JP5912152B2 - N末端ポリシアリル化 - Google Patents
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Description
体を合成する有用な方法について記載している。この方法は、Obermeierの3段階、保護/複合化/脱保護のスキームを拡張したものであるが、各段階の間で反応中間体を単離する必要がない(すなわち、ワンポット合成である)。したがって、インスリンは、A鎖1位のGly残基及びB鎖29位のLys残基において保護され、直ちにPEGと反応させられ、次いで種を単離する前に脱保護される。Liuらは、彼らのワンポット反応によって適切な位置異性体(すなわちPEG−B1−インスリン)が最大50%と、引き続く誘導体化にリサイクルし得る未反応インスリン30%を得ることができると主張している。これらのコンストラクトの調製が迅速に行われると仮定しても、完了するのに最低5日かかることになる。また、この発明では、許容し得る結果を達成するのに大過剰のPEG試薬が必要となる。この発明の生成物は有効であるかもしれないが、その調製にはやはり、タンパク質が、タンパク質に不利な環境(高pH及び低pH)において長時間にわたり3つの反応段階を経ることが必要となる。
。本発明者らは、インスリンにPSAを結合することによって前述したような特性が付与されることを見出した。
図2は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでシッフ塩基を選択的に還元して、タンパク質のアミノ基と安定な非可逆的共有結合を形成することを示す図である。
治療用として規制当局から要求される化学的に定義された複合体を製造する際には、非常にやっかいであると考えられる。
中の多糖の多分散度は1.3未満であり、さらに好ましくは1.1未満である。
えば糖残基上の1個若しくは複数の活性基の反応によって誘導体化された多糖、又は多糖鎖末端の誘導体化基に共有結合した多糖であってもよい。
mは、少なくとも1であり、
HNBは、インスリン又はインスリン様ペプチドのN末端であるB−NH2に由来しており、
Lは結合又は連結基であり、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
GlyOはアニオン性糖ユニットであり、
前記連結基は、存在する場合、一般式−Y−C(O)−R1−C(O)−で表され、
YはNR2又はNR2−NR2であり、R1は先に定義したような二官能有機基であり、R2はH又はC1−6アルキルである]。
るポリマーであってもよい。
te(商標)−担持型ホウ水素化物)。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物が、1μM〜0.1Mの範囲の濃度、4〜10の範囲のpH、0℃〜60℃の範囲の温度、及び1分〜72時間の範囲の期間で、還元剤として使用される。出発原料上のペンダントカルボキシル基が還元されない反応条件が選択される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でのシアノホウ水素化物(cyanoborohydride)、例えば、ポリマー担持型シアノホウ水素化物又はアルカリ金属シアノホウ水素化物、L−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、L−セレクトリド、トリアセトキシホウ水素化物等である。
pHの第1の水溶液中で実施すべきであり、得られた多糖誘導体は次いで第1の水溶液よりpHが高い第2の水溶液中で精製すべきである。酸性pHとは、7より低い値のpHを意味する。通例、第1の水溶液のpHは4.0〜6.5、好ましくは4.0〜6.0の範囲であり、第2の水溶液のpHは6.5〜9.0、好ましくは6.5〜8.5又は6.5〜8.0の範囲である。誘導体化反応を低pHで行うことによって、選択的誘導体化はタンパク質の中間鎖位置においてよりもN末端において促進される。
レゾルシノール試薬を用いたポリシアル酸(シアル酸として)の量的評価を、他の文献[Gregoriadisら、1993年、FernandesとGregoriadis、1996年、1997年]に記載されているようなレゾルシノール法[Svennerholm、1957年]により実施した。タンパク質は、BCA比色法又は280nmでのUV吸収法によって測定した。
新たに調製した0.02Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)溶液(8倍モル過剰)を20℃でCAと混合し、この反応混合物を暗所で15分間磁気攪拌した。次いで、2倍体積のエチレングリコールをこの反応混合物に添加して過剰NaIO4を消費し、この混合物を20℃でさらに30分間攪拌した。酸化コロミン酸(CAO)を、4℃で、0.01%炭酸アンモニウムバッファー(pH7.4)に対して長時間(24h)透析した(分画分子量3.5kDa透析チューブ)。限外濾過(分画分子量3.5kDa)を使用して透析チューブからのCAO溶液を濃縮した。所定の体積まで濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、次に使用するまで−40℃で保管した。あるいは、CAOをエタノールを用いた沈殿(2回)によって反応混合物から回収した。
2,4ジニトロフェニルヒドラジン(2,4−DNPH)を用いてコロミン酸の酸化度の質的評価を実施した。2,4ジニトロフェニルヒドラジンは、カルボニル化合物との相互作用で難溶性の2,4ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる。非酸化物(CA)/酸化物(CAO)を2,4−DNPH試薬(1.0ml)に添加し、それぞれの溶液を振とう
した後、結晶状の沈殿が認められるまで37℃で静置した[Shrinerら、1980年]。CAの酸化の程度(量的)を、アルカリ溶液中でフェリシアン化物イオンが還元されるとフェロシアン化鉄(プルシアンブルー(Persian blue))になることに基づく方法[ParkとJohnson、1949年]を用いて測定し、次いで630nmで測定した。この例では、グルコースを標準として使用した。
コロミン酸の試料(CAとCAO)を、NaNO3(0.2M)、CH3CN(10%、5mg/ml)に溶解し、屈折率を検出する2×GMPWXLカラムでクロマトグラフィーによる分離を行った(GPCシステム:VE1121 GPC溶媒ポンプ、VE3580 RI検出器及びTrisec3ソフトウェア(Viscotek Europe Ltd)を使った照合)。各試料(5mg/ml)は0.45μmナイロン膜で濾過し、移動相として0.2M NaNO3とCH3CN(10%)を使って0.7cm/分で移動させた。
PEG化の化学反応のルールは、ポリシアリル化には適用することができない。なぜならば、これら分子では物理化学的特性が異なるからである。PSAは酸に不安定なポリマーであり、中性pH付近において数週間安定である(図3)。図3の結果は、pH6.0及び7.4においてCAOが8日間安定であること、pH5.0ではゆっくりと分解する(48時間後には最初の分子量の92%)こと、pH4.0でもゆっくりと分解する(48時間後には最初の分子量の70%)ことを示している。ポリシアル酸は高度に親水性であるが、PEGは両親媒性分子である。PEG化に使う条件を用いてポリシアリル化を実施すると、多くの場合タンパク質の凝集及び沈殿が見られる。
6.1 インスリン−CA複合体の調製(N末端法)
インスリン(5804Da)を白色固体として供給した。このインスリンを最小量の100mM HClで溶解し、次いで所定のpHに調整して氷の上に置いた。複合化のために添加すべきCAOの量は、下式に基づいて算出した。
CAOの重量={タンパク質の量(g)/(タンパク質の分子量)}×(CAOの分子量)×(CAOのモル過剰)
必要量のCAOを秤量した。CAOをpH6.0の10mM NaOAcに可溶化し、全CAOが溶解するまでこの混合物を穏やかにボルテックスで撹拌し、次いですべての凝集/沈殿物を除去すべく濾過して新しい容器に入れた。必要量のインスリンタンパク質溶液をこのCAO溶液に添加して7.5モル過剰(小規模)及び5モル過剰(大規模)のCAOを得、その反応混合物を4±1℃の穏やかな振とう機に置いておくことによって穏やかに混合した。100mg/ml NaCNBH3溶液を添加して最終反応混合物において8mg/mlとなるようにし、穏やかに混合した後、最終反応混合物のpHを確認し、場合によって、4±1℃で0.5M NaOH/HClを用いてpHを6.0に調整した。最後に、pH6.0の10mMのNaOAcを用いて反応混合物の体積を調整し、反応混合物中のタンパク質濃度を1mg/mlとした。チューブを密封し、所望の温度(4±1℃)で24時間攪拌した。適当な方法(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンバッファー、pH7.4)によって反応を停止し、SDS−PAGE(18%トリスグリシンゲルを使用)、SE−HPLC(Superose 12カラム)用に試料を取り出し、反応混合物のpHを確認した。すべての沈殿物を取り除くために、SE−HPLC分析及び精製の前に、反応混合物を13000rpmで5分間遠心した。SE−HPLC用の好ましいバッファーは、0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.9)であった。
N末端誘導体化及び無作為誘導体化のために、インスリン上に一定範囲の分子量を有するCAO(10〜30kDa)を用いて還元的アミノ化を実施した。複合化反応のためのプロセス変数の範囲を調べた。CAO10〜20(小規模)及び5〜10(大規模)モル過剰。試薬=50〜100mM NaCNBH3、反応用バッファー=10mM NaOAc pH5.5〜6.5、温度=4±1℃、時間=16〜24時間など。
前記混合物から遊離CAOを除去するために、HIC(HiTrap Butyl FF)を使用した。インスリン反応混合物を、濃縮(NH4)2SO4(例えば3M)、20mM Na2HPO4(pH7.4)を用いた最小限の体積で希釈してローディング溶液を調製し、ローディング溶液の(NH4)2SO4濃度を0.8Mとする。pHが7.4であるかどうか確認するか、0.5M HCl/NaOHで調整する。このローディング溶液は0.2μm膜フィルターで濾過する必要がある。
洗浄:グラジエントシステム:IECバッファーA:90%、AEXバッファーB(20mMリン酸バッファー+1M NaCl、pH7.4):10%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:68%、IECバッファーB:32%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:35%、IECバッファーB:65%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:0%、IECバッファーB:100%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
精製複合体を含有するIEC画分を合わせ、バッファーをPBSバッファーに変えて洗浄し塩を除去する。塩除去後のpHを7.4に調整する。次いで、溶液を4±1℃で濃縮し、タンパク質濃度をUV分光法(280nm)で分析した。複合体を滅菌濾過し、活性
測定用及びSDS−PAGEとSE−HPLCによる特性評価用に試料を取った。必要に応じて、アリコートをタンパク質定量及びCA定量用に取り除いた。残りは、再び使用するまで、またSE−HPLCによる物理的安定性を調べるまで4±1℃で保管した。
インスリン(5808Da)を白色固体として供給した。このインスリンを、最小限量の100mM HClを添加して溶解し、所与のpHに調整して、氷上に置いた。複合化のために添加する14kDa CAの量は、下式に基づいて算出した。
14kDaCAOの重量={タンパク質の量(g)/(タンパク質の分子量)}×(CAOの分子量)×(CAOのモル過剰)
14kDa CAOの必要量を秤量した。14kDa CAOを、10mMリン酸バッファー、pH6.0に可溶化し(最終反応体積の20%体積をここで使用した)、すべての14kDa CAOが溶解するまでこの混合物を穏やかにボルテックス撹拌し、次いですべての凝集/沈殿物を除去すべく濾過して新しい容器に入れた。必要量のインスリンタンパク質溶液をこの14kDa CAO溶液に添加して7.5モル過剰(小規模)及び5モル過剰(大規模)の14kDa CAOを得、その反応混合物を4±1℃の穏やかな振とう機に置いておくことによって穏やかに混合した。100mg/ml NaCNBH3溶液を添加して最終反応混合物において63.5mM又は4mg/mlとなるようにし、穏やかに混合した後、最終反応混合物のpHを確認し、場合によって、4±1℃の0.5M NaOH/HClでpHを6.0に調整した。最後に、pH6.0の10mMのNaOAcを使って反応混合物の体積を調整し、反応混合物中のタンパク質濃度を1mg/mlとした。チューブを密封し、所望の温度(4±1℃)で24時間攪拌した。適当な方法によって反応を停止し、SDS−PAGE(18%トリスグリシンゲルを使用)、SE−HPLC(Superose 12カラム)用に試料を取り出し、反応混合物のpHを確認した。すべての沈殿物を取り除くために、SE−HPLC分析及び精製の前に、反応混合物を13000rpmで5分間遠心した。SE−HPLC用の好ましいバッファーは、0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.9)であった。
N末端誘導体化及び無作為誘導体化のために、インスリン上に一定範囲の分子量を有するCA(10〜30kDa)を用いて還元的アミノ化を実施した。複合化反応のためのプロセス変数の範囲を調べた。CAO 10〜20(小規模)及び5〜10(大規模)モル過剰。試薬=50〜100mM NaCNBH3、反応用バッファー=10mMリン酸バッファー、pH5〜7.4、温度=4〜37±1℃、時間=16〜24時間など。
混合物から遊離CAOを除去するために、HICを使用した。インスリン反応混合物を、濃縮(NH4)2SO4(例えば3M)、20mM Na2HPO4(pH7.4)を使った最小限の体積で希釈してローディング溶液を調製し、ローディング溶液の(NH4)2SO4濃度を0.8Mとする。pHが7.4であるかどうか確認し、7.4でなければ0.5M HCl/NaOHで調整する。このローディング溶液は0.2μm膜フィルターで濾過する必要がある。
20(MW:5Kd)で除去する。pHを確認し、必要であればpH7.4に調整する。予めIECバッファーAで平衡化しておいたIECカラムにロードする。下記のようにしてグラジエントシステムを適用した。
洗浄:グラジエントシステム:IECバッファーA:90%、AEXバッファーB(20mMリン酸バッファー+1M NaCl、pH7.4):10%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:68%、IECバッファーB:32%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:35%、IECバッファーB:65%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:0%、IECバッファーB:100%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
精製複合体を含有するIEC画分を併せ、バッファーをPBSバッファーに変えて洗浄し塩を除去する。塩除去後のpHを7.4に調整する。次いで、溶液を4±1℃で濃縮し、タンパク質濃度をUV分光法(280nm)で分析する。複合体を滅菌濾過し、活性測定用及びSDS−PAGEとSE−HPLCによる特性評価用に試料を取った。必要に応じて、アリコートをタンパク質定量及びCA定量用に取り除いた。残りは、再び使うまで、またSE−HPLCによる物理的安定性を調べるまで4±1℃で保管した。
4℃で冷蔵されたJasco AS−2057 plusオートサンプラー、Jasco UV−975 UV/VIS検出器を装備したLiquid Chromatograph(JASCO)でHPLCを実施した。データは、IBM/PCでEZchrom
Eliteソフトウェアを使って記録した。SEC試料を、0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.9の均一濃度の移動相を用いて、Superose 12カラムで分析した(図8)。図8は、インスリンに起因すると考えられる、RT=75.408におけるただ1つのピークを示す。
18%トリグリインゲル(triglyine gel)を用いてSDS−PAGEを行った。試料を
還元又は非還元バッファーのいずれかで希釈し、タンパク質5.0μgを各ウェルにロードした。ゲルをトリグリセリン緩衝系で泳動し、クーマシーブルーで染色した(図5及び7)。抗PSA抗体を使ってウェスタンブロットを行った。図4は、インスリン製剤(部位特異的、N−末端)のSDS−PAGEを示す。
Novex(登録商標)IEFゲルを用いて、インスリンとCAO−インスリン複合体等電点の差を測定した。試料を溶解して0.5mg/ml濃度とした。5μlの試料を5μlのNovex IEF試料バッファー、pH3〜10で希釈した後、タンパク質試料をゲルにロードした。
滅菌インスリン複合体をPBSバッファー中、4℃で、6週間保管した。試料の未変性PAGEを毎週行った。
インスリン製剤のin vivoでの有効性を、雌CD−1マウス、7〜8週齢で調べた。0.3 IUのタンパク質量(同一の活性)をマウスに皮内注射した。マウスは4匹ずつ7群に分け、インスリン製剤を、各群の各マウスに下記のように投与した。インスリン(0.3 IU/マウス)、Lantus(Aventis)インスリン−PSA複合体(14kDa)、PBS。各マウスから血液1滴を取り、血中グルコースをアキュチェックアクティブ(ACCU−CHEK Active)(Roche Diagnostics)で測定した。
CAの活性化及び酸化度の測定
N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)残基の線状α−2,8結合ホモポリマーであるコロミン酸(CA)を使用した。20mM過ヨウ素酸塩を用いて、コロミン酸の酸化曝露を室温で15分間実施した。過ヨウ素酸塩処理後の内部α−2,8結合Neu5Ac残基の完全性を、ゲル浸透クロマトグラフィーで分析し、酸化(CAO)物質に関して得られたクロマトグラフを、未酸化CAのクロマトグラフと比較した。酸化CA及び未酸化CAはほぼ一致した溶離プロファイルを呈していることが分かったが、連続する酸化工程がポリマー鎖の著しい開裂を引き起こしているという証拠はない。
温度、反応剤モル比、及び鎖長を変えながら、CAOとrh−インスリン1mgを使ってポリシアル化条件を最適化した。結果を図5〜12に示す。4℃は、CAOとインスリンの反応の間の安定性に関して最適な温度であるように思われる。しかし、これより高い温度では、複合化がより大きくなり、CAOのインスリンに対するモル比が7.5:1でより効果的になることができる。
15kDa CAO−インスリンのin vivo有効性に及ぼすpHの影響から、pH6.0の方がpH7.4よりもより有効であることが分かった。したがって、以後の実験はpH6.0で実施した。ペプチドマッピング及びエドマン分解からのデータによって、pH6.0のポリシアル化条件で得られた複合体が、インスリンB鎖においてN末端で特異的にブロックされることが確認された。
単分散CAO−インスリンをうまく複合化することができ、高度に純粋な複合体をスケールアップHIC及びIECによって精製することができた。精製効率は、図10に明示するようなIEC及びHICを分取HPLC機器と組み合わせた装置によって向上した。
700mgの出発反応物としてのインスリンの例では、スケールアップカラム精製を使って230mgの14kDa CAO−インスリン(タンパク質重量)を得た。
Claims (22)
- (a)インスリン又は(b)インスリン様タンパク質のポリシアル酸誘導体の集団を含む組成物であって、前記ポリシアル酸が10〜20kDaの範囲の分子量を有し、かつ前記誘導体のうち少なくとも85%が、インスリン又はインスリン様タンパク質のB鎖のN末端のみにおいてポリシアル酸の非還元末端により誘導体化されている、組成物。
- 前記ポリシアル酸が、約14kDaの分子量を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリシアル酸が、20〜60個の多糖ユニットを有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記インスリン様タンパク質が、核酸レベルにおいてインスリンと80%又はそれ以上の同一性を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記インスリン様タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列を有するインスリン前駆体タンパク質由来のヒトインスリンが有する活性の少なくとも50%を有する、請求項1に記載の組成物。
- 糖尿病の治療のための、請求項1〜5のいずれかに記載の組成物。
- さらに、1又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記薬学的に許容される賦形剤が、1又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール及びアミノ酸からなる群から選択される、請求項7に記載の組成物。
- 前記安定化剤が、糖及びポリオールからなる群から選択される、請求項8に記載の組成物。
- 前記糖又はポリオールが、スクロース、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、マンニトール、ラクトース及びエチレングリコールからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
- 前記可溶化剤が、界面活性剤である、請求項8に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、Tween80、Tween20、Tween40、Pluoronic F68、Brij 35及びTriton X−100からなる群から選択される1又は複数の非イオン性界面活性剤である、請求項11に記載の組成物。
- 前記金属イオンが、Zn2+、Ni2+、Co2+、Sr2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、及びFe2+からなる群から選択される2価のイオンである、請求項8に記載の組成物。
- 前記ポリマーが、PSA、PEG及びヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択される、請求項8に記載の組成物。
- 前記保存剤が、m−クレゾールである、請求項8に記載の組成物。
- 前記アミノ酸、又はアミノ酸誘導体が、ヒスチジン、グリシン、その他類似のアミノ酸、及びアスパラギン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項8に記載の組成物。
- 糖尿病の治療に使用される組成物であって、
一般式(I)で表される多糖誘導体
mは10〜80であり、
HNBは、インスリン又はインスリン様タンパク質のB鎖のN末端であるB−NH2に由来しており、
Lは、結合又は連結基であり、若しくはポリペプチドを含み、
GlyOは、ポリシアル酸であり、
前記連結基は、存在する場合、一般式−Y−C(O)−R1−C(O)−で表され、 Yは、NR2又はNR2−NR2であり、R1は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン、及びアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択される二官能有機基であり、これらの二官能有機基はいずれもカルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド及び/又はアミン結合によって置換及び/又は介在されていてもよく、
R2は、H又はC1−6アルキルである。]、及び
1又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸、並びに
1又は複数の薬学的に許容される賦形剤
を含む、組成物。 - mが20〜60個のシアル酸ユニットである、請求項17又は18に記載の組成物。
- mが40〜50個のシアル酸ユニットである、請求項19に記載の組成物。
- 前記薬学的に許容される賦形剤が、1又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール及びアミノ酸からなる群から選択される、請求項17に記載の組成物。
- Lが結合である、請求項19に記載の組成物。
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