DE3915929A1 - Polysaccharid mit immunstimulierender wirkung, verfahren zu dessen gewinnung und arzneimittel enthaltend dieses polysaccharid - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu dessen Gewinnung sowie Arzneimittel enthaltend dieses Poly­ saccharid.

Die Immunstimulation als therapeutisches Konzept ist in der Medizin seit langem bekannt. Im allgemeinen versteht man darunter die Verabreichung von Substanzen, die selbst nur eine geringe bzw. überhaupt keine antigene Wirkung aufweisen, die jedoch in der Lage sind, primär auf unspezifische Art und Weise die körpereigenen Abwehrmechanismen zu induzieren. Nach heutigen Erkenntnissen ist eine Vielzahl von Stoffen in der Lage, die Immunabwehr zu stimulieren, wobei insbesondere verschiedene Mineralien, zum Beispiel Al(OH)₃, MgSO₄, Beryllium, pflanzliche Öle mit oder ohne Zusatz von Mykobakterien sowie eine Reihe von pflanzlichen Wirkstoff­ gruppen wie Alkaloide, Sesqui- und Diterpenverbindungen, Chinone und Polysaccharide zu nennen sind. Der gesamte Komplex der Immunstimulierung wird ausführlich beschrieben von zum Beispiel Chedid, L., et al. "Immunstimulation", Springer-Verlag , Heidelberg/New York, 1980; Heidelberger, M., "Structure and Immunological Specificity of Poly­ saccharides"; Fortschritte der chem. org. Naturst. 42, 288 (1982); Drews, J., "Immunpharmakologie", Springer Verlag, 1986, G. Dannhardt, Therapeutikon 11, November 1988, 653; "Immunopotention": Ciba Foundation Symposium, Elsevier, Amsterdam 1973, "Immunopharmacology of Infectious Diseases, Ed. J.A. Majde, Alan R. Liss, New York, 1987.

Die genaue Wirkungsweise immunstimulierender Substanzen konnte in den meisten Fällen bis heute nicht endgültig geklärt werden. Generell zeigen diese Substanzen unter anderem einen Einfluß auf die Funktion und/oder Proliferation von immunkompetenten Zellen, wobei sie jedoch keine Ge­ dächtnisreaktion hinterlassen. Dies bedeutet, daß als Wirkungsziele für die immunstimulierenden Substanzen die Makrophagen und Granulocyten sowie T- und B-Lymphozyten im Vordergrund stehen. Die Wirkung kann auf direktem oder indirektem Wege, zum Beispiel über das Komplementsystem oder über Lymphozyten, über die Produktion von Kininen, zum Beispiel Interferon, Interleukine, Tumor-Nekrose-Faktor, Colony stimulation factor sowie über eine Steigerung von Makro- und Mikrophagocytose erfolgen. Wegen der Ver­ flechtung von unspezifischen und spezifischen Abwehrmechanismen ist dabei mit Kaskadeneffekten und der gleichzeitigen Beeinflussung mehrerer Ab­ wehrmechanismen zu rechnen.

In der Medizin ergeben sich als bevorzugte Anwendungsgebiete für die Immunstimulation vor allem die Therapie von Mischinfektionen, chronisch­ persistierenden, chemotherapieresistenten, bakteriellen und viralen Infektionen, die Prophylaxe von opportunistischen Infektionen bei Risikopatienten, die Therapie der malignen Erkrankungen und in gewissem Umfang auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Immunstimulantien können auch bei der Zytostatika-Therapie zur teilweisen Kompensation der damit verbundenen Immunsuppression eingesetzt werden.

Es ist bekannt, daß verschiedene Polysaccharide, insbesondere aus Pilzen und höheren Pflanzen, in der Lage sind, die Aktivität des Immunsystems zu steigern. Zu den bekanntesten Immunstimulantien aus dieser Reihe gehören die α-1,3/1,6-Glukane Lentinan und Schizophyllan (vgl. "Immunpharmacology of Infectious Diseases", Springer Verlag, 1986).

Aus der EP-A 02 46 069 ist ein wäßriger Extrakt aus Pflanzen der Gattung Nerium bekannt, der die Zellvermehrung hemmende Eigenschaften aufweist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Poly­ saccharid mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu dessen Gewinnung und ein Arzneimittel, enthaltend dieses Polysaccharid zur Verfügung zu­ stellen.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid weist folgende allgemeine Formel auf:

in der der Rest R einen mittleren Methylierungsgrad von etwa 90% aufweist und im übrigen unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkalikation oder Erd­ alkalikation bedeutet.

Die GC-MS Ergebnisse der Permethylierungsanalysen zeigten, daß die Poly­ saccharidkette aus α (1→4) verknüpften D-Galakturonsäureeinheiten be­ steht, deren Carboxylgruppen zu ca. 90% methyliert sind. Außer α (1→4) glykosidischen Bindungen konnten keine anderen Bindungsverhältnisse nach­ gewiesen werden. Das heißt: Die Polysaccharidkette ist linear aufgebaut und besitzt keine Verzweigungen.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid setzt sich im Gegensatz zu den bisher bekannten Lentinan- und Schizophyllan-Polysacchariden praktisch aus­ schließlich aus α (1→4) verknüpften D-Galakturonsäureeinheiten zusammen, deren Carboxylgruppen zu ca. 90% methyliert sind. Das Molekular­ gewicht des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde mit 30 000 bis 40 000 D, bevorzugt mit ca. 35 000 D, in der HPLC-Gelpermeationschromatographie bestimmt.

Die Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharids erfolgte durch in vitro Verfahren, die die Leistungs­ fähigkeit des mononukleären Systems, sowie die Stimulierbarkeit vom T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten. Bei diesen Untersuchungen wurde über­ raschend gefunden, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid insbesondere die Sekretion des Tumor-Nekrose-Faktors deutlich zu steigern vermag.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wird bevorzugt aus Blättern des Oleanderbaumes gewonnen. Es kann jedoch auch über Gewebekulturen, wie in der DE-OS 35 41 945 für Echinacea beschrieben, gewonnen werden.

Das Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Polysaccharids besteht im wesentlichen darin, daß man das zerkleinerte Ausgangsmaterial mit der ca. 5fachen Menge destillierten Wassers für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden kocht, anschließend die festen Teile abfiltriert, den Ex­ trakt auf mindestens Raumtemperatur abkühlen läßt und nochmals filtriert.

Man erhält aus dem Extrakt eine Polysaccharidrohfraktion durch Fällung mit Alkohol, über Komplexbildung mit Schwermetallsalzen oder quartären Ammoniumsalzen. Vorzugsweise fällt man die Polysaccharide mit Ethanol, den man im Verhältnis von 3 : 1 bis 1 : 3, vorzugsweise im Verhältnis 1 : 1 zusetzt. Nach Stehenlassen für mindestens 12 Stunden filtriert man ab, nimmt den Rückstand in destilliertem Wasser auf und wiederholt die Alkoholfällung zweimal.

Den letzten Rückstand, den man wiederum in Wasser aufnimmt kann man gege­ benenfalls lyophilisieren. Auf diese Weise erhält man eine Rohfraktion. Diese Rohfraktion trennt man durch herkömmliche Gelchromatographiever­ fahren, zum Beispiel unter Verwendung einer Biogel® P-60 Säule, in nieder- und hochmolekulare Bestandteile auf.

Aus der hochmolekularen Fraktion isoliert man anschließend durch lonen­ austauschchromatographie, zum Beispiel unter Verwendung einer DEAE Sepharose® C 6-B Säule, durch Elution mit einem 0-1 m NaCl Gradienten das erfindungsgemäße Polysaccharid bei einer NaCl Konzentration von ca. 0,2 m.

Beispiel

Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharides aus Nerium oleander Blättern

Die Ausbeute an erfindungsgemäßem Polysaccharid kann nach Herkunft und Erntezeit des Ausgangsmaterials variieren.

Alle im folgenden beschriebenen Arbeiten wurden, wenn nicht anders ange­ geben, bei 4°C ausgeführt.

Die Blätter des Nerium oleander Baumes wurden zerkleinert und in der ca. 5fachen Menge destillierten Wassers 3 Stunden lang gekocht. Die festen Anteile wurden abfiltriert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein weiteres mal filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt. Diese Lösung wurde für 12 Stunden stehengelassen, die gebildete Gel­ suspension abfiltriert und der Rückstand in destilliertem Wasser aufge­ nommen. Diese Lösung wurde wieder mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt und für 12 Stunden stehengelassen. Die gebildete Gelsuspension wurde abfiltriert, der Rückstand in destilliertem Wasser gelöst und ein drittes mal mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt. Nach Stehenlassen für mindestens 12 Stunden wurde die Gelsuspension abfiltriert, der Rückstand in destilliertem Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Auf diese Weise wurde ein Roh­ extrakt erhalten.

Zur weiteren Auftrennung des Rohextrakts wurden die niedermolekularen Substanzen von den hochmolekularen Substanzen schonend getrennt. Dafür wurde der Rohextrakt in Wasser gelöst, die Lösung zentrifugiert und der Überstand auf eine Biogel P-60-Säule gegeben und mit destilliertem Wasser eluiert, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden. Die erste Fraktion enthielt ein Polysaccharidgemisch vom Molekulargewichtsbereich 17 000 bis 120 000 D. Die zweite Fraktion (MG ca. < 10 000 D) enthielt niedermole­ kulare Poly- und Oligosaccharide und andere Substanzen.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde durch Chromatographie der hoch­ molekularen Fraktion an einer Anionenaustauscher DEAE Sepharose® CL 6 B Säule erhalten.

Die hochmolekulare Fraktion wurde in Wasser gelöst und auf die mit DEAE Sepharose® gefüllte Säule gegeben und mit einem 0-1 m NaCl Gradienten eluiert. Dabei eluierte bei ca. 0,2 m NaCl eine Polysaccharidfraktion mit positiver optischer Drehung von 38,12° (1 mg/ml H₂O, Raumtemperatur). Für das Polysaccharid dieser Fraktion wurde die oben angegebene Struktur ermittelt.

Die Struktur des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde durch Methanol- Bestimmung und ¹³C-NMR-Spektroskopie untersucht. In diesen Unter­ suchungen wurde gefunden, daß das Polysaccharid nur aus D-Galakturon­ säureeinheiten besteht, die zu ca. 90% methyliert sind.

Die Permethylierungsanalyse lieferte die Bindungsverhältnisse des Galakturonans (Hakomori, S.I., J. Biochem. (Tokyo) 55, 205 (1964)).

Zur weiteren Analyse dieses Polysaccharids wurde zunächst das Molekular­ gewicht bestimmt.

Die Molekulargewichtsbestimmung erfolgt mittels HPLC-Gelpermeations­ chromatographie (HP-GPC). Verwendetes HP-GPC-System:
µ-Bondagel E 125 + 5 Bondagel E 500 (Fa. Waters).
Puffersystem: 0,5 m Phosphatpuffer, pH 6

Als Vergleichssubstanzen wurden Dextran T 10, T 40, T 70, T 110, T 2000 und Glucose verwendet.

In dieser Methode wurde für das erfindungsgemäße Polysaccharid ein Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000 D, vorzugsweise von ca. 35 000 D ermittelt.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß das Molekulargewicht in Abhängig­ keit der angewandten Untersuchungsmethoden variieren kann.

Durch den Carbazoltest (Bitter, T. und Muir, H.M., Analyt. Biochem. 4, 330 (1962) wurde der Uronsäuregehalt des erfindungsgemäßen Polysaccharids bestimmt.

Zur Bestimmung der Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde dieses mit TFA versetzt und 2 Stunden lang bei 121°C im Trocken­ schrank erhitzt. Nach der Entfernung von TFA wurde eine Dünnschicht­ chromatographie durchgeführt.

Adsorbens: Kieselgel G F₂₅₄-Fertigplatten für die Nano-DC(HPTLC) 20×20 cm (Fa. Merck)
Laufmittelsystem: n-Butanol-Aceton-Essigsäure-Wasser (35 : 35 : 10 : 20)
Detektion: Anilindiphenylaminophosphorsäure
Als Ergebnis wurde gefunden, daß nur D-Galacturonsäure nachweisbar ist.

Die α (1→4) Verknüpfung der D-Galakturonsäure wurde zusätzlich mit Pektinase untersucht. Das Polysaccharid wurde in destilliertem Wasser gelöst und mit Pektinase 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde mittels Dünnschichtchromatographie die freigesetzte Galakturonsäure nachgewiesen.

Die pharmakologische Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde in anerkannten in vitro Tests untersucht. Da es bislang keine spezifischen Testmethoden zur Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung von Substanzen gibt, verwendet man bis heute primär solche in vitro- und in vivo-Verfahren, die den Einfluß von Verbindungen oder Pflanzen­ extrakten auf den Funktionszustand und die Leistungsfähigkeit des mono­ nukleären Systems, sowie die Stimulierbarkeit von T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.

Bei diesen Untersuchungen wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid insbesondere im Tumor-Nekrose Faktor Freisetzungstest wirksam ist.

TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) ist ein Protein, das beim Menschen aus 157 Aminosäuren besteht. Es wird bei Induktion in Makrophagen synthetisiert und in die Blutbahn abgegeben. TNF stimuliert das Abwehrsystem und tötet die Tumorzellen ab. Bei dem TNF-Test wird die zu testende Substanz den Versuchstieren injiziert. Danach wird im Blut der Versuchstiere die TNF-Konzentration anhand der nekrotischen Wirkung auf Tumorzellinien gemessen und als Parameter für die stimulatorische Wirkung der Test­ substanzen verwendet.

Der Tumor-Nekrose-Faktor-Test (TNF-T) wurde nach Stimpl, M., Proksch, A., Wagner, H. und Lohmann-Matthes, M.L. Infection and Immunity 46, 845 (1984), durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dar­ gestellt.

Tabelle 3

TNF-T-Ergebnisse

Wie aus der Tabelle entnehmbar ist, bewirkt das erfindungsgemäße Poly­ saccharid eine deutliche Steigerung der TNF Konzentration, d.h. es induziert in den Makrophagen die Synthese des TNF.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid kann entweder getrennt als Rein­ substanz oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht werden, wenngleich es im allgemeinen wirksamer ist, die Verbindung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung zu verabreichen. Vorzugsweise liegt die Zubereitung in Form einer Formulierung vor, die

• 1) das erfindungsgemäße Polysaccharid allein enthält und
• 2) eines oder mehrere geeignete Bindemittel, Trägermaterialien und/oder weitere Hilfsstoffe und
• 3) gegebenenfalls weitere therapeutische Wirkstoffe oder Adjuvantien aufweist.

Die Trägermaterialien, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe müssen pharma­ zeutisch und pharmakologisch verträglich sein, so daß sie mit den anderen Bestandteilen der Zubereitung vereinbar sind und keine nachteilige Wirkung auf den behandelten Organismus ausüben.

Die Formulierungen schließen jene ein, die für die parenterale (ein­ schließlich subkutane, intradermale, intramuskuläre und intravenöse) oder orale Verabreichung geeignet sind, wenngleich der am besten geeignete Verabreichungsweg von dem Zustand des Patienten abhängt.

Die Herstellung der Formulierungen erfolgt unter Anwendung von an sich auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Methoden. Alle Methoden schließen den Schritt ein, das erfindungsgemäße Polysaccharid (d.h. den Wirkstoff) mit dem Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe, wobei letztere einen zusätzlichen Bestandteil darstellen, zu vermischen bzw. zu ver­ einigen. lm allgemeinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, daß man den Wirkstoff mit den flüssigen Trägermaterialien oder den fein­ teiligen Trägermaterialien oder beiden innig vermischt und dann erforder­ lichenfalls das erhaltene Produkt in die gewünschte Verabreichungsform bringt. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die für die orale Verab­ reichung geeignet sind, können in Form von diskreten Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes enthalten, sowie in Form von Pulvern oder Granulaten, in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wäßrigen oder nicht wäßrigen Flüssigkeit, oder in Form einer Emulsion zum Beispiel in Form von Liposomen, vorliegen.

Der Wirkstoff kann auch in Form eines Bolus oder einer Paste vorliegen.

Die Tabletten kann man durch Pressen oder Vergießen herstellen, wobei man gegebenenfalls eines oder mehrere der üblichen Hilfsmittel zugibt.

Die für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen schließen sterile Injektionslösungen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostostatika und gelöste Materialen, die die Formulierung im Hinblick auf den menschlichen Organismus isotonisch machen, ein. Weiter kann das erfindungsgemäße Polysaccharid in Form von sterilen Suspensionen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können, vorliegen. Die Formulierungen können als Einzel- oder Mehrfach-Dosis vorliegen, bei­ spielsweise in Form von Ampullen oder dicht verschlossenen Fläschchen und können auch in lyophilisierter Form gelagert werden, so daß es lediglich erforderlich ist, bei notwendiger Verabreichung steriles flüssiges Trägermaterial, beispielsweise für Injektionszwecke geeignetes Wasser, unmittelbar vor Verwendung zuzugeben. Die unmittelbar vor der Verab­ reichung bereiteten Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilem Pulver, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art bereitet werden.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können neben den vorhin genannten Bestandteilen andere für die in Rede stehenden Formulierungen geeignete Bestandteile enthalten. So können beispielsweise die auf oralem Weg zu verabreichenden pharmazeutischen Zubereitungen Aromastoffe enthalten.

Die zur Applikation geeigneten Mengen des Wirkstoffes variieren in Ab­ hängigkeit vom jeweiligen Therapiegebiet. Im allgemeinen enthält eine Einzeldosis 5 bis 95% aktiven Bestandteil. Dies entspricht bei einer einmaligen Applikation zum Beispiel 50 µg bis 100 mg pro Dosis/Mensch parenteral und 1 mg bis 500 mg peroral. Diese Dosierung kann jedoch in Abhängigkeit des Verabreichungsweges, des Patientenzustandes und des Therapiegebietes in breiten Grenzen variieren.

Claims (13)

1. Polysaccharid der allgemeinen Formel: in der der Rest R einen mittleren Methylierungsgrad von etwa 90% aufweist und im übrigen unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkali- oder Erdalkalikation bedeutet und das ein Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000 D, bestimmt in der HPLC-Gelpermeationschromato­ graphie, aufweist.

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, in dem mindestens 80%, vorzugsweise etwa 90% der Carboxylgruppen methyliert sind.

3. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es aus Pflanzen der Gattung Nerium erhalten wurde.

4. Pharmazeutische Zubereitung mit immunstimulierender Wirkung, ent­ haltend als aktiven Bestandteil ein Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Verbindung mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen.

5. Verwendung eines Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Immunstimulans.

6. Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharids nach einem der An­ sprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man

• a) Teile des Nerium oleander Baumes in einem polaren anorganischen Lösungsmittel kocht;
• b) die Festteile abfiltriert, nach Abkühlen bei Raumtemperatur wieder filtriert, die Polysaccharide ausfällt, den Niederschlag abfiltriert und in einem polaren anorganischen Lösungsmittel aufnimmt und diesen Rohextrakt gegebenenfalls lyophilisiert;
• c) den Rohextrakt durch Gelfiltration in eine hoch- und nieder­ molekulare Fraktion auftrennt und das saure Polysaccharid aus der hochmolekularen Fraktion durch Ionenaustauschchromatographie und Elution mit einem Salzgradienten eluiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man in Stufe a) als polares anorganisches Lösungsmittel destilliertes Wasser verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man die festen Teile in etwa der 5fachen Menge destilliertem Wasser kocht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem man das Ausgangs­ material für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden, kocht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem man die Polysaccharide in Stufe b) durch Zusatz von Ethanol (96%) im Verhältnis 1 : 1 ausfällt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem man die Ethanolfällung zweimal wiederholt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, bei dem man in Stufe c) die Elution mit einem 0-1 m NaCl Gradienten durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man die Blätter von Nerium oleander als Ausgangsmaterial verwendet.