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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der bioaktiven
Naturprodukte und betrifft insbesondere eine von Fraktionen von
Eurycoma longifolia abgeleitete Zusammensetzung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Bestandteile
von Eurycoma longifolia, in Malaysia auch als Tongkat Ali bekannt,
wurden in der traditionellen Volksmedizin eingesetzt. Extrakte dieser
Pflanze sollen allgemein für
die Behandlung von zahlreichen Krankheiten und Syndromen nützlich sein:
Malaria, Krebs, Angstzustände,
Geschwüre
sowie männliche
Unfruchtbarkeit und sexuelle Dysfunktion. In der Vergangenheit sind
viele der Informationen über
den medizinischen Wert der Pflanze anekdotisch gewesen. Gut kontrollierte,
wiederholbare Extraktionen und Bioaktivitätstests können die Funktion der Bestandteile
verdeutlichen. Beispielsweise werden Untersuchungen vorgenommen,
um Extrakte von Eurycoma longifolia zu untersuchen, bei denen gezeigt
wurde, dass sie cytotoxische Wirkungen haben. Diese Extrakte, die
Quassinoide einschließen,
umfassen Verbindungen wie Eurycomalakton, Eurycomanol und Eurycomanon,
die auf ihre cytotoxischen Eigenschaften und potentielle Verwendung
als Anti-Krebs-Mittel, Anti-Malaria-Mittel und Anti-Ulcus-Mittel untersucht
wurden.
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Chromatographische
Verfahren zur Herstellung von Quassinoid-Extrakten aus Eurycoma
longifolia wurden in Chan et. al. (1998) offenbart. Diese Literaturstelle
beschreibt die potentielle Verwendbarkeit von solchen Quassionoid-Extrakten
für die
Behandlung von Krebs, Geschwüren,
Malaria und Fieber.
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Im
Gegensatz zu Quassionoiden, deren Wirkungen nach stringenten Aufreinigungsstrategien
untersucht worden sind, wurden keine Bestandteile aus Eurycoma longifolia
mit einer möglichen
aphrodisierenden Aktivität
und mit Potential für
Behandlungen von männlicher
Unfruchtbarkeit und sexueller Dysfunktion isoliert. Rohe, mit Butanol,
Methanol, Wasser und Chlorofrom extrahierte Fraktionen von Eurycoma
longifolia wurden auf ihre verhaltenstypischen Wirkungen in Säugetieren
untersucht. Gemische von Verbindungen, die anhand dieser Grundverfahren
aufgetrennt wurden, wurden an männliche
Mäuse und
Ratten verabreicht, um die Wirkungen auf das Sexualverhalten und
die Leistungsfähigkeit
der Tiere zu bestimmen. (Experimental Animals (Tokyo), 49(1), 35,
(2000): Hoon et al., und Int. J. of Pharmacognosy, 35(2), 144, (1997):
Hoon et al. offenbaren die Verwendung von Extrakten von Eurycoma
longifolia.
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Die
Untersuchung der sexuellen Wirkungen von Eurycoma longifolia zielten
auf den Einfluss der Rohextrakte auf Orientierungsaktivitäten von
sexuell erfahrenen und naiven männlichen
Ratten gegenüber
empfänglichen
Weibchen ab. Die in den behandelten Ratten beobachteten Aktivitäten schließen Aufbeugen,
Lecken und anogenitales Beschnüffeln
ein. Die Verhaltensweisen der behandelten Ratten im Vergleich zu
ihrer Umwelt wurden ebenfalls untersucht, einschließlich der
Analyse von Aktivitäten
wie Bewegung, Erkundung, Aufzucht und Kletterfähigkeit. Zusätzlich wurden
die Ratten auf die Häufigkeit
genitaler und nicht genitaler Pflege untersucht. Die Analyse dieser
Arten von Verhaltensmerkmalen diente als Test zur Untersuchung der
anekdotischen aphrodisierenden Eigenschaften von Eurycoma longifolia,
und die Verabreichung der Rohextrakte wurde mit einer erhöhten sexuellen
Leistungsfähigkeit
der behandelten Tiere in Korrelation gebracht. Obwohl der Einsatz
von Verhaltensstudien auf die sexuelle Physiologie von rohen Eurycoma
longifolia-Extrakten eine Wirkung zeigt, hat die Forschung keine
Aufreinigungsstrategien eingesetzt, um isolierte Bestandteile zu
gewinnen. Daher wurden im Stand der Technik nicht die physikalischen
Eigenschaften der aphrodisierenden Kandidatenverbindungen von Eurycoma
longifolia identifiziert, oder man war nicht in der Lage, die aus
Eurycoma longifolia isolierten Verbindungen auf ihre Unfruchtbarkeit
oder sexuelle Dysfunktion auf einen zellulären Level zu untersuchen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
wurde nun festgestellt, dass bestimmte aufgereinigte Bestandteile
von wässrigen
Extrakten von Eurycoma longifolia eine Bioaktivität mit erhöhter Testosteron-Synthese
und -freisetzung sowie Spermienaktivität und -freisetzung besitzt.
Diese gereinigten Bestandteile umfassen Peptide mit einem Molekulargewicht von
ungefähr
4.300 Dalton. Es werden Verfahren zur Behandlung männlicher
Unfruchtbarkeit und sexueller Dysfunktion unter Verwendung der gereinigten
Bestandteile bereitgestellt. Es werden auch Präparationen, die Extrakte von
Wurzeln der Eurycoma longifolia-Pflanze einschließen, bereitgestellt.
Die Präparationen
können zur
Applikation oder Verabreichung über
mehrere Routen formuliert sein.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die
eine Fraktion eines wässrigen
Extraktes von Eurycoma longifolia umfassen. Die Fraktion umfasst
ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton. In bestimmten
Ausführungsformen
besitzt die Fraktion eine Aktivität, die ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus erhöhter
Testosteronsynthese, erhöhter
Testosteronfreisetzung aus Zellen, erhöhter Spermienzahl und erhöhter Spermienbeweglichkeit.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen
ist das Peptid ein Glycopeptid. In anderen bevorzugten Ausführungsformen
hat das Peptid ungefähr
30 bis 39 Aminosäuren,
vorzugsweise hat das Peptid ungefähr 36 Aminosäuren.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Isolierung eines
bioaktiven Bestandteils aus einem wässrigen Extrakt von Eurycoma
longifolia bereitgestellt. Die Verfahren umfassen die Herstellung
eines wässrigen
Extraktes von Eurycoma longifolia und das Isolieren des bioaktiven
Bestandteils aus der Fraktion. Der bioaktive Bestandteil wird durch
ein chromatographisches Verfahren isoliert, vorzugsweise einem Verfahren
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Hochleistungsumkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) und Größenausschlusschromatographie.
Der bioaktive Bestandteil umfasst ein Peptid mit einem Molekulargewicht
von ungefähr
4.300 Dalton. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird eine Umkehrphasen-HPLC
unter Verwendung eines chromatographischen Mediums ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus C4 und C18 durchgeführt. In anderen Ausführungsformen
umfassen die Verfahren weiter das Fraktionieren des wässrigen
Extraktes unter Verwendung von wenigstens einem Größenausschluss-Chromatographiemedium
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Bio-Gel P-2 und Bio-Gel P-4 vor der
Auftrennung über
Chromatographie durch Umkehrphasen-HPLC. In anderen bevorzugten
Ausführungsformen
ist die Bioaktivität
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus zunehmender Testosteron-Synthese, zunehmender
Testosteron-Freisetzung aus Zellen, zunehmender Spermienzahl und
zunehmender Spermienbeweglichkeit.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung werden bioaktive Bestandteile von Eurycoma
longifolia bereitgestellt, die nach den zuvor genannten Verfahren
hergestellt wurden.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt,
die einen wässrigen
Extrakt von Eurycoma longifolia umfasst, der zur Behandlung einer
sexuellen Dysfunktion oder männlichen
Unfruchtbarkeit verwendet werden kann. Die Verwendung umfasst das
Verabreichen einer Menge einer Zusammensetzung, die eine Fraktion
eines wässrigen
Extraktes von Eurycoma longifolia umfasst, an einen Patienten, der
Bedarf an einer solchen Behandlung hat. Die Fraktion umfasst ein
Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton. Die verabreichte
Menge ist wirksam, um eine Aktivität zu erhöhen, die ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus zunehmender Testosteronsynthese, zunehmender
Testosteronfreisetzung aus Zellen, zunehmende Spermienzahl und zunehmende
Spermienbeweglichkeit. Gemäß anderen
Aspekten der Erfindung wird die Verwendung der Zusammensetzung,
die einen wässrigen
Extrakt von Eurycoma longifolia umfasst, zur Erhöhung der Testoseronsynthese,
Erhöhung
der Testosteronfreisetzung von Testiszellen, Erhöhung der Spermienzahl und/oder
Erhöhung
der Spermienbeweglichkeit bereitgestellt. Die Verwendung umfasst
das Verabreichen einer Menge der zuvor genannten Eurycoma longifolia-Zusammensetzung,
die wirksam ist, um die Testosteronsynthese, die Testosteronfreisetzung
von Hodenzellen, die Spermienanzahl bzw. Spermienbeweglichkeit zu
erhöhen,
an einen Patienten, der Bedarf an einer solchen Behandlung hat.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen
bereitgestellt. Die Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge
der zuvor genannten Zusammensetzungen zusammen mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger.
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung werden im Folgenden in ihren Einzelheiten
nachstehend beschrieben.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
ein schematische Flussdiagramm des Größenausschluss-Chromatographieverfahrens
zur Isolierung der biokativen Fraktion von Eurycoma longifolia.
Die bioaktiven Fraktionen FDAE und F3AE werden bei den gezeigten
Schritten gewonnen.
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2 zeigt
ein schematische Flussdiagramm der Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung
für die
bioaktiven Fraktionen von Eurycoma longifolia.
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3 zeigt
ein Chromatogramm der Eurycoma longifolia Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigungsdurchläufe für FDAE (obere
Spur) und F3AE (untere Spur). Die Zahlen und Aufteilungen am Boden
der Spuren bezeichnen die Elutionszeit in Minuten. Die Sterne (*)
bezeichnen die bioaktive Fraktion oder den Peak.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von bioaktiven Fraktionen
von Extrakten von Eurycoma longifolia für die Behandlung männlicher
Unfruchtbarkeit und sexueller Dysfunktion. Männliche Unfruchtbarkeit ist
ein häufig
vorkommendes Problem und schließt
viele Aspekte ein einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf: abnormale Libido, abnormale Spermienbeweglichkeit und abnormale
Spermienanzahl. Diese Arten von Abnormalitäten können mit abnormal niedrigen
Testosteron-Spiegeln in Beziehung gebracht werden. Beispielsweise
besitzen "zwei Drittel
der unfruchtbaren Männer
eine Teilverminderung der Samenflüssigkeitsparameter und eine
geringere Fruchtbarkeit",
und "es war eine
Vielzahl von empirischen Therapien (z.B. neugebundenes Testosteron,
Gonadotrophine, Antiöstrogene)
nicht erfolgreich" (Harrison's Principle of Internal
Medicine, 1998). Neben der Unfruchtbarkeit können verminderte Testostersonspiegel
mit einer fehlenden sexuellen Funktion und einer verminderten Libido
korreliert werden, über
die viele ältere
und in einigen Fällen auch
jüngere
Männer
klagen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Fruchtbarkeits-
und antisexuelle Dysfunktions-Präparationen,
die solche bioaktiven Fraktionen einschließen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst die Identifikation des bioaktiven
Bestandteils von Eurycoma longifolia (zur Erhöhung der Testosteron-Freisetzung
oder -herstellung oder Spermienbeweglichkeit oder -anzahl) als Peptidmolekül, sehr
wahrscheinlich ein Glycopeptid. Wie in den Beispielen unten gezeigt,
wurde ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300
Dalton durch eine Reihe von chromatographischen Verfahren aufgereinigt
bis hin zu einem Hochleistungsumkehrphasenchromatographie(HPLC)-Aufreingungsschritt.
Die Analyse der isolierten und aufgereinigten bioaktiven Fraktion
deutete auf das Vorliegen eines bioaktiven Peptids mit ungefähr 4.300
Dalton hin, das mit mehreren Arten von Zuckerresten verbunden ist.
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Eurycoma
longifolia-Extrakte können
als Ausgangsmaterialien für
die hier beschriebenen chromatographischen Verfahren durch eine
wässrige
Extraktion von Eurycoma longifolia erhalten werden. In bevorzugten
Ausführungsformen
werden lediglich die Wurzeln der Pflanze verwendet. In bevorzugten
Ausführungsformen
werden die Wurzeln pulverisiert. Es kann eine Vielzahl von hydrophilen
Lösungsmitteln
für die
Extraktionsprozedur verwendet werden einschließlich z.B. Wasser, Methanol,
Ethanol und andere Nieder-Alkyl-Alkohole. Die pulverisierten Wurzeln
können
in einem Lösungsmittel
gekocht werden, und Zellreste können
von dem Extrakt durch Zentrifugation entfernt werden. Es können mehrere
Extraktionen durchgeführt
werden, um den wässrigen
Extrakt weiter zu verfeinern.
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Wie
hier beschrieben, kann eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren
verwendet werden, um die den Wirkstoff von Eurycoma longifolia enthaltenden
Fraktionen zu isolieren. Solche chromatographischen Verfahren umfassen
Größenausschlusschromatographie,
Gel-Filtrations-Chromatographie,
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC), Umkehrphasen-HPLC und Ionenaustausch-Chromatographie. In
einer Ausführungsform
handelt es sich bei dem chromatographischen Verfahren um eine Größenausschlusschromatographie.
Wie der Fachmann leicht erkennt, kann in einigen Ausführungsformen
eine Größenauschlusschromatographie
mit Polyacrylamid-Kügelchen
wie Biogel P-2 oder Biogel P-4 durchgeführt werden, während in
anderen Ausführungsformen
die Größenausschlusschromatographie
mit anderen Größenausschlussprodukten
desselben oder anderer Hersteller durchgeführt werden kann. Die Verfahren
zum Auswählen
von Größenausschlussmaterialien
und -verfahren sind für
denjenigen, der auf dem Gebiet der Chromatographie kundig ist, Routine.
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In
anderen Ausführungsformen
kann das Chromatographieverfahren eine Umkehrphasen-HPLC sein. Vorzugsweise
umfasst die Säule
in einer Ausführungsform
ein auf Kieselsäure
basierendes Adsorptionsmittel. In einigen Ausführungsformen ist die Umkehrphasen-HPLC-Säule eine C4-(Butyldimethylchlorsilan)-Säule. In anderen
Ausführungsformen
ist die Umkehrphasen-HPLC-Säule
eine C18-(Oktadecyl)-Säule.
Wie der Fachmann erkennt, kann die Säule auch ausgewählt sein
aus, aber nicht beschränkt
auf: C8, C1-(Trymethylchlorsilan)-, CN- oder Phenyl-Säulen. Verfahren zur Auswahl
von Umkehrphasen-HPLC-Säulen,
Adsorptionsmitteln und Adsorptionsmodifikationen sind für denjenigen,
der auf dem Gebiet der Chromatographie kundig ist, Routine.
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Um
die Eigenschaften von Fraktionen von Eurycoma longifolia-Extrakten
zu untersuchen, wurde eine Reihe von Experimenten unter Verwendung
von Formulierungen der Fraktionen durchgeführt. Die Einzelheiten dieser
Experimente sind in den Beispielen unten aufgeführt. Alternative Verfahren
zur Untersuchung der Spermienbeweglichkeit, der Spermienanzahl und
des Testosteronspiegels sind dem Fachmann bekannt (z.B. siehe Harrison's Principles of Internal
Medicine, 1998; Winters et al., 1991; Froman and McLean, 1996; Bomman,
et al., 1993) und sollen als solche in dem Test der bioaktiven Fraktion
verwendbar sein. In anderen Ausführungsformen
kann die Untersuchung der Fraktionen des Eurycoma longifolia-Extraktes
das Bestimmen der hier beschriebenen Verhaltensparameter einschließen.
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In
einer Gruppe der erfindungsgemäßen Ausführungsformen
umfassen die erfindungsgemäßen Präparationen
neben den von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen,
z.B. Fraktionen von Eurycoma longifolia-Extrakten, einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
zur oralen Verabreichung.
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Um
eine orale Verabreichung zu ermöglichen,
können
die von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen mit einem
beliebigen pharmazeutisch verträglichen
Träger
zur oralen Verabreichung vermischt werden. Mit dem Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher
Träger
zur oralen Verabreichung" ist
eine Zusammensetzung gemeint, welche nicht toxisch und für das menschliche
Verdauungssystem nicht schädlich
ist, und die mit von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen
vermischt werden kann, um eine Lösung,
Sirup, Emulsion, Gel oder Feststoff zu bilden. Präparationen
für eine
intravenöse,
intramuskuläre,
subkutane oder allgemein parenterale Verabreichung können auch
durch bekannte Verfahren im Stand der Technik hergestellt werden.
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Ein
Beispiel von Substanzen, die als pharmazeutisch verträgliche Träger zur
oralen Verabreichung dienen können,
sind Zucker wie Laktose, Glukose und Saccharose; Stärke wie
Getreidestärke
und Kartoffelstärke;
Zellulose und deren Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose,
Ehtylcellulose und Celluloseacetat; pulverförmiger Tragacant; Malz; Gelatine;
Kalk; Stearinsäure;
Magnesiumstearat; Kalziumsulfat; vegetative Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl und Getreideöl; Polyole
wie Propylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol;
Polyvinylpyrrolidon; Alginisäure;
pyrogenfreies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Phosphatpufferlösungen;
Kakaobutter; Emulgatoren sowie andere nicht toxische kompatible
Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.
Benetzungsmittel und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat sowie Färbemittel,
Geschmacksstoffe, Arzneistoffträger,
Tablettenzusätze,
Stabilisatoren, Antioxidantien und Konservierungsmittel können ebenfalls
vorhanden sein. Andere kompatible pharmazeutische Zusätze und
Wirkstoffe können
in dem pharmazeutisch verträglichen
Träger
zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten
sein.
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Die
Präparationen
zur oralen Verabreichung können
in Form von Tabletten, Kapseln, weichen oder harten Gelatinekapseln,
Pillen einschließlich
Formulierungen zur verzögerten
oder verlängerten
Freisetzung, dispersiblen Pulvern oder Granulaten, Bonbons, Packungen,
Kapseln aus Stärkemasse,
Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Aerosole (als
Feststoff oder in Flüssigmedium)
und dergleichen vorliegen.
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In
anderen Gruppen von Ausführungsformen
umfassen die erfindungsgemäßen Präparationen
neben den von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen,
z.B. Fraktionen von Eurycoma longifolia-Extrakten, einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
zur topischen Verabreichung. Solche pharmazeutisch verträglichen
Träger
sind im Stand der Technik bekannt und umfassen üblicherweise jede beliebige
gegenwärtig verwendete
und kommerziell erhältliche
dermatologische oder kosmetische Zusammensetzung oder Kombinationen
von gegenwärtig
verwendeten und kommerziell erhältlichen
dermatologischen oder kosmetischen Zusammensetzungen. Daher kann
man einfach eine erhältliche
dermatologische oder kosmetische Zusammensetzung modifizieren, indem
eine von Eurycoma longifolia abgeleitete Zusammensetzung zugegeben
wird und, wenn notwendig, die Verhältnisse der wässrigen
und nicht wässrigen
Bestandteile angepasst werden, um eine für eine topische Verabreichung
geeignete Konsistenz zu erhalten.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger zur topischen Verabreichung" eine Zusammensetzung,
die zur topischen Verabreichung an menschliche Haut durch Aufstreichen
oder Einreiben geeignet ist, ohne Irritationen an der menschlichen
Haut hervorzurufen, und die mit von Eurycoma longifolia abgeleiteten
Zusammensetzungen vermischt werden kann, um eine Lösung, Emulsion, Gel,
Lotion, Salbe, Balsam, Creme oder aufstreichbaren Feststoff oder
Paste zu bilden. Solche pharmazeutisch verträglichen Träger können Weichmacher, oberflächenaktive
Substanzen, Befeuchtungsmittel, Gleitmittel, Verdicker, Abdichtmittel,
bakteriozide Substanzen, perkutan penetrierende Mittel und Konservierungsmittel einschließen. Zusätzlich können verschiedene
kosmetische Mittel wie Duftstoffe und Pigmente in einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger
zur topischen Verabreichung eingeschlossen sein.
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Eine
Ausführungsform,
bei der die Verwendung einer Zusammensetzung zur Behandlung von
sexueller Dysfunktion oder männlicher
Unfruchtbarkeit der hier beschriebenen entspricht, besteht in der
Verabreichung des von Eurycoma longifolia abgeleiteten bioaktiven
Agenz an ein Individuum. Wie hier verwendet, bezeichnet ein Individuum
einen Menschen, einen nicht menschlichen Primaten, Rind, Pferd,
Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze oder Nager. In allen Ausführungsformen
sind menschliche Individuen bevorzugt. In allen Ausführungsformen
sind männliche
Individuen bevorzugt. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch,
der unter Verdacht steht, an einer sexuellen Dysfunktion zu leiden
oder unfruchtbar zu sein oder bei dem eine sexuelle Dysfunktion
oder Unfruchtbarkeit diagnostiziert wurde.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der
Testosteronsynthese, der Testosteronfreisetzung von Hodenzellen,
der Spermienzahl und/oder der Spermienbeweglichkeit offenbart und
verwendet eine Präparation,
die eine von Eurycoma longifolia abgeleitete Zusammensetzung einschließt, die
das bioaktive Agenz umfasst. In einer Ausführungsform kann die Präparation
der von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzung zusammen
mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden, die dem Fachmann bekannt
sind, um die Testosteronsynthese, Testosteronfreisetzung, Spermienzahl
oder Spermienbeweglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise kann die
Anwendung eines Pflasters für
eine langsame Testosteronfreisetzung mit einer gleichzeitigen Verabreichung
der bioaktiven Formulierung von Eurycoma longifolia begleitet sein.
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Die
erfindungsgemäßen bioaktiven
Formulierungen von Eurycoma longifolia werden in wirksamen Mengen,
alleine oder als Cocktail mit anderen Verbindungen verabreicht.
Eine wirksame Menge ist eine Menge, die ausreichend ist, um die
Testosteronsynthese, die Testosteronfreisetzung von der Testis,
die Spermienanzahl oder die Spermienbeweglichkeit zu erhöhen. Die
effektiven Mengen werden natürlich
von der Schwere des zu behandelnden Zustands, den individuellen
Patientenparametern einschließlich
dem Alter, dem physiologischen Zustand, der Größe, dem Gewicht, der gleichzeitigen
Behandlung, der Häufigkeit
der Behandlung und der Art der Verabreichung abhängen. Diese Faktoren sind für den Fachmann
bekannt und können
durch reine Routine-Experimente ermittelt werden. Es ist allgemein
bevorzugt, dass eine Maximaldosis verwendet wird, welche der nach
medizinischer Einschätzung
sichersten Dosis entspricht.
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Im
Allgemeinen liegen die täglichen
Dosen für
aktive Verbindungen bei ungefähr
0,01 gm/kg pro Tag bis 2000 gm/kg pro Tag. Es wird erwartet, dass
die oralen Dosen in dem Bereich von 10 bis 500 gm/kg in einer oder
mehreren Verabreichungen pro Tag die erwünschten Ergebnisse liefern.
Für den
Fall, dass die Antwort in einem Individuum für solche Dosen nicht ausreicht,
können
höhere
Dosen (oder wirksame höhere
Dosen durch eine andere, lokalisierte Verabreichungsroute) bis zu
dem Grad, den der Patient toleriert, eingesetzt werden. Die Dosierungsbereiche
können
zur Behandlung von individuellen Patienten und entsprechend dem
behandelten spezifischen Zustand angepasst werden. Es können mehrere
Dosen pro Tag vorgesehen sein, um geeignete systemische Spiegel
der Verbindungen zu erreichen.
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Es
ist eine Vielzahl von Verabreichungsrouten verfügbar. Der spezifische, ausgewählte Modus
hängt natürlich von
der spezifischen, ausgewählten
Formulierung, der Schwere des zu behandelnden Zustandes und der
für die
therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosierung ab. Die erfindungsgemäßen Verfahren
können,
allgemein gesprochen, unter Verwendung eines beliebigen Verabreichungsmodus,
der medizinisch annehmbar ist, durchgeführt werden, das heißt jeglicher
Modus, der wirksame Spiegel der aktiven Verbindungen erzeugt, ohne
klinisch nicht akzeptable Nebenwirkungen hervorzurufen. Solche Verabreichungsmodi
umfassen orale, rektale, topische, nasale, transdermale oder parenterale
Routen. Der Ausdruck "parenteral" umfasst eine subkutane,
intravenöse,
intramuskuläre
Verabreichung oder Infusion. Intravenöse und intramuskuläre Routen
sind für
eine langfristige Therapie und Prophylaxe nicht besonders geeignet.
In wirksamen Notfallsituationen ist eine intravenöse Verabreichung
bevorzugt. Eine orale Verabreichung wird aufgrund des Befindens des
Patienten sowie des Dosierungsplanes für eine prophylaktische Behandlung
bevorzugt.
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Die
Zusammensetzungen können
leicht in einer Einheitsdosisform vorliegen und durch bekannte Verfahren
im Stand der Technik der Pharmazie hergestellt werden. Im Allgemeinen
werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem die aktiven Verbindungen
gleichmäßig mit
einem Flüssigkeitsträger, einem
fein aufgeteilten Festträger
oder beiden zusammengebracht werden und anschließend das Produkt, wenn notwendig, geformt
wird.
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Die
für eine
orale Verabreichung geeigneten Zusammensetzungen können als
diskrete Einheiten vorliegen, wie z.B. Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse,
Tabletten oder Bonbons, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge
der aktiven Verbindung enthält.
Andere Zusammensetzungen umfassen Suspensionen in wässrigen
Flüssigkeiten
oder nicht wässrigen
Flüssigkeiten
wie z.B. Sirup, Elixier oder Emulsion.
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Andere
Abgabesysteme können
zeitabhängige
Verzögerungs-
oder Erhaltungsabgabesysteme umfassen. Solche Systeme können wiederholte
Verabreichungen der wirksamen Verbindungen der Erfindung vermeiden,
was für
das Individuum und den Arzt leichter ist. Es sind viele Arten von
freisetzenden Abgabesystemen verfügbar und dem Fachmann bekannt.
Diese umfassen Polymer-basierende Systeme wie z.B. Polymilchsäure und
Polyglycolsäure,
Polyanhydride und Polycaprolacton; nicht-polymere Systeme, die Lipide
sind einschließlich
Sterole wie z.B. Cholesterol, Cholesterol-Ester und Fettsäuren oder
neutrale Fette, wie z.B. Mono-, Di- und Triglyceride; Hydrogel-Freisetzungssysteme,
silastische Systeme; Peptid-basierende Systeme; Wachsbeschichtungen,
gepresste Tabletten unter Verwendung konventioneller Bindestoffe
und Arzneimittelstoffträger,
teilweise fusionierte Implantate und dergleichen. Spezifische Beispiele
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: (a) Erosionalsysteme,
in denen das Polysaccharid in einer Form innerhalb einer Matrix
enthalten ist, beispielsweise beschrieben in den US-Patentnummern 4,452,775
(Kent); 4,667,014 (Nestor et al.); und 4,748,034 und 5,239,660 (Leonard),
und (b) Diffusionssysteme, in denen ein aktiver Bestandteil bei
einer kontrollierten Rate durch ein Polymer dringt, beispielsweise
beschrieben in den US-Patentnummern 3,832,253 (Higuchi et al.) und
3,854,480 (Zaffaroni). Zusätzlich
kann ein Pumpen-basiertes Hardware-Abgabesystem verwendet werden,
von denen einige zur Implantation angepasst sind.
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Beispiele
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Beispiel 1: Isolierung
von bioaktiven Fraktionen von Eurycoma longifolia
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Einleitung
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Partiell
aufgereinigte Extrakte von Wurzeln aus Eurycoma longifolia wurden
durch mehrere Aufreinigungsschritte erhalten, einschließlich Reflux
und zwei Runden einer Größenauschlusschromatographie.
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Verfahren
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Der
Ausgangsschritt bei der Isolierung einer bioaktiven Fraktion von
Eurycoma longifolia bestand in der Pulverisierung von 500 gm E.
longifolia-Wurzel, gefolgt von Kochen für 8 Stunden in 8 l destilliertem
Wasser. Das gekochte Gemisch wurde dann zentrifugiert, das Pellet
verworfen und der geklärte Überstand
gesammelt und gefriergetrocknet, um ungefähr 30 gm zu ergeben. Diese
Fraktion wurde als "FDAE" identifiziert und ein
Teil des FDAE wurde für
eine weitere Aufreinigung und den in den Beispielen 3 und 4 gezeigten
Tests zurückgestellt.
Von den verbleibenden gefriergetrockneten FDAE-Pellets wurden 15
gm in 50 ml destilliertem Wasser resuspendiert und eine Bio-Gel
P-2-Säule
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mit einem internen Durchmesser
von 45 mm und einem Bettvolumen von 280 ml geladen und von der Säule mit
destilliertem Wasser eluiert. Das Eluat wurde in zwei Fraktionen
gesammelt, die anhand der Farbe unterschieden werden konnten, wobei
die Anfangsfraktion in brauner Farbe und die zweite Fraktion in
fluoreszierendem Gelb vorlag. Die Anfangsfraktion (Fraktion 1) wurde
gefriergetrocknet.
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Von
der gefriergetrockneten Fraktion wurden 1,5 gm in 10–15 ml destilliertem
Wasser resuspendiert und auf eine 20 × 800 mm, 260 ml Bettvolumen
Bio-Gel P-4-Säule
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) geladen und mit destilliertem
Wasser eluiert. Basierend auf der unterschiedlichen Verfärbung wurden
4 Fraktionen des Eluats gesammelt, gefriergetrocknet und zur Messung
der Bioaktivität
verwendet. 1 fasst das Aufreinigungsschema
zusammen.
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Ergebnisse
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Die
dritte eluierte Fraktion wurde als "F3AE" bezeichnet.
Ein Teil von F3AE wurde in den im Beispiel 2 gezeigten Bioaktivitätsexperimenten
eingesetzt, und ein Teil von F3AE wurde wie in Beispiel 3 beschrieben weiter
aufgereinigt.
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Beispiel 2: Biotest von
bioaktiven Fraktionen von Aufreinigungsprozeduren für Eurycoma
longifolia
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Einleitung
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Um
die Bioaktivität
der dritten eluierten Fraktion F3AE zu untersuchen, wurde ein Teil
der eluierten Fraktion unter Verwendung von Standard-Testosteron-
und Spermienuntersuchungs-Verfahren
untersucht.
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Verfahren
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Unter
Verwendung von Standardverfahren wurden In-vivo-Radioimmunotest-Messungen
von Testosteron unter Verwendung von Plasma aus Test- und Kontrolltieren
durchgeführt.
Zusätzlich
wurden In-Vitro-Hormontests unter Verwendung von standardgemäßen Gas-Chromatographie-Verfahren
durchgeführt.
Eine Spermienanalyse zur Konzentration und Beweglichkeit wurde unter
Verwendung von Standardverfahren durchgeführt.
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Ergebnisse
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Die
Ergebnisse des Biotests sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle
1: Ergebnisse der In-vivo- und In-Vitro-Bioaktivitäts-Tests
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Beispiel 3: Alternatives
Verfahren zur Isolierung von bioaktiven Fraktionen von Eurycoma
longifolia
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Einleitung
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Entsprechend
der Anfangsauftrennung der Fraktionen von Eurycoma longifolia (s.
Beispiel 1). Es wurde ein Teil von FDAE (s. Beispiel 1) und ein
Teil der bioaktiven Fraktion F3AE, die von der E. longifolia-Wurzel isoliert
wurde (s. Beispiel 2) unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC-Verfahren aufgereinigt
und unter Verwendung von Aminosäureanalyse,
Zuckeranalyse und Massenspektroskopieverfahren charakterisiert.
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Verfahren
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Jede
Fraktion FDAE oder Fraktion F3AE (s. Beispiel 1 und 2, Verfahrensabschnitte)
wurde auf eine Rainin-C4-Säule
auf einem Rainin-HPLC-System (Rainin Instrument Co., Wob urn, MA)
für eine
Umkehrphasenauftrennung geladen. Die sechzigminütige HPLC-Aufreinigung wurde
bei einer konstanten Durchflussrate von 1 ml/min laufengelassen.
Es wurden jeweils FDAE oder F3AE mit ungefähr 1 gm/ml destilliertem Wasser zum
Zeitpunkt 0 initiiert. Die mobile Phase betrug 100% 0,1 Trifluoressigsäure (TFA)
für die
ersten 10 Minuten und wurde dann durch 100% 0,1% TFA auf 100% Acetonitril über die
verbleibenden 50 Minuten des Durchlaufes ausgewechselt. Die Fraktionen
wurden über
den gesamten Durchlauf gesammelt, und das Eluat wurde anhand einer
UV-Detektion bei 245 nm beobachtet und anschließend gefriergetrocknet. 3 zeigt
chromatographische Spuren der Auftrennungen von dem FDAE-Durchlauf (A) und
dem F3AE-Durchlauf (B). Ein einzelner, mit dem "*" bezeichneter
Peak in der unteren Spur in 3 entspricht
der in Beispiel 2 charakterisierten bioaktiven Fraktion. Der Gehalt
des einzelnen Peaks, der nach 9 Minuten eluiert wurde, wurde einer
Peptidanalyse und einer Zuckeranalyse unter Verwendung von Standardverfahren
unterzogen. Es wurde auch eine Massenspektroskopieanalyse mit der
9-Minuten-Fraktion entsprechend den Anweisungen des Herstellers
unter Verwendung einer oberflächenverstärkten Laserdesorptionsionisierung
durchgeführt
(SELDI; z.B. Ciphergen, Palo Alto, CA).
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Ergebnisse
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Die
Einzelpeakelution nach 9 Minuten wurde, basierend auf den in Beispiel
2 beschriebenen Biotests als bioaktiv bestimmt. Der Peak wurde anhand
mehrerer Verfahren analysiert, um dessen Zusammensetzung zu bestimmen.
Die nach 9 Minuten eluierte Verbindung bestand aus ungefähr 33 bis
36 Peptiden und war mit ungefähr
mit 3 Arten von Zuckern verbunden einschl.: Xylose, Glucose und
Fucose, und besaß eine
Masse von ungefähr
4.300 Dalton.
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Literaturstellen
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- Chan K. L., C. Y. Choo, H. Morita und H. Itokawa (1988),
High performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis
of Eurycoma longifolia, Planta Medica 64: 741–745.
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New York.
- Winter, S. J., Medhamurthy, V. L Gay, and T. M. Plant (1991)
A comparison of moment to moment and diurnal changes in circulating
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