DE60037190T2

DE60037190T2 - Medikamentzusammensetzung die lecithin-modifizierte superoxiddismutase enthält

Info

Publication number: DE60037190T2
Application number: DE60037190T
Authority: DE
Inventors: Yoshihito Higashiyamato-shi IKEDA; Hiromi Musashimurayama-shi SATOU
Original assignee: LTT Bio Pharma Co Ltd
Current assignee: LTT Bio Pharma Co Ltd
Priority date: 1999-06-24
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2020-06-24
Also published as: DE60037190D1; EP1188445B1; WO2001000230A1; WO2001000230A8; EP1188445A1; EP1188445A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung, die eine lecithin-modifizierte Superoxid-Dismutase (nachfolgend manchmal einfach als PC-SOD bezeichnet) und Saccharose als Medikamententräger enthält, und auf eine lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung, die aus ihnen zusammengesetzt ist, zur Verwendung bei der Behandlung von motorischen Neuronenerkrankungen oder ulcerativen gastrointestinalen Verletzungen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen der besagten lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung unter Verwendung von Saccharose als effektivem Bestandteil.
Stand der Technik
Der Stand der Technik, der der vorliegenden Erfindung am nächsten ist, wird beschrieben.

(a) In der vorliegenden Erfindung verwendbares PC-SOD und ein dieses enthaltendes Medikament als aktiver Bestandteil werden in der Japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 9-117279 beschrieben.
(b) Eine biologische aktive Proteinzusammensetzung für orale und topische Verabreichung, die ein lecithin-modifiziertes biologisch aktives Protein enthält, ist in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 3-170438 beschrieben. Superoxid-Dismutase (die nachfolgend manchmal einfach als SOD bezeichnet wird) wird als ein Beispiel des biologisch aktiven Proteins beschrieben und Zucker wird beispielhaft als Additiv angegeben.

Ikeda K., et al. (Neuromuscular disorders: NMD. Englang SEP 1995, Band 5, Nr. 5, Seiten 383 bis 390) offenbaren eine lezithinierte Superoxid-Dismutase (PC-SOD) vom Cu/Zn-Typ. Die vorgelegten experimentellen Ergebnisse zeigen die Möglichkeit auf, dass PC-SOD therapeutisches Potential bei menschlicher motoneuronaler Erkrankung hat.
US-A-5 762 929 bezieht sich auf ein neuartiges Behandlungsverfahren für eine motoneuronale Erkrankung durch Verabreichung eines therapeutischen Agens, das mit Lezithin über chemische Quervernetzung konjugierte Superoxid-Dismutase umfasst. Sie offenbart die Verwendung von Mannit als Medikamententräger.
XP-002278397 (Datenbank WPI-Abschnitt, 1997) ist auf ein Behandlungsmittel für Niereninsuffizienz gerichtet, das eine lecithin-modifizierte SOD umfasst.
Eine Medikamentenzusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Mannit und eine lecithin-modifizierte Superoxid-Dismutase enthält, ist von Hori Yusuke et al. (Japanese Journal of Pharmacology, Band 74, Nr. 1, 1997, Seiten 99–103) beschrieben worden.
JP-A-9117279 und JP-A-6054681 beziehen sich auf eine lecithinierte Superoxid-Dismutase. Das darin beschriebene Medikament umfasst die lecithinierte Superoxid-Dismutase als aktiven Bestandteil. PC-SOD wird durch Binden von Lysolecithin durch chemische Quervernetzung an die Superoxid-Dismutase (SOD) erhalten.
Jedoch ist bei diesem Stand der Technik keinerlei spezifische Kombination einer Medikamentenzusammensetzung, die PC-SOD und Saccharose enthält, beschrieben. Zusätzlich gab es keine Lösungen für Probleme, die beinhalten: eine Reduktion der Aktivität von PC-SOD aufgrund der langfristigen Lagerung; die Eigenschaften bei Lyophilisierung; und das Aussehen von Spitzen von Analoga bei Analyse mittels Säulen-Chromatographie.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Medikamentenzusammensetzung, die PC-SOD enthält, mit geringer Reduktion der PC-SOD-Aktivität (das heißt höherer Stabilität) bei Langzeitlagerung; guter Eigenschaft bei Lyophilisierung; und kontrolliertem Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulen-Chromatographie.
Die vorliegenden Erfinder haben sorgfältig eine Medikamentenzusammensetzung untersucht, die PC-SOD als ein aktives Ingredienz enthält, um die oben beschriebenen Problem zu lösen und haben nachfolgenden gefunden, dass: Saccharose als Medikamententräger eine Reduktion der PC-SOD-Aktivität aufgrund von Langzeitlagerung hemmt (Stabilität erhält); gute Eigenschaften bei Lyophilisierung bewahrt; eine Wirkung der Kontrolle des Auftretens von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulen-Chromatographie aufweist und dass dies es ermöglicht, eine Medikamentenzusammensetzung bereitzustellen, welche die obigen Probleme lösen kann, was zur Vollendung der vorliegenden Erfindung führt.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt eine lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung (nachfolgend als Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung bezeichnet) bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie PC-SOD enthält, das durch die nachfolgende allgemeine Formel (I) repräsentiert ist, und Saccharose als einen Medikamententräger: SOD' (Q – B)_m (I)dadurch gekennzeichnet, dass SOD' ein Rest von Superoxid-Dismutase ist; Q eine chemische Quervernetzung ist; B ein Rest ohne ein Wasserstoffatom einer Hydroxylgruppe von Lysolecithin mit der Hydroxylgruppe an der 2-Position von Glyzerin ist und die Formel (II): O-CH(CH₂OR)[CH₂OP(O)CO^–(OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃] (II)aufweist, wobei R ein Rest von Fettsäure ist; m eine Durchschnittsanzahl von Bindungen von Lysolecithin mit einem Molekül von Superoxid-Dismutase ist, welches eine positive Zahl von 1 oder größer ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung für die Behandlung von motorisch-neuronalen Erkrankungen oder ulcerativen gastrointestinalen Verletzungen bereit. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von motorisch-neuronalen Erkranken oder ulcerativen gastrointestinalen Verletzungen.
Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise die folgenden Eigenschaften:

(a) Eigenschaft: wenn Injektionswasser (destilliertes Wasser zur Injektion) zur lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung zugefügt wird, wird sie gelöst und es werden keine unlöslichen Fremdsubstanzen beobachtet;
(b) Stabilität: wenn die Superoxid-Dismutase-Aktivität pro Einheitsgewicht unmittelbar nach Lyophilisieren dieser Medikamentenzusammensetzung als 100 eingestellt wird, liegen die relativen Werte der Aktivität zu dem Zeitpunkt, nachdem die lyophilisierte Zusammensetzung bei 8°C für 12 Monate, 25°C für 12 Monate oder 40°C für 6 Monate gelagert worden ist, alle bei 97% oder mehr;
(c) Spitzen von Analoga in der Gelfiltrationschromatografie: wenn die lyophilisierte Zusammensetzung wieder gelöst wird, einer Gelfiltrationschromatografie unterworfen wird und die Absorption der Eluate bei 220 nm gemessen wird, wird keine maßgebliche Differenz zwischen der Spitzenform von lecithin-modifizierter Superoxid-Dismutase auf dem Detektionsdiagramm der Absorption und der Spitzenform der lecithin-modifizierten Superoxid-Dismutase vor Lyophilisierung beobachtet; und
(d) Spitzen von Analoga durch Phasenumkehrchromatografie: wenn die lyophilisierte Zusammensetzung zu Zeitpunkten wieder gelöst wurde, nachdem bei es bei 8°C für 12 Monate, 25°C für 12 Monate oder 40°C für 6 Monate gelagert worden ist und einer Umkehrphasenchromatografie unterworfen wird und die Absorption der Eluate bei 220 nm und 270 nm gemessen wird, unterscheidet sich jeglicher Betrag detektierter Analoga nicht maßgeblich von denen unmittelbar nach Lyophilisierung.

Der Ausdruck "Auflösung" in dieser Spezifikation bedeutet, dass ein Solut (lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung) und ein Lösungsmittel (Wasser zur Injektion) gemischt werden, um eine makroskopisch klare Lösung zu bilden. Hinsichtlich dem, ob "Auflösung" auftritt oder nicht, wird es bevorzugt, zu beurteilen, ob das Solut innerhalb von 10 Sekunden durch Zugeben des Lösungsmittels (Wasser zur Injektion) zum Solut bei Raumtemperatur (1°C bis 30°C) und leichtes Schütteln gelöst werden kann.
Weiterhin behält die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorzugsweise alle in den oben beschriebenen (a) bis (d) beschriebenen Charakteristika, selbst zu irgendwelchen Zeitpunkten, nachdem die lyophilisierte Substanz bei 8°C für 36 Monate, 25°C für 36 Monate oder 40°C für 6 Monate gelagert worden ist.
Zusätzlich ist ein Agens enthalten, das Saccharose als einen aktiven Bestandteil hat, um eine Reduktion der PC-SOD-Aktivität zu inhibieren (nachfolgend manchmal als Inhibitor der vorliegenden Erfindung bezeichnet), indem erreicht wird, dass sie mit PC-SOD, die durch die obige allgemeine Formel (I) repräsentiert ist, koexistiert, oder um das Auftreten von Spitzen von Analoga zu kontrollieren, wenn die PC-SOD durch Säulenchromatografie analysiert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Minderung der PC-SOD-Aktivität inhibiert, indem Saccharose dazu gebracht wird, mit durch die allgemeine Formel (I) repräsentierter PC-SOD zu koexistieren, oder es wird das Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse der PC-SOD durch Säulenchromatografie gehemmt.
Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist als Medikament nützlich, da die Minderung der PC-SOD-Aktivität bei Langzeitlagerung (Stabilität ist größer) durch eine Wirkung von Saccharose als Medikamententräger in der Zusammensetzung kleiner wird, die Eigenschaften bei Lyophilisierung gut sind und das Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulenchromatografie unter Kontrolle ist.
Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird für Krankheiten verwendet, die durch überschüssigen aktiven Sauerstoff verursacht werden, bei der eine Reduktion der PC-SOD-Aktivität bei Langzeitlagerung kleiner ist (Stabilität ist größer), die Eigenschaften bei Lyophilisierung gut sind und das Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulenchromatografie kleiner sind.
Zusätzlich ist der vorliegende erfinderische Inhibitor nützlich bei der Präparation der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, da er eine Reduktion der PC-SOD-Aktivität bei Langzeitlagerung hemmt (Stabilität beibehält), die Eigenschaften bei Lyophilisierung gut erhält und eine Wirkung der Kontrolle des Auftretens von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulenchromatografie aufweist.
Bester Modus zum Ausführen der Erfindung.
Die Ausführungsform wird unten stehend beschrieben.
<1> Die vorliegende Erfinderische Medikamentenzusammensetzung
(1) Für die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendete PC-SOD
Der Ausdruck "Lecithin" in der vorliegenden Beschreibung bezeichnet normales Lecithin, was Phosphatidylcholin bedeutet, und "Lysolecithin" bezeichnet eine Verbindung, in der ein Molekül Fettsäure, gebunden an der 2-Position von Glycerin in Lecithin, entfernt wird und eine Hydroxylgruppe an dem Kohlenstoffatom an der 2-Position gebunden ist.
Die in der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltene PC-SOD kann üblicherweise durch Binden eines oder mehrerer Lecithinderivate, bei denen ein chemisches Quervernetzungsmittel an der Hydroxylgruppe an der 2-Position von Lysolecithin gebunden ist, an SOD erhalten werden. Die PC-SOD wird durch die folgende Formel (I) repräsentiert: SOD' (Q – B)_m (I)
Bei der oben beschriebenen allgemeinen Formel (I) ist SOD' ein Rest von Superoxid-Dismutase.
Soweit SOD' in der obigen allgemeinen Formel (I) die essentielle Funktion des Zersetzens von aktivem Sauerstoff O₂ ^– in vivo ausführen kann, sind Herkunft und dergleichen nicht besonders beschränkt und aus verschiedenen Tieren und Pflanzen oder Mikroorganismen herrührende SOD-Reste könnte breit verwendet werden. Jedoch wird unter Berücksichtigung, dass es bevorzugt wird, die Antigenizität in einem lebenden Organismus zu soweit als möglich vermindern, bevorzugt, als SOD zur Verwendung von Medikamenten eine geeignet passende SOD gemäß den Tiertypen auszuwählen, denen die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verabreicht wird. Wenn beispielsweise Menschen das Ziel sind, die am ehesten die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung brauchen mögen, wird es bevorzugt, vom Menschen abgeleitete SOD zu verwenden, um so die Antigenizität als SOD in einem menschlichen lebenden Körper soweit als möglich zu vermindern. Von ihnen wird menschlich abgeleitete Cu/Zn-SOD (menschliche abgeleitete SOD, die Kupfer und Zink im Aktivitätszentrum enthält; nachfolgend manchmal als menschliche Cu/Zn-SOD abgekürzt) besonders bevorzugt, weil sie eine große Menge an Expression in den Zellen gibt, eine Produktionstechnik durch ein gentechnisches Verfahren etabiliert ist und großtechnische Präparation möglich ist.
Diese menschliche Cu/Zn-SOD beinhaltet: natürliche menschliche Cu/Zn-SOD, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wordenist; menschliche Cu/Zn-SOD, die durch ein gentechnisches Verfahren hergestellt worden ist; rekombinante menschliche Cu/Zn-SOD mit dem im Wesentlichen derselben Aminsäuresequenz wie natürliche menschliche Cu/Zn-SOD, und SODs, bei denen teilweise Aminosäuren in der Aminosäuresequenz dieser menschlichen Cu/Zn-SODs modifiziert oder verändert wurden und jegliche menschliche Cu/Zn-SOD kann verwendet werden.
Als Referenz ist die Aminosäuresequenz dieser natürlichen menschlichen Cu/Zn-SOD in Sequenz Nr. 1 gezeigt. Zusätzlich ist die tatsächliche menschliche Cu/Zn-SOD als ein Protein-Dimer aufgebaut, das diese Aminosäuresequenz aufweist.
Während, wie in der Aminosäuresequenz dieses Proteins gezeigt, die Aminosäure an der 111-Position in natürlicher menschlicher Cu/Zn-SOD Cystein ist, sind auch menschliche Cu/Zn-SOD berichtet worden, bei dem die Konversion zu Serin an der 111-Position durch ein Protein-technisches Verfahren durchgeführt worden ist, z. B. eine ortsgerichtete Mutagenese ( Japanische Patentveröffentlichung Nr. 62-130684 ) und menschliche Cu/Zn-SOD, bei der Cystein an der 111-Position chemisch modifiziert wurde ( Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-199895 ) und die PC-SOD der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung dieser menschlichen Cu/Zn-SOD als Rohmaterial erhalten werden. Aus diesem menschlichen Cu/Zn-SODs wird die PC- SOD der vorliegenden Erfindung vorzugsweise unter Verwendung der menschlichen Cu/Zn-SOD als ein Rohmaterial erhalten, bei der Cystein an der 111-Position chemisch modifiziert wurde, z. B. das Cystein zu S-(2-Hydroxyethylthiocystein) modifiziert worden war, das von gleichförmiger elektrischer Ladung und Molekulargewicht ist, stabil hinsichtlich der SOD-Aktivität.
Somit werden in der vorliegenden Erfindung sowohl solche, in denen partielle Aminosäuren in der menschlichen Cu/Zn-SOD durch eine ortsgerichtete Mutagenese etc. substituiert sind und solche, die durch chemisches Modifizieren von partiellen Aminosäuren in der menschlichen Cu/Zn-SOD erhalten werden, einfach als menschliche Cu/Zn-SOD bezeichnet.
Zusätzlich wird ein in der oben beschriebenen Formel (I) als B bezeichneter "Rest ohne ein Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe von Lysolecithin mit einer Hydroxylgruppe an der 2-Position von Glycerin" durch die nachfolgende Formel (II) repräsentiert: -O-CH(CH₂OR)[CH₂OP(O)(O^–)(OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃)] (II)(wobei R ein Rest von Fettsäure (Acylgruppe) ist)
R ist vorzugsweise ein Rest von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren von 10–28 Kohlenstoffen, bevorzugterweise eine Myristylgruppe, eine Palmitylgruppe, eine Stearylgruppe, eine Icosanylgruppe, eine eine Docosanylgruppe und andere Reste von gesättigten Fettsäuren von 14–22 Kohlenstoffen, am bevorzugtesten eine Palmitylgruppe, die ein Rest von saturierter Fettsäure von 16 Kohlenstoffen ist.
In der oben beschriebenen Formel (I) repräsentiert Q eine chemische Quervernetzung. Die chemische Quervernetzung ist nicht besonders beschränkt, soweit sie chemisch gebunden (kovalente Bindung) werden kann, um SOD mit Lecithin zu quervernetzen. Für die chemische Quervernetzung sei vorzugsweise der Rest C(O)-(CH₂)_n-C(O)beispielhaft angeführt. Dieser Rest ist vorzugsweise ein Rest ohne Hydroxylgruppen an beiden Enden der geradkettigen, durch die Formel HO-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-OH repräsentierten Dicarbonsäure oder ein Rest ohne Teile, die Hydroxylgruppen an beiden Enden des Dicarbonsäureanhydrids, des Dicarbonsäureester, des Dicarbonsäurehalids oder anderer reaktiver Derivate und dergleichen der Dicarbonsäure entsprechen. Wenn Q in der obigen beschriebenen Formel (I) ein Rest der oben beschriebenen geradkettigen Dicarbonsäure ist, sind ein Ende von Q und B durch eine Esterbindung verknüpft. In einem solchen Fall wird das andere Ende von Q angenommen als direkt durch eine Amidbindung etc. mit einer Aminogruppe von SOD gebunden. In solch einem Fall zeigt SOD einen Rest ohne ein Wasserstoffatom einer in der SOD-Bindung involvierten Aminogruppe. In der oben beschriebenen chemischen Quervernetzung ist n in der Gruppe -(CH₂)_n- eine Ganzzahl von 2 oder größer, vorzugsweise eine Ganzzahl von 2 bis 10, am bevorzugtesten 3.
m in der oben beschriebenen Formel (I) repräsentiert die Durchschnittsanzahl von Bindungen von Lysolecithin an ein Molekül SOD. m ist eine oder mehrere positive Zahlen, vorzugsweise 1–12 Positivzahlen, am bevorzugtesten 4.
Bei der Herstellung von PC-SOD kann die Kupplung eines Lecithinderivats an SOD gemäß bekanntem Verfahren durchgeführt werden, z. B. dem in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 6-54681 beschriebenen Verfahren. Der Herstellprozess dieser PC-SOD wird in Beispielen beschrieben.
Es wird bevorzugt, dass die in der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendete PC-SOD bis zu dem Ausmaß gereinigt ist, bei dem sie als Medikament geeignet ist und im Wesentlichen keine Substanzen enthält, die nicht als Medikament gestattet sind.
Beispielsweise wird es bevorzugt, eine gereinigte PC-SOD mit 2.500 U/mg (PC-SOD) oder mehr spezifischer Aktivität zu verwenden, eine gereinigte mit 3.500 U/mg (PC-SOD) oder mehr spezifischer Aktivität wird dabei mehr bevorzugt. Hierbei bedeutet 1U (Einheit) in der vorliegenden Beschreibung eine enzymatische Menge an PC-SOD, die 50% der Reduktionsrate von NBT (Tetrazoliumblau) hemmt, gemessen durch das Verfahren gemäß J.Biol.Chem., Band 244, Nr. 22, 6049–6055 (1969), wobei NBT unter der Bedingung eines pH von 7,8 bei 30°C verwendet wird.
(2) In der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendeter Medikamententräger
Die Medikamentenzusammensetzung erfüllt alle in den vorstehenden (a) bis (d) beschriebenen Eigenschaften mit Saccharose in Bezug auf Löslichkeit und Stabilität. Es wird bevorzugt, das in der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendete Saccharose bis zu dem Ausmaß gereinigt wird, dass sie als Medikament geeignet ist, und im Wesentlichen keine Substanzen enthält, die nicht als ein Medikament gestattet sind, und mit aktivierter Holzkohle behandelt wird. Die Behandlung mit aktivierter Holzkohle kann durch Auflösen von Saccharose in Wasser, gefolgt von in-Kontakt-Bringen dieser wässrigen Lösung mit aktivierter Holzkohle durchgeführt werden. Solch eine aktivierte Holzkohle-Behandlung kann beispielsweise eine Endotoxin-Konzentration in der Saccharose vermindern, kann weiterhin das Auftreten von Spitzen von Analoga hemmen und kann die Stabilität verbessern.
Die Endotoxin-Konzentration in den in der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendeten Saccharose-Träger ist vorzugsweise 0,25 EU/mg oder niedriger, bevorzugter am detektierbaren Limit (0,006 EU/ml) oder darunter.
Wenn die Endotoxin-Konzentration im Saccharose-Medikamententräger unter Verwendung des bekannten Messverfahrens für Endotoxin gemessen werden kann, wird die Limulus-Testmethode unter Verwendung von Limulina/Amöbizid/Lysat-Komponenten bevorzugt. Als das in dem Limulus-Testverfahren verwendete Limulus-Reagenz wird vorzugsweise das endotoxin-spezifische Limulus-Reagenz verwendet. Als Limulus-Reagenz können beispielsweise die folgenden, kommerziell erhältlichen Limulus-Reagenzien verwendet werden: Toxicolor System LS-6, LS-20, LS-50M, Endospecy ES-6 und Endospecy ES-200 (Seikagaku Corporation).
(3) Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst PC-SOD und Saccharose als Medikamententräger. Die Zusammensetzung wird durch Formulieren der in (I) beschriebenen PC-SOD und Saccharose als ein Medikamententräger und Lyophilisieren der Zusammensetzung, die in (2) beschrieben ist, erhalten. Somit kann die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, in der die Reduktion der PC-SOD-Aktivität aufgrund von Langzeitlagerung kleiner ist (Stabilität ist größer); die Eigenschaften bei Lyophilisierung ausgezeichnet sind; und das Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulenchromatografie kontrolliert sind, erhalten werden.
Ein Mischverhältnis der PC-SOD zur Saccharose als Medikamententräger in der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in geeigneter Weise durch einen Fachmann gemäß der Dosis-Menge, der Form und dergleichen der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung bestimmt werden und das Gewichtsverhältnis von "PC-SOD/Saccharose als Medikamententräger" ist vorzugsweise etwa 0,1/100-80/100, bevorzugtererweise 0,4/100-60/100, aber ist darauf nicht besonders beschränkt.
Der Fettsäuregehalt in der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung beträgt vorzugsweise 0,13–0,15 μmol/mg Protein. Der Fettsäuregehalt kann unter Verwendung von beispielsweise einem von YMC Co., Ltd. hergestellten "Kit zur Analysierung von langkettigen oder kurzkettigen Fettsäuren" gemessen werden.
Soweit die enzymatische Aktivität von PC-SOD und der Effekt der vorliegenden Erfindung nicht betroffen sind, können üblicherweise für Medikamente verwendete Komponenten sowie etwa andere aktive Ingredienzen von Medikamenten, ein konventioneller Exzipient, ein Bindemittel, ein Schmiermittel, ein Farbstoff, ein Desintegrator, ein Pufferagens, ein isotonisches Agens, ein Konservierungsmittel und ein Linderungsmittel der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung zugesetzt werden. Als solche Komponenten können Substanzen, die physiologisch akzeptabel sind, eine Reinheit zu dem Ausmaß haben, dass sie als Medikament verwendbar sind und im Wesentlichen keine Substanzen enthalten, die nicht als Medikament gestattet sind, verwendet werden.
Die Herstellung der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von PC-SOD und Saccharose als einem Medikamententräger und Lyophilisieren der Zusammensetzung mit pharmazeutisch bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Die Form der Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist eine lyophilisierte Form. Das heißt, die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung.
Die Lyophilisierung kann durch geeignetes Einstellen der Bedingungen etc. von einem Fachmann gemäß bekannter Lyophilisierverfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann dies unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Lyophilisierers durch Einstellen durchgeführt werden, um in der Reihenfolge der nachfolgenden Schritte (1) bis (5) ausgeführt zu werden. Darin zeigen Zahlen in Klammern die für jeden Schritt erforderliche Zeit.

(1) Kühlen: beispielsweise Kühlung von einer Raumtemperatur bis auf –40°C bis –50°C (etwa 0,3 bis 1,5 Std.).
(2) Halten des Kühlzustandes, während ein Vakuumzustand erhalten wird: beispielsweise Halten bei –40°C bis –50°C (12 Std. oder mehr).
(3) Rückkehr aus dem Kühlzustand zur Raumtemperatur, während der Vakuumzustand erhalten bleibt: beispielsweise Rückkehr von –40°C bis –50°C zu einer Raumtemperatur (etwa 3 bis 15 Std.).
(4) Halten der Raumtemperatur, während der Vakuumzustand gehalten wird (z. B. etwa 3 bis 20 Std.).
(5) Rückkehr zum Normaldruck.

Bei der Herstellung der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung, die aus den Schritten (1) bis (5) besteht, sollte die für den obigen Schritt (2) erforderliche Zeit vorzugsweise festgelegt werden und die Zeit ist vorzugsweise 12 Stunden oder mehr.
Für die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung ist diejenige, deren Eigenschaften alle Bedingungen der nachfolgenden (a)-(d) erfüllt, besonders bevorzugt.

(a) Eigenschaft: wenn die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung makroskopisch beobachtet wird, hat ihre Kuchenform eine Tablettenform und wenn Wasser zur Injektion der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung zugesetzt wird, wird sie rasch aufgelöst und es werden keine unlöslichen Fremdsubstanzen beobachtet (die Eigenschaft der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung ist gut erhalten). Üblicherweise wird die in Wasser zur Injektion innerhalb von 10 Sekunden gelöst.
(b) Stabilität: wenn die enzymatische Aktivität pro Gewichtseinheit unmittelbar nach Lyophilisieren als 100 (%) gesetzt wird, sind die Relativwerte (%) der enzymatischen Aktivität bei den Zeitpunkten nachdem die lyophilisierte Zusammensetzung bei 8°C für 12 Monate, 25°C für 12 Monate oder 40°C für 6 Monate gelagert worden ist, 97% oder mehr, vorzugsweise 99% oder mehr. Diese Stabilität kann durch das beschriebene und später erklärte Verfahren im "(1-2-2)-Stabilitätstest" in Beispiel 1 gemessen werden.
(c) Spitzen von Analoga durch Gelfiltrationschromatografie: Wenn die Absorption bei 220 nm gemessen wird, wird keine maßgebliche Differenz zwischen der Spitzenform von PC-SOD (in der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung) im Detektionsdiagramm der Absorption und der Spitzenform von PC-SOD vor Lyophilisierung festgestellt. Die Chromatografie wird vorzugsweise durch das im "(1-2-3-1)-Detektionstest für Spitzen von Analoga durch Gelfiltrationschromatografie", später in Beispiel 1 beschrieben, beschriebene Verfahren durchgeführt.
(d) Spitzen von Analoga durch Phasenumkehr-Chromatografie: Nachdem die lyophilisierte Zusammensetzung bei 8°C für 12 Monate, 25°C für 12 Monate oder 40°C für 6 Monate gelagert worden ist, ändert sich die Menge an durch Messung der Absorption bei 220 nm und 270 nm detektierten Analoga nicht maßgeblichen Vergleich zu denjenigen unmittelbar nach Lyophilisieren. Die Chromatografie wird vorzugsweise durch das im "(1-2-3-2)-Detektionstest von Spitzen von Analoga durch Umkehrphasenchromatografie", in Beispiel 1 später beschrieben, beschriebene Verfahren ausgeführt.

Weiterhin behält die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorzugsweise alle oben unter (a) bis (d) beschriebenen Eigenschaften auch zu jeglichen Zeitpunkten, während derer die lyophilisierte Zusammensetzung bei 8°C für 36 Monate, 25°C für 36 Monate oder 40°C für 6 Monate gelagert worden ist.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Analoga umfassen verschiedene Substanzen, die durch Spaltung an unterschiedlichen Orten hauptsächlich in Lecithin einschließlich freigesetzten Fettsäuren etc. erzeugt werden. Von diesen Analoga wird angenommen, dass sie durch Spaltung von mit PC-SOD verknüpftem Lecithin erzeugt werden, dass somit, wenn eine große Menge von an PC-SOD verknüpftem Lecithin abgespalten wird, die Funktion als PC-SOD vermindert wird und wenn eine solche Menge an solchen Analoga enthalten sind, sind sie für die Qualität, die Standards etc. als Droge nicht bevorzugt zu verwalten.
Während die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als die endgültige Dosierform wie sie ist, zur Verabreichung als Medikament verwendet werden kann, kann sie als ein Rohmaterial für ein Medikament verwendet werden, das andere Dosierformen aufweist, beispielsweise eine Flüssigpräparation, eine lyophilisierte Präparation etc.
Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise als eine Präparation zur Injektion, die PC-SOD als aktives Ingredienz aufweist, verwendet. Wenn beispielsweise die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als eine Präparation zur Injektion eines Lösungszustands bereitgestellt wird, kann die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellte Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung des Lösungszustands in einen geeigneten Behälter, wie etwa einer Ampulle, eine Phiole und eine Spritze zur Injektion gefüllt und versiegelt werden, dann kann sie selbst verteilt oder gelagert werden, um zur Administration als Injektion bereitgestellt zu werden.
Wenn die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als eine Präparation zur Injektion in einem gefrorenen Zustand bereitgestellt wird, kann die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem gefrorenen Zustand in einem geeigneten Behälter, wie etwa einer Ampulle, einer Phiole und einer Spritze zur Injektion in einem versiegelten Zustand gehalten werden, und dann vertrieben oder gelagert werden, um zur Verabreichung als eine Injektion bereitgestellt zu werden, indem sie vor Verabreichung aufgetaut wird.
Wenn die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als eine Präparation zur Injektion bereitgestellt wird, kann die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als eine Präparation zur Injektion in einem geeigneten Behälter, wie etwa einer Ampulle, einer Phiole und einer Spritze zur Injektion etc. in einem versiegelten Zustand gehalten werden, dann vertrieben oder gelagert werden, um zur Verabreichung als eine Injektion durch Auflösung mit destilliertem Wasser zur Injektion vor Verabreichung bereitgestellt zu werden. Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann im lyophilisierten Zustand als ein Set mit einem Lösungsmittel zum Auflösen bereitgestellt werden.
Die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist eine Form der lyophilisierten Zusammensetzung zur Injektion.
<2> Das Behandlungsagens
Das Behandlungsagens ist ein Behandlungsagens für Krankheiten, umfassend die Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Weiterhin beinhaltet das Behandlungsagens ein Konzept, wie etwa ein therapeutisches Agens, ein präventives Agens, einen Inhibitor gegen die Zersetzung, ein Verbesserungsagens etc., für unterschiedliche Krankheiten. Für PC-SOD kann Saccharose, diese Mischmenge, andere Komponenten, die enthalten sein können, eine Dosierform, etc. die als konstitutive Komponenten des Behandlungsagens verwendet werden, dieselben Modi wie für die oben beschriebene Medikamentenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung angenommen werden.
Krankheiten, auf welche das Behandlungsmittel angewendet werden, sind nicht besonders beschränkt, soweit die Krankheiten durch die Wirkung von PC-SOD behandelt werden können (Behandlung, Prävention, Aufrechterhaltung (Hemmung der Verschlechterung), Reduktion (Verbesserung von Symptomen) und dergleichen).
Die durch die Wirkung von PC-SOD behandelbaren Erkrankungen beinhalten jene, die durch übermäßig reaktiven Sauerstoff verursacht werden, und beinhalten spezifischer:
motorische neuronale Erkrankungen (z. B. amyotrophe laterale Sklerose (ALS), spinale progressive Muskelatrophie, familiäre spastische Paraplegsie, das Charcot-Marie-Bein, progressive bulbare Schwellung, juvenil-laterale Muskelatrophie der oberen Gliedmaße (Hirayama-Erkrankung), etc.), ischämische Reperfusions-Erkrankung, akutes Nierenversagen (akutes Vornierenversagen, renales akutes Nierenversagen, postrenales akutes Nierenversagen etc.), Lupus Nephritis (normaler glomerulärer. Lupus Nephritis, mit mesangialer proliferativer Veränderung einhergehender Lupus Nephritis, fokale segmentierte Glomerulonephritis, diffuse proliferative Glomerulonephritis, diffuse Membran-Glomerulonephritis, terminale sklerotierende Glomerulonephritis, etc.) funktionelle Störungen (Allolalie, motorische Funktionsstörung durch Paralyse, visuelle Störungen, Hörstörungen, Geruchsbeeinträchtigungen, sensorische Beeinträchtigungen wie etwa Disgeusie, mentale Beeinträchtigungen etc.), die cerebrovaskuläre Störung begleitet (Enzephalorrhagie, cerebrale Überdruck-Hämorrhagie, cerebraler Infarkt, cerebrale Thrombose, Gehirnembolie, transiente Ischämie-Attacke, hypertensive Enzephalopathie, etc.), interstitiale Lungenentzündung, Fibrose (Lungenfibrose, etc.), ulcerative gastrointestinale Verletzungen (Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, etc.), Arthritis, Hitzeverletzungen, etc. Von diesen sind motorische neuronale Erkrankungen (insbesondere ALS) und ulcerative gastrointestinale Verletzungen (Colitis ulcerosa und Morbus Crohn) bevorzugte Indikationen. Zusätzlich sind auch Fibrose (insbesondere Lungenfibrose) und interstitiale Pneumonie bevorzugte Indikationen.
Das Behandlungsagens hat eine verbessernde Wirkung auf diese Erkrankungen und auf Symptome, die mit diesen Erkrankungen einhergehen, durch die Wirkung der enthaltenen PC-SOD. Hierin sind die aufgeführten Erkrankungsnamen beispielhaft, aber der Anwendungsumfang des Behandlungsagens ist nicht auf solche beispielhaft angegebenen Erkrankungen beschränkt.
Es wird bevorzugt, dass die später beschriebenen Dosierungsformen geeignet als solche des Behandlungsagens ausgewählt werden gemäß den Eigenschaften und Fortschreitungsstufen der angepeilten Erkrankungen.
Das Behandlungsagens kann oral oder parenteral verabreicht werden, abhängig von Verabreichungsverfahren wie etwa Injektion (intramuskulär, subkutan, intrakutan, intravenös, etc.), peroraler Anwendung, Inhalation, etc. und kann gemäß den Verabreichungsverfahren geeignet formuliert werden. Als eine Dosierform, während es eine Injektion (Lösung, Suspension, Emulsion, Festmedizin zum Auflösen bei Verwendung, etc.) gibt, eine Tablette, eine Kapsel, ein Granulat, ein Pulver, eine Lösung, ein lipoides Agens, ein Gel, ein externes Pulver, ein Spray, ein Inhalationspulver, ein Suppositorium, etc., ist die Injektion bevorzugt, und es ist noch bevorzugter, eine Injektion für intravenöse Verabreichung vorzubereiten.
Eine Menge des aktiven Inhaltsstoffes (PC-SOD) im Behandlungsagens und eine Verabreichungsmenge des oben beschriebenen Behandlungsagens variieren abhängig von dem Präparationsverfahren der Formulierung, einer Dosierform, einem Erkrankungstyp, einem Verabreichungsverfahren, einer Verabreichungsform, dem Zweck der Verwendung der oben beschriebenen Verabreichungsmittel, einem spezifischen Symptom eines Patienten (Erkrankungsgrad), dem Körpergewicht eines Patienten, etc. ist aber nicht besonders beschränkt auf beispielsweise 0,5–100 mg (1.500–300.000 U) pro Tag pro Erwachsenem, kann als klinische Menge beispielhaft angegeben werden. Zusätzlich ist bezüglich der Dosierintervalle der obigen Formulierung etwa einmal am Tag möglich und eine 3- bis 4-fach aufgeteilte Verabreichung ist auch möglich.
Während das Behandlungsagens auch als dasjenige präpariert werden kann, das Wirbeltieren verabreicht wird, die dazu in der Lage sind, die oben beschriebenen Erkrankungen zu entwickeln, insbesondere Säuger, wird bevorzugt, ein Behandlungsagens für Menschen herzustellen.
<3> Der Inhibitor und das inhibitorische Verfahren
Wie oben beschrieben, kann dadurch, dass man die Saccharose zu bringt, mit PC-SOD zu koexistieren, kann die Reduktion der PC-SOD-Aktivität inhibiert werden oder kann das Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse der PC-SOD durch Säulenchromatografie kontrolliert werden.
Dementsprechend ist der Inhibitor ein Agens, das Saccharose als einen effektiven Bestandteil zur Inhibierung der Minderung der PC-SOD-Aktivität oder zur Steuerung des Auftretens von Spitzen von Analoga bei Analyse der PC-SOD durch Säulenchromatografie aufweist, indem erreicht wird, dass die Saccharose mit PC-SOD koexistiert, die durch die oben beschriebene allgemeine Formel (I) repräsentiert wird. Vorzugsweise wird das Agens für sowohl den Zweck des Inhibierens der Reduktion der oben beschriebenen PC-SOD-Aktivität als auch für das Kontrollieren des Auftretens von Spitzen von Analoga bei Analysen der oben beschriebenen PC-SOD durch Säulenchromatografie verwendet.
Der Inhibitor zeigt weiterhin einen Effekt des Bewahrens der Eigenschaft der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung zusätzlich zu den obigen inhibitorischen Effekten, indem er dazu gebracht wird, mit PC-SOD zu koexistieren, wenn die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung hergestellt wird. Somit wird der Inhibitor vorzugsweise verwendet, indem er dazu gebracht wird, mit der oben beschriebenen PC-SOD zu koexistieren, insbesondere bei Präparation der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung, die die oben beschriebene PC-SOD enthält.
Weiterhin ist das inhibitorische Verfahren dasjenige, durch welches die Reduktion der PC-SOD-Aktivität inhibiert wird oder das Auftreten von Peaks von Analoga bei Analyse der PC-SOD durch Säulenchromatografie kontrolliert wird, indem die Saccharose dazu gebracht wird, mit der PC-SOD zu koexistieren, welche durch die oben beschriebene allgemeine Formel (I) repräsentiert wird. Vorzugsweise wird das inhibitorische Verfahren für beide Zwecke des Inhibierens der Reduktion der oben beschriebenen PC-SOD-Aktivität und der Kontrolle des Auftretens von Spitzen von Analoga bei Analysieren der oben beschriebenen PC-SOD durch Säulenchromatografie verwendet.
Als aktives Ingredienz des Inhibitors oder in den inhibitorischen Verfahren verwendete Saccharose und ihre zu PC-SOD zugegebene Menge etc. sind ähnlich zu denjenigen, die oben beschrieben worden sind <1>.
Weiterhin kann die Inhibierung der Reduktion der PC-SOD-Aktivität, die Kontrolle von Spitzen von Analoga bei Analysierung durch Säulenchromatografie und ein gutes Erhalten der Eigenschaft der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung bei Verwendung zur Herstellung der Zusammensetzung durch die in den später beschriebenen Beispielen beschriebenen Verfahren bestätigt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird spezifisch durch die nachfolgenden Herstellbeispiele und Beispiele beschrieben. Jedoch sollte der vorliegende erfinderische technische Umfang nicht auf diese beschränkt werden.
[Herstellbeispiel]
<1> Herstellung von humaner Cu/Zn-SOD
Die verwendete SOD ist diejenige, die gemäß dem in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 6-199895 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Die Aminosäure an der 111-Position dieser menschlichen Cu/Zn-SOD ist S-(2-Hydroxyethylthio)-Cystein.
<2> Herstellung von PC-SOD
PC-SOD wurde durch Präparieren von 2-(4-Hydroxycarbonylbutyroyl)-Lysolecithin gemäß dem in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 6-54681 beschriebenen Verfahren hergestellt, gefolgt von einem Reagierenlassen dieser mit der SOD des oben beschriebenen <1>. Nach Reinigung/Konzentrierung wurde die Anzahl von Bindungen des Lecithinderivats pro Molekül von SOD durch Analysieren der Proteinkonzentration gemäß dem Lowry-Verfahren (Lowry, O.H. et al., J.Biol.Chem., Band 193, 265 (1951)) und durch Analysieren einer Rest-Aminogruppe von SOD gemäß dem TNBS-Verfahren (Trinitrobenzolsulfonat, Goodwin, J.F. et al., Clin. Chem., Band 16, 24 (1970)) erhalten, um zu finden, dass die Durchschnittsanzahl an Bindungen 4,0 war. Die wässrige Lösung dieser PC-SOD zeigte sich blau-grün bis grün und der pH betrug 7–8. Zusätzlich war bei der Untersuchung des Molekulargewichtes durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dieses etwa 18.000 pro Monomer der PC-SOD-Subeinheit (PC-SOD ist ein Homodimer aus der Subeinheit).
[Beispiel 1]
"PEG 4000", das im vorliegenden Beispiel verwendet wird, bedeutet Polyethylenglykol (Durchschnittsmolekulargewicht 4000).
(1) Die in diesem Beispiel verwendeten Verfahren werden gemeinsam wie folgt beschrieben:
(1-1) Lyophilisierung

Eine Lösungszusammensetzung wurde unter Verwendung des Lyophilisierers (Modell Nr. RL402BS; hergestellt von Kyowa Vakuum) lyophilisiert. Das Programm der Lyophilisierung wurde eingestellt wie durchgeführt, in der Reihenfolge von den Schritten (1) bis (5) in der nachfolgenden Tabelle 1. Tabelle 1

Schritt	Druck	Temperatur	Erforderliche Zeit
(1)	Kühlen	25°C → –40°C	0,5 Stunden
(2)	Aufrechterhalten des Vakuumzustands	Aufrechterhalten bei –40°C	12 Stunden
(3)	Aufrechterhalten des Vakuumzustands	–40°C → 25°C	12 Stunden
(4)	Aufrechterhalten des Vakuumzustands	Aufrechterhalten bei 25°C	16,5 Stunden
(5)	Rückkehr des Drucks durch Stickstoffgas	Aufrechterhalten bei 25°C	mehrere Sekunden

(1-2) Unterschiedliche Testverfahren
(1-2-1) Eigenschaftentest
Für die lyophilisierte Zusammensetzung wurde die Eigenschaft der Zusammensetzung durch das nachfolgende Verfahren untersucht.
Diejenigen, bei denen die Kuchenform der lyophilisierten Zusammensetzung makroskopisch tablettenartig war, und wenn Wasser zur Injektion der lyophilisierten Zusammensetzung zugesetzt wurde, sie sich innerhalb von 10 Sekunden löste und es keine unlöslichen Fremdsubstanzen beobachtet wurden, wurden als ";" evaluiert, während diejenigen, wo die Kuchenform der lyophilisierten Zusammensetzung nicht tablettenartig war oder bei Wasserzugabe zur Injektion zur lyophilisierten Zusammensetzung sie sich nicht sich innerhalb von 10 Sekunden auflöste oder unlösliche Fremdsubstanzen beobachtet wurden, wurden als "x" evaluiert.
(1-2-2) Stabilitätstest
Für die lyophilisierte Zusammensetzung wurde die enzymatische Aktivität von PC-SOD in der Zusammensetzung durch das folgende Verfahren gemessen.
Unter Verwendung der durch Hinzufügen von Wasser zur Injektion zur lyophilisierten Zusammensetzung zur Rekonstitution erhaltenen Lösung und unter Verwendung von NBT unter Bedingungen pH 7,8 bei 30°C wurde die Aktivität durch das Verfahren gemäß J. Biol. Chem., Band 244, Nr. 22, 6049–6055 (1969) gemessen, um die enzymatische Menge, welche 50% der Reduktionsrate von NBT als 1 U zu erhalten. Im Vergleich zur enzymatischen Aktivität unmittelbar nach Lyophilisieren, die mit 100% angesetzt wurde, wurde der Relativwert (%) der enzymatischen Aktivität nach Lagerung berechnet.
(1-2-3) Detektionstest für Spitzen von Analoga durch Säulenchromatografie
(1-2-3-1) Detektionstest für Spitzen von Analoga durch Gelfiltrationschromatografie (nachfolgend manchmal als "GPC" abgekürzt).
Eine durch Hinzufügen von Wasser zur Injektion zur lyophilisierten Zusammensetzung für die Wiederauflösung erhaltene Lösung wurde als eine Probe verwendet, die einer Hochleistungs-Flüssigchromatografie unter Verwendung der folgenden Säulen- und Mobilphase unterworfen wurde:
Säule: YMC-Pack Diol-200 (von YMC Co., Ltd. hergestellt), und
Mobile Phase: 45% Acetonitril/0,01 M Phosphatpuffer.
Die Absorption der Eluate bei 220 Nm wurde kontinuierlich detektiert, um das Detektionsdiagramm zu erhalten. Die Fälle, bei denen keine maßgebliche Differenz zwischen Spitzenformen von PC-SOD auf dem Detektionsdiagramm und den Spitzformen von PC-SOD vor der Lyophilisierung beobachtet wurden, wurden als ";" evaluiert, während die Fälle, wo die Spitzen, die nicht in solchen von PC-SOD vor Lyophilisierung gesehen wurden, beobachtet wurden, als "x" evaluiert worden.
(1-2-3-2) Detektionstest von Spitzen von Analoga durch Umkehrphasenchromatografie (nachfolgend manchmal als "CN" abgekürzt.
Die Probe wurde ähnlich wie die obige (1-2-3-1) hergestellt und einer Hochleistungs-Flüssigchromatografie unter Verwendung der folgenden Säule und Mobilphase unterworfen:
Säule: Cyanopropyliertes Kieselerdegel (hergestellt von YMC Co., Ltd.), und
Mobile Phase: Acetonitril/0,1% Trifluor-Essigsäure (Elution bei einem Konzentrationsgradient von 20%–90% an Acetonitril).
Die Absorption der Eluate bei 200 nm und 270 nm wurde kontinuierlich detektiert. Die Gesamtfläche (SI) der Spitzengruppe (Spitzengruppe von Analoga) erschien vor einer PC-SOD-Spitze (Hauptspitze) und die Gesamtfläche (ST) von PC-SOD-Spitze und SI wurde gemessen, um eine Menge (SI/ST;%) von Analoga in jeder Probe zu berechnen.
Für die später beschriebenen Tabellen 7 und 8 werden die relativen Werte gezeigt, wenn eine Menge an Analoga unmittelbar nach Lyophilisieren in der Verschreibung 1 für den leichten Vergleich als 1 gesetzt.
(2) Test bezüglich der PC-SOD enthaltenden Medikamentenzusammensetzung
(2-1) Einfluss 1 anhand von Typen von Inhaltsstoffen in der Zusammensetzung
PC-SOD (0,4 mg/Phiole), das in oben beschriebenen Herstellbeispielen hergestellt wurde, und unterschiedliche Ingredienzien (Zahlen in Klammern in der Tabelle zeigen Gewicht pro Phiole) wurden in Wasser zur Injektion gelöst, um die Lösungszusammensetzung herzustellen und diese wurde nachfolgend lyophilisiert.
Die lyophilisierte Substanz wurde den oben beschriebenen unterschiedlichen Tests unterworfen und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Bei jenen, bei denen auch nur ein x in den Evaluierungspunkten vorhanden war, wurde als "x" evaluiert, während solche, bei denen kein x in den Evaluierungspunkten vorhanden war, wurden alle als "T" evaluiert. Tabelle 2

Inhaltsstoff	Eigenschaftstest	GPC	Bewertung
Alanin (20 mg)	;	x	x
Inositol (20 mg)	;	x	x
Mannit (20 mg)	;	x	x
Sorbit (20 mg)	x	;	x
Saccharose (20 mg)	;	;	T
Creatinin (10 mg)	x	x	x
Glycin (20 mg)	;	x	x
PEG4000 (0,5 mg)	;	x	x
Harnstoff (20 mg)	;	x	x
Keiner	x	x	x

Aus den Ergebnissen von Tabelle 2 wurde geklärt, dass die Eigenschaft der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung extrem gut wurde und das Auftreten von Spitzen von Analoga bei Analyse durch Säulenchromatografie (GPC) durch das Formulieren von PC-SOD zusammen mit Saccharose kontrolliert wurde.
(2-2) Einfluss 1 von Arten von Ingredienzien
In dem oben beschriebenen Herstellbeispiel hergestelltes PC-SOD und unterschiedliche in Tabelle 3 gezeigte Ingredienzien wurden in Wasser zur Injektion gelöst, um die Lösungszusammensetzung herzustellen, nachfolgend wurde jeweils 0,5 ml getrennt in eine Phiole gegossen und diese wurde lyophilisiert gemäß dem oben beschriebenen Verfahren.

Das Gewicht in der Tabelle zeigt das in einer Phiole enthaltene und "–" bedeutet keine Zugabe. Tabelle 3

	PC-SOD	Saccharose	PEG4000	Sorbit	Mannit
Verschreibung 1	2 mg	100 mg	–	–	–
Verschreibung 2	2 mg	5 mg	10 mg	–	–
Verschreibung 3	2 mg	–	–	5 mg	10 mg
Verschreibung 4	2 mg	–	10 mg	5 mg	–

Die lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung der oben beschriebenen Verschreibungen 1 bis 4 wurde dem Eigenschaftentest, dem Stabilitätstest und dem Detektionstest für Spitzen von Analoga durch Gelfiltrationschromatografie und dem Detektionstest für Spitzen von Analoga durch Umkehrphasenchromatografie an den folgenden Zeitpunkten (a) bis (d) unterworfen:

(a) unmittelbar nach Lyophilisierung (nicht gelagert),
(b) zum Zeitpunkt nach Lagerung bei 40°C für 3 Monate nach Lyophilisierung,
(c) der Zeitpunkt nach Lagerung bei 25°C für 3 Monate nach Lyophilisierung, und
(d) der Zeitpunkt bei Lagerung bei 8°C für 3 Monate nach Lyophilisierung (der Zeitpunkt gelagert für 6 Monate in Verschreibung 1).

Die Ergebnisse jedes Tests werden in den Tabellen 4 bis 7 gezeigt. (1) Eigenschaftentest Tabelle 4

Verschreibung (a) (b) (c) (d)

Unmittelbar nach Lyophilisierung 40°C für 3 Monate 25°C für 3 Monate 8°C für 3(6) Monate

¹ ; ; ; ;

² ; ; ; ;

³ ; ; ; ;

4 ; ; ; ;

Jegliche Verschreibung zeigte gute Eigenschaften.

Verschreibung	(a) Unmittelbar nach Lyophilisierung	(b) 40°C für 3 Monate	(c) 25°C für 3 Monate	(d) 8°C für 3(6) Monate
1	100	100	110	102
2	100	97	114	110
3	100	114	103	102
4	100	99	94	91

Die Verschreibung, die Sorbit und Polyethylenglykol enthielt (Verschreibung 4) zeigte eine größere Reduktion der PC-SOD-Aktivität als die anderer Verschreibung.

Verschreibung	(a) Unmittelbar nach Lyophilisierung	(b) 40°C für 3 Monate	(c) 25°C für 3 Monate	(d) 8°C für 3(6) Monate
1	;	;	;	;
2	;	;	;	;
3	;	K.T.	K.T.	;
4	;	;	;	;

In Tabelle 6 bedeutet K.T., dass kein Test durchgeführt wurde.

Es wurden keine Spitzen von Analoga durch Gelfiltrationschromatografie in irgendeiner der Verschreibungen detektiert. Tabelle 7 (4) Detektionstest für Spitzen von Analoga durch Umkehrphasenchromatografie (200 Nm)

Verschreibung	(a) Unmittelbar nach Lyophilisierung	(b) 40°C für 3 Monate	(c) 25°C für 3 Monate	(d) 8°C für 3(6) Monate
1	1	1,0	1,0	1,1
2	1,5	1,8	1,6	1,8
3	1,5	3,4	2,2	1,8
4	1,4	3,4	2,2	1,8

In der Sorbit und Mannit enthaltenen Verschreibung (Verschreibung 3) und in der Sorbit und Polyethylenglykol enthaltenen Verschreibung (Verschreibung 4) war die Spitzenfläche von Analoga durch Umkehrphasenchromatografie etwa 1,4- bis 3,4-fache von dem der Saccharose enthaltenen Verschreibung (Verschreibung 1).
Zusätzlich wurden die Experimente ähnlich zu der obigen Verschreibung unter Verwendung von 0,4 mg oder 10 mg für den Inhalt von PC-SOD durchgeführt, folglich wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.
Aus den obigen Ergebnissen wurde gefunden, dass die PC-SOD und die Saccharose enthaltene lyophilisierte Zusammensetzung extrem vorteilhafte Effekte aufweist, dass:
(1) die Eigenschaften gut sind; (2) die Reduktion der enzymatischen Aktivität aufgrund von Langzeitlagerung signifikant kleiner ist (extrem stabil) und (3) Spitzen von Analoga durch Gelfiltrationschromatografie und Umkehrphasenchromatografie extrem weniger sind im Vergleich zur anderen Verschreibung.
[Beispiel 2]
Um zu untersuchen, ob die PC-SOD und Saccharose enthaltende lyophilisierte Zusammensetzung einer Langzeitlagerung widerstehen konnte oder nicht, wurden die folgenden Tests durchgeführt.
Die lyophilisierte, PC-SOD enthaltende Zusammensetzung wurde mit der obigen Verschreibung 1 hergestellt, nachfolgend wurden unterschiedliche Tests gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 1 zu den folgenden Zeitpunkten (e) bis (h) durchgeführt. Für jede Verschreibung der vorliegenden Tests wurden jeweils 3 Ansätze den Tests unterworfen:

(e) unmittelbar nach Lyophilisierung (nicht gelagert),
(f) Zeitpunkt bei Lagerung bei 40°C für 6 Monate nach Lyophilisierung,
(g) Zeitpunkt nach Lagerung bei 25°C für 12 Monate (g-2), 24 Monate (g-2) und 36 Monate (g-3) nach Lyophilisierung und
(h) Zeitpunkt bei Lagerung bei 8°C für 12 Monate (h-2), 24 Monate (h-2) und 36 Monate (h-3) nach Lyophilisierung.

Die Ergebnisse der Tests werden gemeinsam in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8

Test	(e) Unmittelbar nach Lyophilisierung	(f) 40°C 6 Monate	(g-1) 25°C 12 Monate	(g-2) 25°C 24 Monate	(g-3) 25°C 36 Monate	(h-1) 8°C 12 Monate	(h-2) 8°C 24 Monate	(h-3) q8°C 36 Monate
Eigenschaft	;	;	;	;	;	;	;	;
Stabilität	100	102	106	111	112	105	110	105
GPC	;	;	;	;	;	;	;	;
CN	1,0 1,0	1,2 1,3	1,0 1,0	1,0 0,6	1,1 1,1	0,9 0,9	1,0 0,8	1,1 1,1

(Die obere Reihe der Spalte CN zeigt die Ergebnisse bei 220 nm und die untere Zeile zeigt jene bei 270 nm)

Experimente ähnlich zu dieser Verschreibung unter Verwendung von 0,4 mg oder 10 mg für den Inhalt an PC-SOD wurden durchgeführt, folglich sind ähnliche Ergebnisse in den Tabellen 9 bzw. 10 gezeigt. Tabelle 9

Test	(e) Urmittelbar nach Lyophilisierung	(f) 40°C 6 Monate	(g-1) 25°C 12 Monate	(g-2) 25°C 24 Monate	(g-3) 25°C 36 Monate	(h-1) 8°C 12 Monate	(h-2) 8°C 24 Monate	(h-3) 8°C 36 Monate
Eigenschaft	;	;	;	;	;	;	;	;
Stabilität	100	104	104	110	104	104	110	108
GPC	;	_;	;	;	q;	;	;	;
CN	1,0 1,0	1,0 1,6	0,8 0,9	0,9 0,7	1,0 1,0	0,7 0,8	0,9 0,7	1,1 1,1

Test	(e) Unmittelbarnach Lyophilisierung	(f) 40°C 6 Monate	(g-1) 25°C 12 Monate	(g-2) 25°C 24 Monate	(g-3) 25°C 36 Monate	(h-1) 8°C 12 Monate	(h-2) 8°C 24 Monate	(h-3) 8°C 36 Monate
Stabilität	100	101	104	108	110	104	104	105
GPC	;	;	;	;	;	;	;	;
CN	1,0 1,0	1,2 1,1	1,0 0,9	1,1 0,8	1,2 1,1	1,1 0,9	1,0 0,8	1,1 1,1

[Beispiel 3]
30 mg von im obigen beschriebenen Herstellbeispiel hergestellter PC-SOD und 50 mg Saccharose wurden in Wasser zur Injektion gelöst, um die Lösungszusammensetzung herzustellen, nachfolgend wurden jeweils 1,5 ml getrennt in eine Phiole gegossen, um sie gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zu lyophilisieren.
Zum Zeitpunkt unmittelbar nach Lyophilisierung der oben beschriebenen Zusammensetzung und nach Lagerung bei 8°C für 9 Monate wurden unterschiedliche Tests gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer bezüglich dem Messverfahren der spezifischen Aktivität. Die spezifische Aktivität wurde durch das Verfahren gemäß J.Biol.Chem., Band 244, Nr. 22, 6049–6055 (1969) unter Verwendung einer Lösung gemessen, die durch Zugeben von Wasser zur Injektion zur lyophilisierten Zusammensetzung für ein Wiederauflösen und unter Verwendung von Cytochrom C unter den Bedingungen von pH 7,8 bei 25°C erhalten wurden, um eine enzymatische Menge zu erhalten, die 50% der Reduktionsrate von Cytochrom C als 1 U setzt. Im Vergleich zur enzymatischen Aktivität unmittelbar nach Lyophilisierung, die auf 100 (%) gesetzt wurde, wurden die relativen Werte (%) der enzymatischen Aktivität nach Lagerung berechnet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11

Test (e) Unmittelbar nach Lyophilisierung 8°C 6 Monate 8°C 9 Monate 25°C 6 Monate

Eigenschaft ; ; ; ;

Stabilität 100 104 123 109

GPC ; ; ; ;

CN 1,0 1,0 1,2 1,3 1,0 1,1 1,2 1,3

Aus den obigen Ergebnissen wurde gezeigt, dass Saccharose Effekte des Erhaltens der Eigenschaft der lyophilisierten Medikamentenzusammensetzung Inhibieren der Reduktion der PC-SOD-Aktivität (Behalten der Stabilität), das Kontrollieren von Peaks von Analoga bei Analyse durch Gelfiltrationschromatografie und Umkehrphasenchromatografie etc. selbst nach Langzeitlagerung gut behielt, indem sie PC-SOD zugesetzt wurde, neben dem bekannten Effekt als Medikamententräger (Bindemittel). Sequenzliste

Claims

Lyophilisierte Medikamentenzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Saccharose als Medikamententräger und eine lecithin-modifizierte Superoxid-Dismutase enthält, die durch die nachfolgende allgemeine Formel (I) repräsentiert ist: SOD' (Q – B)_m (I)dadurch gekennzeichnet, dass SOD' ein Rest von Superoxid-Dismutase ist; Q eine chemische Quervernetzung ist; B ein Rest ohne Wasserstoffatom einer Hydroxylgruppe von Lysolecithin mit der Hydroxylgruppe an der 2-Position von Glycerin ist und die Formel (II) hat: -O-CH(CH₂OR)[CH₂OP(O)(O^–)(OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃] (II)wobei R ein Rest Fettsäure ist; M eine Durchschnittsanzahl von Bindungen von Lysolecithin mit einem Molekül von Superoxid-Dismutase ist, die eine positive Zahl von 1 oder mehr ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fettsäuregehalt in der Medikamentenzusammensetzung 0,13–0,15 μmol/mg Protein beträgt.
Medikamentenzusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Q = -C(O)-(CH₂)_n-C(O)- ist, wobei n eine Ganzzahl von 2 oder mehr ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass SOD' ein Rest von menschlicher Superoxid-Dismutase ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass SOD' ein Rest einer modifizierten Form von Superoxid-Dismutase ist, in der eine Aminosäure an der 111-Position einer Aminosäuresequenz menschlicher Superoxid-Dismutase zu S-(2-Hydroxyehtylthio)Cystein konvertiert ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Superoxid-Dismutase Kupfer und Zink im aktiven Zentrum enthält.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass n eine Ganzzahl von 2 bis 10 ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass m eine Positivzahl von 1 bis 12 ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Saccharose mit Aktivkohle behandelt ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gewichtsverhältnis von lecithinisierter Superoxid-Dismutase zu Saccharose 0,4/100-60/100 ist.
Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei der Behandlung von motorischer Neuronenerkrankung oder ulcerativer Gastrointestinalverletzung.
Verwendung einer Medikamentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer motorischen Neuronenkrankheit oder ulcerativen Gastrointestinalverletzung.
Verfahren zum Herstellen einer Medikamentenzusammensetzung gemäß Anspruch 1 durch Formulieren von Saccharose als einem Träger und einer lecithin- modifizierten Superoxid-Dismutase, die durch die allgemeine Formel (I) repräsentiert ist, und Lyophilisieren der Zusammensetzung.