PT792160E - Factor neurotrofico derivado das celulas gliais utilizado como agente neuroprotector - Google Patents

Description

Descrição “Factor neurotrófico derivado das células gliais, utilizado como agente neuroprotector”

Campo da invenção A presente invenção diz respeito à utilização do factor neurotrófico derivado das células gliais (FNDG, em inglês GDNF), como agente neuroprotector, e mais particularmente descreve uma terapêutica contra convulsões.

Antecedentes da invenção A epilepsia é uma doença neurodegenerativa vulgar. É no grupo etário das crianças e dos adolescentes que a incidência da doença é mais elevada, havendo neste grupo etário 75% de pacientes que desenvolvem epilepsia antes dos 20 anos de idade. A doença caracteriza-se por convulsões crónicas e recorrentes, indicativas de uma disfunção do sistema nervoso central que pode ser provocada por diversos factoies etiológicos. Por exemplo, a epilepsia tem sido imputada parcialmente a uma libertação excessiva ou a uma incorporação insuficiente de aminoácidos endógenos excitatórios, tais como o glutamato, o que pode dar origem a lesões neuronais e a necrose (Sperk, Prog In Neurobiol.. 42:1-32 (1994); McNamara, J. Neurosci., 14:3413-1325 (1994)).

As convulsões podem ser suscitadas num cérebro normal por tratamentos tais como os electrochoques (Swinyard et ai, J Pharmac. Exp. Ther.. 140:375-384 (1952)), excitação (Goddard et ai, Exp. Neurol,. 25:295 (1969)) ou por meio de agentes químicos convulsivos (Nadler, Life Sei.. 24:2031-2042 (1981); Ben-Ari et d, Neurosci.. 6:1361-1391 (1981)). A produção de convulsões por meio destes métodos e as subsequentes lesões cerebrais iniciam uma cascata complexa de alterações regenerativas e plásticas, incluindo a expressão de genes antecipativos imediatos e factores de crescimento no hipocampo e noutras regiões do cérebro de ratos adultos (Sperk, Prog. In Neurobiol.. 42:1-32 (1994)). As alterações na expressão do factor de crescimento dos nervos (FCN, em inglês NGF), do factor de crescimento dos fibro-blastos básicos (FCFb. em inglês bFGF) e no factor neurotrófico derivado do cérebro (FNDC, em inglês BDNF) contribuem para a plasticidade do cérebro lesionado, em modelos de lesões em conformidade com Gall et al., Mol. Brain Res„ 9:113-123 (1991); Emfors et al., Neuron.. 7:165-176 (1991); e Follesa et al., Exp. NeuroL 127:37-44 (1994). A administração sistémica ou intracraniana de ácido caínico aos ratos induz uma síndroma caracterizada por um estado epiléptico límbico agudo e a subsequente lesão cerebral neuronal semelhante à observada no lobo temporal na epilepsia dos seres humanos. Assim, o ácido caínico é vulgarmente utilizado como ferramenta para o estudo da epilepsia do lobo temporal em animais experimentais (Ben-Ari et al., Neurosci- 6:1361-1391 (1981); e Nadler, Life Sei.. 24:2031-2042 (1981)). O receptor de cainato é um dos três receptores glutamato ionotrópicos, sendo os outros dois designados pelos seus agonistas preferidos: NMDA (N-metil-D-aspartato) e AMPA (propionato de a-amino-3-hídroxi-5-metil-4-isoxazoI). Os receptores de cainato e AMPA são frequentemente designados no seu conjunto por receptores de tipo não NMDA. Os receptores de tipo não NMDA fazem circular principahnente catiões monovalentes e intervêm na transmissão sináptica excitatória rápida, tendo sido demonstrado mais recentemente que desempenham um papel importante na manutenção de determinados processos de plasticidade (Miller, Neurosci.. 14:477-179 (1991); e Muller et al., Science. 242:1694-1697 (1988)).

Num estudo recente ficou demonstrado que os níveis de ARNm num novo factor neurotrófico, o factor neurotrófico derivado das células gliais (FNDG) aumentam no hipocampo dos adultos após as convulsões induzidas pelo ácido caínico (Humpel et al., Neurosci.. 59:791-795 (1994)). O faetor neurotrófico derivado das células gliais, que é um elemento da superfamília do faetor β do crescimento transformante (Ρ-β(ΤΓ, em inglês TGF-β), foi clonado e expresso e demonstrou-se que manifesta in vitro uma poderosa actividade trófica para os neurónios dopaminérgicos mesencefálicos ventrais do cérebro médio embrionário (Lin et ui, Science. 260:1130-1132 (1993); e Lin et al., J. Neurochem.. 63:758-768 (1994)). Também se demonstrou que o FNDG recombinante humano (FNDGih, em inglês rfiGDNF) induz a germinação de fibras dopaminérgicas in vivo (Hudson et ai, Soe. Neurosci. Abstr.. 19:652 (1993)), aumenta o ritmo de transformação da dopamina na substância negra dos ratos (Hudson et al., supra; Miller et al., Soe. Neurosci Abstr.. 20:535.7 (1994)), protege os neurónios contra as lesões provocadas por 6-OHDA e aumenta o crescimento e a formação de fibras em transplantes de tecido negro de fetos de rato in oculo (Stromberg et al., Exp. Neurol.. 124:401--412 (1993)). Além disso, uma análise feita por hibridação in situ comprovou a expressão de ARNm do FNDG em cérebros embrionários, mas não em cérebros adultos normais, sugerindo isso que o FNDGrh pode ser um faetor derivado do objectivo relevante, durante o desenvolvimento (Olson et al., Soe. Neurosci. Abstr.. 19:652 (1993); e Stromberg et al., Exp.

Neurol.. 124:401-412 (1993)). A epilepsia é frequentemente tratada com farmacos para se evitar a ocorrência de ataques convulsivos. Dos pacientes que reagem favoravelmente a tal terapia, há cerca de 60% que continuam a ter ataques convulsivos, embora menos frequenlemeníe. Dos 40% de pacientes que são tratáveis, há contudo muitos deles que são afectados por efeitos secundários graves, por exemplo, fadiga, sonolência e impotência que afectam de uma forma importante a sua qualidade de vida. Assim sendo, continuam a ser necessárias terapias alternativas que sejam eficazes e não induzam os referidos efeitos secundários graves. A presente invenção responde a esta necessidade e também proporciona vantagens afins.

Descrição abreviada da invenção A presente invenção tem por objecto revelar que o FNDG confere neuroprotecção contra doenças associadas aos ataques convulsivos, tais corno a epilepsia Assim sendo, a presente invenção descreve métodos para inibir os ataques convulsivos mediante a administração de FNDG a um paciente que necessite de uma terapia contra as convulsões, numa quantidade suficiente para inibir ou impedir o início dos ataques convulsivos.

De acordo com a presente invenção, esta proporciona a utilização do factor neurotrófico derivado das células gliais para a produção de um agente terapêutico para inibir a actividade convulsiva, em que o referido agente terapêutico não é para ser administrado como um adeno-vírus recombinante que possua uma sequência heteróloga de ADN que codifique o factor neurotrófico derivado das células gliais.

De acordo com a presente invenção, esta proporciona também a utilização do factor neurotrófico derivado das células gliais para a produção de um agente terapêutico para inibir a perda de células neuronais que tem lugar em consequência da actividade convulsiva.

De acordo com mais um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona a utilização do factor neurotrófico derivado das células gliais para a produção de um medicamento utilizável numa terapia contra os ataques convulsivos, em que o referido medicamento não é para ser administrado como um adenovírus recombinante que compreenda uma sequência heteróloga de ADN que codifique o factor neurotrófico derivado das células gliais.

De preferência, o FNDG é produzido por via recombinante e é administrado em mistura com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Posto isto, a presente invenção descreve também composições farmacêuticas que incorporam uma quantidade terapeuticamente eficaz de FNDG e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Descrição resumida dos desenhos A figura 1 mostra que o FNDGrh confere protecção contra as perdas neuronais induzidas pelo ácido caínico. O FNDG intraventricular (0,5, 550 pg/2 pL) protege as CAI do hipocampo (figura IA), as amígdalas (figura 1B) e os neurónios talâmicos (figura 1C) contra as lesões induzidas pelo ácido caínico (administração subcutânea de 12 mg/kg). Os animais receberam FNDGrh nas concentrações de 0,05, 0,5, 5 ou 50 pg/4 pL (respectivamente de C a F), FNDG inactivo (B) ou veículo (A) 1 hora antes da administração do ácido caínico. O grupo G representa animais normais que não foram objecto de nenhumas manipulações. Comparativamente com o grupo que recebeu ácido caínico/veículo, nos animais tratados com FNDG, aumentou significativamente a sobrevivência neuronal em todas as regiões examinadas. O número de neurónios contados é a média ± D.P. de 9-24 determinações. A sígnificância das diferenças entre a administração de veículo e a administração de FNDGrh foi de P < 0,01 (**) e de P < 0,05 (*), utilizando o teste t de Student De igual modo, houve uma diferença significativa (P < 0,01) entre os grupos de tratamento só com veículo (A) e os que não foram objecto de nenhum tratamento (G). A figura 2 mostra que o FNDGrh confere protecção contra as perdas de células piramidais CAI do hipocampo, induzidas pelo ácido caínico. Secções coronais da região CAI do hipocampo contrastadas com violeta-de-cresilo x 25. (figura 2A): 7 dias após a administração do ácido caínico (12 mgftg, s.c.) + veículo (2 pL/v.ic.). Veja-se a necrose das células piramidais CAI. (Figura 2B): ratos normais sacrificados ao mesmo tempo. (Figura 2C): 7 dias após a

administração do ácido caínico (12 mg/kg s.c.) + FNDGA (50 pg/2 pL, v.ic.)- Veja-se a protecção das células piramidais CAI. A figura 3 mostra graficamente os efeitos de (Δ) FNDGrh (50 pg/2 pL v.ic.), (A) veículo (2 pL v.ic.), (□) ácido caínico (12 mg/kg s.c.) + FNDGrh (50 pg/2 pL, v.ic.), (O) ácido caínico (12 mg/kg s.c.) + FNDGih (0,5 pg/2 pL v.ic.) e (B)ácido caínico (12 mg/kg s.c.) + veículo (2 pL, v.ic.), sobre a sua acção indirecta na perda de peso. Os pesos corporais foram determinados diariamente durante 7 dias e os seus valores estão expressos em termos de variação do peso corporal a partir do dia zero. Os compostos foram administrados no dia zero. Os valores são a média ± D.P. (n = 7-11).

Descrição minuciosa da invenção A presente invenção diz respeito à utilização do íàctor neurotrófico derivado das células gliais para a produção de um agente terapêutico para inibir a actividade convulsiva, em que o referido agente terapêutico não é para administração como um adenovírus recombinante que compreenda uma sequência heteróloga de ADN que codifique o factor neurotrófico derivado das células gliais.

De acordo com uma variante da presente invenção, o FNDG preferido é a proteína humana que ocorre naturalmente. A proteína humana que ocorre naturalmente é preferida para terapia de seres humanos, em parte porque se admite que constitua um risco menor de originar efeitos secundários fisiológicos imprevisíveis e indesejáveis em pacientes tratados com ela. No entanto, na medida em que os FNDG de origem não humana, tais como o FNDG do rato, são substancialmente equivalentes aos FNDG dos seres humanos e possuem uma actividade biológica equivalente, também são considerados abrangidos no âmbito da presente invenção.

Para os efeitos aqui pretendidos, considera-se que uma proteína “ocorre naturalmente” se essa proteína ou uma proteína praticamcntc equivalente existir nonnalmente nos seres humanos saudáveis. As proteínas que “ocorrem naturalmente” compreendem especificamente as formas de proteínas que existem em seres humanos saudáveis e que são parcialmente truncadas nos terminais amino ou carboxilo ou que possuam aminoácidos que tenham sido desaminados ou de algum modo modificados por via química. As proteínas que “ocorrem naturalmente” podem ser obtidas pelos métodos do ADN recombinante e também por isolamento a partir das células que nonnalmente as produzam. A expressão “que ocorre naturahnente” também abrange as proteínas que contenham ou às quais falte um grupo metionilo no terminal NH2 em consequência da expressão em £ coli. A frase “praticamente equivalente” utilizada na memória descritiva e nas reivindicações anexas tem por objecto significar que há um grau muito elevado de homologia entre resíduos aminoácidos (ver, de um modo geral. M. Dayoff, Alias of Protein Sequence and Structure. vol. 5, pág. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.) e também que há uma actividade biológica comparável. O FNDG particularmente preferido da presente invenção é a proteína que ocorre naturalmente e que foi isolada a partir de meio condicionado de crescimento das células de glioblastoma B49 isento de soro, conforme já anteriormente descrito na publicação PCT com o n° WO 93/06116. Há outras formas preferidas de FNDG que também estão descritas no documento 93/06116.

As sequências de ácidos nucleicos dos genes que codificam os FNDG humanos c do rato e as sequências de aminoácidos dessas proteínas também estão indicadas no pedido de patente de invenção WO 93/06116. A presente invenção compreende as formas de FNDG não glicosiladas e também as formas truncadas das proteínas FNDG que ocorram naturalmente e as recombin antes.

As formas modificadas de FNDG também estão previstas nas utilizações dos métodos da presente invenção. Por exemplo, é possível modificar um FNDG por acoplamento a um ou vários radicais polietileno-gicol (PEG), a outros radicais poliméricos repetitivos ou a outras cadeias secundárias acopladas à estrutura polipeptídica básica dos FNDG. Ainda de acordo com outra variante, a sequência de aminoácidos da cadeia de polipeptidos pode ser modificada, por exemplo, por substituição, adição ou supressão de um ou vários aminoácidos, desde que a acbvidade anticonvulsiva desejada dos FNDG não seja substancialmente prejudicada. Assim sendo, o termo “FDNG” pretende abranger todas as formas de FNDG.

No pedido de patente de invenção WO 93/06116 também estão descritos métodos para a produção de diversas formas de FNDG. Um dos métodos descritos consiste em isolar os FNDG provenientes de diversas fontes, tais como o meio de células B49 isento de soro. Um segundo método descrito consiste em isolar os genes responsáveis pela codificação dos FNDG, efectuar a clonagem dos genes em vectores e tipos de células convenientes e exprimir os genes para que produzam os FNDG. Este último método, que é exemplificaíivo dos métodos do ADN recombinante, em geral, é um método preferível da presente invenção. Os métodos do ADN recombinante são preferidos, em parte porque permitem obter comparativamente quantidades mais elevadas de proteínas com uma pureza maior.

De preferência, o FNDG descrito antes é produzido pelo método já referido numa forma “praticamente pura”. A expressão “pradeamente pura” significa que o FNDG, numa forma não modificada, tem uma actividade específica comparativamente elevada. No entanto, faz-se observar que os derivados das formas modificadas de FNDG podem ter diferentes actividades

Uma vez que é possível que a actividade anticonvulsiva do FNDG lhe é conferida por uma ou várias parcelas discretas e separáveis da proteína, também se antevê que o método da presente invenção possa ser praticado administrando uma composição terapêutica cujo ingrediente activo seja essa parcela (ou essas parcelas) do FNDG que controla (ou controlam) a função anticonvulsiva.

De acordo com uma variante preferida da presente invenção, de ver administrada aos pacientes uma composição farmacêutica que contém o FNDG numa quantidade eficaz, para a sua neuroprotecção. Para aplicações terapêuticas, o FNDG pode ser formulado conjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável para a produção de composições farmacêuticas. A expressão “veículo farmaceuticamente aceitável” aqui utilizada refere-se a um veículo não tóxico, geralmente inerte para o agente activo, que não afecte de forma prejudicial o agente ou o paciente a quem a composição irá ser administrada. Os veículos ou excipientes podem ser encontrados em textos farmacêuticos convencionais, por exemplo, na obra ReminptmPs Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tais veículos compreendem, por exemplo, soluções aquosas como os tampões bicarbonato, os tampões fosfato, a solução de Ringer e o soluto salino fisiológico. Além disso, o veículo pode conter outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para modificar ou manter o pH, a osmolaridade, a viscosidade, a transparência, a cor, a esterilidade, a estabilidade, a velocidade de dissolução ou o odor da formulação.

As composições farmacêuticas podem ser preparadas por métodos conhecidos na especialidade, incluindo, a título de exemplo, a simples mistura dos reagentes. Os especialistas na matéria sabem que a escolha do veículo farmacêutico e da preparação adequada da composição dependem do fim cm vista e do modo de administração.

De acordo com uma variante, prevê-se que o veículo e o FNDG, enquanto agente activo, constituam uma formulação de libertação lenta fisiologicamente compatível F, possível regular a velocidade de libertação dos agentes activos mediante uma escolha correcta dos gmpos de ligação instáveis no oligonucleótido, matéria esta que é conhecida pelos especialistas neste domínio. O solvente pnmário para tal veículo pode sei de natureza aquosa ou não aquosa. Além disso, o veículo pode conter outros excipientes farmacologicamente aceitáveis para modificar ou manter o pH, a osmolaridade, a viscosidade, a transparência, a cor, a esterilidade, a estabilidade, a velocidade de dissolução ou o odor da formulação. De igual modo, o veículo também pode conter outros excipientes farmacologicamente aceitáveis para modificar ou manter a estabilidade, a velocidade de dissolução, a libertação ou a absorção dos agentes activos. Tais excipientes são as substâncias vulgar e correntemente utilizadas para formular doses para administração parentética, quer sob uma forma de dose unitária quer sob uma forma de doses múltiplas.

Uma vez formulada a composição farmacêutica, esta pode ser guardada em fiascos estéreis, sob a forma de soluções, suspensões, geles, emulsões, sólidos ou pós desidratados ou liofilizados. Tais formulações podem ser guardadas quer numa forma pronta para utilização quer numa forma que necessite de ser reconstituída imediatamente antes da administração. A armazenagem preferida de tais formulações faz-se a temperaturas não superiores a 4°C e de preferência a -70°C. Também é preferível que essas formulações que contêm os agentes activos sejam guardadas e administradas a valores de pH próximos do valor fisiológico. Presentemente admite-se que seja indesejável a administração numa formulação com um valor de pH elevado (isto é, superior a 8) ou com um valor de pH baixo (isto é, inferior a 5). A via de administração das formulações farmacêuticas que contêm os agentes activos para aplicação sistémica pode ser intracraniana, subcutânea, intramuscular, intravenosa ou -7 ' /. y ' ' ' -.-11 oral. De preferência, o modo de administração das formulações farmacêuticas que contêm os agentes activos para aplicação local é a sua introdução directamente no cérebro pelo circuito ventricular intracraniano (v.ic.) com a ajuda de catéteres e bombas.

Para administração oral, a composição farmacêutica da presente invenção é encapsulada. Os agentes activos encapsulados podem ser formulados conjuntameute ou não com veículos faimaceuticamente aceitáveis vulgarmente utilizados na formulação de formas de dosagem no estado sólido. De preferência, a cápsula é concebida de modo a que a parte actíva da formulação seja libertada no ponto do tracto gastrointestinal onde a biodisponibilidade seja maximizada e a degradação pré-sistémica seja minimizada. É possível incorporar outros excipientes para facilitar a absorção dos agentes activos. Também é possível utilizar diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes auxiliares da suspensão, agentes desintegradores de comprimidos e aglutinantes. lndependentemente do modo de administração, calcula-se a dose especifica tendo em conta o peso aproximado do corpo do paciente. Entre outros íàctores a ter em conta na determinação do regime adequado de dosagem, refere-se a doença ou a patologia que se pretende tratar ou evitar, a via de administração e a idade, o sexo e a avaliação médica do paciente. Em determinados casos, estipula-se o regime de dosagem e o modo de administração para se criar um intervalo pré-seleccionado de concentrações do FNDG na corrente sanguínea do paciente. De preferência, administra-se o FNDG em doses compreendidas entre cerca de 0,0005 mg/kg e 1 mg/kg Os outros refinamentos dos cálculos necessários para se determinar o regime adequado de dosagem para o tratamento, envolvendo cada uma das formulações anteriormente referidas, são feitos habitualmente pelos especialistas na matéria, sendo isso uma questão que resolvem dentro das suas tarefas habituais, sem necessidade de uma experimentação excessiva, especialmentc à luz da informação sobre regimes de dosagem e ensaios aqui descritos. Esses regimes de dosagem podem ser estipulados recorrendo à prática de ensaios perfeitamente definidos para a determinação das dosagens utilizadas, em conjunto com os dados adequados de tipo dose-rcsposta.

Conforme se disse antes, a dosagem suficiente para se administrar uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de FNDG pode ser determinada pelos especialistas na matéria sem necessidade de uma experimentação desmedida Pude definir-sc uma “quantidade terapenti-camente eficaz” como sendo a quantidade de FNDG suficiente para inibir ou para evitar convulsões no paciente.

Faz-se observar que as formulações de FNDG aqui descritas podem ser utilizadas para aplicações tanto veterinárias como humanas e que o termo “paciente” deve ser tomado sem nenhumas limitações. No caso das aplicações veterinárias, os regimes de dosagem devem ser idênticos aos especificados antes.

Em estudos feitos a propósito da presente invenção, e descritos mais minuciosamente nos exemplos, demonstrou-se que o FNDGrh evita as convulsões induzidas pelo cainato e as concomitantes perdas de células neuronais. Este efeito foi observado mesmo com doses relativamente baixas e de uma forma dependente das doses. A imunocontrastação pronunciada observada com o FNDGrh nas regiões CAI e CA3 do hipocampo coincide com a observada nas regiões do hipocampo que são extremamente vulneráveis à toxicidade induzida pelo ácido caínico, conforme descrito por J.V. Nadler, The Hippocampus-New Vistas, págs. 463--481 (Alan R. Liss, 1989). A intensa constrastação do FNDGrh, por acção de um anticorpo policlonal anti-FNDG, foi observada bilateralmente, indicando isso que esta proteína se pode deslocar por todo o sistema ventricular, o que pode ser uma explicação paru α conservação bilateral dos neurónios CAI.

Os resultados indicam que o FNDGrh pode ter simultaneamente actividade anticonvulsiva e antiepileptogénica, conforme indicado pela inibição respectivamente das convulsões (únicas- -crónicas e sacudidelas de tipo cão molhado. Parece que as propriedades anticonvulsivas do FNDGrh são mais potentes do que as acções antiepileptogémcas. Admite-se que a epileptogénese e as convulsões tenham perfis farmacológicos diferentes. A epileptogénese pode ser bloqueada pelos antagonistas do receptor de NMDA (Stasheffeí a/., Science. 245:648-651 (1989)). Pelo contrário, no caso das convulsões podem ser necessárias concentrações mais elevadas de antagonistas ou podem não ser bloqueadas por todos os antagonistas do NMDA, se bem que possam ser bastante sensíveis aos fánnacos anticonvulsivos vulgannente utilizados. A epileptogénese é uma mudança relativamente permanente que ocorre quando o tecido neural é transformado, passando de um estado normal para um estado epiléptico (Stasheff et al., supra). Nestes estudos foram avaliados os efeitos do FNDGrh directamente sobre as modificações permanentes no tecido neural; no entanto, as sacudidelas de tipo cão molhado, que constituem um prelúdio de tais modificações, foram inibidas pelo FNDGrh.

As convulsões induzidas pelo ácido caínico produzem um padrão consistente de lesões cerebrais, a partir do momento em que um estado epiléptico tenha sido atingido e mantido para além de um período crítico (Ben-Ari et al., Neurosci.. 375-403 (1985); e Tanaka et al., proa Neurobio!. 38:317-334 (1992)). O padrão de lesões cerebrais observado nestes estudos é semelhante ao já descrito na literatura. Com a administração periférica de cainato foi verificada uma ausência de pendas neuronais, induzidas pelo ácido caínico, na região CA3 do hipocampo (Nadler, The Hjppocampus-New Vistas, págs. 463-481 (Alan R. Liss, 1989)). Os efeitos neuro-protectores do FNDGrh sobre os neurónios do hipocampo, do tálamo e amigdalóides é consistente com uma redução da actividade convulsiva por acção deste factor neurotrófico. No entanto, não é de excluir um possível efeito directo do FNDGrh sobre a excitotoxicidade induzida pelo ácido caínico, uma vez que há outros Setores neurotrófico^ tais como o FCFb e O FCN, que podem conferir protecçõo contra a excitotoxicidade induzida pelo glutamaío, conforme descrito por Hefti et al., Neurobiol Aginp 10:515-588 (1989); Berlove et al., Soe.

Neurosci. Abstr.. 17:1267 (1991); Shigeno et aL, J. Neurosci.. 11:2914-2919 (1991); Cheng e Mattson, Neuron. 7:1031-1041 (1991); Shimohama et ai, Neurosci. Lett.. 164:55-58 (1993); e Mattson e Cheng, Stroke. 24:1-136 -1-140 (1993).

No entanto, admite-se como improvável que o FNDGih possa actuar como um inibidor dos complexos de receptores-canais do glutamato, com base nos requisitos estruturais destes receptores para a activação, conforme descrito por Dingledine et al. na obra Neurobiology. 14:1-96 (1988). É mais provável que o FNDGrh possa influenciar fenómenos ou sistemas a jusante que estejam associados à activação do receptor do glutamato. Comprovou-se que há outros factores neurotrófícos que têm os efeitos seguintes: (a) modificações nas funções ou no número de receptores do glutamato; (b) indução de enzimas protectoras, quer sejam proteínas do stress quer sejam enzimas do metabolismo dos superóxidos; (c) alterações dos equilíbrios iónicos - em especial nas reservas do cálcio intracelular ou na actividade de ATPase associada a Na+/K+; e (d) efeitos mediadores indirectos através das células gliais. A possibilidade de o FNDGrh poder ter uma actividade depressiva geral sobre a transmissão sináptica poderia explicar a inibição da actividade convulsiva induzida pelo ácido caínico. No entanto, estudos preliminares electrofisiológicos in vitro, utilizando lâminas finas de hipocampo do rato, indicaram que o FNDGrh, na concentração de 2 pg/mL, não afectou os potenciais suscitados que foram registados nas áreas CAI e CA3, tendo para tal sido utilizadas técnicas convencionais de registos extracelulares. A melhoria das convulsões induzidas pelo ácido caínico pode reflectir eventualmente uma redução na biodisponibilidade do ácido caínico por acção do FNDGrh. Isto parece improvável, tomando por base as relações diferenciais de tipo dose/resposta relativas ao FNDGrh em termos de redução das sacudidelas de tipo cão molhado e das convulsões tónicas-crónicas. Além disso, o FNDGrh inactivo não inibiu as convulsões induzidas pelo ácido caínico. Λ aptidão do hipocampo para exprimir ARNm do FNDG, após convulsões induzidas pelo ácido cainico, sugere que o cérebro pode ter capacidade para produzir FNDG em determinadas condições geradoras de stress. Este fenómeno não é invulgar, uma vez que há muitos elementos da família de genes de FCN que aumentam extemalizadamente devido a lesões excitotóxicas e/ou convulsões. Sem se pretender estabelecer nenhuma dependência em relação a qualquer teoria particular, presume-se que a produção local de FNDG actue como um travão no processo convul sivo/excitotóxico, limitando assim as lesões potenciais que eventualmente possam ter lugar. Os neurónios do hipocampo exprimem os dois tipos de receptores ionotrópicos e metabotrópicos de glutamato e presume-se que a activação do receptor NMDA ionotrópico indirectamente pelo cainato participe na regulação do ARNm dos FNDG. Esta conclusão é fundamentada por estudos recentes que demonstram que o bloqueador MK-801, específico do canal do receptor NMDA (Wong et al, Proc. Natl. AcacL Sei. U.S.A.. 83:7104-7108 (1986)), atenuou a expressão de ARNm dos FNDG induzida pelo ácido cainico (Humpel, Neurosci.. 59:791-795 (1994)). Esta redução da expressão do ARNm do FNDG é consistente com a hipótese anterior, uma vez que a actividade epileptiforme poderia ser reduzida, poderiam ocorrer menos lesões excitotóxicas na região CAI do hipocampo e poderia ser reduzido o estímulo para a produção endógena de FNDG. A conclusão de que uma única injecção de FNDGrh, sob a forma de bolus, por via ventricular intracerebral reduz a massa corporal dos ratos, fundamenta estudos anteriores que levaram a inferir que a administração central ou periférica de neurotrofinas induz a perda de massa corporal (Altar et al., Proc, Nafl. Acad. Sei. U.S.A., 89:11347-11351 (1992); Martm--Iverson et al, J. Neurosci.. 14:1262-1270 (1994)). Os eventuais mecanismos subjacentes a uma diminuição da massa corporal podem estar relacionados com alterações no domínio das monoaminas centrais, tais como a dopamina e a 5-HT. A administração periférica de ácido caínico também induziu alterações da massa corporal. Recentemente, Hajnal et cã., Braiii Res. Duil.. 29:209-916 (1992), demonstraram que as microlesões produzidas pelo ácido caínico, aplicado por via iontoforética no núcleo central da amígdala originaram perdas de massa corporal, hipofagia ou afagia e hipodipsia ou adipsia, de uma forma dependente das doses. Estes estudos também sugeriram que as perturbações alimentares duradouras, produzidas pelo ácido caínico na amígdala, não estavam relacionadas de uma forma causal com as alterações patológicas da actividade EEG, estando antes relacionadas com o enfraquecimento dos mecanismos complexos regulativos implicados no comportamento alimentar. A amígdala não é a única região do cérebro que comanda o comportamento alimentar, podendo a excitotoxicidade produzida pelo cainato afectar outras regiões cerebrais que comandam o comportamento alimentar. A observação de que doses diminutas de FNDGrh atenuaram as perdas de massa induzidas pelo ácido caínico, pode ser consistente com a sua aptidão para reduzir lesões excitotóxicas e para evitar a destruição do circuito neural que está associado ao comportamento alimentar. A acentuação das perdas de massa pela dose mais elevada de FNDGrh representa mais do que a soma dos efeitos do ácido caínico e do FNDGrh. Assim, na mediação dos fenómenos de perdas de massa corporal pode haver um efeito sinérgico entre o FNDGrh e outros mediadores endógenos libertados durante as lesões cerebrais.

Estudos prévios efectuados in vitro indicaram que o FNDGrh é um poderoso factor neurotrófico que reforça a sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos do cérebro médio e que tais efeitos parecem ser relativamente específicos para este sistema transmissor (Lm et cã., Science. 260:1130-1132 (1993)). Os estudos actuais indicam que o FNDGrh pode ter outras acçõcs sobre os sistemas neurotransmissores, tais como o sistema glutaminérgico. Esta conclusão é fundamentada também pelo facto de se ter descortinado que o ARNm do FNDG se estende às populações neuronais diferentes dos neurónios que contêm dopamina (Schaar etal, Exp. Neurol., 124:368-371 (1993); Humpel et ai, Ncurosci.. 59:791-795 (1994)). A utilização de factores neurotróficos, como terapia potencial nos casos de epilepsia, parece constituir uma nova forma de atacar o problema e presume-se que estes estudos constituam a primeira demonstração do bloqueio eficaz da actividade convulsiva por uru factor neurotrófico no modelo de epilepsia dos lobos temporais.

Os exemplos adiante descritos têm por objecto ilustrar a presente invenção, sem lhe impor qualquer limitação. EXEMPLO 1 A. Preparação de FNDGrh activo

Realizou-se a expressão de FNDGrh madum em E. coli pelos mesmos métodos descritos por McDonald et al. na obra Biochim. Bioohvs. Acta. 1090:70-80 (1991) aqui incorporada por referência. A seguir recuperou-se o FNDGrh, sob a forma de corpos de inclusão que foram isolados a partir do lisado celular por centrifugação e solubilizados em guanidina 4 M, cisteína 90 mM e Tris 20 mM a pH 8,5. Efectuou-se a renaturação da proteína para passar à espécie activa por diluição 10X com guanidina 0,2 M, ureia 2 M e Tris 20 mM a pH 8,75. A mistura redobrada foi mantida a 4°C durante 2 dias antes de ser aplicada a uma coluna de tipo ‘SP Sepharose Big Bead’ (Pharmacia) equilibrada em acetato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 300 mM a pH 5. Efectuou-se a eluição do FNDG recombinante humano a partir da coluna, utilizando um gradiente salino de cloreto de sódio a variar entre 0,3 M e 0,6 M. As fracções que continham o FNDGrh foram combinadas e diluídas com igual volume de cloreto de sódio 5 M e citrato dc sódio 20 mM, antes de serem carregadas numa coluna de ‘Phenyl--Sepharose’ (alta capacidade, Pharmacia) equilibrada em cloreto de sódio 2,5 M e citrato de 18 sódio 20 mM a pH 5. Efectuou-se a elvrição do FNDGrh, a partir da coluna de alta capacidade, com um gradiente salmo de cloreto de sódio decrescente a variar entre 2,5 M e 0 M. Juntou--se as fraeções adequadas que foram diluídas com igual volume de acetato de sódio 20 mM. A mistura proteinica diluída foi aplicada depois a uma coluna de elevado rendimento de tipo ‘SP Sepharose' (Pharmacia) equilibrada em acetato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 475 mM a pH 5. Efectuou-se a eluição do FNDGrh a partir da coluna, com um gradiente salino de cloreto de sódio a variar entre 475 mM e 675 mM. As fraeções que continham o FNDGrh purificado foram combinadas, concentradas e guardadas a -20°C. B. Preparação do FNDGrh inactivo

Inactivou-se quimicamente o FNDG recombinante humano, bloqueando os grupos ácido carboxílico da proteína com um excesso de éster metílico da glicina por acoplamento de carbodiimida. Efectuou-se a diafiltração de 100 mg do FNDGrh purificado, em MES 0,5 M a pH 5, até se atingir uma concentração final da proteína igual a 1 mg/mL. Acrescentou-se EDC e éster metílico da glicina, respectivamente com as concentrações de 80 mM e 800 mM. Deixou-se a mistura de reacção em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Efectuou-se a diálise da mistura em presença de soluto salino tamponado com fosfato para se remover os reagentes em excesso, antes de ter sido guardada a -20°C. EXEMPLO 2 Cirurjpa

Foram utilizados ratos F344 adultos (machos da estirpe Harlen), pesando entre 200 g e 225 g Os animais foram mantidos a uma temperatura constante de 22°C e cumpriram um ciclo de 12 horas com luz e 12 horas sem luz. Os animais tiveram sempre acesso livre aos alimentos e à água. Anestesiou-se os animais com isofluorano a 2,5% + O2 e depois foram colocados numa armação estereotáxica ‘Kopf, sob anestesia permanente. Estes animais receberam uma injecção unilateral quer de FNDGih (50, 5, 0,5, 0,05 μ§β pL), quer de veículo (Soluto Salino Tamponado com Fosfato; 2 pL) quer de FNDG inactivo (2 pg/2 pL), durante um período de 5 minutos, no ventrículo lateral (v.ic.), tendo para tal sido utilizada uma seringa de Hamilton de calibre 26. Deixou-se ficar a seringa de Hamilton no seu lugar durante mais 5 minutos antes da remoção. As coordenadas das injecções relativas à bregma foram: AP -0,8, ML -1,5 e uma profundidade de 3,5 mm contados a partir da dura-máter. A pele dos animais foi suturada com agrafos e esperou-se que decorresse um período para 0 seu restabelecimento. Quer o FNDGrh, quer 0 FNDG inactivo quer 0 veículo foram administrados 1 hora antes do ácido caínico. Dissolveu-se ácido caínico (Tocris Neuramin, Inglaterra) em soluto salino a 0,9% e administrou-se esta mistura por via subcutânea à razão de 12 mg/kg. Registou-se o peso dos animais diariamente durante todo 0 período do estudo. EXEMPLO 3 Histologia do cérebro

Decorridos 7 dias após a administração de ácido caínico, anestesiou-se os ratos com pentobaibitona sódica à razão de 5 ragjkg (i.p.) e efectuou-se-lhes uma perfusão transcardiana com uma solução de formalma tamponada com fosfato. Efectuou-se-lhes a remoção dos cérebros que foram estabilizados por imersão, pelo menos durante 24 horas, na mesma solução estabilizadora. A seguir efectuou-se a desidratação dos cérebros que foram então embebidos em cera parafínica e cortados coronalmente em lâminas delgadas com a espessura de 5 pin, tendo as secções sido contrastadas com Nissl. Utilizando um microscópio de Leitz, efectuou-.se

uma contagem das células viáveis bilateralmente nas regiões CAI e CA3 do hipocampo, do tálamo (núcleos talâmicos parafasciculares e talàmicos periventricularcs) e da amígdala (área anterolateral da amígdala-hipocampo; núcleo posterior basomediano amigdalóide; núcleo basolateral amigdalóide; núcleo amigdalóide cortical posterior e posteromediano). Os números de células, comprimentos e áreas foram determinados a 4,16 mm abaixo da bregma (-4,16 mm) (Paxinos e Watson). Mediu-se o comprimento linear total do sector CAI do hipocampo por meio de um sistema de análise de imagens ‘lmage-Γ (Universal Tmagmg Corp., West Chester, PA). Mediu-se a área talâmica e as áreas amigdalóides por meio de um retículo ocular de 100 mm2 correspondente a 0,25 mm2 numa escala linear calibrada, utilizando uma objectiva com uma amplificação de 20X. O número de células contadas foi expresso em termos de células/mm para a região do hipocampo e em termos de células/mm2 para o tálamo e para a amígdala. EXEMPLO 4

Distribuição de FNDGrh

Decorridas 24 horas após a injecçâo ventricular intracrianiana (v.ic.) de FNDGrh (100 pg/ /4 pL), efectuou-se uma operação de perfúsão dos ratos com uma solução de formalina a 10% tamponada e neutra, realizou-se a remoção dos cérebros que foram embebidos em parafina e seccionados depois em lâminas delgadas de 5 pm. As secções foram imunocontrastadas para observação do FNDG, tendo para tal sido utilizado um anticorpo de coelho purificado por afinidade, destinado ao FNDGrh. Utilizou-se o anticorpo (0,59 mg/mL) com uma diluição de 1:100 e manteve-se a incubar com as secções durante 1 hora, antes de se aplicar anticorpo de coelho monovalente biotinilado e subsequentemente a substância ‘Omnitags Streptavidin

Alkaline Phosphatase’ (Lipshaw Immunon, Pittsburg, PA). Efectuou-se a revelação das secções utilizando o sistema de substrato ‘New Fuchsm’ (Dako Corp., Carpinteria, CA). As contraprovas negativas foram secções em que o anticorpo irrelevante, em concentrações semelhantes, serviu para substituir o anticorpo primário, e secções obtidas a partir de ratos injectados com soluto salino tamponado com fosfato. As lâminas delgadas foram montadas com ‘Crystal Mount’ (Biomeda, Foste- City, CA) e depois com ‘Pennounf (Fischer Scientific, Fairlawn, NJ) para se criar uma preparação permanente. Avaliou-se a distribuição de FNDGrb utilizando um microscópio de Leitz equipado com um micrómetro ocular. EXEMPLO 5 Bioensaio

Efectuou-se um bioensaio para se pesquisar a actividade de FNDGrh e de FNDG inactivo, conforme descrito por Lin et cd. na publicação X Biol. Chem.. 265:8942-8947 (1990), obra que aqui se considera incorporada por referência. Dito de forma abreviada, o ensaio in vitro para pesquisa da actividade do FNDG permitiu medir a sobrevivência dos neurónios da cadeia do sistema simpático (E90) embrionário dos pintainhos. Foram utilizados 2000 neurónios purificados que foram colocados dentro de cada cavidade (lóculo) de um prato de 96 cavidades a que foram acrescentadas diluições sequenciais de amostras de FNDG. Decorridas 44 horas fez-se uma estimativa do número de neurónios sobreviventes, em termos da aptidão das células vivas para efectuarem a redução do corante vital MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil--tetrazólio) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Exprimiu-se a bioactividade do FNDGrh em termos do valor CE50 que é uma diluição do FNDGrh que proporciona 50% da sobrevivência ncuronol máxima, com base no ensaio com MTT. 22' EXEMPLO 6 Estatística

Utilizando o teste t de Student efectuou-se uma análise de comparações histológicas entre animais de contraprova e animais tratados com FNDG. Efectuou-se uma análise de regressão logística para se testar o efeito de tipo dose-resposta devido ao FNlXjrh sobre as sacudidelas de tipo cão molhado e sobre as convulsões de tipo tónico-crónico e a seguir efectuou-se um teste de exactidão à Fisher. Efectuou-se uma análise comparativa das massas corporais recorrendo ao teste de Wald, que é uma análise unidireccional da variância (ANOVA) a que se seguiu um procedimento de comparações múltiplas à Scheffe. EXEMPLO 7 Resultados A injecção periférica de cainato, à razão de 12 mg/kg a ratos da estirpe Físcher 344, induziu sacudidelas de tipo cão molhado e convulsões em menos de 2 horas e mortalidade antes de decorridas as primeiras 8 horas (Quadro 1).

Quadro 1 FNDG Pg/2pL Sacudidelas de tipo cão molhado Convulsões tónicas-crónicas Mortes 50 2/10 0/10 0/10 5 5/8 1/8 0/8 0,5 7/7 0/7 0/7 0,05 8/8 7/8 4/8 2, inactivo 8/8 7/8 4/8 Veículo 13/13 13/13 2/13 23 23

O quadro 1 mostra a actividade anticonvulsiva do FNDGrh contra o ácido caínico (12 mg/kg s.c.). Uma hora antes da administração do ácido caínico administrou-se o FNDG recombinante humano, veículo ou FNDG inactivo (v.ic.). Os valores indicam o número de ratos em que foram observadas sacudidelas de tipo cão molhado, convulsões tónicas-crónicas ou que morreram. Todos os animais foram monitorizados durante as primeiras 12 horas após a administração do ácido cainico e depois apenas diariamente. Utilizando o teste de exactidão à Fisher, os níveis de dosagem que foram significativos para as sacudidelas de tipo cão molhado foram de 50 pg (p = 0,00009) e de 5 pg (p = 0,042). No caso das convulsões tónicas-crónicas foram significativas doses de 0,05 (p = 0,012), 0,5 (p = 0,00001), 5 (p = 0,00007) e 50 (p = 0,0000009).

Estas modificações comportamentais, tal como assinaladas no quadro 1, foram consistentes com estudos anteriores descritos por Lothman & Collins na obra ‘Brain Res.’. 218:299-318 (1981). A administração íntravenlricular de FNDGih (0,05-50 pg/2 pg) atenuou de forma significativa (p = 0,0036) as sacudidelas de tipo cão molhado induzidas pelo ácido caínico, de uma forma dependente da dose. De igual modo, os ratos tratados com ácido caínico, que receberam o FNDgrh por via intracerebroventricular, em doses compreendidas entre 0,5 pj^2 pL e 50 pg/2 pL, não revelaram actividade convulsiva tónica-crónica, ao passo que 50% dos animais tratados com a dose mais baixa (0,05 pg/2 pL) e os animais injectados quer com veículo (STP, n = 13) quer com FNDg inactivo (2 pg/2 pL) tiveram convulsões tónicas-crónicas (p = 0,0008, analise de regressão logística; ver o quadro 1). Não houve mortes entre os ratos que receberam FNDGrh, tendo havido mortes entre os ratos que receberam veículo ou FNDG inactivo. Além disso, o FNDGih atrasou o começo das sacudidelas de tipo Cão molhado. Os animais tratados com veículo tiveram sacudidelas de tipo cão molhado ao fim de 30 minutos após a administração do ácido caínico. A administração de FNDG recombinante humano (50 pg/2 μι e 5 pg/2 pL) retardou o começo das sacudidelas de tipo cão molhado por mais 30 a 60 minutos, ao passo que as doses mais baias atrasaram o começo apenas em 15 a 20 minutos. A injecçao periférica de cainato produziu consistentemente perdas neuronais na região CAI do hipocampo, talâmica e da amígdala, que foram detectadas 7 dias mais tarde. O exame histológico do hipocampo revelou uma perda de 50% a 60% das células piramidais CAI em todos os animais que tinham recebido veículo ou o FNDG inactivo (v.ic.), comparativamente com os animais de contraprova (figuras 1 e 2). A perda de células piramidais CAI por acção do cainato foi altamente significativa (p < 0,01, teste t de Student). A administração de FNDGrh (0,5-50 pg/2 pL, v.ic.) atenuou de forma significativa (p < 0,001) a poda intensa de células piramidais CAI induzida pelo cainato nos sectores esquerdo e direito do hipocampo, comparativamente com os animais tratados com veículo (2 pL, v.ic.), uma dose baixa de FNDG (0,05 pg/2 pL) ou FNDG inactivo (2 pg/2 pL). O número de células piramidais CAI viáveis não foi significativamente diferente nos animais tratados com FNDGrh (50 pg), comparativamente com os animais normais (figura 1). O ácido caínico também provocou uma perda intensa de neurónios talâmicos e amigdalóides, a qual foi significativamente atenuada (p < 0,01) pelo FNDgrh (0,5-50 pg/pL) (figura 1). A protecção conferida pelo FNDGth (50 pg/2 pL) também foi comprovada contra as perdas de células neuronais induzidas pelo ácido caínico, ao inibir a necrose e a vacuolização intensas da formação talâmica pelo ácido caínico na ausência de FNDGth.

As secções imunocontrastadas de ratos injectados com FNDGrh (100 pg4 pL) revelaram uma distribuição disseminada da proteína por todo o sistema ventricular, pelos tecidos pen-ventrioulaies, no espaço subaracnoideu e nos neutrófilos subjacentes ao fim de 24 horas após a injecção de FNDGrh. Verificou-se uma imunocontrastação positiva na face lateral do 25 hipocampo nas áreas CAlb, CAlc, CA2 e CA3 que estão adjacentes às partes posteriores dos ventrículos laterais. A administração de FNDGrh (50 pg/2 pL) por via v.ic. a animais de linha genuína produziu uma diminuição importante da massa corporal e uma velocidade menor de aumento da massa corporal ao longo do período de duração do estudo, comparativamente com os animais tratados só com veículo (figura 3). A análise revelou simultaneamente uma diferença na velocidade de variação da massa corporal entre o dia zero e o 7° dia (teste à Wald, p < 0,001) e uma diferença na variação do peso total (teste à Wald, p < 0,001). Efectuou-se a comparação (ANOVA unidireccional) da variação da massa corporal desde o valor de referência até ao valor observado ao 7o dia entre os grupos tratados com cainato e com FNDGrh e também entre os grupos tratados com cainato e veículo. A análise revelou uma diferença nítida nas variações de peso entre os grupos de tratamento (p < 0,001). As doses mais baixas de FNDGih atenuaram aparentemente as perdas de massa provocadas pelo cainato, não tendo por si próprias produzido nenhumas perdas adicionais de peso (teste à Scheffe, p < 0,05). No entanto, a administração de doses mais elevadas de FNDGrh (50 pg/pL e 5 pg/pL) exacerbou aparentemente as perdas de massa (teste à Scheffe, p < 0,05) (quadro 2).

Grupo Quadro 2 Média D.P. 50 pg de FNDGrh -10,6 6,8 Veículo 5,4 4,8 Ácido caínico (AC) + veículo -6,5 9,0 AC + 0,05 pg de FNDGrh 4,3 6,4 AC + 0,5 pg de FNDGrh 10,1 4,7 AC + 5 pg de FNDGih -15,9 22,1 AC + 50 pg de FNDGrh -31,4 11,9 26 O FNDGrii muitíssimo purificado favoreceu, em cultura, a sobrevivência dos neurónios das cadeias do sistema simpático dos pintainhos. O teste de sobrevivência neuronal da cadeia do sistema simpático embrionário dos pintainhos, com o FNDGrh modificado quimicamente (até 750 ng/mL), não revelou nenhuma actividade biológica detectável quando comparado com o FNDGrh activo (CE50 = 10 ng/mL).

As formas inactiva e activa de FNDG foram testadas para se pesquisar os níveis de lipopolissacáridos (LPS) e de proteínas de E. coli (PEC). Estes níveis foram respectivamente > 1 UE/mg e > 50 ppm. A memória descritiva anterior é exemplificativa e tem por objecto ilustrar e explicar a presente invenção.

Lisboa, 29 de Novembro de 2001

Claims (7)

1 {? Reivindicações 1. Utilização do factor neurotrófico derivado das células gliais para a preparação de um agente terapêutico para inibir a actividade convulsiva, em que o referido agente terapêutico não se destina a ser administrado como um adenovírus recombinante que compreenda uma sequência heteróloga de ADN que codifique o factor neurotrófico derivado das células gliais.

2. Utilização do factor neurotrófico derivado das células gliais para a preparação de um agente terapêutico para inibir as perdas de células neuronais resultantes da actividade convulsiva.

3. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que a actividade convulsiva está associada à epilepsia.

4. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a actividade convulsiva é provocada por uma quantidade prejudicial de ácido caínico.

5. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o factor neurotrófico derivado das células gliais é produzido por métodos do ADN recombinante. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o factor neurotrófico derivado das células gliais é adequado para administração num veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

6. η 2 η 2

7. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o factor neurotrófíco derivado das células gliais é adequado para administração intracraniana ou intraventricular. Utilização de factor neurotrófico derivado das células gliais para a preparação de um medicamento utilizável em terapia anticonvulsiva, em que o referido medicamento não se destina a ser administrado como um adenovírus recombinante que compreenda uma sequência heteróloga de ADN que codifique o factor neurotrófico derivado das células gliais. Lisboa, 29 de Novembro de 2001