ES2939816T3 - Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos - Google Patents

Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2939816T3
ES2939816T3 ES16845186T ES16845186T ES2939816T3 ES 2939816 T3 ES2939816 T3 ES 2939816T3 ES 16845186 T ES16845186 T ES 16845186T ES 16845186 T ES16845186 T ES 16845186T ES 2939816 T3 ES2939816 T3 ES 2939816T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
neoislets
insulin
islet
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16845186T
Other languages
English (en)
Inventor
Christof Westenfelder
Anna Gooch
Ping Zhang
Zhuma Hu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SYMBIOCELLTECH LLC
Original Assignee
SYMBIOCELLTECH LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SYMBIOCELLTECH LLC filed Critical SYMBIOCELLTECH LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2939816T3 publication Critical patent/ES2939816T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Se describen neo-lslets que comprenden: a) células de islote desdiferenciadas y células madre mesenquimatosas y/o adiposas; o b) células de los islotes rediferenciadas y células madre mesenquimatosas y/o adiposas cuando las células han sido tratadas para facilitar la rediferenciación. En el presente documento se describen además métodos para generar Neo-lslets. También se describen métodos para tratar a un sujeto, comprendiendo los métodos: proporcionar al sujeto Neo-lslets descritos en el presente documento. Además se describen métodos para tratar a un sujeto que padece Diabetes Mellitus Tipo 1, Diabetes Mellitus Tipo 2 y otros tipos de diabetes mellitus insulinodependiente, o intolerancia a la glucosa proporcionando al sujeto Neo-lslet como se describe en este documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos Campo Técnico
La solicitud se relaciona con el campo de la biotecnología, la medicina y el cultivo celular. Se refiere específicamente a un método para la generación de un conglomerado de células (también identificado como "Neoislotes"), una composición que comprende un conglomerado de células y su uso en un tratamiento médico, por ejemplo, el tratamiento de la diabetes mellitus.
Antecedentes de la invención
Las células p productoras de insulina, cuando se aíslan del páncreas de un donante, generalmente proliferan muy poco ex vivo, es decir, no lo suficiente como para generar números de células adecuados para el tratamiento de la diabetes mellitus insulinodependiente. Las tecnologías actuales y muchas terapias preclínicas diseñadas para superar esta escasez y proporcionar a los pacientes diabéticos una terapia de reemplazo de insulina liberada fisiológicamente de larga duración (trasplantes de islotes y páncreas; terapias derivadas de células precursoras, etc.) se ven obstaculizadas tanto por la escasez de células donantes como por la necesidad de suprimir el sistema inmunológico del paciente, lo que conduce a un nuevo conjunto de efectos adversos para el paciente, tales como infecciones oportunistas y tumores malignos. La gran escasez de donantes de páncreas adecuados combinada con la necesidad de trasplantes de islotes repetidos, que requieren hasta cinco donantes cada uno, continúa impidiendo la disponibilidad general de estas costosas terapias. Se prueban sistemas de micro y macroencapsulación de células productoras de insulina para facilitar el aislamiento inmunológico y superar este problema. Sin embargo, los materiales de encapsulación utilizados representan cuerpos extraños y pueden inducir una respuesta autoinmune que resulte en el fracaso de la terapia o requiera el uso prolongado de medicamentos antirrechazo.
Resumen de la invención
La invención se expone en las reivindicaciones que se adjuntan. Más en particular, en la presente descripción se describe un método para la generación de un conglomerado de células, el método comprende:
a. desdiferenciar las células de los islotes por proliferación in vitro para obtener células de los islotes desdiferenciadas,
b. opcionalmente hacer proliferar aún más las células de los islotes desdiferenciadas,
c. colocar las células desdiferenciadas de los islotes en cultivo con células madre mesenquimales y/o células madre derivadas de tejido adiposo, y
d. cocultivar las células de los islotes desdiferenciadas con las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo en una superficie hidrófoba, lo que forma de esta manera el conglomerado de células de las células de los islotes desdiferenciadas y las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo,
en donde las células de los islotes desdiferenciadas se caracterizan por una expresión de insulina, síntesis de insulina, almacenamiento de insulina y/o secreción de insulina inducida por glucosa significativamente reducidas en comparación con las células de los islotes recién aisladas, y en donde las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo son células madre adultas indiferenciadas que proliferan y no producen insulina.
También se describe una composición que comprende un conglomerado de células que puede obtenerse mediante un método como se describió anteriormente, en donde el conglomerado de células comprende células de los islotes desdiferenciadas que se caracterizan por una expresión de insulina, síntesis de insulina, almacenamiento de insulina y/o secreción de insulina inducida por glucosa significativamente reducidas en comparación con células de los islotes recién aisladas.
Adicionalmente se describe una composición para uso en el tratamiento médico de un sujeto, tal como el tratamiento de la diabetes mellitus.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1: representa una descripción general esquemática de la formación de neoislotes y su uso en el tratamiento de diabetes mellitus insulinodependiente o diabetes mellitus no insulinodependiente.
La Figura 2: Crecimiento y transición epitelial a mesenquimal de células de los islotes cultivadas. Todas las imágenes tienen un aumento de 10 x. Panel A: Islotes completos recién aislados del ratón transgénico C57Bl/6 inslgfp, en donde el gen de la Proteína Verde Fluorescente (gfp) está bajo el control del promotor del gen de la insulina 1 (insl).1 Las células beta de los islotes son verdes. Panel B: Islotes completos ins1gfp+ después de 6 días de cultivo. Todavía es evidente una expresión significativa del gen de la insulina (células verdes), pero las células crecen más que los islotes y proliferan. En estas células superadas, la expresión del gen de la insulina está regulada negativamente y las células ya no son verdes. Panel C: células de los islotes de ratón ins1gfp+ disociadas cultivadas durante 1 día, fijadas y analizadas por inmunocitoquímica para determinar la proteína de insulina, mediante el uso de un anticuerpo anti-insulina de conejillo de indias y un anticuerpo de conejillo de indias conjugado con cy3 para visualizar la proteína insulina (rojo). La imagen revela que, si bien hay muy pocas células gfp+, aproximadamente la mitad de las células contienen insulina, pero no son verdes. Esto indica que las células beta se adhieren y proliferan a medida que pierden la expresión del gen de la insulina debido a la transición epitelial a mesenquimal. Panel D: células de los islotes ins1gfp+ disociadas cultivadas 2 días en presencia de EdU. Las células se fijaron y se tiñeron con Hoechst33342 (núcleos, azul) y para EdU (rojo). Las células que no se dividen son de color verde brillante y tienen una morfología epitelial redonda, mientras que las células que se dividen (núcleos rojos) adquieren una apariencia mesenquimal alargada y son solo ligeramente verdes, lo que indica la regulación negativa de la expresión del gen de la insulina e ilustra su transición epitelial a mesenquimal.
La Figura 3: Perfiles de expresión génica dependientes del pase (P) comparativos de materiales de partida de los NI. Perfiles de expresión génica (Log10RQ) de células de los islotes cultivadas de ratón, perro y humano (izquierda) y M/ASC (derecha) en los pases 1, 2 y 3 (P1, P2, y P3, respectivamente). Todos los perfiles de expresión génica para ambos tipos de células se normalizaron a los de islotes recién aislados específicos de especie. En general, en ratones, perros y humanos, los perfiles de expresión génica de las ASC difieren de los de las células de los islotes de los pases, y la eliminación de las células de los islotes disminuye progresivamente la expresión de los genes asociados a las células de los islotes. Datos: media con IC del 95 %, representativa de seis experimentos independientes. ^ , expresado en hASC, pero no en células de los islotes humanos, lo que evita la normalización respectiva; *, no expresado.
Las Figuras 4A - 4D. Fenotipado ASC de ratón (Figura 4A) y canino (Figura 4B). Las Figuras 4A y 4B, paneles superiores izquierdos: imágenes de campo claro de cultivos de ASC confluentes, adherentes a plástico; Paneles superiores derechos: Diferenciación osteogénica (tinción de calcio con rojo de alizarina); Paneles inferiores izquierdos: diferenciación adipogénica (tinción aceite Rojo-O); Paneles inferiores derechos: Diferenciación condrogénica (tinción con azul alcián). Las barras de escala rojas = 50 pm. La Figura 4C: La expresión del gen IDO-1 de las ASC caninas expuestas al IFNy se normalizó a la de las cASC no expuestas (media ± SEM de 4 experimentos independientes). La expresión del gen IDO-1 se estimula 3,4 veces cuando las ASC caninas se exponen al IFNy. La Figura 4D: Las ASC de ratón y perro cultivadas fueron examinadas por FACS para determinar su expresión positiva de CD44 y su expresión negativa de antígenos de trasplante CD45, CD34 e I-A[b] y DLA-DR. Si bien todas las M/ASC se caracterizan por la adherencia plástica y la capacidad de experimentar la diferenciación trilinaje, no todas las M/ASC no humanas expresan el mismo conjunto de epítopos de superficie celular que las de los humanos y, aunque la mayoría expresa CD44, la expresión de CD90 es variable. La expresión canina de M/ASC de CD90 es variable.
La Figura 5: Formación y representación de neoislotes. La Figura 3A representa imágenes y un esquema de células de ratón que experimentan la formación de neoislotes, en donde 1) las MSC de ratón positivas para proteína fluorescente verde (gfp+) se expanden en cultivo; 2) las células de los islotes de ratón se expanden en cultivo; 3) las células se cocultivan en placas de adhesión ultrabaja y forman neoislotes fácilmente. Los neoislotes pueden cultivarse subsecuentemente en medio de rediferenciación (RDM).
La Figura 6: PANELES IZQUIERDO, MEDIO y DERECHO: imágenes (aumentos a 63 x) de neoislotes murino (izquierda), canino (centro) y humano (derecha); ASC (verde), células de los islotes (rojo) y núcleos (azul). La morfología y la composición celular no difieren significativamente entre los neoislotes murinos, caninos y humanos.
Las Figuras 7A y 7B. Por ciento de ASC de perro teñidas con Cell Tracker Green y de IC de perro no teñidas en cNI antes y después de la formación. La Figura 7A: Gráficos de dispersión de FACs representativos (x=dispersión directa; y=fluorescencia) que muestran el por ciento de (i) ASC solo (panel del extremo izquierdo), (ii) IC solo (panel central izquierdo) (iii) células al inicio del cocultivo (panel central derecho), (iv) NI disociados formados a partir del cocultivo en (iii; panel del extremo derecho) verdes y sin teñir, 24 horas después del cocultivo recolectado y disociado para preparación de células individuales. El 96,9 % de las ASC se tiñeron efectivamente de verde antes del cocultivo y solo el 0,1 % de las IC sin teñir son autofluorescentes. Tras el inicio del cocultivo, aproximadamente el 47 % de las células son ASC y el 53 % son IC, y después de la formación, dentro de las NI, aproximadamente el 51 % de las células son ASC y el 49 % son IC. La Figura 7B: Gráfico de barras del por ciento de ASC e IC en NI, 24 horas después del cocultivo (media ± SEM) de n=12 repeticiones independientes del experimento realizado en la Figura 7A, lo que indica que, consistentemente, las NI se componen de aproximadamente un 50 % de IC y un 50 % de ASC. Las diferencias entre barras no son estadísticamente significativas.
Las Figuras 8A-8C: Perfiles de expresión génica de neoislotes de ratón, perro y humano. Todos los datos están normalizados a 2 genes domésticos, p-actina y p2 microglobulina. La Figura 8A: Perfil de expresión génica de genes asociados a islotes en neoislotes de ratón (arriba) y perro (abajo). Los perfiles de expresión génica se obtuvieron a partir de neoislotes de ratón rediferenciados (arriba a la izquierda), islotes de ratón recién aislados (arriba a la derecha) y neoislotes de ratón recién formados (normalización de ratón) en los siguientes 14 genes asociados a los islotes: insulina 1 (ins1), insulina 2 (ins2), glucagón (gcg), somatostatina (sst), caja homeótica pancreática y duodenal-1 (pdx1), factor de transcripción de insulina mafA (mafa), nk6 caja homeótica 1 (nkx6.1), polipéptido pancreático (ppy), glut-1, glut-2, ucn3, kcj11, sur2 y receptor glp1 (glp1r). Los perfiles de expresión génica se obtuvieron de neoislotes de perros rediferenciados (abajo a la izquierda), islotes de perros recién aislados (abajo a la derecha) y neoislotes de perros recién formados (normalización de perros) en los siguientes 6 genes asociados a los islotes: insulina (ins), gcg, sst, nkx6.1, sur1, y glp1r. Tanto los neoislotes de perro como de ratón recién formados expresan niveles bajos de todos los genes asociados a los islotes probados, y tienen la capacidad de experimentar una rediferenciación que resulta en niveles más altos de estos genes. La Figura 8B: Arriba: Perfiles de expresión génica para la insulina 1 (ins1), insulina 2 (ins2), glucagón (gcg), somatostatina (sst), polipéptido pancreático (ppy), caja homeótica pancreática y duodenal-1 (pdx1), factor de transcripción de insulina mafA (mafa), transportador de glucosa 2 (glut-2), factor de crecimiento endotelial vascular a (vegf-a) y factor 1 derivado de células estromales (cxcl-12) se obtuvieron a partir de neoislotes de ratón recién formados generados a partir de células de los islotes de ratón P1 y MSC de ratón P5 (izquierda), o células de los islotes de ratón P2 y MSC de ratón P5 (derecha), y normalizados a islotes de ratón recién aislados. Medio: perfiles de expresión génica de genes asociados a células de los islotes, insulina (ins), gcg, pdxl y receptor de sulfonilurea 1 (suri), así como también genes asociados a ASC vegf-a, cxcl12, y factor de crecimiento transformante p1 (tgfp-1) en neoislotes caninos recién formados producidos a partir de células de los islotes de perro P1 y ASC de perro P2 (izquierda) o células de los islotes de perro P2 y ASC de perro P2 (derecha) y normalizadas a islotes de perro frescos. Abajo: Perfil de expresión génica para ins, gcg, sst, ppy, pdxl, mafa, nk6 caja homeótica 1 (nkx6.1), urocortina 3 (ucn3), suri, vegf-a, cxcl12, tgfp-1, y igf-1 en neoislotes humanos recién formados generados a partir de células de los islotes humanos P1 y ASC humanos P3 (izquierda) o células de los islotes humanos P2 y ASC humanos P2 (derecha) normalizados a islotes humanos recién aislados. Este panel demuestra que en todas las especies (murino, canino, humano), (a) los neoislotes hechos de células de los islotes desdiferenciadas expresan niveles bajos de genes de células de los islotes, y (b) la expresión de genes de células de los islotes disminuye con el paso. La Figura 8C: Secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) por 50 neoislotes de ratón C57Bl/6 recién formados que comprenden células de los islotes P1 desdiferenciadas y MSC P5 (barras cruzadas) frente a 50 islotes de ratón C57Bl/6 recién aislados (barras vacías). Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Los neoislotes liberan aproximadamente el 1 % de la insulina que liberan los islotes recién aislados en respuesta a la exposición a glucosa 25 mM durante 60 minutos (~0,5 ng frente a ~50 ng de insulina). Esto es paralelo a la disminución de la expresión del gen de la insulina en los pases observados en el Panel B.
La Figura 9. El tratamiento con NI alogénico estableció euglucemia en ratones NOD espontáneamente diabéticos. Niveles de glucosa en sangre (media ± SEM) de ratones NOD normalizados con Linbits (Día 0), luego infundidos vía ip el Día 20 después de la terapia con Linbit con 2x105 C57Bl/6 Nl/kg (n=6; barras abiertas) o vehículo (n=6; barras negras). Si bien los niveles de glucosa en sangre de los ratones tratados con vehículo aumentaron cuando expiraron los Linbits (aproximadamente el día 35), la euglucemia se mantuvo a largo plazo en los ratones tratados con NI, lo que implica la rediferenciación de IC en células productoras de insulina y la protección inmunitaria mediada por NI contra ataques alo y autoinmunes. Nivel normal de glucosa en sangre, línea discontinua.*, P < 0,05 frente al grupo tratado con vehículo.
Las Figuras 10A-10C. Niveles de glucosa en sangre de ratones C57Bl/6 diabéticos STZ tratados con NI y conglomerados y rediferenciación in vivo de IC en células endocrinas contenidas en los NI. La Figura 10A: Los niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo se muestran en grupos de ratones diabéticos STZ, todos tratados vía ip el día 7 con (i) vehículo, (ii) 2x105 conglomerados de ASC/kg de peso corporal, (iii) 2x105 conglomerados de IC/kg de peso corporal o (iv) 2x105 NI/kg de peso corporal *, P < 0,05 frente al grupo tratado con vehículo. ★ , P < 0,05 frente al grupo tratado con conglomerados de ASC. La Figura 10B: Izquierda, imagen de fluorescencia (verde, células eGFP+) de un omento representativo de un ratón euglucémico tratado con NI 21 semanas después de la inyección de los NI (barra de escala = 200 pm). Derecha, la expresión del gen omental (media ± SEM) se normalizó a la de los NI antes de la administración, lo que demuestra el injerto de los NI y una rediferenciación endocrina significativa. La Figura 10C: Los perfiles de expresión de Ins1 e Ins2 (media ± SEM) de páncreas completo de ratones diabéticos tratados con conglomerados de ASC, conglomerados de IC y NI frente a ratones diabéticos tratados con vehículo se normalizaron a los de ratones no diabéticos. Dado que los niveles de expresión del gen de la insulina pancreática se redujeron de manera similar en todos los grupos de tratamiento frente a los de los ratones hiperglucémicos tratados con vehículo, se deduce que el control de la glucosa en sangre observado en los ratones tratados con NI se logró mediante la secreción de insulina de los NI omentales.
La Figura 11: Morfología y viabilidad de C57Bl/6 de conglomerados de IC y ASC usados para tratar los ratones en las Figuras 10A-10C. Imágenes de fluorescencia de conglomerados IC solo P1 (izquierda) y ASC solo P1 (derecha) después de la formación y teñidos para viabilidad con PI (rojo) y FDA (verde, ver Métodos). Los conglomerados de ASC solo y de IC solo son > 95 % viables antes de la inyección vía ip. Las barras de escala (rojas) = 150 pm.
La Figura 12: Perfiles de glucosa en sangre y estudio de búsqueda de dosis en ratones NOD/SCID tratados vía ip tres semanas después de la hiperglucemia inducida por STZ, con vehículo o neoislotes caninos. Tanto las dosis de 2x105 (barras negras) y 8x104 de neoislotes/kg de peso corporal (barras cruzadas) reducen los niveles de glucosa en sangre a largo plazo en comparación con el tratamiento con vehículo (barras abiertas). Sin embargo, 2x105 neoislotes/kg de peso corporal ("pc") es una dosis más efectiva.
La Figura 13: Reversión de la euglucemia mediante la eliminación de neoislotes caninos. El tratamiento vía ip de ratones NOD/SCID diabéticos STZ con neoislotes caninos (barras negras) provoca una euglucemia sostenida en comparación con los animales tratados con vehículo (barras abiertas), mientras que la eliminación de los neoislotes caninos de tales animales tratados da como resultado la hiperglucemia.
Las Figuras 14Ay 14B. Los NI singénicos yxenogénicos administrados vía IP normalizan los niveles de glucosa en sangre de ratones diabéticos STZ. La Figura 14A: Niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo de ratones C57Bl/6 diabéticos STZ tratados vía ip con 2x105 NI singénicos/kg de peso corporal (barras negras, N=6) o vehículo (barras abiertas, N=6). La Figura 14B: Niveles de glucosa en sangre de ratones NOD/SCID diabéticos STZ tratados con 2 x 105 NI caninos/kg de peso corporal (barras negras, N=5) o vehículo (barras abiertas, N=5). En ambas Figuras 14A y 14B, los niveles de glucosa en sangre se normalizaron por primera vez el día cero con gránulos de Linbit antes de la administración de los NI. Mientras que los ratones tratados con vehículo se vuelven hiperglucémicos una vez que se agota la insulina de los Linbits (30-40 días después de la implantación), los ratones tratados con NI (singénicos y xenogénicos) permanecen normoglucémicos, lo que indica que los NI controlan los niveles de glucosa en sangre a largo plazo. *, P < 0,05 frente a grupos tratados con vehículo.
La Figura 15: Gráficos de supervivencia de Kaplan Meier de ratones diabéticos NOD/SCID tratados poco después del desarrollo de diabetes con los neoislotes caninos o vehículo. Los animales diabéticos tratados tanto con las dosis de 2X105 (cuadrados) u 8X104 (círculos) de neoislotes/kg de peso corporal sobrevive significativamente más tiempo que los animales tratados con vehículo (triángulo) o, sorprendentemente, los animales de control no diabéticos (diamantes).
La Figura 16: Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (GTT IP) y ELISA de insulina canina de ratones NOD/SCID tratados con neoislotes. Arriba: Protocolo experimental de GTT IP. Abajo a la izquierda: GTT IP de ratones NOD/SCID tratados con 2X105 neoislotes/kg de peso corporal (cuadrados, n=5) frente a ratones tratados con vehículo (círculos, n=3). Las GTT IP son normales en los ratones NOD/SCID tratados con 2X105 neoislotes/kg de peso corporal, mientras que los niveles de glucosa en sangre de los animales tratados con vehículo permanecen significativamente elevados. Abajo a la derecha: El ELISA de insulina específica canina realizado en muestras duplicadas de sueros del vehículo (barra izquierda, n=3) y ratones NOD/SCID tratados con neoislotes caninos (barra central, rayada, n=5) que se habían recolectado durante las pruebas de tolerancia a la glucosa, así como también sueros de ratones C57Bl/6 no diabéticos (barra negra central, n=2, control negativo para especificidad de ELISA) y un perro sano (barra abierta, control positivo para especificidad de ELISA). En ratones caninos tratados con neoislotes, pero no tratados con vehículo, un aumento de la glucosa en sangre se acompaña de la liberación de insulina canina, lo que indica que la liberación de insulina de los neoislotes caninos es responsable de los niveles de GTT IP normales.
La Figura 17: La insulitis permanece en ratones NOD tratados con los NI. Imagen representativa (40x) de una sección pancreática teñida con hematoxilina eosina de un ratón NOD euglucémico tratado con los NI 11 semanas después del tratamiento que demuestra la presencia de insulitis persistente de alto grado (círculo negro). Barra de escala (blanca) = 200 pm.
Las Figuras 18A- 18C. Injerto de los NI, supervivencia y expresión de insulina en ratones NOD. La Figura 18A: Representación de la fluorescencia in vivo de un ratón NOD tratado 10 semanas antes con NI eGFP+ marcados con DiR demuestran su ubicación en la parte superior del abdomen. La Figura 18B: Los NI eGFP+ de ratón C57Bl/6 administrados vía ip permanecieron injertados en el omento y mantuvieron la euglucemia en ratones NOD con diabetes espontánea 11 semanas después del tratamiento (ver la Figura 9). Imagen izquierda (10x): omento representativo de un ratón NOD tratado con NI eGFP+ C57B1/6 (verde; ver flechas rojas). Esta imagen demuestra que los NI se alojaron e injertaron en el omento, e indica que no hay rechazo de los NI. Imagen derecha (10x): imagen ampliada de un sol NI injertado. Se muestra su ubicación, cerca de capilares (flecha amarilla). La Figura 18C: Panel izquierdo, imagen principal: Secciones del omento (imagen 10x) representadas en la Figura 18B teñido por inmunohistoquímica para ADN (Dapi, azul) y proteína de insulina (rojo). Se detectó claramente la proteína insulina. Recuadro, control negativo en el que se omitió el anticuerpo anti-insulina primario. Panel derecho, imagen principal: Secciones del omento (10x) de un ratón NOD diabético tratado con vehículo teñido para ADN (azul) y proteína de insulina (rojo). Recuadro: Aumento de 40x de la misma sección (barra de escala = 10 pm). No se detectó insulina en ninguno de los aumentos. Estas imágenes demuestran la ubicación omental y la síntesis de insulina por los NI injertados. Barras de escala = 100 pm a menos que se indique de otra forma.
La Figura 19: Niveles de glucosa en sangre de ratones NOD/SCID diabéticos STZ tratados con neoislotes caninos. Los animales fueron tratados con neoislotes 3 meses después del inicio de la diabetes y seguidos a largo plazo. Los animales con diabetes establecida muestran normoglucemia después del tratamiento con neoislotes caninos (barras negras), mientras que los tratados con vehículo (barras abiertas) se mantienen hiperglucémicos después de la liberación de insulina cuando los Linbits caducan en ~ Día 36. Esto demuestra que los neoislotes son efectivos para establecer la euglucemia en la diabetes de aparición remota.
La Figura 20: Niveles de glucosa en sangre de ratones NOD con T1DM autoinmunes tratados con neoislotes alogénicos. Se trataron ratones NOD hembra diabéticos espontáneamente con gránulos de insulina de liberación lenta (Linbits, vía sc) para controlar la hiperglucemia. En el día 20 posterior a la terapia con Linbit, los ratones se trataron con neoislotes alogénicos derivados de ratones C57Bl/6 (generados a partir de células de los islotes P2 y MSC gfp+ P5; n=5; barras negras) o vehículo (n=3; barras vacías). Estos datos demuestran claramente que la euglucemia se mantiene como consecuencia del aislamiento inmunitario inducido por los neoislotes frente a ataques tanto aloinmunes como autoinmunes.
La Figura 21: Los neoislotes no inducen hipoglucemia en ratones no diabéticos. Panel superior: Se administraron vía ip 2x105 neoislotes/kg de peso corporal derivados de ratones C57Bl/6 a ratones C57Bl/6 no diabéticos. Los animales tratados fueron seguidos durante 12 semanas. Los niveles de glucosa en sangre se evaluaron semanalmente. No se observó hipoglucemia en ningún momento, lo que demuestra la liberación fisiológica de insulina por los neoislotes de ratón. Los neoislotes permanecen injertados y no fueron rechazados. Panel inferior: Niveles de glucosa en sangre de ratones NOD/SCID tratados vía ip con (a) 2x105 neoislotes de perro marcados con DiR recién formados (células de islote de perro P2 ASC de perro P4; línea gris; n=6) o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (control; línea negra; n=3). Los neoislotes permanecen injertados (ver la Figura 18A). No se observó hipoglucemia en ningún momento. Estos datos demuestran aún más la liberación fisiológica de insulina por parte de los neoislotes de perros.
Las Figuras 22A-22C: Ni las MSC ni las células de los islotes cultivadas contenidas en los neoislotes alogénicos inducen la formación de anticuerpos. En todos los paneles, las células se incubaron con sueros de ratones control o ratones tratados y luego con la IgG anti-ratón marcada con ficoeritrina (PE), luego se analizaron por FACS. En los Paneles A y B, se recogieron sueros de ratones NOD que se volvieron euglucémicos mediante el tratamiento con neoislotes 12 semanas después del tratamiento, o de ratones NOD de control tratados con vehículo o no tratados. La Figura 22A: Análisis FACS de las MSC C57Bl/6 Gfp+ de neoislotes. La fila superior muestra histogramas de MSC teñidas con anticuerpo de isotipo (control negativo, arriba a la izquierda) y MSC incubadas con sueros de ratones NOD no tratados (centro y derecha). La fila inferior muestra histogramas FACS de MSC incubadas con sueros de ratones NOD tratados con neoislotes alogénicos (tres paneles de la izquierda) o tratados con vehículo (panel de la derecha). No hay evidencia de una respuesta de anticuerpos a las MSC alogénicas. La Figura 22B: Análisis FACS de células de islote cultivadas C57Bl/6 de neoislotes. La fila superior muestra histogramas de células de los islotes teñidas con anticuerpo de isotipo (control negativo, arriba a la izquierda) y células de los islotes incubadas con sueros de ratones NOD no tratados (centro y derecha). La fila inferior muestra histogramas FACS de células de los islotes incubadas con sueros de ratones NOD tratados con neoislotes alogénicos (tres paneles de la izquierda) o tratados con vehículo (panel de la derecha). Estos datos demuestran que no hay respuesta de anticuerpos a las células de los islotes alogénica cultivadas. La Figura 22C: Control positivo. Histograma superior: ASC de perro incubadas con sueros de ratón NOD recogidos 14 días después del tratamiento con vehículo, seguido de incubación con IgG anti-ratón marcada con PE. Histograma inferior: ASC de perro incubadas con suero de ratón NOD recogidos 14 días después del tratamiento vía ip con ASC de perro, seguido de incubación con IgG anti-ratón marcada con PE. Estos datos demuestran que los ratones NOD montan una respuesta inmune robusta a las células xenogénicas.
La Figura 23: Respuesta de la IgG a las células usadas para generar los NI (MSC e IC) con las que se trataron los ratones NOD. Se muestra un resumen de los resultados de FACS para MSC C57Bl/6 P1 e IC cultivadas C57Bl/6 P5 incubados con sueros y anticuerpo IgG anti-ratón marcado con cy3. Los sueros procedían de ratones NOD tratados con vehículo y tratados con NI del experimento representado en la Figura 2. Los sueros se recogieron en el momento del sacrificio (Día 77). Como control positivo, también se recogieron sueros de ratones NOD tratados con islotes C57Bl/6 (alogénicos) intactos 14 días después de la administración vía ip de los islotes y se evaluaron mediante FACS como anteriormente. Cy3+: por ciento de células Cy3+ (media ± SE) detectadas tras la incubación con sueros. Una respuesta de < 7 % se consideró negativa. El rechazo de los NI mediado por anticuerpos parece improbable ya que (i) los ratones NOD permanecieron euglucémicos (ver la Figura 2), y (ii) los datos de FACS no muestran respuesta de IgG a estas células en ratones NOD por lo demás inmunocompetentes. *, P < 0,05 frente a otros tratamientos.
La Figura 24: Por ciento de células T colaboradoras, citotóxicas y reguladoras de bazo (a-d) y omento (e) de ratones NOD tratados con islotes (N=3) frente a ratones NOD tratados con NI (N=3) 14 días después de la administración vía ip. Para (a) y (b), se muestra el por ciento de células CD3+ que también son (a) CD4+ o (b) CD8+. Para (c) y (d), se muestra el por ciento de células CD4+ que también eran (c) CD25+ o (d) CD25+Foxp3+. Si bien los porcentajes de células T auxiliares y citotóxicas fueron más bajos en los ratones tratados con NI que en los ratones tratados con islotes, los porcentajes de células T reguladoras aumentaron significativamente, lo que sugiere que los NI ayudaron a restaurar la normoglucemia en ratones NOD (ver la Figura 2) en parte a través de la modulación inmunológica. (e) El por ciento de células Foxp3 positivas en los omentos de ratones NOD tratados con los NI aumentó notablemente frente a los animales tratados con islotes. Los omentos se tiñeron para Foxp3 y el por ciento de células positivas se contó como se describe en Información complementaria. *, P < 0,05 frente al grupo tratado con islotes.
Descripción detallada
Las referencias a métodos de tratamiento como se describen en la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
El método descrito y los conglomerados de células obtenidos por él superan la capacidad limitada para generar suficientes dosis terapéuticas de células de los islotes aisladas y cultivadas a partir de un único donante de páncreas y proporcionarlas a un sujeto que las necesite.
Como se usa en la presente descripción, los neoislotes comprenden células madre mesenquimales y/o células madre derivadas de tejido adiposo, y células de los islotes desdiferenciadas. Por tanto, la invención se refiere a un método para la generación de un conglomerado de células, el método que comprende:
a. desdiferenciar las células de los islotes por proliferación in vitro para obtener células de los islotes desdiferenciadas,
b. opcionalmente hacer proliferar aún más las células de los islotes desdiferenciadas,
c. colocar las células desdiferenciadas de los islotes en cultivo con células madre mesenquimales y/o células madre derivadas de tejido adiposo, y
d. cocultivar las células de los islotes desdiferenciadas con las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo en una superficie hidrófoba, lo que forma de esta manera el conglomerado de células de las células de los islotes desdiferenciadas y las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo,
en donde las células de los islotes desdiferenciadas se caracterizan por una expresión de insulina, síntesis de insulina, almacenamiento de insulina y/o secreción de insulina inducida por glucosa significativamente reducidas en comparación con las células de los islotes recién aisladas, y en donde las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo son células madre adultas indiferenciadas que proliferan y no producen insulina.
Más en particular, la invención se refiere a un método como se describió anteriormente, en donde las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo proliferan durante hasta 4 pases antes de cocultivarlas con las células de los islotes desdiferenciadas.
Los neoislotes, generados in vitro por el método descrito anteriormente son el tamaño aproximado de los islotes pancreáticos. Tales neoislotes comprenden células madre mesenquimales (MSC) derivadas de médula ósea y/o células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) y células de los islotes desdiferenciadas (que no expresan insulina). Las células de los islotes expandidos en cultivo que se desdiferencian a través de la transición epitelial a mesenquimal (EMT), luego se agregan con MSC y/o ASC en los conglomerados de células de neoislotes, que se rediferenciarán espontáneamente y reanudarán la secreción regulada de insulina cuando se administren a los sujetos. Por lo tanto, la invención también se refiere a una composición que comprende un conglomerado de células que puede obtenerse mediante un método como se describió anteriormente, en donde el conglomerado de células comprende células de los islotes desdiferenciadas que se caracterizan por una expresión de insulina, síntesis de insulina, almacenamiento de insulina y/o secreción de insulina inducida por glucosa significativamente reducidas en comparación con células de los islotes recién aisladas. Tal composición puede comprender adicionalmente un hidrogel. La invención también se refiere a tal composición que está encapsulada.
Los islotes pancreáticos, como todos los órganos, poseen pequeñas cantidades de MSC y/o ASC que intrínsecamente, como pericitos, ejercen acciones antiinflamatorias, inmunoprotectoras complejas, de supervivencia y de apoyo a la reparación de tejidos. Los neoislotes que contienen células desdiferenciadas pueden tratarse para provocar la rediferenciación, lo que da como resultado la rediferenciación en los neoislotes que comprenden células de los islotes rediferenciadas que expresan insulina. La creación in vitro de neoislotes, compuestos por cultivos de células de los islotes expandidos y un número mucho mayor de MSC y/o ASC saludables, permite que estos neoislotes, mediados por las acciones pleiotrópicas de MSC y/o ASC, resistan agresiones inflamatorias, inmunitarias y de otro tipo cuando se administra a sujetos con control glucémico alterado, tales como diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 y otros tipos de diabetes mellitus insulinodependiente, o tolerancia alterada a la glucosa. Por lo tanto, la invención también se refiere a las composiciones como se describió anteriormente y en las reivindicaciones adjuntas 3 - 5 para su uso en un tratamiento médico de un sujeto, tal como el tratamiento de la diabetes mellitus, más en particular la diabetes mellitus tipo I o la diabetes mellitus tipo II o diabetes mellitus asociada con cáncer de páncreas o pancreatitis.
Sin pretender ceñirse a la teoría, en la presente descripción se plantea la hipótesis de que el componente MSC/ASC de los neoislotes proporciona aislamiento inmunitario, protección y mayor supervivencia del componente derivado de los islotes (las células de los islotes desdiferenciadas o las células de los islotes rediferenciadas), lo que previene de esta manera el rechazo y mejorar el injerto de los neoislotes. La amplificación de las potentes actividades inmunomoduladoras de las m Sc y/o ASC normales en neoislotes proporciona un aislamiento autoinmune y aloinmune de las células de los islotes, lo que elimina de esta manera la necesidad de medicamentos antirrechazo o de dispositivos de encapsulación. Además, el componente MSC/ASC del neoislote puede inducir, a través de la liberación del crecimiento de hepatocitos y otros factores, la reversión de la transición epitelial a mesenquimal, lo que facilita la rediferenciación de las células desdiferenciadas de los islotes en células productoras de insulina in vivo. Generalmente, es más eficiente crear neoislotes de células de los islotes desdiferenciadas con ASC o MSC que fusionar las células de los islotes con ASC o MSC para inmunoaislar la célula de los islotes. Si bien la fusión de células es efectiva, es muy ineficiente, ya que solo aproximadamente el 30 % de las células se fusionan y la mayoría de las células se pierden durante los procesos de purificación. Además, la fusión de diferentes tipos de células se ha asociado con el desarrollo de tumores malignos y, por lo tanto, las células fusionadas pueden no ser seguras para su uso terapéutico.2
Las composiciones como se describieron en la presente descripción pueden administrarse por vía intraperitoneal (ip). La capacidad del omento de los mamíferos para absorber cuerpos extraños y varios tipos de células facilita el injerto duradero y espontáneo de los neoislotes, que luego suministran insulina al sujeto fisiológicamente, es decir, en la vena porta del hígado, optimizada adicionalmente por superior detección de glucosa peritoneal a la del espacio subcutáneo (ver, D.R. Burnett, L.M. Huyett, H.C. Zisser, F.J. Doyle y B.D. Mensh, "Glucose sensing in the peritoneal space offers faster kinetics than sensing in the subcutaneous space", Diabetes 63: 2498-505 (2014). La ruta fisiológica de suministro de insulina podría reducir la resistencia a la insulina, la lipogénesis potenciada por la insulina y la exposición potencialmente dañina de los tejidos periféricos a altas concentraciones de insulina. Por estas razones, el omento es especialmente adecuado para la implantación de los neoislotes, además, si surge la necesidad, los neoislotes pueden extraerse del sujeto mediante una omentectomía (extracción quirúrgica de parte o la totalidad del omento).
Si hubiera evidencia de rechazo prematuro del neoislote, se administrará al sujeto un ciclo inicial corto con rapamicina para mejorar la supervivencia y función del neoislote. Si un receptor de esta terapia carece o tiene un omento dañado, se utilizaría un trasplante de vena intraportal o un dispositivo de encapsulación adecuado.
Por tanto, la invención se refiere a una composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el tratamiento comprende la administración parenteral, intraperitoneal o subcutánea o la administración en la vena porta del hígado.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen métodos para la generación de neoislotes. Tal método es un método de acuerdo con la reivindicación 1.
En un método como se describe en la presente descripción en la reivindicación 1, los neoislotes pueden recubrirse con hidrogel. Tal recubrimiento puede realizarse después de cualquier etapa en la que se forme un neoislote o antes de infundir o proporcionar neoislotes a un sujeto. Por tanto, la invención también se refiere a una composición que comprende un hidrogel de acuerdo con la reivindicación 4.
En un método como se describe en la presente descripción en la reivindicación 1, los neoislotes pueden estar contenidos dentro de un dispositivo de encapsulación. Tal encapsulación puede realizarse después de cualquier etapa en la que se forme un neoislote o antes de infundir o proporcionar neoislotes a un sujeto. Por tanto, la invención también se refiere a una composición encapsulada de acuerdo con la reivindicación 5.
Los neoislotes pueden ser inmunes privilegiados. Como se usa en la presente descripción, "inmune privilegiado" se refiere a los neoislotes descritos en la presente descripción que provocan una respuesta inmune menos robusta que las células o los neoislotes que no tienen el privilegio inmunológico. La respuesta inmunológica a células "inmunes privilegiadas" o neoislotes puede ser 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 % o 100 % o menos que la respuesta inmunológica a células no-inmunes privilegiadas o neoislotes.
Las células diferenciadas de los islotes expresan, por ejemplo, insulina, pero no proliferan o lo hacen mínimamente, in vitro. Las células aisladas de los islotes pueden ser inducidas a desdiferenciarse in vitro. Como se usa en la presente descripción, las células de los islotes "desdiferenciadas" o los núcleos de las células de los islotes son células o núcleos que ya no expresan ni producen insulina cuando se exponen a la glucosa. El proceso de desdiferenciación también se denomina en la presente descripción transición epitelial a mesenquimal o transición "E a M". Las células de los islotes desdiferenciadas pueden proliferar en cultivo a una tasa superior al de las células de los islotes diferenciadas. La desdiferenciación de las células de los islotes puede reducir o silenciar inmediatamente la expresión de insulina, la síntesis de insulina, el almacenamiento de insulina y/o la secreción de insulina inducida por glucosa en estas células. Las células de los islotes aisladas pueden ser de cualquier hospedero adecuado (por ejemplo, roedor, canino, humano u otro mamífero).
Puede permitirse que las células de los islotes desdiferenciados proliferen in vitro para formar una gran cantidad de células que pueden cocultivarse con otros tipos de células.
La desdiferenciación asociada a la proliferación puede conseguirse mediante el cultivo células de los islotes en condiciones que sean adherentes para las células de los islotes. Las células de los islotes pueden cultivarse en una superficie que se haya recubierto o no con laminina 511 o laminina 411. La desdiferenciación puede realizarse opcionalmente en un medio de desdiferenciación. El medio de desdiferenciación puede incluir un agonista del receptor del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1). El agonista del receptor de GLP-1 puede ser GLP-1, exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, taspoglutida y/o exendina-4. El agonista del receptor de GLP-1 puede estar presente en el medio de cultivo de desdiferenciación a una concentración de 0,1 a 100 nM, de 1 a 50 nM, o a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nM.
El cultivo de islotes y/o células de los islotes aislados en lamininas (por ejemplo, Laminina 411 y 511) y la adición de medios adecuados pueden mejorar la adhesión celular en el cultivo, apoyar la supervivencia celular y estimular moderadamente la proliferación. Para la desdiferenciación, las células de los islotes pueden colocarse en placas sobre un sustrato adecuado que permita la unión. El sustrato puede incluir Laminina 411 y/o Laminina 511. Más específicamente, las células p pueden colocarse en placas en matraces de cultivo de tejidos o pocillos recubiertos con Laminina-411 y/o Laminina-511 y colocarse en RPMI, DMEM, alfa MEM, CMRL, PIM u otro medio de cultivo adecuado y complementarse con 10 % al 20 % de suero bovino fetal u otro suero específico de especie o lisado de plaquetas, y glutamina/penicilina/estreptomicina. El medio de cultivo también puede complementarse con al menos 10 nM de Exendina-4.
Los ejemplos de sueros en los que pueden cultivarse los neoislotes incluyen sueros disponibles en worldwideweb.sigmaaldrich.com. Los ejemplos específicos incluyen: Suero fetal bovino, Suero bovino de ternera, Suero bovino adulto, Suero de pollo, Suero de cabra, Suero porcino, Suero de conejo, Suero de oveja, Suero de caballo, Suero canino, Suero de babuino, Suero de coyote, Suero de ganso, Suero de ratón, Suero de rata, Suero de mono Rhesus, Reemplazo de Suero, y Suero Humano.
Las MSC y las ASC son células madre adultas indiferenciadas que proliferan bien y no producen insulina.
Las células desdiferenciadas de los islotes proliferan bien, pero no expresan o secretan insulina, o lo hacen de forma mínima. Puede permitirse que las células de los islotes desdiferenciadas proliferen para generar cantidades suficientes para la manipulación subsecuente. Una vez que se han generado suficientes células de los islotes desdiferenciadas, las células pueden tratarse con un medio de rediferenciación específico de células de los islotes o células beta. La rediferenciación de las células de los islotes restaura la producción de insulina, lo que resulta en la re-expresión de la expresión, síntesis, almacenamiento y liberación de insulina sensible a la glucosa de la insulina fisiológica.
Se describe la rediferenciación de células de los islotes desdiferenciadas para generar una célula de islote rediferenciada. La rediferenciación, como se usa en la presente descripción, se refiere al tratamiento de células de los islotes desdiferenciadas para generar una célula de los islotes rediferenciada que ha restaurado la expresión de insulina fisiológica, la síntesis, el almacenamiento y la liberación de insulina sensible a la glucosa. La rediferenciación puede ser un proceso de dos etapas.
En una primera etapa, una célula de islote desdiferenciada puede exponerse a un medio de cultivo que contiene un bajo nivel de glucosa. El nivel bajo de glucosa puede seleccionarse entre 1, 2, 3, 4, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, y 6 mM de D-glucosa. El medio puede contener otros componentes tales como Insulina/Transferrina/Selenio (ITS), penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), suero fetal bovino (FBS), suero de perro o lisado de plaquetas humanas. La primera etapa puede incluir el cultivo de células de los islotes desdiferenciados en el medio de cultivo que contiene un nivel bajo de glucosa durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1 a 14, 2 a 13, 3 a 12, 4 a 10, o 5 a 9 días.
En una segunda etapa, la célula de islote desdiferenciada puede exponerse a un medio de cultivo que contiene un alto nivel de glucosa. El nivel alto de glucosa puede seleccionarse entre 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, y 35 mM de D-glucosa. El medio puede contener otros componentes tales como insulina/transferrina/selenio (ITS), penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), suero fetal bovino (FBS), suero de perro o lisado de plaquetas humanas, suplemento N2, suplemento B27, nicotinamida, Activina A, inhibidor II de Alk-5, triyodotironina y un agonista del receptor del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1). La nicotinamida puede estar presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,1 a 100 mM, de 1 a 50 mM, o a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 mM. La Activina A puede estar presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,1 a 100 mM, de 1 a 50 mM, o a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 mM. El agonista del receptor GPL-1 puede estar presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,1 a 100 nM, de 1 a 50 nM, o a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nM. El inhibidor II de ALK-5 puede estar presente en el medio de cultivo a una concentración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 pM. La triyodotironina puede estar presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,1 a 100 pM. El agonista del receptor de g LP-1 puede ser la Exendina-4. La segunda etapa puede incluir el cultivo de células de los islotes desdiferenciados en el medio de cultivo que contiene un nivel alto de glucosa durante 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 10 a 28, 11 a 27, 12 a 26, 13 a 25, o 14 a 29 días.
También se describe en la presente descripción un método para generar células productoras de insulina a través de una expansión sustancial en la cantidad de material de partida (células de los islotes desdiferenciadas) para el cultivo subsecuente con MSC o ASC en proliferación.
Se describen métodos para la formación de neoislotes como se describe en la presente descripción. Tales neoislotes pueden tener aproximadamente el tamaño de los islotes que se encuentran en el páncreas. Los neoislotes pueden formarse, por ejemplo, mediante cualquier método conocido en la técnica. En consecuencia, los neoislotes pueden formarse mediante el cultivo de células en superficies hidrófobas de adhesión ultrabaja.
Los ejemplos de superficies hidrófobas y/o de adherencia ultrabaja incluyen, pero no se limitan a, poliestireno no tratado, capas de hidrogel de adherencia baja y superficies sin carga.
También se describen neoislotes para su uso en el tratamiento médico de un sujeto, tal como un sujeto que necesita insulina y/o sufre de Diabetes Mellitus Tipo 1 ("T1DM") o Tipo 2 ("T2DM"), o sufre de alteración de la tolerancia a la glucosa o Prediabetes Mellitus
Los neoislotes puede administrarse por vía intraperitoneal (ip) y/o en el omento del sujeto. Los neoislotes también pueden administrarse por vía sc, iv, o de cualquier otra vía parenteral al sujeto. La administración de neoislotes a un sujeto aumenta y/o restaura la producción, secreción y sensibilidad a la glucosa de insulina. Los neoislotes pueden recubrirse con hidrogel u otro material antes de la administración para mejorar aún más la supervivencia de los neoislotes in vivo, tal como gelfoam, o un coágulo de trombina. Dado que los neoislotes contienen células de los islotes desdiferenciadas, pueden sufrir una rediferenciación en el sujeto después del tratamiento del sujeto con los neoislotes.
Cuando se trate a sujetos con neoislotes, debe administrarse una dosis suficiente de neoislotes a un sujeto que sufra de T1DM, T2DM o intolerancia a la glucosa para aumentar y/o restablecer la producción y secreción de insulina y la sensibilidad a la glucosa. Los expertos en la técnica entenderán que esta dosis varía en dependencia de la vía de administración, el grado de patología en el sujeto a tratar y la respuesta del sujeto a la terapia, ver, por ejemplo, el Ejemplo 5 más abajo que analiza las dosis de neoislotes administrados por vía ip en modelos animales. Las dosis subsecuentes de neoislotes podrían administrarse al sujeto en dependencia de su respuesta inicial a la terapia. La alta eficiencia (es decir la pérdida muy pequeña de células viables) de los métodos descritos en la presente descripción también proporciona un aumento significativo en el número de dosis que pueden obtenerse de un solo páncreas sobre el tratamiento convencional actual. Por ejemplo, en base al número promedio de islotes que pueden obtenerse de un páncreas canino, la expansión de las células de los islotes a un primer pase da como resultado, en promedio, la capacidad de generar 774 dosis de neoislotes para un canino de 10 kg. Si las células de los islotes se expanden a un segundo pase, se obtiene, en promedio, la capacidad de generar 1550 dosis terapéuticas de neoislotes para un canino de 10 kg. Si estos números se usan como base para el tratamiento humano, se estima que pueden obtenerse de 1000 a 2000 dosis de neoislotes para un ser humano de 70 kg por páncreas humano. Por el contrario, los trasplantes de islotes humanos actuales requieren aproximadamente 4 páncreas para una sola dosis humana. Además, a menudo se necesitan dosis repetidas para lograr la independencia de la insulina.
"Tratar" o "tratamiento" no requiere una cura completa. Significa que los síntomas de la enfermedad subyacente al menos se reducen y/o que una o más de las causas o mecanismos celulares, fisiológicos o bioquímicos subyacentes que causan los síntomas se reducen y/o eliminan. Pueden reducirse los requisitos de insulina. Puede reducirse el daño a los órganos diana. La necesidad de medicamentos antirrechazo puede reducirse o eliminarse. Se entiende que reducido, como se usa en este contexto, significa con relación al estado de la enfermedad, que incluye el estado molecular de la enfermedad, no solo el estado fisiológico de la enfermedad.
El tratamiento (especialmente en las primeras etapas) puede ayudarse con la administración de insulina y/o hipoglucemiantes orales (o fármacos). Tales fármacos incluyen las biguanidas (por ejemplo, metformina), sulfonilureas (por ejemplo, glimepirida, gliburida o glipizida), meglitinidas (por ejemplo, repaglinida), derivados de la difenilalanina (por ejemplo, nateglinida), tiazolidinedionas (por ejemplo, pioglitazona), inhibidores de la DPP-4 (por ejemplo, sitagliptina, saxagliptina, linagliptina), inhibidores de alfa-glucosidasa (por ejemplo, acarbosa o miglitol), secuestradores de ácidos biliares (por ejemplo, colesevelam), etc. Las dosis y la administración de tales fármacos, adyuvantes y/o tratamiento(s) intermedio(s) las determinaría fácilmente un experto en la técnica y dependería del sujeto que se esté tratando, y no es necesario repetirlas aquí.
También se describen métodos de preparación y empaque de los neoislotes conocidos en la técnica para permitir la preparación de los neoislotes a distancia del sujeto a tratar mientras se asegura la supervivencia de los neoislotes antes de la administración, lo que mejora aún más la supervivencia de los neoislotes in vivo después de la administración. Por ejemplo, varios implantes se conocen bien por los expertos en la técnica. Los dispositivos y métodos de encapsulación y microencapsulación también son bien conocidos.
El empaque puede lograrse, por ejemplo, por medios conocidos en la técnica, como tal empaque de neoislotes frescos o congelados en, por ejemplo, jeringas, bolsas estériles, bolsas de infusión, botellas, etc., para su entrega a un sujeto o profesional de la salud. Plasmalyte A pH 7,4 puede ser extremadamente útil para empacar los neoislotes. El uso de modelos animales, que incluye los modelos de roedores y caninos, es bien entendido por los expertos en la técnica para proporcionar una herramienta útil en el desarrollo de tratamientos para la diabetes humana (Aileen J.F. King, "The use of animal models in diabetes research", Br. J. Pharmacol., junio de 2012; 166(3): 877-894). De hecho, como señala King, es ideal proporcionar más de un modelo animal para representar mejor la diversidad de la diabetes humana, como se describe en la presente descripción. La descripción proporcionada permitiría a los expertos en la los expertos en la técnica fabricar y usar neoislotes para tratar la T1DM, la T2DM y la intolerancia a la glucosa en humanos sin experimentación indebida.
Como se describió en la presente descripción, el sujeto puede ser un mamífero, tales como, por ejemplo, un roedor, un canino, un felino, un equino o un ser humano. Las células en el neoislote pueden ser alogénicas, xenogénicas o una combinación de células alogénicas y xenogénicas en relación con el sujeto u otras células en el neoislote.
Como se usa en la presente descripción, "que comprende", "que incluye", "que contiene", "caracterizado por" y sus equivalentes gramaticales son términos inclusivos o abiertos que no excluyen elementos o etapas de métodos adicionales no enumerados, pero también incluyen los más restrictivos términos "que consiste de" y "que consiste esencialmente de".
Sección experimental
Procedimientos generales y reactivos.
La siguiente descripción de experimentos se proporciona únicamente con fines ilustrativos y no debe interpretarse como una descripción integral de métodos o compuestos de acuerdo con la invención.
Dado que los islotes pancreáticos, como todos los tejidos, poseen pequeñas cantidades de células madre mesenquimales, como pericitos, que ejercen efectos tróficos de modulación inmunológica, antiinflamatorios y otros efectos protectores localmente, 3-9 planteamos la hipótesis y probamos si se podrían formar los neoislotes (NI) que comprenden células de los islotes endocrinos con un número mucho mayor de MSC/ASC, y si tales neoislotes proporcionarían un(a) efectivo(a): (i) Aislamiento autoinmune sin dispositivos de encapsulación, (ii) Beneficios de supervivencia de neoislotes alogénicos in vivo, lo que reduce o elimina de esta manera la necesidad de fármacos antirrechazo, (iii) Rediferenciación in vivo de las células de los islotes y, de esta manera, (iv) Secreción adecuada y fisiológica de insulina y mantenimiento duradero de la euglucemia en roedores con T1DM.
Las acciones pleiotrópicas únicas y bien documentadas y en gran medida comparables de las células del estroma mesenquimatoso (MSC) derivadas de la médula ósea o las células madre adiposas (ASC) derivadas del tejido adiposo, si se combinan con números iguales de células de los islotes en conglomerados de células del tamaño de los islotes o "neoislotes" (NI), se aprovechan para proteger a las células p administradas de ataques aloinmunes y autoinmunes y daños inflamatorios, y para mejorar la supervivencia de las células p e inducir la angiogénesis. Fisiológicamente, se cree que solo alrededor del 2 % del número total de células en los islotes representan MSC, ubicadas como células similares a pericitos en nichos microvasculares. Sus funciones citoprotectoras dentro de los islotes probablemente sean paralelas a las de la médula ósea y otros órganos, es decir, actividades vasculoprotectoras y estabilizadoras, antiinflamatorias, tróficas e inmunomoduladoras. Tales NI de tamaño aproximado de los islotes se generaron in vitro del cultivo expandido, a través de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la desdiferenciación asociada, células de los islotes y MSC derivadas de la médula ósea de ratones C57Bl/6. 5x103 NI, cada uno compuesto por ~ 500 células de los islotes y ~ 500 MSC, se administraron por vía intraperitoneal (ip) a ratones NOD inmunocompetentes espontáneamente diabéticos que desarrollan una forma autoinmune de T1DM que se asemeja en gran medida a la T1DM humana. Se eligió este protocolo de tratamiento alogénico porque modela la situación clínica más común en los receptores de trasplantes de páncreas o de islotes. Al no usar medicamentos antirrechazo ni dispositivos de encapsulación, probamos rigurosamente que un alto número de MSC en NI permite que las células de los islotes sobrevivan, se vuelvan a diferenciar en células endocrinas que funcionan normalmente y, de esta manera, establezcan un control glucémico duradero en ratones NOD con T1DM autoinmune. Mientras que los ratones NOD diabéticos tratados con NI prosperaron normalmente, los ratones NOD diabéticos tratados con vehículo permanecieron hiperglucémicos y comenzaron a morir. Estos datos iniciales implicaban que los NI sobreviven, se injertan y vuelven a diferenciarse en células endocrinas funcionales in vivo, y que se logre tanto la protección aloinmune como la autoinmune. Es importante destacar que, después de la administración ip, los NI fueron absorbidos por el omento donde se injertaron a largo plazo y se rediferenciaron en células fisiológicamente productoras de insulina. Los ratones NOD no montaron una respuesta aloinmune humoral a las MSC y las células de los islotes que se usan para formar NI. Los animales diabéticos tratados con NI mostraron un aumento significativo en el número de células T reguladoras (Treg) en sus omentos y bazos en comparación con los animales que fueron tratados con islotes. Cuando se inyectaron los NI en animales no diabéticos, también se injertaron y sobrevivieron en el omento sin causar hipoglucemia, lo que demuestra aún más la secreción regulada de insulina. La secreción de insulina del omento se produce en el sistema portal del hígado, al igual que la del páncreas, que es fisiológica y provoca la inactivación de ~ 50 % de la insulina liberada. Esto limita la exposición poshepática del músculo, el tejido adiposo, la vasculatura y otros órganos a niveles de insulina suprafisiológicos, potencialmente inductores de hipoglucemia y dañinos de cualquier otra manera que se generan cuando la insulina se administra por vía subcutánea. Cuando los ratones diabéticos con estreptozotocina (STZ) se trataron con grupos de células de tamaño similar compuestos solo por MSC o células de los islotes, los niveles de glucosa en sangre, en comparación con los animales euglucémicos tratados con NI, solo se redujeron mínimamente en comparación con los controles tratados con vehículo. Esto demostró claramente que la eficacia terapéutica de los NI depende de manera crítica de la colaboración de los MCS y las células de los islotes. Finalmente, cuando los ratones NOD/SCID diabéticos con STZ se trataron por vía ip mediante un protocolo idéntico con NI caninos (cNI), la euglucemia se indujo fácil y duraderamente y las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IP GTT) se normalizaron. Es importante destacar que la insulina que se liberó durante el IP GTT era específica para perros y, cuando se extirparon quirúrgicamente los cNI, se volvió a desarrollar la hiperglucemia. Tomados en conjunto, los datos presentes demuestran que las complejas acciones pleiotrópicas de las MSC o ASC (M/ASC), como se planteó, pueden aprovecharse fácilmente para proteger las células de los islotes cultivadas y, cuando se combinan con ellas en NI y se administran por vía ip, facilitan el control de la glucemia a largo plazo en ratones con T1DM autoinmune. Concluimos, por lo tanto, que estas observaciones tienen una relevancia traslacional significativa para el tratamiento de la T1DM.
Reactivos: Los reactivos usados y sus fuentes se enumeran en la siguiente tabla.
Reactivo_____________________________ Fuente__________________________________ Tampón de citrato 20 mM pH 4,5 Sigma, St. Louis, MO
Dihidrocloruro de 4',6-diamidino-2-fenilindol Life Technologies, Carlsbad, CA
Accumax Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, CA Tampón ACK Life Technologies, Carlsbad, CA Anticuerpo monoclonal de IgG de conejo anti- Abcam, Cambridge, MA
Ki67 (ab16667)
Albúmina sérica bovina (BSA) Sigma, St. Louis, MO
IFN-gamma canino (781-CG-050) R&D Systems, Minneapolis, MN
Kit de ELISA de insulina canina Mercodia, Uppsala, Suecia
Suero canino Golden West Biologicals, Temecula, CA Kit de imágenes Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Invitrogen, Carlsbad, CA
Cell Tracker Green Life Technologies, Carlsbad, CA Colagenasa 1 Worthington, Lakewood, NJ
Colagenasa P Roche, Indianápolis, IN
IgG anti-conejo de cabra conjugada Cy3 Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA (111116003)
IgG anti-conejo de cabra conjugada Cy3 ab Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA Sustrato DAB de tinción (SK-4100) Vector Laboratories, Burlingame, CA
DiI Life Technologies, Carlsbad, CA
DiR Life Technologies, Carlsbad, CA
ditizona Sigma, St. Louis, MO
DMEM-F12 Sigma, St. Louis, MO
DMSO Sigma, St. Louis, MO
anticuerpo conjugado cy5 anti-conejillo de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA indias de burro
Solución de eosina Y Sigma, St. Louis, MO
Suero fetal bovino (FBS) Hyclone, Logan, UT
Diacetato de fluoresceína Sigma, St. Louis, MO
Formalina Sigma, St. Louis, MO
Gelfoam Pfizer, Kalamazoo, MI
Gentamicina Penicilina Estreptomicina (GPS) Sigma, St. Louis, MO
anticuerpo anti-insulina de conejillo de indias Dako, Carpinteria, CA
Solución salina tamponada de Hanks Gibco, Carlsbad, CA
Contratinción de hematoxilina (H-3404) Vector Laboratories, Burlingame, CA HEPES Gibco, Carlsbad, CA
Histopaque 1077 Sigma, St. Louis, MO
Histopaque 1119 Sigma, St. Louis, MO
Isoflurano Baxter, Deerfield, IL
Laminina 511 BioLamina, Uppsala, Suecia
L-Glutamina-Penicilina-Estreptomicina (GPS) Sigma, St. Louis, MO
Linbits LinShin Canadá, Toronto, Ontario, Canadá Cóctel de anticuerpos contra el subconjunto BD Pharmingen, San Jose, CA
de linfocitos T de ratón (#558391)
NaHCOa Sigma, St. Louis, MO
Glucómetro OneTouch Ultra2 Johnson and Johnson, New Brunswick, NJ PBS Roche, Indianápolis, IN
Yoduro de propidio Life Technologies, Carlsbad, CA
Mini kit Qiagen RNeasy Qiagen, Germantown, MD
anticuerpo anti-Foxp3 de conejo (ab54501) Abcam, Cambridge, MA
RPMI 1640 Life Technologies, Carlsbad, CA
Kits de diferenciación osteo-, condro- y Gibco, Carlsbad, CA
adiogénica Stempro
Estreptozocina Sigma, St. Louis, MO
Transcriptasa inversa SuperScript II Invitrogen, Carlsbad, CA
Cebadores de la PCR TaqMan Applied Biosystems, Foster City, CA Mezcla maestra universal TaqMan II con Applied Biosystems, Foster City, CA
UNG
Kit de detección de Treg (#130-094-165) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania Tritón X 100 Fisher Scientific, Waltham, MA
EDTA de tripsina Sigma, St. Louis, MO
Aislamiento de islotes
De roedores: Los ratones se sacrificaron con isoflurano (3-5 %) en una cámara sellada y se colocaron inmediatamente en una tabla quirúrgica para una incisión estéril en la línea media. Se expuso el páncreas, se localizó el conducto pancreático. Se pinzó el conducto biliar común y se infló el páncreas con 5 ml/ratón o 15 ml/rata con 1 mg/ml de colagenasa P en tampón de disociación (solución salina tamponada de Hanks (HBSS), Ca++, magnesio++ HEPES 25 mM NaHCOs) a través del conducto biliar común. El páncreas inflado se retiró a un tubo cónico estéril que contenía solución de digestión (1 mg/ml de colagenasa P en tampón de disociación). El tubo se colocó en un baño de agua con agitación a 37 °C (120 rpm) y el contenido se digirió durante 15 minutos. La digestión se detuvo con un volumen igual de tampón de disociación frío. El tejido digerido se filtró a través de un tamiz de 400 pm en un tubo nuevo y se centrifugó a 1200 rpm durante 2 minutos a 4 °C con el freno desactivado. El sedimento se lavó con 20 ml de tampón de disociación y se centrifugó de nuevo (1200 rpm durante 2 minutos a 4 °C con el freno desactivado). Para purificar aún más los islotes, el sedimento se resuspendió en 10 ml de solución Histopaque 1077 y se cubrió con 10 ml de DMEMF12 libre de suero para establecer un gradiente. El gradiente se centrifugó a 2000 rpm durante 20 minutos a 4 °C con el freno desactivado y los islotes se recogieron en la interfase entre el medio e Histopaque en un tubo cónico de 50 ml que contenía 20 ml de tampón de disociación. A continuación, los islotes se centrifugaron a 1200 rpm durante 2 minutos, se lavaron con 20 ml de tampón de disociación, se centrifugaron de nuevo, se resuspendieron en medio de cultivo de islotes y se colocaron en una placa de Petri estéril. Se permitió que los islotes se recuperaran en una incubador humidificada a 37 °C, CO2 al 5 %, a pH 7,4 durante la noche.
De perros: Se obtuvieron páncreas frescos de perros sacrificados a través de un acuerdo de intercambio de NIH y se inflaron a través del conducto biliar común, mediante el uso de una solución de colagenasa P de 1 mg/ml. Los islotes caninos se aislaron de páncreas inflados siguiendo versiones modificadas de las técnicas descritas por Vrabelova y otros y Woolcott y otros.10,11 En resumen, el páncreas de perro distendido se cortó en 15 a 20 piezas y se colocó en un tubo de 50 ml que contenía 20 ml de una solución de colagenasa P de 1 mg/ml. El tubo se colocó en un baño de agua a 37 °C con el agitador ajustado a 120 rpm. El contenido de islotes en la solución se controló mediante examen microscópico de muestras teñidas con ditizona obtenidas de pequeñas muestras tomadas a intervalos de 5 minutos. Se continuó la digestión hasta que aproximadamente el 50 % de los islotes quedaron libres de tejido acinar y se detuvo con 20 ml de HBSS suplementado con HEPES 10 mM BSA al 1 %. A continuación, el tejido se tamizó suavemente a través de un tamiz de 400 pm y se centrifugó durante 10 segundos a 100 x g a 4 °C. Los sedimentos se lavaron una vez y se centrifugaron durante 10 segundos a 200 x g (4 °C). Se crearon gradientes de densidad de tres capas al resuspender los gránulos en 10 ml de Histopaque 1119, al superponer lentamente 10 ml de Histopaque 1077 seguidos de otra capa de 10 ml de medio sin suero. El gradiente se centrifugó a 750 x g durante 20 minutos a 4 °C con el freno desactivado. Los islotes se recogieron de la interfaz superior y se transfirieron a un tubo de 50 ml que contenía HBSS suplementado con HEPES 10 mM BSA al 1 %. Las suspensiones de islotes purificadas se lavaron con medio sin suero y se centrifugaron durante 10 segundos a 200 x g (4 °C) dos veces y se pasaron a través de un filtro de células de 40 pm. Se recogieron y usaron cinco alícuotas de 50 pl de cada preparación para evaluar el rendimiento de los islotes. Finalmente, los islotes seleccionados a mano (para eliminar el contenido de células acinares) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 20 % a 37 °C, en una incubadora con CO2 al 5 %.
De humanos: Los islotes humanos se adquirieron de Prodo Laboratories (Irvine, CA).
Cultivo y desdiferenciación de células de los islotes
Células de los islotes de roedores: Los islotes de ratón recuperados se seleccionaron a mano y se purificaron ademan al capturar los islotes en la parte superior de un filtro de 40 pm. Los islotes se cultivaron de la siguiente manera: las células de los islotes se cultivaron al colocar islotes completos en pocillos recubiertos con Laminina 511 y permitiendo que las células de los islotes crecieran más allá de los islotes hasta que el 90 % confluyera en RPMI 1640 FBS al 20 % GPS, lo que da como resultado su desdiferenciación vía e Mt reversible. El cultivo de esta manera purifica aún más las células de los islotes y elimina las células exocrinas restantes. Pase: Se permitió que las células de los islotes de ratón crecieran hasta aproximadamente un 90 % de confluencia. Luego se tripsinizaron (tripsina-EDTA 1x durante 5-10 minutos), se sedimentaron mediante centrifugación a 600x g durante 5 minutos, se lavaron con DMEMF12 FBS al 20 % GPS y se sembraron en matraces T75. Las células de los islotes pasadas se cultivaron en DMEM-F12 FBS al 20 % GPS. El cultivo de esta manera purifica aún más las células de los islotes y elimina las células acinares y ductales.
Células de los islotes caninos: Cultivo inicial: Los islotes de perro recuperados se seleccionaron a mano y se purificaron adicionalmente al capturar los islotes en la parte superior de un filtro de 40 pm. Las células se cultivaron como islotes completos como se describió anteriormente para ratones. Pase: ver lo anterior para las células de los islotes de roedores.
Células de los islotes humanos: Las células se cultivaron como islotes completos y se pasaron como se describió anteriormente para roedores.
Aislamiento y cultivo de las ASC y MSC
ASC (ratón y canino): En condiciones estériles, se recolectaron aproximadamente 3-15 g de muestras de grasa abdominal de ratones no diabéticos o perros no diabéticos sacrificados (acuerdo de intercambio de tejidos NIH) y se colocaron en hielo en tubos cónicos de 50 ml estériles separados que contenían aproximadamente 30 ml de PBS 1x. Las muestras de grasa se trituraron, se colocaron en tubos de PBS que contenían 3 mg/ml de colagenasa 1 y se digirieron durante aproximadamente 1 hora en un baño de agua con agitación a 37 °C. Los tubos se centrifugaron (600 x g, 10 minutos) para sedimentar el contenido celular. El sobrenadante se eliminó con cuidado y el sedimento se lavó dos veces con PBS estéril y luego se resuspendió en 10 ml de DMEM F12 GPS FBS al 10 % para cultivo. Las células se cultivaron en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada a 37 °C a pH 7,4. El medio de cultivo siempre se cambió dos veces por semana. Cuando los cultivos primarios alcanzaron una confluencia del 70-80 %, las células unidas se sometieron a pases mediante exposición a tripsina/EDTA 1 x durante 3-5 minutos, y luego se pasaron o crioconservaron en DMSO al 10 %.
Las ASC humanas no diabéticas se compraron en P1 de Lonza (Walkersville, MD) y se cultivaron como se describió anteriormente.
MSC (de roedores): Las suspensiones de células obtenidas de fémures lavados de ratones sacrificados se sembraron en matraces T25 que contenían DMEM-F12 FBS al 10 % GPS. Las células se cultivaron en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada a 37 °C. El medio de cultivo siempre se cambió dos veces por semana. Cuando los cultivos primarios alcanzaron una confluencia del 70-80 %, las células se separaron con tripsina/EDTA 1x durante 3-5 minutos y se pasaron o congelaron en DMSO al 10 %.
Antes de la formación de neoislotes, las MSC o ASC cultivadas se caracterizan (i) por FACS por su expresión de CD44 y CD90, y expresión negativa de antígenos CD45, CD34 y DLA-DR, y (ii) por su capacidad para experimentar la diferenciación trilinaje (adipogénico, osteogénico, condrogénico) como se describió previamente.15 Antes de la formación de neoislotes, las células de islote canino desdiferenciadas y cultivadas se examinan mediante (a) FACS y se confirma que son negativas para la expresión de DLA-DR, CD90 y CD133; y (b) rtPCR para la expresión génica residual de células de los islotes de insulina, glucagón, somatostatina, pdx-1 y nkx6.1. La viabilidad celular se evaluó mediante el uso de diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI) de la siguiente manera: Se mezcló una solución de tinción 1x (1 pl de 5 mg/ml de FDA y 5 pl de 1 mg/ml de PI disueltos en 100 pl de PBS) con células en 100 pl de PBS, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 segundos y se tomaron imágenes de las células mediante el uso de un microscopio de fluorescencia. Se contaron cuatro campos para números de celda rojos, verdes y totales.
Inducción de indolamina 2, 3 dioxigenasa (IDO-1).
Las ASC caninas se probaron en P2 para la inducción de IDO-1 en respuesta al interferón gamma (IFNy) canino de la siguiente manera. Se sembraron ocho placas de cultivo de 35 mm con 0,5x106 ASC derivadas de caninos, cada una en DMEM F12 suero canino al 10 %. Se añadieron 10 ng/ml de INFy canino a cuatro placas. Después del cultivo durante la noche en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada a 37 °C, se recogieron células de todas las placas y se analizó la expresión del gen IDO-1 mediante una rtPCR. Los resultados de los cultivos tratados con IFNy se normalizaron con los de las células no expuestas del mismo número de pases y se expresaron como Log10RQ. Ejemplo 1: Método para la formación de neoislotes de acuerdo con la invención y la caracterización in vitro de los conglomerados celulares
Fundamento lógico: (A) Para probar si se podrían formar neoislotes que comprenden (i) células de islote expandidas en cultivo desdiferenciadas combinadas con (ii) cantidades mucho más altas de MSC/ASC que las que se forman de forma natural en los islotes. (B) Determinar si tales neoislotes expresan o pueden ser inducidos a expresar genes asociados a células de los islotes y en qué medida.
Métodos
Crecimiento de las células de los islotes: Las células de los islotes (1) se disociaron con tripsina y las células se sembraron en pocillos o matraces de cultivo tisular (TC) precubiertos con Laminina 511 y/o Laminina 411 (20 pg/ml), o (2) se sembraron islotes completos en pocillos TC recubiertos con Laminina 511 y/o Laminina 411. Ver la Figura 1. En ambos casos, las células se cultivaron y se permitieron que se propagaran en RPMI u otro medio de crecimiento adecuado suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 20 % glutamina/penicilina/estreptomicina (GPS) Exendina 4 (Glp-1 a 10 nM para cultivo de células de roedores) hasta la subconfluencia (todos los suplementos están disponibles comercialmente). Este proceso dura aproximadamente de una a dos semanas. Las células de los islotes se desdiferenciaron dentro de unos días, a juzgar por la inmunohistoquímica (IHC) para la presencia de insulina, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina (ELISA), los ensayos de liberación de insulina estimulada por glucosa (GSIS), los perfiles de expresión génica (rtPCR) y las líneas celulares transgénicas murinas para la Proteína Verde Fluorescente (gfp) bajo el control del promotor del gen de la insulina 1.1 Ver Las Figuras 2 y 8A-8C.
Formación de neoislote: Las ASC (P1 a P4) o MSC (P1 a P5) y las células de los islotes (P1 a P2) se cocultivaron en una relación de 1:1 en placas de cultivo de superficie de unión ultrabaja (Corning, Kennebunk, ME) y se les permitió formar NI durante la noche. Se formaron grupos de células de los islotes y ASC de control mediante el mismo método. Antes de su administración in vivo, las muestras de NI se analizaron mediante la rtPCR para la expresión de genes asociados a islotes y MSC (ver más abajo).
Tinción para microscopía confocal: Las ASC o MSC se tiñeron con Cell Tracker Green (verde) y las células de los islotes pasadas se tiñeron con Lipophilic Tracer DiI (rojo) según las instrucciones del fabricante. Después de la tinción celular, se formaron NI, se recolectaron, se fijaron en formalina al 10 % y se tiñeron con diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) antes de la microscopía confocal.
El marcaje de neoislotes con Lipophilic Tracer DiR se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante.
Rediferenciación de neoislotes: Se logró la rediferenciación in vitro de neoislotes mediante el uso de aditivos disponibles comercialmente, en un proceso de dos etapas. Etapa 1: Se cultivaron neoislotes de origen humano, canino o de roedores durante 6-8 días en DMEM libre de suero que contenía D-glucosa 5,6 mM y se complementó con: (a) Fracción V de BSA al 1 %, (b) ITS-G, (c) GPS. Etapa 2: Después de 6-8 días, este medio se reemplazó con medio de rediferenciación (RDM) y se cultivó durante 2 semanas. RDM es DMEM que contiene glucosa 25 mM y se complementa con: (a) Suplemento A de N2 (disponible comercialmente), (b) Suplemento SM-1 (disponible comercialmente), (c) Nicotinamida 10 mM (disponible comercialmente), (d) Exendina 4 10 nM (disponible comercialmente), (e) Activina A 2 nM (disponible comercialmente). Rediferenciación probada y confirmada por la rtPCR para la expresión de genes asociados a islotes y MSC como se describe más abajo.
Evaluación de la relación celular de neoislote: Para cada especie (ratón, perro, humano), se recogieron cultivos adherentes de ASC y perros, IC de ratón como se describió anteriormente. Los ASC se tiñeron de verde con Cell Tracker Green para poder distinguirlos de los circuitos integrados. La eficiencia de la tinción se evaluó mediante FACS y se determinó que era > 95 %. Las IC se dejaron sin teñir. Los NI se formaron durante la noche en placas de adhesión ultrabaja de seis pocillos como se describió anteriormente mediante el uso de 0,5x106 ASC y 0,5x106 IC por pocillo en 2 ml de DMEM/F12 FBS al 10 %. Al día siguiente, los NI se recogieron y se disociaron en preparaciones de células individuales mediante una incubación de 30 minutos con 1 ml de Accumax por pocillo. A continuación, las preparaciones de células individuales se resuspendieron en PBS 1x BSA al 1 % y se analizaron mediante FACS (BD FACScan Analyzer, San Jose, California) para determinar el por ciento de células verdes (ASC) frente a las no teñidas (IC).
rtPCR: El ARN se extrajo de 1x106 muestras de células mediante el uso de un mini kit Qiagen RNeasy, que incluye una etapa de digestión con ADNasa para excluir el ADN contaminante, y según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó mediante el uso de la transcriptasa inversa SuperScript II durante 60 minutos a 42 °C. La PCR en tiempo real se llevó a cabo por duplicado mediante el uso de cebadores TaqMan específicos de especie (Applied Biosystems, ABS, Foster City, California) y según las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 20 pl con mezcla maestra universal TaqMan II con UNG. Las condiciones de reacción fueron 50 °C durante 2 minutos, seguido de 95 °C durante 10 minutos de inicio, y 40 ciclos de fusión a 95 °C durante 15 segundos y recocido a 60 °C durante 1 minuto. Todas las muestras se analizaron por duplicado y se usó el valor del ciclo de umbral promedio (Ct) para los cálculos. El sistema PCR en tiempo real ABS 7500 se usó para monitorear la PCR en tiempo real. La cuantificación relativa (RQ, normalización) de cada gen diana se calculó con el método Ct mediante el uso del software ABS proporcionado con el instrumento, y mediante la normalización a dos genes de mantenimiento interno, beta actina y beta 2 microglobulina (B2m). La RQ se calculó a través de la normalización a controles externos como se indica y mediante el uso del software provisto con la máquina. Los resultados se presentan como log10 (RQ) ± log10 (RQmín y RQmáx). Se consideraron significativas las diferencias superiores a log10 (RQ) 2 o inferiores a log10 (RQ) -2. Los cebadores de la PCR utilizados se enumeran en la siguiente tabla.
Genes diana (RATÓN) # de catálogo de ABS
Actb Mm04394036 g1
B2m Mm00437762 m1
Ins1 Mm01259683 g1
Ins2 Mm00731595_gH
Gcg Mm01269055 m1
Sst Mm00436671_m1
Ppy Mm01250509 g1
Pdx1 Mm00435565_m1
Mafa Mm00845206 s1
Slc2a1 Mm00441480 m1
Slc2a2 Mm00446229 m1
Ucn3 Mm00453206 s1
Abcc8 Mm00803450 m1
Nkx6-1 Mm00454961 m1
Glplr Mm00445292 m1
Kenj11 Mm00440050 s1
Vegfa Mm01281449 m1
Cxcl12 Mm00445553 m1
Tgfb1 Mm01178820 m1
Igf1 Mm00439560 m1
Genes diana (PERRO) # de catálogo de ABS
ACTB Cf03023880 g1
B2M Cf02659077 m1
INS Cf02647520 m1
GCG Cf02624195 m1
SST Cf02625293 m1
PDXI Cf02622671 m1
NKX6-1 Cf02705682 mH
ABCC8 Cf02690717 m1
GLP1R Cf02696492 m1
VEGFA Cf02623449 m1
CXCL12 Cf02625258 m1
TGFB1 Cf02623325 m1
IGF1 Cf02627846 m1
IDO-I Cf02640742 m1
Genes diana (HUMANOS) # de catálogo de ABS
ACTB Hs01060665_g1
B2M Hs00984230 m1
INS Hs02741908_m1
GCG Hs01031536_m1
SST Hs00356144_m1
PPY Hs00358111_g1
PDX1 Hs00236830_m1
MAFA Hs01651425_s1
NKX6-1 Hs00232355_m1
UCN3 Hs00846499_s1
ABCC8 Hs01093761_m1
VEGFA Hs00900055_m1
CXCL12 Hs03676656_mH
TGFB1 Hs00998133_m1
IGF1 Hs01547656 m1
Resultados
Crecimiento y caracterización de las IC y M/ASC: Los materiales de partida de los NI, es decir, IC y M/ASC cultivadas, se obtuvieron como sigue. Se ensayó la viabilidad de islotes recién aislados de ratones, perros y humanos no diabéticos, se pusieron en cultivo y se cultivaron y se sometieron a pases como se describió en los ejemplos anteriores. Las IC crecen fuera de los islotes, proliferan y se desdiferencian a medida que se someten a EMT, un proceso reversible. Las IC cultivadas retienen perfiles de expresión génica asociados a IC residuales que disminuyen con el pase y exhiben un patrón de expresión génica distinto de los de M/ASC (Figura 3). Todas las IC se usaron en P1-P2 para la formación y experimentación de NI. Se obtuvieron MSC y ASC de ratones, perros y humanos no diabéticos y se cultivaron y caracterizaron como se describe en el Ejemplo 3. Todas las MSC y ASC cumplieron con los criterios mínimos de adherencia plástica, capacidad para experimentar diferenciación trilinaje, expresión de epítopos característicos de la superficie celular y, lo que es más importante, ausencia de expresión de antígenos de trasplante IA[b] (ratón) / DLA-DR (perro) / HLA-DR (humanos). La exposición de ASC caninas a IFNy indujo significativamente la expresión génica de indolamina 2, 3 dioxigenasa (IDO-1) (Figuras 4A - 4D), un inhibidor importante de la respuesta de células T en estados inflamatorios tales como insulitis. Todas las M/ASC se usaron en P1-P5 para la formación y experimentación de NI. Tanto las IC como las M/ASC fueron cariotipadas (Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, College Station, TX) y se encontró que eran normales. Formación y representación de neoislotes: La Figura 1 muestra un esquema de la formación de neoislote y un uso propuesto. Como se muestra en la figura, se usaron células de islote desdiferenciadas y ASC o MSC para formar neoislotes que pueden inducirse para producir proteínas específicas de células de islote para tratar la T1DM o T2DM; células de los islotes desdiferenciadas y ASC o MSC. Las células de los islotes se desarrollaron primero a partir del islote (ratón, canino o humano), y se les permitió desdiferenciarse y proliferar durante uno o más pases. Una vez desdiferenciadas, tales células expresan y producen genes o proteínas significativamente reducidos o no específicos de células de los islotes, respectivamente. Las ASC o MSC se cultivaron mediante métodos estándar hasta 4 pases. Una vez que se dispone de un número suficiente de cada tipo de célula, los dos tipos de células pueden cocultivarse en matraces de baja adherencia para formar neoislotes del tamaño de un islote.
La Figura 2 ilustra el crecimiento y la transición epitelial a mesenquimal que resultó del cultivo de células de los islotes de la manera descrita en la presente descripción. Para ayudar a ilustrar este fenómeno, se usó el ratón transgénico, C57B1/6, ins1gfp+, en donde la proteína fluorescente verde (gfp) está bajo el control del promotor del gen Insulina 1 (insl).1 Como solo las células beta de los islotes expresan el gen de la insulina 1, las células beta que expresan el gen de la insulina aisladas de esta cepa aparecen en verde y, por lo tanto, son fácilmente identificables. El panel A muestra islotes completos aislados del ratón ins1-gfp+. Estos islotes se cultivaron en placas recubiertas con Laminina 511 como se describió anteriormente. El panel B de la Figura 2 es de islotes completos Ins1gfp+ después de 6 días de cultivo. Si bien todavía había una expresión significativa del gen de la insulina donde se unían los islotes (células verdes), las células se separan de los islotes y proliferan, y en estas células, la expresión del gen de la insulina está regulada negativamente (las células ya no son verdes). Esto se ilustra más completamente en el Panel C de la Figura 2, que representa células de los islotes Ins1gfp+ que se tripsinizaron para disociar los islotes antes del cultivo, luego se fijaron y se tiñeron para la proteína insulina (rojo). Donde las células son verdes o amarillas, el gen ins1 todavía se transcribe y traduce activamente. Donde las células aparecen solo en rojo, la proteína de insulina está presente, pero la falta de color verde (o amarillo) indica que el gen está regulado negativamente. Finalmente, el Panel D de la Figura 2 muestra células de los islotes Ins1gfp+ que se cultivaron en presencia de EdU para seguir la división celular. Estas células se fijaron y tiñeron con Hoechst (núcleos, azul) y para EdU (rojo). Las células en las que se produce la traducción del gen ins1 aparecen en verde. Los núcleos de las células que se dividen aparecen rojos. Como puede verse en la imagen, las células que no se dividen son de color verde brillante y tienen una morfología epitelial redonda, mientras que las células que se dividen (núcleos rojos) adquieren una apariencia mesenquimal alargada y son solo ligeramente verdes, lo que indica la regulación negativa de la expresión del gen de la insulina.
Se prepararon los NI de un tamaño de islote aproximado de 150 pm mediante el cocultivo durante la noche de MSC derivadas de médula ósea o sus ASC análogas derivadas de tejido adiposo (M/ASC) con cultivo de células de islote murino expandido (IC) en una relación de 1:1 (encontrado para ser óptimo) en un sistema de adhesión celular ultrabajo. Un ejemplo de este proceso mediante el uso de células de ratón se muestra en la Figura 5. Para evaluar más a fondo la posible relevancia traslacional de tales NI murinos, confirmamos que se podrían generar fácilmente NI comparables a partir de las IC y M/ASC caninas y humanas. Se cultivaron MSC de ratón C57Bl/6 positivas para proteína fluorescente verde (gfp+) y células de islote de ratón C57Bl/6. A continuación, los dos tipos de células se cultivaron en placas de baja adherencia y formaron neoislotes. Las imágenes confocales (aumento de 63 x) de neoislotes murinos, caninos y humanos únicos de ASC (verde) y células de islote (rojo) se muestran respectivamente en las imágenes izquierda, media y derecha de la Figura 6. Como puede verse, para los neoislotes de origen murino, canino o humano, las células madre y endocrinas se distribuyen por igual en todo el neoislote. El por ciento de cada tipo de célula en los NI se evaluó adicionalmente de la siguiente manera. Las ASC caninas se tiñeron con Cell Tracker Green y se cocultivaron con células de los islotes sin teñir en una relación de 1:1 como se indicó anteriormente. Después de que se formaron las NI, se disociaron con Accumax en células individuales y se analizaron mediante FACS como se describe en Métodos en línea, que revelaron que 24 horas después de la formación, las NI se componen de aproximadamente un 50 % de M/ASC y un 50 % de IC (Figura 7A), lo que indica además que ambos tipos de células permanecen en una relación de 1:1 dentro de la formación posterior de NI. Perfiles de expresión génica y secreción de insulina estimulada por glucosa de neoislotes murinos, caninos y humanos: Si bien estos neoislotes no expresan niveles significativos de insulina, a medida que las células de los islotes cultivadas experimentan una transición epitelial a mesenquimal cuando se cultivan, pueden volver a diferenciarse in vitro mediante el uso del protocolo de rediferenciación descrito anteriormente, de manera que reexpresen los genes de las células de los islotes. Cuando los dos tipos de células, IC y M/ASC, se combinaron para formar los NI como se muestra en la Figura 5, el patrón de expresión del gen NI exhibió características de ambos tipos de células. La Figura 8A muestra los perfiles de expresión génica de los islotes de neoislotes de ratón (arriba) y perro (abajo) 14 días después de la exposición al medio de rediferenciación (lados izquierdos) en comparación con los islotes de ratón o perro recién aislados (lados derechos). Ambos conjuntos de perfiles de expresión génica se normalizaron a los de neoislotes de ratón (arriba) o de perro (abajo) recién formados y desdiferenciados. Estos resultados indican que los neoislotes de perro y ratón recién formados expresan niveles bajos de todos los genes asociados a los islotes probados y tienen la capacidad de experimentar una rediferenciación para expresar niveles más altos de estos genes. Los NI recién formados pudieron secretar insulina en respuesta a la glucosa in vitro, aunque aproximadamente 100 veces menos que los islotes intactos. La Figura 8B muestra los perfiles de expresión génica de neoislotes murinos (arriba), caninos (centro) y humanos (abajo) recién formados hechos a partir de MSC o ASC y células de los islotes P1 (izquierda) o P2 (derecha) en comparación con islotes recién aislados de esas especies (normalización). Como puede verse en este panel, los neoislotes humanos, de perro y de ratón recién formados expresan niveles bajos de genes asociados a los islotes, así como también genes asociados con ASC/MSC (vegf-a, cxcl12, tgfp1 e ifgl), y para cada una de estas especies, la expresión de los genes de las células de los islotes disminuye con un mayor número de pases de células de los islotes. Como se muestra en las Figuras 8C, en respuesta a la exposición a glucosa 25 mM, la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) por 50 neoislotes de ratón C57Bl/6 recién formados (células de islote P1 y MSC P5, barras rayadas) es aproximadamente el 1 % de 50 islotes de ratón C57Bl/6 recién aislados (barras abiertas). Esto es paralelo a la disminución de la expresión del gen de la insulina observada en la Figura 8B.
Conclusión: Tomados en conjunto, estos resultados indican (i) que pueden formarse fácilmente neoislotes de células de islote cultivadas y MSC o ASC in vitro; (ii) que en todas las especies (ratón, perro, humano), tales neoislotes son similares en apariencia y perfiles de expresión génica, que expresan bajos niveles de genes asociados a los islotes; (iii) que a través de las especies (ratón, perro, humano) tales neoislotes son capaces de ser rediferenciados in vitro para volver a expresar genes asociados con el sistema endocrino pancreático. Además, estos resultados sugieren que estos neoislotes pueden ser de uso terapéutico en el tratamiento de humanos o animales diabéticos insulinodependientes y no insulinodependientes.
Ejemplo 2: Tratamiento médico;
Estudios de búsqueda de dosis y prueba de principio in vivo en ratones NOD diabéticos espontáneos y ratones NOD/SCID diabéticos STZ tratados IP con neoislotes de roedores
Modelos animales
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los NIH, y fueron supervisados y aprobados por un veterinario institucional y miembro de la IACUC. Los ratones y las ratas se compraron en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) o Harlan (Haslett, MI) y se alojaron a temperatura y humedad constantes, con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas en jaulas regulares tipo caja de zapatos. A menos que se indique de otra forma, todos los ratones y ratas tuvieron acceso ilimitado a una dieta estándar y agua del grifo. Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo mediante el uso de ratones hembra C57Bl/6, NOD hembra o NOD/SCID hembra que pesaban entre 15 y 35 g. Todos los experimentos con ratas se realizaron en ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre 538 y 650 g.
Protocolo de captación omental de partículas de polidextrano
Cuatro ratas Sprague-Dawley de 2 años de edad que pesaban entre 538-650 g fueron anestesiadas y tratadas vía ip con 5 ml de partículas de polidextrano (PDP; Sephadex G-25 estéril, tamaño de partícula 87-510 pm) suspendidas 1:1 en solución salina normal. El día 7 después de la administración, se sacrificaron los animales y se recogieron sus omentos y otros órganos y se examinaron para detectar la presencia de PDP.
Modelos de diabetes
Estreptozotocina (STZ): Los ratones con diabetes no obesa/inmunodeficiencia combinada grave (NOD/SCID) y C57Bl/6 se convirtieron en diabéticos con 3-5 dosis vía ip (1 dosis por día) de 50 -75 mg/kg de peso corporal de STZ, recién disuelta en tampón de citrato 20 mM, pH 4,5. Se consideró que los ratones eran diabéticos cuando sus niveles de glucosa en sangre sin ayunar eran >300 mg/dl en 3 días separados.
Espontáneo: Los ratones NOD hembra desarrollan T1DM espontáneamente entre las 12-20 semanas de edad. Se consideró que los ratones eran diabéticos cuando sus niveles de glucosa en sangre sin ayunar eran >300 mg/dl en 3 días separados. Tratamiento con insulina: Cuando se indica en los resultados y las figuras, se administró insulina a animales diabéticos a través de gránulos de insulina subcutánea de liberación lenta (Linbits). Los animales se anestesiaron con isoflurano y se insertaron de 1-3 gránulos de Linbit justo debajo de la piel según las instrucciones del fabricante. Se controlaron las concentraciones de glucosa en sangre en la vena de la cola durante varios días para garantizar que los animales no tuvieran hiperglucemia ni hipoglucemia.
Monitoreo de glucosa en sangre: En todos los estudios con animales, las concentraciones de glucosa en sangre se evaluaron dos veces por semana mediante el muestreo de la vena de la cola y mediante el uso de un glucómetro OneTouch Ultra 2 (nivel de detección, 20-600 mg de glucosa/dl). Anestesia: Los animales se anestesiaron con isoflurano, 1-5 %, mediante el uso de un sistema de anestesia para roedores por inhalación (Euthanex, Palmer, PA). Las temperaturas rectales se mantuvieron a 37 °C mediante el uso de una cama de agua quirúrgica calentada (Euthanex, Palmer, PA).
Tratamiento de ratones NOD diabéticos con NI alogénicos de ratones C57Bl/6: Los niveles de glucosa en sangre de los ratones NOD diabéticos se normalizaron con Linbits y NI, compuestos por MSC eGFP+ P5 y células de los islotes P1 (2x105 NI/kg de peso corporal suspendido en 0,5 ml de medio DMEMF12 sin suero; N=6) o vehículo (0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero; N=6) se administraron de forma estéril por vía ip, mediante el uso de anestesia ligera con isofluorano el día 20 después de la administración de Linbit. No se administró insulina exógena subsecuente en ninguno de los grupos. A las 10 semanas después de la administración de los NI, se sacrificaron los ratones y se recolectaron sus omentos, hígados, bazos, pulmones, riñones y páncreas y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia para detectar la presencia de NI eGFP+. También se recogieron sueros para probar una respuesta alo-IgG a las células que forman los NI. Como control positivo para esta prueba, se administraron Linbits a un grupo adicional de 3 ratones NOD y se trataron vía ip con 2 x 105 islotes alogénicos recién aislados/kg de peso corporal suspendido en 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero. Estos ratones se sacrificaron 14 días después de la administración de los islotes, y sus sueros se recogieron y examinaron como antes.
Se administró vía ip un tratamiento a ratones C57Bl/6 diabéticos STZ con NI singénicos, conglomerados ASC o conglomerados IC: A cuatro grupos de ratones wt C57Bl/6 de 10 semanas de edad, diabéticos STZ, controlados con glucosa en sangre (a través de Linbits). (i) 0,5 ml de vehículo (DMEM-F12 sin suero; N=6), o 2x105/kg de peso corporal. (ii) NI recién formados (PS eGFP+ MSC y P1 IC; N=6), (iii) conglomerados compuestos solo por P1 ASC (N=5) o (iv) conglomerados compuestos solo por P1 IC (N=5). Los ratones fueron seguidos como se indica. Tras su sacrificio, se recogieron omentos, páncreas, bazos, hígados, pulmones y riñones y se examinaron fluoroscópicamente para detectar la presencia de NI eGFP+. Además, se obtuvieron perfiles de expresión génica asociados a islotes en todos los omentos y páncreas.
Tratamiento de ratones no diabéticos con NI de ratón o caninos: NI de ratón: A seis grupos de 2 a 4 ratones C57Bl/6 de 12 semanas de edad cada uno se les administró vía ip (i) 2x105/kg de peso corporal NI singénicos recién formados (P5 MSC y P1 IC) suspendidos en 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero, o (ii) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (vehículo). Los ratones fueron seguidos durante un máximo de 12 semanas. NI caninos: Dos grupos de ratones NOD/SCID de 9 semanas de edad fueron tratados vía ip con (i) 2x105/kg de peso corporal con cNI recién formados suspendidos en 0,5 ml de DMEM/F12 (N=6) o (ii) 0,5 ml de Dm Em -F12 sin suero (vehículo; N=3). Los ratones fueron seguidos durante 10 semanas.
Resultados
Para probar nuestra hipótesis central en un modelo T1DM autoinmune clínicamente altamente informativo, primero examinamos si la administración vía ip de los NI alogénicos generados in vitro podrían restablecer la euglucemia en ratones NOD espontáneamente diabéticos como un reflejo de (i) su supervivencia, (ii) la rediferenciación de las células de los islotes contenidas en los NI en células productoras de insulina funcionales in vivo, y (iii) la protección cito-, alo- y autoinmune mediada por MSC de los grupos de células trasplantadas.
Tratamiento de ratones NOD espontáneamente diabéticos con NI alogénicos. Dado que otros descubrieron que las células progenitoras de los islotes y las células beta de los islotes desdiferenciadas pueden diferenciarse en células endocrinas funcionales in vivo, probamos si los NI murinos alogénicos como se describe en la presente descripción que se administraron vía ip a ratones NOD espontáneamente diabéticos, que desarrollan una forma autoinmune mediada por células T de T1DM, restablecerían la euglucemia. Se eligió este protocolo porque se parece mucho a la situación clínica más común en donde un paciente con T1DM recibe un trasplante alogénico de páncreas o de islotes. Para facilitar tanto el seguimiento in vivo como la localización post-mortem, los NI administrados se marcaron dualmente con DiR y se componían de MSC P5 derivadas de ratones C57Bl/6 transgénicos para el gen eGFP, expresados constitutivamente en todos los tejidos, y IC P1 de ratones C57Bl/6 de tipo salvaje (ver la Figura 5). Otros han demostrado que la normalización de los niveles de glucosa en sangre con insulina mejora la rediferenciación de las células de los islotes en células productoras de insulina in vivo lo que reduce simultáneamente los efectos glucotóxicos sobre las células trasplantadas. Por lo tanto, para evitar posibles efectos glucotóxicos en los NI trasplantados y para estimular la rediferenciación endocrina de las IC trasplantadas, los niveles de glucosa en sangre de doce ratones NOD hembra espontáneamente diabéticos se normalizaron con la administración subcutánea de gránulos liberadores de insulina (Linbits), un efecto que dura 30-40 días después de la administración.
Luego, estos ratones se dividieron en dos grupos y se trataron vía ip con 2x105/kg de peso corporal con NI de ratones C57Bl/6 alogénicos (N=6) o con vehículo (N=6; Figura 9). Como era de esperar, en los días 35-40 posteriores al tratamiento con Linbit, la hiperglucemia volvió a desarrollarse en los ratones NOD tratados con vehículo, mientras que sorprendentemente, los niveles de glucosa en sangre en los animales tratados con NI permanecieron cerca de lo normal (Figura 9). Se logró una restauración similar de la normoglucemia en experimentos paralelos para ratones C57Bl/6 diabéticos con estreptozotocina (STZ), tratados con ratones nOd/SCID singénicos y diabéticos STZ, tratados con NI xenogénicos (caninos) (Figuras 14A y 14B).
Juntos, estos datos muestran que (i) los NI se injertan y sobreviven, (ii) los IC dentro de los NI se rediferencian in vivo, lo que proporciona al ratón una nueva fuente endógena de insulina, y (iii) las MSC contenidas en los NI proporcionan efectivamente citoprotección y aloinmunoaislamiento y autoinmunoaislamiento de las células productoras de insulina en ratones NOD, y aparentemente establecen el control glucémico en este modelo de T1DM clínicamente muy relevante.
La colaboración de células de los islotes y M/ASC dentro de los NI es esencial para establecer la normoglucemia en animales diabéticos. Para explorar más a fondo la colaboración entre las IC y M/ASC en los NI, se realizaron dos experimentos que se resumen en las Figuras 10A - 10C. En estos, se usó un modelo de estreptozotocina (STZ) fácilmente controlable de la T1DM en ratones C57Bl/6 inmunocompetentes. En el primer grupo, los ratones C57Bl/6 diabéticos STZ fueron tratados vía ip con 2x105/kg de peso corporal con NI singénicos o con vehículo. En el segundo, los ratones STZ-diabéticos C57Bl/6 fueron tratados vía ip con 2x105/kg de peso corporal con grupos de control compuestos por ASC (P1) o IC de pases (P1) solos (Figura 11). Es importante destacar que el número total de celdas en cada conglomerado de celdas generado fue idéntico al de las NI (-1000 celdas por conglomerado). Tres ratones del grupo tratado con los NI y todos los ratones de los grupos de control fueron sacrificados a las 12 semanas. Los tres ratones tratados con los NI restantes se siguieron durante 21 semanas. Se obtuvo euglucemia a largo plazo (21 semanas) en ratones C57Bl/6 diabéticos STZ que se trataron vía ip con los NI singénicos. Significativamente, el tratamiento con grupos control generados de manera idéntica compuestos por ASC o IC cultivadas solas solo redujo mínimamente los niveles de glucosa en sangre cuando se administraron conglomerados de IC (Figura 10A), lo que demuestra que tanto las IC como las células madre deben estar presentes dentro de los NI para facilitar la rediferenciación óptima de células productoras de insulina.
Rediferenciación in vivo. Los datos del experimento del ratón NOD (Figura 9), así como también de los omentos recuperados (Figura 18B) implican que los NI vuelven a diferenciarse in vivo para producir suficiente insulina para convertir a los ratones en euglucémicos. De hecho, los omentos recuperados de los ratones C57Bl/6 euglucémicos tratados con NI a las 21 semanas mostraron un injerto de NI y un aumento significativo de la expresión génica de insulina, glucagón, somatostatina y Pdx1 en comparación con los NI con los que fueron tratados (Figura 10B). Esto demuestra claramente la rediferenciación efectiva in vivo de células de los islotes que expresan hormonas de los islotes. Además, la expresión de Ins1 e Ins2 en el páncreas completo de ratones diabéticos STZ se redujo significativamente, como se esperaba, en todos los animales (Figura 10C), lo que indica que la euglucemia en los ratones tratados con NI se logró mediante la secreción fisiológica de insulina proporcionada por los NI injertados en el omento y no por insulina pancreática residual.
Estudios de búsqueda de dosis y prueba de principio in vivo en ratones NOD/SCID diabéticos STZ tratados IP con neoislotes caninos
Fundamento lógico: En el Ejemplo 1, se demostró que los neoislotes de ASC recién formados y las células de islote desdiferenciadas expresan niveles bajos de genes asociados a islotes así como también genes asociados a las ASC/MSC. También se observó que el componente derivado endocrino de tales neoislotes tiene la capacidad de rediferenciar in vitro para reexpresar niveles más altos de genes asociados a los islotes. Otros han demostrado que las células precursoras endocrinas pueden volver a diferenciarse in vivo para producir insulina. Por lo tanto, probamos (i) si los neoislotes que comprenden las ASC caninas y células de los islotes desdiferenciadas pueden revertir la hiperglucemia de manera dependiente de la dosis y afectar la supervivencia animal, y (ii) si la eliminación de los neoislotes daría como resultado el regreso de la hiperglucemia, lo que confirma que los neoislotes son los únicos responsables del tratamiento obtenido de la T1DM.
Métodos
Neoislotes: Los neoislotes se formaron a partir de ASC caninas (pase 2) y células de los islotes caninas cultivadas (pase 1).
Modelos de diabetes: Se hicieron diabéticos ratones diabéticos no obesos/de inmunodeficiencia combinada grave (NOD/SCID) con 5 dosis vía ip de 50 mg/kg de peso corporal de estreptozotocina (STZ) en tampón de citrato. Una vez que los niveles de glucosa en sangre fueron >300 mg/dl en 3 días separados, se les administró, en el día 0, un gránulo de insulina de liberación lenta vía sc a cada uno (Linbit, Linshin, Canadá) con el fin de controlar los niveles de glucosa en sangre y evitar de esta manera un daño por glucotoxicidad celular. Estos gránulos caducan a los 36 días aproximadamente (ver la Figura 12). Los animales se trataron vía ip con (a) 200 000 o (b) 80 000 neoislotes derivados de caninos recién formados, no rediferenciados/kg de peso corporal, o (c) vehículo (DMEM/F12). En algunos estudios, Los NI se extirparon quirúrgicamente el día 76 y se siguió a los ratones durante 2 semanas adicionales.
Pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (GTT): A los 55 días después del tratamiento, 3 ratones tratados con vehículo y 5 ratones tratados con neoislotes caninos se mantuvieron en ayunas durante 5 horas, con lo cual se evaluaron los niveles de glucosa en sangre de referencia mediante el uso de un glucómetro OneTouch Ultra 2 (Johnson and Johnson, New Brunswick, NJ; nivel de detección límite de 600 mg glucosa/dl). A continuación, se anestesiaron los animales y se administraron 2 g de glucosa/kg de peso corporal (disueltos en medio libre de suero y esterilizados por filtración) mediante inyección vía ip bajo anestesia con isoflurano. Los niveles de glucosa en sangre se evaluaron a los 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de la administración de glucosa.
Protocolos de tratamiento
Tratamiento alogénico NOD: Una vez que se confirmó que los ratones NOD hembra eran hiperglucémicos (glucosa en sangre sin ayunar >300 mg/dl en 3 días separados), se trataron vía sc con gránulos de Linbit. Una vez que los niveles de glucosa en sangre de los animales se normalizaron, se anestesiaron (isoflurano) y se administraron vía ip los neoislotes, compuestos por P5 gfp+MSC y células de los islotes P1 (2x105 neoislotes/kg de peso corporal suspendidos en 0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero; n=6) o vehículo (0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero; n=3). No se administró insulina exógena subsecuente a los animales en ninguno de los grupos. Los niveles de glucosa en sangre y los pesos corporales se evaluaron dos veces por semana y los ratones se siguieron durante 10 semanas. A las 10 semanas después de la administración de neoislotes, se sacrificaron los animales y se recogieron sus sueros, omentos, hígados, bazos, pulmones y riñones y páncreas, y se examinó la presencia de neoislotes e insulina. Ninguno fue encontrado en ninguna parte excepto en el omento.
Tratamiento singénico C57Bl/6 de animales diabéticos STZ: Se anestesiaron ratones C57Bl/6 diabéticos STZ y controlados con glucosa en sangre (a través de Linbits) y se les administró vía ip (a) 2x105 neoislotes de ratón gfp+ recién formados (PS gfp+MSC y células de islote P1) teñidos con DiR y suspendidos en 0,5 ml de DMEM-F12 libre de suero (vehículo; n=3), o (b) 2x105 neoislotes de ratón gfp+ recién formados teñidos con DiR e integrados en gelfoam (n=3). Los animales del grupo control se anestesiaron y se trataron vía ip con 0,5 ml de vehículo (n=3). Los pesos y niveles de glucosa en sangre se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana en todos los animales durante 18 semanas. Una vez por semana, los animales fueron examinados bajo anestesia con isofluorano mediante el uso de un generador de imágenes Licor, Pearl Impulse para rastrear los neoislotes. Tras el sacrificio, se recogieron el omento, páncreas, bazo, hígado, pulmones y riñones y se examinó la presencia de neoislotes. Ninguno fue encontrado en ninguna parte excepto en el omento.
Tratamiento de ratones no diabéticos: Administración de neoislotes de ratón: Seis grupos de 2 a 4 ratones hembra C57Bl/6 no diabéticos de 12 semanas de edad (peso promedio de 21,9 g) cada uno se anestesiaron y se les administró vía ip (a) 2x105 neoislotes de ratón recién formados (MSC gfp+ P5 y células de islote P1) suspendidos en 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (5 grupos sacrificados en diferentes puntos de tiempo con fines de seguimiento), o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (vehículo; 1 grupo). Los pesos y niveles de glucosa en sangre se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana durante 12 semanas. Administración de neoislote canino: Se anestesiaron dos grupos de ratones hembra NOD/SCID no diabéticos de 9 semanas de edad que pesaban de 19,7 a 24,8 g y se les administró vía ip (a) 2x105 neoislotes caninos teñidos con DiR recién formados suspendidos en 0,5 ml de DMEM/F12 (N=6) o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (vehículo; n=3). Los pesos y niveles de glucosa en sangre se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana durante 10 semanas. Una vez por semana, los animales fueron examinados bajo anestesia con isofluorano mediante el uso de un generador de imágenes Li-Cor, Pearl Impulse para rastrear los neoislotes. Tras el sacrificio, se recogieron el omento, páncreas, bazo, hígado, pulmones y riñones y se examinó la presencia de neoislotes. Ninguno fue encontrado en ninguna parte excepto en el omento.
Tratamiento xenogénico en NOD/SCID con diabetes de inicio reciente: Se anestesiaron grupos de ratones hembra NOD/SCID diabéticos STZ de 20 semanas de edad que pesaban 17-29 g (n=5 por grupo) cuyos niveles de glucosa en sangre se controlaron con gránulos de Linbit y se trataron vía ip con (a) 2x105 o (b) 8x104 neoislotes caninos/kg de peso corporal no rediferenciados recién formados incrustados en gelfoam, o (c) vehículo (DMEM/F12). Los neoislotes estaban compuestos por células de islote P1 y ASC caninas P2. Los niveles de glucosa en sangre y los pesos corporales se evaluaron dos veces por semana y los ratones se siguieron durante 13 semanas. Se realizaron GTT IP en el grupo de dosis alta 55 días después del tratamiento, y los neoislotes se extrajeron quirúrgicamente del grupo de ratones de dosis alta en la semana 10.
Tratamiento xenogénico en NOD/SCID con diabetes de inicio remoto: Se hicieron diabéticos ratones NOD/SCID hembra de 11 semanas de edad que pesaban de 18,4 a 22,8 g con tres dosis vía ip de 75 mg/kg de peso corporal de STZ en tampón de citrato. El estado diabético fue confirmado por niveles de glucosa en sangre >300 mg/dl en 3 días separados. Una vez que se confirmó que los animales eran diabéticos, se controlaron sus niveles de glucosa en sangre durante aproximadamente 3 meses con terapia de insulina mediante el uso de gránulos de linbit vía sc. Para confirmar que todos los animales seguían siendo diabéticos antes de la administración de neoislotes o del vehículo, se permitió que los Linbit caducaran y que los ratones volvieran a desarrollar hiperglucemia. Los ratones se trataron de nuevo con Linbits (día 0) para controlar los niveles de glucosa en sangre y prevenir el daño glucotóxico del neoislote. Luego, los ratones anestesiados se trataron vía ip con (i) 2x105 neoislotes caninos/kg de peso corporal integrados en espuma de gel o (ii) vehículo (0,5 ml de DMEM/F12). Los neoislotes estaban compuestos por células de islote P1 y ASC caninas P2. Los niveles de glucosa en sangre y los pesos corporales se evaluaron dos veces por semana y los ratones se siguieron durante 11 semanas. GTT IP: A los 55 días después del tratamiento, 3 ratones tratados con vehículo y 5 ratones tratados con cNeoislote se mantuvieron en ayunas durante 5 horas, con lo cual se evaluaron los niveles de glucosa en sangre de referencia. A continuación, se anestesiaron los animales y se administraron 2 g de glucosa/kg de peso corporal (disueltos en 0,5 ml medio libre de suero y esterilizados por filtración) mediante inyección vía ip bajo anestesia. Los niveles de glucosa en sangre de la vena de la cola se evaluaron a los 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de la administración de glucosa.
ELISA para insulina canina: Los sueros de los ratones tratados con el vehículo y neoislote que se habían recolectado durante las pruebas de tolerancia a la glucosa se examinaron mediante ELISA para detectar la presencia de insulina canina específica que no reacciona de forma cruzada con la insulina de ratón (Mercodia, Uppsala, Suecia), según las instrucciones del fabricante. También se analizaron sueros de un perro, así como también de un ratón C56Bl/6 como controles positivos y negativos, respectivamente, para la reactividad cruzada. Prueba de respuesta de anticuerpos: Se incubaron alícuotas de ~5x104 (MSC, ASC o células de los islotes que se usaron para crear los neoislotes que se administraron) cada una con ~500 pl de suero obtenido de neoislote o ratones NOD tratados con ASC caninos >14 días después de la administración de neoislotes o de ASC. Las células se incubaron con los sueros durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, las células se centrifugaron a 600 xg durante 5 minutos, se resuspendieron en tampón FACS y se incubaron con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado con cy3 (dilución). Las células se incubaron unos 20 minutos adicionales en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, se añadió un ml de PBS 1x BSA al 1 %, las células se sometieron a agitación vorticial, se centrifugaron, se resuspendieron en 400 pl de tampón de fijación (formaldehído al 1 %) y se analizaron mediante FACS (BD FACScan Analyzer, San Jose, CA). Un cambio de > 7 % de las células se consideró una respuesta positiva, lo que indica que el suero contenía anticuerpos contra las células analizadas. Integración de neoislotes en gelfoam: Se recogieron dosis individuales de neoislotes en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron a 200 xg durante 2 minutos. Los sobrenadantes se desecharon y los sedimentos se resuspendieron en 0,2 ml de DMEM-F12 sin suero cada uno. A continuación, las suspensiones de neoislote se cargaron en bloques de gelfoam estéril de 0,5 x 0,5 x 0,5 cm, que se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 3 horas antes de la administración vía ip a los ratones. Los neoislote incrustados en Gelfoam se trasplantaron quirúrgicamente en condiciones estériles y bajo anestesia en las almohadillas de grasa peritoneal y el omento de los ratones receptores. La incisión abdominal se cerró con suturas de dos capas.
Representación in vivo: La representación in vivo de neoislotes teñidos con DiR se realizó en ratones anestesiados mediante el uso del generador de imágenes Li-Cor, Pearl Impulse.
Resultados
Una dosis de 2x105 neoislotes/kg de peso corporal administrado vía ip 1 mes posterior a la STZ logra y mantiene la euglucemia y promueve la supervivencia animal: Tres grupos de cinco ratones NOD/SCID cada uno se trataron vía ip aproximadamente un mes después del establecimiento de la diabetes T1DM inducida por la STZ con (a) 200000 o (b) 80000 neoislotes derivados de caninos recién formados, no rediferenciados/kg de peso corporal, suspendidos en 0,5 ml de medio sin suero (DMEM-F12), o (c) vehículo (0,5 ml de medio sin suero). Los Linbits se administraron una vez, aproximadamente 1 mes después de la administración de la STZ (Día 0 en las Figuras 12, 13, 14Ay 14B), y neoislotes o vehículo se administraron una vez que se estabilizaron los niveles de glucosa en sangre, 12 días después de la administración de Linbit. Los animales tratados con vehículo comenzaron a morir el día 21, a pesar de la terapia con insulina (ver la Figura 15). Como se muestra en la Figura 12, 13, 14A y 14B, una vez que el efecto de los Linbits desaparece, los animales restantes tratados con vehículo (barras abiertas) volvieron a tener hiperglucemia. Los animales diabéticos tratados con neoislote (barras negras y rayadas) mostraron niveles de glucosa en sangre normalizados, con la dosis de 200 000 neoislotes/kg de peso corporal controlando la hiperglucemia de manera más efectiva que la dosis de 80000 neoislotes/kg de peso corporal. Como demuestra la Figura 15, las tasas de mortalidad fueron significativamente más bajas en los grupos tratados (cuadrados y círculos) que en el grupo de diabéticos tratados con vehículo (triángulos) o, sorprendentemente, en el grupo de control sano, no diabético (diamantes).
Las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (GTT IP) fueron normales en 2x105 animales tratados con neoislotes/kg de peso corporal, y un aumento de la glucosa en sangre estuvo acompañado por la liberación de insulina canina: Se realizaron g Tt IP (2 g de glucosa/kg de peso corporal) 54 días después del tratamiento con neoislotes caninos (66 días después de la terapia con Linbit) en ratones NOD/SCID que habían sido tratados con dosis o vehículo 2x105 de neoislotes caninos/kg de peso corporal como se describió en los Métodos. Como se muestra en la Figura 16, los GTT IP de los animales tratados con neoislotes fueron normales, mientras que los niveles de glucosa en sangre de los ratones tratados con vehículo permanecieron elevados 2 horas después de la administración de glucosa.
Los sueros de los ratones tratados con el vehículo y neoislote que se habían recolectado durante las pruebas de tolerancia a la glucosa se examinaron mediante ELISA para detectar la presencia de insulina canina específica que no reacciona de forma cruzada con la insulina de ratón como se describió en los Métodos. Como puede verse en la Figura 16, se detectó insulina canina en los sueros de ratones tratados con neoislotes (barra rayada), pero no de ratones tratados con vehículo. Los sueros de ratones C57Bl/6 sanos también se analizaron para garantizar que no hubiera una reactividad cruzada significativa entre la insulina canina y la de ratón. No se observó reactividad cruzada significativa.
La recuperación de neoislotes caninos restablece la hiperglucemia: El día 76, los neoislotes fueron retirados del grupo de tratamiento de 2x105 neoislotes/kg de peso corporal. Como demuestra la Figura 13, la eliminación de los neoislotes caninos dio como resultado el restablecimiento de la hiperglucemia en este grupo de animales (barras negras) similar a la de los animales tratados con vehículo (barras abiertas).
Conclusión: Los resultados presentados en el Ejemplo 6 demuestran que los neoislotes caninos recién formados administrados por vía ip a animales con diabetes de inicio reciente rediferencian in vivo para proporcionar una secreción de insulina adecuada y fisiológica y un mantenimiento duradero, pero reversible, de la euglucemia en roedores con T1DM. Además, la capacidad de eliminar los conglomerados mediante la eliminación del omento es una característica de seguridad de esta tecnología cuando se justifica clínicamente.
Seguimiento de neoislotes y angiogénesis
Fundamento lógico: (A) Es bien sabido que el omento acumula células y cuerpos extraños de varios tamaños. Por lo tanto, planteamos la hipótesis y probamos si los neoislotes, cuando se entregaban por vía ip, serían absorbidos e injertados en el omento. Tal ubicación ofrece dos ventajas: (i) Como en el caso del páncreas, la sangre del omento drena directamente al hígado a través del sistema portal. Por lo tanto, la insulina fabricada por los neoislotes se administraría de forma fisiológica. (ii) El omento puede retirarse sin efectos nocivos significativos, si se desea por seguridad u otras razones que se extraigan los neoislotes. (B) Como las MSC y las ASC expresan potentes factores angiogénicos y de supervivencia, también examinamos si el componente de células madre de los neoislotes injertados mejoró el desarrollo de un suministro de sangre para los neoislotes.
Métodos
Los neoislotes de ratón se generaron a partir del cocultivo en recipientes de baja adherencia de células de islote P2 derivadas de ratones C57Bl/6 de tipo salvaje y MSC P5 derivadas de ratones C57Bl/6 transgénicos para el gen GFP+ para facilitar el seguimiento de los neoislotes in vivo. Como se indica más abajo, en un grupo de experimentos, después de la formación, los neoislotes se tiñeron con la sonda de carbocianina excitable con luz infrarroja DiR (Molecular Probes, Eugene, OR) para permitir el seguimiento in vivo.
Los neoislotes de perro se formaron a partir del cocultivo en recipientes de baja adherencia de células de islote de perro P2 y ASC de perro P4 que se habían teñido con DiR para permitir el seguimiento en animales vivos.
Modelo de diabetes y tratamiento alogénico: Los ratones diabéticos no obesos (NOD) hembra desarrollan espontáneamente la T1DM aproximadamente a las 12-20 semanas de edad. Una vez que se confirmó que los ratones NOD hembra eran hiperglucémicos (glucosa en sangre >300 mg/dl en tres días separados), se trataron vía sc con gránulos de Linbit. Una vez que se normalizaron los niveles de glucosa en sangre de los animales, se administraron neoislotes (2x105 neoislote/kg de peso corporal suspendido en 0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero) o vehículo (0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero) vía ip a grupos de cinco animales cada uno. No se administró insulina exógena subsecuente a los animales en ninguno de los grupos. Los niveles de glucosa en sangre y los pesos corporales se evaluaron dos veces por semana y los ratones se siguieron durante 10 semanas. A las 10 semanas después de la administración de neoislotes, se sacrificaron los animales y se recogieron sus sueros, omentos, hígados, bazos, riñones y páncreas.
Administración de neoislote canino: Se administraron vía ip neoislotes de perros marcados con DiR a 6 ratones NOD/SCID, y los ratones se examinaron semanalmente durante 10 semanas bajo anestesia con isoflurano mediante el uso de un Li-Cor Pearl Impulse™ generador de imágenes para rastrear los neoislotes.
Administración de neoislotes singénicos: Se realizaron dos experimentos de administración singénica, uno en animales no diabéticos y otro en animales diabéticos.
A) Animales no diabéticos: A seis grupos de ratones C57Bl/6 no diabéticos se les administró vía ip (a) 2X105 neoislotes de ratón gfp+ recién formados suspendidos en 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (5 grupos), o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (vehículo; 1 grupo). Los pesos y niveles de glucosa en sangre (Glucómetro OneTouch Ultra 2) se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana en todos los animales. En varios puntos de tiempo hasta 12 semanas, se sacrificaron grupos de animales y se recogieron sus sueros, omentos, hígados, bazos, pulmones, riñones y páncreas.
B) Animales diabéticos: A dos grupos de ratones C57Bl/6 diabéticos STZ se les administró vía ip (a) 2X105 neoislotes de ratón gfp+ recién formados, teñidos con DiR y suspendidos en 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero, o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (vehículo). Los pesos y niveles de glucosa en sangre (Glucómetro OneTouch Ultra™ 2) se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana en todos los animales durante 13 semanas. Una vez por semana, los animales fueron examinados bajo anestesia con isofluorano mediante el uso de un generador de imágenes Licor, Pearl Impulse para rastrear los neoislotes.
Inmunohistoquímica: Los omentos y otros órganos se recolectaron, fijaron e integraron como se describió anteriormente.13 Las secciones de omento se desparafinaron y se tiñeron mediante inmunohistoquímica para ADN con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Molecular Probes, Eugene, OR) y proteína de insulina mediante el uso de un anticuerpo anti-insulina de conejillo de indias (Dako, Carpinteria, cA), y un anticuerpo anti conejillo de indias conjugado con cy3 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) según las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los neoislotes se injertan espontáneamente en el omento murino y producen insulina. Presumimos que los NI inyectados se alojarían, unirían e injertarían en los omentos bien vascularizados de los ratones, lo que ofrecería la ventaja de la secreción fisiológica de insulina en el sistema portal del hígado. De hecho, como se muestra en la Figura 18A, la representación de la fluorescencia in vivo de un ratón NOD euglucémico tratado 10 semanas antes con NI marcados con DiR demuestran su ubicación persistente en la parte superior del abdomen.
Para evaluar aún más el patrón de injerto intraperitoneal y la función de los NI eGFP+ marcados con DiR, como se detecta en la Figura 18A, tras la eutanasia de los ratones NOD tratados con NI del experimento que se muestra en la Figura 9, examinamos histológicamente el omento, el páncreas, el bazo, el hígado, los pulmones y los riñones para detectar la presencia de los NI eGFP+. Los Ni solo se detectaron en los omentos de los animales (Figura 18B). Además, las secciones del omento se tiñeron de forma positiva para insulina (Figura 18C, panel izquierdo), mientras que los controles negativos (Figura 18C, recuadro) y los omentos de ratones NOD diabéticos tratados con vehículo no mostraron tinción de insulina (Figura 18C, panel derecho). Los páncreas mostraron tener insulitis de alto grado, como se esperaba (Figura 17), lo que indica que la euglucemia no se logró a través de la recuperación de los islotes, sino más bien a través de la secreción fisiológica de insulina por los NI injertados en el omento. Es importante destacar que no hubo evidencia histológica de formación de tumores o maldiferenciación ectópica (adipo-, osteo-, condrogénica) en ninguno de los órganos examinados.
Conclusión: Tomados en conjunto, los resultados anteriores demuestran que en todas las especies: (i) Los neoislotes que se administran vía ip injertados en el omento donde permanecen a largo plazo, vuelven a diferenciarse, secretan insulina de manera fisiológica y no son rechazados. (ii) Las propiedades angiogénicas del componente de células madre del neoislote ayudan a vascularizar los neoislotes, lo que les brinda el oxígeno necesario, la nutrición y la administración optimizada de insulina desde los neoislotes hacia la vena porta del hígado. Ejemplo 3: Tratamiento con neoislotes de diabéticos de inicio remoto
Fundamento lógico: Mostramos en el Ejemplo 1 que los neoislotes son efectivos en el tratamiento de la T1DM de aparición reciente. Probamos aquí si los neoislotes también fueron efectivos en el tratamiento de la T1DM de inicio remoto.
Métodos
Neoislotes: Los neoislotes se formaron a partir de ASC caninas (pase 2) y células de los islotes caninas cultivadas (pase 1).
Modelos de diabetes: Se hicieron diabéticos ratones diabéticos no obesos/de inmunodeficiencia combinada grave (NOD/SCID) con 3 dosis vía ip de 75 mg/kg de peso corporal de estreptozotocina (STZ) en tampón de citrato. El estado diabético fue confirmado por niveles de glucosa en sangre >300 mg/dl en 3 días separados. Una vez que se confirmó que los animales eran diabéticos, se controlaron sus niveles de glucosa en sangre durante aproximadamente 3 meses con terapia de insulina mediante el uso de gránulos de linbit vía sc. Para confirmar que todos los animales seguían siendo diabéticos antes de la administración de los neoislotes o del vehículo, se permitió que los Linbit caducaran y que todos los ratones desarrollaran hiperglucemia. Los ratones se volvieron a tratar con Linbits (Día 0 en la Figura 19 para controlar los niveles de glucosa en sangre y prevenir el daño celular glucotóxico. Los GTT IP y ELISA de insulina se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5, y los resultados se combinaron con los de los animales en el Ejemplo 6 (inicio reciente) y se presentaron en la Figura 16.
Resultados
Dos grupos de cinco ratones NOD/SCID diabéticos cada uno se trataron vía ip 3 meses después de la T1DM inducida por la STZ con (a) 200 000 neoislotes derivados de caninos recién formados/kg de peso corporal suspendidos en 0,5 ml de medio libre de suero (DMEM-F12) o (b) vehículo. Un resumen del diseño experimental se muestra en la Figura 19. Como se muestra en la Figura 19, los animales con diabetes de aparición remota muestran normoglucemia después del tratamiento con neoislotes caninos (barras negras), mientras que los tratados con vehículo (barras abiertas) se mantienen hiperglucémicos una vez que caducan los gránulos de insulina.
Conclusión: Los datos anteriores demuestran que, como es el caso de la diabetes de aparición reciente, los neoislotes también son efectivos para establecer la euglucemia en la diabetes de aparición remota.
Ejemplo 4: Tratamiento de ratones NOD espontáneamente diabéticos con neoislotes de ratón alogénicos Fundamento lógico: Mostramos en el Ejemplo 1 que los neoislotes caninos pueden revertir la diabetes inducida por la STZ en ratones NOD/SCID. Si bien los datos de NOD/SCID presentados anteriormente indican que los neoislotes generados a partir de células derivadas de caninos son capaces de someterse a una rediferenciación in vivo de manera segura y efectiva para producir insulina y secretarla de manera fisiológica a largo plazo, el modelo NOD/SCID no aborda los problemas de protección de las células trasplantadas de los ataques diabetogénicos autoinmunes y aloinmunes. Las ASC y las MSC exhiben poderosas propiedades inmunomoduladoras.16 Presumimos que el componente de células madre de los neoislotes proporcionaría un aislamiento inmunológico local y probamos si los neoislotes podrían restaurar la euglucemia cuando se administran alogénicamente a ratones NOD con diabetes espontánea.
Métodos
Los neoislotes de ratón se generaron a partir del cocultivo en recipientes de baja adherencia de células de islote P2 derivadas de ratones C57Bl/6 de tipo salvaje y MSC P5 derivadas de ratones C57Bl/6 transgénicos para el gen GFP+.
Modelo de diabetes espontánea y tratamiento alogénico: Una vez que se confirmó que los ratones NOD hembra eran hiperglucémicos (glucosa en sangre >300 mg/dl en 3 días separados), se trataron vía sc con gránulos de Linbit. Una vez que se normalizaron los niveles de glucosa en sangre de los animales, se administraron neoislotes (2X105 neoislote/kg de peso corporal suspendido en 0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero) o vehículo (0,5 ml de medio DMEM-F12 sin suero) vía ip a grupos de 5 animales cada uno. No se administró insulina exógena subsecuente a los animales en ninguno de los grupos. Los niveles de glucosa en sangre y los pesos corporales se evaluaron dos veces por semana y los ratones se siguieron a largo plazo.
Resultados
Una dosis de 200000 neoislotes alogénicos/kg de peso corporal administrada vía ip logra y mantiene la euglucemia en ratones NOD con diabetes espontánea. Los niveles de glucosa en sangre de vehículos y ratones NOD tratados con neoislotes se muestran en la Figura 20. Para resumir, los niveles de glucosa en sangre se normalizaron en ratones tratados con neoislotes alogénicos (barras negras), mientras que los ratones tratados con vehículo (barras abiertas) permanecieron hiperglucémicos.
Conclusión: Estos datos demuestran que, al igual que los neoislotes caninos, los neoislotes de ratón (i) se rediferencian in vivo para proporcionar una secreción de insulina adecuada para restablecer y mantener la euglucemia y, lo que es más importante, (ii) proporcionan un aislamiento inmunitario frente a ataques tanto aloinmunes como autoinmunes sin encapsulación, como se hipotetizó.
Los neoislotes no inducen hipoglucemia en ratones no diabéticos
Fundamento lógico: De los experimentos anteriores, es evidente que los neoislotes se injertan en el omento donde se rediferencian para producir y secretar insulina. Sin embargo, si la secreción de insulina fuera constitutiva y no fisiológica, esto podría conducir potencialmente a episodios de hipoglucemia. Probamos, por lo tanto, si la administración de neoislotes a animales no diabéticos provocaría hipoglucemia.
Métodos
Los neoislotes de ratón se generaron a partir del cocultivo en recipientes de baja adherencia de células de islote P2 derivadas de ratones C57Bl/6 de tipo salvaje y MSC P5 derivadas de ratones C57Bl/6 transgénicos para el gen GFP+.
Los neoislotes de perro se formaron a partir del cocultivo en recipientes de baja adherencia de células de islote de perro P2 y ASC de perro P4.
Administración de neoislotes de ratón: A seis grupos de 2 a 4 ratones C57Bl/6 no diabéticos se les administró, a cada uno, vía ip (a) 2X105 neoislotes singénicos de ratón recién formados suspendidos en 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (5 grupos), o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 sin suero (vehículo; 1 grupo). Los pesos y niveles de glucosa en sangre (Glucómetro OneTouch Ultra 2) se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana durante 12 semanas.
Neoislotes caninos: A dos grupos de ratones NOD/SCID se les administró vía ip (a) 2X105 neoislotes de perro recién formados (N=6) o (b) 0,5 ml de DMEM-F12 libre de suero (vehículo; N=3). Los pesos y niveles de glucosa en sangre (Glucómetro OneTouch Ultra 2) se evaluaron al inicio del estudio y luego dos veces por semana durante 10 semanas.
Resultados
Los neoislotes no causan hipoglucemia en ratones no diabéticos. Como se muestra en el Ejemplo 8 y en la Figura 18B, se administraron vía ip injertos de neoislotes de perro o ratón en el omento. Como puede verse en la Figura 21, panel superior, los niveles de glucosa en sangre de ratones C57Bl/6 que fueron tratados con neoislotes de ratón se mantienen normales y comparables a los de los ratones tratados con vehículo. Se obtuvieron resultados similares para ratones NOD/SCID tratados con los neoislotes caninos (Figura 21, panel inferior).
Conclusión: Estos datos demuestran que los neoislotes injertados formados a partir de células caninas o de ratón liberan insulina de forma fisiológica y no constitutiva.
Las MSC alogénicas y las células de los islotes cultivadas contenidas en los neoislotes no provocan una respuesta de anticuerpos en los receptores
Fundamento lógico: Los ejemplos anteriores indican que los neoislotes descritos en la presente descripción pueden usarse de forma alogénica para restablecer la normoglucemia en animales diabéticos sin rechazo. El siguiente estudio se llevó a cabo para evaluar más a fondo si los animales tratados alogénicamente con neoislotes producen anticuerpos contra cualquiera de los tipos de células que componen los neoislotes.
Métodos
Los neoislotes de ratón se generaron a partir del cocultivo en recipientes de baja adherencia de células de islote P2 derivadas de ratones C57Bl/6 de tipo salvaje y MSC P5 derivadas de ratones C57Bl/6.
Prueba de respuesta de anticuerpos: Los sueros de prueba se incubaron tanto con: (a) 1X105 MSC C57Bl/6 gfp+, como con (b) 1X105 células de los islotes C57Bl/6 cultivadas durante 30 minutos. Los sueros de control positivo se incubaron con 1X105 ASC caninas. Después de la incubación con suero, las células se centrifugaron, se resuspendieron en tampón FACS y se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón marcado con ficoeritrina (PE) (Pharmingen, San Diego, CA). Las células se incubaron unos 20 minutos adicionales en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, se añadió un ml de PBS 1 x (Roche, Indianápolis, IN) BSA al 1 % (Sigma, St. Louis, MO). Las células se sometieron a agitación vorticial, luego se centrifugaron, se resuspendieron en tampón de fijación (formaldehído al 1 %) y se analizaron mediante FACS (BD FACScan Analyzer, San Jose, CA; conteo de 10 000 células).
Resultados
Los sueros se obtuvieron de:
(i) ratones NOD que habían sido tratados vía ip con 2X105 neoislotes/kg de peso corporal 12 semanas después del tratamiento con neoislote (ver Ejemplo 8),
(ii) ratones NOD que habían sido tratados vía ip con vehículo 12 semanas después del tratamiento con vehículo (ver Ejemplo 8), y
(iii) ratones NOD a los que no se les había infundido (ratones vírgenes).
Se incubaron MSC de ratón de neoislotes y células de los islotes de ratón de neoislotes con los sueros recolectados y luego con anticuerpo IgG anti-ratón marcado con ficoeritrina (PE). A continuación, las células expuestas al suero se analizaron mediante FACS como se describió anteriormente en Métodos para determinar si había algún anticuerpo IgG contra las MSC administradas o las células de los islotes en los sueros de los ratones tratados. Como se sabe que la administración xenogénica de las ASC provoca una respuesta inmunitaria, las ASC caninas que habían estado expuestas a sueros de ratones NOD 14 días después de la administración de ASC caninas se incubaron con anticuerpos IgG anti-ratón marcados con PE, se analizaron mediante FACS y se usaron como controles positivos.
Si los ratones tratados con neoislotes hubieran desarrollado una respuesta aloinmune a las MSC o a las células de los islotes en los neoislotes, entonces el anticuerpo IgG de ratón a marcado con PE se uniría a las células expuestas al suero y las células aparecerían desplazadas (Pe positivo) en el análisis FACS. Un cambio de > 7 % de las células (% de células positivas para la PE) en FACS se consideró una respuesta positiva de aloanticuerpos.
Como se muestra en las Figuras 22A-22C, los sueros de ratones alogénicos tratados con neoislotes no contenían anticuerpos IgG contra las MSC alogénicas de ratón (Figura 22A) o células de los islotes (Figura 22B). Además, estos datos sugieren que los sueros de ratones NOD tratados con vehículo no contenían anticuerpos IgG preformados contra las MSC o células de los islotes desdiferenciadas. Como se esperaba, los sueros de ratones tratados con ASC caninas (control positivo) contenían altos niveles de anticuerpos IgG contra las ASC caninas como se evidencia por un cambio en el 95 % de las células (Figura 22C).
Los ratones NOD no montan una respuesta IgG aloinmune a las MSC y las células de los islotes de los NI. Para examinar si las células de los islotes y las MSC contenidas en los NI están protegidas de un ataque inmunitario humoral, evaluamos si los sueros de ratones NOD normoglucémicos tratados con NI contenían anticuerpos IgG dirigidos contra las MSC o las IC cultivadas que se usaron para generar los NI administrados. Los sueros de ratones NOD normoglucémicos tratados con NI no contenían anticuerpos IgG dirigidos a las MSC ni a las IC cultivadas, mientras que la administración vía ip de cantidades idénticas de islotes alogénicos (C57Bl/6) recién aislados usadas como control positivo provocó una respuesta de anticuerpos robusta (Figura 23). La falta de una respuesta de anticuerpos IgG a las células que se usan para formar los Ni alogénicos, junto con el logro de la euglucemia a largo plazo, indica además que los NI, como se describe en la presente descripción, también proporcionan protección aloinmune humoral a sus células de los islotes y a componentes de las MSC.
Inhibición de la respuesta autoinmune. Crítico para tratar efectivamente la T1DM autoinmune con células productoras de insulina es el aislamiento autoinmune de esas células, y los resultados presentados en la Figura 9 implica que las IC dentro de los NI están protegidas del ataque autoinmune de los ratones NOD tratados. La destrucción autoinmune de células beta en ratones NOD está mediada, como en la T1DM humana, por células Th1 CD4+ autorreactivas, y se caracteriza por insulitis que involucra infiltración de islotes por macrófagos, células T CD4+ y CD8+. Se ha demostrado previamente que la administración de alo-ASC solas o con islotes alivia o previene la hiperglucemia en animales diabéticos y humanos en parte al promover la expansión de las células T reguladoras y suprimir la expansión de las células inmunitarias a través de la expresión Tgfb1 aquí confirmada (Figuras 3, 8A y 8B) y regulación positiva de IDO en perros (Figura 4C). Para explorar la posibilidad de que el componente M/ASC de los NI proteja las células de los islotes del ataque autoinmune del ratón NOD a través de mecanismos similares, examinamos un conjunto seleccionado de mecanismos inmunomoduladores de las MSC conocidos de la siguiente manera. Tratamos otro grupo de ratones NOD diabéticos ip con islotes C57Bl/6 alogénicos (N = 3) o con NI alogénicos (N = 3). Después de 14 días, tales ratones fueron sacrificados y se recogieron su sangre, páncreas, riñones, pulmones, bazos y omentos. El páncreas se examinó histológicamente y se demostró que mostraba insulitis como se esperaba. Los bazos se recogieron y analizaron mediante FACS para determinar los porcentajes de células positivas para CD3, CD4, CD8, FOXP3 y CD25. Los omentos recogidos se examinaron mediante IHC para detectar la presencia de células Foxp3+. El por ciento de células doble positivas CD3/CD4 y CD3/CD8 (linfocitos T auxiliares y citotóxicos) fue significativamente menor en las células de bazo de los ratones NOD tratados con NI frente a los tratados con islotes, mientras que el porcentaje de células doble positivas CD4/CD25 y células T reguladoras triple positivas CD4/CD25/Foxp3 aumentó significativamente en los bazos de ratones nOd tratados con NI frente a tratados con islotes (análisis FACS, Figura 24, Paneles a-d). De manera similar, el análisis IHC de los omentos de los ratones tratados con NI mostró un aumento significativo en el por ciento de células Foxp3 positivas frente a las de los ratones tratados con vehículo (Figura 24, Panel e). Si bien el número de animales analizados es pequeño, estos resultados concuerdan con los hallazgos de otros y con nuestra hipótesis de que los NI, y específicamente su componente M/ASC, promueven la euglucemia en ratones diabéticos T1 a través de la modulación de la respuesta autoinmune diabetogénica. Los omentos de los ratones anteriores también se tiñeron para Ki67 para examinar si había una división celular significativa asociada con los injertos de NI. Ninguno se encontró.
Conclusión: Los datos anteriores indican que la administración de neoislotes no provoca una respuesta de anticuerpos para ninguno de los tipos de células que componen el neoislote, lo que respalda aún más la hipótesis de que los neoislotes proporcionan aislamiento inmunológico y eliminan la necesidad de medicamentos antirrechazo y dispositivos de encapsulación.
Nuestros extensos datos in vitro e in vivo hasta la fecha y presentados anteriormente demuestran que el tratamiento de la T1DM experimental en ratones con neoislotes singénicos y alogénicos, y neoislotes de múltiples especies son capaces de restablecer la euglucemia efectivamente, es decir, tratar la T1DM, y esto durante el seguimiento a largo plazo. No se observaron eventos adversos, tal como la transformación oncogénica o mala diferenciación ectópica de neoislotes. Esta novedosa terapia puede usarse como tratamiento de la diabetes insulinodependiente tanto en animales de compañía (perros, gatos) como en humanos con diabetes mellitus tipo 1.
Ejemplo 5: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente y células de islote de una fuente alogénica. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 6: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas y MSC y/o ASC alogénicas
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes en donde las células madre y las células de los islotes tienen una fuente alogénica de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 7: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes xenogénicas y/o MSC y/o ASC alogénicas
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes en donde las células madre y/o las células de los islotes tienen una fuente xenogénica de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 8: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente y células de islote de una fuente alogénica. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 9: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas y MSC y/o ASC alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes en donde las células madre y las células de los islotes tienen una fuente alogénica de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 10: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes xenogénicas y/o MSC y/o ASC alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes en donde las células madre y/o las células de los islotes tienen una fuente xenogénica de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 11: Tratamiento de la Dabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes rediferenciadas y/o MSC y/o ASC alogénicas
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes en donde las células madre y/o las células de los islotes tienen una fuente alogénica de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente. Los neoislotes rediferenciados ex vivo. Los neoislotes rediferenciados se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 12: Tratamiento de la Diabetes Mellitus insulinodependiente mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes rediferenciadas y/o MSC y/o ASC alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes en donde las células madre y/o las células de los islotes tienen una fuente alogénica de un sujeto humano identificado que padece de Diabetes Mellitus insulinodependiente. Los neoislotes rediferenciados ex vivo. Los neoislotes rediferenciados resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Ejemplo 13: Tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas
La terapia con insulina se ha usado en pacientes que sufren de diabetes mellitus tipo 2, ver, por ejemplo, K. Horvath, K. Jeitler, A. Berghold, S.H. Ebrahim, T.W. Gratzer, J. Plank, T. Kaiser, T.R. Pieber y A. Siebenhofer, "Long-acting insulin analogues versus NPH insulin (human isophane insulin) for type 2 diabetes mellitus," Cochrane Database of Systematic Reviews 2007, Número 2, Núm. de artículo: CD005613, Do I: 10.1002/14651858.CD005613 pub3.
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC de un sujeto humano identificado que padece de diabetes mellitus tipo 2 y células de islote de una fuente alogénica. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado. Mientras tanto, el sujeto se trata con un fármaco hipoglucemiante oral e/o insulina.
Ejemplo 14: Tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas y MSC y/o ASC alogénicas
Los neoislotes que contienen células humanas se generan como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes donde las células madre y las células de los islotes son de una fuente alogénica de un sujeto humano identificado que padece diabetes mellitus tipo 2. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado. Mientras tanto, el sujeto se trata con un fármaco hipoglucemiante oral e/o insulina.
Ejemplo 15: Tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes xenogénicas y/o MSC y/o ASC alogénicas
Los neoislotes que contienen células humanas se generan como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes donde las células madre y/o las células de los islotes son de una fuente xenogénica de un sujeto humano identificado que padece diabetes mellitus tipo 2. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado. Mientras tanto, el sujeto se trata con un fármaco hipoglucemiante oral e/o insulina.
Ejemplo 16: Tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Se generan neoislotes que contienen células humanas como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC de un sujeto humano identificado que padece de diabetes mellitus tipo 2 y células de islote de una fuente alogénica. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado. Mientras tanto, el sujeto se trata con un fármaco hipoglucemiante oral e/o insulina.
Ejemplo 17: Tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes alogénicas y MSC y/o ASC alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Los neoislotes que contienen células humanas se generan como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes donde las células madre y las células de los islotes son de una fuente alogénica de un sujeto humano identificado que padece diabetes mellitus tipo 2. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado. Mientras tanto, el sujeto se trata con un fármaco hipoglucemiante oral e/o insulina.
Ejemplo 18: Tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 mediante el uso de neoislotes que contienen células de los islotes xenogénicas y/o MSC y/o ASC alogénicas y ASC y/o MSC adyuvantes
Los neoislotes que contienen células humanas se generan como se describió en los experimentos anteriores mediante el uso de ASC y/o MSC y células de los islotes donde las células madre y/o las células de los islotes son de una fuente xenogénica de un sujeto humano identificado que padece diabetes mellitus tipo 2. Los neoislotes resultantes se administran al sujeto, y también se administran al sujeto ASC/MSC humanas adyuvantes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado. Mientras tanto, el sujeto se trata con un fármaco hipoglucemiante oral e/o insulina.
Administración de neoislotes a un sujeto que padece diabetes mellitus insulinodependiente.
Los neoislotes generados como se describen en la presente descripción se administraron por vía intravenosa a un sujeto que padecía diabetes mellitus insulinodependiente. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Administración de neoislotes a un sujeto que padece diabetes mellitus tipo 2.
Los neoislotes generados como se describen en la presente descripción se administraron por vía intravenosa a un sujeto que padecía diabetes mellitus tipo 2. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Administración de neoislotes a un sujeto que padece diabetes mellitus insulinodependiente.
Los neoislotes generados como se describen en la presente descripción se administraron por vía subcutánea al sujeto que padecía diabetes mellitus insulinodependiente. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Administración de neoislotes a un sujeto que padece diabetes mellitus insulinodependiente.
Los neoislotes generados como se describen en la presente descripción se administraron por vía subcutánea al sujeto que padecía diabetes mellitus tipo 2. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Tratamiento de la Prediabetes Mellitus mediante el uso de neoislotes
Los neoislotes generados como se describen en la presente descripción se administraron al sujeto que sufría de intolerancia a la glucosa o prediabetes. Varias semanas después del tratamiento, el sujeto muestra un control glucémico mejorado.
Referencias.
1. Hara M., X. Wang, T. Kawamura, V.P. Bindokas, R.F. Dizon, S.Y. Alcoser, M.A. Magnuson y G.I. Bell: Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta-cells. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.
284: E177-E183, 2003.
2. Zhou X., K. Merchak, W. Lee, J.P. Grande, M. Cascalho y J.L. Platt: Cell Fusion Connects Oncogenesis with Tumor Evolution. Am. J. Pathol. 185: 2049-60, 2015.
3. DelaRosa O., B. Sánchez-Correa, S. Morgado, C. Ramírez, B. del Rio, R. Menta, E. Lombardo, R. Tarazona y J.G. Casado: Human Adipose-Derived Stem Cells Impair Natural Killer Cell Function and Exhibit Low Susceptibility to Natural Killer-Mediated Lysis. Stem Cells Dev. 21: 1333-1343, 2012.
4. Burr S.P., F. Dazzi, O. Garden: Mesenchymal stromal cells and regulatory T cells: the Yin and Yang of peripheral tolerance? Immunol. Cell Biol. 91: 12-8, 2013.
5. English K: Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol. Cell Biol. 91: 19-26, 2012.
6. Kim Y.-H., Y.-M. Wee, M.-Y. Choi, D.-G. Lim, S.-C. Kim, D.-J. Han: Interleukin (IL)-10 induced by CD11b(+) cells and IL-10-activated regulatory T cells play a role in immune modulation of mesenchymal stem cells in rat islet allografts. Mol. Med. 17: 697-708, 2011.
7. Spaggiari G.M., L. Moretta: Cellular and molecular interactions of mesenchymal stem cells in innate immunity. Immunol. Cell Biol. 91: 27-31, 2013.
8. Le Blanc K., L.C. Davies: Mesenchymal stromal cells and the innate immune response. Immunol. Lett. in press: 15 de mayo de 2015. pii: S0165-2478(15)00072-3. doi: 10.1016/j.imlet.2015.05.004. [publicado en línea antes de la impresión].
9. Plock J.A., J.T. Schnider, W. Zhang, R. Schweizer, W. Tsuji, N. Kostereva, P.M. Fanzio, S. Ravuri, M.G. Solari, H.-Y. Cheng, P.J. Rubin, K.G. Marra, V.S. Gorantla: Adipose- and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Prolong Graft Survival in Vascularized Composite Allotransplantation. Transplantation 99(9): 1765-73: 2015.
10. Vrabelova D., C.A. Adin, A. Kenzig, C. Gilor, F. Xu, J.L. Buss, A. Rajab: Evaluation of a high-yield technique for pancreatic islet isolation from deceased canine donors. Domest. Anim. Endocrinol. 47: 119-26, 2014.
11. Woolcott O.O., R.N. Bergman, J.M. Richey, E.L. Kirkman, L.N. Harrison, V. Ionut, M. Lottati, D. Zheng, I.R. Hsu, D. Vski, M. Kabir, S.P. Kim, K.J. Catalano, J.D. Chiu y R.H. Chow: Simplified method to isolate highly pure canine pancreatic islets. Pancreas 41: 31-8, 2012.
12. Lange C., F. Togel, H. Ittrich, F. Clayton, C. Nolte-Ernsting, A.R. Zandery C. Westenfelder: Las células madre mesenquimales administradas mejoran la recuperación de la insuficiencia renal aguda inducida por isquemia/reperfusión en ratas. Kidney Int. 68: 1613-7, 2005.
13. Togel F., Z. Hu, K. Weiss, J. Isaac, C. Lange y C. Westenfelder: Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 289: F31-42, 2005.
14. Togel F., K. Weiss, Y. Yang, Z. Hu, P. Zhang y C. Westenfelder: Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol.
292: F1626-35, 2007.
15. Pittenger M.F., A.M. Mackay, S.C. Beck, R.K. Jaiswal, R. Douglas, J.D. Mosca, M.A. Moorman, D.W. Simonetti, S. Craig y D.R. Marshak: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-7, 1999.
16. Crop M.J., C.C. Baan, S.S. Korevaar, J.N.M. IJzermans, I.P.J. Alwayn, W. Weimar y M.J. Hoogduijn: Donor-Derived Mesenchymal Stem Cells Suppress Alloreactivity of Kidney Transplant Patients. Transplantation 87: 896­ 906, 2009.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la generación de un conglomerado de células, el método comprende:
a. desdiferenciar las células de los islotes por proliferación in vitro para obtener células de los islotes desdiferenciadas,
b. opcionalmente hacer proliferar aún más las células de los islotes desdiferenciadas,
c. colocar las células desdiferenciadas de los islotes en cultivo con células madre mesenquimales y/o células madre derivadas de tejido adiposo, y
d. cocultivar las células de los islotes desdiferenciadas con las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo en una superficie hidrófoba, lo que forma de esta manera el conglomerado de células de las células de los islotes desdiferenciadas y las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo,
en donde las células de los islotes desdiferenciadas se caracterizan por una expresión de insulina, síntesis de insulina, almacenamiento de insulina y/o secreción de insulina inducida por glucosa significativamente reducidas en comparación con las células de los islotes recién aisladas, y en donde las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo son células madre adultas indiferenciadas que proliferan y no producen insulina.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo proliferan durante hasta 4 pases antes de cocultivarlas con las células de los islotes desdiferenciadas.
3. Una composición que comprende un conglomerado de células que puede obtenerse mediante un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el conglomerado de células comprende células de los islotes desdiferenciadas que se caracterizan por una expresión de insulina, síntesis de insulina, almacenamiento de insulina y/o secreción de insulina inducida por glucosa significativamente reducidas en comparación con células de los islotes recién aisladas.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende adicionalmente un hidrogel.
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde la composición está encapsulada.
6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 -5 para su uso en un tratamiento médico de un sujeto.
7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el tratamiento médico es el tratamiento de la diabetes mellitus.
8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la diabetes mellitus es diabetes mellitus Tipo I o diabetes mellitus Tipo II o diabetes mellitus asociada con cáncer de páncreas o pancreatitis.
9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el tratamiento comprende la administración parenteral, intraperitoneal o subcutánea o la administración en la vena porta del hígado.
10. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde las células de los islotes de la composición son alogénicas para el sujeto.
11. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 - 10, en donde las células madre mesenquimales y/o las células madre derivadas de tejido adiposo son alogénicas para el sujeto.
12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en donde la composición es xenogénica para el sujeto.
13. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-12, en donde el tratamiento comprende una etapa en donde se trata con rapamicina un rechazo prematuro de las células de los islotes.
14. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-13, en donde el tratamiento comprende el control de los niveles de glucosa en sangre del sujeto mediante la administración de inyecciones de insulina y/o con un fármaco oral.
ES16845186T 2015-09-10 2016-09-09 Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos Active ES2939816T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562216920P 2015-09-10 2015-09-10
US201562264238P 2015-12-07 2015-12-07
PCT/US2016/051105 WO2017044847A1 (en) 2015-09-10 2016-09-09 Neo-islets comprising stem and islet cells and treatment of diabetes mellitus therewith

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2939816T3 true ES2939816T3 (es) 2023-04-27

Family

ID=58236772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16845186T Active ES2939816T3 (es) 2015-09-10 2016-09-09 Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11485954B2 (es)
EP (2) EP3347027B1 (es)
JP (2) JP6771567B2 (es)
CA (1) CA2995599C (es)
DK (1) DK3347027T3 (es)
ES (1) ES2939816T3 (es)
FI (1) FI3347027T3 (es)
PT (1) PT3347027T (es)
WO (1) WO2017044847A1 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9878071B2 (en) 2013-10-16 2018-01-30 Purdue Research Foundation Collagen compositions and methods of use
WO2016172365A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Purdue Research Foundation Office Of Technology Commercialization Cell-collagen-silica composites and methods of making and using the same
ES2939816T3 (es) * 2015-09-10 2023-04-27 Symbiocelltech Llc Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos
US11739291B2 (en) 2017-04-25 2023-08-29 Purdue Research Foundation 3-dimensional (3D) tissue-engineered muscle for tissue restoration
CA3071159A1 (en) * 2017-07-25 2019-01-31 Purdue Research Foundation Collagen encapsulation of insulin-producing cells
CN110862955B (zh) * 2018-08-27 2022-07-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于器官芯片的胰岛病理模型建立方法
JP7431247B2 (ja) 2019-08-23 2024-02-14 富士フイルム株式会社 ミクロカプセルと細胞構造体とを含む組成物
CN111269888B (zh) * 2020-03-24 2022-04-08 山东兴瑞生物科技有限公司 一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞、制备方法及其应用
CA3207286A1 (en) * 2021-02-03 2022-08-11 Symbiocelltech, Llc Cell clusters comprising stem and islet cells, methods of making, and treatment of diabetes mellitus therewith

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2593549C (en) 2005-01-07 2016-04-26 Wake Forest University Health Sciences Regeneration of pancreatic islets by amniotic fluid stem cell therapy
WO2008036349A2 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Insugen, Llc Fused stem cells useful for the treatment of diabetes and methods thereof
US20110045077A1 (en) * 2006-11-13 2011-02-24 Gordon Weir Encapsulated pancreatic islet cell products and methods of use thereof
WO2011049524A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Cell culture/handling product and method for production and use thereof
US8900860B2 (en) 2009-11-30 2014-12-02 National Yang-Ming University Method for expanding mesenchymal stem cells in low-density and hypoxic culture
US20130095081A1 (en) 2010-04-20 2013-04-18 Keith Leonard March Compositions and methods of treatment with stem cells
WO2012112982A2 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Hydrogel encapsulated cells and anti-inflammatory drugs
WO2012129513A2 (en) * 2011-03-23 2012-09-27 University Of Florida Research Foundation, Inc. Blockage of pai-1 in diabetic cd34+ stem cells corrects cellular dysfunction
US9109042B2 (en) * 2011-05-08 2015-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. Delaying the progression of diabetes
JP6063613B2 (ja) * 2011-08-09 2017-01-18 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド ベータ細胞の分化およびインスリン産生を促進するためのｍｉＲ−７のダウンレギュレーション
WO2015058139A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-23 Symbiocelltech, Llc Stem cell / islet cell hybrids, generation thereof, and methods for the treatment and cure of insulin-dependent diabetes mellitus
ES2939816T3 (es) * 2015-09-10 2023-04-27 Symbiocelltech Llc Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos

Also Published As

Publication number Publication date
DK3347027T3 (da) 2023-03-06
JP2018530603A (ja) 2018-10-18
PT3347027T (pt) 2023-03-15
US20170073641A1 (en) 2017-03-16
EP3347027A4 (en) 2019-02-06
US11485954B2 (en) 2022-11-01
EP3347027B1 (en) 2023-02-15
CA2995599C (en) 2021-07-27
CA2995599A1 (en) 2017-03-16
EP3347027A1 (en) 2018-07-18
JP6771567B2 (ja) 2020-10-21
EP4201413A1 (en) 2023-06-28
US20230033991A1 (en) 2023-02-02
WO2017044847A1 (en) 2017-03-16
JP2020111619A (ja) 2020-07-27
FI3347027T3 (fi) 2023-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2939816T3 (es) Neoislotes que comprenden células madre y de islotes y el tratamiento de la diabetes mellitus con los mismos
Lysy et al. Concise review: pancreas regeneration: recent advances and perspectives
CA2593549C (en) Regeneration of pancreatic islets by amniotic fluid stem cell therapy
AU778929B2 (en) Pancreatic stem cells and their use in transplantation
JP2005533746A (ja) ランゲルハンス島の幹細胞および真性糖尿病の処置におけるその使用
Rafael Cell Transplantation and Immunoisolation: Studies on a macroencapsulation device
Paek et al. Adipose stem cell-based regenerative medicine for reversal of diabetic hyperglycemia
Kuppan et al. Co‐transplantation of human adipose‐derived mesenchymal stem cells with neonatal porcine islets within a prevascularized subcutaneous space augments the xenograft function
Cunha et al. Stem-cell-based therapies for improving islet transplantation outcomes in type 1 diabetes
Zhang et al. Insulin‐producing cells derived from rat bone marrow and their autologous transplantation in the duodenal wall for treating diabetes
Mabed The potential utility of bone marrow or umbilical cord blood transplantation for the treatment of type I diabetes mellitus
Yamaoka Regeneration therapy for diabetes mellitus
US20240084261A1 (en) Cell Clusters Comprising Stem and Islet Cells, Methods of Making, and Treatment of Diabetes Mellitus Therewith
US20190000889A1 (en) Methods for treating diabetes
US11951136B2 (en) Preservation of pancreatic islet grafts in the extrahepatic space
Deb et al. The role of stem cells in the treatment of type 1 diabetes mellitus and associated complications
Lei et al. Clinical Trials with Stem Cell-Derived Insulin-Producing Cells
Messaggio et al. Phenotype plasticity of mesenchymal stem cells from Lipostem™-derived human adipose tissue
Raspa et al. Expression of surface and intracellular specific markers by human stem cells derived from Lipostem™-treated adipose tissue
Tuch et al. Human trials with microencapsulated insulin-producing cells: Past, present and future
Rosca et al. Current trends in diabetes mellitus-pancreatic beta cell regeneration and replication in rats.
Dave Stem Cells Derived Insulin-Secreting Cells for Insulin-Dependent Diabetes Mellitus: Exploiting Laboratory Discoveries
Sörenby Strategies to improve macroencapsulated islet graft survival
Kerby downloaded from the King’s Research Portal at https://kclpure. kcl. ac. uk/portal
Pugazhenthi et al. Islet Cell Biology, Regeneration, and Transplantation