciones en el patrón de expresión de ciertos antígenos (EpCAM se expresa en todas las células madre hepáticas pero está confinada a la superficie celular en los hepatoblastos) o por perfiles antigénicos diferentes (N-CAM está presente en las células madre hepáticas, mientras que la alfa-fetoproteína (AFP) y la ICAM1 son expresadas por los hepatoblastos).
[0020] En una forma de realización, las células madre hepáticas primarias se obtienen de hígados humanos de la manera anteriormente descrita. Brevemente, se obtiene una suspensión de células únicas de células hepáticas de hígado entero y se siembra en placas sobre plástico de cultivo tisular, solo, o en una matriz de proteínas extracelulares que comprenden colágeno y laminina. Las células se incubaron entonces en medio que comprende suero durante el tiempo necesario para que las células suspendidas se adhieran a la placa (normalmente, 1-2 días).
[0021] A continuación, el medio con suero se elimina y se sustituye con "medio de Hiroshi Kubota", (HK), que es sin suero, y complementado con factores de crecimiento específicos. Más específicamente, HK es un medio basal sin suero (por ejemplo, RPMI 1640) que no contiene cobre, bajo en calcio (< 0,5 mM) y complementado con insulina (5 |jg/ml), transferrina/Fe (5 jg/ml), lipoproteína de alta densidad (10 jg/ml), selenio (10-10 M), zinc (10-12 M) y 7,6 jE de una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina purificada. Los métodos detallados para la preparación de este medio han sido publicados en otro lugar, por ejemplo, Kubota H, Reid LM, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 2000;97:12132-12137.
[0022] Bajo estas condiciones, durante un periodo de 5-14 días, se forman colonias de células madre hepáticas de manera relativamente rápida en la placa.
Diferenciación de células progenitoras en células pancreáticas productoras de insulina
[0023] Los términos célula "tipo p pancreáticas de los islotes" o célula "pancreática de los islotes productora de insulina" como se utiliza en este caso se refieren a células que expresan al menos dos marcadores indicativos de una célula p pancreática de los islotes. Los marcadores de células p pancreáticas de los islotes ilustrativos incluyen, pero de forma no limitativa, la expresión de la caja homeótica-1 duodenal y pancreática (PDX-1), insulina, somatostatina, transportador de glucosa 2 (glut2), glucógeno, amilasa y neurogenina 3 (Ngn3). Los marcadores ilustrativos adicionales incluyen características morfológicas tales como una forma esférica. Otros marcadores ilustrativos adicionales incluyen características tales como la producción de insulina. Así, en ciertas formas de realización, las células tipo b pancreáticas de los islotes expresan funciones de las células p pancreáticas de los islotes más maduras, como la producción de insulina.
[0024] En ciertas formas de realización, las células tipo hepatocito de la invención expresan dos o más marcadores de hepatocitos como se describe en este caso. En otra forma de realización, las células tipo p pancreáticas de los islotes expresan tres o más de los marcadores de células p pancreáticas de los islotes como se describe en este caso. En ciertas formas de realización, las células tipo p pancreáticas de los islotes de la invención expresan cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más marcadores de hepatocitos como se describe en este caso. Como apreciaría la persona experta en la materia, las células tipo p pancreáticas de los islotes de la invención también pueden expresar otros marcadores o funciones conocidos.
[0025] En una forma de realización, las células progenitoras se diferencian usando el método siguiente: antes de la inducción, las células progenitoras se cultivan durante un tiempo suficiente para que se adhieran a la placa de cultivo tisular en medio definido que contiene: DMEM bajo en glucosa 0,5-10 g/L (preferiblemente, 1 g/L), MCDB201 pH 7,4, 1x insulina-transferrina-selenio (ITS, Invitrogen), 0,1-5 mg/mL (preferiblemente, 0,15 mg/mL) de albúmina (por ejemplo, Albumax, Invitrogen), 0,5-5 nM (preferiblemente, 1 nM) de dexametasona, 25-250 pM (preferiblemente, 100 pM) de ácido ascórbico-2-fosfato, 5-50 ng/mL (preferiblemente, 10 ng/mL) de EGF, 5-50 ng/mL (preferiblemente, 10 ng/mL) de PDGF, FBS al 1-5 % (preferiblemente, al 2 %) y penicilina/estreptomicina (Pen/Strep). Las células progenitoras se cultivan luego durante aproximadamente 24 horas en medio de preinducción que contiene: medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) libre de suero, 1-5 mM (preferiblemente, 2 mM) de butirato de sodio y Pen/Strep. Las células se cultivan a continuación durante 3 a 36 horas, pero preferiblemente durante aproximadamente 24 horas o más en medio de diferenciación que contiene IMDM, sustituto de suero Knock-out (KSR, Gibco) al 1-5 % (preferiblemente, al 2 %) y Pen/Strep.
[0026] El butirato de sodio es un potente inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI) que modula la expresión de un gran número de genes. Otros HDACI adecuados para la invención son fenilbutirato, ácido retinoico, ácido valproico, compuesto APHA 8, apicidina, (-)-depudecina, Scriptaid, sirtinol y tricostatina.
[0027] En otra forma de realización, las células progenitoras se diferencian usando el método siguiente: antes de la inducción, las células progenitoras se cultivan durante un tiempo suficiente para que se adhieran a la placa de cultivo tisular en medio definido que contiene: DMEM bajo en glucosa (1 g/L), MCDB201 pH 7,4, 1x insulinatransferrina-selenio (ITS, Invitrogen), 0,15 g/mL Albumax (Invitrogen), 1 nM de dexametasona, 100 pM de ácido ascórbico-2-fosfato, 10 ng/mL de eGf , 10 ng/mL de PDGF, FBS al 2 %y penicilina/estreptomicina (Pen/Strep). Las células progenitoras se cultivan luego durante aproximadamente 24 en medio de preinducción que contiene: DMEM "bajo" en glucosa 1 g/L, 5-25 mM (preferiblemente, 10 mM) de nicotinamida, 0,5-5 mM (preferiblemente, 1 mM) de p-mercaptoetanol, FBS al 2 % y Pen/Strep. Las células se cultivan entonces durante 10 horas o más en medio de diferenciación que contiene DMEM-glucosa 1 g/L sin suero, 10 mmol/L nicotinamida, 1 mmol/L de p-mercaptoetanol y Pen/Strep.
[0028] Las células progenitoras se pueden diferenciar en presencia de un soporte para permitir el cultivo tridimensional de las células durante la diferenciación. El material de soporte puede comprender componentes de origen natural o puede estar comprendido por materiales sintéticos, o ambos. El material de soporte también puede ser biocompatible. El material de soporte ilustrativo incluye matrices extracelulares y materiales descritos. Otros materiales de soporte que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, uno o una mezcla de dos o más de lo siguiente: colágenos (por ejemplo, colágeno de los tipos I, III, IV, V y VI), gelatina, alginato, fibronectina, laminina, entactina/nidógeno, tenascina, trombospondina, SPARC, undulina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos (por ejemplo, hialuronano, heparán sulfato, sulfato de condroitina, queratán sulfato y dermatán sulfato), polipropileno, TER polímero, alginato-poli-L-lisina, sulfato de condroitina, quitosano, MATRIGEL (Becton-Dickinson) u otros materiales de matriz extracelular disponibles comercialmente.
[0029] En una forma de realización particular, la matriz extracelular para usar en la diferenciación de las UCM en células tipo hepatocito es el colágeno I. Hay comercialmente disponibles placas recubiertas de colágeno de Becton-Dickinson.
[0030] Las células progenitoras se cultivan en uno o más de los medios descritos en la presente durante un tiempo suficiente para la expresión de al menos dos de los siguientes marcadores: PDX-1, insulina, somatostatina, glut2, glucógeno, amilasa y Ngn3; características morfológicas tales como una forma redonda y la producción de insulina.
[0031] En una forma de realización particular, las células progenitoras se diferencian en células pancreáticas de los islotes productoras de insulina por cultivo en medio de diferenciación IMDM que comprende KSR al 2 % y Pen/Strep en una matriz de colágeno I.
[0032] Las células se cultivan típicamente durante un tiempo suficiente para adquirir propiedades funcionales tipo células p pancreáticas de los islotes, tal como la producción de insulina. A este respecto, la diferenciación se evalúa midiendo propiedades funcionales tales como la producción de insulina, usando técnicas conocidas en la técnica. La insulina es una pequeña hormona peptídica producida solamente por las células b de los islotes halladas en el páncreas y secretada en la sangre (in vivo) o el medio (in vitro). Para demostrar la secreción de insulina, se pueden teñir células diferenciadas con un anticuerpo anti-insulina humana. También se pueden usar técnicas ELISA estándar para detectar y cuantificar la cantidad de insulina secretada en el medio.
[0033] Brevemente, se ensamblan bandas en placas de microtitulación y cada pocillo se llena con 300 pL de tampón de lavado de HRP, y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación se elimina el tampón y se añade una muestra de 20 pL a los pocillos con 20 pL de anticuerpo de detección. Las placas se incuban luego de nuevo a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador orbital. El contenido de los pocillos se decanta y se lavan tres veces con tampón de lavado de HRP. Se añaden 100 pL de solución enzimática a cada pocillo y se deja incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. De nuevo, los pocillos se lavan 5 veces con tampón de HRP. A continuación, se añaden 100 pL de solución de sustrato a los pocillos y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. Típicamente luego se desarrolla un color azul a partir de una reacción química. La reacción se termina con 100 pL de "solución de parada". Las soluciones están comercialmente disponibles. Las placas se analizan a 450 nm.
[0034] La inmunohistoquímica se realiza de la siguiente manera: las células se fijan en metanol o paraformaldehído durante 2 minutos y se lavan posteriormente con PBS. Se añade peróxido de hidrógeno al 3 % y se incuba durante 60 minutos. Tras lavar la solución, se aplica el anticuerpo primario con una dilución 1:500 en PBS/Blotto al 5 %/Tween al 0,3 % y se deja incubar durante 60 minutos. De nuevo, las células se lavan tres veces con PBS para eliminar la solución, y se aplica el anticuerpo secundario con una dilución 1:400 en PBS/Blotto al 5 %/Tween al 0,3 % durante 60 minutos.
[0035] Como reconocería la persona experta en la materia tras leer la presente descripción, cualquier variedad de técnicas conocidas en la técnica se puede usar para determinar la expresión de marcadores de células b pancreáticas de los islotes y la morfología celular, incluyendo, pero de forma no limitativa, ensayos de expresión génica tales como PCR, RT-PCR, PCR cuantitativa, análisis de expresión de proteínas, incluyendo inmunohistoquímica, ensayos de inmunofluorescencia, y similares. Tales técnicas se conocen en la técnica y no necesitan más elaboración aquí.
[0036] La diferenciación de las células de la invención se puede detectar por una variedad de técnicas, tales como, pero de forma no limitativa, métodos citométricos de flujo, inmunohistoquímica, técnicas de inmunofluorescencia, hibridación in situ y/o técnicas biológicas histológicas o celulares. Según la presente invención, más de un 30 % de las células progenitoras se pueden diferenciar en células pancreáticas de los islotes productoras de insulina, preferiblemente más de aproximadamente un 50 % de las células, más preferiblemente más de aproximadamente un 75 % de las células, y más preferiblemente más de aproximadamente un 90 % de las células.
Métodos para usar las células pancreáticas productoras de insulina
[0037] Se describe que las células pancreáticas tipo p de los islotes de la invención pueden ser genéticamente modificadas. Conforme a esto, las células pancreáticas tipo p de los islotes de la invención son expuestas a un vector de transferencia génica que comprende un ácido nucleico con un transgén, de manera que el ácido nucleico se introduce en la célula bajo condiciones apropiadas para que el transgén se exprese en la célula. El transgén es por lo general un casete de expresión, que incluye un polinucleótido codificante operativamente enlazado a un promotor adecuado. El polinucleótido codificante puede codificar una proteína, o puede codificar ARN biológicamente activo, tal como RNA antisentido, ARNip o una ribozima.
[0038] Así, el polinucleótido codificante puede codificar un gen que confiera, por ejemplo, resistencia a una toxina o un agente infeccioso, una hormona (como, por ejemplo, hormonas de crecimiento peptídicas, factor de liberación de hormonas, hormonas sexuales, hormonas adrenocorticotropas, citocinas tales como interferones, interleucinas y linfocinas), una fracción de señalización intracelular unida a la superficie celular como, por ejemplo, moléculas de adhesión celular y receptores de hormonas, y factores que promueven un linaje de diferenciación dado, o cualquier otro transgén con una secuencia conocida.
[0039] Como se describirá a continuación, las células pancreáticas de los islotes productoras de insulina diferenciadas a partir de células progenitoras de la invención son útiles en una variedad de ámbitos, incluidos el cribado de fármacos, el cribado de interacciones farmacológicas, el trasplante, la regeneración de tejido/órgano y el tratamiento del daño hepático u otros trastornos hepáticos.
[0040] Se describen métodos para probar la actividad de un compuesto (por ejemplo, un fármaco o un candidato a fármaco). La actividad de un compuesto se puede evaluar midiendo el efecto del fármaco sobre la viabilidad y/o la actividad metabólica de las células pancreáticas tipo p de los islotes de la invención o el efecto del fármaco sobre los transportadores de transporte farmacológico. Como entendería la persona experta en la materia en vista de la presente descripción, las células pancreáticas tipo p de los islotes de la invención se pueden usar en cualquier ensayo de cribado de fármacos conocido, como, por ejemplo, ensayos sobre la producción de insulina, ensayos de cribado de fármacos actuales que usan células de los islotes y similares.
[0041] Se describen métodos para probar la actividad (tal como la toxicidad) de un compuesto poniendo en contacto las células pancreáticas tipo p de los islotes de la invención con un compuesto y midiendo la viabilidad de las células pancreáticas tipo p de los islotes. Una reducción en la viabilidad en presencia de un compuesto de prueba en comparación con aquella en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto es tóxico in vivo. La viabilidad de las células se puede determinar usando técnicas bien conocidas por la persona experta en la materia, como, por ejemplo, tiñendo seguido de una citometría de flujo o sencillamente visualizando las células con un microscopio usando un hemocitómetro.
[0042] Se describen métodos para probar la actividad de un compuesto poniendo en contacto las células pancreáticas tipo p de los islotes de la invención con un compuesto y midiendo la actividad metabólica de las mismas células. Una reducción o un aumento en la actividad metabólica en presencia de un compuesto de prueba en comparación con aquella en ausencia del compuesto de prueba indica una actividad farmacológica in vivo.
[0043] Además se describen métodos para evaluar las interacciones farmacológicas. Las interacciones farmacológicas se pueden evaluar poniendo en contacto las células de la invención con dos compuestos y determinando si el efecto sobre las células de un compuesto se ve afectado por la presencia del segundo compuesto. Por ejemplo, el método puede comprender poner en contacto una primera población del células pancreáticas tipo p de los islotes con un primer compuesto, poner en contacto una segunda población de las células pancreáticas tipo p de los islotes con un segundo compuesto y poner en contacto una tercera población de células pancreáticas tipo p de los islotes con el primer y el segundo compuesto y midiendo un efecto particular en cada una de las poblaciones (por ejemplo, viabilidad celular, actividad metabólica, producción de insulina), donde una reducción o un aumento estadísticamente significativos en un efecto en la tercera población en contacto con ambos compuestos en comparación con cualquiera de las poblaciones primera o segunda indicaría una interacción farmacológica. Una interacción farmacológica puede comprender la inhibición de un fármaco por otro fármaco o el aumento de la actividad de un fármaco por otro fármaco.
[0044] Como reconocería la persona experta en la materia, la expresión génica se puede medir usando cualquier variedad de técnicas conocidas en la técnica, tal como, pero de forma no limitativa, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QC-PCR o QC-RT PCR). Otros métodos para detectar la expresión de ARNm son bien conocidos y están establecidos en la técnica y pueden incluir, pero de forma no limitativa, la amplificación mediada por transcripción (TMA), la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), la amplificación de la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA) y la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA).
[0045] Las mediciones de la actividad metabólica se realizan usando técnicas conocidas en la técnica, como, por ejemplo, poniendo en contacto las células con un compuesto de prueba y recogiendo el sobrenadante. Los metabolitos del compuesto presentes en el sobrenadante se miden usando técnicas conocidas, como, por ejemplo, a través de un tipo apropiado de cromatografía en fase líquida de alto rendimiento (HPLC). La incorporación de timidina por las células cultivadas se puede medir para valorar la proliferación celular in vitro.
[0046] Además se describen métodos para el tratamiento del daño o la enfermedad que surge de la pérdida de células p pancreáticas de los islotes. A este respecto, las células pancreáticas de los islotes productoras de insulina diferenciadas de la invención se pueden usar para el tratamiento de cualquier enfermedad que surja de la pérdida de células pancreáticas de los islotes, incluida, pero de forma no limitativa, la diabetes, tanto de tipo I como de tipo II.
[0047] Se describen métodos para el tratamiento del daño celular de los islotes administrando a un individuo que lo necesita, una cantidad eficaz de las células tipo p pancreáticas de los islotes diferenciadas de la invención. Por cantidad eficaz se entiende una cantidad suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al individuo que recibe el tratamiento, tal como una cantidad para mejorar los síntomas de la diabetes para mejorar la función del hígado. En ciertas formas de realización, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para que vuelvan a crecer células P pancreáticas de los islotes funcionales. Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta señales de patología con el fin de disminuir o eliminar esas señales.
[0048] Se describen métodos para mejorar o restaurar la producción de insulina pancreática administrando una cantidad eficaz de las células tipo P pancreáticas de los islotes diferenciadas de la invención. A este respecto, las células tipo P pancreáticas de los islotes se diferencian usando los métodos descritos en este caso, a partir de progenitores, preferiblemente de un paciente individual, para el trasplante autólogo (en situaciones en las que las células apropiadas se puedan haber cosechado y almacenado en el momento del nacimiento) o alogénico respecto a un receptor histocompatible según los métodos descritos en la presente y practicados en la técnica.
[0049] Las células se cultivan como se describe en este caso, se cosechan y se pueden introducir en el bazo, la circulación y/o el peritoneo de un paciente que sufre de una pérdida o reducción de la producción de insulina de cualquier origen, secundaria a una infección vírica, ingestión de toxinas o errores metabólicos innatos, etc. Siempre que sea posible, se utilizan métodos mínimamente invasivos radiológicamente guiados para implantar las células. También se contemplan en la presente células genéticamente modificadas con genes que codifican enzimas diseñadas para mejorar la función hepática.
[0050] Se describe que las células pancreáticas tipo P de los islotes de la presente invención se administran a un individuo que experimenta un trasplante de células P de los islotes. Las células de la presente invención se pueden administrar solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como factores de crecimiento celular de los islotes (por ejemplo, BMP, TGF-beta 1, IGF, FGF) u otras hormonas o poblaciones celulares.
[0051] Brevemente, las composiciones pueden comprender una población celular pancreática tipo P de los islotes como se describe en este caso, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos como la glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para la administración intravenosa o parenteral o para la administración directamente en el hígado.
[0052] Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de administración será determinada por factores como la condición del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque se pueden determinar las dosis apropiadas mediante pruebas clínicas.
[0053] Cuando se indica "una cantidad eficaz" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones que se va a administrar puede ser determinada por un médico con consideración de las diferencias individuales de edad, peso, enfermedad, extensión de la infección o del daño del hígado y condición del paciente (sujeto). En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica que comprende las células descritas en la presente se puede administrar a una dosis de 103 a 107 células/kg de peso corporal y, en ciertas formas de realización, de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de esos rangos. Las composiciones celulares también se pueden administrar múltiples veces a estas dosis. Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente particular controlando al paciente en busca de señales de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
[0054] La administración de las composiciones del sujeto se puede realizar de cualquier manera conveniente, incluyendo por inyección, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar a un paciente por vía subcutánea, por vía intradérmica, por vía intratumoral, por vía intranodular, por vía intramedular, por vía intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.) o por vía intraperitoneal.
[0055] Las composiciones celulares también se pueden administrar usando cualquier número de matrices. Las matrices han sido utilizadas durante varios años en el contexto de la ingeniería tisular.
[0056] Una matriz se utiliza en la presente como un ejemplo de una sustancia biocompatible.
Ejemplo I - Diferenciación de células madre hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina
[0057] Este ejemplo describe la diferenciación de células madre hepáticas humanas en células pancreáticas tipo P de los islotes.
[0058] Se disociaron células madre fetales mecánicamente a partir de una población mixta de células de hígado entero usando la herramienta StemPro® EZPassage™ de Invitrogen. Las células madre se agruparon y se distribuyeron en placas de 12 pocillos recubiertos de colágeno I. Se dejó que las células se unieran durante toda la noche antes de inducir la diferenciación. Más específicamente, las células se sembraron en placas de cultivo tisular recubiertas de colágeno I al 0,1 % con una densidad de 2,0-3,0x106 células/placa y se dejó que se adhirieran durante toda la noche. Las células se trataron entonces durante dos días en medio de preinducción consistente en: medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) libre de suero, 2 mmol/L de butirato de sodio y Pen/Strep. La diferenciación se realizó cultivando las células durante al menos 24 horas en medio de diferenciación que contiene: IMDM, KSR al 2 % y Pen/Strep. El medio se cambió cada tres días y se evaluó la diferenciación de una manera temporal (es decir, en los días 1, 2 y 3).
[0059] Se aislaron los lisados celulares 1 o 3 días después de la inducción de la diferenciación. Se preparó el ADNc a partir de estos lisados para cribar en función de la expresión de genes específicos del páncreas. La expresión de Pdx-1 y somatostatina se detectó el día 3 (figura 1, carriles 1 y 4, respectivamente). Las células cultivadas en medio de expansión de Kubota solo (control) no expresaron Pdx-1 o somatostatina. Sin embargo, se expresó Glut-2 (carril 5), lo que indica que Glut-2 se expresa en las células madre hepáticas, así como en las células pancreáticas.
Ejemplo II - no conforme a la invención - Diferenciación de HUMC en células pancreáticas productoras de insulina
[0060] Este ejemplo describe la diferenciación de células madre humanas de la matriz del cordón umbilical en células pancreáticas tipo p de los islotes.
[0061] Preparación del cordón umbilical: los cordones umbilicales se pesaron, se midieron y se lavaron íntegramente 2x durante 5 minutos en PBS estéril frío (500 mL). El cordón se lavó luego de nuevo en solución de betadine 1x (500 mL) durante 5 minutos seguido de un aclarado íntegro 2x durante 5 minutos con PBS estéril frío (500 mL) para eliminar el betadine. El extremo pinzado del cordón se eliminó luego con una cuchilla quirúrgica a %-1 pulgada más allá del área pinzada. La sangre se drenó y los vasos sanguíneos se enjuagaron posteriormente con VIASPAN® para eliminar cualquier sangre/coágulos usando una aguja de gran calibre y una jeringa de 50 mL.
[0062] Aislamiento de las células de la matriz del cordón: el extremo opuesto del cordón se pinzó con una pinza Hoffman estéril, y se colocó una conexión luer-lock de 3 vías en el extremo en la aguja/cánula. Una jeringa con solución de colagenasa (0,3-1 %) se unió luego a la conexión de 3 vías y la solución se aplicó durante un periodo hasta que el cordón umbilical se hinchó moderadamente. A continuación, el cordón se incubó en una incubadora humidificada a 37 °C, CO2 al 5 % durante 0,5 a 3 horas en fucnión de la concentración de la solución de colagenasa (es decir, cuanto mayor es la concentración de la solución enzimática, más corto el tiempo para completar la digestión). La "solución de colagenasa" puede incluir uno o más de lo siguiente: colagenasa (0,3-1,0 %); dispasa (0,4 %-1,0 %); hialuronidasa (0,1-1,0 %); DNasa (0,03 %).
[0063] Tras la digestión, la pinza Hoffman se retira del cordón y la solución se drena en un recipiente estéril. El cordón se enjuagó posteriormente con PBS estéril, guardando el lavado. El extremo del cordón se volvió a pinzar con una pinza Hoffman, y se aplicó una solución de hialuronidasa (0,1-1,0 %)/DNasa (0,3 %) a través de la conexión durante un periodo hasta que el cordón se hinchó moderadamente. De nuevo, el cordón se incubó durante 1-12 horas. Tras el tiempo de incubación, la solución de cordón y de lavado se lavó y se recogió en un recipiente estéril.
[0064] La digestión insuficiente con el método de canulación se puede remediar por digestión adicional en hialuronidasa al 0,25 %/colagenasa I al 0,25 % en tampón de digestión durante hasta 4 horas a 37 °C. El tejido se tritura luego a través de un filtro de malla de 40-60 usando un tamiz de disociación celular.
[0065] A continuación, las células así obtenidas se empobrecieron en las células que expresan CD31. (CD-31 es un marcador comúnmente expresado en las células endoteliales, las plaquetas, los macrófagos y las células de Kupffer, los granulocitos, las células T/NK, los linfocitos, los megacariocitos, los fibroblastos, los osteoclastos, los neutrófilos y las células HUVEC). La suspensión de células reducida en CD31 se enriqueció luego en células CD44. CD44 es un receptor para el ácido hialurónico.
[0066] Selección adherente en plástico: la suspensión celular se siembra entonces en placas. 24-48 horas después del aislamiento, las células no adherentes se eliminaron lavando tres veces con PBS estéril. Se añadió DM fresco y se cambió cada dos días. Cuando el cultivo alcanzó entre un 50-80 % de confluencia, las células se cosecharon usando tripsina al 0,05 %/0,53 mM de solución de EDTA y se volvieron a sembrar en un matraz de cultivo T75 recubierto de gelatina para seguir expandiéndose en DM. Los cultivos se mantuvieron en un 50-80 % de confluencia en una incubadora humidificada a 37 °C con CO2 al 5 % para su propagación.
[0067] Diferenciación: antes de la inducción, las células se sembraron en placas de cultivo tisular recubiertas de colágeno I al 0,1 % con una densidad de 2,0-3,0x106 células/placa y se dejó que se adhirieran durante toda la noche. Luego las células se trataron durante dos días en medio de preinducción consistente en: medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) libre de suero, 2 mmol/L de butirato de sodio y Pen/Strep. La diferenciación se realizó cultivando las células durante al menos 24 horas en medio de diferenciación que contiene: IMDM, KSR al 2 % y Pen/Strep. El medio se cambió cada tres días y la diferenciación se evaluó de una manera temporal (es decir, en los días 1, 2 y 3).
[0068] La diferenciación de las células se evaluó de la siguiente manera:
Inmunocitoquímica. Las células diferenciadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS durante 10 min y luego se lavaron en PBS. Las células se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,2 % en PBS durante 5 min, se lavaron y entonces se bloquearon en Tritón X-100 al 0,2 %, suero normal al 2 % en PBS durante 1 h y luego se incubaron con anticuerpos para la insulina. Después de lavar tres veces con PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario. La tinción oscura de las células de forma redonda en la figura 2 es indicativa de la expresión de insulina en esas células. Las células UCM indiferenciadas no se tiñen con anti-insulina humana.
[0069] Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR): el ARN se aisló a partir de las células en las columnas RNeasy Quick spin y se convirtieron a ADNc usando hexámeros aleatorios y la transcriptasa inversa SuperScript II. Los productos de la PCR se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2 % y se visualizaron mediante tinción de bromuro de etidio. Se analizó la expresión de varios genes específicos de las células p pancreáticas de los islotes, incluyendo Pdx-1, insulina, glucagón, somatostatina, glut2 y GADPH (control de carga de ADNc). Véase la figura 3.
[0070] Secreción celular de insulina: la concentración de insulina en el medio de cultivo se determinó por ELISA como se ha descrito anteriormente. Véase la figura 4.
[0071] Aunque la invención se ha descrito en relación con formas de realización específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. En general, los principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la presente descripción que entran dentro de la práctica conocida o habitual en la técnica a la que pertenece la invención y que se pueden aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Método para diferenciar células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina, que comprende:
(a) incubar células progenitoras hepáticas, donde las células progenitoras hepáticas son células madre hepáticas que expresan EpCAM, NCAM, albúmina, CK8/18, CK19 y CD133/1 en medio de preinducción sin suero que comprende un inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI); y, posteriormente,
(b) incubar las células progenitoras hepáticas en medio de inducción que comprende sustituto de suero knockout;
durante un tiempo suficiente para diferenciar las células progenitoras hepáticas en células pancreáticas productoras de insulina.
2. Método según la reivindicación 1, donde el inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI) se selecciona del grupo que consiste en butirato de sodio, fenilbutirato, ácido retinoico, ácido valproico, compuesto APHA 8, apicidina, (-)-depudecina, Scriptaid, sirtinol y tricostatina.
3. Método según la reivindicación 2, donde el inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACI) es butirato de sodio.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las células progenitoras hepáticas son células progenitoras hepáticas humanas.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el medio de inducción comprende aproximadamente sustituto de suero knock-out al 2 %.
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