JPS63316798A

JPS63316798A - 新規なペプチド及びこれを有効成分とする創傷治療剤

Info

Publication number: JPS63316798A
Application number: JP15125587A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Matsuda; 整松田; Shigeaki Fujieda; 藤枝　重明; Kifuku Takagi; 基福高木
Original assignee: Nippon Mining Co Ltd
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1987-06-19
Publication date: 1988-12-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ヒト形質転換成長因子（ｈＴＧＦ−α）の１
アミノ酸置換アナログで、ＤＮＡ合成促進作用が強く、
創傷の治療に有用な新規なペプチド及びこれを有効成分
としてなる創傷治療剤に関する。

本発明の新規ペプチドを含有させた創傷治療剤はよりす
ぐれた効果を示すので、医薬界に益するところ大なるも
のがある。

（従来の技術）ｈＴＧＦ−αは、ヒト腫瘍細胞由来の増殖因子で、無血
清培地のもとて腫瘍細胞の増殖を促進させ、更には正常
細胞においても当該因子の添加により増殖性を示すこと
が知られている。また、このｈＴＧＦ−αの完全なアミ
ノ酸配列も、次式に示す構造として、既に開示されてい
る〔プリンク（Ｒ，Ｄｅｒｙｎｋ）他、セル（Ｃｅｌｌ）
、３８．　ｐ２８７〜２９７（１９８４））。

さらに、この細胞増殖機能に着目して、ＴＧＦを。

熱傷、擦過傷、切傷、その他の外傷等、創傷の治癒の促
進に用いることが提案されている（特開昭６１−２１８
５２５号公報）。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者は、上記ｈＴＧＦ−αのアミノ酸配列とそれが
細胞に及ぼす作用等について、鋭意研究を進め、アミノ
酸配列の置換により、よりすぐれた創傷治療剤が得られ
るものと考えるに到った。

（問題点を解決するための手段）本発明においては、このｈＴＧＦ−αの１アミノ酸置換
アナログの特定のものが、ｈＴＧＦ−α　に比べてＤＮ
Ａの合成を著しく促進させる作用があり、創傷の治癒の
促進剤として有用であることを知ったのである。

本発明においてはｈＴＧＦ−αのアミノ酸配列の２０番
目、２５番目又は３５番目のいずれか１つのアミノ酸置
換アナログが有用な新規ペプチドであり、これらを有効
成分として含有してなる創傷治療剤はすぐれた効果を有
することを見出したものである。

本発明は、構造式（式中、ＹがＶａｌ、２がＨｉｓの場合、　ＸはＧｌｕ
を。

ＸがＴｈｒ、　　ＺがＨｉｓの場合、ＹはＡｌａを、Ｘ
がＴｈｒ、ＹがＶａｌの場合、ＺはＡｌａをそれぞれ示
す。）で表される新規なペプチド及びこれを有効成分と
してなる創傷治療剤である。

上記構造式において、このペプチドは上部左端にアミノ
末端を有し、他部右端にカルボキシ末端を有する。

本発明のペプチドは、上述のｈＴＧＦ−αのアミノ酸配
列の３５番目のアミノ酸であるヒスチジンをアラニンに
置換したもの（以下アナログ１と称す）、あるいは、２
０番目のスレオニンをグルタミン酸に置換したもの（以
下アナログ２と称す）、または２５番目のバリンをアラ
ニンに置換したもの（以下アナログ３と称す）である、
また１本発明の新規ペプチドも天然のｈＴＧＦ−αと同
様にリホールディングし、８番目と２１番目、１６番目
と３２番目及び３４番目と４３番目のシスティンがそれ
ぞれジスルフィド結合を作っていると考えられる。

本発明の新規ペプチドは、上記アミノ酸配列に対応した
塩基配列を有するＤＮＡの配列、すなわち遺伝子を既知
の方法により合成し、この遺伝子を発現ベクターに組込
み、このベクターにより宿主微生物を形質転換し、この
微生物を増殖、培養することにより産生ずることができ
る。このベクターとしては、各種のプラスミド、ファー
ジ等を用いることができ、また宿主微生物としては、細
菌、例えばＥ、ｃｏｌｉ、、或いは酵母細胞を用いるこ
とができる。産生されたペプチドは、菌体等から回収さ
れ、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラ
フィー等により精製することができる。

このようにして得られるペプチドは、ＤＮＡ合成促進作
用が強く、すべての皮膚創傷、角膜創傷、及び体の中空
上皮系器官の外傷を含む広範囲の種類の創傷、例えば、
熱傷、擦過傷、切傷、外科手術上の切開及び移植及び潰
瘍等により生じた創傷に適用できる。使用に当たっては
、クリーム、軟膏、溶剤等の担体にｌμｇ〜１０ｎｇ／
Ｑ存在させ、そのまままたは包帯等に含有させ、傷口へ
連続的に暴露することにより行われる。

次に１本発明の実施例を示す。

実施例１謎Ａ」ｊ−一先良久前述したアナログ１のアミノ酸配列に基づき。

次に示した塩基配列のＤＮＡを小片に分けて合成（＾ｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３８０Ａ　Ｄ
ＮＡ合成機を使用）シ、アニーリングして、構造遺伝子
を得た。

ＭＥＴ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　）ｌｉｓ　Ｐｈｅ　
Ａｓｎ　Ａｓｐ門１ｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌ
ｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ
　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ（上記Ａはアデニン
、Ｇはグアニン、Ｔはチミン。

Ｃはシトシンを示す。以下同じ、）尚、ここで示した遺伝子には、後述した発現ベクターに
組み込むための制限酵素切断部位、翻訳開始及び臭化シ
アンによる切断部位（ＮＥＴ）、及び翻訳終結部位（、
で示した）も併せて記載した。

長ｌ斬轟珠勿射災プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとＰｖｕ■との部
位の間で切断し、アンピシリン耐性遺伝子（ＡＰｒ）と
複製起点（ｏｒｉ）とを含むフラグメントにトリプトフ
ァンプロモータとトリプトファンＬＥの蛋白をコードす
る構造遺伝子（ヤノフスキ−（Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ）
他、ニュークリック、アシッド、リサーチ（Ｎ１４ｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　ｐ、　ｐ６６
４７〜６６５９（１９８１））の一部及びクローニング
サイトからなる、次の塩基配列のＤＮＡと接合して発現
ベクターを得た。

３’　−ＧＡＣＣＧＴ　ＴＴＡ　ＴＡＡ　ＧＡＣＴＴＴ
　ＡＣＴにＣＡＡ　ＣＴＧ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＡＧＴ　
Ａ匡ＡＡＣＴＡＧ　ＴＴＡ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＡＣＧ　
ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＣＡＣＧＴＡ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＧＴ
Ａ　ＴＣＧ　ＡＣＡＴＴＧ　ＡＴＣＡ＾１’　ＴＧＡ　
ＴＣＡ　ＴＧＣＧＴＴ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴ
Ｔ　ＴＣＣＣＡＴ　ＡＧＣＴＧＴこの発現ベクターのＨ
ｉｎｄｎｌとＥｃｏＲＩとの部位間を切断して取り除き
、前記で合成したアナログ１の構造遺伝子を組み込み、
このベクターをＥ、ｃｏｌｉ１１ＢＩＯＩ株に導入し、
当該株の形質転換を行った。

得られた形質転換株をＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　　ｐ
ＥＸ−１４Ａｌａ３５と命名し、微工研にＦＥＲＮ　Ｂ
Ｐ−１３９７とじて寄託された。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　　ｐＥＸ−１４Ａｌａ３５
．　ＦＥＲＭ　０Ｐ−１３９７を培養後ＤＮＡを抽出し
、サンガー法により構造遺伝子のＤＮＡの配列を調べ、
アナログ１のアミノ酸配列と同一であることを確認した
。

アナログ１の産生Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　　ｐＥＸ−１４Ａｌａ３５
．　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３９７を、アンピシリン１００
μｇ／ＩＩＱ、トリプトファン２００μｇ／ＩＩＩＱを
含むＭ９培地を用い、３７℃の温度で振盪培養した。

次に、培養液の吸光度（０，０，、、。）が０．５に生
育したところで、菌体を遠心分離し、前記トリプトファ
ンの代わりに２０μｇ／ｌｓＱのβ−インドールアクリ
ル酸を添加した培地に移して、３７℃の温度で３時間培
養した。

培養終了後、当該液を遠心分離して菌体を集め。

当該菌体を超音波細胞破砕機にかけ破壊した。

アナログ１は、１８のアミノ酸からなるトリプトファン
ＬＥペプチドの一部に結合した状態で生産され、難溶性
であったので、遠心分離してペレットを回収し、これを
７０％のぎ酸に溶解して、この液に臭化シアンを添加し
、室温で１６時間反応させ。

アナログ１をトリプトファンＬＥペプチドから切り離し
た１次に、この反応液を窒素気流下で加熱して、ぎ酸と
臭化シアンを留去し、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６
）　０．１Ｍ、硫酸アンモニウム０．１Ｍ、及びＴｒｉ
ｔｏｎ　ＸＸ１００（Ｒｏｈ　＆　ｆｌａａｓ　Ｃｏ、
の商品名）　０．１ｍＭからなるバッファー液に溶解し
、これに還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンを
それぞれ５．０ｍＭ及び０．５ａ＋Ｍ添加し、室温で１
６時間リフォールディングを行い、８番目と２１番目、
１６番目と３２番目及び３４番目と４３番目のシスティ
ンをジスルフィド結合化した。

次いで、これを１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ）Ｉ
８．０）に対して、セルロースチューブ（ｃｕｔ　ＭＷ
ｌｏｏＯ）を用いて透析を行った後、凍結乾燥し、塩化
ナトリウム１３ｇ＋ｉＭ、塩化カリウム１　、２＋ａＭ
、硫酸マグネシウム１　、２ｍＭ、４−（２−ヒドロキ
シエチル）−１−ピペラジンーエタンースルホネイト（
ＨＥＰＥＳ）　５０＋＋＋ＭからなるｐＨ７，７の緩衝
液に溶解した。

アナログ１の精上述の方法でえられたアナログ１を含む液を高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて、次に示した各条件で４段階
の精製を行った。

Ｆ−Ｉ　　　　　Ｃ′ＩＪ　　　　　の　　　　　　り
この精製で得られた液を窒素気流中で加熱して濃縮乾固
し、塩化ナトリウム１３８ｍＭ、塩化カリウム１　、２
ｍＭ、硫酸マグネシウム１．２ｍＭ、　ＨＥＰＥＳ　５
０ｓ＋Ｍ、牛血清アルブミン２ｍｇ／ｍＱを含み、ｐＨ
７，７のバッファー液の少量に溶解、保存した。

このサンプルについて高速液クロマトグラフイー（カラ
ムはμＢＯＮＤＡＰＡＫ−Ｃｕｅ、アセトニトリルで０
．０５％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液０〜６
０％グラディエンド）により蛋白量を測定し。

この結果を第１表に示した。

洗立１淀２４ウエルのミクロタイタープレートの各ウェルに２．
５　Ｘ　ｌｏ’ｃｅｌｌ／１ｉｆｌのマウス胎児（ＡＫ
Ｒ）細胞を含む完全培地（ダルベツコの修正イーグル培
地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ、以下ｒＤＭＥＪと略す）に牛血清を５％添加
したもの〕を１ｍＭずつ分注した。これを５％の炭酸ガ
スを含む空気下に３７℃の温度で一晩インキユベートし
た後、培地を牛血清２％含む完全培地と交換し、同条件
で５〜７日間インキュベートした。

次に、上記で得たアナログ１をＤＭＥで１０２〜１０’
倍に希釈し、各ウェルに１００μΩづつ加えた。ネガテ
ィブコントロールとしてＤＭＥ、ポジティブコントロー
ルとして同様に希釈した上皮細胞成長因子（ＥＧＦ、　
Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社製）
を用いた。

１８時間インキュベートした後、３Ｈ−チミジン（’Ｈ
−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｓ、　ＮＥＮ社製）をＤＭＥで２０
　ｐ　Ｃ３ＩｍＱに希釈し、各ウェルに１００μΩづつ
加え、４時間インキュベートした。　。

次いで、各ウェルから培地を除き、塩化ナトリウム１３
８ｓ＋Ｍ、塩化カリウム２．７＋Ｍ、　リン酸水素二ナ
トリウム８＋ｓＭ及びリン酸二水素カリウム１　、５ｍ
Ｍを含み、　ｐＨ７，３のバッファー液で、数回細胞を
洗浄した後、各ウェルに、０．５％ラウリル硫酸ナトリ
ウム及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸の水溶液を１０
０μＱを加え、室温で５分間放置して細胞を溶解させた
。

この細胞溶解液をグラスフィルターにしみ込ませ、５％
トリクロロ酢酸水溶液及びエタノールで洗浄した後、シ
ンチュレーションカウンターで、５分間１日を測定した
。希釈倍率による変化をグラフにし、標準であるＥＧＦ
の場合と比較し、ＤＮＡ合成促進活性をＥＧＦ相当で求
めた。この結果を促進活性として第１表に示した。

実施例２前述したアナログ２のアミノ酸配列に基づき、構造遺伝
子を得た。即ち、実施例１の構造遺伝子において、ペプ
チドのアミノ酸配列２０番目に対応するＤＮＡのコード
する鎖側をＧＡＡ、コードしない鎖側をＣＴＴとグルタ
ミン酸に対応するＤＮＡとし、またアミノ酸配列３５番
目に対応するＤＮＡのコードする鎖側をＣＡＴ、コード
しない鎖側をＧＴＡとヒスチジンに対応する［）ＮＡと
した以外は、全〈実施例１と同じに構造遺伝子を合成し
、同様に形質転換株を得た。得られた形質転換株をＥ、
ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　　ｐＥＸ−１４Ｇｌｕ２０　と
命名し、微工研にＦＥＲＮ　ＢＰ−１３９５として寄託
された。これを用いて実施例１と同じ操作及び評価を行
った。この結果も第１表に示した。

実施例３前述したアナログ３のアミノ酸配列に基づき、構造遺伝
子を得た。即ち、実施例１の構造遺伝子において、ペプ
チドのアミノ酸配列２５番目に対応するＤＮＡのコード
する鎖側をＯＣＴ、コードしない鎖側をＣＧＡとアラニ
ンに対応するＤＮＡとし、またアミノ酸配列３５＃ｒ目
に対応するＤＮＡのコードする鎖側をＣＡＴ、コードし
ない鎖側をＧＴＡとヒスチジンに対応するＤＮＡとした
以外は、全〈実施例１と同じに構造遺伝子を合成し、同
様に形質転換株を得た。

得られた形質転換株をＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　　ｐ
ＥＸ−１４Ａｌａ２５と命名し、微工研にＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−１３９６として寄託された。これを用いて実施例１
と同じ操作及び評価を行った。この結果も第１表に示し
た。

（比較例１）実施例１の構造遺伝子において、ペプチドのアミノ酸配
列３５番目に対応するＤＮＡのコードする鎖側をＣＡＴ
、コードしない鎖側をＧＴＡとヒスチジンに対応するＤ
ＮＡとして、ｈＴＧＦ−αを産生させた以外は。

全〈実施例１と同じ操作及び評価を行った。この結果も
第１表に示した。

（比較例２）実施例１の構造遺伝子において、ペプチドのアミノ酸配
列２７番目に対応するＤＮＡのコードする鎖側をＯＣＴ
、コードしない鎖側をＣＧＡとアラニンに対応するＤＮ
Ａとし、またアミノ酸配列３５番目に対応するＤＮＡの
コードする鎖側をＣＡＴ、コードしない鎖側をＧＴＡと
ヒスチジンに対応するＤＮＡとした以外は、全〈実施例
１と同じ操作及び評価を行った。この結果も第１表に示
した。

（比較例３）実施例１の構造遺伝子において、ペプチドのアミノ酸配
列１８番目に対応するＤＮＡのコードする鎖側をＧＣＴ
、コードしない鎖側をＣＧＡとアラニンに対応するＤＮ
Ａとし、またアミノ酸配列３５番目に対応するＤＮＡの
コードする鎖側をＣＡＴ、コードしない鎖側をＧＴＡと
ヒスチジンに対応するＤＮＡとした以外は、全〈実施例
１と同じ操作及び評価を行った。この結果も第１表に示
した。

第　　１　　表この結果から本発明の新規ペプチドがＤＮＡ合成促進活
性に優れ、創傷の治癒促進に著しく効果が有ることが分
かる。

（発明の効果）本発明の新規ペプチドは、従来のｈＴＧＦ−αに比べＤ
ＮＡの合成を著しく促進させる作用があり、創傷の治癒
の促進剤として格別の効果を奏するものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の構造式【遺伝子配列があります】（式中、ＹがＶａｌ、ＺがＨｉｓの場合、ＸはＧｌｕを
、ＸがＴｈｒ、ＺがＨｉｓの場合、ＹはＡｌａを、Ｘが
Ｔｈｒ、ＹがＶａｌの場合、ＺはＡｌａをそれぞれ示す
。）で表されるペプチド。
（２）次の構造式【遺伝子配列があります】（式中、ＹがＶａｌ、ＺがＨｉｓの場合、ＸはＧｌｕを
、ＸがＴｈｒ、ＺがＨｉｓの場合、ＹはＡｌａを、Ｘが
Ｔｈｒ、ＹがＶａｌの場合、ＺはＡｌａをそれぞれ示す
。）で表されるペプチドを有効成分としてなる創傷治療
剤。