JPH10508839A - 神経保護薬としてのグリア誘導神経栄養因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、発作行動を抑制又は防止するためのグリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の使用に係わる。本発明の方法は、てんかんのような神経変性疾患を有するか又は潜在的に有する患者に対してＧＤＮＦを投与することによって実現される。調剤上許容可能な担体中に治療有効量のＧＤＮＦを含む調剤組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 神経保護薬としてのグリア誘導神経栄養因子 発明の分野 本発明は、神経保護薬としての、特に抗発作薬としての，グリア誘導神経栄養 因子（ＧＤＮＦ）の使用に係わる。発明の背景 てんかんは、一般的な神経変性疾患である。小児と１０代の子供たちにこの疾 患の高い発生率が認められ、この年齢グループの患者の７５％が２０才になる前 にてんかんを発症する。この疾患は、様々な病因によって引き起こされる可能性 がある中枢神経系機能障害を示す慢性又は再発性の発作を特徴とする。例えば、 てんかんは、一部では、ニューロンの損傷と壊死を生じさせる可能性がある内因 性興奮性アミノ酸（例えばグルタミン酸）の過剰放出又は吸収障害に起因すると されている（Ｓｐｅｒｋ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，４２：１− ３２（１９９４）、及び、ＭｃＮａｍａｒａ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４： ３４１３−１３２５（１９９４））。 電気刺激（Ｓｗｉｎｙａｒｄ他，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．， １４０：３７５−３８４（１９５２））、キ ンドリング（Ｇｏｄｄａｒｄ他，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：２９５（１９６ ９））、又は、化学痙攣剤（Ｎａｄｌｅｒ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２４：２０３ １−２０４２（１９８１）、及び、Ｂｅｎ−Ａｒｉ他，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６ ：１３６１−１３９１（１９８１））のような処置によって、正常な脳において 発作を生じさせることが可能である。これらの方法による発作の発生とその後の 脳損傷は、成体ラットの海馬とその他の脳領域とにおける即時型遺伝子と成長因 子との発現を含む再生的変化と可塑的変化との複合カスケードを生じさせる（Ｓ ｐｅｒｋ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，４２：１−３２（１９９４ ））。Ｇａｌｌ他， Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．，９：１１３−１２３（１ ９９１）、Ｅｒｎｆｏｒｓ他，Ｎｅｕｒｏｎ，７：１６５−１７６（１９９１） 、及び、Ｆｏｌｌｅｓａ他，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２７：３７−４４（１ ９９４）によれば、神経成長因子（ＮＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦ ＧＦ）、及び、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現の変化が、損傷を受けた 脳の可塑性をもたらす。 ラットに対するカイニン酸の全身的投与又は頭蓋内投与は、ヒトにおける側頭 葉てんかんに認められるそれと同様の急性辺 縁てんかん重積状態とそれに続くニューロン性脳損傷とを特徴とする症候群を生 じさせる。このために、カイニン酸が実験動物における側頭葉てんかんの研究ツ ールとして広く使用されている（Ｂｅｎ−Ａｒｉ他，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６： １３６１−１３９１（１９８１）、及び、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ２４：２０３１−２０４２（１９８１））。 カイニン酸塩受容体は、３つのイオン栄養性グルタミン酸塩受容体の中の１つ であり、他の２つは、これらの受容体の好ましい作動薬に関して名付けられ、即 ち、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルタート）受容体とＡＭＰＡ（α−アミ ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオナート）受容 体である。カイニン酸塩受容体とＡＭＰＡ受容体を非ＮＭＤＡ受容体と総称する ことが多い。非ＮＭＤＡ受容体は主に一価カチオンを通過させ、高速興奮性シナ プス伝達を仲介するが、更に最近になって、特定の可塑性プロセスの維持におい て重要な役割を演じることが明らかにされている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ． ，１４：４７７−４７９（１９９１）、及び、Ｍｕｌｌｅｒ他，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ，２４２：１６９４：１６９７（１９８８））。 最近の報告では、カイニン酸によって誘導される発作後に、成体の海馬におい て、新規の神経栄養因子であるグリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に関するｍ ＲＮＡレベルが増大することが明らかにされた（Ｈｕｍｐｅｌ他，Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ ，．５９：７９１−７９５（１９９４））。トランスフォーミング成長因子 β（ＴＧＦ−β）上科のメンバーであるグリア誘導神経栄養因子を、クローニン グし、発現させ、この神経栄養因子が胚中脳腹側の中脳ドパミン作動性ニューロ ンに対する強力な栄養活性をインビトロで示すことが実証されている（Ｌｉｎ他 ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１３０−１１３２（１９９３）、及び、Ｌｉｎ他 ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６３：７５８−７６８（１９９４））。更に、組 換えヒトＧＤＮＦ（ｒｈＧＤＮＦ）が、インビボでドパミン作動性繊維の発芽を 誘導し（Ｈｕｄｓｏｎ他，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．，１９：６ ５２（１９９３））、ラットの黒質中でのドパミン代謝回転を増大させ（Ｈｕｄ ｓｏｎ他，上記、及び、Ｍｉｌｌｅｒ他，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ ｒ． ，２０：５３５．７（１９９４））、６−ＯＨＤＡ病変からニューロンを保 護し、眼内の黒質組織のラット胎児移植片の成長と繊維形成と を増大させる（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ他，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：４０ １−４１２（１９９３））ことが既に実証されている。更に、インシツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのハイブリッド形成の分析によって、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡは胚脳に おいて発現するが正常な成体の脳においては発現しないことが明らかになってお り、このことは、発生中においてｒｈＧＤＮＦが標的誘導因子である可能性があ ることを示唆している（Ｏｌｓｏｎ他，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ ． ，１９：６５２（１９９３）、及び、Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ他，Ｅｘｐ．Ｎｅｕ ｒｏｌ． ，１２４：４０１−４１２（１９９３））。 痙攣発作の発生を防止するために薬剤でてんかんを治療する場合が多い。こう した治療法に対して反応する患者の約６０％が、発作の頻度は低下するものの、 依然として発作を経験する。しかし、治療可能な患者の４０％のうち、こうした 患者の多くが深刻な副作用（例えば、患者の生活の質に著しい悪影響を与える疲 労感、眠気、及び、無力感）を経験する。従って、効果的であり且つこうした深 刻な副作用を生じさせない代替の治療法が必要とされている。本発明はこの必要 を満たし、関連の利点も提供する。発明の要約 本発明は、てんかんのような発作に関連した疾患に対する神経保護をＧＤＮＦ がもたらすという発見に係わる。従って、本発明は、抗発作治療を必要とする患 者に対して発作の発生を抑制又は防止するのに充分な量のＧＤＮＦを投与するこ とによる、発作の抑制のための方法を提供する。 ＧＤＮＦを組換えによって生産し、調剤上許容可能な担体中にＧＤＮＦを含む 形でＧＤＮＦを投与することが好ましい。従って、本発明は更に、治療有効量の ＧＤＮＦと調剤上許容可能な担体とを含む調剤組成物を提供する。図面の簡単な説明 図１は、カイニン酸由来ニューロン損失に対する保護をｒｈＧＤＮＦが与える ことを示している。脳室内ＧＤＮＦ（０．５、５、５０μｇ／２μＬ）が、海馬 ＣＡ１ニューロン（図１Ａ）と扁桃ニューロン（図１Ｂ）と視床ニューロン（図 １Ｃ）をカイニン酸（１２ｍｇ／ｋｇ、皮下）由来病変から保護する。カイニン 酸を投与する１時間前に、動物に対して、ｒｈＧＤＮＦ（各々に、０．０５μｇ ／４μＬ、０．５μｇ／４μＬ、５μｇ／４μＬ、又は、５０μｇ／４μＬ）（ グループＣ−Ｆ）、 不活性ＧＤＮＦ（グループＢ）、又は、ビヒクル（グループＡ）を投与した。グ ループＧは、処置を全く受けなかった正常な動物を表す。カイニン酸／ビヒクル グループに比較して、ＧＤＮＦ処置動物は、検査した全ての領域でニューロン生 存の著しい増大を示した。ニューロン計数は９−２４回の測定の平均±Ｓ．Ｅ． Ｍ．である。スチューデントｔ検定を使用した時の、ビヒクルとｒｈＧＤＮＦと の間の差異の有意性はＰ＜０．０１（^**）とＰ＜０．０５（^* ）だった。同様に 、ビヒクルグループ（Ａ）と非処置グループ（Ｇ）との間に有意差があった（Ｐ ＜０．０１）。 図２は、カイニン酸由来の海馬ＣＡ１錐体細胞損失に対する保護をｒｈＧＤＮ Ｆが与えることを示す。クレシルバイオレット（ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ） で染色したラットＣＡ１海馬領域の冠状切片（２５倍）。（図２Ａ）：カイニン 酸（１２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）＋ビヒクル（２μＬ 頭蓋内脳室内（ｉｃｖ） ）７日後。ＣＡ１錐体細胞の壊死に留意されたい。（図２Ｂ）：同時に死亡させ た正常ラット。（図２Ｃ）：カイニン酸（１２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）＋ｒｈＧ ＤＮＦ（５０μｇ／２μＬ ｉｃｖ）７日後。ＣＡ１錐体細胞の保護に留意さ れたい。 図３は、△ｒｈＧＤＮＦ（５０μｇ／２μＬ ｉｃｖ）、▲ビヒクル（２μＬ ｉｃｖ）、□カイニン酸（１２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）＋ｒｈＧＤＮＦ（５０ μｇ／２μＬ ｉｃｖ）、◇カイニン酸（１２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）＋ｒｈＧ ＤＮＦ（０．５μｇ／２μＬ ｉｃｖ）、及び、■カイニン酸（１２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）＋ビヒクル（２μＬ ｉｃｖ）が、体重損失の仲介に対して及ぼす 影響をグラフとして示している。体重を７日間測定し、その測定値をゼロ日目か らの体重増加として表す。化合物をゼロ日目に投与した。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ ．（ｎ＝７−１１）である。発明の詳細な説明 本発明は、治療有効量のＧＤＮＦ、好ましくは治療有効量の組換えヒトＧＤＮ Ｆ（ｒｈＧＤＮＦ）を投与することによる患者の発作を阻害するための方法を提 供する。 本発明の１つの実施様態では、好ましいＧＤＮＦは自然発生ヒトタンパク質で ある。この自然発生ヒトタンパク質は、そのタンパク質を使用して治療される患 者に予想外の有害な生理学的副作用を生じさせる危険性がより低いと考えられる ので、人 間に対する療法として好ましい。しかし、非ヒトＧＤＮＦ（例えばラットＧＤＮ Ｆ）がヒトＧＤＮＦと実質的に等価であり且つ等価の生物活性を有する限り、こ うした非ヒトＧＤＮＦも本発明の範囲内に含まれると見なされる。 本発明では、タンパク質又はこれと実質的に等価のタンパク質が健康な人間に 通常見い出すことが可能である場合に、このタンパク質を「自然発生」タンパク 質であるとみなす。「自然発生」タンパク質は、特に、そのタンパク質のアミノ 末端又はカルボキシル末端で部分的に切断されている、又は、脱アミノ化もしく は他の形で化学修飾されているアミノ酸を有する、健康な人間に存在することが 認められるタンパク質の諸形態を含む。「自然発生」タンパク質を、組換えＤＮ Ａ法と、そのタンパク質を通常生産する細胞から単離することとによって、得る ことが可能である。 「自然発生」タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現の結果としての、ＮＨ₂−末端 メチオニル基を含むか又は含まないタンパク質も含む。 本明細書とクレームとの全体で使用する術語「実質的に等価である」は、極め て高い度合いのアミノ酸残基相同性（概括的 には、本明細書に特に組み入れているＭ．Ｄａｙｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐ ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ，ｖｏｌ．５， ｐ．１２４（１９７２），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照さ れたい）と等価の生物活性とを有することを意味すると定義する。 本発明の特に好ましいＧＤＮＦは、本明細書に特に引例として組み入れている ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ ９３／０６１１６に記述されている通りのＢ４９グリア 芽細胞腫細胞の無血清成長順化培地から単離された自然発生タンパク質である。 他の好ましいＧＤＮＦの形態もＷＯ ９３／０６１１６に説明されている。 更に、ヒトＧＤＮＦをコードする遺伝子とラットＧＤＮＦをコードする遺伝子 の核酸配列と、こうしたタンパク質のアミノ酸配列とが、ＷＯ ９３／０６１１ ６出願に示されている。本発明は、ＧＤＮＦの非グリコシル化形態と、自然発生 ＧＤＮＦタンパク質と組換えＧＤＮＦタンパク質の末端切断形態とを含む。 ＧＤＮＦの修飾形態も本発明の方法の使用に含まれる。例えば、１つ以上のポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）、他の反復ポリマー部分、又は、ＧＤＮＦの塩 基性（ｂａｓｉｃ）ポリペプチド骨格に付着した他の側鎖を付着させることによ って、ＧＤＮＦを修飾することが可能である。更に別の実施様態では、ＧＤＮＦ の所期の抗痙攣薬活性が著しく損なわれない限り、ポリペプチド鎖のアミノ酸配 列を、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、又は、除去によって修飾する ことが可能である。従って、術語「ＧＤＮＦ」は、ＧＤＮＦの全ての形態を含む ことが意図されている。 様々な形態のＧＤＮＦを生産するための方法も、ＷＯ ９３／０６１１６出願 に開示されている。開示されている方法の１つは、様々な供給源（例えば、Ｂ４ ９細胞の無血清培地）からＧＤＮＦを単離することから成る。開示されている第 ２の方法は、ＧＤＮＦをコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を適切なベクタ ーと細胞型の内でクローニングし、ＧＤＮＦを生産するために遺伝子を発現させ ることを含む。一般的には組換えＤＮＡ方法を具体例とする後者の方法は、本発 明の好ましい方法である。組換えＤＮＡ法は、一つには、より純度の高いタン パク質を比較的より多く得ることが可能なので、好ましい方法である。 上記ＧＤＮＦを上記方法によって「実質的に純粋な」形態で生産することが好 ましい。術語「実質的に純粋な」は、非修飾形態のＧＤＮＦが比較的高い比活性 を有することを意味する。しかし、ＧＤＮＦの誘導体又は修飾形態が異なった比 活性を有する可能性があるということを理解されたい。 ＧＤＮＦの抗痙攣薬活性を上記タンパク質の１つ以上の別個の部分の各々に付 与することが可能なので、抗痙攣薬機能を制御するＧＤＮＦの１部分（又は、１ つ以上の部分）からその活性成分が成る治療組成物を投与することによって、本 発明の方法を実施することが可能であることも意図されている。 本発明の好ましい実施様態では、ＧＤＮＦを含む調剤組成物を神経保護のため に患者に有効量投与する。治療用途では、ＧＤＮＦを調剤上許容可能な担体を用 いて製剤し、調剤組成物を生産することが可能である。本明細書で使用する術語 「調剤上許容可能な担体」は、薬剤に対して悪影響を与えないか、又は、その組 成物を投与する患者に対して悪影響を与えない、活性成分のための無毒性で且つ 一般的に不活性のビヒクルを意味する。 適切なビヒクル又は担体に関しては、標準的な調剤学文献、例えば、本明細書に 引例として組み入れているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，１６ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）を参照することが可能である。こうし た担体は、例えば、炭酸水素塩緩衝液、リン酸緩衝液、リンガー液、及び、生理 的食塩水のような水溶液を含む。これに加えて、こうした担体は、製剤のｐＨ、 浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色彩、無菌性、安定性、溶解速度、又は、にお いを改変又は維持するための他の調剤上許容可能な賦形剤を含むことが可能であ る。 本発明の調剤組成物を、例えば試薬の単純な混合のような従来技術で公知の方 法で調製することが可能である。当業者は、調剤上許容可能な担体の選択と組成 物の適切な調製とが使用意図と投与形態とによって決定されるということを理解 するだろう。 １つの実施様態では、活性薬剤としてのＧＤＮＦと担体とが生理学的相容性の ある徐放性製剤を構成することが意図されている。当業者には公知であるように 、オリゴヌクレオチド中の 反応活性結合基を適正に選択することによって活性薬剤の放出速度を調節するこ とが可能である。こうした担体中の主溶媒の種類は水性であっても非水性であっ てもよい。これに加えて、担体は、製剤のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度 、色彩、無菌性、安定性、溶解速度、又は、においを改変又は維持するための他 の調剤上許容可能な賦形剤を含むことが可能である。同様に、担体は、活性薬剤 の安定性、溶解速度、放出速度、又は、吸収速度を改変又は維持するための更に 別の調剤上許容可能な賦形剤を含むことが可能である。こうした賦形剤は、単回 投与形態又は多回投与形態として非経口投与用製剤を調製するための従来一般的 に使用される物質である。 調剤組成物を調合した後に、この組成物を、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固 体、脱水粉末、又は、凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中に保存することが可 能である。こうした製剤は、そのまま使用可能な形態、又は、投与直前に再形成 が必要な形態のどちらでも保存が可能である。こうした製剤の好ましい保存温度 は、約４℃以下であり、好ましくは−７０℃である。上記活性薬剤を含むこうし た製剤を生理的ｐＨで又は生理的ｐＨ付近のｐＨで保存及び投与することが好ま しい。高ｐＨ（即ち、 ８より高いｐＨ）の製剤又は低ｐＨ（即ち、５より低いｐＨ）の製剤の形での投 与は望ましくないと現時点では考えられている。 活性薬剤を含む調剤製剤を全身的送達のために投与する方法は、頭蓋内、皮下 、筋肉内、静脈内、又は、経口経路による投与であることが可能である。活性薬 剤を含む調剤製剤を局所的送達のために投与する好ましい方法は、カテーテル又 はポンプによって頭蓋内脳室（ｉｃｖ）を介して脳の中に製剤を直接送達するこ とである。 経口投与の場合には、本発明の調剤組成物をカプセル封入する。カプセル封入 した活性薬剤を、固体投薬形態の化合物で一般的に使用する調剤上許容可能な担 体と共に、又は、こうした担体なしに製剤することが可能である。バイオアベイ ラビリティが最大となり且つ前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇ ｒａｄａｔｉｏｎ）が最小となる胃腸経路内の箇所において製剤の活性部分が放 出されるように、カプセルを設計することが好ましい。活性薬剤の吸収を促進さ せるために更に別の賦形剤を含むことが可能である。希釈剤、香味料、低融点ワ ックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び、結合剤 を使用することも可能である。 いずれの投与方法においても、具体的な個々の用量は患者の体重概算値に基づ いて計算する。適切な用量を決定する場合の他のファクターは、治療又は予防す べき疾病又は疾患、投与経路、患者の年齢、性別、及び、病状とを含む。特定の 実施様態では、患者の血液流中のＧＤＮＦ濃度を予め決定した濃度範囲にするよ うに、用量と投与を計画する。ＧＤＮＦを約０．０００５ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ ／ｋｇまでの用量で投与することが好ましい。上記製剤の各々に関する治療上適 切な用量を決定するのに必要な計算を更に改善することは、当業者によって日常 的に行われており、本明細書に開示されている用量情報とアッセイを特に考慮し て、不要な実験を行うことなしに当業者のよって日常的に行われる作業の範囲内 に含まれる。適切な用量反応データに関連付けて使用用量を決定するための確立 されたアッセイを使用することによって、こうした用量を確認することも可能で ある。 上記の通りに、当業者は、不要な実験を行わずに、「治療有効量」のＧＤＮＦ を送達するのに充分な用量を決定することが可能である。術語「治療有効量」を 、患者の発作を抑制又は防 止するのに充分なＧＤＮＦの量と定義することが可能である。 本明細書で説明するＧＤＮＦ製剤を人間に対して使用するばかりでなく獣医学 的用途に使用することが可能であることと、術語「患者」を狭義に捉えるべきで はないことに留意されたい。獣医学的用途の場合に、用量範囲は上記範囲と同様 であるべきである。 下記の実施例で更に詳細に説明する本発明に関連する調査研究で、ｒｈＧＤＮ Ｆがカイニン酸由来発作とこれに関連したニューロン細胞損失とを防止すること が実証された。この作用を、比較的少ない用量で、用量に依存した形で得た。海 馬ＣＡ１及びＣＡ３領域におけるｒｈＧＤＮＦに関する顕著な免疫染色は、Ｊ． Ｖ．Ｎａｄｌｅｒ，Ｔｈｅ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ−Ｎｅｗ Ｖｉｓｔａｓ， ｐ．４６３−４８１（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８９）によって報告されて いる通りの、カイニン酸由来毒性によって極度に影響されやすい海馬領域に一致 する。ポリクローナル抗ＧＤＮＦ抗体によるｒｈＧＤＮＦに関する顕著な免疫染 色が両側に得られたが、このことは、このタンパク質が、ＣＡ１ニューロンの脳 室系を通って移動することが可能であることを示しており、ＣＡ１ニューロンの 両側保存の 原因を示すだろう。 この結果は、強直−間代性痙攣の抑制によって示されるような抗発作活性と、 ウェットドッグシェイク（ｗｅｔ ｄｏｇ ｓｈａｋｅ）の抑制によって示され るような抗てんかん発生活性との両方を、ｒｈＧＤＮＦが有する可能性があるこ とを示している。ｒｈＧＤＮＦの抗痙攣薬特性は、抗てんかん発生性作用よりも 強力であると考えられる。てんかん発生と発作は互いに異なった薬理学的プロフ ィールを有すると考えられる。てんかん発生をＮＭＤＡ受容体遮断薬によって遮 断することが可能である（Ｓｔａｓｈｅｆｆ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：６４ ８−６５１（１９８９））。これとは対照的に、発作はより高濃度の遮断薬を必 要とするか、ＮＭＤＡ遮断薬によっては完全には遮断されない可能性があり、更 には、一般的に使用される抗痙攣薬に対して極めて高い感受性を有する可能性が ある。てんかん発生は、神経組織が正常な状態からてんかん重積状態に変形させ られる場合に生じる比較的永続的な変化である（Ｓｔａｓｈｅｆｆ他，上記）。 これらの調査研究では、ｒｈＧＤＮＦの作用を神経組織内での永続的変化に関し て直接評価しなかったが、こうした変化の前兆であるウェットドッグシェイク （ｗｅｔ ｄｏｇ ｓｈａｋｅ）はｒｈＧＤＮＦによって抑制された。 てんかん重積状態に達して危険時間期間を越えてこの状態が維持されると、カ イニン酸由来発作が一貫したパターンの脳損傷を生じさせる（Ｂｅｎ−Ａｒｉ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ，３７５−４０３（１９８５））、及び、Ｔａｎａｋａ他，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ，３８：３１７−３３４（１９９２））。これ らの調査研究で観察された脳損傷のパターンは、既に関連文献に報告されている 脳損傷パターンと同じである。カイニン酸由来ニューロン損失が海馬ＣＡ３内に 無いことが、末梢カイニン酸塩投与によって確認されている（Ｎａｄｌｅｒ，Ｔ ｈｅ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ−Ｎｅｗ Ｖｉｓｔａｓ ，ｐ．４６３−４８１（ Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８９））。海馬ニューロン、視床ニューロン、及 び、類扁桃ニューロンに対するｒｈＧＤＮＦの神経保護作用は、この神経栄養因 子による発作活動の減少と一致している。しかし、Ｈｅｆｔｉ他，Ｎｅｕｒｏｂ ｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ 、１０：５１５−５８８（１９８９）、Ｂｅｒｌｏｖｅ他，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ． ，１７：１２６７（１９９１）、Ｓｈ ｉｇｅｎｏ他，Ｊ．Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ． ，１１：２９１４−２９１９（１９９１）、Ｃｈｅｎｇ及びＭａｔ ｔｓｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ，７：１０３１−１０４１（１９９１）、Ｓｈｉｍｏｈ ａｍａ他，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１６４：５５−５８（１９９３）、 及び、Ｍａｔｔｓｏｎ及びＣｈｅｎｇ，Ｓｔｒｏｋｅ，２４：Ｉ−１３６−Ｉ− １４０（１９９３）で報告されているように、他の神経栄養因子であるｂＦＧＦ とＮＧＦがグルタミン酸塩由来興奮毒性に対する保護を与えることが可能なので 、カイニン酸由来興奮毒性に対して及ぶ可能性があるｒｈＧＤＮＦの直接的作用 を除外することは不可能である。 しかし、Ｄｉｎｇｌｅｄｉｎｅ他，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４：１−９ ６（１９８８）に説明されている通りの、活性化に関するこれらの受容体の構造 的要件に基づいて、グルタミン酸塩受容体−チャンネル複合体の阻害剤としてｒ ｈＧＤＮＦが作用する可能性は低いと考えられる。グルタミン酸塩受容体活性化 に関連付けられる下流のイベント又は系にｒｈＧＤＮＦが影響を与える可能性の 方が高い。他の神経栄養因子が、（ａ）グルタミン酸塩受容体の数又は機能の変 化、（ｂ）ストレスタンパク質の保護酵素又はスーパーオキシド代謝の酵素の 誘導、（ｃ）細胞内カルシウム貯蔵又はＮａ⁺／Ｋ⁺ ＡＴＰアーゼ活性における 、特異的なイオンバランスの変化、及び、（ｄ）グリア細胞を介しての間接的媒 介物質作用に影響を与えることが既に明らかにされている。 ｒｈＧＤＮＦがシナプス伝達に対する大きな抑制薬活性を有することが可能で あることが、カイニン酸由来発作活動の抑制の原因であると考えられる。しかし 、ラットの海馬切片を使用した予備的なインビトロ電気生理学的調査では、標準 的な細胞外記録方法を使用して、２μｇ／ｍＬのｒｈＧＤＮＦがＣＡ１領域とＣ Ａ３領域とで記録された発生電位に影響を与えないことが明らかになった。カイ ニン酸由来発作の改善は、ｒｈＧＤＮＦによるカイニン酸のバイオアベイラビリ ティの低下を反映する可能性がある。このことが、ウエットドッグシェイクと強 直−間代性発作との減少に関するｒｈＧＤＮＦの微分的用量反応関係に基づく可 能性は低いと考えられる。更に、不活性ｒｈＧＤＮＦは、カイニン酸由来発作を 抑制しなかった。 カイニン酸由来発作後に海馬がＧＤＮＦ ｍＲＮＡを発現させることが可能で あることは、特定のストレス条件下でＧＤＮＦを生産する能力を脳が有する可能 性があることを示唆してい る。ＮＧＦ遺伝子群の多くのメンバーが興奮毒性病変及び／又は発作によって上 方制御されるので、こうした現象は例外的である。なんらかの特定の理論に束縛 されることは望まないが、ＧＤＮＦの局所的生産が発作／興奮毒性プロセスに対 してブレーキとして作用し、従って、発生する可能性がある潜在的損傷を抑制す ると考えられる。海馬ニューロンが向イオン性グルタミン酸塩受容体と向代謝性 グルタミン酸塩受容体との両方を発現させ、カイニン酸塩による間接的な向イオ ン性ＮＭＤＡの活性化がＧＤＮＦ ｍＲＮＡの調節に関与すると考えられる。こ の発見は、特定のＮＭＤＡ受容体チャンネル遮断薬ＭＫ−８０１（Ｗｏｎｇ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．，８３：７１０４−７１ ０８（１９８６））がカイニン酸由来ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現を低減させたこと を実証した最近の研究に支持されている（Ｈｕｍｐｅｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ，５９：７９１−７９５（１９９４））。てんかん様活動が低減させられ、ＣＡ １海馬領域内で生じる興奮毒性損傷が低減させられ、内因性ＧＤＮＦ生産のため の刺激が低減させられると考えられるので、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現のこうした 低減は上記の考えと一致している。 ｒｈＧＤＮＦの単一ボーラス大脳内脳室内注射がラットの体重を減少させると いう発見が、ニューロトロフィンの中枢投与又は末梢投与が体重損失を誘導する という従来の調査研究を支持する（Ａｌｔａｒ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ，８９：１１３４７−１１３５１（１９９２）、及び 、Ｍａｒｔｉｎ−Ｉｖｅｒｓｏｎ他，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４：１２６２ −１２７０（１９９４））。体重の減少を生じさせると考えられる仕組みは、ド パミンと５−ＨＴのような中枢モノアミンにおける変化に関係している可能性が ある。 カイニン酸の末梢投与も、体重の変化を誘導した。最近では、Ｈａｊｎａｌ他 ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，２９：２０９−９１６（１９９２）が、扁 桃の中心核内にイオン導入法で投与したカイニン酸に由来する微小病変が、その 用量に依存する形で、体重損失、嚥下能力低下又は嚥下不能、及び、渇感低下又 は渇感欠如を生じさせることを実証した。こうした研究は、扁桃に対して投与す るカイニン酸によって生じさせられる永続的な食物摂取障害が、病理学的ＥＥＧ 活動変化の原因ではないものの、食物摂取行動に関与する複雑な調節機構の障害 に関連していることを示唆した。扁桃は、食物摂取行動を制御する唯一の脳領域 ではなく、カイニン酸によって生じさせられる興奮毒性が、食物摂取行動を制御 する他の脳領域に影響を与える可能性がある。低用量のｒｈＧＤＮＦがカイニン 酸由来体重損失を減少させたという観察結果は、興奮毒性損傷を減少させ且つ食 物摂取行動に関与する神経回路の破壊を防止するｒｈＧＤＮＦの能力と一致して いる可能性がある。最大用量のｒｈＧＤＮＦによる体重損失の悪化は、カイニン 酸とｒｈＧＤＮＦの作用の合計よりも大きいと思われる。従って、ｒｈＧＤＮＦ と脳損傷時に放出される他の内因性媒介物質との相乗作用は、体重損失減少の媒 介に関与している可能性がある。 これまでに行われたインビトロの調査研究は、ｒｈＧＤＮＦが中脳ドパミン作 動性ニューロンの生存を強化する強力な神経栄養因子であることと、こうした作 用がこの伝達物質系に比較的特異的に現れたことを明らかにした（Ｌｉｎ他，Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ，２６０：１１３０−１１３２（１９９３））。この調査研究は、 ｒｈＧＤＮＦがグルタミン作動性系のような他の神経伝達物質系に対して更に別 の作用を及ぼすことが可能であることを明らかにしている。このことは、ニュー ロンを含むドパ ミン以外のニューロン集団にＧＤＮＦ ｍＲＮＡが及ぶという発見によって更に 支持される（Ｓｃｈａａｒ他，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：３６８−３７ １（１９９３））、及び、Ｈｕｍｐｅｌ他，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，５９：７９１ −７９５（１９９４））。 有望なてんかん療法として神経栄養因子を使用することは新規性のあるアプロ ーチと考えられ、これらの研究は、側頭葉てんかんモデルにおける神経栄養因子 による発作活動の効果的な遮断の最初の実証であると考えられる。 下記の実施例は、本発明を非限定的に説明することを意図している。実施例１ Ａ． 活性ｒｈＧＤＮＦの調製 本明細書に引例として組み入れているＭｃＤｏｎａｌｄ他，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ，１０９０：７０−８０（１９９１）に記載されてい る方法と同一の方法で、成熟ｒｈＧＤＮＦをＥ．ｃｏｌｉ内で発現させた。その 後で、ｒｈＧＤＮＦを、遠心分離によって細胞ライゼートから単離して［４Ｍグ アニジン、９０ｍＭシステイン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８．５］中に可溶化した封入体の形で回収した。このタンパク質を［０．２ Ｍグアニジン、２Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．７５］で１０倍に希釈 することによって活性種に再生した。再生混合物を２日間４℃に維持した後で、 ［２０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５］中で平衡化し たＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 上にローディングした。０．３Ｍ→０．６Ｍ塩化ナトリウム塩勾配を使用して組 換えヒトＧＤＮＦをカラムから溶出させた。ｒｈＧＤＮＦを含む画分を１つにし 、等体積の［５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム］で希釈し、そ の後で、［２．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５］中 で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃ ｉｔｙ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にローディングした。２．５Ｍ→０Ｍ塩化ナト リウム下降塩勾配を使用してｒｈＧＤＮＦをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙカラム から溶出させた。適切な画分をプールし、等体積の２０ｍＭ酢酸ナトリウムで希 釈した。その次に、希釈したタンパク質混合物を［２０ｍＭ酢酸ナトリウム、４ ７５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５］中で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）上にローディングした。４７５ｍＭ→６７５ｍＭ塩化ナトリウム塩勾配 を使用してｒｈＧＤＮＦをカラムから溶出させた。精製ｒｈＧＤＮＦを含む画分 を組み合わせ、濃縮し、−２０℃で保存した。Ｂ． 不活性ｒｈＧＤＮＦの調製 カルボジイミド結合によって過剰グリシンメチルエステルでタンパク質のカル ボン酸基をブロッキングすることによって、組換えヒトＧＤＮＦを化学的に不活 性化した。精製ｒｈＧＤＮＦ １００ｍｇを０．５Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５の中にダ イアフィルトレーションして最終タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。ＥＤＣ ８０ｍＭとグリシンメチルエステル８００ｍＭを加えた。反応物を室温で１時 間静置した。混合物をリン酸緩衝塩類液に対して透析し、過剰な試薬を除去し、 その後で−２０℃で保存した。実施例２ 手術 体重２００−２２５ｇの成体雄Ｆ３４４ラット（Ｈａｒｌｅｎ）を使用した。 動物を１２時間の明暗サイクルで定温度 （２２℃）に維持した。動物が食餌と水を自由に摂取できるようにした。動物を ２．５％イソフルラン＋Ｏ₂で麻酔し、麻酔状態を維持したままでＫｏｐｆ定位 フレーム内に置いた。これらの動物に対して、ｒｈＧＤＮＦ（５０、５、０．５ 、０．０５μｇ／２μＬ）、ビヒクル（リン酸緩衝塩類液、２μＬ）、又は、不 活性ＧＤＮＦ（２μｇ／２μＬ）のいずれかを２６ゲージＨａｍｉｌｔｏｎ注射 器を使用して側脳室（ｉｃｖ）の中に５分間に亙って片側注射した。Ｈａｍｉｌ ｔｏｎ注射器を更に５分間そのままの位置に保った後に取り除いた。ブレグマを 基準とする相対的な注射座標は、硬膜から３．５ｍｍの深さにおいて、ＡＰ − ０．８、ＭＬ −１．５であった。動物の皮膚を創傷クリップで縫合し、回復さ せた。ｒｈＧＤＮＦ、不活性ＧＤＮＦ、又は、ビヒクルを、カイニン酸の１時間 前に投与した。カイニン酸（Ｔｏｃｒｉｓ Ｎｅｕｒａｍｉｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ ．）１２ｍｇ／ｋｇを０．９％塩類液中に溶解し、皮下投与した。調査期間中は 動物の体重を毎日記録した。実施例３ 脳組織 ＫＡ投与７日後に、ラットをペントバルビトンナトリウム ５５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）で麻酔し、リン酸緩衝ホルマリン溶液を噴門経由で潅 注した。脳を取り出し、同一の固定剤中で２４時間以上液浸固定し、５μｍ厚切 片の形に冠状に切断し、切片をＮｉｓｓｌ染色した。Ｌｅｉｔｚ顕微鏡を使用し て、海馬のＣＡ１領域とＣＡ３領域、視床（束周縁の視床核と脳室周囲の視床核 ）、及び、扁桃（扁桃海馬区域、前外側と、基底内側の類扁桃核、後側と、基底 外側の類扁桃核、後方と、後方内側の皮質性類扁桃核）において、生存可能な細 胞の計数を両側的に行った。計数、長さ、及び、面積をＢｒｅｇｍａ −４．１ ６ｍｍ（Ｐａｘｉｎｏｓ及びＷａｔｓｏｎ）で行った。海馬ＣＡ１セクターの総 直線長さをＩｍａｇｅ−１（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ． ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）画像解析システムで測定した。視床区域と 類扁桃区域の面積を，２０倍対物レンズを使用する直線校正スケール上の０．２ ５ｍｍ²に相当する１００ｍｍ²アイピースレチクル（ｅｙｅ ｐｉｅｃｅ ｒｅ ｔｉｃｌｅ）によって測定した。細胞計数を海馬領域に関しては細胞／ｍｍで表 し、視床と扁桃に関しては細胞／ｍｍ²で表した。実施例４ ｒｈＧＤＮＦの分布 ｒｈＧＤＮＦ（１００μｇ／４μＬ）の頭蓋内脳室内注射（ｉｃｖ）の２４時 間後に、ラットに１０％中性緩衝ホルマリンを潅注し、脳を取り出し、パラフィ ンに埋め込み、荷電スライド上で５ミクロンに切断した。ｒｈＧＤＮＦに対する アフィニティー精製ウサギ抗体を使用して、切片をＧＤＮＦに関して免疫染色し た。この抗体（０．５９ｍｇ／ｍＬ）を１：１００希釈で使用し、上記切片と共 に１時間インキュベートし、その後で、一価ビオチニル化抗ウサギを加え、更に その後で、Ｏｍｎｉｔａｇｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｌｉｐｓｈａｗ Ｉｍｍｕｎｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒ ｇｈ，ＰＡ）を加えた。Ｎｅｗ Ｆｕｃｈｓ ｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙ ｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して 切片を現像した。負の対照は、同じ濃度の無関係な抗体を一次抗体の代わりに使 用した切片と、リン酸緩衝塩類液を注射したラットからの切片とを含んだ。スラ イドをＣｒｙｓｔａｌ Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ，ＣＡ）を使用し てマウントし、更にその後でＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ，Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ）を使用してマウントし、永久標本を作った 。ｒｈＧＤＮＦの分布を、接眼鏡マイクロメーターを装着したＬｅｉｔｚ顕微鏡 を使用して評価した。実施例５ バイオアッセイ ｒｈＧＤＮＦと不活性ＧＤＮＦの活性に関するバイオアッセイを、本明細書に 引例として組み入れているＬｉｎ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：８９ ４２−８９４７（１９９０）によって説明されている通りに行った。簡潔に説明 すると、ＧＤＮＦ活性に関するインビトロアッセイによって、ヒヨコ胚交感神経 連鎖（Ｅ９）ニューロンの生存を測定する。２０００個の精製ニューロンを９６ 穴プレートの各穴に入れ、ＧＤＮＦサンプルの連続希釈を加えた。４４時間後に 、生体染色剤ＭＴＴ（３−４［，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５ −ジフェニルテトラゾリウム）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を減少させる生存細胞の能力によって、ニューロン生存を 推定した。ｒｈＧＤＮＦの 生理活性を、ＭＴＴアッセイに基づく最大ニューロン生存の５０％を与えるｒｈ ＧＤＮＦの希釈度であるＥＣ₅₀値として表した。実施例６ 統計 対照動物とＧＤＮＦ処置動物との間の組織学的比較をスチューデントｔ検定で 分析した。ウェットドッグシェイクと強直−間代性発作に関するｒｈＧＤＮＦに よる用量依存作用を試験するためにロジスティク回帰を行い、その後でＦｉｓｈ ｅｒ完全試験を行った。Ｗａｌｄ試験、単向分散分析（ＡＮＯＶＡ）、及び、そ の後でのＳｃｈｅｆｆｅ多重比較方法とを使用して、体重比較を分析した。実施例７ 結果 Ｆｉｓｈｅｒ３４４ラットに対する１２ｍｇ／ｋｇカイニン酸塩の末梢注射が 、ウェットドッグシェイクと痙攣とを２時間以内に誘発し、最初の８時間以内に 死亡を誘発した（表１）。 表１は、カイニン酸（１２ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）に対するｒｈＧＤＮＦの抗 痙攣薬活性を示す。組換えヒトＧＤＮＦ、ビヒクル、又は、不活性ＧＤＮＦを、 カイニン酸の１時間前に投与（ｉｃｖ）した。表に示す値は、ウェットドッグシ ェイク、強直−間代性発作、及び、死亡を示したラットの個体数を示す。全ての 動物を、カイニン酸を投与してから最初の１２時間後に検査し、その後では毎日 検査した。Ｆｉｓｈｅｒ完全試験を使用した場合に、ウェットドッグシェイクに 対して有意性があった用量レベルは５０μｇ／２μＬ（ｐ＝０．００００９）と ５μｇ／２μＬ（ｐ＝０．０４２）であった。強直−間代性発 作に対しては、０．０５μｇ／２μＬ（ｐ＝０．０１２）、０．５μｇ／２μＬ （ｐ＝０．００００１）、５μｇ／２μＬ（ｐ＝０．００００７）、及び、５０ μｇ／２μＬ（ｐ＝０．００００００９）の用量が有意だった。 表１に示す通りの行動変化は、Ｌｏｔｈｍａｎ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂｒａ ｉｎ Ｒｅｓ ．，２１８：２９９−３１８（１９８１）に報告されている従来の 調査研究結果と一致していた。脳室内ｒｈＧＤＮＦ（０．０５−５０μｇ／２μ ｇ）は、用量に依存する形で、カイニン酸由来ウェットドッグシェイクを有意に （ｐ＝０．００３６）低減させた。同様に、大脳脳室内経路によって０．５μｇ ／２μＬから５０μｇ／２μＬまでの用量のｒｈＧＤＮＦを投与したカイニン酸 処置ラットは、強直−間代性発作反応を示さず、一方、ｒｈＧＤＮＦの用量が少 ない（０．０５μｇ／２μＬ）動物の５０％と、ビヒクル（ＰＢＳ ｎ＝１３） 又は非活性ＧＤＮＦ（２μｇ／２μＬ）を注射した動物全てが、強直−間代性発 作活動を示した（ｐ＝０．０００８、ロジスティク回帰分析、表１を参照された い）。ｒｈＧＤＮＦを投与したラットには死亡が生じず、一方、ビヒクル又は非 活性ＧＤＮＦを投与したラットには死亡が生じた。 更に、ｒｈＧＤＮＦはウェットドッグシェイクの発生を遅らせた。ビヒクル処置 動物は、カイニン酸投与後３０分間以内にウェットドッグシェイクを示した。組 換えヒトＧＤＮＦ（５０μｇ／２μＬ、及び、５μｇ／２μＬ）は、更に３０分 間から６０分間ウェットドッグシェイクの発生を遅らせ、一方、より少ない用量 では、ウェットドッグシェイクの発生の遅れは１５分間から２０分間にすぎなか った。 カイニン酸塩の末梢注射は、７日後に検出された選択的な海馬ＣＡ１ニューロ ン損失と視床ニューロン損失と扁桃ニューロン損失を一貫して生じさせた。海馬 の組織検査によって、正常な対照動物に比較して、ビヒクル又は不活性ＧＤＮＦ を投与（ｉｃｖ）した動物全てにおいてＣＡ１錐体細胞の５０−６０％損失が生 じたことが明らかになった（図１と図２）。カイニン酸塩によるＣＡ１錐体細胞 の損失は著しく大きかった（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）。ｒｈＧＤ ＮＦの投与（０．５−５０μｇ／２μＬ、ｉｃｖ）は、ビヒクル（２μＬ、ｉｃ ｖ）、低用量ＧＤＮＦ（０．０５μｇ／２μＬ）、又は、不活性ＧＤＮＦ（２μ ｇ／２μＬ）で処置した動物に比較して、左海馬と右海馬の両方において広範な カイニン酸由来ＣＡ１錐 体細胞損失を有意に減少させた（ｐ＜０．００１）。ｒｈＧＤＮＦ（５０μｇ） 処置動物における生存可能なＣＡ１錐体細胞の個数は、正常な動物の場合のそれ とは有意に相違しなかった（図１）。カイニン酸も著しい視床ニューロン損失及 び扁桃ニューロン損失を生じさせたが、こうしたニューロン損失はｒｈＧＤＮＦ （０．５−５０μｇ／２μＬ）によって有意に減少させられた（ｐ＜０．０１） （図１）。 更に、ｒｈＧＤＮＦを投与しない場合にカイニン酸によって生じさせられる視 床体の著しい壊死及び空胞化を抑制することによって、カイニン酸由来ニューロ ン細胞損失に対するｒｈＧＤＮＦ（５０μｇ／２μＬ）の保護が示された。 ｒｈＧＤＮＦ（１００μｇ／４μＬ）を注射したラットの免疫染色切片から、 ｒｈＧＤＮＦ注射２４時間後における、脳室系、脳室周囲組織、クモ膜下腔、及 び、下神経網の全体に亙ってのｒｈＧＤＮＦの広範な分布が明らかになった。側 方脳室の後側部分に隣接した区域ＣＡ１ｂ、ＣＡ１ｃ、ＣＡ２、及び、ＣＡ３内 における海馬の側方側面にポジティブ免疫染色が存在した。 未処置動物に対するｒｈＧＤＮＦ（５０μｇ／２μＬ、ｉｃ ｖ）の投与は、ビヒクル処置動物に比較して、調査期間全体に亙って、体重の著 しい減少と、体重増加速度の低下とを生じさせた（図３）。分析によって、ゼロ 日目から７日目までの体重変化速度の差異（Ｗａｌｄ試験、ｐ＜０．００１）と 、全体重変化の差異（Ｗａｌｄ試験、ｐ＜０．００１）とが明らかになった。ベ ースラインから７日目までの体重変化を、カイニン酸塩投与グループとｒｈＧＤ ＮＦ投与グループとの間で比較し、及び、カイニン酸塩投与グループとビヒクル 投与グループとの間で比較した（単向ＡＮＯＶＡ）。この分析によって、処置グ ループの中で体重変化に明らかな差異があることが判明した（ｐ＜０．００１） 。より低用量のｒｈＧＤＮＦが、それ自体としては追加の体重損失を生じさせず に、カイニン酸塩に起因する体重損失を減少させると考えられる（Ｓｃｈｅｆｆ ｅ試験、ｐ＜０．０５）。しかし、より高用量のｒｈＧＤＮＦ（５０μｇ／２μ Ｌ、及び、５μｇ／２μＬ）は、体重損失を悪化させると考えられる（Ｓｃｈｅ ｆｆｅ試験、ｐ＜０．０５）（表２）。 高純度のｒｈＧＤＮＦは、培養中におけるヒヨコ交感神経連鎖ニューロンの生 存を促進した。化学修飾ｒｈＧＤＮＦ（７５０ｎｇ／ｍＬまで）に対するヒヨコ 胚交感神経連鎖ニューロン生存アッセイは、活性ｒｈＧＤＮＦ（ＥＣ₅₀ １０ｎ ｇ／ｍＬ）に比較した場合に、検出可能な生物学的活性を示さなかった。 不活 性形態と活性形態のＧＤＮＦを、リポ多糖（ＬＰＳ）レベルとＥ．ｃｏｌｉタン パク質（ＥＣＰ）レベルとに関して試験した。リポ多糖レベルは、＞１ＥＵ／ｍ ｇであり、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質レベルは、＞５０ｐｐｍだった。 本発明の上記の説明は、本発明を説明するための具体例を示している。本発明 の思想と範囲から逸脱することなしに変形と変更を行うことが可能であることは 、当業者には明らかだろう。下記のクレームがこうした変形と変更のすべてを含 むと解釈されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 発作活性に関連した神経変性疾患を抑制することを必要とする患者に対し て、前記神経変性疾患を抑制するために有効な量のグリア誘導神経栄養因子（Ｇ ＤＮＦ）を投与することを含む、前記神経変性疾患を抑制するための方法。 ２． 前記神経変性疾患がてんかんである請求項１に記載の方法。 ３． 前記ＧＤＮＦを組換えＤＮＡ法で生産する請求項１に記載の方法。 ４． 前記発作が有害量のカイニン酸によって引き起こされる請求項１に記載の 方法。 ５． 前記ＧＤＮＦを調剤上許容可能な担体と共に投与する請求項１に記載の方 法。 ６． 前記ＧＤＮＦを頭蓋内投与する請求項１に記載の方法。 ７． 発作を抑制するための治療有効量のＧＤＮＦと調剤上許容可能な担体とを 含む調剤組成物。