DE4001756A1

DE4001756A1 - Polysaccharidgemisch mit immunstimulierender und antiproliferativer wirkung, verfahren zu dessen gewinnung und dieses enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE4001756A1
Application number: DE19904001756
Authority: DE
Inventors: Hueseyin Ziya Prof Dr Oezel; Can Baser Kemal Prof D Huesnue; Ismail Dr Carbik; Hildebert Prof Dr Wagner
Original assignee: CARBIK ISMAIL DR DOZ
Current assignee: CARBIK ISMAIL DR DOZ
Priority date: 1990-01-22
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1991-07-25

Description

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharidgemisch mit immunstimulierender Wirkung aus Pflanzen der Gattung Nerium oleander, dessen Gewinnung und ein Arzneimittel enthaltend dieses Polysaccharidgemisch.

Die Immunstimulation als therapeutisches Konzept ist in der Medizin seit langem bekannt. Im allgemeinen versteht man darunter die Verabreichung von Substanzen, die selbst nur eine geringe bzw. überhaupt keine antigene Wirkung aufweisen, die jedoch in der Lage sind primär auf unspezifische Art und Weise die körpereigenen Abwehrmechanismen zu induzieren. Nach heutigen Erkenntnissen ist eine Vielzahl von Stoffen in der Lage, die Immunabwehr zu stimulieren, wobei insbesondere verschiedene Mineralien, zum Beispiel Al(OH)₃, MgSO₄, Beryllium, pflanzliche Öle mit oder ohne Zusatz von Mykobakterien sowie eine Reihe von pflanzlichen Wirkstoff gruppen wie Alkaloide, Sesqui- und Diterpenverbindungen, Chinone und Polysaccharide zu nennen sind. Der gesamte Komplex der Immunstimulierung wird ausführlich beschrieben von zum Beispiel Chedid, L., et al. "Immun stimulation", Springer-Verlag , Heidelberg/New York, 1980; Heidelberger, M., "Structure and Immunological Specificity of Polysaccharides"; Fort schritte der chem. org. Naturst. 42, 288 (1982); Drews, J., "Immunpharma kologie", Springer Verlag, 1986, G. Dannhardt, Therapeutikon 11, November 1988, 653; "Immunopotention" Ciba Foundation Symposium, Elsevier, Amsterdam 1973, "Immunopharmacology of Infectious Diseases", Ed. J.A. Majde, Alan R. Liss, New York, 1987.

Die genaue Wirkungsweise immunstimulierender Substanzen konnte in den meisten Fällen bis heute nicht endgültig geklärt werden. Generell zeigen diese Substanzen unter anderem einen Einfluß auf die Funktion und/oder Proliferation von immunkompetenten Zellen, wobei sie jedoch keine Ge dächtnisreaktion hinterlassen. Dies bedeutet, daß als Wirkungsziele für die immunstimulierenden Substanzen die Makrophagen und Granulocyten sowie T und B-Lymphozyten im Vordergrund stehen. Die Wirkung kann auf direktem oder indirektem Wege, zum Beispiel über das Komplementsystem oder über Lymphozyten, über die Produktion von Kininen, zum Beispiel Interferon, Interleukine, Tumor-Nekrose-Faktor, Colony stimulation factor und andere, sowie über eine Steigerung von Makro- und Mikrophagocytose erfolgen.

Wegen der Verflechtung von unspezifischen und spezifischen Abwehrmecha nismen ist dabei mit Kaskadeneffekten und der gleichzeitigen Beein flussung mehrerer Abwehrmechanismen zu rechnen.

In der Medizin ergeben sich als bevorzugte Anwendungsgebiete für die Immunstimulation vor allem die Therapie von Mischinfektionen, chronisch persistierenden, chemotherapieresistenten, bakteriellen und viralen Infektionen, die Prophylaxe von opportunistischen Infektionen bei Risiko patienten, die Therapie der malignen Erkrankungen und in gewissem Umfang auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Immunstimulantien können auch bei der Zytostatika-Therapie zur teilweisen Kompensation der damit verbundenen Immunsuppression eingesetzt werden.

Es ist bekannt, daß verschiedene Polysaccharide, insbesondere aus Pilzen und höheren Pflanzen, in der Lage sind die Aktivität des Immunsystems zu steigern. Zu den bekanntesten Immunstimulantien aus dieser Reihe gehören die α-1,3/1,6-Glukane Lentinan und Schizophyllan, vergleiche zum Bei spiel "Immunopharmacology of Infectious Diseases", Springer Verlag 1986.

Beide Polysaccharide sind zur adjuvanten Tumortherapie bereits in Ge brauch. Ihre antitumorale Wirkung wird mit einer Immuninduktion erklärt.

Aus der EP-A 02 46 069 ist ein wäßriger Extrakt aus Pflanzen der Gattung Nerium mit proliferationshemmenden Eigenschaften bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es neue Polysaccharide mit immun stimulierender bzw. antitumoraler Wirkung, Verfahren zu deren Gewinnung und ein Arzneimittel enthaltend diese Polysaccharide zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise hat die Anmelderin gefunden, daß aus den Blättern und Stengeln des Nerium oleander-Baumes ein niedermolekulares Polysaccharid gemisch mit immunstimulierender Aktivität isoliert werden kann.

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Polysaccharidgemisches wurde mit etwa 2500 bis 12 000 D in der HPLC-Gelpermeationschromatographie er mittelt und liegt damit deutlich unter dem Molekulargewicht (ca. 20 000 D) der bislang bekannten Polysaccharide mit immunstimulierender Wirkung.

Die Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharidgemisches erfolgte durch in vitro-Verfahren, die die Leistungsfähigkeit des mononukleären Systems, sowie die Stimulierbarkeit von T und B-Lymphozyten zu messen gestatten.

Bei diesen Untersuchungen wurde überraschend gefunden, daß das er findungsgemäße Polysaccharidgemisch die Granulocytenphagocytose, die Lymphozytentransformation und insbesondere die Sekretion des Tumor- Nekrose-Faktors deutlich zu steigern vermag. Der Tumor-Nekrose-Faktor wird von den Makrophagen bei Induktion gebildet und in die Blutbahn abgegeben. Er spielt in der Tumorabwehr eine wichtige Rolle.

Das erfindungsgemäße Polysaccharidgemisch, das man aus dem wäßrigen Extrakt der Pflanze Nerium oleander erhält, enthält drei Unterfraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts und unterschiedlicher Zusammen setzung.

Als Ausgangsmaterial zur Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharid gemisches sind Stengel und Blätter des Oleander-Baumes (Nerium oleander) geeignet. Vorzugsweise verwendet man die Blätter.

Das Verfahren zur Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharidgemisches besteht im wesentlichen darin, daß man das zerkleinerte Ausgangsmaterial mit der ca. 5fachen Menge destillierten Wasser, für 2 bis 4, vorzugs weise 2,5 bis 3 Stunden kocht, anschließend die festen Teile abfiltriert, den Extrakt auf Raumtemperatur abkühlen läßt und nochmals filtriert. Das gefriergetrocknete Filtrat wird in H₂O dest. aufgenommen und gegen H₂O dest. (Ausschlußgrenze ca. 10 000 D) dialysiert. Das gefrierge trocknete Dialysat behandelt man mit Alkohol und nach Zentrifugation wird der Niederschlag mit bekannten Verfahren der Gelchromatographie weiter aufgetrennt.

Beispiel

Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharidgemisches aus Nerium oleander-Blättern.

Die Ausbeute variiert nach Herkunft und Erntezeit des Ausgangsmaterials. Alle im folgenden beschriebenen Arbeiten wurden, wenn nicht anders ange geben, bei 4°C ausgeführt.

Die Blätter des Nerium oleander-Baumes wurden zerkleinert und in der ca. 5fachen Menge destilliertem Wasser ca. 3 Stunden lang gekocht. An schließend wurden die festen Anteile abfiltriert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein weiteres Mal filtriert. Das Filtrat wurde lyophilisiert, der Rückstand in destilliertem Wasser gelöst und in einem Dialysierschlauch (Molekulargewichtsausschlußgrenze: ca 10 000 D) gegen destilliertes Wasser 3×24 Stunden lang dialysiert. Nach jeweils 24 Stunden wurde das Dialysat gegen destilliertes Wasser ausgewechselt.

Zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Polysaccharidgemisches wurde das Dialysat lyophilisiert, der Rückstand mit Methanol versetzt, geschüttelt und 10 Minuten lang bei 3000 UPM zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde 3× wiederholt.

Im weiteren Trennungsgang wurde der nach der Zentrifugation erhaltene Niederschlag in destilliertem Wasser gelöst, auf eine Sephadex® -LH-20 Säule aufgetragen und mit destilliertem Wasser eluiert. Durch die Sephadex® -LH-20-Säule wurde der Niederschlag in mehrere Fraktionen ge trennt. Die erste Fraktion (NOAG-II) enthält ein Gemisch von Poly sacchariden mit Molekulargewichten zwischen ca. 2500 und 12 000 D.

Zur Isolierung der Unterfraktion-Polysaccharide aus NOAG-II wurde diese Fraktion, gegebenenfalls nach Lyophylisation, in destilliertem Wasser gelöst, auf eine mit Sephadex® -G-50 gefüllte Säule gegeben und mit destilliertem Wasser eluiert. Durch diese Chromatographie wurde NOAG II in drei Polysaccharidfraktionen getrennt. Die Unterfraktionen werden im folgenden als NOAG-III, NOAG-IV, NOAG-V bezeichnet.

Durch Zugabe von 15%iger Trichloressigsäure zu den in Wasser gelösten Polysaccharidfraktionen können 5-7% Proteinanteile entfernt werden.

Zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen Polysaccaridgemisches wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt.

Chemische Untersuchungen 1. Qualitative Zuckerbestimmung

Zur Hydrolyse wurden die Fraktionen mit 2 N-TFA versetzt und 2 Stunden lang bei 121°C im Trockenschrank erhitzt. Nach der Entfernung von TFA wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt.

Adsorbens: Kieselgel G F254 Fertigplatten für die Nano-DC(HPTLC) 20×20 cm (Fa. Merck).

Laufmittelsystem: n-Butanol-Aceton-Essigsäure-Wasser (35 : 35 : 10 : 20).

Detektion: Anilindiphenylaminophosphorsäure.

Als Ergebnis wurde gefunden, daß die folgenden Zucker nachgewiesen werden können.
Galakturonsäure,
Arabinose,
Rhamnose,
Galaktose,
Xylose,
Glucose.

2. Quantitative Neutralzuckerbestimmung

Die Polysaccharidunterfraktionen wurden hydrolisiert und anschließend zu den Alditolacetaten derivatisiert (BLAKENEY A.B. et. al. Carbohydr. Res. 113(1983)291 und die Zucker gaschromatographisch bestimmt.

Gerät: Perkin-Elmer 900.

Säule: Glas, 6ft×2 mm, GP3% SP-23-30 auf 100/200 Supelcoport.

Temperatur: 210°C.

Die molaren Verhältnisse der Neutralzuckerzusammensetzung zeigt die folgende Tabelle.

Die Berechnung der Molverhältnisse ist auf Glucose gleich 1,0 bezogen.

3. Uronsäurebestimmung

Mit Hilfe des Carbazoltests von Bitter, T. und Muir, H.M. Analyt. Biochem. 4, 330 (1962) wurde der Uronsäuregehalt der Polysaccharid fraktionen mit 40 bis 70% bestimmt.

4. Molekulargewichtsbestimmung

Die Molekulargewichte der isolierten Polysaccharide wurden mittels HPLC-Gelpermeationschromatographie (HP-GPC) ermittelt.

HP-GPC-System

μ-Porasil GPC 60 A+μ-Bondagel E-500

Puffersystem

0,05 M Phosphatpuffer pH 6,0 mit 0,15 M NaCl.

Vergleichssubstanzen

Glucose, Maltotriose, Maltoheptaose, Dextransulfat 5000, Dextran T-10, T-40, T-70, T-110, T-2000.

Ergebnisse

Polysaccharid
Molekulargewicht (D)
NOAG III\|10 000 bis 12 000
NOAG IV	5 000 bis 6 000
NOAG V	2 500 bis 3 500

5. Proteingehalt

Der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wurde nach LOWRY O.H., J. Biol. Chem. 193 (1951) 265, durchgeführt.

In dieser Untersuchung zeigte sich, daß das Polysaccharidgemisch einen Proteingehalt von ca. 6 bis 10% aufweist.

Optische Drehung

Die optische Drehung der Substanzen wurde anhand der Polarimeter (Perkin-Elmer Polarimeter 241) bei 20 °C gemessen.
Wellenlänge: = 589 nm (Na),
Konzentration c: 0,1%.
Lösungsmittel: dest. Wasser.

Es zeigt sich, daß die Polysaccharide stark rechtsdrehend sind. Es wurden Werte zwischen 120° und 150° gefunden.

Pharmakologische Untersuchungen

Die pharmakologische Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharidgemisches wurde in anerkannten in vitro-Tests untersucht.

Da es bislang keine spezifischen Testmethoden zur Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung von Substanzen gibt, verwendet man bis heute primär solche in vitro- und in vivo-Verfahren, die den Einfluß von Verbindungen oder Pflanzenextrakten auf den Funktionszustand und die Leistungsfähigkeit des mononukleären Systems, sowie die Stimulierbarkeit von T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.

Bei diesen Untersuchungen wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharidgemisch insbesondere im Tumor-Nekrose-Faktor- Freisetzungstest wirksam ist.

Lymphozyten-Transformationstest

Bei dem Lymphozyten-Transformationstest wird zu den Lymphozytenkulturen mit ³H markiertes Thymidin (ein Baustein der DNS) zugesetzt. ³H-Thymidin wird von den proliferierenden Lymphozyten aufgenommen und in die DNS eingebaut. Die in die DNS eingebaute ³H-Thymidinmenge ist der Lymphozytenproliferation proportional und kann als Parameter zur Beurteilung der stimulierenden Wirkung von Polysacchariden herangezogen werden.

Als Ergebnis zeigt die folgende Tabelle Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen aus der eine sehr gute Stimulierung der Lymphozytenprolifera tion durch das Polysaccharidgemisch NOAG II entnehmbar ist.

Tumornekrose-Faktor-Test (TNF)

TNF (Tumornekrose-Faktor) ist ein Protein, das beim Menschen aus 157 Aminosäuren besteht. Es wird bei Induktion in Makrophagen synthetisiert und in die Blutbahn abgegeben. TNF stimuliert auf der einen Seite das Abwehrsystem und zum anderen wirkt es toxisch auf die Tumorzellen selbst und tötet sie ab. Beim TNF-Test wird die zu testende Substanz zu den Makrophagenkulturen zugesetzt. Nach Inkubation wird in Kulturüberständen der Makrophagen die TNF-Konzentration anhand der nekrotischen Wirkung auf Tumorzellen gemessen und als Parameter für die stimulatorische Wirkung der Testsubstanzen verwendet.

Als Ergebnis wurde gefunden, daß NOAG II die Makrophagen sehr gut zur TNF-Bildung stimuliert, wobei 1,5 µg NOAG II/ml Medium über 500 U ml TNF induzieren.

Die immunstimulierende Wirkung das Polysaccharidgemisch NOAG II wurde zusätzlich im Granulozytentest nach Brandt untersucht (Brandt, L., Scand. I. Haemat. (Suppl.) 2, 1967).

Beim Granulozytentest nach Brandt wird durch in vitro die Zahl der phagozytierten Hefezellen oder Bakterien durch eine Granulozytenfraktion, die aus Humanserum gewonnen wurde, unter dem Mikroskop bestimmt. Man mißt die prozentuale Steigerung der Phagozytose durch die Polysaccharid fraktion. Das Ergebnis zeigt die folgende Tabelle (Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen).

Wie die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, bewirkt das Polysaccharid gemisch NOAG II eine deutliche Steigerung der Phagozytosewerte, die mit den im TNF-Freisetzungstest erhaltenen Stimulierungsdaten gut korrelieren.

Chemolumineszenz-Test (CL-T)

Bei diesem Test wird die Steigerung der Produktion reaktiver Sauerstoff verbindungen bei Makrophagen und Granulozyten durch die Testsubstanzen bestimmt. Dabei werden die reaktiven Sauerstoffverbindungen mit Ver stärkern wie Lucigenin in Reaktion gebracht, die dann zu einer Chemo lumineszenz führt. Durch die Messung dieser Chemolumineszenz werden die stimulatorischen Wirkungen von Testsubstanzen auf das Immunsystem ermittelt. Das Ergebnis zeigt die folgende Tabelle (Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen).

Wie aus der Tabelle ersichtlich, zeigt das Polysaccharidgemisch NOAG II auch in diesem Test Aktivität.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide bzw. das erfindungsgemäße Poly saccharidgemisch kann entweder als Reinsubstanz oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht werden, wenngleich es im allgemeinen wirksamer ist, die Verbindung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung zu verabreichen. Vorzugsweise liegt die Zubereitung in Form einer Formulierung vor, die

1) die erfindungsgemäßen Polysaccharide bzw. das Polysaccharidgemisch allein enthält und
2) eines oder mehrere geeignete Bindemittel, Trägermaterialien und/oder weitere Hilfsstoffe und
3) gegebenenfalls weitere therapeutische Wirkstoffe oder Adjuvantien aufweist.

Die Trägermaterialien, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe müssen pharma zeutisch und pharmakologisch verträglich sein, so daß sie mit den anderen Bestandteilen der Zubereitung vereinbar sind und keine nachteilige Wirkung auf den behandelten Organismus ausüben.

Die Formulierungen schließen jene ein, die für die parenterale (ein schließlich subkutane, intradermale, intramuskuläre und intravenöse) oder orale Verabreichung geeignet sind, wenngleich der am besten geeignete Verabreichungsweg von dem Zustand des Patienten abhängt.

Die Herstellung der Formulierungen erfolgt unter Anwendung von an sich auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, die erfindungsgemäßen Polysaccharide bzw. das Polysaccharidgemisch (d. h. den Wirkstoff) mit dem Trägermaterial, Binde mittel und/oder Hilfsstoffe, wobei letztere einen zusätzlichen Bestand teil darstellen, zu vermischen bzw. zu vereinigen. Im allgemeinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, daß man den Wirkstoff mit den flüssigen Trägermaterialien oder den feinteiligen Trägermaterialien oder beiden innig vermischt und dann erforderlichenfalls das erhaltene Produkt in die gewünschte Verabreichungsform bringt. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können in Form von diskreten Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes ent halten, sowie in Form von Pulvern oder Granulaten, in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wäßrigen oder nicht wäßrigen Flüssig keit, oder in Form einer Emulsion zum Beispiel in Form von Liposomen, vorliegen.

Der Wirkstoff kann auch in Form eines Bolus oder einer Paste vorliegen.

Die Tabletten kann man durch Pressen oder Vergießen herstellen, wobei man gegebenenfalls eines oder mehrere der üblichen Hilfsmittel zugibt.

Die für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen schließen sterile Injektionslösungen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Materialen, die die Formulierung im Hinblick auf den menschlichen Organismus isotonisch machen, ein. Weiter können die erfindungsgemäßen Polysaccharide bzw. das Polysaccharidgemisch in Form von sterilen Suspensionen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können, vorliegen. Die Formulierungen können als Einzel- oder Mehrfach-Dosis vorliegen, beispielsweise in Form von Ampullen oder dicht verschlossenen Fläschchen und können auch in lyophilisierter Form ge lagert werden, so daß es lediglich erforderlich ist, bei notwendiger Ver abreichung steriles flüssiges Trägermaterial, beispielsweise für In jektionszwecke geeignetes Wasser, unmittelbar vor Verwendung zuzugeben. Die unmittelbar vor der Verabreichung bereiteten Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulver, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art bereitet werden.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können neben den vorhin genannten Bestandteilen andere für die in Rede stehenden Formulierungen geeignete Bestandteile enthalten. So können beispielsweise die auf oralem Weg zu verabreichenden pharmazeutischen Zubereitungen Aromastoffe enthalten. Die zur Applikation geeigneten Mengen des Wirkstoffes variieren in Ab hängigkeit vom jeweiligen Therapiegebiet. Im allgemeinen enthält eine Einzeldosis 5 bis 95% aktiven Bestandteil. Dies entspricht bei einer einmaligen Applikation zum Beispiel 50 µg bis 100 mg pro Dosis/Mensch parenteral und 1 mg bis 500 mg peroral. Diese Dosierung kann jedoch in Abhängigkeit des Verabreichungsweges, des Patientenzustandes und des Therapiegebietes in breiten Grenzen variieren.

Claims

1. Polysaccharidgemisch mit immunstimulierender und antiproliferativer Wirkung aus Pflanzen der Gattung Nerium oleander, erhältlich durch:

a) Kochen von Teilen der Pflanze in Wasser für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden,
b) Abtrennen der festen Anteile, Abkühlen des Extraktes auf Raumtempe ratur, Filtration und Dialyse des Filtrats mit einer Molekulargewichts ausschließungsgrenze von ca. 10 000 D gegen Wasser,
c) Lyophilisation des Dialysates, Behandeln des lyophylisierten Materials mit Alkohol und Abtrennen der unlöslichen Bestandteile,
d) Auftrennung des Rückstandes mittels Gelchromatographie und Isolierung der Polysaccharide mit einem Molekulargewicht von ca. 3500 bis 12 000 D.

2. Polysaccharidgemisch nach Anspruch 1, weiter gekennzeichnet durch:

a) ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 2500 bis 12 000 D,
b) einen mittleren Proteingehalt von ca. 8%,
c) einen mittleren Uronsäuregehalt von ca. 60%, und
d) die Zucker Rhamnose, Arabinose, Xylose, Galaktose und Glucose in einem molaren Verhältnis von 0,3 : 0,2 : 0,2 : 0,9 : 1,0, bezogen auf Glucose = 1,0.

3. Polysaccharidgemisch nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß es drei Polysaccharidunterfraktionen mit Molekulargewichten von ca. 2500 D bis ca. 3500 D, ca. 5000 D bis ca. 6000 D und ca. 10 000 D bis 12 000 D, bestimmt in der HP-GPC, enthält.

4. Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharidgemisches nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man:

a) Teile der Pflanze in Wasser für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3, Stunden kocht,
b) die festen Anteile abtrennt, den Extrakt auf Raumtemperatur abkühlt, filtriert, das Filtrat gegen Wasser mit einer Molekulargewichtsaus schließungsgrenze von ca. 10 000 D dialysiert,
c) das Dialysat lyophilisiert, das lyophilisierte Material mit Alkohol behandelt und die unlöslichen Bestandteile abtrennt,
d) aus dem Rückstand mittels Gelchromatographie die Polysaccharide mit einem Molekulargewicht von ca. 3500 bis 12 000 D isoliert.

5. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend als aktiven Bestandteil ein Polysaccharidgemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Verbindung mit pharmazeutisch annehmbaren Träger- und/oder Hilfsstoffen.

6. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 5 als Immunstimulans.

7. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 5 als antiproliferatives Mittel.

8. Polysaccharid mit immunstimulierender und antiproliferativer Aktivität, gekennzeichnet durch

a) ein Molekulargewicht von ca. 10 000 bis 12 000 D, bestimmt in der HP-GPC,
b) die Zucker Rhamnose, Arabinose, Galaktose, und Glucose in einem molaren Verhältnis von 1,1 : 4,4 : 3,2 : 1,0, bezogen auf Glucose = 1,0.

9. Polysaccharid mit immunstimulierender und antiproliferativer Aktivität, gekennzeichnet durch

a) ein Molekulargewicht von ca. 5000 bis 6000 D, bestimmt in der HP-GPC,
b) die Zucker Rhamnose, Arabinose, Galaktose und Glucose in einem molaren Verhältnis von 0,4 : 3,9 : 2,0 : 1,0, bezogen auf Glucose = 1,0.

10. Polysaccharid mit immunstimulierender und antiproliferativer Aktivität, gekennzeichnet durch

a) ein Molekulargewicht von ca. 2500 bis 3500 D, bestimmt in der HP-GPC,
b) die Zucker Rhamnose, Arabinose, Xylose, Galaktose, Glucose in einem molaren Verhältnis von 0,2 : 0,9 : 0,3 : 0,9 : 1,0 bezogen auf Glucose = 1,0.

11. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß es aus Nerium oleander isoliert wurde.

12. Verfahren zur Isolierung eines Polysaccharids nach einem der An sprüche 8 bis 10, bei dem man

a) Teile der Pflanze in Wasser für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3, Stunden, kocht
b) die festen Anteile abtrennt, den Extrakt auf Raumtemperatur abkühlt, das Filtrat gegen Wasser mit einer Molekulargewichtsausschließungsgrenze von ca. 10 000 D dialysiert und anschließend lyophilisiert,
c) das lyophilisierte Material mit Alkohol behandelt und die unlöslichen Bestandteile abtrennt,
d) aus dem Rückstand mittels Gelchromatographie Polysaccharide mit einem Molekulargewicht von ca. 3500 bis 12 000 D isoliert.

13. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend als aktiven Bestandteil mindestens eines der Polysaccharide, wie in Anspruch 8 bis 10 definiert, oder deren Mischung in Verbindung mit pharmazeutisch annehmbaren Träger- und/oder Hilfsstoffen.

14. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 13 als Immunstimulans.

15. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 13 als antiproliferatives Mittel.