BR112016029008B1 - Uso de sulfato de dextrana com peso molecular médio abaixo de 10000 da para induzir a angiogênese em um sujeito - Google Patents

Abstract

USO DE SULFATO DE DEXTRANA COM PESO MOLECULAR MÉDIO ABAIXO DE 10000 Da PARA INDUZIR A ANGIOGÊNESE EM UM SUJEITO. As presentes modalidades referem-se ao uso de sulfato de dextrana com um peso molecular médio abaixo de 10.000 Da para induzir a angiogênese em um sujeito e para aumentar o fluxo sanguíneo em um sujeito que sofre de isquemia.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] As presentes modalidades referem-se geralmente a angiogênese, e em particular a utilização de sulfato de dextrana para a indução de angiogênese num sujeito.

FUNDAMENTOS

[0002] A angiogênese é o processo fisiológico por meio do qual novos vasos sanguíneos se formam a partir de vasos pré-existentes. Isto é distinto da vasculogênese, que é a formação de novo de células endoteliais a partir de precursores de célula de mesoderme. Os primeiros vasos no embrião em desenvolvimento se formam através de vasculogênese, após a qual angiogênese é responsável pela maior parte, se não todo, do crescimento dos vasos sanguíneos durante o desenvolvimento e na doença.

[0003] A angiogênese é um processo normal e vital no crescimento e desenvolvimento, bem como na cicatrização de feridas e na formação de tecido de granulação.

[0004] A angiogênese é tradicionalmente classificada como angiogênese por brotamento ou angiogênese por intussuscepção ou "splitting". Angiogênese por brotamento forma vasos sanguíneos inteiramente novos, enquanto a angiogênese por "splitting" divide um vaso sanguíneo existente em dois.

[0005] A angiogênese pode ser um alvo para o combate de doenças caracterizadas por vascularização pobre ou vasculatura anormal. A ausência de vasos sanguíneos em uma reparação ou de outra forma tecido metabolicamente ativo pode inibir a reparação ou outras funções essenciais. Várias doenças, tais como feridas crônicas isquêmicas, são o resultado de uma falha ou insuficiente formação de vasos sanguíneos e podem ser tratadas por uma expansão local dos vasos sanguíneos, trazendo assim novos nutrientes para o local, facilitando a reparação.

[0006] A aplicação clínica moderna do princípio da angiogênese pode ser dividida em duas áreas principais: terapias anti-angiogênicas e terapias pró-angiogênicos. Considerando que as terapias anti-angiogênicas estão a ser utilizadas para tratar ou prevenir o câncer e doenças malignas, as quais exigem uma grande quantidade de oxigênio e de nutrientes para proliferar, terapias pró-angiogênicas estão a ser exploradas como opções para tratar, por exemplo, doenças cardiovasculares, doenças da artéria coronária, doenças de aterosclerose, doença cardíaca coronária, doença arterial periférica, distúrbios de cicatrização de feridas etc.

[0007] As abordagens tradicionais no tratamento pró-angiogênico incluem, entre outros, a terapia de gene, tendo como alvo os genes de interesse para a amplificação ou a inibição; terapia de proteína, que manipula principalmente fatores de crescimento angiogênicos; e terapias com base em células, que envolve a implantação de tipos específicos de células.

[0008] Ainda existem graves problemas não resolvidos, relacionados com a terapia gênica. As dificuldades incluem a integração eficaz de genes terapêuticos no genoma das células alvo, reduzindo o risco de uma resposta imunitária indesejável, toxicidade potencial, imunogenicidade, respostas inflamatórias, e oncogênese relacionada com os vetores virais usados em genes de implantação e a enorme complexidade da base genética da angiogênese.

[0009] Terapia de proteína pró-angiogênica utiliza vários fatores de crescimento, tais como fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), para promover a angiogênese. Um obstáculo de terapia de proteína é o modo de entrega. Rotas oral, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular de administração de proteína não são sempre tão eficazes, já que a proteína terapêutica pode ser metabolizada ou depurada antes de poder entrar no tecido alvo. Terapias pró-angiogênicas com base em célula ainda estão em estágios iniciais de pesquisa, com muitas questões em aberto sobre os melhores tipos de células e dosagens para usar.

[0010] A isquemia é uma restrição no fornecimento de sangue aos tecidos, causando uma escassez de oxigénio e glucose necessários para o metabolismo celular. A isquemia é geralmente causada por problemas com os vasos sanguíneos, com consequente dano ou disfunção de tecido. Significa, também, anemia local e hipóxia em uma determinada parte de um corpo, por vezes resultantes de congestionamento, como a vasoconstrição, trombose ou embolia.

[0011] A restauração do fluxo de sangue coronário após um período prolongado de isquemia envolve frequentemente chamada lesão de reperfusão causando dano endotelial e um endotélio afetado que assume fenótipo pró-coagulante e pró-inflamatório. A reperfusão acelera muito a ativação do complemento induzida por isquemia e deposição.

[0012] O sulfato de dextrana é um inibidor de complemento bem conhecido e, portanto, tem sido proposto para alcançar citoproteção de endotélio contra a lesão de reperfusão após isquemia.

[0013] Experimental Cell Research 215, 294-302 (1994) descreve que os polissacarídeos sulfatados tais como a heparina e sulfato de dextrana podem ser usados in vitro para a formação de tubo vascular induzida por colagénio. Contudo, dados experimentais in vivo indicam que a heparina de polissacarídeo sulfatada de baixo peso molecular (2,4 kDa) inibiu a angiogênese, Glycobiology 3, 567-573 (1993), Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23, 141-149 (1993).

[0014] A patente US No. 5.135.920 revela que o sulfato de dextrana com um peso molecular médio de 500 000 Da é angiostático, ou seja, inibe a angiogênese.

[0015] Há ainda espaço para melhorias dentro do domínio da angiogênese na técnica.

SUMÁRIO

[0016] É um objetivo geral induzir a angiogênese num sujeito.

[0017] É um outro objetivo aumentar o fluxo de sangue em um sujeito que sofre de isquemia.

[0018] Estes e outros objetivos são alcançados por modalidades, tal como aqui divulgado.

[0019] Um aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a indução de angiogênese num sujeito.

[0020] Um outro aspecto das modalidades refere-se a um método para induzir a angiogênese num sujeito. O método compreende a administração de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para o sujeito.

[0021] Um outro aspecto das modalidades refere-se à utilização de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a fabricação de um medicamento para induzir a angiogênese num sujeito.

[0022] Ainda outro aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para aumentar o fluxo sanguíneo em um sujeito que sofre de isquemia.

[0023] Um outro aspecto das modalidades refere-se a um método para aumentar o fluxo de sangue em um sujeito que sofre de isquemia. O método compreende a administração de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para o referido sujeito.

[0024] Ainda outro aspecto das modalidades relaciona-se com o uso de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a fabricação de um medicamento para aumentar o fluxo sanguíneo em um sujeito que sofre de isquemia.

[0025] Ainda um aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a vascularização de tecido esquêmico em um sujeito.

[0026] Um outro aspecto das modalidades refere-se a um método para a vascularização do tecido isquêmico num sujeito. O método compreende a administração de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para o referido sujeito.

[0027] Ainda um aspecto das modalidades relaciona-se com uso de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a fabricação de um medicamento para vascularização de tecido esquêmico em um sujeito.

[0028] Outro aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio igual ou inferior a 10000 Da para uso in vitro ou ex vivo na indução de angiogênese num órgão e/ou tecido vascularizado, para uso in vitro ou ex vivo no aumento do fluxo de sangue num tecido vascularizado e/ou órgãos e/ou para vascularização in vitro ou ex vivo de um tecido e/ou órgão vascularizado, e métodos relacionados respectivos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] As modalidades, juntamente com objetivos e vantagens adicionais do mesmo, pode ser melhor compreendido fazendo-se referência à descrição a seguir tomada em conjunto com os desenhos anexos, em que:

[0030] A FIG. 1 é um diagrama que ilustra o peso corporal médio durante todo o modelo de isquemia de membro crítica de camundongo. ANOVA de duas vias seguido por comparações post-hoc de Bonferroni não revelaram diferenças estatisticamente significativas entre os grupos.

[0031] A FIG. 2 é um diagrama que ilustra o fluxo de sangue médio por grupo de estudo em todo o modelo de isquemia de membro crítica de camundongo. ANOVA de duas vias para medidas repetidas, seguido do teste post-hoc de Bonferroni, foi realizado. Comparação de grupos tratados com sulfato de dextrana 2M, 3M e 4M com o grupo de controle 1M revelou diferenças estatisticamente significativas dos dias 14 e 21 até o dia 35 (p <0,001).

[0032] A FIG. 3 é um diagrama que ilustra a densidade de capilares CD34 dos grupos através do estudo de isquemia de membro crítica, após coloração dupla com dextrana marcado com FITC (DA). Barras DA representam capilares funcionais. Análise estatística realizada utilizando ANOVA de duas vias seguido de comparações múltiplas de Bonferroni.

[0033] A FIG. 4 é um diagrama que compara a densidade de capilares CD34 de membros isquêmicos e não isquêmicos nos grupos de estudo por meio da isquemia crítica, após coloração dupla com dextrana marcado com FITC (DA). Barras DA representam capilares funcionais. Análise estatística realizada utilizando ANOVA de duas vias seguido de comparações múltiplas de Bonferroni.

[0034] As Figs. 5A-5C ilustram densidade de capilares CD34 dos grupos no estudo de isquemia de membro crítica (Fig 5A - camundongo do veículo controle de grupo 1M; Fig. 5B - camundongo do grupo 3M, sulfato de dextrana 30 mg/kg repetido; A Fig. 5C - camundongo do grupo 4M de sulfato de dextrana 30 mg/kg único). Os diagramas do lado esquerda ilustram coloração de CD34 e os diagramas do lado direito ilustram coloração com dextrana marcado com FITC.

[0035] A FIG. 6 é um diagrama que ilustra pontuação de função do membro em animais HLI-lesionados tratados com sulfato de dextrana. No dia 0, HLI foi induzida por ligadura e excisão da artéria femoral. O tratamento foi iniciado no dia 8 com uma vez por semana (1x/s) ou 3 vezes por semana (3x/s) de veículo ou 10 ou 30 mg/kg de sulfato de dextrana. Pontuação de membro foi classificada 0-3, onde 3 é o pior (arrastar de pés). Sulfato de dextrana induziu melhora significativa a partir do dia 21 em diante (análise nos dias 7, 14, 21, 28 e 35), calculado por ANOVA de duas vias.

[0036] A FIG. 7 é um diagrama que ilustra a densidade de capilares dos grupos no estudo de isquemia do membro crítica do marcador endotelial actina de músculo liso (SMA). Significância estatística de acordo com ANOVA de duas vias seguido por comparações múltiplas de Bonferroni.

[0037] A FIG. 8 compara o fluxo de sangue medido em dois camundongos com sem contato imagens de laser Doppler 35 dias após ligação da artéria femoral do membro posterior esquerdo. O painel inferior foi tratado com veículo (grupo 1M), o painel de topo recebeu o tratamento com sulfato de dextrana (grupo 3M).

[0038] A FIG. 9 ilustra a distribuição de peso do corpo nos grupos usados para o estudo de frequência-derrame de tMCAO.

[0039] A FIG. 10 ilustra Neuroscore por grupo de tratamento ao longo do estudo de frequência-derrame de tMCAO.

[0040] A FIG. 11 ilustra teste de stepping por grupo de tratamento ao longo do estudo de frequência-derrame de tMCAO.

[0041] FIG. 12 ilustra teste de colocação de membro anterior por grupo de tratamento ao longo do estudo de frequência-derrame de tMCAO.

[0042] A FIG. 13 ilustra teste de balanço delta de corpo (volta esquerda-volta direita) por grupo de tratamento ao longo do estudo de frequência-derrame de tMCAO.

[0043] AFIG. 14 ilustra razão de fluxo de sangue cerebral razão e mudança por cento de diâmetro médio de vasos em ambos os grupos sulfato de dextrana, em comparação com o controle de veículo no dia 29.

[0044] A FIG. 15 ilustra a densidade capilar em camundongos tratados SMA por sulfato de dextrana 15 mg/kg por dia, em comparação com controlo de veículo no dia 30.

[0045] A FIG. 16 ilustra a área de GFAP (área de células positivas em microns quadrados por campo x10) no grupo tratado com sulfato de dextrana versus o grupo veículo de controlo no dia 30.

[0046] As Figs. 17A e 17B ilustram o efeito do tratamento sobre a densidade de capilares para um camundongo do grupo de controle de veículo (Fig. 17A) e grupo de sulfato de dextrana (15 mg/kg, diariamente) (Fig. 17B).

[0047] A FIG. 18 ilustra o tamanho do infarto 35 dias após a indução de MI.

[0048] A FIG. 19 compara a coloração de SMA 35 dias após a indução de MI para o tratamento de sulfato de dextrana (15 mg/kg, 3 vezes/semana durante 3 semanas) e o grupo de controlo de veículo.

[0049] As Figs. 20A-20C ilustram a coloração de SMA para a densidade vascular para dois camundongos tratados com sulfato de dextrana (15 mg/kg, 3 vezes/semana durante 3 semanas) (Figs. 20A, 20B) e um camundongo de controlo de veículo (Fig. 20C).

[0050] A FIG. 21 ilustra significa fluxo sanguíneo em um modelo de HLI de camundongo.

[0051] A FIG. 22 ilustra dezenas de pontuações de membro em um modelo de HLI de camundongo.

[0052] A FIG. 23 ilustra SMA e densidade capilar de fator 8 em perna ferida de HLI.

[0053] A FIG. 24 ilustra pontuação de capilares de angiografia marcar na perna ferida de HLI.

[0054] As Figs. 25A-25D ilustram imagens de capilares de angiografia de animal de controle de veículo (Fig. 25A) e animais em grupos de tratamento 2M, 3M e 4M (Fig. 25B-25D).

[0055] Todas as figuras mostram erro médio + padrão da média

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0056] As presentes modalidades referem-se geralmente a angiogênese, e em particular a utilização de sulfato de dextrana para a indução de angiogênese num sujeito.

[0057] As presentes modalidades baseiam-se na descoberta de que o sulfato de dextrana dentro de um peso molecular médio em particular tem efeito indutor de angiogênese e efeito de aumento do fluxo sanguíneo quando administrado a um sujeito, preferivelmente um sujeito mamífero, e mais preferivelmente um sujeito humano.

[0058] Este efeito do sulfato de dextrana de modalidades foi altamente surpreendente à luz da divulgação da técnica anterior que polissacarídeos sulfatados inibiram angiogênese in vivo e que o sulfato de dextrana com um peso molecular médio de 500 000 Da é angiostático, ou seja, inibe a angiogênese.

[0059] Os dados experimentais, tal como apresentados aqui em nítido contraste mostram que o sulfato de dextrana das modalidades possui efeitos in vivo na indução de angiogênese como pode ser visto através do aumento significativo do fluxo sanguíneo médio, diminuindo a gravidade da isquemia, aumentando a densidade capilar num modelo de isquemia e num modelo de acidente vascular cerebral e reduzindo o tamanho do enfarte num modelo de enfarte do miocárdio (MI). O sulfato de dextrana das modalidades é além disso capaz de formar seletivamente os vasos sanguíneos no tecido isquêmico, apesar de não causar qualquer formação significativa de vaso no tecido não isquêmico.

[0060] Assim, um aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 para uso na indução de angiogênese num sujeito.

[0061] No que se segue, referência a peso molecular (médio) e teor de enxofre do sulfato de dextrana se aplica também a qualquer derivado farmaceuticamente aceitável de sulfato de dextrana. Assim, o derivado farmaceuticamente aceitável de sulfato de dextrana tem preferencialmente o peso e teor de enxofre molecular médio, conforme discutido nas seguintes modalidades.

[0062] O sulfato de dextrana fora da gama de modalidades, acredita- se, tem efeito inferior de angiogênese ou nenhum efeito. Por exemplo, a heparina, um outro polissacarídeo sulfatado, com um peso molecular médio de 2,4 kDa realmente inibiu angiogênese assim como moléculas maiores de sulfato de dextrana (Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23, 141-149 (1993); patente US No. 5.135.920).

[0063] Além disso, o sulfato de dextrana de peso molecular superior a 10000 Da geralmente tem um efeito menor contra o perfil de efeitos secundários, em comparação com sulfato de dextrana com um peso molecular médio mais baixo. Isto significa que a dose máxima de sulfato de dextrana que pode ser administrada com segurança a um sujeito é inferior para grandes moléculas de sulfato de dextrana (> 10000 Da), em comparação com moléculas de sulfato de dextrana com um peso molecular médio dentro da gama presente. Como consequência, tais moléculas de sulfato de dextrana maiores são menos adequadas em usos clínicos quando o sulfato de dextrana deve ser administrado a indivíduos in vivo. Além disso, as grandes moléculas de sulfato de dextrana tem de fato o efeito oposto, em comparação com sulfato de dextrana das modalidades como é evidenciado a partir da patente US No. 5.135.920.

[0064] Assim, parece haver uma gama muito estreita, no que diz respeito ao peso molecular médio de sulfato de dextrana em que o sulfato de dextrana tem efeito de angiogênese quando administrado a um sujeito e que as moléculas de sulfato de dextrana fora da gama de modalidades não têm nenhum efeito de angiogênese ou até mesmo tem efeito de inibição de angiogênese.

[0065] O sulfato de dextrana é um polissacarídeo sulfatado e, em particular, um glucano sulfatado, isto é, polissacarídeo feito de muitas moléculas de glicose. Peso molecular médio tal como é aqui definido indica que os polissacarídeos sulfatados individuais podem ter um peso molecular diferente deste peso molecular médio, mas que o peso molecular médio representa o peso molecular médio dos polissacarídeos sulfatados. Isto implica ainda que haverá uma distribuição natural de pesos moleculares em torno deste peso molecular médio para uma amostra de sulfato de dextrana.

[0066] Peso molecular médio (MW) de sulfato de dextrana é tipicamente determinado utilizando métodos indiretos, tais como de cromatografia de exclusão/penetração de gel, dispersão de luz ou viscosidade. Determinação do peso molecular médio utilizando tais métodos indiretos irá depender de uma série de fatores, incluindo a escolha da coluna e eluente, taxa de fluxo, procedimentos de calibração, etc.

[0067] Peso molecular médio (MW):

típico de métodos sensíveis para tamanho molecular, em vez de valores numéricos, por exemplo, dispersão de luz e métodos de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Se uma distribuição normal é presumida, então um mesmo peso de cada lado de Mw, isto é, o peso total de moléculas de sulfato de dextrana na amostra tendo um peso molecular inferior a Mw é igual ao peso total de moléculas de sulfato de dextrana na amostra tendo um peso molecular acima de Mw.

[0068] Numa modalidade, o sulfato de dextrana ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável tem um peso molecular médio na gama de 2 000 e 10000 Da. Numa outra modalidade, o peso molecular médio está dentro de uma gama de 2 500 e 10000 Da. Numa modalidade particularmente preferida, o peso molecular médio está dentro de uma gama de 3 000 e 10000 Da.

[0069] Numa modalidade opcional, mas preferencial, menos do que 40% das moléculas de sulfato de dextrana tem um peso molecular inferior a 3 000 Da, preferivelmente menos do que 35%, tal como menos do que 30% ou menos do que 25% das moléculas de sulfato de dextrana tem um peso molecular inferior a 3 000 Da. Além disso, ou alternativamente, menos do que 20% das moléculas de sulfato de dextrana tem um peso molecular superior a 10000 Da, preferivelmente menos do que 15%, tal como menos do que 10% ou menos do que 5% das moléculas de sulfato de dextrana tem um peso molecular acima de 10000 Da. Assim, numa modalidade particular, o sulfato de dextrana tem uma distribuição de peso molecular substancialmente estreita em torno do peso molecular médio.

[0070] Numa modalidade particular, o peso molecular médio de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, está dentro de uma gama de 3 500 e 9 500 Da, tal como no intervalo de 3 500 e 8 000 Da.

[0071] Numa outra modalidade particular, o peso molecular médio de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, está dentro de uma gama de 4 500 e 7 500 Da.

[0072] Numa outra modalidade particular, o peso molecular médio de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, está dentro de uma gama de 4 500 e 5 500 Da.

[0073] Assim, numa modalidade atualmente preferencial o peso molecular médio de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, é de preferência de cerca de 5 000 Da ou, pelo menos, substancialmente perto de 5 000 Da, tal como 5 000 ± 500 Da, por exemplo, 5 000 ± 400 Da, de preferência 5 000 ± 300 Da ou 5 000 ± 200 Da, tal como 5 000 ± 100 Da. Assim, numa modalidade, o peso molecular médio em peso de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, é de 4,5 kDa, 4,6 kDa, 4,7 kDa, 4,8 kDa, 4,9 kDa, 5,0 kDa, 5,1 kDa, 5,2 kDa, 5,3 kDa, 5,4 kDa ou 5,5 kDa.

[0074] Numa modalidade particular, o peso molecular médio em peso de sulfato de dextrana, ou o derivado farmacêutico respectivo, tal como apresentado acima, é de Mw médio, e de preferência, determinado por cromatografia de exclusão/ penetração de gel, cromatografia de exclusão de tamanho, dispersão de luz ou métodos baseados na viscosidade.

[0075] Numa modalidade particular, sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, consiste, em média, de cerca de ou ligeiramente acima de 5 unidades de glucose e tem um número médio de sulfato por unidade de glicose de pelo menos 2,0, tal como de pelo menos 2,5.

[0076] O sulfato de dextrana é um derivado polianiónico de dextrana e contém enxofre. O teor médio de enxofre para sulfato de dextrana das modalidades é de um modo preferido 15 a 20% e mais preferivelmente cerca de 17%, que corresponde geralmente a cerca de dois grupos sulfato por resíduo de glucosil. Numa modalidade particular, o teor de enxofre do sulfato de dextrana é de preferência igual a ou, pelo menos, perto do grau máximo possível de teor de enxofre das moléculas de dextrana.

[0077] Numa modalidade particular, o sulfato de dextrana de modalidades tem um peso molecular numérico médio (Mn) tal como medido por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) dentro de uma gama de 1.850 e 2.000 Da.

[0078] Numa outra modalidade particular, o sulfato de dextrana de modalidades tem, em média, 5,1 unidades de glicose e um número médio de sulfato por unidade de glicose de 2,6-2,7, geralmente resultando num peso molecular médio em número (Mn) tal como medido por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) dentro de um intervalo de 1.850 e 2.000 Da.

[0079] Número de peso molecular médio (Mn):

tipicamente derivado por ensaios de grupo final, por exemplo, espectroscopia de NMR ou cromatografia. Se uma distribuição normal é presumida, então um mesmo número de moléculas de sulfato de dextrana pode ser encontrado em cada um dos lados de Mn, ou seja, o número de moléculas de sulfato de dextrana na amostra tendo um peso molecular inferior a Mn é igual ao número de moléculas de sulfato de dextrana na amostra tendo um peso molecular acima de Mn.

[0080] O sulfato de dextrana de acordo com as modalidades pode ser proporcionado como um seu derivado farmaceuticamente aceitável de sulfato de dextrana. Derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem solvatos e sais de sulfato de dextrana, por exemplo, um sal de sódio ou de potássio.

[0081] O sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades é de preferência administrado por injeção para o sujeito e em particular por injeção intravenosa (i.v.), infeção subcutânea (s.c.) ou injeção intraperitoneal (i.p.), de preferência injeção i.v. ou s.c. Outras vias de administração parentérica que podem ser utilizadas incluem injeção intramuscular e intra-articular. Injeção de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode, em alternativa, ou além disso, ter lugar diretamente em, por exemplo, um tecido isquêmico ou órgão ou outro local no corpo sujeito em que a angiogênese e o aumento do fluxo de sangue estão a tomar lugar.

[0082] O sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades é de preferência formulado como uma solução para injeção aquosa com um solvente ou excipiente seleccionado. O solvente é vantajosamente um solvente aquoso e, em particular, uma solução tampão. Um exemplo não limitativo de uma tal solução tampão é um tampão de ácido cítrico, tais como tampão de mono- hidcamundongo de ácido cítrico (CAM), ou um tampão de fosfato. Por exemplo, o sulfato de dextrana de modalidades pode ser dissolvido em soro fisiológico, tais como solução salina de NaCI a 0,9%, e em seguida, opcionalmente tamponado com 75 mM de CAM e ajustando o pH para cerca de 5,9 utilizando hidróxido de sódio. Também são possíveis soluções não-tamponadas, incluindo soluções para injeção aquosas, como solução salina, ou seja, NaCl (aq). Além disso, outros sistemas de tampão que não CAM podem ser usados se uma solução tamponada é desejada.

[0083] As modalidades não são limitadas a preparações injetáveis e outras vias de administração podem, alternativamente, ser utilizadas, incluindo oralmente, nasalmente, bucalmente, retalmente, dermicamente, traquealmente, bronquialmente, ou topicamente. O composto ativo, sulfato de dextrana, é então formulado com um excipiente ou carreador adequado que é seleccionado com base na via de administração particular.

[0084] Gamas de dose adequadas para o sulfato de dextrana das modalidades podem variar de acordo com o tamanho e peso do indivíduo, a condição para a qual o sujeito é tratado, e outras considerações. Em especial para seres humanos, uma possível gama de dosagem poderia ser de 1 μg/kg e 150 mg/kg em peso corporal, de preferência de 10 μg/kg a 100 mg/kg em peso corporal.

[0085] Em modalidades preferidas, o sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, é formulado para ser administrado a uma dosagem numa gama de 0,05 a 50 mg/kg em peso corporal do sujeito, de preferência de 0,05 ou 0,1 a 40 mg/kg em peso corporal do sujeito, e mais preferivelmente de 0,05 ou 0,1 a 30 mg/kg, ou 0,1 a 25 mg/kg ou de 0,1 a 15 mg/kg, ou 0,1 a 10 mg/kg em peso corporal do sujeito.

[0086] A administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, de modalidades é preferencialmente iniciada tão cedo quanto possível após a lesão ou outra condição causando isquemia, acidente vascular cerebral ou uma doença cardiovascular no sujeito ou causando uma condição médica que possa ser tratada ou pelo menos aliviada pela indução da angiogênese como desencadeada pela administração de sulfato de dextrana ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável.

[0087] A administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, não tem necessariamente de ser limitada ao tratamento de uma condição médica presente, mas pode em alternativa, ou adicionalmente, ser utilizada para a profilaxia. Em outras palavras, o sulfato de dextrana de modalidades pode ser administrado a um indivíduo que vai ser submetido a um procedimento médico, tal como a cirurgia, que pode causar a isquemia local ou outro efeito farmacológico que pode ser tratado, inibida ou aliviado pela indução da angiogênese e/ou aumentando o fluxo sanguíneo.

[0088] O sulfato de dextrana das modalidades pode ser administrado numa única ocasião da administração, tal como sob a forma de uma única injeção de bolus. Esta dose de bolus pode ser injetada muito rapidamente para o paciente, mas é vantajosamente infundida ao longo do tempo de modo que a solução de sulfato de dextrana é infundida ao longo de alguns minutos de tempo para o paciente, por exemplo, durante 5 a 10 minutos.

[0089] Alternativamente, sulfato de dextrana da modalidade pode ser administrada em múltiplas, isto é, pelo menos, duas, ocasiões durante um período de tratamento. A duração de tal período de tratamento está tipicamente relacionada com o período de tempo endógeoa de cicatrização de feridas em diferentes tipos e o tipo de insulto. Para mais informações de períodos de tratamento adequados, pode ser feita referência ao Capítulo 1 Overview of Wound Healing in Different Tissue Types, páginas 3-40 de Indwelling Neural Implants: Strategies for Contending with the In Vivo Environment, ed. William M. Reichert de 2008 por Taylor & Francis Group, LLC (ISBN: 978-0-8493-9362-4).

[0090] Assim, o sulfato de dextrana de modalidades poderia ser administrado uma vez ou em várias vezes por dia, uma vez ou em várias vezes por semana, uma vez ou em várias vezes por mês, como exemplos ilustrativos.

[0091] Em geral, para doenças agudas, tais como, que causam isquemia aguda em, por exemplo, acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio (MI), transplante de células e órgãos, a duração do período de tratamento pode ser de uma única administração, mas é, de preferência, sob a forma de várias administrações durante um período de tratamento de, por exemplo, uma semana, algumas semanas ou um mês. Períodos de tratamento mais longos de até três meses ou até um ano podem melhorar ainda mais a cura e recuperação.

[0092] Para as condições isquêmicas de tipo intermitente, pode haver uma possibilidade de utilizar o tratamento como profilaxia (prevenção) ou o tratamento diretamente depois de exacerbação da doença. Este tipo de protocolo de administração pode ser adequado para doenças tais como esclerose múltipla (EM), a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a doença das células falciformes. Os períodos de tratamento podem ser até 1-3 meses para o tratamento após exacerbação. Para a profilaxia da doença, períodos de tratamento mais longos, opcionalmente, podem ser utilizados.

[0093] A indução da angiogênese num sujeito através da administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, as modalidades está de preferência ocorrendo num indivíduo humano que sofre de uma doença, distúrbio ou condição médica que causa isquemia no corpo do sujeito humano.

[0094] A isquemia é uma restrição no fornecimento de sangue aos tecidos, causando uma escassez de oxigénio e glucose necessários para o metabolismo celular. A isquemia é geralmente causada por problemas com os vasos sanguíneos, com consequente dano ou disfunção de tecido ou órgão. Significa, também, anemia local e hipóxia em uma determinada parte de um corpo, por vezes resultantes de congestionamento, como a vasoconstrição, trombose ou embolia.

[0095] Um tratamento eficaz da isquemia ou uma abordagem eficaz na prevenção ou pelo menos redução do risco de sofrer de isquemia é induzir a angiogênese. A angiogênese provoca um aumento no fluxo de sangue no tecido relevante e pode, assim, neutralizar qualquer restrição no fornecimento de sangue para o tecido causada pela doença, distúrbio ou condição médica.

[0096] Exemplos não limitativos mas ilustrativos de doenças, distúrbios ou condições médicas que podem causar isquemia incluem a cicatrização de feridas; isquemia periférica, tais como isquemia após o transplante de órgãos, tecidos ou células, doença arterial periférica, isquemia de membros, pernas inquietas, síndrome de Raynaud, doença falciforme, ou tromboangeíte obliterante; isquemia coronária, como a causada por insuficiência cardíaca congestiva, enfarte do miocárdio ou doença arterial coronária; doenças isquêmicas em crianças, tais como as doenças perinatais ou neonatais, doenças da infância, por exemplo, hipóxia neonatal ou lesão isquêmica cerebral, encefalopatia asfixia, paralisia cerebral; isquemia no sistema nervoso central, tal como a causada por lesão traumática cerebral, arterite temporal, hipoxia causada pela esclerose múltipla, derrame (acidente vascular cerebral), esclerose lateral amiotrófica; ou doença distrófica muscular; isquemia causada por lesão trombótica, hemorrágica ou traumática.

[0097] A cicatrização de feridas envolve geralmente quatro fases, geralmente denotadas fase precoce, fase inflamatória, fase proliferativa e de fase de maturação e de remodelação. A angiogênese é um dos processos que ocorrem durante a fase proliferativa. A administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, pode promover o efeito de angiogênese que ocorre como um dos sub-processos de cicatrização de feridas. O processo de angiogênese ocorre em simultâneo com a proliferação de fibroblastos durante a cicatrização de feridas quando as células endoteliais migram para a área da ferida. Uma vez que a atividade dos fibroblastos e células epiteliais requer oxigénio e nutrientes, a angiogênese é imperativa para outras fases de cicatrização de feridas, como a epiderme e a migração de fibroblasto.

[0098] Isquemia periférica geralmente indica estados isquêmicos que ocorrem em tecidos e órgãos diferentes do coração (isquemia coronária) e o sistema nervoso central (isquemia de SNC). Pode haver várias causas de isquemia periférica. Um exemplo típico é o transplante de órgãos ou de tecidos a um sujeito. O órgão ou tecido transplantado é então tipicamente exposto a isquemia durante o processo de enxerto inicial, tendo lugar a partir do ponto de transplante até novos vasos sanguíneos terem sido formados em torno do órgão ou tecido transplantado. Existe um alto risco de dano ou disfunção do órgão ou de tecido devido a isquemia e hipoxia, caso o fornecimento de sangue suficiente não seja estabelecido logo após o transplante. Assim, a indução da angiogênese por sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com as modalidades em conexão com o transplante pode reduzir significativamente o risco de danos ou disfunção do órgão transplantado ou tecido devido a isquemia e/ou hipoxia. A administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com as modalidades pode ter lugar antes do transplante, a fim de induzir a angiogênese e proporcionar aumento do fluxo sanguíneo no local de transplante, antes do evento real de transplante. Em tal caso, o aumento do fluxo sanguíneo induzido por dextrana sulfato das modalidades pode ser suficientes para impedir ou pelo menos reduzir os danos isquêmicos para o órgão ou tecido transplantado.

[0099] Doença vascular periférica (PVD), comumente referida doença como doença arterial periférica (DAP) ou doença arterial obstrutiva periférica (DAOP) ou arteriopatia obliterante periférica, refere-se à obstrução das grandes artérias não dentro da vasculatura de arco aórtico, coronária ou cérebro. PVD pode resultar de aterosclerose, processos inflamatórios que conduzem à estenose, de uma embolia, ou formação de trombos. Causa isquemia aguda ou crônica. Um tratamento eficaz de PVD é restaurar o fluxo sanguíneo através da administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com as modalidades.

[0100] Isquemia, muitas vezes referida como isquemia aguda, ocorre quando existe uma falta repentina de fluxo de sangue a um membro. Isquemia aguda é normalmente devido a um embolia ou trombose. A trombose é normalmente provocada por doença vascular periférica (doença aterosclerótica que leva à obstrução dos vasos sanguíneos), enquanto uma embolia pode ser devido ao ar, trauma, gordura, fluido amniótico, ou um tumor. Os indivíduos que sofrem de isquemia dos membros iriam se beneficiar da administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades.

[0101] Na medicina, fenômeno de Raynaud é fluxo sanguíneo excessivamente reduzido em resposta ao frio ou estresse emocional, causando a descoloração dos dedos, dedos do pé e, ocasionalmente, outras áreas. O fenômeno de Raynaud por si só é apenas um sinal (hipoperfusão) acompanhado de um sintoma. Quando ligado a patogênese, pode ser parte de doença de Raynaud (também conhecido como fenômeno de Raynaud primário), onde a causa é desconhecida, ou parte da síndrome de Raynaud (fenômeno de Raynaud secundário), que é uma síndrome causada por uma doença primária conhecida, mais comumente doenças do tecido conjuntivo, como lúpus eritematoso sistêmico. É um hiperativação do sistema nervoso simpático, causando vasoconstrição extrema dos vasos sanguíneos periféricos, levando à hipóxia tecidual. Casos crônicos recorrentes casos de fenômeno de Raynaud podem resultar na atrofia da pele, tecidos subcutâneos e músculo, possivelmente causando ulceração e gangrena isquêmica. A administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades pode ser um meio eficaz de reduzir o risco de sofrer de, tratar ou pelo menos aliviar os sintomas da síndrome ou doença de Raynaud.

[0102] Doença falciforme (SCD), ou anemia falciforme (AF) ou drepanocitose, é uma doença hereditária do sangue, caracterizada por hemácias que assumem uma forma rígida anormal de foice. Falcização diminui a flexibilidade dos eritrócitos e resulta em um risco de um fluxo insuficiente de sangue a uma parte do corpo. A indução de angiogênese usando sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades pode ser usada para reduzir o risco de desenvolvimento de isquemia periférica em indivíduos que sofrem de anemia falciforme.

[0103] Tromboangeíte obliterante, também conhecida como doença de Buerger ou gangrena pré-senil, é uma inflamação progressiva recorrente e trombose (coagulação) de pequenas e médias artérias e veias das mãos e dos pés. Tromboangeíte obliterante pode, portanto, causar isquemia nas mãos e nos pés devido a restrição do fluxo de sangue destas extremidades. A administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades pode ser um meio eficaz para aumentar o fluxo de sangue para as mãos e os pés.

[0104] Isquemia coronária é um termo médico de não se ter sangue suficiente através das artérias coronárias. Isquemia coronária está associada a doenças cardíacas, bem como ataques cardíacos. É também conhecida como isquemia cardíaca. A doença arterial coronariana (DAC) ocorre quando substâncias gordurosas ficam presas às paredes das artérias coronárias, o que estreita as artérias e restringe o fluxo de sangue. Isso faz com que falte oxigênio e sangue para o coração, o que pode resultar em um infarto do miocárdio (ataque cardíaco). DAC provoca a constrição das artérias, o que leva a uma falta de fluxo de sangue através das artérias, bem como oxigénio, um processo chamado de aterosclerose. A aterosclerose é a causa mais comum de isquemia coronária. O aumento do fluxo sanguíneo no músculo do coração através da indução da angiogênese desencadeada pela administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, de modalidades pode ser importante para reduzir o risco ou reduzir o dano causado por isquemia coronária. Também trombose pode ser uma causa de isquemia coronariana.

[0105] O enfarte do miocárdio (MI) ou enfarte agudo do miocárdio (AMI), vulgarmente conhecido como um ataque de coração, ocorre quando o fluxo sanguíneo para parte do coração pára, causando danos no músculo do coração. A maioria dos infartos ocorre devido a doença arterial coronariana. O mecanismo de um MI muitas vezes envolve a ruptura de uma placa aterosclerótica levando à completa obstrução de uma artéria coronária. A administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades reduz o tamanho do tamanho de enfarte. Deste modo, os danos permanentes aos músculos cardíacos causados por MI podem ser significativamente reduzidos de acordo com as modalidades.

[0106] Isquemia no SNC pode ser devido a várias causas. Por exemplo, lesão cerebral traumática pode causar um bloqueio ou restrição no fluxo sanguíneo para uma parte do cérebro. Tal restrição do fluxo de sangue pode ter consequências graves se hipoxia ocorre no cérebro. Aumento do fluxo sanguíneo como causado pela administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades pode, assim, ser usado para reduzir o risco de danos permanentes para o cérebro causados por isquemia a seguir a uma lesão cerebral traumática.

[0107] Arterite temporal, também chamada de arterite de células gigantes (ACG), arterite craniana ou doença fr Horton, é uma doença inflamatória dos vasos sanguíneos que envolve mais comumente artérias grandes e médias da cabeça, com predomínio para os ramos da artéria carótida externa. É uma forma de vasculite. A indução da angiogênese e aumento do fluxo sanguíneo como causada pela administração de sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, das modalidades pode ser benéfica para indivíduos que sofrem de artrite temporal.

[0108] Acidente vascular cerebral, por vezes referido como um acidente vascular cerebral (AVC), insulto vascular cerebral (IVC) ou coloquialmente derrame cerebral, é a perda da função cerebral devido a uma perturbação no fornecimento de sangue para o cérebro. Esta perturbação é devido ou a isquemia ou a hemorragia. A isquemia é causada por um bloqueio de um vaso sanguíneo por meio de trombose ou embolia arterial, ou por hipoperfusão sistêmica. Acidente vascular cerebral hemorrágico é causado pelo sangramento de vasos sanguíneos do cérebro, quer diretamente para o parênquima cerebral ou no espaço subaracnóide circundante do tecido cerebral. Sujeito que sofre de um acidente vascular cerebral iria se beneficiar de um tratamento que aumenta o fluxo de sangue para o cérebro para reduzir o risco de danos causados pelo fornecimento insuficiente de sangue. Como consequência, a administração de sulfato de dextrana, ou o seu derivado farmaceuticamente aceitável, de modalidades é vantajosamente administrada a indivíduos que sofrem de acidente vascular cerebral.

[0109] Vários distúrbios neurológicos podem causar uma restrição no fornecimento de sangue para o SNC, tal como parte do cérebro. Por exemplo, Multiple Sclerosis International 2013, 1-6 (2013) divulga que as lesões iniciais da esclerose múltipla (EM) estão associadas a hipoxia. Assim, os sujeitos que sofrem de EM podem se beneficiar de um aumento do fluxo sanguíneo, a fim de tratar ou pelo menos reduzir ou inibir a hipóxia associada com EM.

[0110] A esclerose lateral amiotrófica (ALS), também referida como doença dos neurónios motores (DNM) e a doença de Lou Gehrig, é uma doença neurodegenerativa com várias causas. É caracterizada por fraqueza rapidamente progressiva devido à atrofia muscular e espasticidade muscular, dificuldade em falar (disartria), de deglutição (disfagia) e em respirar (dispnéia). As experiências têm demonstrado que a ALS está associada com a redução do fluxo sanguíneo em, por exemplo, regiões do lobo frontal premotor, Acta Neurologica Scandinavia 116, 340344 (2007). Especula-se que o aumento do fluxo sanguíneo através da indução da angiogênese possa ser benéfico para indivíduos que sofrem de ALS.

[0111] A indução de angiogênese de acordo com as modalidades pode ainda ser utilizada em ligação com o implante de vários dispositivos médicos, sensores, etc., em que pode ser vantajosa para induzir a microcirculação em direcção ou em conexão com o implante.

[0112] O sulfato de dextrana das modalidades pode, assim, ser utilizado para tratar, inibir ou prevenir várias doenças isquêmicas, distúrbios e condições, e também componentes isquêmicos em várias doenças, distúrbios e condições.

[0113] Uma vantagem significativa das presentes modalidades é que o sulfato de dextrana das modalidades é capaz de induzir seletivamente a angiogênese num sujeito, isto é, induzir a angiogênese num local, tal como um tecido ou órgão, onde é necessária angiogênese. Por exemplo, a angiogênese é induzida e ocorre em tecido isquêmico, mas não no tecido não isquêmico, tal como exemplificado na Fig. 4, que mostra a presença de uma pequena formação de capilares (como ilustrado por CD-34) e confirmando funcionamento e capilares ativos (tal como ilustrado por DA) no membro isquêmico direito, mas não no membro não-isquêmico esquerdo.

[0114] Um outro aspecto das modalidades refere-se a um método para induzir a angiogênese num sujeito. O método compreende a administração de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para o sujeito.

[0115] Um outro aspecto das modalidades refere-se à utilização de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a fabricação de um medicamento para induzir a angiogênese num sujeito.

[0116] Ainda outro aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para uso em aumentar o fluxo sanguíneo em um sujeito que sofre de isquemia.

[0117] Um aspecto relacionado das modalidades define um método para aumentar o fluxo de sangue em um sujeito que sofre de isquemia. O método compreende a administração de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para o sujeito. Outro aspecto relacionado das modalidades define uso de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a fabricação de um medicamento para aumentar o fluxo sanguíneo em um sujeito que sofre de isquemia.

[0118] Numa modalidade particular, sulfato de dextrana, ou o derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, é capaz de aumentar o fluxo sanguíneo num tecido isquêmico ou órgão do sujeito.

[0119] O tecido ou órgão pode ser um órgão periférico, o coração ou o tecido do SNC, tais como o cérebro, como discutido no acima exposto.

[0120] Ainda um aspecto das modalidades relaciona-se com sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a vascularização de tecido esquêmico em um sujeito.

[0121] Um aspecto relacionado com as modalidades define um método para a vascularização do tecido isquêmico num sujeito. O método compreende a administração de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para o sujeito. Outro aspecto relacionado das modalidades define uso de sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, com um peso molecular médio inferior a 10000 Da para a fabricação de um medicamento para vascularização de tecido esquêmico em um sujeito.

[0122] O tecido isquêmico poderia ser um órgão periférico, o coração ou o tecido do SNC, tais como o cérebro, como discutido no acima exposto.

[0123] A vascularização, ou seja, a formação de pequenos capilares, induzida ou desencadeada por sulfato de dextrana das modalidades é seletiva em termos de tomar lugar no tecido isquêmico num sujeito, mas não no tecido não isquêmico, isto é, saudável, do sujeito. A vascularização induzida de acordo com as modalidades, assim, ocorre no(s) sítio(s) onde é necessária, deixando o tecido saudável inalterado (sem formação significativa de vascularização).

[0124] O sujeito é de preferência um mamífero, mais de preferência um primata e, em particular, um sujeito humano. A presente modalidade pode, no entanto, ser também utilizada em aplicações veterinárias. Exemplo de sujeitos animais não limitativos incluem primatas, gato, cão, porco, cavalo, camundongo, camundongo.

[0125] As modalidades podem também ser aplicadas em tratamento in vitro e/ou ex vivo de tecidos e/ou órgãos vascularizados, a fim de induzir angiogênese no tecido e/ou órgão vascularizado, aumentar o fluxo sanguíneo no tecido vascularizado e/ou órgãos e/ou vascularizar um tecido e/ou de órgão vascularizado.

[0126] Em tal caso, o sulfato de dextrana, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser adicionado ao tecido vascularizado e/ou órgão em várias aplicações in vitro ou ex vivo . Por exemplo, o sulfato de dextrana, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser adicionado a um meio de cultura em que o tecido vascularizado e/ou órgão é imerso ou contatado in vitro. Alternativamente, ou em adição, tecidos e/ou órgãos vascularizados podem ser pulverizados com uma solução que compreende o sulfato de dextrana, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável. Além disso, se o tecido e/ou órgão vascularizado está ligado a uma bomba de circulação extracorpórea ou dispositivo de oxigenação por membrana extracorporal (ECMO), então sulfato de dextrana, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser adicionado ao sangue que é bombeado através do tecido vascularizado e/ou órgão.

EXPERIMENTOS EXEMPLO 1 Avaliação da angiogênese em modelo de camundongo de isquemia de membro traseiro crítica

[0127] Doença arterial periférica (DAP) é uma forma de doença vascular periférica (PVD), em que há um bloqueio parcial ou total do fornecimento de sangue a um membro, em geral a perna, que conduz ao fluxo sanguíneo deteriorado e hipóxia no tecido. Quando PAD avança ela atinge a fase de isquemia crítica (CLI) com ulcerações de pele, gangrena e amputações inevitáveis. Angiogênese terapêutica emergiu como um meio não-invasivo de promoção da neovascularização em tecidos isquêmicos. Tal como divulgado no presente estudo administração subcutânea sistémica de sulfato de dextrana promove a angiogênese causando a formação de pequenos vasos sanguíneos e a proliferação de células endoteliais. No presente estudo um modelo de isquemia grave estável (Journal of Experimental and Clinical Medicine 31, 128-132 (2006)) foi utilizado para avaliar a segurança e eficácia de sulfato de dextrana sobre a angiogênese e o resultado funcional.

Materiais

[0128] O sulfato de dextrana com um peso molecular médio no intervalo de 5-7 kDa foi obtido a partir de pKa Chemicals A/S, Dinamarca. Nas Figs. 1-4, 6, 7, sulfato de dextrana é denotado TM-700.

[0129] Uma solução de injeção de sulfato de dextrana foi preparada no dia antes do início do estudo. Como veículo, foi utilizado NaCl a 0,9% (solução salina) (Teva Pharmaceutical Industries Ltd). A solução para injeção foi preparada por adição do volume relevante de NaCl para o composto pesado para obter uma concentração alvo para administração (10 ou 30 mg/kg de peso corporal). O sulfato de dextrana foi dissolvido por agitação em vórtice ou simplesmente rodando o tubo de algumas vezes. A solução foi armazenada a 2-8°C durante a noite para os agregados se estabilizarem. No dia seguinte, o tubo foi agitado em vórtice e a solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm para obter uma solução estéril. As soluções foram preparadas no dia 7, para usar no dia 8-21, e uma segunda preparação foi realizada no dia 21, para serem utilizadas no dia 22-35. A solução foi armazenada a 2-8°C entre as datas do pedido.

[0130] No total, 60 camundongos macho Balb/c, 9 semanas de idade, com um peso corporal médio de 24,7 g no início do estudo (dia 0) foram obtidos a partir de Harlan Labocamundongories, Israel. O peso mínimo e máximo registado em cada grupo foi de dentro do intervalo de ± 20% da média de grupo. Os animais foram tratados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde (NIH) e pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados de Laboratório de Animais (AAALAC). Os animais foram alojados em gaiolas polissulfonas (PSU) (5/gaiola) que mede 42,5 x 265,6 x 18,5 cm, com aço inoxidável grade superior com instalações que permitam ração peletizada e água potável em garrafas de policarbonato de vidro transparente; roupa de cama: esterilizados a vapor de casca de arroz limpo (Harlan, Sani-chip, Cat #: 106S8216) foi usado e material de cama foi alterado, juntamente com a gaiola pelo menos duas vezes por semana. Os animais foram alimentados ad libitum numa dieta comercial para roedores (Teklad Certified global 18% de proteína da dieta cat #: 106S8216). Os animais tiveram livre acesso à água potável autoclavada e acidificada (pH entre 2,5 e 3,5), obtida a partir do abastecimento do município. Os animais foram alojados em condições labocamundongoriais padrão, com ar condicionado e filtrado (HEPA F6/6) com entrada de ar fresco adequado (alterações mínimas 15 de ar/hora). Os animais foram mantidos em um ambiente de clima controlado. Faixa de temperaturas foi 20-24°C e intervalo RH foi 30-70% com 12 horas de luz e 12 horas de ciclo escuro.

Procedimento cirúrgico

[0131] No dia da cirurgia a anestesia foi induzida por 1,5 a 3,0% de isoflurano, de 1,5% de N2O e 0,5 % O2. Sob anestesia, os camundongos foram colocados com o lado ventral para cima. Uma incisão de 0,5-1,0 cm foi feita uma na pele na região inguinal. A artéria femoral foi ligada proximalmente logo após a parte distal da artéria ilíaca e distal após a sua bifurcação com profunda artéria femoral com fio de seda 6-0, seccionado e excisadas entre duas ligaduras. A ferida foi fechada com fio de seda 4-0 e os camundongos foram deixados para recuperar.

Tratamento de sulfato de dextrana

[0132] No dia 8, semana 2 pós-cirurgia, em cada animal em grupos 2M e 3M foram injetados solução de sulfato de dextrana s.c. três vezes por semana. Os animais do grupo 4 M foram injetados uma vez por semana e o grupo 1M recebeu tratamento com veículo (NaCl), ver Tabela 1.Tabela 1 - Alocação de Grupo

Medições de peso corporal

[0133] O peso corporal foi medido no dia de estudo -1 antes da cirurgia e em seguida uma vez por semana. Entre o dia 0 e o dia 7 foi observado uma pequena redução no peso corporal significativo em todos os grupos de animais 1 M, 2 M, 3M e 4M que variam de 1,1 g a 1,6 g, ver Fig. 1. A partir do dia 14 em diante, foi observado um aumento gradual em peso. Deste modo, entre o dia 0 e o dia 35 do aumento médio no peso do corpo variando entre 0,4 g e 1,7 g, ver Tabela 2.Tabela 2 - Mudança de base no peso corporal pelo grupo de estudo médio

Medições do fluxo sanguíneo

[0134] Fluxos sanguíneos nas pernas de ambos os lados foram medidos com um laser Doppler sem contato antes da cirurgia no dia -1 e nos dias: 1, 7, 14, 21, 28 e 35 pós-operação. Medições do fluxo sanguíneo foi expressa como a relação entre o fluxo no membro isquêmico para o membro normal.

[0135] Todos os grupos de animais 1M, 2M, 3M e 4M exibiram um aumento no fluxo arterial médio no membro operado entre o dia 1 e no dia 35, ver Fig. 2. O aumento do fluxo médio da linha de base após a cirurgia no sulfato de dextrana do grupo 2M tratado (10 mg/kg, 3 vezes/semana) por 46,7 unidades; no de sulfato de dextrana do grupo 3M tratado (30 mg/kg, 3 vezes/semana) por 59,3 unidades e no sulfato de dextrana do grupo 4M tratado (30 mg/kg 1 vez/semana) de 51,1 unidades em relação ao aumento de 19,5 unidades no veículo de controle do grupo 1M. Isto representa 2,2, 3,0 e 2,8 vezes aumentam respectivamente no fluxo sanguíneo significativo devido ao tratamento com sulfato de dextrana, ver Tabela 3 e a Fig. 2.Tabela 3 - Alteração do fluxo sanguíneo pelo grupo de estudo médio

[0136] A FIG. 8 compara o fluxo de sangue medido num camundongo de controle (grupo 1 M) e um camundongo tratado com sulfato de dextrana de acordo com o grupo 3M. A figura mostra imagens sem contato de laser Doppler 35 dias após ligação da artéria femoral do membro posterior esquerdo.

Avaliação macroscópica da gravidade isquêmica

[0137] Avaliação macroscópica do membro isquêmico foi realizada no dia 7 e uma vez por semana depois disso, utilizando notas morfológicas para a área necrótica, consulte a Tabela 4.Tabela 4 - Tipos morfológicos para a área necrótica

[0138] O membro isquêmico foi macroscopicamente avaliado semanalmente a partir do dia 7 até ao dia 35, usando escalas morfológicas graduais para a área necrótica, consulte a Tabela 4. Em todos os grupos de animais tratados com veículo e observou-se necrose do pé de sulfato de dextrana ou amputação do pé (graduada de 1 a 2, ver Tabela 6). As taxas percentuais de amputação do pé em cada grupo de tratamento são apresentadas na Tabela 5 e Tabela 6. Amputação do pé foi encontrada no grupo de controle tratado com veículo 1M (15,4%) e no grupo 4M tratado com sulfato de dextrana (30 mg/kg 1 vez/semana) (7,1%). Verificou-se que a taxa de necrose do dedo do pé no grupo 1M de controle tratado com veículo foi de 23,1% de animais. Nos grupos de animais tratados com sulfato de dextrana 2M e 3M, 35 dias após a indução HLI da taxa de necrose do dedo foi de 21,4% e 14,3%, respectivamente. No grupo de animais 4M tratados com sulfato de dextrana não ocorreu qualquer incidência de necrose do dedo (Tabela 6).Tabela 5 - Incidência de camundongos com dedo do pé e membro necrose no dia 7

Tabela 6 - Incidência de camundongos com dedo do pé e membro necrose no dia 35

Avaliação in vivo da função dos membros e dano isquêmico

[0139] A avaliação semi-quantitativa do uso prejudicado do membro isquêmico foi realizada uma vez por semana após a cirurgia, utilizando a seguinte escala, ver Tabela 7. Tabela 7 - As avaliações da função do membro

[0140] A função dos membros foi classificada como "Não aplicável" no caso de amputação parcial ou total do membro. Nesse caso, as medições do fluxo sanguíneo não foram incluídas na análise estatística.

[0141] Em paralelo com as medições do fluxo de sangue e, em comparação com o grupo de controle de veículo 1M, todos os grupos tratados com sulfato de dextrana a 2M, 3M e 4M apresentaram melhores resultados em melhoria funcional dos membros, ver Tabela 8 e na Tabela 9 a seguir e na Fig. 6.Tabela 8 - Incidência de camundongos com pontuações de função de membro 0, 1, 2 e 3 no dia 7

Tabela 9 - Incidência de camundongos com pontuações de função de membro 0, 1, 2 e 3 no dia 35

Imuno-histoquímica e análise da densidade de capilares

[0142] Os camundongos foram sacrificados no final do estudo no dia 36. Isotiocianato de fluoresceína (FITC) - conjugado de dextrana 500.000 Da 10 mg/ml foi injetado i.v. numa dose de 200 μl por camundongo 5 minutos antes de serem sacrificados todos os animais. O músculo quadríceps foi dissecado na parte coronária. O músculo foi fixado em 2,5% de paraformaldeido fresco (pH 7,4) durante 24 horas e foi, em seguida, incorporado em parafina para actina de músculo liso (SMA) com anticorpos monoclonais de camundongo (anti-SMA Ab-1, clone 1A4, 1:800, Termo científico) e imunocoloração de CD34 com anti CD34 (1: 200, Cedralene). Parafina foi feita de acordo com o procedimento de incorporação padrão.

[0143] Seções coradas foram avaliadas e fotografadas por microscópio de fluorescência (E600; Nikon, Tokyo, Japão) equipadas com objetivos do plano de flúor ligado a uma câmara CCD (DMX1200F; Nikon). Sob estas condições Cy3 mostra fluorescência de vermelho brilhante: Ex (máximo): 543 nm; Em (max) 570 nm, enquanto dextrana fluoresceína mostra intensa fluorescência verde (Ex (max): 488 nm; Em (max): 530 nm). As imagens digitais foram recolhidas e analisadas utilizando software Image Pro +. Quatro seções de amostras do músculo foram colhidas em áreas de oito animais dos grupos 1M, 3M e 4M. A área de vasos sanguíneos foi medida. A densidade foi expressa como o número médio de capilares por campo de visão. Total de vasos representam todos os vasos sanguíneos na área medida.

[0144] O número de capilares CD34 positivos foi maior nos grupos 3M e 4M tratados com sulfato de dextrana em comparação com o grupo de controle 1M no dia 35 do estudo, ver Figs. 3, 4 e 5A-5C. A coloração positiva CD34 é considerada como uma indicação para a formação de pequenos capilares e, assim, os resultados obtidos suportam a melhoria do fluxo sanguíneo observada nos grupos de animais tratados com sulfato de dextrana. Coloração dextrana confirmou que estes capilares estão funcionando e ativos. A coloração com SMA revelou o mesmo aumento nas formações de capilares como a coloração com CD34, ver Fig. 7.

[0145] A Fig. 4 mostra claramente que o sulfato de dextrana das modalidades apenas induz angiogênese no tecido isquêmico, isto é, no membro direito, e não no tecido não isquêmico, isto é, o membro esquerdo. Deste modo, o sulfato de dextrana das modalidades provoca uma indução seletiva de angiogênese apenas onde é necessário.

[0146] A angiogênese comprometida é uma das características das doenças isquêmicas. O alvo mais estabelecido para a angiogênese terapêutica foi o VEGF e os seus receptores. No entanto, ensaios clínicos para aliviar a isquemia foram decepcionantes, indicando a necessidade de novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças isquêmicas.

[0147] No presente estudo, avaliou-se a melhora do fluxo sanguíneo no modelo de isquemia do membro posterior do camundongo para avaliar a eficácia do sulfato de dextrana. Repetiu-se (três vezes por semana) ou (uma vez por semana) uma administração de sulfato de dextrana a uma dose de 30 mg/kg s.c. perfusão sanguínea significativamente restaurada em comparação com o controle tratado com veículo. No dia 35, foram observados dois e meio a três vezes maiores valores de perfusão de fluxo sanguíneo nos grupos tratados com sulfato de dextrana em comparação com o grupo de controle, com efeito estatisticamente significativo a partir de quatorze dias após o tratamento.

[0148] Os dados coletivos do estudo confirmaram a eficácia terapêutica do sulfato de dextrana dado s.c. para o tratamento de doença arterial periférica oclusiva no modelo animal Balb/c. As amputações espontâneas ou a taxa de necrose do dedo do pé também diminuíram em animais tratados com sulfato de dextrana em comparação com o grupo de controle. O tratamento com sulfato de dextrana melhorou a restauração funcional do membro em todo o grupo de animais tratados com fármacos em comparação com o controle tratado com veículo. O tratamento com sulfato de dextrana não causou quaisquer efeitos adversos nos animais tratados.

[0149] Os resultados da imuno-histoquímica confirmaram os resultados in vivo. Coletivamente, os dados deste estudo confirmaram a eficácia terapêutica do sulfato de dextrana para o tratamento da doença arterial periférica oclusiva no modelo de camundongo.

[0150] O tratamento com sulfato de dextrana em camundongos com isquemia de membros posteriores resultou numa recuperação significativa e rápida do fluxo sanguíneo, medida pelo Doppler laser e demonstrada também pela diminuição da severidade isquêmica dos membros e pela melhoria mais rápida da função dos membros.

[0151] Nenhum efeito adverso na saúde geral foi registrado em nenhum dos grupos. Estes dados foram confirmados por avaliação imuno- histoquímica. Os resultados refletem alterações na morfologia dos vasos sanguíneos, isto é, aumento da densidade dos capilares e angiogênese dos vasos sanguíneos.

EXEMPLO 2 Avaliação da eficiência da angiogênese no modelo de camundongos

[0152] Utilizou-se o modelo de camundongo tMCAO para avaliar a eficácia do tratamento com sulfato de dextrana. Os camundongos foram tratados com sulfato de dextrana durante 28 dias através de injeções subcutâneas, a partir de duas horas após o procedimento cirúrgico, quer a 30 mg/kg, três vezes por semana ou a uma dose diária de 15 mg/kg. Durante o estudo as funções neurológicas, motoras e somatossensorial foram monitorados em uma bateria de testes comportamentais.

[0153] As diferenças claras foram demonstradas entre os grupos tratados com sulfato de dextrana e o grupo de controle tratado com veículo. Melhoria nas funções motoras, avaliada pelo Neuroscore, no teste de passos e teste de balanço do corpo, foi demonstrada em ambos os grupos tratados com o fármaco. Funções sensorio-motoras também recuperados na sequência de tratamento de sulfato de dextrana. É provável que o efeito de tratamentos de sulfato de dextrana deve ser atribuída à sua atividade angiogênica. Esta conclusão foi apoiada por um aumento na perfusão do sangue cerebral e Músculo Liso de actina (SMA) de densidade de capilares positivos no hemisfério afetado. O sulfato de dextrana do tratamento também reduziu a resposta inflamatória em comparação com o controlo tratado com veículo.

[0154] Em vista destes resultados pode-se concluir que o tratamento sulfato de dextrana claramente melhorada do motor e déficits somatossensoriais, bem como perfusão sanguínea cerebral e atividade angiogênica no modelo de acidente vascular cerebral de camundongos.

[0155] O AVC é uma causa proeminente de incapacidade grave e de longa duração e a terceira causa de morte nos Estados Unidos. Os custos totais de saúde para incapacidade devido a acidente vascular encefálico são estimados em 53,6 bilhões anualmente. Os acidentes vasculares cerebrais isquêmicos compreendem mais de 88% de todos os acidentes vasculares cerebrais, tornando-os o tipo mais comum de lesão cerebrovascular. As condições isquêmicas no cérebro causam a morte neuronal, levando a déficits sensorimotores permanentes. É claro agora que o tratamento imediato para pacientes com acidente vascular cerebral é muitas vezes impossível no cenário clínico. Os médicos precisam de novas estratégias de tratamento para os tratamentos de acidente vascular cerebral com urgência.

[0156] Diversos modelos animais têm sido utilizados para estudar a isquemia cerebral no esforço de compreender sua fisiopatologia e identificar estratégias terapêuticas para minimizar a gravidade do dano isquêmico. A isquemia focal resulta em enfarte cerebral localizado e é induzida pela oclusão da artéria cerebral média (MCAO) no camundongo. Ele ganhou aceitação crescente como um modelo para o infarto hemisférico em seres humanos. Após MCAO um infarto cortical e estriatal com evolução temporal e espacial ocorre dentro do território vascular fornecido pela artéria cerebral média.

[0157] Na última década foram coletadas evidências crescentes de avaliação comportamental nos estudos em animais. Verificou-se que a melhoria funcional era altamente fiável como medida de eficácia terapêutica. Um dos tratamentos inovadores mais promissores para complicações vasculares é a angiogênese terapêutica, que emergiu como meio não invasivo para promover a neovascularização em tecidos isquêmicos.

[0158] Neste estudo, o potencial neuroprotetor e reabilitação de sulfato de dextrana foi estudada no modelo de camundongo transiente do acidente vascular cerebral MCAO.

Materiais

[0159] O sulfato de dextrana com um peso molecular médio no intervalo de 5-7 kDa foi obtido a partir de pKa Chemicals A/S, Dinamarca. Nas Figs. 9-16 sulfato de dextrana é denotado TM-700.

[0160] O sulfato de dextrana foi dissolvido em 0,9% de NaCl (salina) (Teva Pharmaceutical Industries Ltd.) a uma concentração de 60 mg/mL para os três vezes por semana e de injeção de 30 mg/ml para a injeção diária. A formulação é estável durante uma semana. Os animais receberam 0,5 ml/kg, igual a 30 e 15 mg/kg de peso corporal.

[0161] No total, 46 camundongos SD fêmeas com um peso corporal médio de 342 g no início do estudo (Dia 0) foram obtidos a partir de Harlan Labocamundongories, Israel. O peso mínimo e máximo registado em cada grupo foi de dentro de um intervalo de ± 20% do peso médio do grupo. Os animais foram tratados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde (NIH) e pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados de Laboratório de Animais (AAALAC). Os animais foram alojados em gaiolas de polietileno (5/gaiola) medindo 35 x 30 x 15 cm, com aço inoxidável grelha superior facilitando ração peletizada e água potável em garrafa de plástico; roupa de cama: esterilizados a vapor de arroz limpo casca (Harlan, Sani-chip cat #: 2018A+F) foi usadose material de cama foi alterado, juntamente com a gaiola pelo menos duas vezes por semana. Os animais foram alimentados ad libitum numa dieta comercial para roedores (Teklad Certified global 18% de proteína da dieta cat #: 106S8216). Os animais tiveram livre acesso à água potável autoclavada e acidificada (pH entre 2,5 e 3,5), obtida a partir do abastecimento do município. Os animais foram alojados em condições labocamundongoriais padrão, com ar condicionado e filtrado (HEPA F6/6) com entrada de ar fresco adequado (mínimo 15 alteraçõesde ar/hora). Os animais foram mantidos em um ambiente de clima controlado. Faixa de temperaturas foi 20-24°C e intervalo RH foi 30-70% com 12 horas de luz e 12 horas de ciclo escuro.

Procedimento cirúrgico

[0162] No dia da cirurgia anestesia foram induzidos com isoflurano a 4% numa mistura de 70% de N2O e 30% de O2 e mantida com 1,5-2% de isoflurano.

[0163] A oclusão da artéria cerebral média transiente foi realizada de acordo com o método previamente descrito em Acidente vascular encefálico 29, 2162-2170 (1998). A artéria carótida comum direita (CCA) foi exposta através de uma incisão no pescoço da linha média e cuidadosamente dissecada livre de nervos circundantes e fáscia - da sua bifurcação para a base do crânio. Os ramos da artéria occipital da artéria carótida externa (ECA) foram então isolados e esses ramos foram dissecados e coagulados. O ECA foi dissecado distalmente e coagulado juntamente com os ramos terminais da artéria lingual e maxilar, que foi então dividido. A artéria carótida interna (ICA) foi isolada e cuidadosamente separada do nervo vago adjacente, e a artéria pterigopalatina foi ligada próxima à sua origem com uma sutura de nylon 5-0 (SMI, Bélgica). Em seguida, uma sutura de seda 4-0 foi amarrada de forma frouxa em torno do coto de ECA mobilizado e um fio de sutura de monofilamento 4-0 de 4 cm de comprimento (a ponta da sutura foi amortecida usando uma chama e a sutura foi revestida com polilisina, à inserção) foi inserido através da ECA proximal no ICA e daí para dentro do círculo de Willis, ocluindo efetivamente o MCA. O ferimento cirúrgico foi fechado e os animais foram devolvidos às suas gaiolas para se recuperarem da anestesia. Duas horas depois da re-anestesia dos camundongos de oclusão, o monofilamento foi retirado para permitir a reperfusão, a ferida cirúrgica foi fechada e os camundongos foram devolvidos às suas gaiolas.

[0164] A uma hora após a oclusão, os animais foram sujeitos a avaliação neurológica utilizando o "Neuroscore para critérios de exclusão". Apenas os animais com uma pontuação total de 10 > foram incluídos no estudo.

Tratamento de sulfato de dextrana

[0165] Iniciado duas horas após a oclusão (imediatamente após a reperfusão), os animais nos grupos 2M e 3M (sulfato de dextrana em doses de 30 mg/kg três vezes por semana ou 15 mg/kg por dia) e animais no grupo 1M (veículo de controle) foram injetados subcutaneamente, Ver Tabela 10.Tabela 10 - Alocação de Grupo

Análise de dados

[0166] A menos que especificado de forma diferente, todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA bidirecional para medidas repetidas, seguidas por testes de comparação pós-hoc de Bonferroni.

Pesos corporais

[0167] Ao longo do estudo, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no peso corporal entre os vários grupos de tratamento, ver Fig. 9.

Pontuação de exame neurológico (Neuroscore)

[0168] Avaliação: pré-operação, uma hora após a oclusão e nos dias 7, 14, 21 e 28

[0169] A Escala de Avaliação Neurológica Modificada (mNRS) foi realizada. A pessoa que fez as avaliações comportamentais desconhecia a droga/dose dada (teste cego). O Neuroscore com pontuação total 18 foi realizado de acordo com acidente vascular cerebral32, 1005-1011 (2001).

[0170] O Neuroscore incluiu um conjunto de testes clínico- neurológicos (composto de testes motores, sensoriais, reflexos e de equilíbrio) que foram utilizados para avaliar o efeito dos tratamentos testados. O Neuroscore foi classificado numa escala de 0 a 18 (em que a pontuação normal é 0 e a pontuação máxima do déficit é representada por 18). Como esperado, em todos os grupos de camundongos foi observado um declínio acentuado nas funções neurológicas duas horas após a indução de tMCAO, com melhoria espontânea ao longo do tempo a seguir. Foram exibidas diferenças estatisticamente significativas nos grupos 2M tratados com sulfato de dextrana a 30 mg/kg três vezes por semana e tratados com 3M com 15 mg/kg de sulfato de dextrana diariamente, em comparação com o controle tratado com veículo, desde o primeiro teste no dia 7 ao longo do estudo até o dia 28, ver a Fig. 10. Não foi encontrada diferença estatística entre os dois esquemas de dosagem 2M e 3M.

Teste de Degrau

[0171] Avaliação: pré-operação e nos dias 7, 14, 21 e 28

[0172] Os animais foram testados para a acinesia de membros anteriores utilizando o teste de reforço. O animal foi mantido com as suas patas traseiras e um membro anterior fixos com uma pata e a pata traseira solta foi posta ao longo da mesa. O número de passos de ajuste foram contados enquanto o animal foi movido lateralmente ao longo da superfície da mesa (85 cm em cerca de cinco segundos), no sentido dianteiro e reverso para ambos os membros frontais.

[0173] Os animais foram testados para a acinesia de membros frontais no teste de passo a passo, vulgarmente utilizados para a medição da função neuromuscular, como um índice para a função motora do animal. Algumas melhorias na função motora ao longo do tempo foi observado em todos os animais que foram submetidos a tMCAO, principalmente como um resultado da recuperação funcional espontânea. No entanto, a melhoria funcional em camundongos tratados com sulfato de dextrana foi mais pronunciada em comparação com os controles tratados com veículo. Em ambos os grupos de animais tratados, grupo 2M e 3M, esta melhoria foi estatisticamente significativa em relação ao controle de partida no primeiro teste no dia 7 e continuou a melhorar até termino do estudo no dia 28, ver Fig. 11. Não foi encontrada diferença estatística entre os dois esquemas de dosagem 2M e 3M.

Colocação membro anterior Avaliação: pré-operação e nos dias 7, 14, 21 e 28

[0174] Para o teste de colocação do membro anterior, o examinador mantém o camundongo perto de uma mesa e pontuação capacidade do camundongo para colocar o membro anterior sobre a mesa em resposta aos estimulação dos bigodes, visual, tátil, ou proprioceptiva. Subpontuações separadas foram obtidas para cada modo de entrada sensorial e adicionados para dar pontuações totais (0 = normal, 12 = maximamente prejudicada).teste de colocação de membro anterior (0-12): colocação de Bigode (0-2); colocação Visual (para a frente (0-2), para os lados (0-2)) colocação tátil (dorsal (0-2), lateral (0-2)) colocação proprioceptiva (0-2). Para cada subteste, os animais foram pontuados como segue: 0.0 = resposta imediata 0.5 = resposta dentro de 2 segundos 1.0 = resposta de 2-3 segundos 1.5 = resposta > 3 segundos 2.0 = nenhuma resposta

[0175] Teste de colocação membro anterior foi utilizado para avaliar déficits motores sensoriais e somatossensorial. Semelhante a outros testes, alguma melhoria espontânea em déficits motores sensoriais ao longo do tempo foi observado em todos os animais que foram submetidos a tMCAO. No entanto, todos os camundongos tratados com sulfato de dextrana exibiu uma melhoria estatisticamente significativa em comparação com o tratamento de controle com veículo, começando no dia 14 e com a duração de estudar terminação no dia 28, ver Fig. 12. No grupo de melhoria 3M em déficits motores sensoriais alcançou significância estatística já no primeiro teste no dia 7.

Teste de equilíbrio do corpo

[0176] Avaliação: pré-operação e nos dias 7, 14, 21 e 28

[0177] O camundongo foi mantido a cerca de uma polegada a partir da base de sua cauda. Ele foi, em seguida, elevado a uma polegada acima de uma superfície de uma mesa. O camundongo foi mantido no eixo vertical, definida como não mais do que 10 ° para a esquerda ou direita. Um balanço foi registrado sempre que o camundongo se move a cabeça para fora do eixo vertical para ambos os lados. Antes de tentar outra balanço, o camundongo foi devolvido para a posição vertical para o seguinte balanço ser contado. Vinte oscilações totais foram contadas. Um camundongo normal, normalmente tem um número igual de balanços para ambos os lados. A seguir a isquemia focal, o camundongo tende a balançar para o lado contralateral (esquerda lado, neste caso). pontuações do balanço do corpo foram expressos como uma percentagem de direita sobre balanços totais. Houve uma recuperação parcial espontânea das pontuações corpo do balanço (para 50%) durante o primeiro mês após o acidente vascular cerebral.

[0178] Os animais foram testados para acinesia de mebro anterior no teste corpo balanço, comumente usados para a medição das funções neuromusculares. Alguns melhoria espontânea em função motora ao longo do tempo foi observada em todos os animais que foram submetidos a tMCAO. No entanto, todos os camundongos tratados com sulfato de dextrana exibiu uma melhoria estatisticamente significativa em comparação com o tratamento de controle com veículo, começando no dia 7 e com a duração de estudar terminação no dia 28, ver Fig. 13. Não foi encontrada diferença estatística entre os dois esquemas de dosagem 2M e 3M.

Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral

[0179] Avaliação: dia 29

[0180] A avaliação do fluxo sanguíneo cerebral no córtex e vaso constrição foi realizado usando o sistema de Doppler Laser Flow-R, na qual o fluxo sanguíneo intracraniano e do diâmetro dos vasos (constrição/dilatação) foi monitorizado. Este foi realizado em início dia 29 pós acidente vascular cerebral. procedimento Doppler foi realizado enquanto os animais estavam sob anestesia isoflurano.

[0181] Os animais também foram examinados para a restauração do fluxo sanguíneo cerebral no hemisfério danificado no dia 29. Estatisticamente melhoria significativa na taxa de perfusão sanguínea cerebral foi observada em todos os animais que foram submetidos a tMCAO e tratados com sulfato de dextrana (grupo 2 M e 3 M) em comparação com o grupo tratado com veículo de controle 1M. A razão de diâmetro dos vasos também aumentou em animais tratados com sulfato dextrana versus controle, ver as figuras. 14 e 15.

Coleta de Amostras e Sacrifício

[0182] No dia 30 após a MCAO, os camundongos foram anestesiados com cetamina/xilazina foram transcardialmente perfundidos com paraformaldeído tamponizado (PFA) a 4%. Os cérebros foram coletados fixos em 4% de PFA tamponada por imunocoloração e avaliação histológica.

[0183] Duas secções de amostras de cérebro foram colhidas em áreas de seis animais dos grupos 1M e 3M. Os capilares foram contados sob o microscópio, num total de três campos aleatórios de cada secção. A densidade foi expressa como o número médio de capilares por campo de visão. O tratamento com 15 mg de sulfato de dextrana/kg ao dia, aumenta o número de capilares 30 dias após acidente vascular cerebral, em comparação com o grupo de controle tratado com veículo.

[0184] Aumento do número de capilares SMA com diâmetro inferior a 30 μm foi observada em animais que foram submetidos a tMCAO, e tratados com sulfato de dextrana 15 mg/kg por dia, em comparação com grupo de controle tratado com veículo, como um resultado do efeito angiogénico, ver Fig . 16.

[0185] As Figs. 17A e 17B ilustram o efeito do tratamento sobre a densidade de capilares para um camundongo do grupo de controle de veículo (Fig. 17A) e grupo de sulfato de dextrana (15 mg/kg, diariamente) (Fig. 17B).

Sinais de mortalidade e clínicos

[0186] Dezoito camundongos morreram durante o estudo. Um camundongo morreu logo após reperfusão antes da dosagem e dezessete camundongos dentro de 10 horas após a dosagem (6 no grupo 1M, 6 no grupo 2M e 5 no grupo 3M). Nenhum sinais clínicos adversos não relacionados com o modelo foi observado em todos os grupos de animais.

[0187] O acidente vascular cerebral tMCAO modelo-camundongo é, tradicionalmente, um modelo aceito para avaliar a eficácia neuroprotetora e de reabilitação de tratamentos com drogas. Este modelo foi utilizado no presente estudo para avaliar a eficácia do tratamento com sulfato de dextrana a dois esquemas de dosagem. Os camundongos foram tratados com sulfato de dextrana durante 28 dias através de injeções subcutâneas, a partir de duas horas após o procedimento cirúrgico, quer a 30 mg/kg, três vezes por semana ou a uma dose diária de 15 mg/kg. Durante o estudo as funções neurológicas, motoras e somatossensorial foram monitorados em uma bateria de testes comportamentais.

[0188] Como esperado, observou-se alguma recuperação espontânea de funções neurológicas durante os 28 dias de seguimento após a indução acidente vascular cerebral. No entanto, as diferenças claras foram demonstradas entre os grupos tratados com sulfato de dextrana e o grupo de controle tratado com veículo. Não houve diferenças estatisticamente significativas foram observadas no entanto entre os dois esquemas de dosagem. Melhoria nas funções motoras, avaliada pelo Neuroscore, no teste de passos e teste de balanço do corpo, foi demonstrada em ambos os grupos tratados com o fármaco (Fig. 10, 11 e 13). funções sensorio-motoras também recuperados na sequência de tratamento de sulfato de dextrana (Fig. 12). Os efeitos benéficos foram observados a partir do primeiro ensaio no dia 7 do tratamento e continuou a melhorar até final do estudo no dia 28. Os efeitos observados não pode ser atribuída a diferenças na saúde dos camundongos gerais como todos os grupos ganharam peso na mesma taxa, sem diferenças significativas entre eles (Fig. 9). Além disso, não há diferenças observadas nos sinais clínicos gerais foram observadas. É provável que o efeito de tratamentos de sulfato de dextrana deve ser atribuída à sua atividade angiogénica. Esta conclusão foi apoiada por um aumento na perfusão do sangue cerebral e capilares SMA positivos densidade no hemisfério afetada. O sulfato de dextrana do tratamento também reduziu a resposta inflamatória em comparação com o controle tratado com veículo.

[0189] Em vista destes resultados pode-se concluir que o tratamento sulfato de dextrana claramente melhorada do motor e déficits somatossensoriais, bem como perfusão sanguínea cerebral e atividade angiogênica no modelo de acidente vascular cerebral de camundongos.

[0190] O sulfato de dextrana das formas de realização tenha sido assim demonstrado que induzem seletivamente a angiogénese em modelos de CLI (Exemplo 1) e acidente vascular cerebral (Exemplo 2). Os resultados experimentais indicam que mesmo um tratamento tardio (início dia 15 após a ligadura) é eficaz. As doses no intervalo de 3 a 30 mg/kg (S.C.) são eficazes e protocolos de administração de dose única, uma vez por semana e 3 vezes por semana são todos eficazes. Histologia documenta a formação de vasos funcionais recém fomados. O sulfato de dextrana das formas de realização, assim, proporciona um efeito seletivo em áreas isquemicas.

EXEMPLO 3 Avaliação de sulfato de dextrana em um modelo de enfarte do miocárdio

[0191] O presente estudo avaliou a eficácia do tratamento angiogênico sulfato de dextrana em um modelo de camundongo de enfarte do miocárdio.

[0192] O coração tem limitada capacidade de regeneração, por isso perda muscular de infarto agudo do miocárdio (MI) é tipicamente substituído por tecido cicatricial não-contrátil com vascularização limitada. Promover a angiogênese e aumento da perfusão tecidual é uma estratégia promissora para a reparação cardíaca após MI.

Materiais e métodos

[0193] O modelo de infarto do miocárdio em camundongos envolvia ligadura da artéria coronária esquerda permanentemente com um ponto intramural. A cirurgia causou a obstrução do fluxo de sangue e, posteriormente, ao dano isquêmico gravese e enfarte das paredes cardíacas.

[0194] No total, 150 camundongos SD fêmeas com um peso corporal médio de 178 g no início do estudo (Dia 0) foram obtidos a partir de Harlan Labocamundongories, Israel. Os animais foram alimentados ad libitum numa dieta comercial para roedores (Teklad Certified global 18% de proteína da dieta). Os animais tiveram livre acesso à água potável autoclavada e acidificada (pH entre 2,5 e 3,5), obtida a partir do abastecimento do município. Os animais foram alojados sob condições labocamundongoriais padrão. Faixa de temperaturas foi 20-24°C e intervalo RH foi 30-70% com 12 horas de luz e 12 horas de ciclo escuro.

[0195] O sulfato de dextrana com um peso molecular médio no intervalo de 5-7 kDa foi obtido a partir de pKa Chemicals A/S, Dinamarca. O sulfato de dextrana foi dissolvido em 0,9% de NaCl (salina) (Teva Pharmaceutical Industries Ltd.) a ser injetada em doses de 15 mg/kg ou 3 mg/kg.

[0196] No dia da cirurgia os animais foram anestesiados com uma combinação de 90 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. De modo a induzir MI, sob anestesia e analgesia, do peito de camundongo foi aberto por toracotomia esquerda, o pericárdio foi removido e a artéria coronária proximal esquerda foi permanentemente ocluída com um ponto intramural (Circulation 117, 1388-1396 (2008)). Duas horas após a cirurgia, cada animal em todos os grupos tratados foram injetados s.c. com sulfato de dextrana ou veículo de solução salina de acordo com a Tabela 11.Tabela 11 - Alocação de Grupo

[0197] No dia 36 após a indução MI, os camundongos foram sacrificados por inalação de CO2 e os corações foram colhidos e fixados em solução de formalina tamponada a 4%. parafina de rotina foi realizada utilizando procedimentos histológicos padronizados.

[0198] Para a finalidade de identificação do tamanho MI, foi utilizado tingimento de tricromo Masson. Nove corações de um grupo tratado (2M) e oito do grupo não tratado (1M) foram seccionados transversalmente em cinco secções, que foram embebidos em parafina. Cinco secções de parafina em 5 μM foram realizadas num micrótomo Lika. Todas as secções foram coradas acordo com o protocolo padrão tricrômico de Masson. As secções foram visualizados num sistema de computador, de imagens e o tamanho do enfarte foi marcado e calculados utilizando o programa ImageJ. tamanho do enfarte foi expressa como percentagem da área de enfarte (sem manchas) versus a área total do ventrículo esquerdo. Para cada animal, foi calculada cinco secções em série incluindo um contendo a ligadura foram analisados e o valor médio de todas as secções para cada coração. O marcador imunohistoquímico (actina do músculo liso - SMA) foi utilizado para avaliar a contagem de densidade vascular.

[0199] Contagem de densidade vascular foi realizado por 1mm quadrado, na borda da lesão do enfarte do miocárdio da área afetada. Fotos foram tiradas usando um microscópio Olympus BX43 usando a ampliação da objetiva X40. contagem de densidade vascular de vasos positivos SMA foi realizada utilizando o software Image Analysis - Imagem Pro Plus 5.1 pela Media Cybernetics.

Resultados

[0200] A FIG. 18 ilustra o tamanho do infarto 35 dias após a indução de MI. Todos os grupos de tratamento tiveram menor tamanho médio de enfarte quando comparado com o grupo de controle não tratado. Houve uma diferença significativa entre o grupo de tratamento 2M e o grupo controle 1M.

[0201] FIG. 19 compara coloração SMA 35 dias após a indução do MI para o grupo de tratamento 2M e grupo controle 1M. O sulfato de dextrana tratamento resultou numa densidade capilar SMA maior em comparação com controle de veículo.

[0202] As Figs. 20A-20C ilustram imagens de coloração SMA para a densidade vascular para dois camundongos no grupo de tratamento 2M (Figs. 20A e 20B) e um camundongo do grupo de controle 1 M (Fig. 20C). O sulfato de dextrana no tratamento resultou numa maior densidade vascular SMA como comparado com o controle de veículo.

[0203] O sulfato de dextrana diminuiu significativamente o volume de enfarte no grupo tratado com 2M após enfarte do miocárdio em camundongos, em comparação com o grupo tratado com veículo de controle. O mesmo grupo tratado com sulfato de dextrana revelou uma tendência de aumento da densidade de capilares na região de enfarte do coração em comparação com o grupo tratado com veículo de controle. sulfato de dextrana promove, assim, vasos sanguíneos do miocárdio e reparar e melhorar a angiogênese na região de enfarte após enfarte do miocárdio. Isso pode melhorar a remodelamento ventricular esquerdo longo prazo e melhorar a recuperação da função ventricular esquerda.

EXEMPLO 4 Avaliação da eficácia de angiogênese em camundongos modelo de isquemia em membro posterior

[0204] No estudo descrito acima no Exemplo 1, a eficácia angiogénica do sulfato de dextrana foi provada num modelo de isquemia grave estável em camundongos. No presente estudo um modelo de isquemia grave estável (Toakai J Exp Clin Med 31(3), 128-13 (2006)) foi utilizado para avaliar a segurança e eficácia de sulfato de dextrana sobre a angiogênese e o resultado funcional.

Materiais

[0205] Soluções de sulfato de dextrana foram preparadas um dia antes do início do estudo. Como veículo, foi utilizado NaCl a 0,9% (solução salina). O volume relevante de NaCl foi adicionado ao composto pesado para obter a concentração de 6 e 60 mg/ml, o que corresponde a administração de 0,5 mL/kg para se obter a dose de 3 e 30 mg/kg, respectivamente. O sulfato de dextrana (peso molecular médio no intervalo de 5-7 kDa foi obtido a partir de pKa Chemicals A/S, Dinamarca) foi dissolvido por agitação em vórtex ou simplesmente rodando o tubo de algumas vezes. A solução foi armazenada a 4o C durante a noite para que os agregados se estabilizarem. No dia seguinte, o tubo foi agitado em vórtice e a solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm para obter uma solução estéril. A preparação foi considerado confiável por até 15 dias quando armazenado a 4oC. As soluções foram preparadas no dia 7 e utilizado nos Dias 8-21; uma segunda preparação foi efetuada no dia 21, e utilizado nos Dias 22-28.

[0206] 90 feito taxa SD com um peso corporal médio de 277 g no início do estudo (Dia 0) foram obtidos a partir de Harlan Labocamundongories, Israel. Os animais foram alimentados ad libitum numa dieta comercial para roedores (Teklad Certified global 18% de proteína da dieta). Os animais tiveram livre acesso à água potável acidificada (pH entre 2,5 e 3,5).

[0207] Os animais foram tratados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde (NIH) e pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados de Laboratório de Animais (AAALAC). Os animais foram alojados em gaiolas de polietileno (3/gaiola) medindo 35 x 30 x 15 cm, com aço inoxidável grelha superior facilitando ração peletizada e água potável em garrafa de plástico; roupa de cama: esterilizados a vapor de arroz limpo casca (Harlan, Sani-chip cat #: 7090A) foram usados e material de cama foi alterado, juntamente com a gaiola pelo menos duas vezes por semana. Os animais foram alimentados ad libitum numa dieta de roedor comercial (Teklad Certified Global 18% Dieta da Proteína cat#: 106S8216). Os animais tiveram livre acesso à água potável autoclavada e acidificada (pH entre 2,5 e 3,5), obtida a partir do abastecimento do município. Os animais foram alojados em condições labocamundongoriais padrão, com ar condicionado e filtrado (HEPA F6/6) com entrada de ar fresco adequado ( mínimo 15 alteraçõesde ar/hora). Os animais foram mantidos em um ambiente de clima controlado. Faixa de temperaturas foi° 20-24°C e intervalo RH foi 30-70% com 12 horas de luz e 12 horas de ciclo escuro.

[0208] Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia e analgesia (1,5 a 3,0% de isoflurano, de 1,5% N2O e 0,5% de O2). Uma incisão de 0,51,0 cm foi feita uma na pele na região inguinal. A artéria e veia femoral foram ligados duas vezes com fio de seda 4-0 e seccionado entre as ligaduras. A ferida foi fechada com fio de seda 3-0 e os camundongos foram deixados para recuperar.

[0209] No dia 8, semana 2 pós-cirurgia, em cada animal em grupos 1M, 2M e 3M foram injetados solução de sulfato de dextrana s.c. três vezes por semana. Os animais do grupo 4M e 5M foram injetados s.c. uma vez no Dia 8, ver Tabela 12.Tabela 12 - Alocação de Grupo

Medição de fluxo sanguíneo

[0210] Fluxos sanguíneos nas pernas de ambos os lados foram medidos com um laser Doppler sem contato antes da cirurgia no dia -1 e nos dias: 1, 7, 14, 21 e 28 pós-operação. Medições do fluxo sanguíneo foi expressa como a relação entre o fluxo no membro isquêmico para o membro normal.

[0211] Todos os grupos de animais tratados exibiram aumento marcado do fluxo de sangue no membro operado comparar com o controle tratado com veículo entre o Dia 1 e Dia 28, ver Tabela 13 e a Fig. 21. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre todos os grupos tratados com sulfato de dextrana em comparação com o controle tratado com veículo.Tabela 13 - alteração no fluxo arterial media

[0212] FIG. 21 mostra a relação entre o fluxo de sangue entre a lesão HLI em relação a perna não-lesada medido por um Doppler laser sem contato. Os diferentes grupos foram comparados usando ANOVA de duas vias para medidas repetidas, seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni. Comparação de dextrana sulfato de grupo tratado 2M, 3M, 4M e 5M para controlar grupo 1M revelou diferenças estatisticamente significativas desde o dia 14 até ao dia 28 (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0.001).

Gravidade isquêmica

[0213] O membro isquêmico foi macroscopicamente avaliado semanalmente a partir do dia 7 até ao dia 28, usando escalas morfológicas graduais para a área necrótica, consulte a Tabela 4. Em todos os grupos de animais tratados com sulfato de dextrana e do veículo não foi encontrada necrose dedo do pé ou a amputação do pé.

Avaliação in vivo da função dos membros e dano isquêmico

[0214] A avaliação semi-quantitativa do uso prejudicado do membro isquêmico foi realizada uma vez por semana após a cirurgia, utilizando a seguinte escala, ver Tabela 7. Pontuação foi realizada por pessoal cego para o tratamento.

[0215] Todos os grupos de animais tratados com sulfato de dextrana tinha melhoria funcional do membro em comparação com o controle tratado com veículo entre o Dia 1 e Dia 28, ver Tabela 14 e a Fig. 22.Tabela 14 - Incidência de camundongos com escores de função de membro 0-3 no dia 28

[0216] Os diferentes grupos foram comparados usando ANOVA de duas vias para medidas repetidas, seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni. Comparação de dextrana sulfato de grupo tratado 2M, 3M, 4M e 5M para controlar grupo 1M revelou diferenças estatisticamente significativas desde o dia 14 até ao dia 28 (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0.001).

Imuno-histoquímica e análise da densidade de capilares

[0217] Quatro seções de amostras do músculo foram colhidas em áreas de seis animais dos grupos 1M, 2M, 3M, 4M, 5M e coradas para os vasos sanguíneos usando anticorpos contra SMA e Fator 8. A área de vasos sanguíneos foi avaliada utilizando análise de imagem. A densidade foi expressa como o número médio de capilares por campo de visão. Total de vasos representam todos os vasos sanguíneos na área medida. O número de SMA e Fator 8 capilares positivos no membro isquêmico direito foi maior em todos os grupos tratados de sulfato de dextrana 2M-5M em comparação com o grupo controle 1M no dia 28 do estudo, ver Fig. 23. SMA e coloração positiva fator 8 são consideradas como uma indicação para a formação de pequenos capilares e, assim, os resultados obtidos suportam a melhoria do fluxo sanguíneo observada nos grupos de animais tratados com sulfato de dextrana. A análise estatística realizada utilizando ANOVA de duas vias seguido de comparações múltiplas de Bonferroni, */** indicam p <0,05/0,01.

Análise de angiografia

[0218] O número de cruzamentos entre vasos cheios de contraste foi determinada por análise de imagem de 28 dias após a indução de isquemia no membro traseiro. A angiografia revelou significativamente grandes números de colaterais nas membro afetado nos camundongos tratados com sulfato de dextrana de comparação com o grupo controle tratado com veículo (p <0,01 e p <0,001 de acordo com a ANOVA de uma via seguida pelo teste Bonferroni post-hoc), ver Figs. 24 e 25A-25D.

[0219] A angiogênese comprometida é uma das características das doenças isquêmicas. O alvo mais estabelecido para a angiogênese terapêutica foi o VEGF e os seus receptores. No entanto, ensaios clínicos para aliviar a isquemia foram decepcionantes, indicando a necessidade de novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças isquêmicas.

[0220] No presente estudo a melhora o fluxo de sangue no modelo de isquemia de membros posteriores de camundongos foi examinada a fim de avaliar a eficácia de sulfato de dextrana em duas doses diferentes e os regimes de tratamento. administração de sulfato de dextrana em doses de 30 e 3 mg/kg sc três vezes por semana ou em dose única no Dia 8 restaurado significativamente perfusão sanguínea e escore funcional melhorada membro em comparação com o controle do veículo tratada desde o dia 14 após a cirurgia. Ambas as doses e regimes de administração foram eficazes. Nenhuma amputação espontânea ou necrose de dedo do pé ocorreu em nenhum dos grupos de animais tratados e de controle. O tratamento com sulfato de dextrana não causou quaisquer efeitos adversos nos animais tratados. A pontuação angiografia (medida do alargamento da artéria colateral) foi significativamente maior em todos os grupos de animais tratados com sulfato de dextrana em comparação com os grupos tratados com veículo, sem diferença estatística entre os vários grupos tratados. SMA e a densidade de capilares fator 8 também aumentaram após o tratamento de sulfato de dextrana. Coletivamente, os dados deste estudo confirmaram a eficácia terapêutica do sulfato de dextrana para o tratamento da doença arterial periférica oclusiva no modelo de camundongo.

[0221] Em conclusão, as modalidades descritas acima são para ser entendidas como exemplos ilustrativos da presente invenção. Será entendido por aqueles versados na técnica que várias modificações, combinações e mudanças podem ser feitas às modalidades sem nos afastarmos do âmbito da presente invenção. Em particular, as soluções parte diferente nas diferentes formas de realização podem ser combinadas noutras configurações, sempre que seja tecnicamente possível. O escopo da presente invenção é, no entanto, definido pelas reivindicações anexas.

Claims (17)

1. Uso de sulfato de dextrana, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, tendo um peso molecular médio abaixo de 10.000 Da e um teor de enxofre médio em um intervalo de 15 a 20%, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para induzir a angiogênese em um tecido ou órgão isquêmico em um sujeito.

2. Uso de sulfato de dextrana, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, tendo um peso molecular médio abaixo de 10.000 Da e um teor de enxofre médio em um intervalo de 15 a 20%, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para aumentar o fluxo sanguíneo em um sujeito que sofre de isquemia.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no aumento do fluxo sanguíneo em um tecido ou órgão isquêmico do referido sujeito.

4. Uso de sulfato de dextrana, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, tendo um peso molecular médio abaixo de 10.000 Da e um teor de enxofre médio em um intervalo de 15 a 20%, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para vascularizar o tecido isquêmico em um sujeito.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido peso molecular médio está dentro de um intervalo de 2.000 e 10.000 Da.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido peso molecular médio está dentro de um intervalo de 3.000 e 10.000 Da.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido peso molecular médio está dentro de um intervalo de 3.500 e 9.500 Da.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido peso molecular médio está dentro de um intervalo de 4.500 e 7.500 Da.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido peso molecular médio está dentro de um intervalo de 4.500 e 5.500 Da.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de que o teor de enxofre médio é de 17%.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que o referido sulfato de dextrana, ou o referido derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem um peso molecular numérico médio (Mn), conforme medido pela espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), dentro de um intervalo de 1850 e 2000 Da.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido sulfato de dextrana, ou o referido derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem 5,1 unidades de glicose em média e um número médio de sulfato por unidade de glicose de 2,6 a 2,7.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido sulfato de dextrana, ou o referido derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, é formulado como uma solução de injeção aquosa.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido sujeito é um sujeito humano que sofre de uma doença, distúrbio ou condição médica que causa isquemia no corpo do referido sujeito humano.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condição médica é selecionado de um grupo consistindo em cicatrização de feridas, isquemia periférica, doença arterial periférica, isquemia dos membros, perna inquieta, síndrome de Raynaud, doença falciforme ou tromboangeíte obliterante; isquemia coronariana, insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio ou uma doença arterial coronariana; lesão cerebral isquêmica ou por hipóxia neonatal, encefalopatia por asfixia, paralisia cerebral; isquemia no sistema nervoso central, lesão cerebral traumática, arterite temporal, hipóxia causada por esclerose múltipla, acidente vascular cerebral, esclerose amiotrófica lateral; doenças distróficas musculares; isquemia causada por lesões trombóticas, hemorrágicas ou traumáticas.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo é um sal de sulfato de dextrana.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido sal de sulfato de dextrana é um sal de sódio de sulfato de dextrana.

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