CN103638516B - 一种包含尿酸氧化酶的药用组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供可作为医药品基质使用的尿酸氧化酶（UOX）组合物及其制备方法。该组合物包含在尿酸氧化酶的m个氨基上结合精制卵磷脂残基（PC），精制的卵磷脂残基如下述通式（I）所示，其中m为1-16的整数，结合卵磷脂残基的尿酸氧化酶表示为PC-UOX。该药用组合物以前述尿酸氧化酶氨基被精制卵磷脂残基结合的PC-UOX为主成分，由PC-UOX（m）（m=1-16）组成。

Description

一种包含尿酸氧化酶的药用组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种包含尿酸氧化酶的药用组合物及其制备方法，具体来讲，涉及在来源于微生物、动物、植物尿酸氧化酶（UOX）中结合精制卵磷脂残基制得的药用组合物及其制备方法、精致工序等。

背景技术

尿酸氧化酶是生物体内一种重要的酶，能够将溶解度较低的尿酸代谢为溶解度较高的尿囊素，再通过排泄系统排出体外，防止在体内累积较高浓度的尿酸。在人进化历史上，由于发生编码尿酸氧化酶的基因发生了突变导致人体内无法合成尿酸氧化酶，无法将尿酸降解为尿囊素。

若长时间的在排泄尿酸或尿酸生成上出现故障后，体内尿酸被累积，由于尿酸在血浆中溶解度较低，导致易沉积结晶在体内温度较低的四肢关节等部位，形成痛风，进一步结晶沉积结块会侵蚀关节部位的骨骼。

癌症化疗过程中细胞的大量死亡，造成瞬时的尿酸大量生成，血尿酸的浓度的升高也会给患者造成很大的风险。

黄曲霉提取的尿酸氧化酶作为一种治疗药物，能很快的降解尿酸，降低人体内的血尿酸浓度，从20世纪70年代起就用于癌症化疗过程中的血尿酸浓度的迅速上升的治疗。在生物技术迅速发展的20世纪90年代，更高质量的重组的尿酸氧化酶替代了天然来源的尿酸氧化酶，用于癌症化疗中。

而尿酸氧化酶作为药物治疗痛风时，由于其较大的分子量（120kDa），外源的尿酸氧化酶在人体内很容易造成很大的免疫原性，无法用于作为一种长期的代谢疾病痛风的药物，并且尿酸氧化酶在人体内的半衰期很短，限制了尿酸氧化酶在人体内活性的作用。

在21世纪，聚乙二醇（PEG）化修饰能包裹尿酸氧化酶的表面抗原位点，大大的降低免疫原性，同时也避免了被快速地降解增加了半衰期。PEG化的尿酸氧化酶已经被批准作为一种治疗难治性痛风的药物。

但是，近年来研究发现PEG化的尿酸氧化酶快速降解体内血尿酸，溶解痛风石的同时会带来小的痛风结晶从痛风石上扩散开来，和免疫细胞内的信号分子结合，造成严重的炎症反应，导致痛风的反复发作。这些缺陷和不足限制了PEG化尿酸氧化酶在临床中应用。

中国专利申请CN101302501B，发明名称为“聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用”中公开了聚乙二醇化的尿酸氧化酶制备以及使用，由此方法获得的PEG化尿酸氧化酶无法进入胞内来代谢胞内的尿酸晶体，而且容易造成上述的炎症反应，导致痛风的反复发作，给患者带来了痛苦。

针对目前尿酸氧化酶应用中存在的不足和缺陷，申请人进行潜心研究发现，将具有良好细胞亲和性精制卵磷脂残基特定结合在尿酸氧化酶的氨基上制得的结合了精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶药用组合物，可以克服PEG化尿酸氧化酶的免疫原性问题，同时大大提高尿酸氧化酶的半衰期，细胞亲和性高，容易进入人体内的细胞中，代谢细胞内的尿酸晶体，可以很好地防止在溶解痛风石的同时微小痛风结晶的扩散，抑制了痛风的反复发作。

发明内容

本发明的目的是提供一种可作为医药品基质使用的包含尿酸氧化酶的药用组合物。

本发明的另一目的是提供该尿酸氧化酶药用组合物的制备方法以及精制工艺等。

本发明者进行研究后发现，特定的尿酸氧化酶（UOX）的1-16个氨基被精制的卵磷脂残基结合后制得的尿酸氧化酶（PC-UOX）为主成分的药用组合物可解决前述课题。对制备该PC-UOX组合物的条件进行探索后发现，通过精制的卵磷脂残基与特定的UOX以特定比例反应，采用特定的精制方法进行精制，可以高收率的获得PC-UOX组合物。

本发明目的是通过如下技术方案实施的：

一种包含尿酸氧化酶的药用组合物，其中尿酸氧化酶来源于微生物，动物或植物，该组合物中以尿酸氧化酶的m个氨基上结合如下述通式（I）所示的精制卵磷脂残基的组合物A为主成分：

表示的精制卵磷脂残基，其中m为1-16的整数。

其中，微生物来源包括假丝酵母菌或黄曲霉；动物来源为除人和猿类以外的哺乳动物；植物来源包括豆类植物的根或叶。

其中，精制卵磷脂残基的纯度大于98%。

该药用组合物中还可以含有尿酸氧化酶的16个以上的氨基上结合前述通式（I）表示的精制卵磷脂残基的组合物B。

利用高校液相色谱法测定的组合物A和组合物B的比例之和相对于尿酸氧化酶的总量在90%以上，其单位为色谱图的峰面积%。

其中，组合物A的比例相对于结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶的总量在90%以上，其单位为色谱图峰面积%。

利用尿酸降解法测定的尿酸氧化酶组合物的活性为每1mg该药用组合物的活性单位值在2单位以上。

组合物A含有以4或8分子m相同或不同的结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶缔合的四聚体或八聚体形式。

实施相对1摩尔的下述通式（II）：

表示的精制卵磷脂衍生物，使用0.005-0.4倍摩尔的来自微生物，动物或植物的尿酸氧化酶与其反应，获得结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶粗品，通过利用离子交换柱色谱法对该粗品进行精制工序，制造权利要求1-7中任一项所述的含有精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶组合物，通式（II）中，R为碳数8-30的烷基，Z为羟基或从形成活性酯的基团除去了羧基而得的基团，n为2-10的整数。

其中，精制工艺为使用溶剂C使制造结合卵磷脂残基的尿酸氧化酶粗品中未反应的尿酸氧化酶吸附于离子交换树脂中，使结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶组合物穿透析出；溶剂C由无机盐浓度为5-100mM的pH6-11，含有0.5%-5%的非离子型去污剂组成的缓冲液。

实施发明的最佳方式

本发明的PC-UOX组合物包含来自微生物、动物或植物的尿酸氧化酶的一个以上的氨基被通式（I）表示的卵磷脂残基取代的结构的PC-UOX。

对用于该PC-UOX的制备的UOX获得方法无特别限定，可以是来自假丝酵母或黄曲霉的UOX，也可以是其他来源的UOX。即，本发明的来自假丝酵母的UOX是具有与来自假丝酵母的UOX类似结构的UOX，来源可以是任意的。

本发明中，该药物组合物由结合精制卵磷脂残基的PC-UOX和未结合的UOX构成。

通式（I）表示的卵磷脂残基（以下称为卵磷脂残基（I））中，R为碳数8~30的烷基，优选碳数14~22的烷基。R优选直链结构或支链结构，特好为直链结构。R优选碳数13,15或17的直链烷基，特好为碳数15的直链烷基。

n为2~10的整数，优选2~6，特好为3。

本发明中，PC-UOX组合物中所包含的PC-UOX是UOX的一个以上的氨基被精制卵磷脂残基（I）结合的化合物为主成分。由于来自假丝酵母的UOX单个肽链中存在30个氨基，所以PC-UOX的精制卵磷脂残基结合的总数可能为1-30。

本发明的PC-UOX组合物是以该精制卵磷脂残基（I）数（m）为1-16的整数，且m的平均值为5-8的PC-UOX（A）为主成分。m是与存在于PC-UOX（A）中的氨基结合的卵磷脂残基（I）的结合数。

“以PC-UOX（A）为主成分”是指包含于PC-UOX组合物的PC-UOX的量比中，PC-UOX（A）的比例最大。相对于PC-UOX组合物所包含的PC-UOX总量的PC-UOX（A）的比率优选质量比例85%以上，特好为质量比例90%以上。

PC-UOX的卵磷脂残基的结合数较多时，由于疏水性提高，所以与细胞的结合性提高，易于被吸收入脂肪组织等。此外，在生物体内的稳定性也提高。另一方面，PC-UOX的氨基残基的结合数较少时，由于亲水性提高，所以易于在注射剂等水性制剂中的应用。另外，在生物体内的酶活性也提高，具有生物体内作为抗原被识别的可能性下降。

本发明的PC-UOX组合物中所含的PC-UOX（A）的比例最好考虑各方面的因素来进行控制。

本发明的PC-UOX组合物除了PC-UOX（A）以外，还可含有PC-UOX（B）。

存在于PC-UOX（B）中的卵磷脂残基（I）数（r）为17-30。由于存在于PC-UOX中的立体结构内部的氨基不易被结合，所以通常情况下r优选17-20。但是由于磷脂化程度较高的PC-UOX，疏水性较强易沉淀，在精纯过程中会被去除。则大部分的PC-UOX为PC-UOX（A）。

例如，利用高效液相色谱法（以下简称HPLC）测定的PC-UOX（A）的比例相对于PC-UOX组合物的总量优选90%以上，特好为95%以上。

另外，利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的PC-UOX的比例相对于PC-UOX组合物的总量优选90%以上，特好为95%以上。

HPLC和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的测定条件可采用后述的是实例中记载的条件。

将PC-UOX的比例控制为前述特定比例的情况下，通常能够获得酶活性的稳定性和生物体内的稳定性良好的PC-UOX组合物。另外，利用该分析方法的控制更有效。此外，所得PC-UOX组合物的稳定性更好，所以也易于制剂化。

本发明的PC-UOX组合物中，所包含的作为PC-UOX主成分的PC-UOX（A）最好为4分子m相同或者不同的PC-UOX结合的四聚体的形式。这样充分显现PC-UOX组合物的酶活性。

另外，PC-UOX中包含PC-UOX（B）时，也可由该PC-UOX（B）和PC-UOX（A）及/或PC-UOX（B）之间结合形成二聚体。

本发明的PC-UOX组合物有时包含PC-UOX（A）和PC-UOX（B）以外的化合物

本发明的PC-UOX组合物包含其他化合物时的量，以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的比例，优选20%以下，特好为0-15%。

本发明的PC-UOX组合物具有作为尿酸氧化酶的活性（UOX活性）。UOX活性最好作为以未被PC化的UOX，即假丝酵母的UOX为基准的单位活性值求得。

作为PC-UOX组合物的单位活性值的测定方法，已知酶活偶联显色法，紫外吸收尿酸定量法。

从测定的难易程度以及通用程度，准确性考虑，本发明的PC-UOX组合物的利用紫外吸收尿酸定量法测定的PC-UOX总量每1mg的单位活性值优选5单位以上，特好为7单位。

实施使特定量的来自假丝酵母的UOX和通式（I）表示的卵磷脂衍生物反应而获得未精制的PC-UOX的卵磷脂化工序后，实施利用离子交换柱色谱法对该未精制PC-UOX进行精制的精制工序，藉此可值得本发明的PC-UOX组合物。

通式（II）中，R、n与前述通式的R、n相同。

Z表示羟基或从形成活性酯的基团除去了羰基而得的基团。作为后一种基团，例如可例举对硝基苯酚、1,3,5-三氯苯酚、五氟苯酚、2,4-二硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基哌啶、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二酰亚胺、8-羟基喹啉、2-羟基吡啶等含羟基的化合物除去了羟基的氢原子而得的基团。活性酯体的合成法可采用公知的方法。

具体的制备方法如下：

【结合精制卵磷脂的工序】

该工序最好通过在来自假丝酵母的UOX溶于适当的溶剂而获得的UOX溶液中添加将前述通式表示的卵磷脂衍生物溶于适当的溶剂而获得的卵磷脂衍生物溶液的方法实施。具体来讲，相对于1摩尔卵磷脂衍生物，使0.005-0.4倍摩尔，优选0.01-0.05倍摩尔的来自假丝酵母的UOX与其反应，藉此可以高收率地获得本发明的PC-UOX组合物。

此时，通过调节添加速度，搅拌速度，反应温度，反应时间，反应压力等各种反应条件，能够以更高的收率获得本发明的PC-UOX组合物。

在UOX溶液中添加卵磷脂衍生物溶液的速度只要是卵磷脂衍生物可在短时间内分散于反应体系内的速度即可。

搅拌速度只要是卵磷脂衍生物可在短时间内分散于反应体系内的搅拌速度即可。

由于温度越高每1分子的UOX中的卵磷脂衍生物的导入数越多，所以反应温度的上限优选+20℃。反应温度的下限只要是反应液不会发生冻结的温度即可。反应温度优选0~10℃。

反应时间优选0.5小时~72小时，特好为2~24小时。

反应压力优选0.05~0.2MPa，特好为大气压附近的压力。

为了以更好的收率和更佳的品质制备本发明的PC-UOX组合物，对于包含于UOX溶液中的来自假丝酵母的UOX的浓度，卵磷脂衍生物溶液的添加方法等，最好设定更严密的条件。具体来讲，最好以100-20000倍量的溶剂稀释来自人的UOX，调制UOX溶液后，在该溶液中加入用20-200被量的有机溶剂稀释卵磷脂衍生物而得的卵磷脂衍生物溶液。

作为使UOX溶解的溶剂，可例举水或水和有机溶剂的混合溶剂。优选水。通过使用该溶剂，在添加卵磷脂衍生物溶液时可使反应体系均一化，放置沉淀物的产生。此外，最好使硼酸等溶于这些溶剂中而使其具备缓冲能力。

作为水，优选精制水、离子交换水、蒸馏水或注射用水（以下将它们总称为“水”）。作为有机溶剂，可例举异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1,4-二噁烷及甲醇等，优选异丙醇。

作为被用于PC-UOX的稀释的有机溶剂，可例示与被用于UOX溶液的调制的有机溶剂同样的溶剂，优选异丙醇。

以上获得的反应液（PC-UOX粗品）中，除了PC-UOX（A）以外，还共存有PC-UOX（B）、未反应的来自假丝酵母的UOX、未反应的UOX及其他成分。作为该其它成分，可例举来自被用于卵磷脂衍生物的合成的试剂的未反应物等。

【精制工序】

然后，实施利用脱盐柱或超滤等方法换液至有特定pH值，特定成分的缓冲液中，同时去除反应液中的有机溶液；而后使用离子交换柱色谱法对前述磷脂化工序获得的未精制的PC-UOX进行精制的精制工序。通过实施该精制工序，能够以高收率获得本发明的PC-UOX组合物。

精制工序可通过在填充有离子交换树脂的柱中加入前述未精制PC-UOX使其穿透洗脱，而前述缓冲液含无机盐。

作为离子交换树脂，可以任意使用阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。

作为用于溶解析出的溶剂所含的缓冲液，只要是含无机盐的具有缓冲能力的溶液即可，无特别限定。内含有一定浓度的非离子型去污剂。

作为无机盐，可例举氯化钠，硫酸铵等。它们可单独使用，也可作为任意比例的混合物使用。

作为非离子型去污剂，可例举吐温-20，吐温-80等。体积百分比为0.01%~1%，优选0.1%~0.5%。

具体来讲，最好通过下述步骤实施，即，将未精制的PC-UOX换入相应的溶剂A后，填充进入离子交换柱后，本发明的PC-UOX组合物直接析出，而未反应的UOX吸附在离子交换柱上，从而进行了分离。

溶剂A：由无机盐浓度为5~100mM的pH8.5~11的缓冲液和0.1%~0.5%的吐温-20组成。

本发明的PC-UOX组合物可作为医药品基质使用，通过添加各种添加剂、稀释等操作可制成制剂。

作为剂型形态，可例举注射剂（溶液、悬浊液、乳浊液、使用时在溶解的固体制剂等）、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂、脂质体制剂、凝胶剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散剂和栓剂等。

给药方法可采用注射（肌肉内、皮下、皮内、静脉内等）、口服、吸入等给药方法。给药量根据制剂的调制方法、剂型、疾病的种类、该制剂的给药方法、给药形态、使用目的、患者的体重等分别设定，例如成人一天0.5-200mg。

实施例

以下，对本发明的实施例进行说明，但是本发明的范围并不现定于这些实施例。

实施例1假丝酵母来源的UOX

（1）PC-UOX组合物的制备

在100mL试剂瓶中加入含1mg/mL的假丝酵母来源的UOX的30mLpH8.5的硼酸缓冲液（50mM硼酸，50mM氯化钾），放置在4℃下。

纯度大于98%的精制卵磷脂（0.012g）溶于6mL异丙醇制成卵磷脂溶液。溶液温度为4℃。以1mL/min的速度在前述UOX溶液中滴加该卵磷脂溶液6mL，将于50rpm搅拌4小时而得的溶液作为反应液。

将反应液加入预先使用碳酸盐缓冲液（20mMpH10.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，100mM氯化钠，0.1%的吐温-20）平衡的G-25脱盐柱进行脱盐换缓冲液。所获得的溶液加入使用碳酸盐缓冲液（20mMpH10.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，100mM氯化钠，0.1%的吐温-20）平衡的阴离子交换柱，收集流穿的PC-UOX蛋白溶液。

通过超滤膜或脱盐柱对PC-UOX组合物收集物进行缓冲液置换为磷酸盐缓冲液（20mMpH7.0磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液，100mM氯化钠），调整浓度，并去除可能的沉淀，获得浓度为2mg/mL的PC-UOX组合物溶液。

利用通用电气的分离用层析系统，AktaPurifier；阴离子交换柱采用强阴离子交换柱QSepharose；流动相为上述的碳酸盐缓冲液，在离子交换中采用0.5mL/min的流速。检测器采用UV检测器（波长220nm），柱温为室温。

对所得部分进行MALDITOF-MS分析，测定PC-UOX的分子量，求出与1分子的PC-UOX结合的卵磷脂衍生物的结合数。

（2）利用HPLC测定纯度试验例

在例1制得的溶于磷酸盐缓冲液的PC-UOX溶液，加入等量的注射用蒸馏水，获得分析用的样品。对分析用式样进行HPLC的分析结果是，相对于UOX总量的PC-UOX的比例为92.5%。

HPLC分析中，柱采用YMC-PackCN150×4.6mm，流动相A相为水，0.1%三氟乙酸；B相为乙腈，0.1%三氟乙酸；流速为1.0ml/min，检测器采用UV检测器（波长220nm），柱温为30摄氏度。

（3）利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓度测定例

用等体积水稀释例1制得的磷酸盐蛋白溶液，形成试样溶液。取1mg/mL尿酸氧化酶溶液作为对照。在20μL试样溶液和对照溶液中加入4μL上样缓冲液，沸水中加热3分钟。该试样缓冲液可按照以下步骤制得。即，将甘油，十二烷基磺酸钠，溴酚蓝溶于Tris-HCl缓冲液，形成100mL溶液，再从该溶液中取出95μL，添加2-巯基乙醇5μL调制而得上述试样缓冲液。

对经过前述处理的试样溶液和对照溶液各10μL实施电泳。电泳结束后，马上将凝胶移入染色缓冲液中染色。结束后，在保护液中浸渍30min，再将凝胶干燥。

对试样溶液的主条带以外的条带大小和对照的主条带大小进行比较，其结果是包含于UOX混合物中的PC-UOX的比例为90%。

（4）单位活性值的测定

尿酸的最大吸收峰在292nm处，而其氧化产物，尿囊素的最大吸收波长为224nm处，根据292nm处吸光度的变化情况来检测底物含量，进而计算酶活性。在30摄氏度下，pH8.5，每分钟氧化1μmol的尿酸定义为一个酶活单位。

配置如下的反应用缓冲液：45mM硼酸，46.8mM氯化钾缓冲液，调节pH至8.5。取缓冲液和适量体积的样品共140μL，加入1mM尿酸60μL混合后每分钟监控292nm的吸光光度值，根据斜率的变化计算尿酸氧化酶的酶活。

（5）大鼠体内半衰期的测定

取45只大鼠分为三组，每组15只，分别皮下注射5U/mLUOX，5U/mLPC-UOX和溶媒0.2ml。分别在0.5，1，3，6，12，24，36，48，72小时采血，制备血清后测定单位酶活，以测定酶活半衰期。UOX半衰期为4.3小时，而PC-UOX半衰期为60.3小时。

实施例2黄曲霉来源的UOX

（1）PC-UOX组合物的制备例

在100mL试剂瓶中加入含1mg/mL的黄曲霉来源的UOX的30mLpH8.0的硼酸缓冲液（50mM硼酸，50mM氯化钾），放置在4℃下。

将纯度大于98%的精制卵磷脂（0.012g）溶于6mL异丙醇。制成卵磷脂衍生物溶液。溶液温度为4℃。以1mL/min的速度在前述UOX溶液中滴加该精制卵磷脂残基溶液6mL，将于50rpm搅拌4小时而得的溶液作为反应液。

将反应液加入预先使用碳酸盐缓冲液（20mMpH10碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，100mM氯化钠，0.1%的吐温-20）平衡的G-25脱盐柱进行脱盐换缓冲液。所获得的溶液加入使用碳酸盐缓冲液（20mMpH10碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，100mM氯化钠，0.1%的吐温-20）平衡的阴离子交换柱，收集流穿的PC-UOX蛋白溶液。

通过超滤膜或脱盐柱对PC-UOX组合物收集物进行缓冲液置换为磷酸盐缓冲液（20mMpH7.0磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液，100mM氯化钠），调整浓度，并去除可能的沉淀，获得浓度为2mg/mL的PC-UOX组合物溶液。

利用通用电气的分离用层析系统，AktaPurifier；阴离子交换柱采用强阴离子交换柱QSepharose；流动相为上述的碳酸盐缓冲液，在离子交换中采用0.5mL/min的流速。检测器采用UV检测器（波长220nm），柱温为室温。

对所得部分进行MALDITOF-MS分析，测定PC-UOX的分子量，求出与1分子的PC-UOX结合的卵磷脂衍生物的结合数。

（2）利用HPLC测定纯度试验例

在例1制得的溶于磷酸盐缓冲液的PC-UOX溶液，加入等量的注射用蒸馏水，获得分析用的样品。对分析用式样进行HPLC的分析结果是，相对于UOX总量的PC-UOX的比例为95%。

HPLC分析中，柱采用YMC-PackCN150×4.6mm，流动相A相为水，0.1%三氟乙酸；B相为乙腈，0.1%三氟乙酸；流速为1.0ml/min，检测器采用UV检测器（波长220nm），柱温为30摄氏度。

（3）利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓度测定例

用等体积水稀释例1制得的磷酸盐蛋白溶液，形成试样溶液。取1mg/mL尿酸氧化酶溶液作为对照。在20μL试样溶液和对照溶液中加入4μL上样缓冲液，沸水中加热3分钟。该试样缓冲液可按照以下步骤制得。即，将甘油，十二烷基磺酸钠，溴酚蓝溶于Tris-HCl缓冲液，形成100mL溶液，再从该溶液中取出95μL，添加2-巯基乙醇5μL调制而得上述试样缓冲液。

对经过前述处理的试样溶液和对照溶液各10μL实施电泳。电泳结束后，马上将凝胶移入染色缓冲液中染色。结束后，在保护液中浸渍30min，再将凝胶干燥。

对试样溶液的主条带以外的条带大小和对照的主条带大小进行比较，其结果是包含于UOX混合物中的PC-UOX的比例为97%。

（4）单位活性值的测定

尿酸的最大吸收峰在292nm处，而其氧化产物，尿囊素的最大吸收波长为224nm处，根据292nm处吸光度的变化情况来检测底物含量，进而计算酶活性。在30摄氏度下，pH7，每分钟氧化1μmol的尿酸定义为一个酶活单位。

配置如下的反应用缓冲液：45mM硼酸，46.8mM氯化钾缓冲液，调节pH至8.5。取缓冲液和适量体积的样品共140μL，加入1mM尿酸60μL混合后每分钟监控292nm的吸光光度值，根据斜率的变化计算尿酸氧化酶的酶活。

（5）大鼠体内半衰期的测定

取45只大鼠分为三组，每组15只，分别皮下注射3U/mLUOX，3U/mLPC-UOX和溶媒0.2ml。分别在0.5，1，3，6，12，24，36，48，72小时采血，制备血清后测定单位酶活，以测定酶活半衰期。UOX半衰期为3.1小时，而PC-UOX半衰期为55.6小时。

Claims (5)

1.一种包含尿酸氧化酶的药用组合物，其特征在于，来源于微生物，动物或植物的尿酸氧化酶的m个氨基上结合如下述通式（I）所示的精制卵磷脂残基的组合物A为主成分：

表示精制卵磷脂残基，其中m为1-16的整数、R为碳数8-30的烷基、n为2-10的整数；

其中，组合物A含有以4或8分子m相同或不同的结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶缔合的四聚体或八聚体形式；

其中，该药用组合物中还含有尿酸氧化酶的17-20个氨基上结合前述通式（I）表示的精制卵磷脂残基制得的组合物B；

其中，利用高效液相色谱法测定的组合物A和组合物B的比例之和相对于尿酸氧化酶的总量在90%以上，其单位为色谱图的峰面积%；

其中，组合物A的比例相对于结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶的总量在90%以上，其单位为色谱图峰面积%。

2.根据权利要求1所述的一种包含尿酸氧化酶的药用组合物，其特征在于其中微生物来源选自假丝酵母菌或黄曲霉；动物来源为除人和猿类以外的哺乳动物；植物来源选自豆类植物的根或叶。

3.根据权利要求1所述的一种包含尿酸氧化酶的药用组合物，其特征在于，精制卵磷脂残基的纯度大于98%。

4.根据权利要求1所述的一种包含尿酸氧化酶的药用组合物，其特征在于，利用尿酸降解法测定的尿酸氧化酶组合物的活性为每1mg该药用组合物的活性单位值在2单位以上。

5.权利要求1-4任一项所述的一种包含尿酸氧化酶的药用组合物的制备方法，其特征在于，实施相对1摩尔的下述通式（II）：

表示的精制卵磷脂衍生物，使用0.005-0.4倍摩尔的来自微生物，动物或植物的尿酸氧化酶与其反应，获得结合精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶粗品，通过利用离子交换柱色谱法对该粗品进行精制工序，制造含有精制卵磷脂残基的尿酸氧化酶组合物，通式（II）中，R为碳数8-30的烷基，Z为羟基，n为2-10的整数。