JP4958556B2 - レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
該PC−SODが、前記アミノ基のm個(mは1〜4の整数であり、mの平均値は1.5〜2.4である。)が前記PC−SOD(A)を主成分とし、該PC−SOD(A)が、m=1であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a1)25〜40モル%と、m=2であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a2)35〜50モル%と、m=3であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a3)10〜20モル%と、m=4であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a4)5〜15モル%とからなることを特徴とするPC−SOD組成物である。
また、本発明は、下記一般式(III)
で表されるレシチン誘導体の1モルに対し、銅および/または亜鉛が配位した、111位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼの0.05〜0.4倍モルを水とイソプロピルアルコールとの混合溶媒中で反応させて未精製PC−SODを得るレシチン化工程を行い、つぎに、該未精製PC−SODを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行うことにより前記レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物を製造することを特徴とするPC−SOD組成物の製造方法である。
該PC−SODの製造に用いるSODの入手方法は特に限定されず、ヒト由来のものであっても、他の起源を由来とするものであってもよい。すなわち、本発明におけるヒト由来SODは、ヒトに由来するSODと同一構造を有するものであれば、いずれの起源であってもよい。
なお、本発明において、PC−SODは後述するPC−SOD(A)と、ヒト由来のSODのアミノ基の5個以上がレシチン残基(I)で置換されたPC−SOD(B)(以下、PC−SOD(B)と記す)とからなり、PC−SODの総量とはPC−SOD(A)とPC−SOD(B)との合計量を意味する。
Rは直鎖構造または分岐構造が好ましく、直鎖構造が特に好ましい。Rとしては、炭素数13、15、または17の直鎖アルキル基が好ましく、炭素数15の直鎖アルキル基が特に好ましい。
nは2〜10の整数であり、2〜6が好ましく、3が特に好ましい。
なお、「レシチン残基(I)で置換された」とは、アミノ基(−NH2)の水素原子の1つがレシチン残基(I)に置き換わっていることを意味する。
「PC−SOD(A)を主成分とする」とは、PC−SOD組成物中に含まれるPC−SODの量比のうち、PC−SOD(A)の割合が最大であることを意味する。PC−SOD組成物中に含まれるPC−SODの総量に対するPC−SOD(A)の割合は、75質量%以上が好ましく、85〜100質量%が特に好ましい。
そしてmの平均値は1.5〜2.4である。mの平均値はモル平均値として計算される値であり、PC−SOD(a1)、(a2)、(a3)、および(a4)の総量に対する各々のモル比から算出できる。
PC−SODを医薬品とする場合には、生体内での動態、安定性、製剤化の容易さ等のバランスが取れていることが必要である。これらの要因を考慮した結果、本発明者らは、PC−SODにおけるレシチン残基(I)の結合数の平均値が1.5〜2.4である場合が最適であることを見いだした。さらに本発明のPC−SOD組成物の安定性を考慮した場合には、単にPC−SODにおけるレシチン残基(I)の結合平均数を1.5〜2.4とすればよいのではなく、ある程度のレシチン残基(I)数を有するPC−SODと、レシチン残基(I)の結合数が少ないPC−SODとを並存させることが、医薬品原体としての安定性の向上につながり、かつ医薬品原体および製剤の製造においても効率的であることを見いだした。
PC−SOD(B)中に存在するレシチン残基(I)数(r)は、5〜12個である。
PC−SOD中の立体構造の内部に存在するアミノ基は置換されにくいことから、通常の場合、rは5〜8が好ましい。
PC−SOD組成物中にPC−SOD(B)が含まれる場合のPC−SOD(B)の量は、PC−SOD組成物中に含まれるPC−SODの総量に対して25質量%未満が好ましく、15質量%未満が好ましい。該量が25質量%以上であると前記の理由により本発明の効果が損なわれるおそれがある。
該レシチン残基(I)以外の基の具体例としては、以下の基が挙げられる。ただし、下式中のnは、レシチン残基(I)における意味と同じ意味を示す。
たとえば高速液体クロマトグラフィー(以下、HPLCと略記する。)で測定されるPC−SOD(A)の割合は、PC−SODの総量に対して85%以上(ただし、単位はクロマトグラムの面積%)であることが好ましく、85〜100%であることが特に好ましく、90〜100%であることがとりわけ好ましい。
また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定されるPC−SOD(A)の割合は、PC−SODの総量に対して80%以上(ただし、単位はクロマトグラムの面積%)であることが好ましく、85〜100%であることが特に好ましい。
HPLCおよびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の測定条件は、後述する実施例に記載した条件が採用できる。
PC−SOD(A)の割合が前記特定の割合になるように管理した場合には、酵素活性の安定性および生体内での安定性に優れたPC−SOD組成物を恒常的に得ることができる。また、該分析方法による管理はより効率的である。さらに、得られたPC−SOD組成物は、安定性により優れることから製剤化も容易である。
該二量体としては、PC−SOD(a2)の2分子から形成される二量体、PC−SOD(a1)の1分子とPC−SOD(a3)1分子から形成される二量体等が例示されうる。
また、PC−SOD中にPC−SOD(B)が含まれる場合、該PC−SOD(B)とPC−SOD(A)、および/またはPC−SOD(B)同士が会合して二量体を形成していてもよい。
他の化合物としては、下記一般式(II)で表される脂肪酸が挙げられる。
RCOOH …(II)
[ただし、Rは前記一般式(I)におけるRと同じである。]
PC−SOD組成物中の脂肪酸の定量法としては、ガスクロマトグラフィー、HPLC、マススペクトロメトリー等の手法が挙げられる。また、ラベル化試薬によりラベル化し、HPLCで定量する方法も挙げられる。PC−SOD組成物中の脂肪酸濃度が低い場合は、ラベル化試薬を用いる方法が好ましい。
PC−SOD組成物の比活性値の測定方法としては、チトクロムC法、ニトロブルー・テトラゾリウム法、エピネフリン法、亜硝酸法などが知られており、チトクロムC法を用いて比活性値を測定することが好ましい。チトクロムC法による測定は、Y.Oyanagi(SODと活性酸素調節剤、p.95(1989))、J.M.McCord(J.Biol.Chem.,Vol.224、p.6049(1969))、K.Asada(Agr.Biol.Chem.,Vol.38、p.471(1974))などの文献に記載される方法により実施できる。
本発明のPC−SOD組成物は、製剤化の容易さ、生体内での安定性、効率的な薬効発現の点から、チトクロムC法により測定される比活性値が、PC−SODの総量1mgあたり2000ユニット以上であることが好ましく、2300〜7000ユニットであることが特に好ましい。
Zは、水酸基、または活性エステルを形成する基からカルボニル基を除いた基を表す。後者の基としては、例えば、p−ニトロフェノール、1,3,5−トリクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシピペリジン、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボン酸イミド、8−ヒドロキシキノリン、2−ヒドロキシピリジンなどの水酸基含有化合物の水酸基の水素原子を除いた基が挙げられる。活性エステル体の合成法については公知の方法を用いることができる(特許文献1、および「ペプチド合成の基礎と実験」(泉屋他、1985年、丸善(株)発行)等を参照。)。
本工程は、ヒト由来SODを適当な溶媒に溶解して得たSOD溶液に、前記一般式(III)で表されるレシチン誘導体を適当な溶媒に溶解して得たレシチン誘導体溶液を添加する方法により行うことが好ましい。具体的には、レシチン誘導体1モルに対し、0.05〜0.4倍モル、好ましくは0.1〜0.25倍モルのヒト由来SODを水とイソプロピルアルコールとの混合溶媒中で反応させることによって、本発明のPC−SOD組成物を高収率で得ることができる。
レシチン誘導体溶液のSOD溶液中への添加速度は、レシチン誘導体が短時間で反応系内に分散することができる速度であればよく、通常20〜100mL/分が好ましく、40〜80mL/分が特に好ましい。
撹拌速度は、レシチン誘導体が短時間で反応系内に分散することができる撹拌速度であればよく、通常50〜500rpmが好ましく、100〜300rpmが特に好ましい。
反応温度は、高温になればなるほどSOD1分子あたりのレシチン誘導体の導入数が多くなるため、上限は+20℃とすることが好ましい。反応温度の下限としては、反応液が凍結しない温度であればよい。反応温度としては、0〜+10℃が好ましい。
反応時間は、0.5時間〜72時間が好ましく、2〜24時間が特に好ましい。
反応圧力は、0.05〜0.2MPaが好ましく、大気圧付近の圧力が特に好ましい。
具体的には、ヒト由来SODを100〜2000倍量の溶媒で希釈してSOD溶液を調製し、該溶液に、レシチン誘導体を20〜100倍量の有機溶媒で希釈したレシチン誘導体溶液を加えることによるのが好ましい。
SODを溶解させる溶媒としては、水、または、水と有機溶媒との混合溶媒が挙げられ、水と有機溶媒との混合溶媒が好ましい。該混合溶媒を用いることにより、レシチン誘導体溶液を添加する際に、反応系を均一にでき沈殿物の発生を防止できる。また、これらの溶媒にはホウ酸等を溶解させ、緩衝能を持たせることが好ましい。
水としては、精製水、イオン交換水、蒸留水、または注射用水が好ましい(以下、これらを総称して単に「水」ともいう。)。有機溶媒としては、イソプロピルアルコール、N,N−ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン、N,N−ジメチルアセトアミド、スルホラン、ジメチルスルホキシド、アセトン、1,4−ジオキサン、およびメタノール等が挙げられ、イソプロピルアルコールが好ましい。
レシチン誘導体の希釈に用いられる有機溶媒としては、SOD溶液の調製に用いられる有機溶媒と同様の溶媒が例示でき、イソプロピルアルコールが好ましい。
つぎに、前記レシチン化工程で得られた未精製PC−SODを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行う。本精製工程を行うことにより、高収率で本発明のPC−SOD組成物を得ることができる。
イオン交換樹脂としては、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれであっても使用できる。
無機塩としては、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。これらは単独で用いても、任意の割合の混合物として用いてもよい。
有機溶媒としては、イソプロピルアルコール、N,N−ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン、N,N−ジメチルアセトアミド、スルホラン、ジメチルスルホキシド、アセトン、1,4−ジオキサン、メタノール等が挙げられる。これらのうち、PC−SODの溶解性が良好であり、精製効率が良い点で、メタノールが好ましい。
該溶媒中に含まれる有機溶媒の量は、PC−SODを不溶化させることなく、かつイオン交換樹脂へのPC−SODの吸着を妨げない量とすることが好ましい。有機溶媒の割合は、溶媒の総容量に対し10〜80容量%が好ましく、20〜70容量%が特に好ましく、40〜60容量%がとりわけ好ましい。
具体的には、未精製PC−SODをカラムにチャージした後に、未吸着の物質を溶出させる。つぎに下記溶媒(A)を用いて未反応のSODを溶出させ、つぎに下記溶媒(B)を用いて本発明のPC−SOD組成物を溶出させることにより行うことが好ましい。
溶媒(A):無機塩濃度が5〜100mMであるpH6〜9の緩衝液(a1)と、メタノールとからなり、溶媒(A)に対する該緩衝液(a1)量が20〜90容量%であり、メタノール量が10〜80容量%である溶媒。
溶媒(B):無機塩濃度が150〜400mMであるpH6〜9の緩衝液(b1)と、メタノールとからなり、溶媒(B)に対する該緩衝液(b1)量が20〜90容量%であり、メタノール量が10〜80容量%である溶媒。
製剤形態としては、注射剤(溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等)、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等が挙げられる。
投与方法は、注射(筋肉内、皮下、皮内、静脈内等)、経口、吸入等の投与方法が採用できる。投与量は、製剤の調製方法、剤形、疾患の種類、当該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の体重等によって個別に設定され、たとえば、成人一日あたり、0.5〜200mgを挙げることができる。
[例1]PC−SOD組成物の製造例
20Lのフラスコに注射用蒸留水(大塚製薬社製、商品名:大塚蒸留水、以下同様。)(9000mL)を添加し、ホウ酸(27.7g)、NaOH(3.6g)、KCl(33.7g)を順次添加し溶解した。つぎに、SOD水溶液(100g、SOD濃度113.6mg/mL)を添加後、210rpmで撹拌しながら、クロマトチャンバー内で8℃にしておいたイソプロピルアルコール(2000mL)を33mL/分で滴下し、SOD溶液を調製した。
次いで、NaClを溶解させた50mmol/Lのホウ酸緩衝液(pH8.5±0.2、NaCl濃度=25mmol/L)とメタノールとの1:1(容量比)からなる溶出溶媒を用いて、未修飾SODを溶出させた。
次いで、NaClを溶解させた50mmol/Lのホウ酸緩衝液(pH8.5±0.2、NaCl濃度=200mmol/L)とメタノールとの1:1(容量比)からなる溶出溶媒を用いて溶出した画分をPC−SOD組成物画分とした。
得られた画分についてMALDI TOF−MS分析を行い、PC−SODの分子量、およびフラグメントを測定した。PC−SODの1分子に結合するレシチン誘導体の結合数(m)と、各結合数に相当するPC−SODの比率(モル%)、mの平均値、およびPC−SOD二量体あたりのmの平均値を求めた結果を、下表1に示す。
水性液(Lot.001)に含まれるPC−SODには1〜4分子のレシチン誘導体が結合しており、mの平均値は2であった。
例1と同様の操作を行い、PC−SOD組成物の水性液(Lot.002および003)を得た。各水性液中のPC−SODの1分子に結合するレシチン誘導体の結合数(m)、各結合数に相当するPC−SODの比率(モル%)、mの平均値、およびPC−SOD二量体あたりのmの平均値を求めた結果を下表1にまとめて示す。
例1で製造した水性液(Lot.001、500μL)に注射用蒸留水を加え、PC−SODの濃度を30mg/mLとした液(500μL)に注射用蒸留水(2500μL)を加えて分析用サンプルを得た。分析用サンプルについてHPLC分析を行った結果、PC−SODの総量に対するPC−SOD(A)の割合は96.7%(単位はクロマトグラムの面積%である。)であった。
HPCLの分析には、カラムとして、YMC A−502 S−5 120A CN(150mm×4.6mm、YMC社製)を用い、移動相には、0.1%トリフルオロ酢酸と20%アセトニトリルとの水溶液、および0.075%トリフルオロ酢酸と90%アセトニトリルとの水溶液を、濃度勾配をかけて0.8mL/分で流した。検出器はUV検出器(波長220nm)を用い、カラム温度を室温とした。
例1と同様の方法で得たPC−SOD組成物を含む水性液(Lot.005)につき、例4と同様にHPLC測定を行った結果、PC−SODの総量に対するPC−SOD(A)の割合は97.3%(単位はクロマトグラムの面積%である。)であった。
例1で製造した水性液(Lot.001、500μL)を水で希釈して濃度を30mg/mLとした液(100μL)に水(2900μL)を加えて試料溶液とした。
また、試料溶液(100μL)に水(900μL)を加えた液を比較試料溶液とした。
試料溶液および比較試料溶液の各々20μLに、サンプルバッファー(8μL)を加え、95℃で3分間加熱した。サンプルバッファーは、グリセリン(10g)、ドデシル硫酸ナトリウム(2g)、ブロムフェノールブルー(100mg)をトリス・塩酸緩衝液(50mmol/L)に溶解し100mLとし、この溶液から95μLを取り2−メルカプトエタノール(5μL)を加え調製した。
前記で処理した試料溶液および比較試料溶液の各々4μLにつき、電気泳動を行った。泳動終了後、直ちにゲルを染色用チャンバーに移し、染色を行った。染色終了後、30分間保護液に浸した後、ゲルを乾燥した。保護液は、グリセリン(20mL)に水を加え500mLとして調製した。
試料溶液のメインバンド以外のバンドの大きさと、比較試料溶液のメインバンドの大きさとを比較した結果、PC−SOD組成物に含まれるPC−SOD(A)の割合は90%(単位はクロマトグラムの面積%である。)以上であった。
比活性値は、チトクロムC法を用いて測定した。測定方法は、Y.Oyanagi(SODと活性酸素調節剤、p.95(1989))、J.M.McCord(J.Biol.Chem.,Vol.224、p.6049(1969))、およびK.Asada(Agr.Biol.Chem.,Vol.38、p.471(1974))などの文献に記載される方法にしたがった。なお、比活性値が4500〜5500の範囲にあるヒト由来SODを標品として用いた。
前記例で得たPC−SOD組成物を異なる濃度に調製した試料に、キサンチンオキシダーゼ溶液を入れ、紫外光(550nm)に対する吸光度を測定した。濃度と吸光度のデータから、最小二乗法により検量線を得て、1分間当たりの吸光度増加率から試料の比活性値を求めたところ、Lot.001中のPC−SOD組成物の比活性値(U/mg−SOD)は3400であった。なお、比活性値の単位「U/mg−SOD」はSODの総量(1mg)に対する値であることを意味する。
パルミチン酸(256mg)をエタノールに溶解して20mLとした液を50mmol/L標準原液とした。該標準原液をエタノールで希釈し、0.1mmol/L、0.05mmol/L、および0.01mmol/Lのパルミチン酸標準試料をそれぞれ調整した。また、(パルミチン酸の秤量値)/(パルミチン酸分子量=256.43)値をファクター(Fp)とした。
一方、マルガリン酸(27mg)をエタノールに溶解して200mLとした液を0.5mmol/L内部標準溶液とした。
パルミチン酸標準試料(各100μL)、例1で得た水性液(Lot.001)、例1と同様の方法で得た水性液(Lot.005、Lot.008)のそれぞれ(100μL)に、前記内部標準溶液(100μL)を加えた。ブランクとしてエタノール(100μL)を用いた。
それぞれにA液〜C液からなる長鎖・短鎖脂肪酸ラベル化試薬(ワイエムシィ社製)のA液およびB液を加えて、60℃の恒温槽で20分間撹拌した。さらに、C液(200μL)を加え、60℃の恒温槽で15分間撹拌した液を、HPLC測定試料とした。
HPLCの測定にはカラムとしてYMC A−512 S−5 120A CN(150mm×6.0mm、YMC社製)を用いた。移動相には、0.01%トリフルオロ酢酸と20%アセトニトリルとの水溶液、および0.01%トリフルオロ酢酸および20%アセトニトリルとの水溶液を濃度を変化させながら1mL/分で流した。検出器はUV検出器(波長230nm)を用い、カラム温度は室温とした。
得られたHPLCクロマトグラムからパルミチン酸の面積%を求め、さらに、内部標準溶液の測定値で換算することにより、パルミチン酸の含有量を求めた。PC−SOD総量に対するパルミチン酸濃度は、Lot.001においては0.074nmol/mg、Lot.005においては0.094nmol/mg、Lot.008においては0.067nmol/mgであった。
なお、2004年10月12日に出願された日本特許出願2004−297519号の明細書、特許請求の範囲及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (8)
- 銅および/または亜鉛が配位した、111位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼのアミノ基の1個以上が下記一般式(I)
で表されるレシチン残基で置換されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼを含む組成物であり、
該レシチン化スーパーオキシドディスムターゼが、前記アミノ基のm個[mは1〜4の整数であり、mの平均値は1.5〜2.4である。]が前記レシチン残基で置換されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(A)を主成分とし、該レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(A)が、m=1であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a1)25〜40モル%と、m=2であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a2)35〜50モル%と、m=3であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a3)10〜20モル%と、m=4であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(a4)5〜15モル%とからなる、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物を製造する方法であって、
下記一般式(III)
で表されるレシチン誘導体の1モルに対し、銅および/または亜鉛が配位した、111位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼの0.05〜0.4倍モルを水とイソプロピルアルコールとの混合溶媒中で反応させて未精製レシチン化スーパーオキシドディスムターゼを得るレシチン化工程を行い、つぎに、該未精製レシチン化スーパーオキシドディスムターゼを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行うことを特徴とするレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。 - 前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、スーパーオキシドディスムターゼのアミノ基の5個以上が前記レシチン誘導体からZを除いたレシチン残基で置換されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(B)を含有する請求項1に記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
- 前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、高速液体クロマトグラフィーで測定されるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(A)の割合が、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量に対して85%以上(単位はクロマトグラムの面積%である。)である請求項1または2に記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
- 前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定されるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(A)の割合が、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量に対して80%以上(単位はクロマトグラムの面積%である。)である請求項1〜3のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
- 前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、チトクロムC法により測定される比活性値が、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量1mgあたり2000ユニット以上である請求項1〜4のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
- 前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、下記一般式(II)
RCOOH …(II)
[式中のRは、炭素数8〜30のアルキル基である。]
で表される脂肪酸を、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量1mgあたり0.01〜0.15nmol含む請求項1〜5のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。 - 前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(A)が、mが同一または異なるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ(A)の2分子が会合してなる二量体として含まれる請求項1〜6のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
- 精製工程を、レシチン化工程で得られた未精製レシチン化スーパーオキシドディスムターゼをイオン交換樹脂に吸着させ、つぎに、下記溶媒(A)を用いて未反応のスーパーオキシドディスムターゼを溶出させ、つぎに、下記溶媒(B)を用いて請求項1〜7のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物を溶出させることにより行う請求項1〜7のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
溶媒(A):無機塩濃度が5〜100mMであるpH6〜9の緩衝液(a1)と、メタノールとからなり、溶媒(A)に対する該緩衝液(a1)量が20〜90容量%であり、メタノール量が10〜80容量%である溶媒。
溶媒(B):無機塩濃度が150〜400mMであるpH6〜9の緩衝液(b1)と、メタノールとからなり、溶媒(B)に対する該緩衝液(b1)量が20〜90容量%であり、メタノール量が10〜80容量%である溶媒。
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