CN102746405B - 重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质的化学修饰，公开了一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其中，EPO分子在第一种缓冲液中完成第一次PEG化反应后至少还包括以下步骤：将第一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进一步加入PEG进行第二次PEG化反应，得到最终反应液。本发明应用多缓冲体系的反应方法，实现了EPO的可连续PEG化反应，建立了一种具有较高单取代率、较低多取代率的PEG化反应方法。

Description

重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法

技术领域

本发明涉及蛋白质的化学修饰，尤其是涉及一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法。

背景技术

重组人促红细胞生成素（简称EPO），是保护和促进骨髓中造血干细胞分化、增殖和成熟为红细胞的特异性造血因子，由美国安进公司首先开发上市，在临床上用于治疗各种肾性贫血和非肾性贫血，被称为迄今技术最成熟、疗效最确切和全球销售额最高的基因工程药物。不过，该药物存在用药频繁（每周一针或三针）和生物活性低等主要问题，给患者带来较大的治疗痛苦和生活不便，因此有进一步修饰改良的需要，也就是开发长效化EPO药物。目前，国际上比较成熟的长效EPO药物之一，就是美国安进公司开发上市的第二代EPO制剂“Aranesp”，其半衰期比第一代EPO延长了2倍，可以实现每周只需注射1次的治疗方案，自上市以来，受到医院和病人的欢迎，在2008年的年销售额已达10亿美元以上，并超过了第一代EPO的市场年增长率。同时，聚乙二醇化（PEG化）作为一种很有效的制备长效蛋白质药物的化学修饰途径，也已应用于长效EPO药物的制备。以瑞士罗氏公司于2007年8月上市的“Mircera”为例，其药物活性成分就是单取代的PEG化EPO（mPEG-EPO），该药物拥有比“Aranesp”更为持久的半衰期，达到了大约134小时，可以实现每月只需注射2次或1次的治疗方案，进一步压缩了常规EPO药物的市场份额，形成了“长效、高活性、低治疗成本”的药物特点和竞争优势，从而显著地降低患者的治疗痛苦和经济负担，有效地提高了患者的生活质量。

而在PEG-EPO药物的研发过程中，PEG-EPO的合成反应工艺是非常关键的技术。一个好的PEG-EPO合成工艺可以显著地减低PEG-EPO药物的生产成本，同时直接影响到了最终所得PEG-EPO药物的生物活性以及药效。目前在国际上，比较成功的PEG-EPO药物是罗氏上市的“Mircera”，其合成工艺的单取代反应率大约在40%左右，同时多取代产物含量达到38%，其中的单取代产物是PEG-EPO合成反应的目标产物，具有较为确定的分子结构和较高的药物活性，而多取代产物则是反应的副产物，会加大后续纯化工艺的难度。此外，相比已有的其它PEG化蛋白质药物，EPO具有9个反应位点（如图1所示），包括8个赖氨酸残基和N端氨基，在反应中容易形成多取代产物，更难于实现特异性定点PEG化合成。以罗氏的PEG-EPO药物为例，其最终形成制剂的单取代PEG-EPO药物是由三种以上不同取代位置的单取代产物组成的，其主要的取代位置分别是氮端氨基酸、52位赖氨酸和45位赖氨酸。因此，PEG-EPO合成工艺的重点和难点在于提高单取代率，同时降低多取代率，以利于后续纯化工艺。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种单取代率高、多取代率低的重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法。

本发明的目的是通过以下技术措施实现的，一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其中，EPO分子在第一种缓冲液中完成第一次PEG化反应后至少还包括以下步骤：将第一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进一步加入PEG进行第二次PEG化反应，得到最终反应液。

为了使单取代率更高，在得到最终反应液前还包括以下若干步骤：将前一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的缓冲液中进一步加入PEG进行后一次PEG化反应。

作为一种优选方式，在得到最终反应液前还包括以下步骤：将第二次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液或第三种缓冲液中进一步加入PEG进行第三次PEG化反应。

具体的，所述第一种缓冲液包括pH6.5～7.5的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的缓冲液包括与第一种缓冲液pH值不重叠的pH6.0～9.0的磷酸缓冲液、pH7.4～9.0的硼砂缓冲液、pH9.0～12的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH4.5～7.0的醋酸缓冲液。

更具体的，所述第一种缓冲液包括pH7.2的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的缓冲液包括pH7.4的磷酸缓冲液、pH7.4的硼砂缓冲液、pH9.3的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH5.8的醋酸缓冲液。

一种优选的反应条件，所述PEG化反应方法包括将PEG与EPO混合反应至少2小时，反应pH值为7.0～7.5，所述PEG与EPO的摩尔比为10～25∶1，所述PEG中聚乙二醇的分子量为30,000～40,000道尔顿。

具体的，所述PEG与EPO的摩尔比为10～25∶1为全部PEG化反应步骤中PEG与EPO的摩尔比。

具体的，所述PEG化反应方法包括将PEG与EPO混合反应为2.5小时。

作为进一步提高单取代率的方式，还包括在最终反应液中纯化单取代PEG-EPO的步骤：将最终反应液经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EPO。

PEG-EPO合成工艺之所以单取代率低、多取代率高，是因为在第一次PEG化反应以后，所得PEG-EPO反应液具有较高的稳定性，未反应的EPO原液很难进一步与新加入的PEG试剂发生二次PEG化反应。其原因在于：反应液中已经水解失去活性的PEG试剂，在EPO分子周围形成的空间位阻很大，阻止了新加入的带有反应活性的PEG试剂与反应液中的游离的EPO分子的相互反应。同时，已经被单取代或多取代的EPO分子中可供修饰的氨基数目也变少了，并且剩下的位点比较难被修饰。

依据缓冲液可改变蛋白质构象或封闭某些反应部位的原理，在试验中发现，在相同的pH值范围内，采用不同的缓冲体系进行修饰反应，所得反应效果有很明显的差别。这应该是由于在不同的缓冲环境中，PEG与EPO分子的氨基结合位点不同，同时在离子类型不同的缓冲液中，EPO分子各赖氨酸残基所处的微环境不同，即PEG与各氨基结合的难易程度不同。通过更深入的实验研究，我们进一步发现，在EPO分子完成第一次PEG化反应以后，往所得反应液体系中，加入适量的另一种缓冲液，可以非常有效地降低溶液中游离EPO分子所受到的PEG分子的位阻作用，从而为EPO分子的第二次，乃至多次PEG化反应提供了合适的反应条件。在此基础上，我们已经成功地实现了EPO的二次、三次，乃至四次PEG化反应，建立了一种新的PEG-EPO的制备方法，所得单取代产物的收率较高，并显著地降低了多取代产物的形成。同时，紫外光谱测试、电泳测试、唾液酸测试和体外活性测试等测试结果表明，所得PEG-EPO单取代产物很好地保留其生物活性和蛋白质分子结构。

因此本发明创造性地应用了多缓冲体系的反应方法，实现了EPO的可连续PEG化反应，建立了一种具有较高单取代率、较低多取代率的反应方法。

附图说明

图1为EPO分子的氨基酸序列图；

图2为纯化产物mPEG-EPO的SEC-HPLC分析图谱；

图3为纯化产物mPEG-EPO的紫外光谱分析结果

（从上到下：M-PEG-SCM聚合物样品；EPO原液样品；纯化产物mPEG-EPO样品）；

图4为纯化产物mPEG-EPO的电泳分析结果

（从左到右：EPO原液样品；分子量Marker样品；M-PEG-SCM聚合物样品；纯化产物mPEG-EPO样品）。

具体实施方式

下面结合相关实验和具体实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

在实验和具体实施例中使用了两种PEG试剂都来自北京键凯科技有限公司，分别是：35KD的GLUC-PEG-NHS（葡萄糖聚乙二醇NHS酯）,以及35KD的M-PEG-SCM（甲氧基聚乙二醇乙酸酯）。所用的EPO原液，由深圳赛保尔生物药业有限公司制备。

实验一：PEG-EPO反应液成分含量的长期稳定性

用15ml塑料离心管，加入1.63ml EPO原液（EPO含量3.07mg/ml），以及3.37ml pH7.5的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。准确称量109.4mg GLUC-PEG-NHS，加入1094μl 2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.5。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，取样作SEC-HPLC检测。

SEC-HPLC检测条件如下：

SEC-HPLC柱：GE superpose 6分析柱

流动相：PBS缓冲液

HPLC仪：岛津HPLC，PDA检测器，LC solution工作站

检测波长：280nm

上样量：20μl

流速：0.5ml/min

所得PEG-EPO反应液未经进一步处理，封闭保存于4℃冰箱中，在20个月后，重新取样作SEC-HPLC检测。结果列于表1。

表1PEG-EPO反应液成分含量的长期稳定性考察的SEC-HPLC检测结果

从表1所列结果可以发现，所得PEG-EPO反应液在保存放置20个月后，单取代产物含量只有大约0.2%的增加，几乎可以忽略不计，同时游离EPO分子含量的减少也小于8%。这充分说明了经过第一次PEG化反应后，所得PEG-EPO反应液的成分含量具有很高的稳定性。这应该与反应液中残留的PEG分子有关，因为在反应中加入的PEG试剂是大大地过量的，这些过量的PEG试剂因发生水解反应失去活化基团而不能与游离的EPO分子发生反应。同时，PEG分子在水溶液中溶解以后，其体积会有极大的扩展，进而对反应液中的单取代PEG-EPO、多取代PEG-EPO以及游离EPO分子产生包围封闭效果，尤其是其对EPO分子的空间位阻作用，会阻碍新加入的带有活化基团的PEG试剂靠近EPO分子的结合位点。也就是说，第一次PEG化反应后，溶液中残留的失去活性的PEG分子，会妨碍EPO分子的连续PEG化反应的发生。

实验二：EPO分子的直接连续二次PEG化反应

用15ml塑料离心管，加入1.15ml EPO原液（EPO含量4.36mg/ml），以及3.85ml pH7.2的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。准确称量109.4mg M-PEG-SCM试剂，加入1094μl 2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将M-PEG-SCM溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，取样作SEC-HPLC检测。

然后，往所得PEG-EPO反应液中，再次加入含50mg M-PEG-SCM试剂的水溶液，进行二次PEG化反应。反应完毕后，作SEC-HPLC检测。结果列于表2。

表2EPO分子的直接连续PEG化反应的SEC-HPLC检测结果

从表2所列结果可以发现，对所得PEG-EPO反应液进行直接连续PEG化反应后，单取代产物含量下降了3%，多取代产物含量增加了超过一半，游离EPO分子含量则减少了一半。这说明了，EPO分子的直接连续PEG化反应，虽然可以消耗原反应液中的游离EPO分子，但是不能生成反应的目标产物，即单取代PEG-EPO，反而增加了大量的反应副产物，即多取代PEG-EPO。

实验三：在不同缓冲溶液中的EPO分子的二次PEG化反应

用15ml塑料离心管，加入1.15ml EPO原液（EPO含量4.36mg/ml），以及3.85ml pH7.2的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。准确称量95mg M-PEG-SCM试剂，加入109.4μl 2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将M-PEG-SCM溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，取样作SEC-HPLC检测。

然后，往5支15ml离心管中，分别加入1ml所得PEG-EPO反应液，以及9ml 5种不同的缓冲液，包括：pH7.4磷酸缓冲液、pH7.4硼砂缓冲液、pH9.3硼砂-氢氧化钠缓冲液和pH5.8醋酸缓冲液。摇匀，振荡1小时后，分别取样作第一次SEC-HPLC检测。接着，往所得5种混合溶液中，分别加入含20mg M-PEG-SCM试剂的水溶液，进行第二次PEG化反应。反应完毕后，分别取样作第二次SEC-HPLC检测。结果列于表3。

表3在不同缓冲溶液中的EPO分子的二次PEG化反应的SEC-HPLC检测结果

从表3所列结果可以发现，将第一次PEG化反应得到的PEG-EPO反应液，用不同的缓冲溶液进行10倍的稀释后，其单取代产物含量和多取代产物含量都减少了，同时游离EPO分子的含量增加了。也就是说，加入与原反应体系不同的缓冲溶液，本身改变PEG-EPO反应液的成分含量，另一个可能的原因是，在PEG化反应后，提高反应液的pH值，可以使得PEG-EPO产物中与EPO分子结合不牢固的PEG脱落。

随后进行的第二次PEG化反应的结果表明，这种首先改变反应液的缓冲体系，再进行连续PEG化反应的策略，可以得到单取代率有效地提高、多取代率控制在较低水平的反应效果。其中，在硼砂-氢氧化钠缓冲液与磷酸缓冲液形成的双缓冲液体系中，所得单取代率高于50%，同时多取代率低于20%。此外，在在硼砂缓冲液与磷酸缓冲液形成的双缓冲液体系中，所得单取代率为48.43%，同时多取代率为10.64%。

由于EPO原液偏酸性，高pH值的缓冲体系会显著地降低其生物活性，因此在综合考虑单取代PEG-EPO产物收率，以及保护EPO分子的生物活性之后，选用pH7.4硼砂缓冲液进行后续实验.

实验四：采用双缓冲液体系的EPO分子连续二次PEG化反应

用15ml塑料离心管，加入1.15ml EPO原液（EPO含量4.36mg/ml），以及3.85ml pH7.2的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。准确称量109.4mg GLUC-PEG-NHS试剂，加入1094μl 2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，取样作第一次SEC-HPLC检测。

然后，往所得PEG-EPO反应液中，加入6ml pH7.4硼砂缓冲液，摇匀，振荡1小时后取样作第二次SEC-HPLC检测。

接着，往所得处于双缓冲液体系中的PEG-EPO反应液，加入含109.4mgGLUC-PEG-NHS试剂的水溶液，进行二次PEG化反应。反应完毕后，取样作第三次SEC-HPLC检测。结果列于表4.

表4采用双缓冲液体系的EPO分子连续二次PEG化反应的SEC-HPLC检测结果

从表4所列结果可以发现，采用双缓冲液体系的EPO分子连续二次PEG化反应取得了很好的反应结果，所得最终的单取代率达到了55.89%，同时所得多取代率只有23.83%，游离EPO分子含量接近20%。

实验五：采用双缓冲液体系的EPO分子连续三次PEG化反应

取一支50ml塑料离心管，加入1.15ml EPO原液（EPO含量4.36mg/ml），以及3.85ml pH7.2的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。准确称量50mg GLUC-PEG-NHS试剂，加入500μl 2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，取样作第一次SEC-HPLC检测。

然后，往所得PEG-EPO反应液中，加入12ml pH7.4硼砂缓冲液，摇匀，振荡1小时后取样作第二次SEC-HPLC检测。

接着，往所得处于双缓冲液体系中的PEG-EPO反应液，加入含50mgGLUC-PEG-NHS试剂的水溶液，进行二次PEG化反应。反应完毕后，取样作第三次SEC-HPLC检测。

重复以上第二次PEG化反应的步骤，进行第三次PEG化反应，期间取样作第四次、第五次SEC-HPLC检测。结果列于表5。

表5采用双缓冲液体系的EPO分子连续三次PEG化反应的SEC-HPLC检测结果

从表5所列结果可以发现，采用双缓冲液体系的EPO分子连续三次PEG化反应取得了很好的反应结果，所得最终的单取代率达到了54.40%，同时所得多取代率只有13.30%，游离EPO分子含量为32.30%。同时，与实验四中的连续二次PEG化反应相比，对PEG试剂的加入量采用了少量多次的原则，因此节省了大约25%的PEG试剂。

具体实施例：连续三次PEG化反应方法制备M-PEG-EPO反应液

取一支50ml塑料离心管，加入2.3ml EPO原液（EPO含量4.36mg/ml），以及7.7ml pH7.2的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。准确称量100mg M-PEG-SCM试剂，加入500μl 2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将M-PEG-SCM溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2.5小时。反应完毕后，往所得PEG-EPO反应液中，加入12ml pH7.4硼砂缓冲液，摇匀，振荡1小时后，加入含100mg M-PEG-SCM试剂的水溶液，进行二次PEG化反应。重复以上第二次PEG化反应的步骤，进行第三次PEG化反应。反应完毕后，取样作SEC-HPLC测试，结果列于表6.

表6连续三次PEG化反应方法制备M-PEG-EPO反应液的SEC-HPLC检测结果

在上述所得M-PEG-EPO反应液中，除了目标产物，即单取代产物(mPEG-EPO)以外，还含有多取代产物、游离EPO分子、未反应的PEG聚合物、PEG降解产物等多种杂质化合物。对所得M-PEG-EPO反应液进行了纯化，提取得到了高纯度、高得率的mPEG-EPO，其主要步骤包括：（a）疏水层析；（b）脱盐（置换缓冲液）；或稀释来降低电导率；（c）离子交换层析；（d）超滤浓缩并置换缓冲液.

对纯化产物mPEG-EPO进行了SEC-HPLC分析，所得图谱见图2，具体结果列于表7。结果表明，所得mPEG-EPO产物的纯度大于99％.

表7纯化产物mPEG-EPO的SEC-HPLC检测结果

应用常规的紫外光谱测试方法，并以EPO原液和PEG试剂为对照物质，对所得纯化产物mPEG-EPO进行了紫外光谱分析。在测试过程中，以注射用水为空白参照物，所用的EPO蛋白样品的浓度，以及PEG-EPO蛋白样品的浓度，均为0.8mg/ml。结果如图3所示。所得紫外光谱分析结果表明，EPO分子的结构在反应过程中，没有发生比较剧烈的改变，有利于保留EPO分子的蛋白质活性。

应用常规的电泳测试方法，并以EPO原液和PEG试剂为对照物质，对所得纯化产物mPEG-EPO进行了电泳分析。结果如图4所示，所得电泳分析结果表明，纯化产物mPEG-EPO的分子量大约为77KD，接近EPO分子与单个PEG试剂的分子量之和。同时，所得纯化产物mPEG-EPO的电泳纯度大于99%，没有明显的蛋白质类的杂质。

特别要说明的是：第一次使用的缓冲液不只局限在pH7.2和7.5的磷酸缓冲液，也可使有一些常用的中性缓冲液，如使用pH6.5～7.5的磷酸缓冲液等，缓冲液的简单替换都在本发明保护的范围之内；同样，与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液也不局限在上述实验和实施例中出现的pH7.4的磷酸缓冲液、pH7.4的硼砂缓冲液、pH9.3的硼砂-氢氧化钠缓冲液和pH5.8的醋酸缓冲液，可使有与第一种缓冲液pH值不重叠的pH6.0～9.0范围内的磷酸缓冲液、pH7.4～9.0的硼砂缓冲液、pH9.0～12的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH4.5～7.0的醋酸缓冲液，都是在本发明保护的范围之内。

以上是对本发明重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法进行了阐述，用于帮助理解本发明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，任何未背离本发明原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，EPO分子在第一种缓冲液中完成第一次PEG化反应后至少还包括以下步骤：将第一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进一步加入PEG进行第二次PEG化反应，得到最终反应液；所述第一种缓冲液为pH6.5-7.5的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液为与第一种缓冲液pH值不重叠的pH6.0-9.0的磷酸缓冲液、PH7.4-9.0的硼砂缓冲液、pH9.0-12的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH4.5-7.0的醋酸缓冲液。

2.根据权利要求1所述一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，得到最终反应液前还包括以下步骤：将前一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进一步加入PEG进行后一次PEG化反应。

3.根据权利要求2所述一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，在得到最终反应液前还包括以下步骤：将第二次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进一步加入PEG进行第三次PEG化反应。

4.根据权利要求1-3所述任一一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，所述第一种缓冲液为pH7.2的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液、pH7.4的硼砂缓冲液、pH9.3的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH5.8的醋酸缓冲液。

5.根据权利要求1-3所述任一一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，所述PEG化反应方法包括将PEG与PEO混合反应至少2小时，反应pH值为7.0-7.5，所述PEG与PEO的摩尔比为10-25:1，所述PEG中聚乙二醇的分子量为30000-40000道尔顿。

6.根据权利要求5所述一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，所述PEG与PEO的摩尔比为10-25:1为全部PEG化反应步骤中PEG与EPO的摩尔比。

7.根据权利要求5所述一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，所述PEG化反应方法包括将PEG与PEO混合反应为2.5小时。

8.根据权利要求1-3所述任一一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其特征在于，还包括在最终反应液中纯化单取代PEG-EPO的步骤：将最终反应液经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EPO。

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