KR102015197B1 - 대상체에서의 혈관신생을 유도하기 위한 10000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란의 용도 - Google Patents

대상체에서의 혈관신생을 유도하기 위한 10000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란의 용도 Download PDF

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Abstract

본 실시형태는 대상체에서 혈관신생을 유도하고, 허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키기 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란의 용도에 관한 것이다.

Description

대상체에서의 혈관신생을 유도하기 위한 10000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란의 용도{THE USE OF DEXTRAN SULFATE HAVING AN AVERAGE MOLECULAR WEIGHT BELOW 10000 DA FOR INDUCING ANGIOGENISIS IN A SUBJECT}
본 실시형태는 일반적으로 혈관신생(angiogenesis), 및 특히 대상체에서의 혈관신생을 유도하기 위한 황산덱스트란의 용도에 관한 것이다.
혈관신생은 이미 기존의 혈관으로부터의 새로운 혈관이 형성되는 생리학적 과정이다. 이것은 중배엽 세포 전구체로부터 내피 세포의 신생(de novo) 형성인 혈관형성(vasculogenesis)과 구별된다. 발생 배아에서의 처음의 혈관은 혈관형성을 통해 형성되고, 이후 혈관신생은 발생 동안 및 질환에서 모두는 아니지만 대부분의 혈관 성장을 담당한다.
혈관신생은 성장 및 발달에서, 그리고 상처 치유 및 과립화 조직의 형성에서 일반적이고 중요한 과정이다.
혈관신생은 전통적으로 스프라우팅 혈관신생(sprouting angiogenesis) 또는 중적(intussusception) 또는 분열 혈관신생(splitting angiogenesis)으로 분류된다. 스프라우팅 혈관신생은 완전히 새로운 혈관을 형성하지만, 분열 혈관신생은 기존의 혈관을 2개로 분열시킨다.
혈관신생은 불량한 혈관화 또는 비정상 맥관구조를 특징으로 하는 질환과 싸우기 위한 표적일 수 있다. 복구하는 또는 그렇지 않으면 대사상 활성인 조직에서의 혈관의 부재는 복구 또는 다른 필수 기능을 저해할 수 있다. 허혈성 만성 상처와 같은 몇몇 질환은 실패 또는 불충분한 혈관 형성의 결과이고, 혈관의 국소 팽창에 의해 치료될 수 있어서, 그 부위에 새로운 영양소를 주어, 복구를 촉진한다.
혈관신생의 원칙의 현대의 임상 분야는 2개의 주요 분야로 분할될 수 있다: 혈관신생방지 치료 및 혈관신생촉진 치료. 혈관신생방지 치료가 증식하기 위해 산소 및 영양소의 풍부함을 요하는 암 및 악성종양을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있지만, 혈관신생촉진 치료는 예를 들어 심혈관 질환, 관상 동맥 질환, 죽상동맥경화성 질환, 관상동맥 심장 질환, 말초 동맥 질환, 상처 치유 장애 등을 치료하는 옵션으로서 탐구되었다.
혈관신생촉진 치료에서의 전통적인 접근법은 무엇보다도 증폭 또는 저해를 위한 관심 있는 유전자를 표적화하는 유전자 치료; 혈관신생 성장 인자를 주조 조작하는 단백질 치료; 및 특이적 세포 유형의 이식을 포함하는 세포 기반 치료를 포함한다.
유전자 치료와 관련하여 여전히 심각하고 해결되지 않은 문제점이 존재한다. 어려움은 표적 세포의 게놈으로의 치료학적 유전자의 효과적인 통합, 유전자를 이식하는 데 사용되는 바이러스 벡터와 관련된 원치않는 면역 반응, 잠재적 독성, 면역원성, 염증성 반응 및 발암성의 위험의 감소, 및 혈관신생의 유전자 기준의 순수한 복잡함을 포함한다.
혈관신생촉진 단백질 치료는 혈관신생을 촉진하기 위해 다양한 성장 인자, 예컨대 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF) 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)를 사용한다. 단백질 치료의 장애는 전달 방식이다. 치료학적 단백질이 표적 조직에 진입할 수 있기 전에 대사되거나 없어질 수 있으므로, 단백질 투여의 경구, 정맥내, 동맥내 또는 근육내 경로가 항상 효과적인 것은 아니다. 세포 기반 혈관신생촉진 치료는 최고의 세포 유형 및 사용되는 투약량에 관한 많은 해결되지 않은 질문과 함께 여전히 조사의 초기 단계에 있다.
허혈은 조직에 대한 혈액 공급의 제한이어서, 세포 대사에 필요한 산소 및 포도당이 부족하게 한다. 허혈은 일반적으로 혈관에 의한 문제로 야기되고, 이로 인해 조직의 손상 또는 기능이상이 생긴다. 이것은 또한 때때로 혈관수축, 혈전증 또는 색전증과 같은 울혈로부터 생긴 소정의 신체 부분에서의 국소적인 빈혈 및 저산소증을 의미한다.
연장된 허혈의 기간 후 관상동맥 혈류의 복원이 대개, 내피 손상 및 응고촉진 및 염증촉진 표현형에서 띠는 이환된 내피를 발생시키는, 소위 재관류 손상을 포함한다. 재관류는 허혈 유도 보체 활성화 및 침착을 크게 가속화한다.
황산덱스트란은 널리 공지된 보체 저해제이고, 따라서 허혈 이후 재관류 손상에 대한 내피의 세포보호를 달성하도록 제안되었다.
문헌[Experimental Cell Research 215, 294-302 (1994)]은 황산화 다당류, 예컨대 헤파린 및 황산덱스트란이 콜라겐 유도 혈관 형성을 위해 시험관내 사용될 수 있다는 것을 개시한다. 그러나, 생체내 실험 데이터는 저분자량 황산화 다당류 헤파린(2.4kDa)이 혈관신생을 저해한다는 것을 나타낸다, Glycobiology 3, 567-573 (1993), Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23, 141-149 (1993).
미국 특허 제5,135,920호는 500,000Da의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란이 혈관신생저해성이라는 것, 즉 혈관신생을 저해한다는 것을 개시한다.
당해 분야에서 혈관신생의 분야 내에 여전히 개선의 여지가 존재한다.
대상체에서 혈관신생을 유도하는 것이 일반적인 목적이다.
허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키는 것이 또 다른 목적이다.
이들 목적 및 다른 목적은 본 명세서에 개시된 바와 같은 실시형태에 의해 충족된다.
실시형태의 양태는 대상체에서의 혈관신생을 유도하기 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 관한 것이다.
실시형태의 또 다른 양태는 대상체에서 혈관신생을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태의 추가의 양태는 대상체에서의 혈관신생을 유도하는 약제의 제조를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 용도에 관한 것이다.
실시형태의 여전히 또 다른 양태는 허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키기 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 관한 것이다.
실시형태의 추가의 양태는 허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태의 훨씬 또 다른 양태는 허혈을 겪는 대상체에서의 혈류를 증가시키는 약제의 제조를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 용도에 관한 것이다.
실시형태의 여전히 또 다른 양태는 대상체에서의 허혈성 조직을 혈관화하기 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 관한 것이다.
실시형태의 추가의 양태는 대상체에서의 허혈성 조직을 혈관화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태의 훨씬 또 다른 양태는 대상체에서 허혈성 조직을 혈관화하는 약제의 제조를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 용도에 관한 것이다.
실시형태의 추가의 양태는 장기 및/또는 혈관화된 조직에서 혈관신생을 유도하는 데 있어서의 시험관내 또는 생체외 용도를 위한, 혈관화된 조직 및/또는 장기에서 혈류를 증가시키는 데 있어서의 시험관내 또는 생체외 용도를 위한 및/또는 혈관화된 조직 및/또는 장기를 시험관내 또는 생체외 혈관화하기 위한, 10,000Da 이하의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체, 및 이에 대한 관련 방법에 관한 것이다.
실시형태는, 이의 추가의 목적 및 이점과 함께, 첨부한 도면과 함께 취해지는 하기 설명을 참조함으로써 최고로 이해될 수 있고, 여기서
도 1은 마우스 중증 사지 허혈 모델에 걸친 평균 체중을 예시하는 다이어그램이다. 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니(Bonferroni) 사후 비교는 군 사이의 통계적 유의차를 나타내지 않았다.
도 2는 마우스 중증 사지 허혈 모델에 걸친 연구군에 의한 평균 혈류를 예시하는 다이어그램이다. 반복 측정을 위한 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 사후 시험을 수행하였다. 황산덱스트란 치료군 2M, 3M 및 4M과 대조군 1M의 비교는 35일에 걸쳐 14일 및 21일에 통계적 유의차를 나타냈다(p<0.001).
도 3은 FITC 표지된 덱스트란(DA)에 의한 이중 염색 후 중증 사지 허혈 연구를 통한 군의 CD34 모세혈관 밀도를 예시하는 다이어그램이다. 기능적 모세혈관을 나타내는 DA 막대. 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 다중 비교를 사용하여 수행된 통계 분석.
도 4는 FITC 표지된 덱스트란(DA)에 의한 이중 염색 후 중증 사지 허혈 연구를 통한 군에서의 허혈성 사지 및 비허혈성 사지의 CD34 모세혈관 밀도를 비교하는 다이어그램이다. 기능적 모세혈관을 나타내는 DA 막대. 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 다중 비교를 사용하여 수행된 통계 분석.
도 5A 내지 도 5C는 중증 사지 허혈 연구에서의 군(도 5A - 1M 비히클 대조군으로부터의 마우스; 도 5B - 반복된 황산덱스트란 30㎎/㎏ 3M 군으로부터의 마우스; 도 5C - 단일 황산덱스트란 30㎎/㎏ 4M 군으로부터의 마우스)의 CD34 모세혈관 밀도를 예시한다. 왼쪽 다이어그램은 CD34 염색을 예시하고, 오른쪽 다이어그램은 FITC 표지된 덱스트란 염색을 예시한다.
도 6은 황산덱스트란에 의해 치료된 HLI 손상된 동물에서의 사지 기능 점수를 예시하는 다이어그램이다. 0일에, HLI는 대퇴 동맥의 결찰 및 절제에 의해 유도되었다. 치료는 비히클 또는 10 또는 30㎎/㎏의 황산덱스트란의 1주 1회(1x/w) 또는 1주 3회(3x/w)에 의해 8일에 시작하였다. 사지 점수는 0-3의 등급 매겨지고, 3은 최악(발의 끌기)이었다. 황산덱스트란은, 2방향 ANOVA에 의해 계산된 바대로, 21일로부터(7일, 14일, 21일, 28일 및 35일 분석) 상당한 개선을 유도하였다.
도 7은 내피 마커 평활근 액틴(SMA)의 중증 사지 허혈 연구에서의 군의 모세혈관 밀도를 예시하는 다이어그램이다. 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 다중 비교에 따른 통계 유의성.
도 8은 왼쪽 뒷다리의 대퇴 동맥 결찰 후 35일에 비접촉 레이저 도플러 영상에 의해 2마리의 마우스에서 측정된 혈류를 비교한다. 하부 패널은 비히클 치료되고(1M 군), 상부 패널은 황산덱스트란에 의해 치료를 받았다(3M 군).
도 9는 tMCAO 속도-뇌졸중 연구에 사용된 군에서의 체중의 분포를 예시한다.
도 10은 tMCAO 속도-뇌졸중 연구를 통한 치료군에 의한 신경점수(Neuroscore)를 예시한다.
도 11은 tMCAO 속도-뇌졸중 연구를 통한 치료군에 의한 보행 시험을 예시한다.
도 12는 tMCAO 속도-뇌졸중 연구를 통한 치료군에 의한 앞다리 배치 시험을 예시한다.
도 13은 tMCAO 속도-뇌졸중 연구를 통한 치료군에 의한 신체 흔들림 시험 델타(왼쪽 회전-오른쪽 회전)를 예시한다.
도 14는 29일에 비히클 대조군과 비교하여 황산덱스트란 군 둘 다에서 뇌 혈류 비율 및 혈관 평균 직경의 변화(%)를 예시한다.
도 15는 30일에 비히클 대조군과 비교하여 매일 황산덱스트란 15㎎/㎏에 의해 치료된 래트(rat)에서의 SMA 모세혈관 밀도를 예시한다.
도 16은 30일에 비히클 대조군에 대한 황산덱스트란 치료군에서의 GFAP 구역(x10 필드당 제곱 마이크론의 양성 세포의 구역)을 예시한다.
도 17A 및 도 17B는 비히클 대조군(도 17A) 및 황산덱스트란(15㎎/㎏, 매일) 군(도 17B)으로부터의 래트에 대한 모세혈관 밀도에 대한 치료 효과를 예시한다.
도 18은 MI 유도 후 35일에 경색부 크기를 예시한다.
도 19는 황산덱스트란 치료(3주 동안 1주 3회 15㎎/㎏) 및 비히클 대조군에 대한 MI 유도 후 35일에 SMA 염색을 비교한다.
도 20A 내지 도 20C는 2마리의 황산덱스트란 치료된(3주 동안 1주 3회 15㎎/㎏) 래트(도 20A, 도 20B) 및 1마리의 비히클 대조군 래트(도 20C)에 대한 혈관 밀도에 대한 SMA 염색을 예시한다.
도 21은 래트 HLI 모델에서의 평균 혈류를 예시한다.
도 22는 래트 HLI 모델에서의 사지 점수를 예시한다.
도 23은 HLI-손상 다리에서의 SMA 및 8 인자 모세혈관 밀도를 예시한다.
도 24는 HLI-손상 다리에서의 혈관조영술 모세혈관 점수를 예시한다.
도 25A 내지 도 25D는 비히클 대조군 동물(도 25A) 및 치료군 2M, 3M 및 4M에서의 동물(도 25B 내지 도 25D)의 혈관조영술 모세혈관 영상을 예시한다.
모든 도면은 평균 + 평균의 표준 오차를 나타낸다.
본 실시형태는 일반적으로 혈관신생, 및 특히 대상체에서의 혈관신생을 유도하기 위한 황산덱스트란의 용도에 관한 것이다.
본 실시형태는 특정한 평균 분자량 내의 황산덱스트란이 대상체, 바람직하게는 포유류 대상체, 및 더 바람직하게는 인간 대상체에게 투여될 때 혈관신생 유도 효과 및 혈류 증가 효과를 가진다는 발견에 기초한다.
실시형태의 황산덱스트란의 이 효과는, 황산화 다당류가 생체내 혈관신생을 저해하고, 500,000Da의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란이 혈관신생저해성이라는 것, 즉 혈관신생을 저해한다는 것을 개시하는 선행 기술의 견지에서 매우 놀랍다.
본 명세서에 제시된 바와 같은 실험 데이터는, 실시형태의 황산덱스트란이 평균 혈류를 상당히 증가시키고, 허혈 중증도를 감소시키고, 허혈 모델 및 뇌졸중 모델에서 모세혈관 밀도를 증가시키고, 심근 경색(myocardial infarction; MI) 모델에서 경색부 크기를 감소시킴으로써 볼 수 있는 것처럼 혈관신생을 유도하는 데 있어서 생체내 효과를 가진다는 것을 명확히 반대로 보여준다. 실시형태의 황산덱스트란은 게다가, 비허혈성 조직에서 어떠한 상당한 혈관 형성을 발생시키지 않으면서, 허혈성 조직에서 혈관을 선택적으로 형성할 수 있다.
따라서, 실시형태의 양태는 대상체에서 혈관신생을 유도하기 위한 용도를 위한, 10,000 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 관한 것이다.
하기에서, 황산덱스트란의 (평균) 분자량 및 황 함량에 대한 언급은 황산덱스트란의 임의의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 또한 적용된다. 그러므로, 황산덱스트란의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 바람직하게는 하기 실시형태에 기재된 바와 같은 평균 분자량 및 황 함량을 가진다.
실시형태의 범위 밖의 황산덱스트란은 열악한 혈관신생 효과를 가지거나 실제로 혈관신생 효과를 결코 가지지 않는 것으로 생각된다. 예를 들어, 2.4kDa의 평균 분자량을 가지는 또 다른 황산화 다당류인 헤파린은 실제로 더 큰 황산덱스트란 분자가 그런 것처럼 혈관신생을 저해하였다(Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23, 141-149 (1993); 미국 특허 제5,135,920호).
게다가, 10,000Da 초과의 분자량의 황산덱스트란은 일반적으로, 더 낮은 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란과 비교하여, 부작용에 대한 더 낮은 효과 프로필을 가진다. 이것은 대상체에게 안전하게 투여될 수 있는 황산덱스트란의 최대 용량이, 더 큰 황산덱스트란 분자(10,000Da 초과)에 대해, 본 범위 내의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 분자과 비교하여 더 낮다는 것을 의미한다. 그 결과, 황산덱스트란이 생체내 대상체에게 투여될 때, 이러한 더 큰 황산덱스트란 분자가 임상 용도에서 덜 적절하다. 또한, 큰 황산덱스트란 분자는, 미국 특허 제5,135,920호로부터 입증되는 바대로, 실시형태의 황산덱스트란과 비교하여 사실 반대 효과를 가진다.
따라서, 황산덱스트란이 대상체에게 투여될 때 혈관신생 효과를 가지고, 실시형태의 범위 밖의 황산덱스트란 분자가 혈관신생 저해 효과를 가지지 않거나 실제로 가지는, 황산덱스트란의 평균 분자량과 관련하여 매우 좁은 범위가 있는 것으로 보인다.
황산덱스트란은 황산화 다당류 및 특히 황산화 글루칸, 즉 많은 포도당 분자로 이루어진 다당류이다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 평균 분자량은 개별 황산화 다당류가 이 평균 분자량과 다른 분자량을 가질 수 있지만, 평균 분자량이 황산화 다당류의 평균 분자량을 나타낸다는 것을 의미한다. 이것은 황산덱스트란 샘플에 대한 이 평균 분자량 주위의 분자량의 자연 분포가 있을 것이라는 것을 추가로 암시한다.
황산덱스트란의 평균 분자량(Mw)은 통상적으로 간접 방법, 예컨대 겔 배제/침투 크로마토그래피, 광 산란 또는 점도를 사용하여 결정된다. 이러한 간접 방법을 사용한 평균 분자량의 결정은 칼럼 및 용리제의 선택, 유속, 보정 절차 등을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.
평균 분자량(Mw):
Figure 112017003107665-pct00001
, 숫자 값 이외의 분자 크기에 민감한 방법, 예를 들어 광 산란 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법에 통상적. 정상 분포가 추정되는 경우, Mw의 각각의 말단에서의 동일한 중량, 즉 Mw 미만의 분자량을 가지는 샘플에서의 황산덱스트란 분자의 전체 중량은 Mw 초과의 분자량을 가지는 샘플에서의 황산덱스트란 분자의 전체 중량과 동일하다.
일 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 2,000 내지 10,000Da의 범위 내의 평균 분자량을 가진다. 또 다른 실시형태에서, 평균 분자량은 2,500 내지 10,000Da의 범위 내이다. 특정한 바람직한 실시형태에서, 평균 분자량은 3,000 내지 10,000Da의 범위 내이다.
임의의, 그러나 바람직한 실시형태에서, 40% 미만의 황산덱스트란 분자는 3,000Da 미만의 분자량을 가지고, 바람직하게는 35% 미만, 예컨대 30% 미만 또는 25% 미만의 황산덱스트란 분자는 3,000Da 미만의 분자량을 가진다. 또한, 또는 대안적으로, 20% 미만의 황산덱스트란 분자는 10,000Da 초과의 분자량을 가지고, 바람직하게는 15% 미만, 예컨대 10% 미만 또는 5% 미만의 황산덱스트란 분자는 10,000Da 초과의 분자량을 가진다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 황산덱스트란은 평균 분자량 주위의 실질적으로 좁은 분자량 분포를 가진다.
특정한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 평균 분자량은 3,500 내지 9,500Da의 범위 내, 예컨대 3,500 내지 8,000Da의 범위 내이다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 평균 분자량은 4,500 내지 7,500Da의 범위 내이다.
추가의 특정한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 평균 분자량은 4,500 내지 5,500Da의 범위 내이다.
따라서, 현재에 바람직한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 평균 분자량은 바람직하게는 대략 5,000Da이거나, 적어도 실질적으로 5,000Da에 가깝고, 예컨대 5,000±500Da, 예를 들어 5,000±400Da, 바람직하게는 5,000±300Da 또는 5,000±200Da, 예컨대 5,000±100Da이다. 그러므로, 일 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 평균 분자량은 4.5kDa, 4.6kDa, 4.7kDa, 4.8kDa, 4.9kDa, 5.0kDa, 5.1kDa, 5.2kDa, 5.3kDa, 5.4kDa 또는 5.5kDa이다.
특정한 실시형태에서, 상기 제시된 바와 같은 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 유도체의 평균 분자량은 평균 Mw이고, 바람직하게는 겔 배제/침투 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 광 산란 또는 점도 기반 방법에 의해 결정된다.
특정한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 평균 약 5 또는 약간 이것 초과의 포도당 단위로 이루어지고, 포도당 단위당 적어도 2.0, 예컨대 적어도 2.5의 평균 설페이트 수를 가진다.
황산덱스트란은 덱스트란의 다음이온성 유도체이고 황을 함유한다. 실시형태의 황산덱스트란에 대한 평균 황 함량은 바람직하게는 15 내지 20% 및 더 바람직하게는 대략 17%이어서, 일반적으로 글루코실 잔기마다 약 2개의 설페이트기에 상응한다. 특정한 실시형태에서, 황산덱스트란의 황 함량은 바람직하게는 덱스트란 분자의 황 함량의 최대 가능한 정도이거나 적어도 이에 가깝다.
특정한 실시형태에서, 실시형태의 황산덱스트란은 핵자기공명(NMR) 분광학에 의해 측정된 바대로 1,850 내지 2,000Da의 간격 내의 수 평균 분자량(Mn)을 가진다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 실시형태의 황산덱스트란은 평균 5.1의 포도당 단위 및 포도당 단위당 2.6 내지 2.7의 평균 설페이트 수를 가져서, 통상적으로 핵자기공명(NMR) 분광학에 측정된 바대로 1,850 내지 2,000Da의 간격 내의 수 평균 분자량(Mn)을 생성시킨다.
수 평균 분자량(Mn):
Figure 112017003107665-pct00002
; 말단 기 검정, 예를 들어 NMR 분광학 또는 크로마토그래피에 의해 통상적으로 도출됨. 정상 분포가 추정되는 경우, 동일한 수의 황산덱스트란 분자가 Mn의 각각의 말단에서 발견될 수 있고, 즉 Mn 미만의 분자량을 가지는 샘플에서의 황산덱스트란 분자의 수는 Mn 초과의 분자량을 가지는 샘플에서의 황산덱스트란 분자의 수와 동일하다.
실시형태에 따른 황산덱스트란은 황산덱스트란의 약제학적으로 허용 가능한 유도체로서 제공될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 황산덱스트란의 염 및 용매화물, 예를 들어 나트륨염 또는 칼륨염을 포함한다.
실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 바람직하게는 대상체에게 주사로 투여되고, 특히 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사 또는 (i.p.) 복강내 주사, 바람직하게는 i.v. 또는 s.c. 주사로 투여된다. 사용될 수 있는 다른 비경구 투여 경로는 근육내 및 관절내 주사를 포함한다. 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 주사는, 대안적으로 또는 또한, 혈관신생 및 혈류 증가가 발생해야 하는, 대상체 신체에서의, 예를 들어 허혈성 조직 또는 장기 또는 다른 부위에서 직접적으로 발생할 수 있다.
실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 바람직하게는 선택된 용매 또는 부형제와 함께 수성 주사 용액으로서 제제화된다. 용매는 유리하게는 수성 용매 및 특히 완충제 용액이다. 이러한 완충제 용액의 비제한적인 예는 시트르산 완충제, 예컨대 시트르산 1수화물(CAM) 완충제 또는 인산염 완충제이다. 예를 들어, 실시형태의 황산덱스트란을 식염수, 예컨대 0.9% NaCl 식염수 중에 용해시키고, 이후 75mM CAM에 의해 임의로 완충하고, 수산화나트륨을 사용하여 pH를 약 5.9로 조정한다. 수성 주사 용액, 예컨대 식염수, 즉 NaCl(수성)을 포함하는 비완충 용액이 또한 가능하다. 게다가, 완충 용액이 바람직한 경우 CAM 이외의 다른 완충제 시스템을 사용할 수 있다.
실시형태는 주사에 제한되지 않고, 경구, 비강, 협측, 직장, 진피, 기관, 기관지 또는 국소를 포함하는, 다른 투여 경로가 대안적으로 사용될 수 있다. 황산덱스트란인 활성 화합물은 이후 특정한 투여 경로에 기초하여 선택된 적합한 부형제 또는 담체와 제제화된다.
실시형태의 황산덱스트란에 적합한 용량 범위는 대상체의 몸집 및 체중, 대상체가 치료되는 병태, 및 다른 고려사항에 따라 달라질 수 있다. 특히 인간 대상체의 경우, 가능한 투약량 범위는 1㎍/㎏ 내지 150㎎/㎏(체중), 바람직하게는 10㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏(체중)일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 0.05 내지 50㎎/㎏(대상체의 체중), 바람직하게는 0.05 또는 0.1 내지 40㎎/㎏(대상체의 체중), 및 더 바람직하게는 0.05 또는 0.1 내지 30㎎/㎏, 또는 0.1 내지 25㎎/㎏ 또는 0.1 내지 15㎎/㎏ 또는 0.1 내지 10㎎/㎏(대상체의 체중)의 범위의 투약량으로 투여되도록 제제화된다.
실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 바람직하게는 대상체에서 허혈, 뇌졸중 또는 심혈관 질환을 야기하거나, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여에 의해 촉발되는 바대로 혈관신생 유도에 의해 치료되거나 적어도 경감될 수 있는 의학 병태를 야기하는 손상 또는 다른 병태 후 가능한 빨리 개시된다.
황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 현재의 의학 병태의 치료로 제한되어야 할 필요는 없지만, 대안적으로, 또는 또한, 예방책을 위해 사용될 수 있다. 즉, 실시형태의 황산덱스트란은 국소 허혈에서 일어날 수 있는 수술과 같은 의학 절차 또는 혈관신생의 유도 및/또는 혈류의 증가에 의해 치료되거나 저해되거나 경감될 수 있는 다른 의학 효과를 겪을 대상체에게 투여될 수 있다.
실시형태의 황산덱스트란은 단일 투여 경우에 예컨대 단일 볼루스 주사의 형태로 투여될 수 있다. 이 볼루스 용량은 환자에게 꽤 신속히 주사될 수 있지만, 유리하게는 황산덱스트란 용액이 환자에게 수 분의 시간에 걸쳐, 예컨대 5분 내지 10분 동안 점적주사되도록 시간에 걸쳐 점적주사될 수 있다.
대안적으로, 실시형태의 황산덱스트란은 치료 기간 동안 수회, 즉 적어도 2회 경우로 투여될 수 있다. 이러한 치료 기간의 지속기간은 통상적으로 공격의 유형 및 상이한 유형의 상처 치유의 내인성 시간 기간과 관련된다. 적합한 치료 기간의 더 많은 정보를 위해, 문헌[Chapter 1 Overview of Wound Healing in Different Tissue Types, pages 3-40 of Indwelling Neural Implants: Strategies for Contending with the In Vivo Environment, ed. William M. Reichert, 2008 by Taylor & Francis Group, LLC (ISBN: 978-0-8493-9362-4)]을 참조할 수 있다.
따라서, 실시형태의 황산덱스트란은 예시적인 예로서 매일 1회 또는 수회, 매주 1회 또는 수회, 매월 1회 또는 수회 투여될 수 있다.
일반적으로, 예를 들어 뇌졸중, 심근 경색(MI), 세포 및 장기 이식에서, 예컨대 급성 허혈을 야기하는 급성 질환의 경우, 치료 기간의 지속기간은 단일 투여일 수 있지만, 바람직하게는 예를 들어 1주, 수주 또는 1개월의 치료 기간 동안 수회 투여의 형태이다. 3개월 또는 심지어 1년까지의 더 긴 치료 기간은 치유 및 회복을 추가로 개선할 수 있다.
간헐적 유형의 허혈성 병태의 경우, 예방책(예방)으로서의 치료 또는 질환의 악화 바로 후 치료를 사용할 옵션이 있을 수 있다. 이 유형의 투여 프로토콜은 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 겸상 세포 질환과 같은 질환에 적합할 수 있다. 치료 기간은 악화 후 치료에 대해 1-3개월 이하일 수 있다. 질환의 예방책의 경우, 임의로 더 긴 치료 기간이 사용될 수 있다.
실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여를 통한 대상체에서의 혈관신생의 유도는 바람직하게는 인간 대상체의 신체에서 허혈을 야기하는 질환, 장애 또는 의학 병태를 겪는 인간 대상체에서 발생한다.
허혈은 조직에 대한 혈액 공급의 제한이어서, 세포 대사에 필요한 산소 및 포도당이 부족하게 한다. 허혈은 일반적으로 혈관에 의한 문제로 야기되고, 이로 인해 조직 또는 장기의 손상 또는 기능이상이 생긴다. 이것은 또한 때때로 혈관수축, 혈전증 또는 색전증과 같은 울혈로부터 생긴 소정의 신체 부분에서의 국소적인 빈혈 및 저산소증을 의미한다.
허혈의 효과적인 치료, 또는 허혈을 겪을 위험을 예방하거나 적어도 감소시키는 있어서의 효과적인 접근법은 혈관신생을 유도하는 것이다. 혈관신생은 관련 조직에서 혈류를 증가시키고, 이로써 질환, 장애 또는 의학 병태에 의해 야기된 조직에 대한 혈액 공급의 어떠한 제한에 대응할 수 있다.
허혈을 야기할 수 있는 질환, 장애 또는 의학 병태의 비제한적이지만, 예시적인 예는 상처 치유; 말초 허혈, 예컨대 장기, 조직 또는 세포의 이식 후 허혈, 말초 동맥 질환, 사지 허혈, 하지 불안, 레이노드 증후군(Raynaud's syndrome), 겸상 세포 질환 또는 폐색성 혈전혈관염(thromboangiitis obliterans); 예컨대 울혈성 심부전, 심근 경색 또는 관상 동맥 질환에 의해 야기되는 관상동맥 허혈; 어린이에서의 허혈성 질환, 예컨대 주산기 또는 신생아 질환, 어린이 질환, 예를 들어 신생아 저산소성 또는 허혈성 뇌 손상, 질식 뇌병증, 뇌성마비; 예컨대 다발성 경화증, 뇌졸중, 근위축성 측삭 경화증에 의해 야기된 외상성 뇌 손상, 측두 동맥염, 저산소증에 의해 야기된 중추 신경계에서의 허혈; 또는 근육 이영양성 질환; 혈전성, 출혈성 또는 외상성 손상에 의해 야기된 허혈을 포함한다.
상처 치유는 통상적으로 초기 단계, 염증성 단계, 증식성 단계, 및 성숙 및 개형 단계라 칭해지는 4개의 단계를 일반적으로 포함한다. 혈관신생은 증식성 단계 동안 발생하는 과정 중 하나이다. 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 상처 치유의 하위과정 중 하나로서 발생하는 혈관신생 효과를 촉진할 수 있다. 혈관신생의 과정은 내피 세포가 상처의 구역으로 이동할 때 상처 치유 동안 섬유아세포 증식과 동시에 발생한다. 섬유아세포 및 상피 세포의 활성이 산소 및 영양소를 요하므로, 혈관신생은 상피 및 섬유아세포 이동과 같은 상처 치유에서의 다른 단계에 긴요하다.
말초 허혈은 일반적으로 심장(관상동맥 허혈) 및 중추 신경계(CNS 허혈)와 다른 조직 및 장기에서 발생하는 허혈성 상태를 나타낸다. 말초 허혈의 다양한 원인이 존재할 수 있다. 통상적인 예는 대상체에 대한 장기 또는 조직의 이식이다. 이식된 장기 또는 조직은 이후, 이식된 장기 또는 조직 주위에 새로운 혈관이 형성될 때까지, 이식의 시점으로부터 발생하는 초기 생착 과정 동안 허혈에 통상적으로 노출된다. 이식 직후 충분한 혈액 공급이 확립되지 않는 경우 허혈 및 저산소증으로 인해 장기 또는 조직의 손상 또는 기능이상의 높은 위험이 존재한다. 그러므로, 이식과 연결되어 실시형태에 따른 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 의한 혈관신생의 유도는 허혈 및/또는 저산소증으로 인한 이식된 장기 또는 조직의 손상 또는 기능이상의 위험을 상당히 감소시킬 수 있다. 실시형태에 따른 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는, 실제 이식 사건 전에 이식 부위에서 혈관신생을 유도하고 혈류 증가를 제공하기 위해, 이식 전에 발생할 수 있다. 이러한 경우에, 실시형태의 황산덱스트란에 의해 유도된 혈류의 증가는 이식된 장기 또는 조직의 허혈성 손상을 예방하거나 적어도 감소시키기에 충분할 수 있다.
흔히 말초 동맥 질환(peripheral artery disease: PAD) 또는 말초 동맥 폐색 질환(peripheral artery occlusive disease: PAOD) 또는 말초 폐색성 동맥병증이라 칭하는 말초 맥관 질환(peripheral vascular disease: PVD)은 관상동맥, 대동맥궁 맥관구조 또는 뇌 내에서가 아니라 큰 동맥의 폐색을 의미한다. PVD는 협착증, 색전증 또는 혈전 형성을 발생시키는 염증성 과정인 죽상동맥경화증으로부터 생길 수 있다. 이것은 급성 허혈 또는 만성 허혈을 야기한다. PVD의 효과적인 치료는 실시형태에 따른 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여에 의해 혈류를 복원하는 것이다.
대개 급성 사지 허혈이라 칭하는 사지 허혈은 사지로의 혈류가 갑작스럽게 부족할 때 발생한다. 급성 사지 허혈은 통상적으로 색전증 또는 혈전증으로 인한다. 혈전증은 보통 말초 맥관 질환(혈관 봉쇄를 발생시키는 죽상동맥경화성 질환)에 의해 생기지만, 색전증은 공기, 외상, 지방, 양수 또는 종양으로 인할 수 있다. 사지 허혈을 겪는 대상체는 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여로부터 이익을 받을 것이다.
의약에서, 레이노드 현상은 감기 또는 감정 스트레스에 반응하여 손가락, 발가락 및 때때로 다른 부위의 변색시키는 과도하게 감소한 혈류이다. 레이노드 현상은 그 자체로 증상이 수반되는 단지 징후(저관류)이다. 발병학과 연결될 때, 이것은 원인이 공지되지 않은 레이노드 질환(또한 원발성 레이노드 현상으로 공지됨)의 일부, 또는 공지된 원발성 질환, 가장 흔히 연결 조직 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스에 의해 생긴 증후군인 레이노드 증후군(속발성 레이노드 현상)의 일부일 수 있다. 이것은 조직 저산소증을 발생시키는 말초 혈관의 극도의 혈관수축을 야기하는 교감 신경계의 과활성화이다. 레이노드 현상의 만성 재발 사례는 피부, 피하 조직 및 근육을 위축시켜, 가능하게는 궤양 및 허혈성 괴사를 발생시킬 수 있다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 레이노드 증후군 또는 질환을 겪을 위험을 감소시키거나, 이의 증상을 치료하거나 적어도 경감시키는 효과적인 수단일 수 있다.
겸상 세포 질환(sickle-cell disease: SCD), 또는 겸상 세포 빈혈(sickle-cell anaemia: SCA) 또는 겸상혈구증은 비정상의 딱딱한 겸상 형상을 띠는 적혈구를 특징으로 하는 유전적 혈액 장애이다. 낫적혈구화는 적혈구의 가동성을 감소시키고, 신체의 부분으로의 혈액의 부적절한 흐름의 위험을 발생시킨다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 사용한 혈관신생의 유도는 SCD를 겪는 대상체에서 말초 허혈을 진행시킬 위험을 감소시키도록 사용될 수 있다.
버거 질환(Buerger's disease) 또는 초로기 괴사라 또한 칭하는 폐색성 혈전혈관염은 손 및 발의 작은 및 중간 동맥 및 정맥의 재발하는 진행성 염증 및 혈전증(응고)이다. 폐색성 혈전혈관염은 따라서 이 사지로의 혈류의 제한으로 인해 손 및 발에서의 허혈을 발생시킬 수 있다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 손 및 발로의 혈류를 증가시키기 위한 효과적인 수단일 수 있다.
관상동맥 허혈은 관상 동맥을 통한 충분한 혈액을 가지지 못하는 것에 대한 의학 용어이다. 관상동맥 허혈은 심장 질환 및 심장 마비와 연결된다. 이것은 또한 심장 허혈로 공지되어 있다. 관상 동맥 질환(CAD)은 지방 물질이 관상 동맥의 벽에 들러붙어, 동맥을 좁히고 혈류를 수축시킬 때 발생한다. 이것은 심근 경색(심장 마비)을 발생시킬 수 있는 심장으로의 산소 및 혈액의 부족을 발생시킨다. CAD는 동맥을 통한 혈류 및 산소의 부족을 발생시키는, 죽상동맥경화증이라 불리는 과정인, 동맥의 수축을 발생시킨다. 죽상동맥경화증은 관상동맥 허혈의 가장 흔한 원인이다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여에 의해 촉발된 혈관신생의 유도를 통한 심장 근육에서의 혈류의 증가는 관상동맥 허혈의 위험을 감소시키거나 이에 의해 생긴 손상을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 또한, 혈전증은 관상동맥 허혈에 대한 원인일 수 있다.
흔히 심장 마비로 공지된 심근 경색(MI) 또는 급성 심근 경색(AMI)은 심장의 부분으로 혈류를 중단시킬 때 발생하여 심장 근육을 손상시킨다. 대부분의 MI은 관상 동맥 질환으로 인해 발생한다. MI의 메커니즘은 대개 관상 동맥의 완전한 봉쇄를 발생시키는 죽상동맥경화성 플라크의 파열을 포함한다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 경색부의 크기를 감소시킨다. 따라서, MI에 의해 생긴 심장 근육의 영구적인 손상은 실시형태에 따라 상당히 감소할 수 있다.
CNS에서의 허혈은 다양한 원인으로 인할 수 있다. 예를 들어, 외상성 뇌 손상은 뇌의 부분으로의 혈류의 봉쇄 또는 제한을 발생시킬 수 있다. 이러한 혈류의 제한은 저산소증이 뇌에서 발생할 때 중증 결과를 가질 수 있다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여에 의해 발생하는, 혈류의 증가는 외상성 뇌 손상 이후 허혈에 의해 발생한 영구적인 뇌 손상의 위험을 감소시키기 위해 이로써 사용될 수 있다.
거대세포 동맥염(giant-cell arteritis: GCA), 두개 동맥염 또는 호튼 질환(Horton disease)이라 또한 칭하는 측두 동맥염은, 주로 외경동맥의 가지인, 머리의 큰 동맥 및 중간 동맥을 가장 흔히 포함하는 혈관의 염증성 질환이다. 이것은 혈관염의 형태이다. 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여에 의해 발생하는, 혈관신생의 유도 및 혈류의 증가는 측두 동맥염을 겪는 대상체에게 유리할 수 있다.
때때로 뇌혈관 사건(CVA), 뇌혈관 손상(CVI) 또는 구어체로 뇌 발작이라 칭하는 뇌졸중은 뇌로의 혈액 공급의 장애로 인한 뇌 기능의 소실이다. 이 장애는 허혈 또는 출혈로 인한다. 허혈은 혈전증 또는 동맥 색전증을 통한 혈관의 봉쇄에 의해 또는 전신 저관류에 의해 발생한다. 출혈성 뇌졸중은 뇌 실질조직 또는 뇌 조직을 둘러싸는 지주막하강으로 직접적으로 뇌의 혈관을 출혈시킴으로써 발생한다. 뇌졸중을 겪는 대상체는 불충분한 혈액 공급에 의해 생긴 손상의 위험을 감소시키기 위해 뇌로의 혈류를 증가시키는 치료로부터 이익을 받을 것이다. 그 결과, 실시형태의 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 투여는 뇌졸중을 겪는 대상체에게 유리하게 제공된다.
다양한 신경학적 장애는 CNS, 예컨대 뇌의 부분에 대한 혈액 공급을 제한할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Multiple Sclerosis International 2013, 1-6 (2013)]은 초기 다발성 경화증(MS) 병변이 저산소증과 연관된다는 것을 개시한다. 그러므로, MS를 겪는 대상체는 MS와 연관된 저산소증을 치료하거나 적어도 감소시키거나 저해하기 위해 혈류 증가로부터 이익을 받을 수 있다.
운동 뉴런 질환(MND) 및 루게릭 질환이라 또한 칭하는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)은 다양한 원인을 가지는 신경퇴행성 질환이다. 이것은 근육 위축 및 근육 경직, 말하기의 어려움(구음장애), 연하의 어려움(연하곤란) 및 호흡의 어려움(호흡장애)으로 인한 신속히 진행하는 허약을 특징으로 한다. 실험은 ALS가 예를 들어 운동앞 전두엽 영역에서의 혈류의 감소와 연관된다는 것을 보여준다, Acta Neurologica Scandinavia 116, 340-344 (2007). 혈관신생의 유도를 통한 혈류 증가는 ALS를 겪는 대상체에 유리한 것으로 추측된다.
실시형태에 따른 혈관신생의 유도는, 임플란트에 대해 또는 이것과 연결되어 미세순환을 유도하는 것이 유리할 수 있는 경우, 다양한 의학 장치, 센서 등의 이식에서 추가로 사용될 수 있다.
실시형태의 황산덱스트란은 이로써 다양한 허혈성 질환, 장애 및 병태, 및 또한 다양한 질환, 장애 및 병태에서의 허혈성 성분을 치료하거나 저해하거나 예방하도록 사용될 수 있다.
본 실시형태의 상당한 이점은 실시형태의 황산덱스트란이 대상체에서 혈관신생을 선택적으로 유도, 즉 혈관신생이 필요한 부위, 예컨대 조직 또는 장기에서 혈관신생을 유도할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 혈관신생은 도 4에 예시된 바대로 비허혈성 조직에서가 아니라 허혈성 조직에서 유도되고 발생하여서, 비허혈성 왼쪽 사지에서가 아니라 허혈성 오른쪽 사지에서 (CD-34로 예시된 바와 같은) 작은 모세혈관 형성의 존재를 보여주고, (DA로 예시된 바와 같은) 기능적 및 활성 모세혈관을 확인시켜 준다.
실시형태의 또 다른 양태는 대상체에서 혈관신생을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태의 추가의 양태는 대상체에서의 혈관신생을 유도하는 약제의 제조를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 용도에 관한 것이다.
실시형태의 여전히 또 다른 양태는 허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키기 위한 용도를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 관한 것이다.
실시형태의 관련 양태는 허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키는 방법을 정의한다. 상기 방법은 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태의 또 다른 관련 양태는 허혈을 겪는 대상체에서 혈류를 증가시키는 약제의 제조를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 용도를 정의한다.
특정한 실시형태에서, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 대상체의 허혈성 조직 또는 장기에서 혈류를 증가시킬 수 있다.
조직 또는 장기는 상기 기재된 바대로 말초 장기, 심장 또는 CNS 조직, 예컨대 뇌일 수 있다.
실시형태의 훨씬 또 다른 양태는 대상체에서 허혈성 조직을 혈관화하기 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체에 관한 것이다.
실시형태의 관련 양태는 대상체에서 허혈성 조직을 혈관화하는 방법을 정의한다. 상기 방법은 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태의 또 다른 관련 양태는 대상체에서 허혈성 조직을 혈관화하는 약제의 제조를 위한, 10,000Da 미만의 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체의 용도를 정의한다.
허혈성 조직은 상기 기재된 바대로 말초 장기, 심장 또는 CNS 조직, 예컨대 뇌일 수 있다.
실시형태의 황산덱스트란에 의해 유도되거나 촉발되는, 혈관화, 즉 작은 모세혈관의 형성은 대상체의 비허혈성 조직, 즉 건강한 조직에서가 아니라 대상체에서의 허혈성 조직에서 발생한다는 면에서 선택적이다. 이로써 실시형태에 따라 유도된 혈관화는, 건강한 조직이 영향을 받지 않게 두면서(상당한 혈관화 형성이 없음), 이것이 필요한, 부위(들)에서 발생한다.
대상체는 바람직하게는 포유류 대상체, 더 바람직하게는 영장류 및 특히 인간 대상체이다. 그러나, 본 실시형태는 수의학적 분야에서 또한 사용될 수 있다. 동물 대상체의 비제한적인 예는 영장류, 고양이, 개, 돼지, 말, 마우스, 래트를 포함한다.
실시형태는 혈관화된 조직 및/또는 장기에서 혈관신생을 유도하기 위한, 혈관화된 조직 및/또는 장기에서 혈류를 증가시키기 위한 및/또는 혈관화된 조직 및/또는 장기를 혈관화하기 위한, 혈관화된 조직 및/또는 장기의 시험관내 및/또는 생체외 치료에 또한 적용될 수 있다.
이러한 경우에, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 다양한 시험관내 또는 생체외 분야에서 혈관화된 조직 및/또는 장기에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 혈관화된 조직 및/또는 장기가 시험관내 액침되거나 접촉된 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 혈관화된 조직 및/또는 장기는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 포함하는 용액이 분무될 수 있다. 게다가, 혈관화된 조직 및/또는 장기가 체외 순환 펌프 또는 체외 막 산소화(extracorporeal membrane oxygenation: ECMO) 장치에 연결된 경우, 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체는 혈관화된 조직 및/또는 장기를 통해 펌프질되는 혈액에 첨가될 수 있다.
실험
실시예 1
중증 뒷다리 허혈 마우스 모델에서의 혈관신생의 평가
말초 동맥 질환(PAD)은, 조직에서 손상된 혈류 및 저산소증을 발생시키는, 사지, 보통 다리로의 혈액의 부분 또는 완전 봉쇄가 있는, 말초 맥관 질환(PVD)의 형태이다. PAD가 진행될 때, 이것은 피부 궤양, 괴사 및 불가피한 절단을 동반하는 중증 사지 허혈(critical limb ischemia: CLI)의 단계에 도달한다. 치료학적 혈관신생은 허혈성 조직에서 신생혈관화를 촉진하는 비침습적 수단으로서 생겼다. 본 연구에 개시된 바대로, 황산덱스트란의 전신 피하 투여는 혈관신생을 촉진하여, 소혈관을 형성하고 내피 세포를 증식시킨다. 본 연구에서, 혈관신생 및 기능 결과에 대한 황산덱스트란의 안전성 및 효율을 평가하기 위해 안정한 중증 허혈 모델(Journal of Experimental and Clinical Medicine 31, 128-132 (2006))을 적용하였다.
재료
5 내지 7kDa의 범위 내인 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란을 피케이 케미컬즈사(pK Chemicals A/S)(덴마크)로부터 얻었다. 도 1 내지 도 4, 도 6, 도 7에서, 황산덱스트란은 TM-700으로 표시된다.
황산덱스트란의 주사 용액을 연구 시작 전날에 제조하였다. 비히클로서, 0.9% NaCl(식염수)(테바 파마슈티컬 인더스트리즈사(Teva Pharmaceutical Industries Ltd))을 사용하였다. 관련 용적의 NaCl를 칭량된 화합물에 첨가하여 투여를 위한 표적 농도(10 또는 30㎎/㎏(체중))를 얻음으로써 주사 용액을 제조하였다. 와류시킴으로써 또는 단순히 관을 수회 돌림으로써 황산덱스트란을 용해시켰다. 응집체가 안정화되도록 용액을 2 내지 8℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 관을 와류시키고 용액을 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켜 무균 용액을 얻었다. 용액을 7일에 제조하여, 8 내지 21일에 사용하고, 제2 조제를 21일에 수행하여, 22 내지 35일에 사용하였다. 용액을 도포 날짜 사이에 2 내지 8℃에서 저장하였다.
연구 초기(0일)에 평균 체중이 24.7g인 9주령의 전체 60마리의 수컷 Balb/c 마우스를 할란 레버러토리즈(Harlan Laboratories)(이스라엘)로부터 얻었다. 각각의 군에 기록된 최소 및 최대 체중은 군 평균의 ±20%의 범위 범위 내였다. 동물을 국립 보건원(National Institute of Health; NIH) 및 실험실 동물 관리 평가 및 승인 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care: AAALAC)에 따라 취급하였다. 동물을 유리 투명 폴리카보네이트 병에서 펠렛화된 음식 및 식수에 대한 설비를 가지는 스테인리스 강 상부 그릴이 있는 42.5 x 265.6 x 18.5㎝ 크기의 폴리설폰(PSU) 우리(우리마다 5마리)에 감금하고; 침구: 증기 멸균 깨끗한 벼 껍질(Harlan, Sani-chip, 카탈로그 106S8216호)을 사용하고, 침구 재료를 적어도 1주 2회 우리에 따라 바꿨다. 동물은 상업용 설치류 식이(데크라드 인증 글로벌(Teklad Certified Global) 18% 단백질 식이 카탈로그 106S8216호)를 마음대로 공급받았다. 동물은 자치단체 공급으로부터 얻은 오토클레이빙되고 산성화된 식수(2.5 내지 3.5의 pH)에 자유로이 접근하였다. 동물을 적절한 신선한 공기 공급(최소 15 공기 변화/시간)에 의해 공기 컨디셔닝되고 여과(HEPA F6/6)된 표준 실험실 공기 하에 감금하였다. 동물을 기후 제어 환경에서 유지시켰다. 12시간 광 및 12시간 암 사이클로 온도 범위는 20 내지 24℃이고, RH 범위는 30 내지 70%이었다.
수술 절차
수술일에, 1.5 내지 3.0%의 아이소플루란, 1.5%의 N2O 및 0.5%의 O2에 의해 마취를 유도하였다. 마취 하에, 마우스를 배쪽이 위로 향하게 배치하였다. 서혜부에서의 피부를 0.5-1.0㎝ 절개하였다. 대퇴 동맥을 6-0 명주실에 의해 장골 동맥의 원위 부분 바로 뒤에 근위로 그리고 심오한 대퇴 동맥에 의한 이의 분기점 후 근위로 결찰하고, 2개의 결찰부 사이를 가로절단하고 절제하였다. 상처를 4-0 명주실로 봉합하고, 마우스가 회복하게 하였다.
황산덱스트란 치료
수술 후 2주째인 8일에, 1주 3회 황산덱스트란 용액을 2M 및 3M 군에서의 각각의 동물에게 s.c. 주사하였다. 4M 군에서의 동물을 1주 1회 s.c. 주사하고, 1M 군은 비히클 치료(NaCl)를 받았고, 표 1을 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00003
체중 측정
체중을 수술 전 연구 -1일에 재고 그 후 1주 1회 쟀다. 0일 내지 7일에, 모든 동물 1M, 2M, 3M 및 4M 군에서 1.1g 내지 1.6g의 범위의 작은 평균 체중 감소가 관찰되었고, 도 1을 참조한다. 14일로부터 점진적인 체중 증가가 관찰되었다. 따라서, 0일 내지 35일 사이에 평균 체중 증가는 0.4g 내지 1.7g의 범위이고, 표 2를 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00004
혈류 측정
양측으로부터의 다리에서의 혈류를 수술 전 -1일에 및 시술 후 1일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 비접촉 레이저 도플러에 의해 측정하였다. 혈류 측정은 정상 다리에서의 흐름에 대한 허혈성 사지에서의 흐름의 비율로서 표현된다.
모든 동물 1M, 2M, 3M 및 4M 군은 1일과 35일 사이에 시술된 사지에서 평균 혈류 증가를 나타냈고, 도 2를 참조한다. 평균 혈류는, 비히클 대조군 1M에서의 19.5 단위의 증가와 비교하여, 수술 후 기준선으로부터 황산덱스트란 치료군 2M(1주 3회 10㎎/㎏)에서 46.7 단위로; 황산덱스트란 치료군 3M(1주 3회 30㎎/㎏)에서 59.3 단위로, 황산덱스트란 치료군 4M(1주 1회 30㎎/㎏)에서 51.1 단위로 증가하였다. 이것은 각각 황산덱스트란 치료로 인한 2.2배, 3.0배 및 2.8배의 평균 혈류 증가를 나타내고, 표 3 및 도 2를 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00005
도 8은 대조군 마우스(1M 군) 및 3M 군에 따른 황산덱스트란에 의해 치료된 마우스에서 측정된 혈류를 비교한다. 도면은 왼쪽 뒷다리의 대퇴 동맥 결찰 후 35일에 비접촉 레이저 도플러 영상을 보여준다.
허혈성 중증도의 거시적 평가
괴사 부위에 대해 형태학적 등급을 사용하여 허혈성 사지의 거시적 평가를 7일에 수행하고 이후 1주 1회 수행하였고, 표 4를 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00006
괴사 부위에 대한 등급화된 형태학적 스케일을 이용하여 허혈성 사지를 7일로부터 35일까지 주마다 거시적으로 평가하였고, 표 4를 참조한다. 비히클 및 황산덱스트란에 의해 치료된 모든 동물 군에서 발가락 괴사 또는 발 절단이 관찰되었다(1로부터 2로 등급매겨짐, 표 6 참조). 각각의 치료군에서의 발 절단의 백분율이 표 5 및 표 6에 표시되어 있다. 비히클 치료된 대조군 1M(15.4%) 및 황산덱스트란 치료군 4M(1주 1회 30㎎/㎏)(7.1%)에서 발 절단이 발견되었다. 비히클 치료된 대조군 1M에서의 발가락 괴사율은 동물의 23.1%인 것으로 밝혀졌다. 황산덱스트란 2M 및 3M에 의해 치료된 동물 군에서, HLI 유도 후 35일에 발가락 괴사율은 각각 21.4% 및 14.3%였다. 황산덱스트란에 의해 치료된 동물 4M 군에서, 발가락 괴사의 증거가 발생하지 않았다(표 6).
Figure 112017003107665-pct00007
Figure 112017003107665-pct00008
사지 기능 및 허혈성 손상의 생체내 평가
허혈성 사지의 손상된 사용의 반정량적 평가를 하기 스케일을 시용하여 수술 후 1주 1회 수행하였고, 표 7을 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00009
사지 기능은 부분 또는 완전 사지 절단의 경우에 "이용 불가"로서 등급 매겨졌다. 이러한 경우에, 혈류 측정은 통계 분석에 포함되지 않았다.
혈류 측정과 동시에, 비히클 대조군 1M과 비교하여, 모든 황산덱스트란 치료군 2M, 3M 및 4M은 사지 기능 개선에서 더 우수한 결과를 나타냈고, 하기 표 8 및 표 9 및 도 6을 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00010
Figure 112017003107665-pct00011
면역조직화학 및 모세혈관 밀도의 분석
36일에 연구 종결 시 마우스를 희생시켰다. 모든 동물을 희생시키기 5분 전에 마우스마다 200㎕의 용량으로 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC) - 덱스트란 500,000Da 접합체 10㎎/㎖를 i.v. 주사하였다. 사두근 근육을 관상동맥 부분으로 해부하였다. 근육을 24시간 동안 2.5% 새로운 파라폼알데하이드(pH 7.4) 중에 고정하고, 이후 항-CD34(1:200, 세드랄렌사(Cedralene)) 면역염색에 의한 마우스 단일클론 항체(항-SMA Ab-1, 클론 1A4, 1:800, 써모 사이언티픽사(Thermo scientific)) 및 CD34를 가지는 평활근 액틴(smooth muscle actin; SMA)에 대해 파라핀 중에 포매하였다. 파라핀 포매를 표준 포매 절차에 따라 수행하였다.
염색된 절편을 평가하고, CCD 카메라(DMX1200F; 니콘사(Nikon))에 연결된 편평한 플루어(fluor) 대물렌즈가 장착된 형광 현미경(E600; 니콘사(일본 도쿄))에 의해 사진찍었다. 이 조건 하에, Cy3은 밝은 적색 형광(Ex(max): 543㎚; Em(max) 570㎚)을 나타내지만, 플루오레세인 덱스트란은 강한 녹색 형광(Ex(max): 488㎚; Em(max): 530㎚)을 나타냈다. 디지털 영상을 수집하고, 이미지 프로+(Image Pro+) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 1M, 3M 및 4M 군으로부터 8마리의 동물의 동일한 부위로부터 근육 샘플의 4개의 절편을 수취하였다. 혈관의 부위를 측정하였다. 밀도는 관측 시야당 모세혈관의 평균 수로 표현된다. 전체 혈관은 측정된 부위에서의 모든 혈관을 나타낸다.
CD34 양성 모세혈관의 수는 연구 35일에 대조군 1M과 비교하여 황산덱스트란 치료군 3M 및 4M에서 더 크고, 도 3, 도 4 및 도 5A 내지 도 5C를 참조한다. CD34 양성 염색은 작은 모세혈관 형성에 대한 표시로 생각되고, 따라서 얻어진 결과는 황산덱스트란에 의해 치료된 동물 군에서 관찰된 혈류 개선을 지지한다. 덱스트란 염색은 이 모세혈관이 기능하고 활성이라는 것을 확인시켜준다. SMA 염색은 CD34 염색과 동일한 모세혈관 형성 증가를 나타냈고, 도 7을 참조한다.
도 4는 실시형태의 황산덱스트란이 허혈성 조직, 즉 오른쪽 사지에서만 혈관신생을 유도하고, 비허혈성 조직, 즉 왼쪽 사지에서는 그렇지 않다는 것을 명확히 보여준다. 따라서, 실시형태의 황산덱스트란은 이것이 필요한 경우에만 혈관신생의 선택적 유도를 발생시킨다.
손상된 혈관신생은 허혈성 질환의 특징 중 하나이다. 치료학적 혈관신생에 대한 가장 확립된 표적은 VEGF 및 이의 수용체이다. 그러나, 허혈을 경감시키기 위한 임상 실험은 실망스러워서, 허혈성 질환을 치료하기 위한 새로운 치료학적 표적에 대한 수요를 나타낸다.
본 연구에서, 황산덱스트란의 효능을 평가하기 위해 마우스 뒷다리 허혈 모델에서의 혈류 개선을 조사하였다. 30㎎/㎏ s.c.의 용량에서의 반복된 (1주 3회) 또는 (1주 1회) 황산덱스트란 투여는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 혈액 관류를 상당히 복원하였다. 35일에, 대조군과 비교하여 황산덱스트란 치료군에서 치료 후 14일에 시작하여 통계적으로 유의적인 효과로 2½배 내지 3배 더 높은 혈류 관류 값이 관찰되었다.
연구의 총체적 데이터는 Balb/c 마우스 동물 모델에서 폐색성 말초 동맥 질환의 치료를 위해 s.c. 제공된 황산덱스트란의 치료 효율을 확인시켜준다. 자발적 절단 또는 발가락 괴사율은 또한 대조군과 비교하여 황산덱스트란 치료된 동물에서 감소하였다. 황산덱스트란 치료는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 모든 약물 치료된 동물 군에서 사지 기능 복원을 개선하였다. 황산덱스트란 치료는 치료된 동물에서 어떠한 부작용도 발생시키지 않았다.
면역조직화학 발견은 생체내 결과를 확인시켜준다. 총체적으로, 이 연구의 데이터는 마우스 모델에서의 폐색성 말초 동맥 질환의 치료를 위한 황산덱스트란의 치료 효율을 확인시켜준다.
뒷다리 허혈을 가지는 마우스에서의 황산덱스트란 치료는 레이저 도플러에 의해 측정된 바대로 상당히 신속하게 혈류를 회복시키고, 사지 허혈성 중증도의 감소 및 더 신속한 사지 기능 개선을 또한 입증한다.
일반 건강에 대한 부작용이 어떠한 군에서도 기록되지 않았다. 이 데이터는 면역조직화학 평가에 의해 확인되었다. 발견은 혈관 형태의 변화, 즉 모세혈관 밀도 증가 및 혈관 혈관신생를 반영한다.
실시예 2
래트 뇌졸중 모델에서의 혈관신생 효율의 평가
황산덱스트란 치료의 효율을 평가하기 위해 뇌졸중 tMCAO 래트-모델을 사용하였다. 수술 절차 후 2시간에 시작하여 1주 3회 30㎎/㎏ 또는 15㎎/㎏의 매일 용량으로 피하 주사를 통해 28일 동안 래트를 황산덱스트란에 의해 치료하였다. 연구 동안, 수많은 행동 시험에서 신경학적, 운동 및 체성감각 기능을 모니터링하였다.
황산덱스트란에 의해 치료된 군과 비히클 치료된 대조군 사이에 명확한 차이가 입증되었다. 약물 치료군 둘 다에서 신경 점수, 보행 시험 및 신체 흔들림 시험에 의해 평가된 바대로 운동 기능의 개선이 입증되었다. 감각 운동 기능은 또한 황산덱스트란 치료 이후 회복되었다. 황산덱스트란 치료의 효과가 이의 혈관신생 활성의 덕분이어야 할 것이다. 이 결론은 이환된 반구에서 뇌 혈액 관류 및 평활근 액틴(SMA) 양성 모세혈관 밀도의 증가에 의해 지지된다. 황산덱스트란 치료는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 염증성 반응을 또한 감소시켰다.
이 발견의 관점에서, 황산덱스트란 치료가 래트 뇌졸중 모델에서 운동 및 체성감각 결함, 및 뇌 혈액 관류 및 혈관신생 활성을 명확히 개선한다는 것이 결론내리질 수 있다.
뇌졸중은 심각한 장기간 불능 중 주요 원인이고, 미국에서 사망의 3번째 주요 원인이다. 뇌졸중으로 인한 불구의 전체 건강 비용은 연간 536억으로 예상된다. 허혈성 뇌졸중은 모든 뇌졸중 중 88% 초과를 포함하여서, 이것이 뇌혈관 손상의 가장 흔한 유형이게 한다. 뇌에서의 허혈성 상태는 뉴런 사멸을 발생시켜, 영구적인 감각운동 결함을 발생시킨다. 뇌졸중 환자에 대한 즉각적인 치료가 임상 환경에서 대개 불가능하다는 것이 이제 명확하다. 의사는 뇌졸중 치료에 대한 새로운 치료 전략을 긴급히 요한다.
병리심리학을 이해하고 허혈성 손상의 중증도를 최소화하기 위한 치료학적 전략을 확인하기 위한 노력으로 뇌 허혈을 연구하기 위해 몇몇 동물 모델을 사용하였다. 병소 허혈은 국소화 뇌 경색을 발생시키고, 래트에서 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)에 의해 유도된다. 이것은 인간에서의 반구 경색에 대한 모델로서 승인을 증가하여 얻었다. MCAO 후, 시간 및 공간 진화에 의한 피질 및 선조 경색은 중간 대뇌 동맥에 의해 공급된 맥관 지역 내에 발생한다.
과거 10년에, 뇌졸중 동물 연구에서의 행동 평가에 대한 증거의 증가가 수집되었다. 기능 개선은 치료 효율에 대한 측정치로서 매우 신뢰성 있는 것으로 발견되었다.
뇌졸중에서의 맥관 합병증에 대한 가장 유망한 혁신적인 치료 중 하나는 허혈성 조직에서 신생혈관화를 촉진하기 위한 비침습적 수단으로서 나온 치료학적 혈관신생이다.
이 연구에서, 일시적 MCAO 래트-뇌졸중 모델에서 황산덱스트란의 신경보호 및 재활치료 가능성이 연구되었다.
재료
5 내지 7kDa의 범위 내인 평균 분자량을 가지는 황산덱스트란을 피케이 케미컬즈사(덴마크)로부터 얻었다. 도 9 내지 도 16에서, 황산덱스트란은 TM-700으로 표시된다.
황산덱스트란을 1주 3회 주사의 경우 60㎎/㎖의 농도로 및 매일 주사의 경우 30㎎/㎖의 농도로 0.9% NaCl(식염수)(테바 파마슈티컬 인더스트리즈사) 중에 용해시켰다. 제제는 1주 동안 안정하였다. 동물은 30 및 15㎎/㎏(체중)에 동등한 0.5㎖/㎏를 받았다.
연구 개시(0일)에 평균 체중이 342g인 전체 46마리의 수컷 SD 래트를 할란 레버러토리즈(이스라엘)로부터 얻었다. 각각의 군에 기록된 최소 및 최대 중량은 군 평균 중량의 ±20%의 범위 내였다. 동물을 국립 보건원(NIH) 및 실험실 동물 관리 평가 및 승인 협회(AAALAC)의 가이드라인에 따라 취급하였다. 동물을 플라스틱 병에서 펠렛화된 음식 및 식수에 대한 설비를 가지는 스테인리스 강 상부 그릴이 있는 35 x 30 x 15㎝ 크기의 폴리에틸렌 우리(우리마다 5마리)에 감금하고; 침구: 증기 멸균 깨끗한 벼 껍질(할렌사, 사니-칩(Sani-chip) 카탈로그: 2018SC+F호)을 사용하고, 침구 재료를 적어도 1주 2회 우리에 따라 바꿨다. 동물은 상업용 설치류 식이(데크라드 인증 글로벌 18% 단백질 식이 카탈로그 106S8216호)를 마음대로 공급받았다. 동물은 자치단체 공급으로부터 얻은 오토클레이빙되고 산성화된 식수(2.5 내지 3.5의 pH)에 자유로이 접근하였다. 동물을 적절한 신선한 공기 공급(최소 15 공기 변화/시간)에 의해 공기 컨디셔닝되고 여과(HEPA F6/6)된 표준 실험실 공기 하에 감금하였다. 동물을 기후 제어 환경에서 유지시켰다. 12시간 광 및 12시간 암 사이클로 온도 범위는 20 내지 24℃이고, RH 범위는 30 내지 70%였다.
수술 절차
수술일에, 70% N2O 및 30% O2의 혼합물 중의 4%의 아이소플루란에 의해 마취를 유도하고, 1.5 내지 2%의 아이소플루란에 의해 유지시켰다.
일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색을 문헌[Stroke 29, 2162-2170 (1998)]에서 이전에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 오른쪽 총경동맥(common carotid artery; CCA)을 중간선 목 절제를 통해 노출시키고, 조심스럽게 둘러싼 신경 및 근막으로부터 - 이의 분기점으로부터 두개골의 기부로 해부하였다. 외경동맥(external carotid artery; ECA)의 후두 동맥 가지를 이후 단리하고, 이 가지를 해부하고 응고시켰다. ECA를 추가로 원위로 해부하고, 말단 설동맥 및 악동맥 가지를 따라 응고시키고, 이후 이들을 분할하였다. 내경동맥(internal carotid artery; ICA)을 단리하고, 인접한 미주신경으로부터 조심스럽게 분리하고, 익구개 동맥을 5-0 나일론 봉합사(SMI(벨기에))에 의해 이의 기원에 가깝게 결찰하였다. 다음에, 4-0 명주 봉합사를 가동화된 ECA 절단부 주위에 헐겁게 묶고, 4㎝ 길이의 4-0 모노필라멘트 나일론 봉합사(봉합사의 끝을 불꽃을 사용함으로써 무디게 하고, 봉합사를 삽입 전에 폴리라이신에 의해 코칭함)를 근위 ECA를 통해 ICA로 및 이후 윌리스 고리(circle of Willis)로 삽입하여, MCA를 효과적으로 폐색하였다. 수술 상처를 봉합하고 동물을 이의 우리로 반환시켜 마취로부터 회복시켰다. 폐색 후 2시간에 래트를 재마취하고, 모노필라멘트를 빼내서 재관류를 허용하고, 수술 상처를 봉합시키고, 래트를 이의 우리로 돌려보냈다.
폐색 후 1시간에, 동물을 "배제 기준을 위한 신경점수"를 사용하여 신경학적 평가로 처리하였다. 10 이상의 전체 점수을 가지는 동물만이 연구에 포함되었다.
황산덱스트란 치료
폐색 후 2시간에(재관류 후 즉시) 시작하여, 2M 및 3M 군에서의 동물(1주 3회 30㎎/㎏ 또는 매일 15㎎/㎏의 용량의 황산덱스트란) 및 1M 군(비히클 대조군)에서의 동물을 피하로 주사하고, 표 10을 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00012
데이터 분석
다르게 기재되지 않은 한, 반복 측정에 대해 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 사후 비교 시험을 이용하여 모든 통계 분석을 수행하였다.
체중
연구에 걸쳐, 다양한 치료군 중에 체중의 통계적 유의차가 관찰되지 않았고, 도 9를 참조한다.
신경학적 시험 점수(신경점수)
평가: 시술 전, 폐색 후 1시간 및 7일, 14일, 21일 및 28일
변형 신경학적 순위 스케일(Modified Neurological Rating Scale: mNRS)을 수행하였다. 행동 평가가 이루어진 개인은 제공된 약물/용량을 알지 못했다(맹검 시험). 전체 점수 18을 가지는 신경점수를 문헌[Stroke 32, 1005-1011 (2001)]에 따라 수행하였다.
신경점수는 시험된 치료의 효과를 평가하기 위해 사용된 일련의 임상-신경 시험(운동, 감각, 반사 및 균형 시험의 복합)을 포함하였다. 신경점수는 0 내지 18(여기서, 정상 점수는 0이고, 최대 결함 점수는 18로 표시됨)의 스케일로 등급 매겨졌다. 예상된 바대로, 래트의 모든 군에서 급격한 신경학적 기능 감소는 이후 시간에 따라 자발적으로 개선되면서 tMCAO 유도 후 2시간에 관찰되었다. 28일까지의 연구에 걸쳐 제1 시험으로부터 7일에 비히클 치료된 대조군과 비교하여 1주 3회 30㎎/㎏의 황산덱스트란에 의해 치료된 2M 군 및 매일 15mg/㎏의 황산덱스트란에 의해 치료된 3M 군에서 통계적 유의차가 나타났고, 도 10을 참조한다. 2개의 투약 스케줄 2M 및 3M 사이에 통계 차이가 발견되지 않았다.
보행 시험
평가: 시술 전 및 7일, 14일, 21일 및 28일
보행 시험을 이용하여 앞다리 운동불능에 대해 동물을 시험하였다. 동물을 이의 뒷다리 및 1개의 앞다리가 한 손에 의해 고정되게 유지시키고, 제한되지 않은 앞발이 테이블에 따라 끌렸다. 동물이 앞다리 둘 다에 대해 앞 및 뒤 방향에서 테이블 표면(대략 5초에 85㎝)을 따라 측면으로 이동하면서 조정 보행의 수를 계수하였다.
동물의 운동 기능에 대한 지수로서 신경근 기능의 측정에 흔히 사용되는, 보행 시험에서 앞다리 운동불능에 대해 동물을 시험하였다. 대부분 자발적 기능 회복의 결과로서 tMCAO로 처리된 모든 동물에서 시간에 따른 운동 기능의 약간의 개선이 관찰되었다. 그러나, 황산덱스트란에 의해 치료된 래트에서의 기능 개선은 비히클 치료된 대조군과 비교하여 더 뚜렷하다. 2M 군 및 3M 군인, 동물의 치료군 둘 다에서, 이 개선은 제1 시험에서 7일에 시작하여 대조군과 비교하여 통계 유의성에 도달하고, 28일에 연구 종결까지 계속해서 개선되었고, 도 11을 참조한다. 2개의 투약 스케줄 2M 및 3M 사이에 통계 차이가 발견되지 않았다.
앞다리 배치
평가: 시술 전 및 7일, 14일, 21일 및 28일
앞다리 배치 시험을 위해, 조사자는 테이블 윗면에 가깝게 래트를 유지하고, 휘스커, 시각, 촉각 또는 고유수용 자극에 반응하여 테이블 윗면에서 앞다리를 배치하는 래트의 능력을 점수 매겼다. 별개의 하위점수가 감각 입력의 각각의 모드에 대해 얻어지고 추가되어 전체 점수(0 = 정상, 12 = 최대로 손상됨)를 제공한다.
앞다리 배치 시험(0-12):
휘스커 배치(0-2);
시각 배치(앞쪽(0-2), 옆쪽(0-2))
촉각 배치(배면(0-2), 측면(0-2))
고유수용 배치(0-2).
각각의 하위시험을 위해, 동물을 하기와 같이 점수 매겼다:
0.0 = 즉각적인 반응
0.5 = 2초 내의 반응
1.0 = 2-3초의 반응
1.5 = 3 초과의 반응
2.0 = 반응 무
체성감각 및 감각 운동 결함을 평가하기 위해 앞다리 배치 시험을 사용하였다. 다른 시험과 유사하게, 시간에 따른 감각 운동 결함에서의 약간의 자발적 개선이 tMCAO로 처리된 모든 동물에서 관찰되었다. 그러나, 황산덱스트란에 의해 치료된 모든 래트는, 14일에 시작하여 28일에 연구 종료까지 지속하는, 비히클 대조군 치료와 비교하여 통계적으로 유의적인 개선을 나타냈고, 도 12를 참조한다. 3M 군에서, 감각 운동 결함의 개선은 7일에 제1 시험 후 이미 통계 유의성에 도달하였다.
신체 흔들림 시험
평가: 시술 전 및 7일, 14일, 21일 및 28일
래트를 이의 꼬리의 바닥으로부터 대략 1인치에 유지하였다. 이후, 이것을 테이블의 표면 위로 1인치로 올렸다. 래트를 왼쪽 또는 오른쪽 측에 10° 이하로 한정된 수직 축에서 유지하였다. 래트가 수직 축으로부터 어느 한 측으로 이의 머리를 이동시킬 때마다 흔들림을 기록하였다. 또 다른 흔들림의 시도 전에, 래트는 다음 흔들림이 계수되도록 수직 위치로 돌아갔다. 20개의 전체 흔들림이 계수되었다. 정상 래트는 통상적으로 양 측면으로의 동일한 수의 흔들림을 가진다. 병소 허혈 후, 래트는 대측성 측(이 경우에 왼쪽 측)으로 흔들리는 경향이 있다. 신체 흔들림 점수는 전체 흔들림에 대한 오른쪽의 백분율로서 표현된다. 뇌졸중 후 1개월 동안 (50%를 향한) 신체 흔들림 점수의 자발적 부분 회복이 존재하였다.
신경근 기능의 측정에 흔히 사용되는, 신체 흔들림 시험에서 앞다리 운동불능에 대해 동물을 시험하였다. 시간에 따른 운동 기능에서의 약간의 자발적 개선이 tMCAO로 처리된 모든 동물에서 관찰되었다. 그러나, 황산덱스트란에 의해 치료된 모든 래트는, 7일에 제1 시험에서 시작하여 28일에 연구 종료까지 지속하는, 비히클 대조군 치료와 비교하여 통계적으로 유의적인 개선을 나타냈고, 도 13를 참조한다. 2개의 투약 2M 및 3M 군 사이에 통계 차이가 발견되지 않았다.
뇌 혈류 평가
평가: 29일
뇌 피질 및 혈관 수축에 대한 혈류의 평가를 플로우-R 레이저 도플러 시스템(Flow-R Laser Doppler system)을 사용하여 수행하고, 여기서 두개내 혈류 및 혈관 직경(수축/팽창)을 모니터링하였다. 이것을 뇌졸중 개시 후 29일에 수행하였다. 동물이 아이소플루란 마취 하에 있는 동안 도플러 절차를 수행하였다.
29일에 손상된 반구에서 뇌 혈류 복원에 대해 동물을 또한 검사하였다. 대조군 비히클-치료군 1M에 비해 tMCAO로 처리되고, 황산덱스트란에 의해 치료된 모든 동물(2M 및 3M 군)에서 뇌 혈액 관류 속도의 통계학적으로 유의적인 개선이 관찰되었다. 혈관 직경 비율은 대조군에 비해 황산덱스트란 치료된 동물에서 또한 증가하였고, 도 14 및 도 15를 참조한다.
샘플 수집 및 희생
MCAO 후 30일에, 래트를 케타민/자일라진에 의해 마취시키고, 완충 파라폼알데하이드(PFA) 4%에 의해 경심관류로 관류시켰다. 뇌를 수집하고 면역염색 및 조직학적 평가를 위해 4% 완충 PFA 중에 고정하였다.
뇌 샘플의 2개의 절편을 1M 및 3M 군으로부터 6마리의 동물의 동일한 부위로부터 수취하였다. 각각의 절편으로부터 전체 3개의 무작위 시야에서 현미경 하에 모세혈관을 계수하였다. 밀도는 관측 시야당 모세혈관의 평균 수로 표현된다. 매일 황산덱스트란 15mg/㎏에 의한 치료는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 뇌졸중 후 30일에 모세혈관의 수를 증가시켰다.
혈관신생 효과의 결과로서 비히클 치료된 대조군과 비교하여, tMCAO로 처리되고, 매일 황산덱스트란 15㎎/㎏으로 처리된, 동물에서 직경 30㎛ 미만의 SMA 모세혈관의 수의 개선이 관찰되었고, 도 16을 참조한다.
도 17A 및 도 17B는 비히클 대조군(도 17A) 및 황산덱스트란(15㎎/㎏, 매일) 군(도 17B)으로부터의 래트에 대해 모세혈관 밀도에 대한 치료 효과를 예시한다.
사망률 및 임상 징후
18마리의 래트가 연구 동안 죽었다. 1마리의 래트는 투약 전 재관류 직후 죽었고, 17마리의 래트(1M 군에서 6마리, 2M 군에서 6마리 및 3M 군에서 5마리)는 투약 후 10시간 내에 죽었다. 모든 동물 군에서 모델과 관련되지 않은 불리한 임상 징후가 관찰되지 않았다.
뇌졸중 tMCAO 래트-모델은 치료 동안 신경보호 및 재활 효과를 평가하기 위한 전통적으로 승인된 모델이다. 2개의 투약 스케줄에서 황산덱스트란 치료의 효율을 평가하기 위해 본 연구에서 이 모델을 사용하였다. 수술 절차 후 2시간에 시작하여 1주 3회 30㎎/㎏ 또는 15㎎/㎏의 매일 용량으로 피하 주사를 통해 28일 동안 래트를 황산덱스트란에 의해 치료하였다. 연구 동안, 수많은 행동 시험에서 신경학적, 운동 및 체성감각 기능을 모니터링하였다.
예상된 바대로, 뇌졸중 유도 후 28일 추적관찰 동안 신경학적 기능의 약간의 자발적 회복이 관찰되었다. 그러나, 황산덱스트란에 의해 치료된 군과 비히클 치료된 대조군 사이에 명확한 차이가 입증되었다. 그러나, 2개의 투약 스케줄 사이에 통계적 유의차가 주목할만하지 않았다. 약물 치료군 둘 다에서 신경 점수, 보행 시험 및 신체 흔들림 시험에 의해 평가된 바대로 운동 기능의 개선이 입증되었다(도 10, 도 11 및 도 13). 감각 운동 기능은 또한 황산덱스트란 치료 이후 회복되었다(도 12). 유리한 효과가 치료의 7일에 제1 시험에서 시작하여 관찰되었고, 28일에 연구 종료까지 계속해서 개선되었다. 모든 군이 이들 사이의 유의차 없이 동일한 속도로 체중이 증가하면서, 관찰된 효과는 일반적인 래트의 건강의 차이 때문일 수 없었다(도 9). 또한, 일반적인 임상 징후의 관찰된 차이가 주목할만하지 않았다. 황산덱스트란 치료의 효과가 이의 혈관신생 활성의 덕분이어야 할 것이다. 이 결론은 이환된 반구에서 뇌 혈액 관류 및 SMA 양성 모세혈관 밀도의 증가에 의해 지지된다. 황산덱스트란 치료는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 염증성 반응을 또한 감소시켰다.
이 발견의 관점에서, 황산덱스트란 치료가 래트 뇌졸중 모델에서 운동 및 체성감각 결함, 및 뇌 혈액 관류 및 혈관신생 활성을 명확히 개선한다는 것이 결론내리질 수 있다.
실시형태의 황산덱스트란은 이로써 CLI(실시예 1) 및 뇌졸중(실시예 2) 모델에서 혈관신생을 선택적으로 유도하는 것으로 나타났다. 실험 결과는 심지어 지연된 치료(결찰 후 시작 15일)가 효과적이라는 것을 나타낸다. 3 내지 30㎎/㎏(s.c.)의 간격 내의 용량은 효과적이고, 1주 1회 및 1주 3회의 단일 용량의 투여 프로토콜이 모두 효과적이다. 조직학은 새로 형성된 기능적 혈관 형성을 입증한다. 실시형태의 황산덱스트란은 이로써 허혈성 부위에서의 선택적인 효과를 제공한다.
실시예 3
심근 경색 모델에서의 황산덱스트란의 평가
본 연구는 심근 경색의 래트 모델에서의 황산덱스트란 치료의 혈관신생 효율을 평가하였다.
심장은 재생 능력이 제한되어서, 급성 심근 경색(MI)으로 소실된 근육은 제한된 혈관화에 의해 비수축성 반흔 조직에 의해 통상적으로 대체되었다. 혈관신생의 촉진 및 조직 관류의 증가는 MI 후 심장 회복에 대한 유망한 전략이다.
재료 및 방법
래트에서의 심근 경색 모델은 교내 스티치에 의한 영구적으로 왼쪽 관상 동맥을 결찰하는 것을 포함한다. 수술은 혈류의 폐색 및 후속하여 중증 허혈성 손상 및 심장벽 경색을 발생시켰다.
연구 개시(0일)에 평균 체중이 178g인 전체 150마리의 암컷 SD 래트를 할란 레버러토리즈(이스라엘)로부터 얻었다. 동물은 상업용 설치류 식이(데크라드 인증 글로벌 18% 단백질 식이)를 마음대로 공급받았다. 동물은 자치단체 공급으로부터 얻은 산성화된 식수(2.5 내지 3.5의 pH)에 자유로이 접근하였다. 동물을 표준 실험실 공기 하에 감금하였다. 12시간 광 및 12시간 암 사이클로 온도 범위는 20 내지 24℃이고, RH 범위는 30 내지 70%였다.
평균 분자량이 5 내지 7kDa의 범위인 황산덱스트란을 피케이 케미컬즈사(덴마크)로부터 얻었다. 황산덱스트란을 15㎎/㎏ 또는 3㎎/㎏의 용량으로 피하로 주사하고자 하는 0.9% NaCl(식염수)(테바 파마슈티컬 인더스트리즈사) 중에 용해시켰다.
수술 일자에, 동물을 90㎎/㎏의 케타민 및 10㎎/㎏의 자일라진의 조합에 의해 마취시켰다. MI를 유도하기 위해, 마취 및 무통증 하에, 래트 흉부를 왼쪽 개흉술에 의해 개복하고, 심장막을 제거하고, 근위 왼쪽 관상 동맥을 교내 스티치에 의해 영구적으로 폐색시켰다(Circulation 117, 1388-1396 (2008)). 수술 후 2시간에, 모든 치료군에서의 각각의 동물을 표 11에 따라 황산덱스트란 또는 식염수 비히클에 의해 s.c. 주사하였다.
Figure 112017003107665-pct00013
MI 유도 후 36일에, 래트를 CO2 흡입에 의해 희생시키고, 심장을 수확하고 4% 완충 포르말린 용액 중에 고정하였다. 일상적 파라핀 포매를 표준 조직학적 절차를 이용하여 수행하였다.
MI 크기 확인의 목적을 위해, 메이슨 트리크롬 염색(Masson's Trichrome Staining)을 사용하였다. 치료군(2M)의 9개의 심장 및 비치료군(1M)의 8개의 심장을 5개의 절편으로 횡단하여 절개하고, 이 절편을 파라핀 중에 포매하였다. 5㎛에서의 5개의 파라핀 절편을 리카(Lika) 마이크로톰에서 수행하였다. 모든 절편을 표준 메이슨 트리크롬 프로토콜에 따라 염색하였다. 절편을 컴퓨터 영상화 시스템에서 시각화하고, 경색부 크기를 이미지제이(ImageJ) 프로그램을 사용하여 마크하고 계산하였다. 경색부 크기는 전체 좌심실 면적에 대한 (비염색된) 경색부 면적의 백분율로 표현된다. 각각의 동물의 경우, 결찰을 함유하는 1개를 포함하여 5개의 연속 절편을 분석하고, 각각의 심장에 대한 모든 절편의 평균 값을 계산하였다. 혈관 밀도 계수치를 평가하기 위해 면역조직화학 마커(평활근 액틴 - SMA)를 사용하였다.
혈관 밀도 계수를 이환된 심근 부위의 경색부 병변의 가장자리에서 1㎜ 제곱당 수행하였다. X40 대물렌즈 확대를 사용하여 올림푸스(Olympus) BX43 현미경에서 사진을 찍었다. SMA 양성 혈관의 혈관 밀도 계수를 이미지 분석 소프트웨어 - 이미지 프로 플러스 5.1(Image Analysis software - Image Pro Plus 5.1)(미디아 사이버네틱스사(Media Cybernetics) 제품)을 사용하여 수행하였다.
결과
도 18은 MI 유도 후 35일에 경색부 크기를 예시한다. 모든 치료군은 비치료 대조군과 비교하여 더 작은 평균 경색부 크기를 가졌다. 치료군 2M과 대조군 1M 사이에 유의차가 있었다.
도 19는 치료군 2M 및 대조군 1M에 대한 MI 유도 후 35일에 SMA 염색을 비교한다. 황산덱스트란 치료는 비히클 대조군과 비교하여 더 높은 SMA 모세혈관 밀도를 발생시켰다.
도 20A 내지 도 20C는 2M 치료군에서의 2마리의 래트(도 20A 및 도 20B) 및 1M 대조군에서의 1마리의 래트(도 20C)에 대한 혈관 밀도에 대한 SMA 염색의 사진을 예시한다. 황산덱스트란 치료는 비히클 대조군과 비교하여 더 높은 SMA 혈관 밀도를 발생시켰다.
황산덱스트란은 대조군 비히클 치료군과 비교하여 래트에서 심근 경색 이후 치료군 2M에서의 경색부 용적을 유의적으로 감소시켰다. 동일한 황산덱스트란 치료군은 비히클 치료군과 비교하여 심장의 경색부 구역에서 모세혈관 밀도의 증가의 경향을 나타냈다. 황산덱스트란은 이로써 심근 경색 이후 경색부 구역에서 심근 및 혈관 복원을 촉진하고 혈관신생을 증대시킨다. 이것은 장기간 좌심실 개형을 개선하고, 좌심실 기능의 복원을 증대시킬 수 있다.
실시예 4
래트 뒷다리 허혈 모델에서의 혈관신생 효율의 평가
상기 실시예 1에 기재된 연구에서, 황산덱스트란의 혈관신생 효율은 마우스에서 안정한 중증 허혈 모델에서 입증되었다. 이 연구에서, 상이한 동물 종을 사용함으로써 혈관신생 및 기능 결과에 대한 황산덱스트란의 효율을 평가하기 위해 래트에서의 안정한 중증 허혈 모델(Toakai J Exp Clin Med 31(3), 128-13(2006))을 적용하였다.
재료
연구의 개시 전날에 황산덱스트란 용액을 제조하였다. 비히클로서, 0.9% NaCl(식염수)을 사용하였다. NaCl의 관련 용적을 칭량된 화합물에 첨가하여 6 및 60㎎/㎖의 농도를 얻어서(이것은 0.5㎖/㎏의 투여에 상응함), 각각 3 및 30㎎/㎏의 용량을 얻었다. 황산덱스트란(5 내지 7kDa의 범위 내의 평균 분자량은 피케이 케미컬즈사(덴마크)로부터 얻어짐)을 와류함으로써 또는 단순히 관을 수회 돌림으로써 용해시켰다. 응집체가 안정화되도록 용액을 4℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 관을 와류시키고 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켜 무균 용액을 얻었다. 제제는 4℃에서 저장될 때 15일까지 신뢰성 있는 것으로 생각되었다. 용액을 7일에 제조하고, 8 내지 21일에 사용하고; 제2 제제를 21일에 제조하고, 22일 내지 28일에 사용하였다.
연구 개시(0일)에 평균 체중이 277g인 90 제조 SD 래트를 할란 레버러토리즈(이스라엘)로부터 얻었다. 동물은 상업용 설치류 식이(데크라드 인증 글로벌 18% 단백질 식이)를 마음대로 공급받았다. 동물은 산성화된 식수(2.5 내지 3.5의 pH)에 자유로이 접근하였다.
동물을 국립 보건원(NIH) 및 실험실 동물 관리 평가 및 승인 협회(AAALAC)의 가이드라인에 따라 취급하였다. 동물을 플라스틱 병에서 펠렛화된 음식 및 식수에 대한 설비를 가지는 스테인리스 강 상부 그릴이 있는 35 x 30 x 15㎝ 크기의 폴리에틸렌 우리(우리마다 3마리)에 감금하고; 침구: 증기 멸균 깨끗한 벼 껍질(Harlan, Sani-chip 카탈로그: 7090A호)을 사용하고, 침구 재료를 적어도 1주 2회 우리에 따라 바꿨다. 동물은 상업용 설치류 식이(데크라드 인증 글로벌 18% 단백질 식이 카탈로그 106S8216호)를 마음대로 공급받았다. 동물은 자치단체 공급으로부터 얻은 오토클레이빙되고 산성화된 식수(2.5 내지 3.5의 pH)에 자유로이 접근하였다. 동물을 적절한 신선한 공기 공급(최소 15 공기 변화/시간)에 의해 공기 컨디셔닝되고 여과(HEPA F6/6)된 표준 실험실 공기 하에 감금하였다. 동물을 기후 제어 환경에서 유지시켰다. 12시간 광 및 12시간 암 사이클로 온도 범위는 20 내지 24℃이고, 상대 습도(RH) 범위는 30 내지 70%였다.
모든 수술 절차를 마취 및 무통증(1.5 내지 3.0%의 아이소플루란, 1.5%의 N2O 및 0.5%의 O2) 하에 수행하였다. 서혜부에서의 피부를 0.5-1.0㎝ 절개하였다. 대퇴 동맥 및 정맥을 4-0 명주실에 의해 2회 결찰하고, 결찰부 사이에 가로절단하였다. 상처를 3-0 명주실로 봉합하고, 래트가 회복하게 하였다.
수술 후 2주째인 8일에, 1주 3회 1M, 2M 및 3M 군에서의 각각의 동물에게 s.c. 주사하였다. 4M 및 5M 군에서의 동물을 8일에 1회 s.c. 주사하고, 표 12를 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00014
혈류 측정
양측으로부터의 다리에서의 혈류를 수술 전 -1일에 및 시술 후 1일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 비접촉 레이저 도플러에 의해 측정하였다. 혈류 측정은 정상 다리에서의 흐름에 대한 허혈성 사지에서의 흐름의 비율로서 표현된다.
모든 치료된 동물 군은 1일 내지 28일 사이에 비히클 치료된 대조군과 비교하여 시술된 사지에서 현저한 혈류 증가를 나타내고, 표 13 및 도 21을 참조한다. 비히클 치료된 대조군과 비교하여 황산덱스트란에 의해 치료된 모든 군에서 통계 유의차가 존재하였다.
Figure 112017003107665-pct00015
도 21은 비접촉 레이저 도플러에 의해 측정된 HLI 손상 다리와 비손상 다리 사이의 혈류의 비율을 보여준다. 상이한 군을 반복 측정에 대해 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 사후 시험을 이용하여 비교하였다. 황산덱스트란 치료군 2M, 3M, 4M 및 5M과 대조군 1M의 비교는 14일 내지 28일에 통계적 유의차를 나타냈다(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001).
허혈성 중증도
괴사 부위에 대해 등급화된 형태학적 스케일을 이용하여 허혈성 사지를 7일로부터 28일까지 주마다 거시적으로 평가하였다(표 4 참조). 황산덱스트란 및 비히클에 의해 치료된 모든 동물 군에서, 발가락 괴사 또는 발 절단이 관찰되지 않았다.
사지 기능 및 허혈성 손상의 생체내 평가
허혈성 사지의 손상된 사용의 반정량적 평가를 표 7에 제시된 스케일을 사용하여 수술 후 1주 1회 수행하였다. 점수 매김을 치료에 맹검인 구성원들에 의해 수행하였다.
황산덱스트란에 의해 치료된 모든 동물 군은 1일과 28일 사이에 비히클 치료된 대조군과 비교하여 사지 기능 개선을 가지고, 표 14 및 도 22를 참조한다.
Figure 112017003107665-pct00016
상이한 군을 반복 측정에 대해 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 사후 시험을 이용하여 비교하였다. 황산덱스트란 치료군 2M, 3M, 4M 및 5M과 대조군 1M의 비교는 14일 내지 28일에 통계적 유의차를 나타냈다(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001).
면역조직화학 및 모세혈관 밀도의 분석
근육 샘플의 4개의 절편을 1M, 2M, 3M, 4M, 5M 군으로부터 6마리의 동물의 동일한 구역으로부터 수취하고, SMA 및 8 인자에 대해 항체를 사용하여 혈관에 대해 염색하였다. 혈관의 부위를 영상 분석을 이용함으로써 평가하였다. 밀도는 관측 시야당 모세혈관의 평균 수로 표현된다. 전체 혈관은 측정된 부위에서의 모든 혈관을 나타낸다. 오른쪽 허혈성 사지에서의 SMA 및 8 인자 양성 모세혈관의 수는 연구 28일에 대조군 1M과 비교하여 모든 황산덱스트란 치료군 2M-5M에서 더 컸고, 도 23을 참조한다. SMA 및 8 인자 양성 염색은 래트에서 작은 모세혈관 형성에 대한 표시로서 생각되고, 따라서 얻어진 결과는 황산덱스트란에 의해 치료된 동물 군에서 관찰된 혈류 개선을 지지한다. 2방향 ANOVA, 이어서 본페로니 다중 비교를 사용하여 수행된 통계 분석, */**는 p<0.05/0.01을 나타낸다.
혈관조영술 분석
조영제로 채워진 혈관 사이의 교차의 수를 뒷다리 허혈의 유도 후 28일에 영상 분석에 의해 결정하였다. 혈관조영술은 비히클 치료된 대조군과 비교하여 황산덱스트란에 의해 치료된 래트에서의 이환된 사지에서 상당히 많은 수의 부행동맥(collateral)을 나타냈고(1방향 ANOVA, 이어서 본페로니 사후 시험에 따른 p<0.01 및 p<0.001), 도 24 및 도 25A 내지 도 25D를 참조한다.
손상된 혈관신생은 허혈성 질환의 특징 중 하나이다. 치료학적 혈관신생에 대한 가장 확립된 표적은 VEGF 및 이의 수용체이다. 그러나, 허혈을 경감시키기 위한 임상 실험은 실망스러워서, 허혈성 질환을 치료하기 위한 새로운 치료학적 표적에 대한 수요를 나타낸다.
본 연구에서, 2개의 상이한 용량 및 치료 섭생에서 황산덱스트란의 효율을 평가하기 위해 래트 뒷다리 허혈 모델에서의 혈류 개선을 조사하였다. 8일에 1주 3회 30 및 3㎎/㎏ s.c.의 용량 또는 단일 용량에서의 황산덱스트란 투여는 수술 후 14일로부터 비히클 치료된 대조군과 비교하여 상당히 혈액 관류를 회복시키고 사지 기능 점수를 개선하였다. 용량 및 투여 섭생 둘 다는효과적이었다. 어떠한 치료군 또는 대조군 동물 군에서도 자발적 절단 또는 발가락 괴사가 발생하지 않았다. 황산덱스트란 치료는 치료된 동물에서 어떠한 부작용도 발생시키지 않았다. 혈관조영술 점수(측부 동맥 확대의 측정치)는 비히클 치료군과 비교하여 다양한 치료군 사이에 통계 차이 없이 황산덱스트란에 의해 치료된 모든 동물 군에서 상당히 높았다. SMA 및 8 인자 모세혈관 밀도는 황산덱스트란 치료 후 또한 증가하였다. 총체적으로, 이 연구의 데이터는 래트 뒷다리 허혈 모델에서의 폐색성 말초 동맥 질환의 치료를 위한 황산덱스트란의 치료 효율을 확인시켜준다.
상기 기재된 실시형태는 본 발명의 몇몇 예시적인 실시예로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 실시형태에 다양한 변형, 조합 및 변경이 이루어질 수 있는 것으로 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 특히, 상이한 실시형태에서의 상이한 부분 해결책은, 기술적으로 가능한 경우, 다른 구성으로 조합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 정의된다.

Claims (28)

  1. 대상체에서 허혈성 조직 또는 장기에서의 혈관신생(angiogenesis)을 유도하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 10,000Da 이하의 평균 분자량 및 15 내지 20% 범위의 평균 황함량을 가지는 황산덱스트란 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며, 상기 대상체의 정맥 내 또는 피하 투여용으로 제제화되는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 평균 분자량은 2,000 내지 10,000Da의 범위 내인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 평균 분자량은 3,000 내지 10,000Da의 범위 내인, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 평균 분자량은 3,500 내지 9,500Da의 범위 내인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 평균 분자량은 4,500 내지 7,500Da의 범위 내인, 약제학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 평균 분자량은 4,500 내지 5,500Da의 범위 내인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 평균 황 함량은 17%인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 황산덱스트란 또는 상기 이의 약제학적으로 허용되는 염은 핵자기공명(NMR) 분광학에 의해 측정된 1,850 내지 2,000Da의 간격 내의 수 평균 분자량(Mn)을 갖는, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 황산덱스트란 또는 상기 이의 약제학적으로 허용되는 염은 평균 5.1의 포도당 단위 및 포도당 단위당 2.6 내지 2.7의 평균 설페이트 수를 갖는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 황산덱스트란 또는 상기 이의 약제학적으로 허용되는 염은 상기 대상체의 체중 1㎏당 0.05 내지 50㎎ 범위의 투약량으로 투여되도록 제제화된, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 황산덱스트란 또는 상기 이의 약제학적으로 허용되는 염은 상기 대상체의 체중 1㎏당 0.05 내지 30㎎ 범위의 투약량으로 투여되도록 제제화된, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 황산덱스트란 또는 상기 이의 약제학적으로 허용되는 염은 상기 대상체의 체중 1㎏당 0.1 내지 15㎎ 범위의 투약량으로 투여되도록 제제화된, 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 황산덱스트란 또는 상기 이의 약제학적으로 허용되는 염은 상기 대상체의 체중 1㎏당 0.1 내지 10㎎ 범위의 투약량으로 투여되도록 제제화된, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체의 신체에서 허혈을 야기하는 질환, 장애 또는 의학 병태를 앓는 상기 인간 대상체인, 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 의학 병태는 상처 치유, 말초 허혈, 관상동맥 허혈, 어린이의 허혈성 질환, 질식 뇌병증, 뇌성마비, 중추 신경계의 허혈, 근육 이영양성 질환, 혈전성, 출혈성 또는 외상성 손상에 의해 야기된 허혈로 이루어진 군으로부터 선택된, 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염은 황산덱스트란의 나트륨염인, 약제학적 조성물.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE538503C2 (en) * 2014-11-11 2016-08-16 Tx Medic Ab New dextran sulfate
CN107137421A (zh) * 2017-05-25 2017-09-08 青岛市中心医院 硫酸葡聚糖在制备抑制角膜血管新生药物中的应用
CN111263636A (zh) 2017-09-08 2020-06-09 Tx医生公司 硫酸葡聚糖的新用途
SE543275C2 (en) * 2019-03-07 2020-11-10 Tx Medic Ab Treatment efficiency evaluation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100798566B1 (ko) * 2000-06-27 2008-01-28 안제스에무지 가부시키가이샤 혈관 신생요법용 의약조성물

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5945547B2 (ja) 1977-01-31 1984-11-07 豊田合成株式会社 ステアリングホイ−ル
DE3634392A1 (de) 1986-10-09 1988-04-14 Knoll Ag Verwendung polysulfatierter niedermolekularer dextransulfate
US5135920A (en) 1988-11-16 1992-08-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Angiostatic agents
JPH02223525A (ja) * 1988-11-16 1990-09-05 Takeda Chem Ind Ltd 血管新生阻害剤
IT1264530B (it) * 1992-07-31 1996-10-02 Crinos Industria Farmaco Impiego dei polisaccaridi nelle neuropatie atrofico degenerative
US5744155A (en) * 1993-08-13 1998-04-28 Friedman; Doron Bioadhesive emulsion preparations for enhanced drug delivery
EP1021195A1 (en) * 1997-10-07 2000-07-26 The Regents Of The University Of California Treating occlusive peripheral vascular disease and coronary disease with combinations of heparin and an adenoside a2 agonist, or with adenosine
US6106554A (en) * 1999-02-25 2000-08-22 Bausch & Lomb Surgical, Inc. Intraocular lens implants for the prevention of secondary cataracts
JP5030124B2 (ja) * 2000-12-21 2012-09-19 竜一 森下 血管新生療法用医薬組成物
SE525461C3 (sv) * 2002-11-28 2005-03-23 Prophymed Ab Ny användning av dextransulfat
JP4532092B2 (ja) * 2003-09-30 2010-08-25 泰彦 田畑 血管新生剤
JP2006134692A (ja) * 2004-11-05 2006-05-25 Toppan Printing Co Ltd リチウム電池用外装材
JP4993606B2 (ja) 2005-06-16 2012-08-08 隆行 新藤 Ｒａｍｐ２を標的とする血管構造の安定化剤及び血管新生剤
CA2685208C (en) * 2007-04-24 2014-04-08 Novelmed Therapeutics, Inc. Methods and compositions of inhibiting complement and cellular activation with dextran sulfate
JP5612279B2 (ja) * 2009-06-26 2014-10-22 日本合成化学工業株式会社 心筋梗塞非ヒト動物モデル及びその作製方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100798566B1 (ko) * 2000-06-27 2008-01-28 안제스에무지 가부시키가이샤 혈관 신생요법용 의약조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
European Heart Journal. 2005. Vol.26, pp.2334-2343.*
Human & Experimental Toxicology. 1994. Vol.13, pp.233-239.*

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