KR20220082813A - 인간 재조합 아르기나아제 1의 제조 방법 및 이의 사용 - Google Patents

인간 재조합 아르기나아제 1의 제조 방법 및 이의 사용 Download PDF

Info

Publication number
KR20220082813A
KR20220082813A KR1020227010296A KR20227010296A KR20220082813A KR 20220082813 A KR20220082813 A KR 20220082813A KR 1020227010296 A KR1020227010296 A KR 1020227010296A KR 20227010296 A KR20227010296 A KR 20227010296A KR 20220082813 A KR20220082813 A KR 20220082813A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rharg
arginase
column
protein
peg
Prior art date
Application number
KR1020227010296A
Other languages
English (en)
Inventor
스콧 더블유 로린슨
Original Assignee
아이글레아 바이오테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이글레아 바이오테라퓨틱스, 인크. filed Critical 아이글레아 바이오테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20220082813A publication Critical patent/KR20220082813A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3847—Multimodal interactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03001—Arginase (3.5.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2221/00—Applications of separation devices
    • B01D2221/10—Separation devices for use in medical, pharmaceutical or laboratory applications, e.g. separating amalgam from dental treatment residues

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

PEG화된 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 1과 같은 재조합 아르기나아제를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 상기 재조합 아르기나아제를 포함하는 약학적 조성물 뿐만 아니라 상기 재조합 아르기나아제의 치료 방법 및 사용이 기재되어 있다.

Description

인간 재조합 아르기나아제 1의 제조 방법 및 이의 사용
본 개시는 일반적으로 아르기나아제 1 결핍증 또는 아르기닌혈증의 효소 대체 요법 및 치료에 관한 것이다. 본 개시는 또한 인간 재조합 아르기나아제 1을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 아르기나아제 1은 또한 암 치료에도 사용할 수 있다.
아르기나아제 1 결핍증 또는 아르기닌혈증은 효소 아르기나아제 1의 결핍으로 인한 아미노산 대사의 드문 장애이다. 아르기나아제 1은 요소 회로의 정상적인 기능에 중요한 6가지 효소 중 하나이고, 상기 회로의 마지막 단계에서 L-아르기닌이 요소 및 오르니틴으로 전환되는 것을 촉매한다. 그런 다음, 상기 오르니틴은 미토콘드리아로 다시 들어가 순환을 계속한다.
아르기나아제 1은 적혈구(RBC) 및 간에서 주로 발견된다. 아르기나아제(ARG)1은 돌연변이가 아르기나아제 1 결핍증을 유발하는 것으로 현재 공지된 유일한 유전자이다. 임상적으로, 아르기나아제 1 결핍증은 진행성 치매, 정신운동 지연, 경직성 양측마비, 발작 및 발육 부전으로 이어지는 대뇌 피질 및 추체로의 느린 악화를 특징으로 한다. 치료하지 않고 방치하면, 질병이 심각한 경직, 보행 장애, 장 및 방광 조절 상실, 심각한 지적 장애로 진행된다. 아르기나아제 1 결핍증이 있는 환자는 일반적으로 혈중 아르기닌 수치가 상승하고(정상 상한치[ULN]의 3 내지 4배), 경미한 고암모니아혈증 및 요중 오로트산의 경미한 증가를 보인다. 대부분의 환자는 적혈구(RBC)에서 검출 가능한 아르기나아제 1 효소 활성이 없다(정상의 1% 미만).
현재 아르기나아제 1 결핍증의 치료는 평생에 걸친 식이 단백질 제한을 통해 혈장 아르기닌 농도를 가능한 정상에 가까운 수준으로 유지하는 데 중점을 두고 있다. 단백질 섭취는 단백질 생합성 및 성장을 유지하는 데 필요한 최소량으로 제한된다. 식이 단백질의 절반 이상이 아르기닌이 없는 필수 아미노산 혼합물의 형태로 제공된다. 이러한 식이 조절은 대부분의 환자에게 혈장 아르기닌 수준을 감소시킬 수 있지만, 식이 요법은 맛이 없고 비용이 많이 들며, 특히 성장기 아동의 경우 유지 및 관리가 어렵다.
아르기나아제 1 결핍증 환자에 대한 치료 선택사항이 부족하기 때문에, 아르기닌 수준을 정상 범위 내로 낮추고 정상 아르기닌 수준을 평생에 걸쳐 유지하는 것을 촉진할 수 있는 요법이 상당히 필요한 실정이다. 이러한 치료제의 개발은 아르기닌 및 이의 대사물의 신경독성 효과에 대한 노출을 최소화하고 상기 환자에게서 정상적인 신경인지 발달의 가능성을 제공하려는 시도에 유용할 수 있다.
아르기나아제 1 결핍증 또는 아르기닌혈증의 치료 외에도, 상기 방법으로 제조된 아르기나아제를 사용하여 다른 질병들을 치료할 수 있다. 아르기나아제 1은 암 치료 및 펨브롤리주맙과 같은 면역항암제와의 병용 치료에서의 사용을 조사하는 임상 시험에서 사용되었다.
아르기나아제의 제조
본 발명의 일 양태는 재조합 인간 아르기나아제 단백질을 생성 및/또는 정제하는 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 재조합 인간 아르기나아제 단백질은 재조합 인간 아르기나아제 1(rhARG1, 서열번호 1; 도 1(a)에 도시됨)이다. 다른 구현예들에서, 상기 재조합 인간 아르기나아제 단백질은 재조합 인간 아르기나아제 2(rhARG2, 서열번호 3; 도 1(c)에 도시됨)이다. 본원에서 rhARG1에 대해 구체적으로 언급하지만, 본원에 기재된 방법, 제제 및 사용은 rhARG2에도 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 적용되는 인간 아르기나아제 1 및 2 단백질은 2개의 Mn2+ 부위를 가지며; 비천연 금속 보조인자를 갖는 변형된 아르기나아제 1 또는 2 단백질을 생성하기 위해 둘 중 하나의 부위 또는 둘 모두의 부위가 치환될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 단백질은 pH 7.4에서 200 mM-1 s-1 초과의 kcat/KM을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 pH 7.4에서 약 200 mM-1 s-1 내지 약 4,000 mM-1 s-1의 범위에서 kcat/KM를 나타낸다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 pH 7.4 및 37°C에서 약 400 mM-1 s-1 내지 약 2,500 mM-1 s-1의 범위에서 kcat/KM을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 아르기나아제 1 또는 2의 아미노산 서열 및 비천연 금속 보조인자를 포함하는 단백질을 고려하며, 상기 단백질은 37°C 및 pH 7.4에서 약 400 mM-1 s-1 초과의 kcat/KM을 나타낸다. 예시적인 kcat/KM 값은 pH 7.4 및 37°C에서 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1,000, 약 1,100, 약 1,200, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 3,500 및 약 4,000 mM-1 s-1을 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법이 제공된다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 방법은 하기를 포함한다: rhARG1을 발현하는 대장균 세포의 균주 발효, Co-아르기나아제 1 중간체(Co-rhARG1)를 제공하기 위한 rhARG1에서의 망간을 코발트로 치환, 상기 Co-아르기나아제 1 중간체의 정제, 및 원료의약품(Co-rhARG1-PEG)을 형성하기 위한 Co-아르기나아제 1 중간체의 PEG화. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 페그질라기나제를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 방법은 여러 단계들: 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)를 생성하는 생물반응기에서 대장균 세포를 배양하는 단계; 대장균 세포를 용해하는 단계; 용해물에서 세포 파괴물을 제거하는 단계; 양이온 교환 컬럼에 세포 용해물을 로딩하는 단계; 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 고염 용액으로 용출하는 단계; 용출된 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 코발트 염과 함께 배양하여 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 형성하는 단계; 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 음이온 교환 컬럼에 적용하고 통과액을 수집하는 단계; 상기 통과액을 제3 크로마토그래피 컬럼에 첨가하는 단계; 및 상기 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 높은 염 농도를 사용하여 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 용출하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법은 양이온 교환 수지 1리터당 최대 60 g의 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 양이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법은 최대 약 0.5 M 염 농도의 고염 용액을 사용하여 양이온 교환 컬럼으로부터 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 용출시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)은 0.1 M 염 농도의 고염 용액을 사용하여 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)은 약 0.0 내지 약 0.5 M 염 농도의 구배를 사용하여 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)은 약 0.0 내지 약 0.2 M 염 농도의 구배를 사용하여 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된다.
하나 이상의 구현예들에서, 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법은 Co2+를 포함하는 코발트 염으로 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 코발트 염은 CoCl2를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법은 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG) 통과액을 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼을 포함하는 제3 크로마토그래피 컬럼에 첨가하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법은 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG) 또는 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 PEG화 반응물과 반응시켜 PEG화된 단백질을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 PEG화된 단백질은 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321에서 하나 이상의 PEG화된 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 PEG화된 단백질은 K16의 약 15% 내지 약 60%, K32의 약 35% 내지 약 80%, K38의 약 20% 내지 약 85%, K40의 약 10% 내지 약 60%, K47의 약 10% 내지 약 60%, K67의 약 40% 내지 약 90%, K74의 약 30% 내지 약 95%, K82의 약 30% 내지 약 98%, K87의 약 15% 내지 약 65%, K88의 약 25% 내지 약 70%, K152의 약 25% 내지 약 85%, K154의 약 15% 내지 약 65%, K171의 약 20% 내지 약 75%, K222의 0% 내지 약 30%, K223의 0% 내지 약 35%, K312의 0% 내지 약 45%, 및 K321의 0% 내지 약 45% 중 하나 이상으로 PEG화된다. 일부 구현예들에서, 상기 PEG화된 단백질은 적어도 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K312 및 K321에서 PEG화된 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 PEG화된 단백질은 K3, K149, K190, K195, K29, K265 및 K283에서 PEG화된 아미노산 잔기를 갖지 않는다.
Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들은 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 투여용으로 제제화된 대장균에서 발현되는 코발트 치환, PEG화된 인간 재조합 아르기나아제 1 효소에 관한 것이다. 아르기나아제 1의 활성 부위에서 천연 망간(Mn2+)을 코발트(Co2+)로 대체하면 생리학적 pH에서 안정성 및 촉매 활성이 향상된다. PEG화는 또한 재조합 아르기나아제 1의 순환 반감기(t1/2)를 연장한다.
다양한 구현예들에서, 상기 방법은 생물반응기에서 대장균 세포를 배양하여 재조합 인간 아르기나아제 1을 생성하는 단계, 대장균 세포를 용해하는 단계, 및 상기 재조합 인간 아르기나아제 1을 정제하는 단계를 포함한다(도 2 및 도 3을 참조). Co-아르기나아제 1 중간체의 정제는 하기의 단계들: 고압 균질화에 의한 세포 파괴, 균질물 정화, SP 세파로오스 FF 양이온 교환 포획 크로마토그래피, 코발트 교환, 한외여과/정용여과, Q 세파로오스 FF 음이온 교환 통과액 크로마토그래피, 캡토 MMC 다중모드 크로마토그래피, 및 한외여과/정용여과 중 하나 이상을 포함하는 정제 절차에 의해 실시할 수 있다. 정제된 Co-아르기나아제 1 중간체는 PEG화된 원료의약품을 형성하도록 가공되거나, 또는 이후 원료의약품으로의 전환을 위해 냉동 및 저장될 수 있다.
방법의 바람직한 구현예들에서, rhARG1을 함유한 대장균 용해물을 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 컬럼("컬럼 1"이라고도 함)에 로딩하여 상기 rhARG1을 포획한 다음, 이를 고염 용액으로 용출하여 제1 단백질 생성물("제1 단백질 생성물")을 제공한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 방법은 제1 단백질 생성물을 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 컬럼("컬럼 2"로도 지칭됨) 상에 로딩하는 단계 및 통과액을 수집하여 제2 단백질 생성물("제2 단백질 생성물")을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 방법의 다른 양태에서, 상기 방법은 제2 단백질 생성물을 아르기나아제 1을 포획한 다음 용출하여 제3 단백질 생성물("제3 단백질 생성물")을 제공하는 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼에 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제3 크로마토그래피 컬럼("컬럼 3"이라고도 함)은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼일 수 있다.
다양한 구현예들은 코발트 조효소에 대해 아르기나아제의 천연 망간 조효소를 변경하는 것을 포함한다. 코발트 대체(코발트 로딩이라고도 함)는 제조 공정의 임의의 단계에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 아르기나아제 1 코발트 로딩은 PEG화된 아르기나아제 1에 대한 대장균 용해물, 제1 단백질 생성물, 제2 단백질 생성물, 제3 단백질 생성물, 또는 P의 임의의 단계에서 실시할 수 있다. 다른 구현예들에서, 상기 코발트 로딩은 칼럼 1로부터 용출된 아르기나아제 1, 또는 칼럼 2로부터 용출된 아르기나아제 1, 또는 칼럼 3으로부터 용출된 아르기나아제 1에 대해 실시할 수 있다. 코발트 로딩은 CEX 컬럼으로부터 용출된 아르기나아제 1, AEX 컬럼으로부터 용출된 아르기나아제 1, MMC 컬럼으로부터 용출된 아르기나아제 1, 또는 SEC 컬럼으로부터 용출된 아르기나아제 1에 대해 실시할 수 있다.
아르기나아제 1의 코발트 로딩은 코발트를 함유한 다양한 용액 및 다양한 온도에서 실시할 수 있다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 코발트 염은 CoCl2와 같은 5 a Co2+를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 아르기나아제 1의 코발트 로딩은 실온 또는 대략 실온에서, 예컨대 약 15 내지 약 25℃ 또는 약 20 내지 약 25℃에서 CoCl2와 함께 실시한다. 코발트 로딩의 속도는 반응 온도를 높이거나 낮추어 조작할 수 있다. 코발트 로딩은 또한 pH 값의 범위에서 실시할 수 있다.
본 개시의 일 양태는 CEX 크로마토그래피(컬럼 1)와 관련된 조건을 변화시키는 것에 관한 것이다. 컬럼 1에 로딩된 단백질의 양을 증가 또는 감소시켜 상이한 아르기나아제 1 전하 변이체를 선택할 수 있다. 부하율을 조작하여 보다 바람직한 CEX 전하 종 프로파일로 이동할 수 있다. 최대 약 60 g/L의 부하율(그램 단위의 단백질 양/리터 단위의 CEX 컬럼 수지의 부피)은 높은 비활성을 갖는 아르기나아제 1을 생성할 수 있다. 다양한 구현예들에서, 상기 부하율은 최대 약 10 g/L, 약 20 g/L, 약 30 g/L, 약 40 g/L, 약 50 g/L 또는 약 60 g/L이다.
바람직한 구현예에서, 아르기나아제 1은 먼저 컬럼 1에서 포획된 후, 컬럼 2에 이어서 컬럼 3에서 순차적으로 정제된다. 대안적인 구현예에서, 대장균 용해물은 AEX 컬럼(예를 들어, 컬럼 2)에 로딩되고 통과액이 CEX 컬럼에 도포되어 아르기나아제 1을 캡처할 수 있다. 다른 구현예에서, 아르기나아제 1의 코발트 로딩은 PEG화 반응 후에 발생할 수 있다. 또한, 다른 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 SEC 컬럼과 같은 MMC 컬럼을 대체할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)은 서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 방법은 여러 단계들: 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)를 생성하는 생물반응기에서 대장균 세포를 배양하는 단계; 대장균 세포를 용해하는 단계; 용해물에서 세포 파괴물을 제거하는 단계; 양이온 교환 컬럼에 세포 용해물을 로딩하는 단계; 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 고염 용액으로 용출하는 단계; 용출된 재조합 인간 아르기나아제 단백질(rhARG)을 코발트 염과 함께 배양하여 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 형성하는 단계; 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 음이온 교환 컬럼에 적용하고 통과액을 수집하는 단계; 상기 통과액을 제3 크로마토그래피 컬럼에 첨가하는 단계; MMC 컬럼으로부터 고염 용액을 사용하여 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 단백질(Co-rhARG)을 용출하는 단계; 및 과량의 몰의 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르를 반응시키고 과량의 PEG를 제거하는 단계를 포함한다.
재조합 인간 아르기나아제 1, 약학적 조성물 및 제제
본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 rhARG1, Co-rhARG1 및/또는 Co-rhARG1-PEG, 또는 이를 포함한 조성물에 관한 것이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321 중 하나 이상에서 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 결합된다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 인간 아르기나아제(rhARG) 단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 단백질은 비천연 금속 보조인자와 복합체로 존재하고, 상기 비천연 금속 보조인자는 코발트이며, 상기 단백질은 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321 중 하나 이상에서 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 결합되는, 조성물에 관한 것이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 H100, D123, H125, D127, D231, D233, W121, D180, S229, C302 및 E255로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 D180S, S229C, S229G, C302F, C302I, E255Q, D180E, 및 S229A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 C302이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 2개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 절단된 아르기나아제 I 단백질이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 외인성 단백질 단편을 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 외인성 단백질 단편은 면역글로불린의 Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역의 일부를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, Co-rhARG-PEG의 고유 활성도는 약 400 U/mg 내지 약 700 U/mg의 범위이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 시험관내 분석시 pH 7.4에서 약 200 mM-1 s-1 내지 약 4,000 mM-1 s-1의 범위의 아르기닌 가수분해에 대한 kcat/Km을 나타낸다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질은 시험관내 분석시 pH 7.4에서 약 400 mM-1 s-1 내지 약 2,500 mM-1 s-1의 범위의 아르기닌 가수분해에 대한 kcat/Km을 나타낸다.
하나 이상의 구현예들에서, PEG:Co-rhARG의 몰비는 약 7몰/몰 내지 약 15몰/몰의 범위이다.
하나 이상의 구현예들에서, 유리 PEG 농도는 100 μg/mL 이하이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 조성물의 총 코발트 함량은 약 9 μg/mL 내지 약 15 μg/mL 범위이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 조성물은 이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF)에 로딩될 때 적어도 9개의 피크를 생성하고, 피크 1은 20% 미만, 피크 2는 30% 미만, 피크 3+ 4는 10-30% 범위, 피크 5는 15-30% 범위, 피크 6은 10-25% 범위, 피크 7은 25% 미만, 피크 8은 15% 미만, 및 피크 9는 8% 미만이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 조성물은 iCIEF에 로딩될 때 적어도 9개의 피크를 생성하고, 피크 1은 5-7% 범위, 피크 2는 8-11% 범위, 피크 3+4는 16-20% 범위, 피크 5는 21-24% 범위, 피크 6은 21-22% 범위, 피크 7은 14-15% 범위, 피크 8은 5-8% 범위, 및 피크 9는 2-3% 범위이다.
본 발명의 다른 양태는 rhARG1, Co-rhARG1 및/또는 Co-rhARG1-PEG 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 조성물은 정맥내 또는 피하 투여용으로 제제화된다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 조성물은 인산칼륨, 염화나트륨 및 글리세롤을 포함한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 조성물은 약 50 mM NaCl, 약 1 mM K2HPO4, 약 4 mM K2HPO4, 및 약 1.5% w/v 글리세롤을 포함한다.
아르기나아제 1 결핍증의 치료 방법
본 발명의 다른 양태는 Co-rhARG1-PEG와 같은 재조합 인간 아르기나아제 1의 투여에 관한 것이다. 상기 투여는 IV 또는 SC 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 상기 양태의 하나 이상의 구현예들에서, Co-rhARG1-PEG의 용량은 특정 알고리즘에 의해 결정된다:
상기 알고리즘의 하나 이상의 구현예들에서, 상기 환자는 0.10 mg/kg에서 요법을 시작한다. 혈장 아르기닌 수준을 모니터링한다. 혈장 아르기닌 수준이 150 μM 초과인 경우, 상기 용량은 0.20 mg/kg으로 증가한다. 혈장 아르기닌 수준이 50 μM 미만인 경우, 상기 용량은 0.05 mg/kg으로 감소한다. 그렇지 않으면, 상기 환자는 0.10 mg/kg의 용량을 유지한다.
상기 알고리즘의 하나 이상의 구현예들에서, 용량 변경은 하기와 같다:
Figure pct00001
혈장 아르기닌 수준이 150 μM 초과인 경우, 단일 168시간 샘플을 사용하여 상기 샘플 이전의 2회 용량이 a) mg/kg 단위의 동일한 용량 수준이고, b) 연속적(누락된 용량 없음)인 경우 하기 표의 2회 용량 수준(0.20 mg/kg을 초과하지 않음) 만큼 용량을 증가시킨다.
Figure pct00002
2개의 연속 168시간 샘플의 혈장 아르기닌 수준(누락된 용량에 관계없이)이 모두 50 μM 미만인 경우, 상기 용량을 0.05 mg/kg 미만으로 감소하지 않도록 하기 표에서 1회 용량 수준만큼 감소시킨다.
Figure pct00003
(a) 페그질라기나제 투여는 수준 2, 0.10 mg/kg에서 시작한다. 용량 증가는 필요시 2회 용량 수준만큼 실시한다. 용량 감소는 1회 용량 수준만큼 실시한다.
본 발명의 추가적인 특징은 하기의 기재된 설명 및 첨부된 도면으로부터 명백해질 것이다:
도 1은 아르기나아제 1의 아미노산 및 DNA 서열 뿐만 아니라 아르기나아제 2의 아미노산 서열을 도시한다. 도 1(a)은 대장균에서 발현된 재조합 인간 아르기나아제 1의 아미노산 서열 (서열번호 1)을 도시하고; 도 1(b)은 재조합 인간 아르기나아제 1의 코돈 최적화 DNA 서열(서열번호 2)을 도시한다. 아르기나아제 1의 발현된 단량체에는 천연의 인간 아르기나아제 1 단량체에서 발견되는 N 말단 메티오닌이 없다. 도 1(c)는 천연 인간 아르기나아제 2 단량체에서 발견되는 N 말단 메티오닌이 없는 아르기나아제 2의 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 대장균의 발효 및 아르기나아제 1의 발현을 위한 예시적인 과정을 도시하는 개략도이다.
도 3은 재조합 인간 아르기나아제 1, 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 1, 및 PEG화된 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 1의 정제를 위한 예시적인 과정을 도시하는 개략도이다. 도 3(a)는 양이온 교환 컬럼(컬럼 1), 음이온 교환 컬럼(컬럼 2) 및 캡토(Capto) 다중모드 컬럼(컬럼 3) 뿐만 아니라 코발트 로딩 단계를 포함하는 예시적인 공정을 도시한다. 도 3(b)는 Co-아르기나아제 1 중간체의 PEG화에 이어서 원료의약품을 제공하기 위한 최종 여과 및 제제화를 도시한다.
도 4는 아르기나아제 1의 컬럼 크로마토그래피 정제를 도시한다. 도 4(a)는 대장균 세포 용해물을 양이온 교환 컬럼(컬럼 1)에 로딩하는 단계, 컬럼을 세척하는 단계 후, (제1 단백질 생성물을 제공하기 위해) 고염 용액으로 용출하는 단계를 도시한다. 단백질 로딩 및 용출은 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 평가하였다. 약 3리터(L)의 세포 용해물을 컬럼에 적용한 다음, 상기 컬럼을 약 1.5 L의 완충액으로 세척한 후, 용출을 약 1 L 미만으로 실시하였다. 도 4(b)는 컬럼 1에서 용출된 아르기나아제 1(제1 단백질 생성물)을 음이온 교환 컬럼(컬럼 2)에 로딩하는 단계를 도시하고, 단백질 농도는 280 nm에서 흡광도를 사용하여 측정하였다. 아르기나아제 1은 제2 단백질 생성물을 제공하기 위해 상기 컬럼 2로부터의 통과액에서 수집하였다. 도 4(c)는 캡토 다중모드 양이온 교환 컬럼(컬럼 3)에서 아르기나아제 1을 포획하고 고염 용액으로 용출하여 제3 단백질 생성물을 제공하는 단계를 도시한다.
도 5는 컬럼 1(제1 단백질 생성물이라고도 함)에서 용출된 Co-아르기나아제 1 중간체 샘플의 전하 이질성 프로파일을 결정하는 데 사용된 분석적 양이온 교환 HPLC 방법의 결과를 도시한다. 아르기나아제 1의 1 mg/ml 샘플을 1.0 mL/분의 유속으로 20 mM MES, pH 6.0 완충액의 이동상을 갖는 양이온 교환 컬럼에 로딩하였다. 0-500 mM NaCl의 구배를 40분에 걸쳐 도입하고 상기 컬럼에서 용출된 단백질의 양을 280 nm에서의 흡광도로 추정하였다. 도 5(a)는 아르기나아제 1의 전하 이질성 종의 대표적인 크로마토그램을 도시한다. 아르기나아제 1 전하 변이체는 10~20분 후에 상기 분석 HPLC 컬럼에서 용출하였다. 도 5(b)는 피크를 더 크게 확대한 도 5(a)와 동일한 크로마토그램을 도시한다. 도 5(c)는 아르기나아제 1 양이온 교환 전하 변이체에 대한 피크 수 할당을 도시한다. 도 5(d)는 이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF) 방법으로 분석된 원료의약품의 일반적인 전하 이질성 프로파일을 도시한다.
도 6은 대장균에서 rhARG의 발현에 의해 생성된 아르기나아제 1 글루코닐화 변이체를 결정하기 위한 LC/MS 방법의 결과를 도시한다. LC/MS 분석은 비변형 아르기나아제 1(단량체), 글루코닐화 아르기나아제 1, 포스포글루코닐화 아르기나아제 1, 및 2배(2X)의 글루코닐화 아르기나아제 1을 식별한다. 상기 추적은 약물 중간체의 두 가지 개별 생성 실행에서 비롯한 것이다. 질량 스펙트럼의 오버레이는 35°C의 RP LCMS에서 33~35분에 걸쳐 합산하였다. 스펙트럼은 비변형 아르기나아제 1로 인한 신호의 피크 강도로 정규화된다. 변이체의 피크 강도는 상대적 존재량에 비례한다.
도 7은 컬럼 1에 적용한 0.0~0.2 M NaCl의 구배의 결과를 도시한다. 상기 구배를 통해 0.25 CV(컬럼 부피)마다 분획을 수집하였다. 데이터는 2개의 상이한 로트의 회수된 세포 슬러리를 공급 재료로 사용하는 2회의 컬럼 1 실행을 나타낸다. 평가에 사용된 부하율은 30 g/L이었다. 상기 구배는 생성물 회수를 유지하면서 상이한 글루코노일화 종을 성공적으로 분리하였다.
도 8은 Co-아르기나아제 1 중간체 및 Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 효소 활성을 도시한다. 도 8(a)는 Co-아르기나아제 1 중간체의 대표적인 효소 운동 분석을 도시한다(37°C에서 0~2mM 범위에 걸친 기질 농도로 아르기닌을 오르니틴으로 전환). 도 8(b)는 Co-rhARG1-PEG 원료의약품에 대한 대표적인 효소 운동 분석을 도시한다.
도 9는 Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 약동학적 분석을 도시한다. 도 9(a) 및 도 9(b)는 Co-rhARG1-PEG의 단일 IV 용량 투여 후 환자에게서 평균(±SD) 아르기나아제 1 농도 대 시간 프로파일을 도시한다: 파트 1. 선형(a) 및 반-대수(b) 플롯이 도시된다. 제1 평균 BQL 농도는 LLOQ(0.125 μg/mL)의 절반에 표시된다. 모든 환자의 평균 순환 약물 농도는 Co-rhARG1-PEG의 용량이 증가함에 따라 증가하였다. 도 9(c) 내지 도 9(f)는 Co-rhARG1-PEG의 QW(매주) IV 용량 투여 후 환자에게서 평균(±SD) Co-rhARG1-PEG 농도 대 시간 프로파일을 도시한다: 파트 2. 1주차(c) 및 8주차(d)에 대한 선형 플롯; 1주차(e) 및 8주차(f)에 대한 반-대수 플롯.
도 10은 아르기나아제 1 결핍증 환자에 대한 Co-rhARG1-PEG의 투여를 평가하기 위한 1/2상 공개 연구에서 약동학(PK) 및 약력학(PD)에 대한 세 가지 대표적인 통합 플롯(a, b, c)을 도시한다. 단계적 증량 중단 기준을 사용하여, 파트 2에서 결정된 용량은 환자 1의 경우 0.09 mg/kg, 환자 3의 경우 0.12 mg/kg, 및 0.04 mg/kg이었다(도시된 파트 2의 기간 동안). 용량의 단계적 증량 중단 기준을 적용함으로써, 시험의 다른 환자들은 다양한 파트 2 용량 수준으로 결정하였다. 상기 동일한 기준을 적용하여 선호하는(건강한) 범위를 벗어나는 아르기닌 수준에 반응하여 이미 Co-rhARG1-PEG를 사용 중인 임의의 환자의 용량을 조정(증가 또는 감소)할 수 있다.
도 11은 Co-rhARG1-PEG의 IV 및 피하 투여의 비교를 도시한다. 환자에게 선호되는 혈장 아르기닌 농도는 40 μM 내지 115 μM(점선) 사이이다. Co-rhARG1-PEG의 피하 투여는 IV 투여를 통한 것보다 더 긴 상기 바람직한 범위 내의 아르기닌 농도를 가져온다. 도 11(a)는 파트 2가 끝난 후 제1 주의 데이터를 포함하고 도 11(b)는 상기 1주 연장으로부터 IV 데이터를 제외한다. 도표는 환자 값의 평균으로 표시되며, 데이터는 각 환자에 대해 중단 기준이 결정된 용량으로부터 비롯된다.
도 12는 Co-rhARG1-PEG의 투여 후 혈장 아르기닌 및 혈장 구아니디노 화합물 수준을 도시한다. 도 12(a)는 기준선에서, 1회 투여 후, 8회 투여 후, 및 공개 연장(OLE) 동안의 혈장 아르기닌 수준을 도시한다. 도 12(b)는 기준선 및 상기 OLE 기간 동안 구아니디노아세트산(GAA), N-α-아세틸-L-아르기닌(NAA), α-케토-δ-구아니디노발레르산(GVA) 및 아르기닌산(ARGA)에 대한 혈장 수준을 도시한다.
도 13은 임상 결과에 대한 기준선 결손 및 반응을 도시한다. 도 13(a)는 6분 걷기 시험(6MWT), 대운동 기능 측정(GMFM) 파트 D 및 E, 그리고 적응 행동 평가 시스템(ABAS)에 대한 아르기나아제 1 결핍증 환자의 기준선 결손을 도시한다. 도 13(b)는 6MWT, GMFM-D 및 GMFM-E에 대한 임상 반응을 도시한다.
도 14는 6MWT, GMFM-D 및 GMFM-E의 시간 의존적 개선을 도시한다. 도 14(a)는 용량 8 및 용량 20에서 모든 환자 및 6MWT에서 기준선 결손이 있는 환자에 대한 6MWT에 대한 임상 반응자의 백분율을 도시한다. 도 14(b)는 용량 8 및 용량 20에서 모든 환자 및 6MWT에서 기준선 결손이 있는 환자에 대한 GMFM-D에 대한 임상 반응자의 백분율을 도시한다. 도 14(c)는 용량 8 및 용량 20에서 모든 환자 및 6MWT에서 기준선 결손이 있는 환자에 대한 GMFM-D에 대한 임상 반응자의 백분율을 도시한다.
도 15는 Co-rhARG1-PEG의 상이한 배치의 부위 특이적 PEG화 분석을 도시한다.
재조합 인간 아르기나아제 1
hArg1으로 확인된 인간 아르기나아제 1은 L-아르기닌(L-Arg)의 가수분해를 촉매하여 L-오르니틴 및 요소를 수득하는 이핵 망간 금속효소이다. 아르기나아제 1은 3개의 비공유 결합된 동일한 단량체 단위의 삼량체이다. 단량체 아르기나아제 1은 효소적으로 활성이지만 덜 안정적이다. 아르기나아제 1의 활성 부위에서 천연 망간(Mn2+)을 코발트(Co2+)로 치환하면 생리학적 pH에서 촉매 활성이 향상된다. 본원에 기재된 코발트 치환 아르기나아제 1 효소를 제조하는 방법은 고순도 및 고 활성인 효소를 제공한다. 상기 방법은 또한 원료의약품 제조에서 분리된 중간체로서 Co-아르기나아제 1(Co-rhARG1)을 제공할 수 있다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 원료의약품은 PEG화된 Co-아르기나아제 1(Co-rhARG1-PEG)이다. Co-아르기나아제 1의 PEG화는 순환 반감기를 유의적으로 연장한다. 다시 말해, 본원에서 rhARG1에 대해 구체적으로 언급하지만, 본원에 기재된 방법, 제제 및 사용은 rhARG2에도 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "rhARG1"은 서열번호 1과 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 재조합 효소와 같은 재조합 인간 아르기나아제 1 효소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "Co-rhARG1", "Co-아르기나아제 1 중간체" 등은 천연 망간 보조인자의 적어도 일부가 코발트로 대체된 rhARG1을 지칭한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1은 Co-rhARG1-PEG에 대한 제조 및/또는 정제 공정에서 분리가능한 중간체이다.
본원에 사용된 용어 "Co-rhARG1-PEG", "PEG화된 Co-아르기나아제 1" 등은 효소에 공유 결합된 하나 이상의 PEG 단위를 갖는 Co-rhARG1, 예컨대 N 말단 아미노산 및/또는 하나 이상의 리신 잔기에서의 유리 아민(들)을 지칭한다.
Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 양은 PEG화되지 않은 효소의 질량으로 나타낼 수 있다. 상기 방법의 일 구현예에서, Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 각 mg(효소 기준)은 또한 약 1~2 mg의 PEG, 예컨대 약 mg의 PEG를 함유한다.
도 1(a)은 대장균에서 발현된 아미노산 서열을 도시한다. hArg1 단백질 서열은 NCBI 데이터베이스(유니프롯(UniProt)KB: 유전자좌 ARGI1_HUMAN, 수탁번호 P05089)에서 입수하였다. 중첩 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응에 사용하여 대장균에서의 발현에 최적화된 코돈인 아르기나아제 1 DNA를 생성하였다(도 1(b)). 아르기나아제 1의 321 아미노산 대장균 발현된 단량체에는 천연의 인간 아르기나아제 1 단량체에서 발견되는 N 말단 메티오닌이 없다. Co-아르기나아제 1의 계산된 분자량은 34721.6 달톤이다(표 1). 동종삼량체 Co-아르기나아제 1의 계산된 분자량은 104164.8 달톤이다. 아르기나아제 1은 그 어떤 이황화 결합도 갖지 않는다.
예시적인 Co-아르기나아제 1 중간체의 구조적 정보
Co-아르기나아제 1의 분자량 34721.6 달톤(코발트로 계산된 값)
동종삼량체 Co-아르기나아제 1 104164.8 달톤(코발트로 계산된 값)
단량체의 길이 321개의 아미노산 잔기
이황화 결합 없음
아미노산 서열 재조합 인간 아르기나아제 1의 1차 서열은 도 1에
제시된다.
하나 이상의 구현예들에서, 단량체 Co-rhARG1-PEG의 계산된 분자량은 약 75-115 kDa이다. 하나 이상의 구현예들에서, 동형 삼량체 Co-rhARG1-PEG의 계산된 분자량은 약 224-344 kDa이다. 하나 이상의 구현예들에서, PEG의 평균 수는 약 8 내지 약 25몰의 PEG/몰 Co-아르기나아제 1 단량체, 예컨대 약 8 내지 약 16몰의 PEG/몰 Co-아르기나아제 1 단량체이다. PEG의 예시적인 양은 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15 및 약 16몰의 PEG/몰 Co-아르기나아제 1 단량체를 포함한다. 하나 이상의 구현예들에서, 각각의 PEG는 약 1,000 내지 약 10,000 달톤, 예컨대 약 1,000, 약 2,000, 약 3,000, 약 4,000, 약 5,000, 약 6,000, 약 7,000, 약 8,000, 약 9,000 또는 약 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 PEG의 평균 MW는 약 5,000 달톤이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 페그질라기나제를 포함한다. 페그질라기나제는 하기의 두 가지 화학명:
a. 폴리(옥시-1,2-에탄디일), α-(카르복시메틸)-ω-메톡시-, 아르기나아제 1[코발트 보조인자](합성 인간)을 갖는 아미드(1:10), 삼량체
b. Des-Met1-아르기나아제-1(간형 아르기나아제, EC 3.5.3.1)(호모 사피엔스)을 가지고, 이로부터 망간은 코발트로 대체되고, (N 말단 세린 및 N6-리신의 )평균 10개의 1차 아민은 대장균에서 생성된 비공유 동종삼량체인 [메톡시폴리(에틸렌옥시)]아세틸로 아미드화된다.
페그질라기나제의 분자식은 C1554H2492N416O453S6 [C3H4O2 (C2H4O)n]a 단량체이다. 페그질라기나제의 평균 분자량은 삼량체의 경우 284kDa이다. 페그질라기나제의 CAS 등록 번호는 1659310-95-8이다.
페그질라기나제의 잠재적인 PEG화 부위는 하기와 같다:
Figure pct00004
일반적으로, PEG화 반응은 Co-rhARG1에 대해 실시된다. 일부 구현예들에서, 페길화 반응은 rhARG1에 대해 실새될 수 있다. 하나 이상의 구현예들에서, 반응물의 양, 시간, 온도 및 용액 및 반응물 취급(예컨대, 혼합, 첨가 속도, PEG 취급)은 일관된 PEG화된 생성물을 제조하는데 중요하다. 일반적으로, Co-rhARG1에 대한 PEG화 반응은 pH의 반응 완충액에서 실시된다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1은 pH 8.4의 0.1 M 인산나트륨 완충액 내에서 PEG화된다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 PEG화 반응은 4:1 내지 1:1 범위인 Co-rhARG1(g)에 대한 PEG(g)의 반응물 비율을 포함한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 PEG화 반응은 약 2.77:1 범위인 Co-rhARG1(g)에 대한 PEG(g)의 반응물 비율을 포함한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 PEG화 반응은 PEG 및 Co-rhARG1을 약 5분 내지 약 300분, 약 10분 내지 약 300분, 약 20분 내지 약 300분, 약 30분 내지 약 300분, 약 5분 내지 약 280분, 약 10분 내지 약 280분, 약 20분 내지 약 280분, 약 30분 내지 약 280분, 약 5분 내지 약 260분, 약 10분 내지 약 260분, 약 20분 내지 약 260분, 약 30분 내지 약 260분, 약 5분 약 240분, 약 10분 내지 약 240분, 약 20분 내지 약 240분, 약 30분 내지 약 240분을 분무함으로써 실시된다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 PEG화 반응은 과량의 PEG를 제거하고 반응 완충액의 pH를 감소시킴으로써 중지된다. 하나 이상의 구현예들에서, 과잉 PEG는 여과 기술에 의해 제거한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 pH는 반응 완충액을 저장 완충액으로 교환함으로써 감소한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 저장 완충액은 5 mM 인산칼륨, 50 mM NaCl, 1.5% w/v 글리세롤 및 pH 7.4를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321 아미노산 잔기들 중 하나 이상에서 PEG화된다. 일부 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 적어도 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K312 및 K321 아미노산 잔기들에서 PEG화된다. 일부 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 K222 및/또는 K223 아미노산 잔기들에서 PEG화된다. 일부 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 K222 및/또는 K223 아미노산 잔기들에서 PEG화되지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 K3, K149, K190, K195, K29, K265 및 K283 아미노산 잔기들의 적어도 하나 이상에서 PEG화되지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 K3, K149, K190, K195, K29, K265 및 K283 아미노산 잔기들에서 PEG화되지 않는다.
상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K16은 약 15% 내지 약 60% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K32는 약 35% 내지 약 80% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K38은 약 20% 내지 약 85% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K40은 약 10% 내지 약 60% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K47은 약 10% 내지 약 60% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K67은 약 40% 내지 약 90% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K74는 약 30% 내지 약 95% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K82는 약 30% 내지 약 98% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K87은 약 15% 내지 약 65% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K88은 약 25% 내지 약 70% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K152는 약 25% 내지 약 85% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K154는 약 15% 내지 약 65% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K171은 약 20% 내지 약 75% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K222는 약 0% 내지 약 30% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K223은 약 0% 내지 약 35% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K312는 약 0% 내지 약 45% 범위에서 PEG화된다. 상기 Co-rhARG1-PEG의 하나 이상의 구현예들에서, K321은 약 0% 내지 약 45% 범위에서 PEG화된다.
PEG-단백질 몰비는 PEG화 정도를 나타내는 속성이다. 일부 구현예들에서, 약 1 내지 약 20몰의 PEG는 1몰의 Co-rhARG1을 PEG화하였다. PEG:Co-rhARG1의 몰비의 예시적인 범위는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1 및 20:1을 포함한다. 일부 구현예들에서, PEG:Co-rhARG의 몰비는 약 7몰/몰 내지 약 15몰/몰의 범위이다.
유리 PEG는 PEG 제거 및 안정성을 입증하기 위해 측정된다. 일부 구현예들에서, PEG화된 Co-rhARG1(mL) 중 유리 PEG 농도(μg)는 500 μg/mL 이하, 400 μg/mL 이하, 300 μg/mL 이하, 200 μg/mL 이하, 100 μg/mL 이하, 및 50 μg/mL 이하이다.
인간 아르기나아제 1은 L-아르기닌을 L-오르니틴 및 요소로 전환하는 요소 회로의 제5 및 마지막 단계를 촉매한다. PEG화된 원료의약품인 Co-rhARG1-PEG는 동일한 반응을 촉매한다. 효소 활성을 평가하기 위한 분석은 pH 7.4 및 37°C에서 고정된 반응 시간 동안 L-아르기닌의 L-오르니틴으로의 전환을 측정한다. 생성물의 전환량을 반응 속도로 변환하고 Km 및 kcat을 결정하기 위해 미카앨리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식에 맞춘다.
Figure pct00005
Vmax는 포화 기질 농도에서 달성된 최대 반응 속도이다. Km은 Vmax의 절반에서 속도를 산출하는 기질 농도를 측정하기 위한 미카앨리스-멘텐 결합 상수이다. 효소 회전율 수 kcat은 Vmax/[E]로 계산된다.
고유 활성도는 μmole/min으로 표시되는 2 mM 아르기닌에서의 반응 속도를 효소 농도(mg)로 나누어 결정한다.
효소 활성 분석에서 측정된 KM 및 kcat에 대한 Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 값은 일반적으로 각각 0.15~0.22 mM 및 대략 200~300/초의 범위이다. Co-아르기나아제 1 중간체를 페길화하여 원료의약품을 형성하면, PEG화되지 않은 중간체와 비교하여 효소 활성이 유의적으로 변하지 않는다. 하지만, PEG화는 Co-아르기나아제 1 중간체와 비교하여 Co-rhARG1-PEG 의약품의 순환 반감기를 유의적으로 증가시킨다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 단백질(예컨대, Co-rhARG1 또는 Co-rhARG1-PEG)은 pH 7.4에서 200 mM-1 s-1 초과의 kcat/KM을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 pH 7.4에서 약 200 mM-1 s-1 내지 약 4,000 mM-1 s-1의 범위에서 kcat/KM을 나타낸다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 pH 7.4 및 37°C에서 약 400 mM-1 s-1 내지 약 2,500 mM-1 s-1의 범위에서 kcat/KM을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 아르기나아제 1의 아미노산 서열 및 비천연 금속 보조인자를 포함하는 단백질을 고려하며, 상기 단백질은 37°C 및 pH 7.4에서 약 400 mM-1 s-1 초과의 kcat/KM을 나타낸다. 예시적인 kcat/KM 값은 pH 7.4 및 37°C에서 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1,000, 약 1,100, 약 1,200, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 3,500 및 약 4,000 mM-1 s-1, 또는 상기 값들 사이의 임의의 범위를 포함한다.
고유 활성도는 단백질의 효능을 나타낸다(예컨대, Co-rhARG1 20 또는 Co-rhARG1-PEG). 하나 이상의 구현예들에서, Co-rhARG-PEG의 고유 활성도는 약 200 U/mg 내지 약 1000 U/mg의 범위이다. 고요 활성도의 예시적인 범위는 약 200 U/mg 내지 약 1000 U/mg, 약 300 U/mg 내지 약 1000 U/mg, 약 400 U/mg 내지 약 1000 U/mg, 약 200 U/mg 내지 약 900 U/mg, 약 300 U/mg 내지 약 900 U/mg, 약 400 U/mg 내지 약 900 U/mg, 약 200 U/mg 내지 약 800 U/mg, 약 300 U/mg 내지 약 800 U/mg, 약 400 U/mg 내지 약 800 U/mg, 약 200 U/mg 내지 약 700 U/mg, 약 300 U/mg 내지 약 700 U/mg, 및 약 400 U/mg 내지 약 700 U/ mg를 포함한다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 rhARG1, Co-rhARG1 또는 Co-rhARG1-PEG는 서열 번호 1과 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5% 이상의 동일성을 가질 수 있다. 하나 이상의 구현예들에서, rhARG1, Co-rhARG1 또는 Co-rhARG1-PEG는 서열번호 1에 의해 기재된 아미노산 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 입수 가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함한 두 서열 간의 동일성을 계산하기 위해 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램을 사용할 수 있다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 rhARG1, Co-rhARG1 또는 Co-rhARG1-PEG는 H100, D123, H125, D127, D231, D233, D180, S229, 및 C302로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예들에서, rhARG1, Co-rhARG1 또는 Co-rhARG1-PEG는: D180S, S229C, S229G, C302F, C302I, E255Q, D180E, 및 S229A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 하나 이상의 구현예들에서, rhARG1, Co-rhARG1 또는 Co-rhARG1-PEG는 C302에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
본원에 기재된 방법들을 사용하여, 아르기나아제 1의 거의 모든 망간 보조인자를 코발트로 대체할 수 있다. 코발트 보조인자로의 변화는 pH 7.4에서 아르기닌에 대한 Km을 2.8 mM에서 약 0.18 mM으로 변화시킨다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 약 0.1 내지 약 2 μg Co/mg 단백질을 포함한다. 예시적인 코발트 로딩은 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약, 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 및 약 2 μg Co/mg의 단백질을 포함한다.
유리 코발트는 코발트 제거 및 안정성을 입증하기 위해 측정된다. 일부 구현예들에서, 유리 코발트는 0.10 μg/mL 이하, 0.09 μg/mL 이하, 0.08 μg/mL 이하, 0.07 μg/mL 이하, 0.06 μg/mL 이하, 0.05 μg/mL 이하, 및 0.04 μg/mL 이하이다.
총 코발트는 단백질의 효능에 영향을 미치며, 유리 코발트의 양이 상대적으로 적기 때문에 결합된 코발트를 나타낸다. 일부 구현예들에서, 총 코발트의 농도는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 8 μg/ mL 내지 약 19 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 16μg/ mL, 약 6 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 및 약 9 μg/mL 내지 약 15 μg/mL의 범위이다.
일부 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 약 1 μg 미만의 Mn/mg 단백질, 예컨대 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 약 0.5, 약 0.4, 약 0.3, 약 0.2, 약 0.15, 약 0.1, 약 0.09, 약 0.08, 약 0.07, 약 0.06, 약 0.05, 약 0.04, 약 0.03, 약 0.02 또는 약 0.01 μg 미만의 Mn/mg 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, Co-rhARG1-PEG 원료의약품은 약 2 μg의 Co/mg 단백질 및 약 0.05 μg의 Mn/mg 단백질을 함유한다.
다양한 구현예들에서, 상기 Co-rhARG1-PEG는 약 1 μg 미만의 Fe/mg 단백질, 예컨대 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 약 0.5, 약 0.4, 약 0.3, 약 0.2, 약 0.15, 약 0.1, 약 0.09, 약 0.08, 약 0.07, 약 0.06, 약 0.05, 약 0.04, 약 0.03, 약 0.02 또는 약 0.01 μg 미만의 Fe/mg 단백질을 포함한다.
rhARG1, Co-rhARG1 및 PEGrhARG1의 제조 및 정제
예시적인 상류 및 하류 제조 방법의 개요는 도 2 및 도 3에서 볼 수 있다.
진탕 플라스크 확장
진탕 플라스크 확장/발효의 목적은 생산 발효조에 접종하기 위해 접종원을 생성하는 것이다. 진탕 플라스크 확장은 생산 반응조의 접종을 위한 세포 덩어리 뿐만 아니라 분석 목적을 위한 추가 세포 덩어리를 생성한다. 아르기나아제 1 발효 공정의 대표적인 개요는 도 2에서 볼 수 있다.
접종원 배지의 분취량을 1개의 500 mL 플라스크(1차 플라스크) 및 6개의 3 L 일회용 플라스크(2차 플라스크) 내에 도입한다. 상기 플라스크를 가압증기 멸균처리하고 25개의 멸균 후 첨가물을 각 플라스크로 옮긴다. 접종 전에, 1차 배지를 37°C의 처리 온도로 예열한다. 2차 접종 전에, 2차 플라스크를 37°C의 처리 온도로 예열한다.
아르기나아제 1을 발현하는 대장균 제조용 세포은행(WCB)의 한 바이알을 저온 저장고에서 꺼내어 해동한다. 목표 부피(약 1.1 mL)의 해동된 세포를 1차 플라스크에 무균 상태로 첨가하고, 상기 플라스크를 교반하면서 37°C에서 배양한다. 접종 후 몇 시간부터 시작하여 매시간마다 플라스크로부터 샘플을 제거하여 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도에 의한 세포 성장을 추적한다. 1차 플라스크에서 1.0 이상의 목표 OD600에 도달하면, 목표 부피(15mL)의 1차 배양물을 각각의 2차 플라스크로 무균 상태로 옮긴다. 상기 2차 플라스크를 37°C에서 교반하면서 배양한다. 접종 후 4시간부터 시작하여 일단 OD600이 ≥ 1.5에 도달하면 30분마다 증가시키면서 1개의 2차 플라스크로부터 샘플을 제거한다. 측정값이 2.0 OD600 이상의 지정된 밀도를 충족하면, 나머지 2차 플라스크를 샘플링한다. 모든 2차 플라스크의 평균 OD600이 플라스크를 옮기기 위한 지정된 기준을 충족하면, 상기 플라스크들을 모으고 접종원을 생산 발효조로 옮긴다. 아르기나아제 1에 대한 발효 공정의 대표적인 개요는 도 2에서 볼 수 있다.
생산 발효
생산 발효의 목적은 진탕 플라스크 배양을 확장하고 아르기나아제 1의 생성을 유도하는 것이다. 생산 발효는 대량의 아르기나아제 1을 생성할 수 있다. 세포 덩어리를 구축하기 위한 진탕 플라스크 확장 단계 이후, 발효 공정에서 가용성 단백질로서 아르기나아제 1(대장균 내)이 생성된다. 일 구현예에서, 1500 L 발효조는 접종 전에 멸균 첨가를 포함하는 초기 배치 배지를 함유한다. 접종 후, 발효조에 대한 투입물에는 영양 공급, 소포제 용액, 배양 pH를 유지하기 위한 산 또는 염기의 첨가가 포함된다. 2차 용기는 영양 공급 배지를 보유한다. 자동 제어 전략은 용존 산소, 살포 속도, 교반 속도, pH, 압력 및 온도를 포함하여 일관된 세포 성장을 위한 중요한 매개변수를 유지한다. 아르기나아제 1 발현은 이소프로필 베타-D-1-티오갈락토프라노사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되며, 회수는 약 18시간 후에 실시한다. 발효조의 성능은 세포 밀도, 고체 비율, 및 가용성 아르기나아제 1의 비율을 모니터링하여 생산 종료 시 평가한다.
바람직한 구현예에서, 발효 배지는 생산 발효조에서 직접 제조한다. 내부 멸균(SIP) 전에 정제수를 필요한 중량으로 발효 배지에 첨가한다. 카나마이신, 포도당 및 인산칼륨의 멸균 후 첨가물은 배지가 냉각되면 생산 발효조 내로 여과 멸균된다. 필요한 경우, 멸균 배지를 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 정제수로 지정된 사전 접종 중량이 되게 한다. 발효 배지는 염기(수산화암모늄)를 사용하여 조절된 pH 값으로 적정한다.
37ºC의 생산 발효조는 압력 보조 전달을 통해 취합된 접종원을 사용하여 무균 상태로 접종한다. 발효 브로스 샘플을 정기적인 빈도로 수집하고 접종 시점부터 발효가 식을 때까지 OD600 분석을 위해 측정한다. 포도당 샘플은 접종 후 3시간에 시작하여 접종 후 9시간 후에 빈도를 증가시키며 규칙적인 간격으로 채취한다. 배양물의 과도한 거품을 피하기 위해 발효 공정 중에 필요에 따라 소포제 용액을 첨가한다. 용존 산소는 요구 시 산소 살포와 함께 교반 연계에 의해 제어한다. 배양 pH는 산 및 염기 투입물을 사용하여 유지한다. 성장 배지는 교반 및 통기를 실시하면서 바람직하게는 36-38ºC 및 pH 7.0-7.4로 유지한다.
영양 공급물은 효모 추출물, 마톤(Martone) B-1, L-시스테인 HCl, 및 글리세롤로 구성된다. 상기 공급은 포도당 농도가 10 g/L 미만(접종 후 12-14시간)일 때 시작하여 생산이 끝날 때까지 고정된 속도로 지속한다. IPTG가 추가되면 발현이 촉발된다. 유도는 18시간 동안 지속한다. 발효 공정이 완료된 후, 회수 작업을 준비하기 위해 냉각된다. 생산 발효조는 약 6 g/L의 가용성 아르기나아제 1의 역가를 생성할 수 있다. 생산 발효의 개요는 도 3에서 볼 수 있다.
회수 작업
회수 작업은 가용성 아르기나아제 1을 함유하는 세포를 포획하고, 상기 세포를 부수고/용해하며, 원심분리 및/또는 여과를 사용하여 세포 파괴물의 용해물을 제거한다. 회수한 세포 슬러리는 장기간 보관을 위해 냉동하거나 저온에서 보관할 수 있다. 회수 작업은 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 균질화기를 통한 2회 통과 또는 압력 하의 세포 파괴(French press)에 의해 세포를 용해시키고, 제2 시간동안 원심분리한 후, 제1 크로마토그래피 단계 전에 막 여과할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 디스크 스택 원심분리기를 사용하여 전체 세포를 발효 배지로부터 분리한다. 생성된 세포 슬러리를 25 mM HEPES, pH 7.6에 재현탁시킨 다음, 균질화기를 통해 2회 통과시켰다. 25 mM HEPES의 pH는 또한 pH 7.2-7.6의 범위에서 사용할 수 있다. 용해된 물질은 원심분리기를 사용하여 정화하여 세포 파괴물을 제거한 다음, 0.2 μm 등급 필터를 통해 멤브레인 여과한다. 바람직한 구현예에서, 회수 단계는 15℃ 이하의 목표 온도에서 실시한다.
대안적인 구현예에서, 세포 파괴는 고압을 사용하여 실시한다. 세포 슬러리를 제어된 속도로 균질화기로 옮기고 균질화된 유출물을 열교환기에 통과시켜 압력 균질화 동안 나타나는 온도 상승을 감소시킨다. 냉각된 세포는 2회의 균질화 통과 과정을 거친다. 제1 통과 용해 풀(pool)을 수집 용기에서 공급 용기로 다시 이동시킨다. 통과 과정 사이의 유지 기간을 최소화하여 잠재적인 미생물 성장을 감소시킨다.
용해 후 물질을 원심분리에 의해 정화하여 용해물의 가용성 성분으로부터 세포 파괴물을 제거한다. 상기 용해물을 제어된 속도로 디스크 스택, 간헐적 배출, 원심분리기로 이동시킨다. 정화된 용해물을 추가 처리를 위해 수집한다.
정화된 용해물을, 예컨대 약 0.2 μm 필터로 여과한다. 공정 전환 필터는 공정 작업 중 미생물 제어에도 사용할 수 있다. 상기 목적을 위해, 필터는 0.5 μm 또는 0.2 μm 필터가 될 수 있다. 상기 단계는 또한 정화 작업 동안 분리되지 않았을 수 있는 정화된 물질로부터 작은 미립자를 제거한다. 사용하기 전에, 필터를 정제수로 광범위하게 세척하고 25 mM HEPES, pH 7.6 완충액으로 평형화한다. 각 하류 공정 단계에 앞서 미생물오염(bioburden) 부하 가능성을 완화시키기 위해 사전 필터가 선행될 수 있다.
rhARG1, Co-rhARG1 및 Co-rhARG1-PEG의 정제
rhARG1을 발현하는 세포를 배양하는 데 사용되는 방법(예컨대, 상기 기재된 발효 공정)에 관계없이, 본원에 기재된 정제 방법을 사용하여 rhARG1을 포획하고 효소를 추가로 정제할 수 있다. 상기 정제 방법은 Co-rhARG1을 생성하기 위해 코발트를 로딩하는 단계 및/또는 PEG화 반응물과 반응하여 Co-rhARG1-PEG를 제공하는 단계와 같은 선택적 단계를 포함할 수 있다.
정제 공정의 다양한 구현예들은 rhARG1을 포획하기 위한 양이온 교환(CEX) 컬럼의 사용에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 CEX 컬럼은 다중 크로마토그래피 컬럼을 구비한 시스템에서 제1 컬럼("컬럼 1")이다. 상기 컬럼 1에서 용출된 단백질 생성물은 "제1 단백질 생성물"이다.
하나 이상의 구현예들에서, 칼럼 1은 pH 약 7 내지 약 8의 범위에서, 예컨대 pH 약 7.6에서 rhARG1에 결합하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 사용한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 hARG1은 염의 부재 하에 또는 낮은 염 농도에서 결합한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 hARG1은 높은 염(예컨대, NaCl) 농도, 예컨대 최대 약 0.5 M NaCl을 갖는 완충액으로 용출한다. 예시적인 염 농도는 약 0.01, 약 0.02, 약 0.03, 약 0.04, 약 0.05, 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4 및 약 0.5 M NaCl을 포함한다.
다양한 구현예들에서, 염 구배를 사용하여 rhARG1의 상이한 전하 변이체를 분리한다. 예시적인 염 구배는 약 0 내지 약 0.5 M NaCl, 약 0 내지 약 0.4 M NaCl, 약 0 내지 약 0.3 M NaCl, 약 0 내지 약 0.2 M NaCl 또는 약 0 내지 약 0.1 M NaCl이다.
하나 이상의 구현예들에서, 상기 방법은 제1 단백질 생성물(임의적으로 코발트 치환 이후)을 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 컬럼("컬럼 2") 상에 로딩하는 단계 및 통과액을 수집하여 제2 단백질 생성물("제2 단백질 생성물")을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 방법의 다른 양태에서, 상기 방법은 제2 단백질 생성물을 아르기나아제 1을 포획한 다음 용출하여 제3 단백질 생성물("제3 단백질 생성물")을 제공하는 제3 컬럼에 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제3 크로마토그래피 컬럼("컬럼 3")은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼 또는 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼일 수 있다.
다양한 구현예들은 상기 rhARG1이 Mn 보조인자를 대체하기 위해 Co로 로딩되는 것을 제공한다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 Co 로딩은 CoCl2와 같은 Co2+ 염을 사용하여 실시한다. 배양 시간은 온도에 따라 다르므로, 낮은 코발트 치환 온도는 더 긴 배양 시간을 필요로 하고 더 높은 코발트 치환 온도는 긴 배양 시간을 필요로 하지 않는다. 코발트 로딩 온도는 1ºC만큼 낮거나 50ºC보다 높을 수 있으며 해당 배양 시간은 길게는 8시간 이상 또는 10분 미만일 수 있다.
다양한 구현예들는 상기 rhARG1 또는 Co-rhARG1이 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르(MW 5000)와 같은 PEG화 반응물과 반응하는 것을 제공한다. 상기 PEG화 반응물은 일반적으로 효소에 비해 10-40 몰 과량으로 제공된다. 배양 시간은 0.5 내지 4시간의 범위일 수 있다. PEG화 동안의 pH는 약 8 내지 약 9, 예컨대 약 pH 8.4일 수 있다.
하나 이상의 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 아르기나아제 I 단량체, 글루코노일화 아르기나아제 I, 포스포글루코노일화 아르기나아제 I, 2x 글루코노일화 아르기나아제 I, 글루코노일화 + 포스포글루코노일화 아르기나아제 I, 및 2x 포스포글루코노일화 아르기나아제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 적어도 70%의 아르기나아제 I 단량체를 포함한다. 예시적인 양은 적어도 70%, 적어도 75, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 아르기나아제 I 단량체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 10% 미만의 글루코노일화 아르기나아제 I을 포함한다. 예시적인 양은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8% 또는 약 9%의 글루코노일화 아르기나아제 I, 또는 상기 값들 사이의 임의의 범위를 포함한다. 일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 10% 미만의 포스포글루코노일화 아르기나아제 I을 포함한다. 예시적인 양은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8% 또는 약 9%의 포스포글루코노일화 아르기나아제 I을 포함한다. 일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 적어도 70%의 아르기나아제 I 단량체, 10% 미만의 글루코노일화 아르기나아제 I, 및 10% 미만의 포스포글루코노일화 아르기나아제 I을 포함한다.
이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF)은 PEG화된 삼량체의 이질성 수준으로 인해 PEG화된 단백질의 일관성에 대한 측정을 제공한다. 하나 이상의 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1의 icIEF 분석은 9개의 구별되는 피크, 피크-1, 피크-2, 피크-3, 피크-4, 피크-5, 피크-6, 피크-7, 피크-8 및 피크-9를 포함하고, 각각은 9개의 구별되게 하전된 종인, 종-1, 종-2, 종-3, 종-4, 종-5, 종-6, 종-7, 종-8 및 종-9에 해당한다. 각 피크의 곡선 아래 면적은 상기 특정 종의 비율에 해당한다. 하나 이상의 구현예들에서, 특정 피크들은 피크-1+2 또는 피크-3+4와 같은 관련 종들에 대해 함께 조합될 수 있다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화된 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만 및 약 10% 미만의 비율로 피크-1에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만 및 약 10% 미만의 비율로 피크-2에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 및 약 10% 미만의 비율로 조합한 피크-1+2에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화된 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 35%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 25%, 약 4% 내지 약 40%, 약 4% 내지 약 35%, 약 4% 내지 약 30%, 약 4% 내지 약 25%, 약 6% 내지 약 40%, 약 6% 내지 약 35%, 약 6% 내지 약 30%, 약 6% 내지 약 25%, 약 8% 내지 약 40%, 약 8% 내지 약 35%, 약 8% 내지 약 30%, 약 8% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 및 약 10% 내지 약 25%의 비율 범위로 피크-3+4에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 30%, 및 약 15% 내지 약 25%의 비율 범위로 피크-5에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 2% 내지 약 35%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 25%, 약 2% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 35%, 약 4% 내지 약 30%, 약 4% 내지 약 25%, 약 4% 내지 약 20%, 약 6% 내지 약 35%, 약 6% 내지 약 30%, 약 6% 내지 약 25%, 약 6% 내지 약 20%, 약 8% 내지 약 35%, 약 8% 내지 약 30%, 약 8% 내지 약 25%, 약 8% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 및 약 10% 내지 약 20%의 비율 범위로 피크-6에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만 및 약 10% 미만의 비율로 피크-7에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 및 약 5% 미만의 비율로 피크-8에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
일부 구현예들에서, 정제된 PEG화 단백질, rhARG1 또는 Co-rhARG1은 약 18% 미만, 약 16% 미만, 약 14% 미만, 약 12% 미만, 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 6% 미만, 및 약 4% 미만의 비율로 피크-9에 대한 곡선 아래 면적을 포함한다.
rhARG1, Co-rhARG1 및 Co-rhARG1-PEG의 투여
본원에 기재된 rhARG1, Co-rhARG1 및 Co-rhARG1-PEG(및 이들을 포함하는 조성물)는 정맥내, 척추강내, 피하, 근육내, 종양내 및/또는 복강내를 포함하여 임의의 적절한 경로를 통해 투여할 수 있다. 하나 이상의 구현예들에서, 상기 rhARG1, Co-rhARG1 및 Co-rhARG1-PEG(또는 이들을 포함하는 조성물)는 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 투여한다.
rhARG1, Co-rhARG1 및 Co-rhARG1-PEG를 함유한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제제로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로 주사 가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조한다. 적합한 희석제 및 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합이다. 또한 원하는 경우, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
rhARG1, Co-rhARG1 및 Co-rhARG1-PEG(예: 페그질라르기나제)의 투여에 관한 예시적인 방법 및 지침이 하기에 제시된다. 하기의 설명은 페그질라르기나제에만 해당되지만, 상기 방법 및 지침은 다른 재조합 아르기나아제 1 및 2 효소에도 적용 가능하다.
권장 정맥 투여량 요법:
치료를 시작하기 전에 기준 혈장 아르기닌 농도를 수득한다. ARG1-D 환자에 대한 페그질라르기나제의 초기 권장 투여량은 단일 정맥내 주입으로서 매주 1회 0.10 mg/kg이다. 0.10 mg/kg의 초기 용량이 혈장 아르기닌을 150 마이크로몰/L 이하의 수준으로 감소시키지 않으면, 상기 용량을 주 1회 최대 0.20 mg/kg까지 조정할 수 있다. 치료 중 혈장 아르기닌 수준이 50 μmol/L 아래로 떨어지면, 투여량을 줄이는 것을 고려해 본다. 페그질라기나제를 5회 이상 IV 투여하는 경우, ARG1-D 환자에게 페그질라르기나제의 피하 투여를 고려하고 혈장 아르기닌 수준을 주기적으로 계속 모니터링한다.
권장 피하 투여량 요법:
페그질라르기나제 정맥 투여에서 피하 투여로 전환하는 경우, 다음 예정된 정맥 용량 제1 피하 용량을 투여한다. 초기 피하 용량은 마지막 투여된 IV 용량과 동일한 mg/kg 용량이어야 한다. 피하 용량은 혈장 아르기닌 수준이 50-150 마이크로몰/L의 범위로 유지되도록 임상적으로 표시된 바와 같이 수정할 수 있다.
혈액 아르기닌 모니터링:
페그질라르기나제로 치료를 시작한 후, 환자의 혈장 아르기닌 수준이 목표 범위인 50 내지 150 μmol/L 내에 있을 때까지 혈장 아르기닌 모니터링을 실시해야 한다. 그 후, 혈액 아르기닌 조절을 평가하기 위해 주기적인 혈장 아르기닌 모니터링을 권장한다. 피하 용량 투여로 변경하거나 식이 요법을 변경할 때, 추가 혈장 아르기닌 모니터링이 필요할 수 있다.
제조 및 투여 지침
페그질라르기나제는 1 mg/mL 또는 5 mg/mL 농도의 페그질라르기나제 5 mL를 함유하는 10 mL 일회용 유리 바이알 내의 냉동 액체 제제로 공급된다. 페그질라르기나제의 각 일회용 유리 바이알은 단일 정맥 주사 또는 피하 주사로서 사용하기 위한 것이다. 투여 전에 페그질라르기나제에 미립자 물질 및 변색이 있는지 육안으로 검사한다. 페그질라르기나제는 무색 내지 연노란색 또는 연분홍색의 용액이다. 변색되거나 흐리거나, 또는 미립자 물질이 바이알에 존재하는 경우 폐기한다. 상기 바이알에서 뚜껑을 밀어 올려 제거한다. 알코올 면봉으로 바이알의 고무 마개를 닦아 소독한다. 18G 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 바이알에서 적절한 부피의 약물을 제거한다. 하나 초과의 바이알이 필요한 경우, 별도의 바늘을 사용하여 각 바이알로부터 용액을 추출한다. 주사기 펌프에 사용하기 위해 바이알에서 추출할 용액을 계산한다. 적절한 부피의 약물이 주사기 내로 주입되면, 별도의 바늘을 사용하여 생리식염수를 추출하여 총 부피가 40 mL가 되도록 한다. 하기와 같이 필요한 약물의 양을 계산한다.
mg/mL 페그질라르기나제의 양 = 환자 체중(kg) x 용량 수준(mg/kg)
Figure pct00006
주사기 펌프를 사용하여 30분에 걸쳐 정맥 주입을 통해 페그질라르기나제를 투여한다.
주 1회 0.1 mg/kg 투여를 위한 체중 기반 투여
체중(kg)* 주입 부피(mL) 바이알 구성
3 0.30 1 mg/mL
4 0.40 1 mg/mL
5 0.50 1 mg/mL
6 0.60 1 mg/mL
7 0.70 1 mg/mL
8 0.80 1 mg/mL
9 0.90 1 mg/mL
10 1.0 1 mg/mL
15 1.5 1 mg/mL
20 2.0 1 mg/mL
25 2.5 1 mg/mL
30 3.0 1 mg/mL
35 3.5 1 mg/mL
40 4.0 1 mg/mL
50 5.0 1 mg/mL
60 1.20 5 mg/mL
70 1.40 5 mg/mL
80 1.60 5 mg/mL
하나 이상의 구현예들에서, 피하 주사를 위한 부피는 최대 부피, 예컨대 성인 환자의 경우 최대 2 mL/주사 및/또는 소아 환자의 경우 최대 1 mL/주사 부피를 갖는다. 피하 투여를 위해 계산된 부피가 최대 부피보다 크면, 더 높은 바이알 농도를 사용할 수 있고/거나(예컨대, 1 mg/mL 대신 5 mg/mL) 부피를 여러 개의 더 작은 주사로 분할할 수 있다(예컨대, 4 mL 주사를 각각 2 mL씩 2회 주사로 분할함).
제형 및 강점
페그질라르기나제 주사는 10 mL 바이알에서 하기와 같이 사용할 수 있는 무색 내지 연노란색 또는 연분홍색의 용액이다:
a. 주입 용액: 1.0 mg/mL의 5 mL
b. 주입 용액: 5.0 mg/mL의 5 mL
경고 및 주의사항
페그질라르기나제의 투여 시 과민 반응이 나타날 수 있다. 페그질라르기나제의 주입 중 및 주입 후, 급성 알레르기 반응(예컨대, 두드러기, 가려움증, 홍반, 저혈압, 빈맥)의 징후 및 증상에 대해 모든 환자를 모니터링한다. 중증의 과민반응이 있는 경우에는, 즉시 페그질라르기나제의 투여를 늦추거나 중단하고 적절한 의료적 치료를 실시한다. 투여 전에, 환자에게 졸리지 않은 항히스타민제를 이용한 예비투약을 고려한다. 코르티코스테로이드가 필요한 경우, 고암모니아혈증을 유발할 가능성이 있으므로 주의해서 사용해야 한다.
임신: 임신 카테고리 B
생식 연구는 최대 100 mg/kg의 용량에서 생쥐 및 쥐에서 실시하였다. 페그질라르기나제로 인한 태아에 대한 피해의 증거는 없었다. 하지만, 임산부에 대한 적절하고 잘 통제된 연구는 없다. 동물 생식 연구에서 항상 사람의 반응을 예측할 수 있는 것은 아니므로, 임신 중에 분명히 필요한 경우에만 페그질라르기나제를 사용해야 한다.
수유부
페그질라르기나제가 모유에 존재하는지 여부는 공지되지 않았다. 모유 수유의 발달 및 건강상의 이점은 페그질라르기나아제에 대한 어머니의 임상적 필요성 및 상기 약물로 인해 모유 수유 중인 어린이에게 미칠 수 있는 임의의 잠재적인 부작용과 함께 고려되어야 한다.
설명
페그질라르기나제는 아르기닌을 오르니틴 및 요소로 전환하는 아르기나아제 1과 동일한 반응을 촉매함으로써 작용하는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)에 공유 결합된 코발트 치환 재조합 인간 아르기나아제 I 효소이다. 인간 아르기나아제 1은 이핵 망간 금속효소이다. 페그질라르기나제를 생성하기 위해 망간 보조인자를 코발트로 대체하여 Co-아르기나아제 I을 수득한다. 아르기나아제 I의 활성 부위에서 천연 망간(Mn+2)을 코발트(Co+2)로 치환하면 생리적 pH에서 안정성 및 촉매 활성을 향상시킨다. 페길화는 순환 반감기를 연장한다. 페그질라르기나제의 평균 분자량은 약 284 kDa이다. 페그질라르기나제는 단백질 함량 mg당 약 320-600 단위 범위의 고유 활성도를 가진다. 1 활성 단위는 37°C에서 분당 아르기닌 1 마이크로몰을 오르니틴으로 전환하는 데 필요한 효소의 양으로 정의한다.
페그질라르기나제는 정맥 또는 피하 주입용이며 pH 7.4에서 50 mM 염화나트륨, 5 mM 인산칼륨, 및 1.5% w/v 글리세롤을 함유하는 완충액 중의 1 mg/mL 및 5 mg/mL의 농도로 제제화된 무균의 투명하고 무색에서 연노란색 또는 연분홍색인 용액으로 공급된다. 투명한 일회용 유리 바이알 내에 방부제가 없는 멸균 용액으로서 제공된다. 1 mg/mL 페그질라르기나아제 의약품의 각 바이알은 5 mL의 의약품을 함유한다(바이알당 5 mg 페그질라르기나아제). 5 mg/mL 페그질라르기나아제 의약품의 각 바이알은 5 mL의 의약품을 함유한다(바이알당 25 mg 페그질라르기나아제). 바이알은 코팅된 고무 마개로 덮이고 알루미늄 뚜껑을 밀어 올리는 형태로 밀봉되며 -60°C 이하에서 냉동 보관한 후 사용 전에 해동한다.
약력학
아르기나아제 1 결핍증이 있는 성인 및 소아 환자에 대한 페그질라르기나제 치료는 혈액 아르기닌 농도를 치료 전 기준값에서 40 내지 115 마이크로몰e/L의 정상 혈액 아르기닌 범위로 감소시켰다. L-아르기닌의 최대 억제는 투여 후 약 8시간에 관찰되었으며, 투여 후 168시간까지 투여 전 수준으로 회복이 발생하면서 용량 의존적 방식으로 감소하였다. 페그질라르기나아제와 아르기닌 사이에 강한 상관관계가 관찰되었고, IV 투여 후 아르기닌에 대한 즉각적인 억제 효과가 나타났으며, 아르기닌 농도의 최대 감소는 투여 후 24시간 이내에 도달하였다.
약동학
14명의 대상체에게 IV 투여한 후, 페그질라르기나제 약동학과 아르기닌 사이의 관계를 특성화하기 위해 0-168시간의 투여 간격 전체에 걸쳐 약동학 샘플을 수집하였다. 용량 범위(0.015 mg/kg - 0.2 mg/kg)에 걸쳐, Cmax 및 AUC0-168로 측정한 페그질라르기나제 노출은 용량에 대략 비례하여 증가했으며 용량이 13배 증가하면 Cmax 및 AUC0-168은 14배 증가하였다. 주 1회 IV 투여 요법 후 페그질라르기나제의 축적은 관찰되지 않았으며, 용량 범위에 걸쳐 T1/2가 약 30시간이었고 노출 메트릭에서 대상체 간 변동성(13 - 46% CV)이 낮거나 중간이었다.
동물 독성학 및/또는 약리학
아르기닌 수준에 대한 페그질라르기나제의 약리학적 효과는 아르기나아제 I의 신생아 형질전환 마우스 모델 및 성체 마우스의 타목시펜 유도 아르기나아제 결핍 모델에서 평가하였다. 상기 모델은 순환하는 아르기닌 및 아르기닌의 이화 산물이 유의적으로 과도하게 존재한다는 점에서 인간 질병을 모방하지만, 아르기나아제 I 결핍증이 있는 인간과 달리 상기 동물에게는 심각하고 일반적으로 치명적인 고암모니아혈증이 발병한다. 약리학적 효과는 또한 쥐의 아르기닌 유도된 아르기닌혈증 모델에서 평가하였다. 페그질라르기나제는 용량 의존적 방식으로 혈장 아르기닌 수준을 감소시켰다.
페그질라르기나제의 잠재적 독성 및 TK는 6개월에 이어서 6주의 회복 기간 동안 0.1, 0.3 및 1.0 mg/kg의 IV 일시주사를 매주 1회 투여한 출생 후(PND) 21일(2세 인간에 해당)의 어린 쥐에서 평가하였다. 페그질라르기나제는 내약성이 좋았고, 먹이 섭취, 응고, 소변 검사, 검안경 검사, 성적 성숙, 성장 호르몬 분석, 골수 분석, 기능 관찰 종합(FOB) 평가 및 신경 행동 시험(청각 반응 습관화, 운동 활동 또는 모리스(Morris) 수중 수영 미로)와 관련하여 시험 항목 관련 사망률 및 유의한 시험 항목 효과가 관찰되지 않았다. 6개월 종결 및 6주 회복 기간 만료 시 페그질라르기나제 관련 육안 소견은 없었다. 불리한 미세 변화는 고환 및 부고환으로 제한되었으며 0.3 및 1.0 mg/kg에서 수컷 생식 기관의 무게 감소 및 유해한 정자 분석 결과와 상관관계가 있었다. 1.0 mg/kg에서, 정자 운동성 감소, 꼬리 부고환 정자 수 감소, 정자 농도 감소, 관찰된 비정상 정자 비율의 증가와 함께 정자 분석에서 부작용이 관찰되었다. 상기 관찰은 직접적인 치료 관련 효과로 간주되었으며 0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg에서 고환에서 미세한 세뇨관 변성의 미세한 변화와 상관관계가 있었다. 대조군 및 1.0 mg/kg 군에 대한 6주 회복 기간 후, 이러한 변화는 비정상적인 정자 및 정자 수의 비율 증가를 제외하고는 전반적으로 가역적이었다. 6주 후 상기 부분 가역성은 정상적인 정자 발달 주기가 약 9주 또는 6주 회복 기간보다 길기 때문에 예상하지 못한 것이 아니었다.
중요하게는, 조직병리학에 의해 관찰된 명백한 PEG화 효과가 없었다. 독성 역학 데이터는 페그질라르기나제 노출이 연구 전반에 걸쳐 유지됨을 나타내었다. 결론적으로, 암컷의 NOAEL은 1.0 mg/kg이었다. 수컷의 경우, 상기 NOAEL은 0.3 mg/kg 및 mg/kg에서 고환의 미세한 변화를 기준으로 0.1 mg/kg이었다.
페그질라르기나제의 잠재적 독성 및 TK는 13주에 이어서 4주의 회복 기간 동안 0.1, 0.3 및 1.0 mg/kg의 용량으로 사이노몰구스 원숭이에게 매주 1회 정맥내 일시 주사한 후 평가하였다. 1.0 mg/kg에서 관찰된 임상 징후에는 체중 감소, 숱이 없는 모발(전신), 건조/변색된 피부(전신), 떨림, 식욕 부진, 묽은 변, 활동 감소, 운동실조, 근육 소모 및/또는 무뚝뚝한/구부정한 모습의 증가가 포함된다. 임상 병리학적 매개변수(응고, 성장 호르몬 및 소변 검사), ECG 및 안과 검사, 호흡수 및 혈압 평가에서 치료 관련 효과가 나타나지 않았다.
공급/보관 및 취급 방법
페그질라르기나제는 주사 용액으로 공급된다.
페그질라르기나제는 냉동 상태로 공급된다(-60°C 이하). 희석된 페그질라르기나제는 즉시 사용해야 한다. 즉시 사용이 불가능한 경우, 희석된 페그질라르기나제는 투여 중 2°C 내지 8°C(36°F 내지 46°F)에서 최대 8시간 동안 보관할 수 있다.
실시예
본 개시의 몇몇 예시적인 구현예를 설명하기 전에, 본 개시는 이하의 설명에서 제시된 구성 또는 공정 단계의 세부사항으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 개시는 다른 구현예들이 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.
하기의 실험적 개시에서, 다음의 약어가 적용된다: eq(등가물); M(몰); μM(마이크로몰); mM(밀리몰); N(정상); 몰(몰); mmol(밀리몰); μmol(마이크로몰); nmol(나노몰); g(그램); mg(밀리그램); μg(마이크로그램); L(리터); ml(밀리리터); μl(마이크로리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); μm(마이크로미터); nm(나노미터); MW(분자량); PBS(인산염 완충 식염수); min(분).
실시예 1: 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피(컬럼 1)
바람직한 구현예에서, 아르기나아제 1은 양이온 교환 컬럼(CEX)에서 포획되어 생성물 관련 불순물 및 공정 관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질(HCP), DNA 및 내독소를 감소시킨다(정제 공정에 대한 개요는 도 3을 참조). 특정 구현예에서, 아르기나아제 1 정제 공정의 제1 컬럼(컬럼 1) 크로마토그래피 단계는 SP 세파로오스 FF 수지 및 유입구 열 교환기를 사용한다. 컬럼 1은 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 pH 7.6에서 염이 없는 상태에서 아르기나아제 1에 결합하고 염 농도가 증가된 완충액으로 용출한다(도 4(a)). 일 구현예에서, 염은 NaCl이고 컬럼 1로부터의 용출은 실온에서 25 mM HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7.2-7.6을 사용하여 실시한다. 하지만, 컬럼 1에 NaCl 구배를 적용하는 것과 같은 대안적인 구현예들가 가능하다.
도 4(a)는 컬럼 1에서 아르기나아제 1의 대표적인 정제를 도시한다. 약 3리터의 정화된 대장균 용해물을 양이온 교환 컬럼에 로딩하였다. 280 nm에서의 높은 흡광도에서 알 수 있듯이, 많은 양의 단백질이 컬럼 상에 결합하지 않고 통과액 내에서 검출된다. 그런 다음, 상기 컬럼을 대략 2리터의 컬럼 세척 용액으로 세척하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출된 바와 같이, 아르기나아제 1이 풍부한 분획은 이후 0.1 M NaCl(최종 피크)로 용출하였다.
실시예 2: 코발트 치환
바람직한 구현예에서, 아르기나아제 1 천연 망간 조효소는 코발트로 대체된다. 코발트 치환(코발트 로딩이라고도 함) 동안, 일반적으로 아르기나아제 1에 존재하는 두 개의 망간 이온 중 하나 또는 둘 모두가 코발트 이온으로 대체된다. 다양한 온도가 코발트 치환 단계 뿐만 아니라 광범위한 농도의 코발트에 사용할 수 있다(표 2를 참조). 코발트 치환을 위한 배양 시간은 10분 정도로 짧을 수 있으며 50°C 초과의 온도에서 실시할 수 있다. 반대로 코발트 로딩 온도는 1°C 또는 5°C만큼 낮을 수 있으며 8시간을 초과하여 실시할 수 있다. 또한, 아르기나아제 1에 로딩된 코발트의 비율이 높을수록 고유 활성도가 높아진다.
컬럼 1(컬럼 1 풀이라고도 함)에서 용출된 아르기나아제 1은 코발트 치환 단계를 위해 실온에서 유지될 수 있다. 일 구현예에서, 염화코발트 모액(0.5 M CoCl2)은 최종 염화코발트 농도가 10 mM인 소정의 속도로 컬럼 1 풀에 첨가함으로써 50배 희석된다. 그런 다음, 코발트 치환을 20°C에서 2시간 동안 혼합한다. 다른 구현예에서, 아르기나아제 1 코발트 로딩은 실온에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안 10 mM CoCl2의 용액에서 실시한다.
코발트 로딩 단계의 개요는 표 3에서 볼 수 있다.
Co-아르기나아제 I 코발트 로딩
ID Co(mM) 온도(°C) 시간(분) 총 Co(μg/mg 아르기나아제) 총 Mn(μg/mg 아르기나아제) 고유 활성도(U/mg)
APO-아르기나아제 I* NA NA NA <0.025 0.008 24
APO 로딩 1* 0.1 5 15 0.3 ND 117
Coh-Arg I* 10 20 60 2 0.06 410
APO 로딩 2* 1 5 15 2.4 ND 395
APO 로딩 3* 10 20 15 2.8 ND 493
APO 로딩 4* 10 20 60 2.9 ND 489
APO 로딩 5* 10 37 15 2.8 ND NT
APO 로딩 6 10 53 15 2.6 ND NT
Co-Argl-PEG 10 53 15 3 ND 500
이론적 3.4
* 그래프로 나타냄.
실시예 3: 한외여과/정용여과 1(UF/DF 1)
UF/DF 1은 유리 코발트 이온을 제거하고 음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해 Co-아르기나아제 1을 용액으로 교환한다. UF/DF1 단계는 분자량 컷오프가 30 kDa인 막을 사용한다. 상기 단계의 중요한 기능은 음이온 교환 크로마토그래피 전에 유리 코발트의 수준을 줄이고 Co-아르기나아제 1 풀을 완충액 교환하는 것이다. 막을 세정액(0.5 N NaOH)으로 소독하고 물로 헹군다. 정규화된 투수성 시험(NWP)를 실시한 후, 생산에 사용하기 전에 평형을 유지한다. UF/DF 시스템이 평형화되면 Co-아르기나아제 1 풀은 25 mM HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7.6에 대해 3시간 동안 정용여과한 후, 50 mM 트리스, pH 8.4의 4 투석부피에 이른다. 정용여과 후, 상기 풀은 50 mM 트리스, pH 8.4에서 시스템 보류 부피의 2배를 사용하여 시스템에서 재순환되고 회수된다.
UF/DF1 막은 2 M NaCl 세척을 실시한 후 30분의 재순환과 함께 0.5 N NaOH를 사용하는 변성 세척 단계를 실시하여 세척한다. 시스템을 정제수로 세척하고 NWP 시험으로 세척 절차의 효과성을 평가한다. 막을 0.1 N NaOH에 보관할 수 있다.
대안적 구현예에서, 완충액의 1차 교환은 25 mM HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7.2-7.6으로 실시하고 2차 교환은 50 mM 트리스, pH 8.1-8.5로 실시한다.
실시예 4: 음이온 컬럼 크로마토그래피(컬럼 2)
아르기나아제 1 정제의 바람직한 구현예는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피("컬럼 2")인 다른 컬럼을 사용한다. 컬럼 2의 일 구현예는 Q 세파로오스 FF 수지이다. 상기 컬럼 2 단계의 한 기능은 UF/DF1 풀로부터 숙주 세포 DNA 및 내독소와 같은 공정 관련 불순물을 줄이는 것이다. 컬럼 2는 Co-아르기나아제 1이 통과하고 로딩 및 세척 단계 동안 컬럼 유출물 내에 수집되는 동안 상기 불순물을 결합한다. 일 구현예에서, 컬럼 2에 대한 음이온 교환 통액형 크로마토그래피는 Q 세파로오스 FF로 실시하고, 최대 40 g의 단백질/L 수지가 완충제 50 mM 트리스, pH 8.1-8.5를 사용하여 컬럼 상에 로딩된다.
방법의 다른 구현예에서, 제1 단백질 생성물은 음이온 교환 컬럼에 로딩되어 불순물을 포획하는 한편 아르기나아제 1은 통과액 내에서 회수된다. 도 4(b)는 음이온 교환 컬럼(컬럼 2)에 걸친 아르기나아제 1 정제의 대표적인 크로마토그램이다. 280 nm에서의 흡광도에서 볼 수 있듯이, 많은 양의 단백질이 통과액 내에서 검출된다. 불순물은 컬럼 2에서 포획되며 아르기나아제 1이 추가로 강화된 컬럼 2 풀(제2 단백질 생성물이라고도 함)로 용출되지 않는다.
실시예 5: 캡토 다중모드 컬럼 크로마토그래피(컬럼 3)
바람직한 구현예에서, 아르기나아제 정제 공정은 제3 컬럼 크로마토그래피 컬럼(컬럼 3)을 사용한다. 일 구현예에서, 컬럼 3은 캡토 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼 또는 대안적으로 크기 배제 컬럼이다. MMC를 사용하는 구현예들은 컬럼에서 아르기나아제 1을 포획하는 반면, 숙주 세포 단백질(HCP), DNA 및 내독소와 같은 공정 관련 불순물은 통과액 내에서 세척한다. 상기 구현예에서, Co-아르기나아제 1은 pH 8.4에서 염의 부재 하에 컬럼으로 포획한 다음, Co-아르기나아제 1은 증가된 염 농도의 완충액으로 용출할 수 있다. 캡코 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 대표적인 예는 도 4(c)에 도시되어 있다.
일 구현예에서, MMC 크로마토그래피(컬럼 3)는 최대 30 g의 단백질/L 수지를 로딩하기 위해 대략 15 컬럼 부피를 사용하고, 고염의 연속 용출을 50 mM 트리스, 250 mM NaCl, pH 8.1-8.5로 실시한다. 여러 구현예들에서, 음이온 교환 컬럼(컬럼 2)으로부터의 통과액을 pH 8.4의 캡토 MMC 컬럼에 로딩하고, 세척한 다음, 결합된 Co-아르기나아제 1을 50 mM 트로메타민, 250 mM 염화나트륨을 사용하여 용출한다.
실시예 6: 한외여과/정용여과 2(UF/DF 2)
UF/DF 2는 아르기나아제 1을 농축하고 단백질을 사전 PEG화된 중간체로 교환한다. UF/DF2 단계는 분자량 컷오프가 30 kDa인 막을 사용한다. 상기 단계의 중요한 기능은 PEG화 전에(또는 추가 여과 및 저장 전에) PEG화되지 않은 Co-아르기나아제 1 중간체의 컬럼 3 풀을 완충액 교환하는 것이다. 막을 세정액(0.5 N NaOH)으로 소독하고 물로 헹군다. 일단 UF/DF 시스템이 평형화되면, 컬럼 3 풀(제3 단백질 생성물이라고도 함)을 5 투석부피에 대해 20 mM 인산나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5%(w/v) 글리세롤, pH 7.4에 대해 정용여과한다. 컬럼 3 풀 농도가 8 g/l 미만인 경우, 풀을 8 g/L로 추가로 농축한다. 정용여과(및 필요한 경우, 농축) 후, 상기 풀은 20 mM 인산나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5%(w/v) 글리세롤, pH 7.4를 사용하여 시스템의 보류 부피의 2배를 사용하여 시스템으로부터 재순환되고 회수된다. 회수 후, 정용여과 용액으로 2단계 희석을 사용할 수 있다. 제1 희석의 목표 농도는 6 g/L이고 제2 단계의 농도 목표는 5 g/L이다. 목표에 도달하기 위해 두 단계를 사용할 수 있다. 제1 희석 후 농도가 목표 범위 내에 있는 경우, 제2 단계가 필요하지 않을 수 있다.
실시예 7: 중간체 여과 및 UF/DF 3
PEG화 반응 전에, 코발트 함유 아르기나아제 1은 장기 냉동을 포함하여 장기 보관할 수 있다. 중간체 Co-아르기나아제는 0.2 μm 필터를 통해 여과하고 장기 보관을 위해 동결할 수 있다.
UF/DF3 단계는 분자량 컷오프가 30 kDa인 막을 사용한다. 상기 단계의 한 기능은 완충액 교환하고 여과된 UF/DF2 풀(신선 또는 해동)을 농축하여 PEG화에 최적인 조건을 제공하는 것이다. 동결된 Co-아르기나아제 1 중간체를 출발 물질로서 사용하는 경우, 최대 36시간 동안 실온에서 해동하게 된다. 막을 세정액(0.5 N NaOH)으로 소독하고 물로 헹군다. 정규화된 투수성 시험(NWP)를 실시한 후, 생산에 사용하기 전에 평형을 유지한다. 일단 UF/DF 시스템이 평형화되면, Co-아르기나아제 1 중간체는 5 투석부피에 대해 0.1 M 인산나트륨, pH 8.4에 대해 정용여과한다. 정용여과 후, 상기 풀은 0.1 mM 인산나트륨, pH 8.4에서 시스템의 보류 부피의 2배를 사용하여 시스템에서 농축, 재순환 및 회수된다. 회수 후, 정용여과 용액으로 2단계 희석을 사용한다. 제1 희석의 목표 농도는 11 g/L이고 제2 단계의 농도 목표는 10 g/L이다. 2단계는 목표 달성을 용이하게 하기 위해 사용하는 단계이다. 제1 희석 후 농도가 목표 범위 내에 있는 경우, 제2 단계가 필요하지 않을 수 있다.
UF/DF 2 및 UF/DF 3 단계와 관련하여, 제1 완충액 교환은 20 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, 1.5% 글리세롤, pH 7.4, 5DV 이상으로 실시하고 단백질을 약 5.0 mg/mL로 농축할 수 있다. 제2 완충액 교환은 0.1 M 인산나트륨, pH 8.1-8.5로 실시하고, 단백질을 약 10.0 mg/mL로 농축할 수 있다(원료의약품의 PEG화를 위한 준비).
실시예 8: 아르기나아제 1의 PEG화
PEG화는 PEG(폴리에틸렌 글리콜)를 Co-아르기나아제 1(원료의약품) 분자에 공유 부착한다(PEG화 단계의 대표적인 구현예에 대하여 표 4를 참조). 일 구현예에서, PEG화 반응은 5000 Da PEG 분자를 Co-아르기나아제 1에 공유 결합한다. 대안적인 구현예들에서, PEG화는 아르기나아제 1의 코발트 치환 전에 또는 생산 공정의 다른 지점에서 실시할 수 있다. 일 구현예에서, PEG 접합 반응은 Co-아르기나아제 1 상에서 입체적으로 이용 가능한 리신과 반응하는 고체 또는 액체 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르를 사용할 수 있다. 생성된 PEG화된 단백질(Co-rhARG1-PEG)의 분자량은 약 280 kDa이다. PEG화된 풀은 여과되고 UF/DF4 작업 시까지 2-8°C에서 보관할 수 있다.
Co-rhARG1 원료의약품을 위한 PEG화 공정
단계 공정 작업
1 중간체 해동(가능한 경우)
↓
2 한외여과/정용여과
↓
3 고체 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르(MW 5000)의 첨가 및 pH 8.4에서 15분을 초과하여 배양
↓
4 한외여과/정용여과
↓
5 (Co-rhARG1-PEG) 원료의약품의 여과, 폴리카보네이트 병에 주입, -60ºC 이하에서 동결
일 구현예에서, 고체 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르(MW 5000)를 19.3x 몰 과량 및 배양 0.5-4.0시간, pH 8.4에서 아르기나아제 1 함유 용액에 첨가할 수 있다.
PEG화 후, 한외여과/정용여과는 결합되지 않은 PEG를 제거하고, 아르기나아제 1을 제제 완충액으로 교환하며, 제제화 단계를 위해 아르기나아제 1을 농축한다. 상기 UF/DF4 단계는 분자량 컷오프가 100 kDa인 막을 사용한다. 상기 단계의 한 기능은 유리 PEG를 제거하면서 PEG 풀을 최종 제제로 완충액 교환하는 것이다. 상기 목적을 위해 사용되는 막을 세정액(0.5 N NaOH)으로 소독하고 물로 헹군다. 일단 UF/DF 시스템이 평형화되면, PEG 풀을 10 투석부피에 대해 5 mM 인산나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5%(w/v) 글리세롤, pH 7.4에 대해 정용여과한다. 정용여과 후, 상기 풀은 압력을 가해 시스템에서 회수한다. 회수된 UF/DF4 풀은 최종 여과 및 충전 단계 전에 5 mM 인산칼륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5%(w/v) 글리세롤, pH 7.4로 5 g/L로 희석한다. 대안적 구현예에서, 아르기나아제 1은 20 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, 1.5% 글리세롤, pH 7.4로 교환하고, 약 5.0 mg/mL의 단백질 농도로 조정한다.
일부 구현예들에서, 제제 완충액 5 mM 인산칼륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5% 글리세롤, pH 7.4는 인산나트륨 완충액과 같은 다른 완충액과 비교하여 아르기나아제 1의 저장시 안정성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 하나 이상의 구현예들에서, 완충액 5 mM 인산칼륨은 1 mM K2HPO4 및 4 mM KH2PO4를 포함한다.
원료의약품(Co-rhARG1-PEG)은 활성화된 PEG 분자를 리신의 -아미노기 및 N 말단 아미노산의 아민기에 접합시켜 만든 PEG화된 코발트 치환 인간 아르기나아제 1이다. 염료 기반 형광 분석은 오르토 프탈디알데히드를 사용하여 단백질당 PEG 분자의 몰비를 결정하는 데 사용한다. 오르토 프탈디알데히드는 티올의 존재 하에, 특히 1차 아민과 반응하여 형광 유도체를 형성한다. 형광 신호를 측정하면 단백질 분자 내에 존재하는 반응성 유리 아민을 정량화할 수 있다. 정량화는 N-아세틸 리신을 사용하는 표준 곡선을 기반으로 한다. 단백질당 PEG화된 아민의 수는 비접합된 Co-아르기나아제 1에 존재하는 유리 아민의 이론적인 수에서 PEG화된 원료의약품의 형광 분석에 의해 측정된 유리 아민의 수를 빼서 결정할 수 있다. 리신 잔기에 N 말단 아미노산을 더한 이론적 유리 아민의 수는 25이다. 원료의약품 내 유리 비접합 PEG는 굴절률에 의한 검출과 함께 SEC-HPLC에 의해 측정한다. 결과는 유리 PEG의 μg/mL로 표시할 수 있다(표 5를 참조).
SEC-HPLC 방법 매개변수 유리 PEG Co-rhARG1-PEG 원료의약품
설명 방법 매개변수
컬럼 TOSOH G3000PWxl, 7.8 x 300 mm, 7 μm 컬럼
검출기 굴절률 검출기
주입 부피 10 μL
유속 0.8 mL/분
자동샘플러 온도 5°C
컬럼 온도 20°C
이동상 A 1X PBS
중지 시간 20분
실시예 9: 약물 중간체의 CIEX-HPLC 특성화
대장균 발효 중에, 다양한 아르기나아제 1 전하 변이체를 생성할 수 있다. 전하 변이체는 TSK 겔 양이온 교환 컬럼을 사용하는 양이온 교환 HPLC(CIEX-HPLC) 방법으로 분석할 수 있다. 상기 유형의 분석은 20 mM MES, pH 6.0의 이동상(A) 및 20 mM MES, 500 mM NaCl pH 6.0의 이동상 B; mL/분의 유속; 40.0분의 실행 시간; 컬럼 온도 22°C; 및 표 6에 따른 이동상 구배를 사용한다.
CIEX-HPLC 전하 변이체 Co-아르기나아제 1 중간체 구배 프로그램
분 % 이동상 B
0.00 0
1.95 0
17.00 30
23.00 60
25.00 100
30.00 100
30.10 0
40.00 0
샘플은 분석 전에 제제 완충액으로 희석한다. 결과는 전하 변이체 비율 분포로 설명된다. 대표적인 크로마토그램이 도 5(a)에 도시되며, Co 아르기나아제 1 중간체에 대해 일반적으로 6개의 주요 피크가 관찰된다.
실시예 10: 원료 의약품의 iCIEF 특성화
약물 중간체는 PEG화되어 원료의약품을 형성한다. 약물 중간체의 PEG화는 약물 중간체 CIEX-HPLC 방법의 사용을 본 발명의 일부로 개발된 다른 구현예들보다 덜 적합하게 만든다. 음이온 IEX-HPLC를 평가하였지만, 적절한 분리를 제공하지 않았다. 대안적으로, 원료의약품의 전하 변이체를 분석하기 위해 이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF) 방법이 개발되었다.
이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF)의 분석 물질은 인가된 전기장의 존재 하에 히드로늄 이온(양극액) 및 히드록실 이온(음극액)의 역이동에 의해 모세관을 통해 이동한다. 샘플은 담체의 양쪽성 전해질 및 pI 표지를 포함하는 매트릭스에서 희석된다. 단백질의 분리는 두 가지 집속 단계로 발생한다. 초기 사전 집속 단계는 pH 구배를 설정한다. 전하 변이체는 제2의 더 높은 전압 집속 단계에서 더 선명하게 초점이 맞춰지고 분리된다. 전체 모세관의 UV 광 흡수 이미지는 30초마다 및 집속 단계가 완료된 후 디지털 방식으로 포획된다.
결과는 전하 변이체 비율 분포로 표시할 수 있다. 대표적인 전기영동도가 도 5(b)에 도시되고, 원료의약품에 대해 9개의 주요 피크가 관찰된다. 피크 3 및 4는 상기 피크 사이의 분해능이 가변적이기 때문에 함께 통합된다. 상기 피크의 상대 면적은 표 7에 제시된다:
Co-rhARG1-PEG의 전하 변이체의 iCIEF 특성화
명칭 pI 면적 %면적
1 표지 4.220
2 피크 1 6.111 130195 12
3 피크 2 6.268 245568 22
6 피크 3+4 6.360 255343 23
7 피크 5 6.501 226011 20
8 피크 6 6.604 156066 14
9 피크 7 6.708 71805 6
10 피크 8 6.794 27780 2
11 피크 9 6.866 8847 1
12 표지 7.650
실시예 11: Co-아르기나아제 1 중간체 및 원료의약품의 효소 활성
효소 분석을 사용하여 활성을 측정하고 Co-아르기나아제 1 중간체 및 Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 정체를 확립하며, 아르기닌에서 오르니틴으로의 전환을 모니터링한다. 반응 혼합물은 0-2 mM 범위에 걸쳐 7가지 상이한 아르기닌 기질 농도에서 시험된 하나의 효소 농도를 갖는다. 반응은 37°C에서 고정된 시간 동안 실시한다. 임의의 주어진 기질 농도에서 기질 소모량이 10% 미만이 되도록 반응 시간을 설정하였다. 반응이 중단되고 생성물인 오르니틴이 유도체화되며 역상 UPLC에 의해 정량화된다.
반응 속도 대 기질 농도 플롯의 예는 대표적인 Kcat, Km, 및 kcat/Km 값과 함께 도 8(a)(Co-아르기나아제 1 중간체) 및 도 8(b)(Co-rhARG1-PEG 원료의약품)에 도시되어 있다.
실시예 12: 코발트 및 망간의 분석
코발트, 잔류 망간 및 유리 코발트는 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(ICP-MS)를 사용하여 측정하였다. 샘플은 1% 질산 및 6% 과산화수소를 사용하여 전자파로 분해함으로써 매트릭스에서 모든 금속을 방출하였다. 생성된 분해를 ICP-MS로 분석하였다. 코발트 및 잔류 망간 샘플은 임의의 샘플 처리 없이 분해하였다. 투과물에서 효소를 분리하기 위해 한외여과된 투과물 샘플에서 유리 코발트를 측정하여 효소와 연관되지 않은 코발트를 측정하였다. 표 8은 Co-아르기나아제 1 중간체의 일부 특성을 요약한 것이다.
일반적 Co-아르기나아제 1 중간체의 특성
시험 목적 분석 원리 일반 값
CIEX HPLC 전하 HPLC 피크 1: 0-4%
피크 2: 2-8%
피크 3: 10-20%
피크 4: 16-30%
피크 5: 40-52%
피크 6: 4-15%
SDS-PAGE(환원) 순도 전하 이동성 ≥95%
Kmkcat 활성 HPLC 0.15-0.24 mM
200-380/초
고유 활성도 활성 HPLC 320-600 U/mg
코발트 활성 ICP-MS 7-13 μg/mL
유리 코발트 안정성 ICP-MS ≤0.05 μg/mL
잔류 망간 불순물, 활성 ICP-MS ≤1 μg/mL
pH 산성 pH 7.0-7.8
전형적인 Co-rhARG1-PEG 원료의약품의 특성
시험 목적 분석 원리 일반 값
전하 이질성 품질 이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF) 피크 1: <20%
피크 2: <30%
피크 3 및 피크 4: 10-30%
피크 5: 15-30%
피크 6: 10-25%
피크 7: <25%
피크 8: <15%
피크 9: <8%
Km
kcat 		활성 HPLC 0.15-0.24 mM
200-380/초
고유 활성도 활성 HPLC 320-600 U/mg
총 코발트 활성 ICP-MS 7-13 μg/mL
잔류 망간 활성 ICP-MS <1 μg/mL
유리 코발트 안정성 ICP-MS ≤0.05 μg/mL
PEG: 단백질 몰비 PEG화 HPLC 8-16몰/몰
유리 PEG 불순물 HPLC <500 μg/mL
pH* 산성 pH 7.0-7.8
실시예 13: Co-아르기나아제 1 중간체 번역 후 변형
Co-아르기나아제 1 중간체 번역 후 변형은 펩티드 매핑, LC-MS 원형 질량 분석, 및 역상 LC/MS와 같은 다양한 기술을 사용하여 검출하였다. 확인된 모든 변형의 요약은 표 10에 나열되어 있다.
Co-아르기나아제 1 중간체의 확인된 변형
변형 검출 방법
N 말단 글루코노일화/글루코노일화 펩티드 매핑(Glu-C 분해) RP-HPLC-MS/MS 및 LC-MS
RP-UPLC/MS
포스포글루코노일화 RP-UPLC/MS
디-글루코노일화 RP-UPLC/MS
N 말단 메티오닌-절단 펩티드 매핑(Glu-C 분해) RP-HPLC-MS/MS 및 LC-MS
아세틸화 펩티드 매핑(Glu-C 분해) RP-HPLC-MS/MS 및 LC-MS
N 탈아미드화/숙신이미드 형성 펩티드 매핑(Glu-C 분해) RP-HPLC-MS/MS 및 LC-MS
특성화에 따라, Co-아르기나아제 1 중간체 변형이 존재할 때 주요 변형은 N 말단 글루코노일화(펩티드 매핑에 의해 확인됨)인 것으로 확인되었다. 아르기나아제 1 변형된 종의 추가적인 특성화는 3개의 시점(발효, 컬럼 1 이후 및 컬럼 3의 약물 중간체)에서 채취한 샘플을 시험함으로써 실시하였다. 분석 방법은 일반적으로 아르기나아제가 해리되고 단량체로서 분석되는 것을 요구한다. 아르기나아제 1 N 말단 글루코노일화(단량체로서 분석)는 일반적으로 10.8 내지 13.9%이었다. 다른 변형은 3개 시점의 샘플에 걸쳐 N 말단 포스포글루코노일화 단량체(4.3 내지 6.5%) 및 디-글루코노일화 단량체(0.7 내지 1.2%)였다. 표준화된 참조 생산 실행에서 사용된 샘플에서, 비변형 Co-아르기나아제 1(단량체) 및 Co-아르기나아제 1 중간체의 수준은 각각 80.6% 내지 83.6%로 유사하였다. 정제 공정에 사용된 표준 조건(즉, 컬럼 1에 염 구배가 적용되지 않음)은 Co-아르기나아제 1 중간체(81.1 내지 83.6%)로 운반되는 비변형 단량체의 상대적 수준을 적당히 변경하였다.
Co-아르기나아제 1 특성화 LC/MS 결과
샘플 ID 아르기나아제 1 단량체(비변형) (%) 글루코노일화 아르기나아제 1 단량체(%) 포스포글루코노일화 아르기나아제 1 단량체(%) 디-글루코노일화 아르기나아제 1 단량체(%)
표준화된 참조 80.6 13.9 4.3 1.1
발효 81.1 12.4 6.5 1.2
컬럼 후 81.4 12.2 5.4 0.9
원료 의약품 83.6 10.8 4.9 0.7
실시예 14: 컬럼 1 조건의 변화
대안적인 구현예들에서, NaCl 구배를 칼럼 1에 적용할 수 있다. 컬럼 1에 대한 NaCl 구배를 사용하면, 다른 아르기나아제 1 변이체를 분리하여 바람직한 구현예들에 대해 선택할 수 있다. 도 7은 컬럼 1에 적용한 0.0-0.2 M NaCl의 구배를 도시한다. 컬럼 1 용출로부터 수집한 개별 분획을 SE-HPLC, CEX-HPLC 및 RP-HPLC로 분석하였다.
아르기나아제 1 전하 변이체 피크 수를 1에서 6으로 할당하는 분석적 CEX-HPLC 방법을 사용하였다(도 5(c)를 참조). 피크 수는 다양한 글루코노일화 상태 뿐만 아니라 글루코노일화되지 않은 아르기나아제 1과 일치한다. 상기 분석은 NaCl 구배로부터 용출된 아르기나아제 1의 6개 피크를 나타내었다. 아르기나아제 1 변이체는 컬럼 1 용출 피크에서 초기에 용출된 피크 수 1, 2 및 3을 할당하였다. 용출된 아르기나아제 1 및 피크 5(비변형 아르기나아제 1)의 최고 농도 부분을 통해 피크 4가 용출되었고, 나중에 용출 피크에서 피크 6이 용출되었다. 따라서, 0.0-0.2 M NaCl은 아르기나아제 1의 상이한 전하 변이체를 성공적으로 분리하였다.
0-0.5 M NaCl과 같은 컬럼 1 용출에 대체 NaCl 구배를 사용할 수 있다. NaCl 구배의 사용은 아르기나아제 1을 6개의 별개의 피크로 재현 가능하게 분리하여 원료의약품 또는 의약품의 제조에서 추가 처리를 위한 특정 아르기나아제 1 변이체의 선택을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
제1 단백질 생성물(및 아르기나아제 1 변이체)에 대한 추가 분석 또한 LC/MS로 분석하였다(도 6을 참조). 상기 LC/MS 분석은 대장균에서 아르기나아제 1의 생성에 의해 생성된 특정 유형의 글루코닐화를 식별한다. 상기 LC/MS 분석은 비변형 아르기나아제 1, 글루코닐화 아르기나아제 1, 포스포글루코닐화 아르기나아제 1, 및 2배(2X)의 글루코닐화 아르기나아제 1을 식별한다.
표 12는 0-0.2 M NaCl 구배(및 상응하는 분획화된 CEX 피크 1-6)의 적용이 글루코닐화 수준이 상이한 분획을 생성함을 나타낸다. 피크 수 1-6의 각각을 LC/MS로 분석하였다. 데이터는 주요 피크(피크 5)가 높은 고유 활성도 뿐만 아니라 높은 비율의 글루코닐화되지 않은 아르기나아제 1을 갖는다는 것을 보여준다. 원하는 특성에 따라 상이한 분획(피크 1-6에 해당)을 추가 처리를 위해 수집할 수 있다.
약물 중간체 피크 1-6의 LC/MS 분석.
분획 농도(mg/mL) MS에 의한 % 글루코닐화되지 않은 아르기나아제 1 단량체 질량 고유 활성도(U/mg)
피크 수 1 0.2 28.4 118
피크 수 2 0.9 37.8 286
피크 수 3 3.4 56.2 298
피크 수 4 6.5 68.2 349
피크 수 5 12.0 96.6 329
피크 수 6 2.2 97.1 198
컬럼 1의 다양한 NaCl 농도 외에도, 컬럼 1에 상이한 양의 단백질을 로딩하여 글루코닐화되지 않은 아르기나아제 1 종의 정제를 향상시킬 수 있다.
컬럼 1의 부하율을 변경하고 컬럼 1에 걸쳐 NaCl 구배를 사용하면 글루코닐화된 아르기나아제 1 종을 생산하는 대장균 발효 중에 경험하는 예상치 못한 교란을 보상할 수 있다.
실시예 15: 발효 조건의 변화
아르기나아제 1의 생산을 위한 발효 조건의 강건성을 결정하기 위해 실험을 실시하였다. 표 13은 차선의 pH 7.6에서의 대장균의 발효가 바람직한 pH 7.2 발효에서보다 더 많은 글루코닐화를 생성한다는 것을 보여준다. 용기 B1, B8 및 B12는 최적의 발효 조건(pH 7.2, 용존 산소 30%, 배지 공급 속도 0.06 mL/분)을 사용하였다. 용기 B3은 pH 7.6(최적의 조건보다 높은 pH)에서 대장균을 발현하는 아르기나아제 1을 발효시키는 데 사용하였다. pH의 증가는 더 높은 비율의 포스포-글루코닐화된 부가물을 결과로서 야기하였다(대조군 실행에서 23% 대 10-12%).
발효 용기에서 관찰된 글루코닐화된 아르기나아제 1
용기 천연 Arg 1 글루코닐화 포스포-글루코닐화 2X
글루코닐화		 글루코닐화 및 포스포-글루코닐화
B1 88.5 6.2 5.3 - --
B8 89.2 6.3 4.6 -- --
B12 89.0 5.9 5.1 -- --
평균 88.9 6.1 5.0 -- --
B3 76.7 15.0 5.8 1.8 0.6
실시예 16: 컬럼 1에 대한 부하율의 변화
상이한 양의 대장균 세포 용해물을 컬럼 1에 적용하여 아르기나아제 1 전하 변이체의 정제 뿐만 아니라 수율 및 순도에 미치는 영향을 결정하였다. 15-60 g의 단백질/L 수지의 부하율은 CIEX 전하 종 프로파일에서의 이동을 나타내는 다양한 조건 하에서 사용하였다(표 14). 부하율이 높을수록 글루코닐화된 변이체가 더 잘 분리되었다(하지만, 수집된 분획에 따라 수율이 상쇄될 수 있음). 예를 들어, 부하율이 20 mg 단백질/mL 수지인 피크 5는 45.8%인 반면, 부하율이 40 mg/mL인 경우 50.0%로 증가하였다.
단백질 생성물 1에 대한 컬럼 1 부하율의 영향
샘플 피크 면적(%) 단계수율(%)
40 mg/mL LF 1 1.2 95.1
2 1.6
3 11.6
4 21.2
5 50.0
6 15.5
30 mg/mL LF 1 1.1 101.0
2 4.1
3 14.0
4 21.1
5 46.2
6 13.5
20 mg/mL LF 1 1.6 93.2
2 4.5
3 14.3
4 20.9
5 45.8
6 12.8
실시예 17: 1/2상 임상 조사
본 발명의 방법에 의해 생산된 의약품은 아르기나아제 1 결핍증 및 아르기닌혈증에서 Co-rhARG1-PEG의 투여를 평가하기 위한 1/2상, 공개 연구에서 사용하였다. 상기 연구의 1차 종료 시점은 아르기닌혈증/아르기나아제 1 결핍증이 있는 대상체에서 Co-rhARG1-PEG의 정맥내(IV) 투여의 안전성과 내약성을 평가하는 것이었다. 2차 종료 시점은: 혈장 아르기닌 농도에 대한 IV 투여된 시험 약물의 효과를 결정하고; 혈장 구아니디노 화합물(GC)에 대한 IV 투여된 시험 약물의 효과를 결정하며; IV 투여된 시험 약물의 약동학(PK) 프로파일을 특성화하는 것이었다. 다른 종료 시점들은: 6분 보행 시험(6MWT), 대운동 기능 측정(GMFM) 파트 D 및 파트 E, 적응 행동 평가 시스템(ABAS)과 같은 임상적 이점을 포착할 때 임상 결과 사정에 대한 평가를 포함한다.
1/2상 데이터는 Co-rhARG1-PEG가 혈장 아르기닌을 지속적으로 낮추는 데 매우 효과적임을 입증하였다. 또한, 환자에게서 혈장 아르기닌 수준의 조절은 이동성 및 적응 행동에서 임상적으로 의미있는 반응을 동반하였다. 치료는 일반적으로 내약성이 좋았다. 과민 반응은 드물었고 표준 조치로 관리할 수 있었다.
연구를 위해 공급된 Co-rhARG1-PEG 의약품은 1 mg/mL 농도의 제제화된 의약품 5 mL를 함유하는 10 mL의 일회용 유리 바이알 내 액체 제제였다. 약물은 50 mM NaCl, 1 mM K2HPO4, 4 mM KH2PO4 및 1.5% w/v 글리세롤에서 제제화되었다.
1/2상 연구는 두 부분: 파트 1(단일 상승 용량 증량) 및 파트 2(반복 투여)로 실시하였다. 상기 1/2상 시험 101A 및 102A 공개 연장 시험에 대한 연구 설계는 하기의 그래픽으로 도시되어 있다.
Figure pct00007
파트 1에서는 환자에게 약물을 소개하고 안전성에 중점을 두었다. 파트 2는 일관된 용량으로 환자를 안정시키고 임상 효과의 표지를 찾기 위해 설계하였다. 각 파트는 아르기닌 수준의 기준선 평가가 선행되었다. 파트 1에 참여한 모든 환자는 지속적인 투여에 적격인 경우 파트 2에서 아르기나아제 1 투여를 계속할 수 있었다.
연구에서, 각 환자는 각각의 연속 용량 수준 사이에 2주의 휴약/관찰 기간을 통해 파트 1에서 증량할 수 있는 시작 용량을 투여받았다. 파트 1의 각 환자에 대한 가능한 용량은 혈장 아르기닌을 최적화하는 데 필요한 만큼 2주 간격으로 0.015, 0.03, 0.06, 0.10, 0.15, 0.20 및 0.30 mg/kg이었다. 임의의 특정 용량을 반복하거나, 또는 이전 용량 수준에서 나온 데이터가 특정 기준을 충족하는 경우 지정된 용량 수준들 사이에서 용량을 증감할 수 있다. 예를 들어, 하기의 용량 증량 중단 기준 중 하나 이상이 충족되면 용량 증량을 중단할 수 있다: 환자의 혈장 아르기닌 수준이 해당 기간 동안 수집된 모든 샘플에 대해 투여 후 적어도 40(±2) 연속 시간 동안 40 μM 미만인 경우, 또는 해당 기간 또는 환자의 혈장 아르기닌 수준이 해당 기간 동안 수집된 모든 샘플에 대해 투여 후 적어도 112(±2) 연속 시간 동안 평균 115 μM 미만인 경우.
상기 사건들 중 그 어느 것도 발생하지 않은 경우, 임의의 용량 증량 중단 기준에 도달하거나 상기 환자가 0.30 mg/kg의 프로토콜에 따라 최고 용량을 투여받을 때까지 2주마다 다음의 더 높은 용량 수준의 아르기나아제 1로 증량할 수 있다. 궁극적으로, 치료 목적을 위해 0.30 mg/kg을 초과하여 용량을 증가시킬 수도 있다.
파트 2는 파트 1을 완료한 환자에 대한 반복 투여 기간이었다. 파트 2에서는 반복 용량 투여 기간 동안 150-200 μM 미만으로 사전 용량을 유지하는 것을 강조하면서 약 40 μM 내지 약 115 μM 범위의 혈장 아르기닌을 안전하게 최적화하는 각 환자에 대한 용량 및 요법을 찾았다. 데이터가 반복 용량 투여 동안 용량-반응 결과를 더 잘 조사할 수 있는 가능성을 나타내는 경우 파트 2에서는 여러 용량 수준을 사용할 수 있었다. 치료 중 아르기닌 수준은 또한 치료 전에 결정된 아르기닌 수준과 비교하였다.
101A의 파트 2를 완료한 환자는 장기 공개 연장 시험(OLE, NCT03378531)에 참여할 수 있었다. 3년의 OLE 기간의 나머지 기간 동안 피하 투여로 전환할 수 있는 선택사항이 포함된 24주간의 IV 투여로 치료하였다.
결과
평균 Cmax 및 평균 AUC0-168의 증가는 모든 환자에게서 용량 비례하는 것으로 나타났다. 평균(± SD) Cmax는 Co-rhARG1-PEG 용량 수준인 0.015, 0.03, 0.06, 0.1 및 0.2 mg/kg 각각에 대해 0.428 ± 0.0915, 0.723 ± 0.247, 1.73 ± 0.538, 2.27 ± 0.238 및 6.13(N=1) μg/mL이었다. ADA 양성 대 ADA 음성 환자의 평균 Cmax에 약간의 항약물 항체(ADA)의 영향이 있었다(도 9).
AUC의 변화(AUC0-168, AUC0-∞)는 0.06 및 0.1 mg/kg(입수 가능한 데이터를 포함) 사이에 눈에 띄는 변화가 없다는 점에 주목하면서 연구된 용량 범위에 걸쳐 용량 비례하는 것으로 나타났다. 평균 청소율(CL) 추정치는 모든 환자에게서 0.789 내지 1.57 mL/hr/kg, ADA 음성 환자에게서 0.776 내지 1.33 mL/hr/kg의 범위였다. 평균 분포 부피(Vss) 추정치는 모든 환자에게서 35.3 내지 52.1 mL/kg, ADA 음성 환자에게서 32.8 내지 52.1 mL/kg의 범위였다.
연구의 파트 1은 관찰된 PD(아르기닌) 반응을 사용하여 파트 2의 각 환자에 대한 최적(개별) 시작 용량을 선택하는 데 도움이 되었다. 파트 2의 1주차에, 평가된 용량 범위에 걸쳐 Co-rhARG1-PEG의 용량을 증량한 모든 환자에게서 평균 순환 약물 농도가 증가하는 경향이 있었다. 파트 2에서 Co-rhARG1-PEG의 제1 투여 후, 평균 Cmax의 증가는 모든 환자에게서 용량에 비례하는 것으로 나타났다. 평균(± SD) Cmax는 Co-rhARG1-PEG 용량 수준인 0.015, 0.03, 0.04, 0.06, 0.09, 0.1 및 0.12 mg/kg 각각에 대해 0.292(N=1), 0.395(N=1), 1.01±0.221, 1.75±0.391, 1.99(N=1), 2.34(N=1) 및 2.87±0.626 μg/mL이었다.
파트 2, 8주에서, 모든 환자의 평균 순환 약물 농도는 일반적으로 Co-rhARG1-PEG의 용량을 증량함에 따라 증가하였다. 8주차에 입수 가능한 PK 농도에서 주목할만한 ADA 영향은 없었다. 데이터의 결과로서, 상기 시점에서 대부분의(13/14) 환자가 정상 상태를 달성하는 것으로 가정하였다. Co-rhARG1-PEG의 8차 QW 용량 후, 평균 Cmax 및 AUC0-168의 증가는 모든 환자에게서 용량 비례하는 것으로 나타났다.
약동학 데이터 외에도, 약력학(아르기닌) 데이터를 수집하였다(도 10). 아르기나아제 1 결핍증이 있는 환자는 파트 2에서 QW IV 용량의 Co-rhARG1-PEG를 투여받았고, 시작 용량은 관찰된 PD(아르기닌) 반응을 기반으로 파트 1에서 선택하였다. Co-rhARG1-PEG의 제1 QW IV 용량 후, 순환 아르기닌 수준, 특히 0.04 mg/kg 이상의 Co-rhARG1-PEG 용량에서 현저한 감소가 있었다. 여러 경우에, 개별 아르기닌 농도가 40 μM 미만으로 떨어졌다. 또한, 초기 아르기닌 수준으로의 회복은 0.04 mg/kg 이상의 용량 및 제2 QW(매주) Co-rhARG1-PEG 용량 투여 직전에 대부분의 환자에게서 불완전하게 나타났다.
전반적으로, Co-rhARG1-PEG에 대한 노출은 일반적으로 증가하였으며 용량을 증량함에 따라 아르기닌 억제가 증가하였다. 파트 1에서는 개별화된 용량 최적화를 실시함으로써 파트 2의 1주 및 8주에 용량 수준당 다양한 환자 수에 대한 일련의 용량 범위를 적용하였다.
실시예 18: 피하 투여
실시예 17의 1/2상 연구의 파트 2를 완료한 후, 일부 환자들은 Co-rhARG1-PEG의 IV 투여에서 피하 투여로 전환하였다. 놀랍게도, Co-rhARG1-PEG의 피하 투여는 IV 투여보다 우수한 것으로 보이는 약력학적 프로파일을 수득하였다. 또한 예기치 않게도, IV 투여와 동일한 제제가 Co-rhARG1-10 PEG의 피하 투여에 성공적으로 사용되었다.
Co-rhARG1-PEG의 피하 투여는 IV 투여보다 더 긴 혈장 아르기닌 농도에 대한 바람직한(건강한) 표적 범위 내에서 환자 아르기닌 수준을 유지하였다(도 11). 환자에게서 선호되는 최적화된 혈장 아르기닌 농도는 약 40 μM 내지 약 115 μM 범위(반복 용량 투여 중)이며, 투여 전 150-200 μM 미만으로 수준을 유지하는 것을 강조하였다. 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, Co-rhARG1-PEG의 피하 투여는 결과적으로 아르기닌 농도가 40 μM의 더 낮은 수준을 상회하고 115 μM의 더 높은 수준을 하회하는 것으로 나타난다. 놀랍게도, 피하 투여는 전적으로 바람직한 범위에 있는 아르기닌 농도를 수득하였다. 이는 환자가 다른 주간 Co-rhARG1-PEG 용량을 투여 받을 때까지 적절한 혈장 범위의 아르기닌 농도를 유지할 것임을 의미한다.
실시예 19: 1/2상 임상 연구 및 공개 연장 시험의 약력학 및 임상 반응
16명의 환자(소아 11명 및 성인 5명)가 101A 파트 1에 등록되었고 그 중 15명의 환자가 101A 파트 2에 참여하였다. 2명의 환자는 개인적인 이유로 시험에서 탈퇴하였다(1명의 환자는 파트 1 용량 3 이후, 1명의 환자는 파트 2 용량 3 이후). 101A 파트 2를 완료한 14명의 환자 모두가 OLE 시험에 참여하였다.
환자에 대한 기준선 특성은 표 15에 제시되어 있다.
기준선 특성들
연령, 년, 중간값(범위) 15(5-31)
여성, n(%) 11(69)
아르기닌, μM, 중간값(범위) 389(238-566)
암모니아, μM, 중간값(범위) 38(9-77)
ALT(U/L), 중간값(범위) 34(15-171)
ARG1 변이, n(%)
동형접합체
복합이형접합체		 11(68.8)
5(31.2)
혈장 아르기닌 및 구아니디노 화합물 수준을 분석한 결과, 혈장 아르기닌 수준의 현저하고 지속적인 감소가 발견되었다(도 12(a)에서는 페그질라르기나제 20회 용량 후 기준선에서 274 μM의 중간값 감소로 입증되었다.) 기준선에서 용량 1, 용량 8 및 OLE로의 혈장 아르기닌 감소가 통계적으로 유의적이었다(p<0.001). 혈장 아르기닌 감소는 혈장 구아니디노 화합물(GC) 수준의 감소를 동반하였다. 도 12(b)는 기준선에서의 구아니디노아세트산(GAA), N-α-아세틸-L-아르기닌(NAA), α-케토-δ-구아니디노발레르산(GVA) 및 아르기닌산(ARGA)에 대한 혈장 수준 및 상기 OLE 기간 동안 혈장 Gc의 감소를 도시한다.
16명의 환자 중 15명이 기준선에서 모든 이동성 평가를 완료하였다(환자 13번은 휠체어를 타야만 했음(도 13(a)). 결손은 적자는 하기와 같이 정의되었다: 6MWT: 하위 5번째 백분위수 미만; GMFM 파트 D: 39 중 35 미만; GMFM 파트 E: 72 중 68 미만; ABAS-3: 85 이하. 환자의 88%(16명 중 14명)는 기준선에서 적어도 하나의 이동성 결손이 있었고; 16명의 환자 중 88%, 50% 및 56%가 각각 6MWT, GMFM 파트 D 및 GMFM 파트 E에서 기준선 결손이 있는 것으로 분류되었다. 적응 행동 ABAS-3 평가는 기준선에서 10명의 환자에 대해 입수 가능하였다. 6명의 환자는 언어, 연령 및 인지 장애로 인한 제약을 포함하여 기술적인 이유로 시험을 받지 않았고, 환자 10명 중 8명(80%)은 ABAS-3에 의해 평가된 1개 이상의 영역에서 기준선 결손이 있었다.
전반적인 임상 반응은 14명의 환자 중 11명(79%)이 6MWT, GMFM-D 또는 GMFM-E 평가 중 적어도 하나에서 1이상의 MCID 개선을 기반으로 용량 20에서 반응자로 정의되었음을 나타내었다(도 13(b)). 20-용량 데이터는 6MWT, GMFM-D 및 GMFM-E가 ARG1-D 환자의 임상적 이점을 포착하기 위한 변화에 충분히 민감하다는 것을 보여주었다. 전체 반응자의 비율은 용량 8에서 용량 20으로 상당히 증가하였다. 용량 44에 도달한 모든 5명의 환자(100%)는 반응자로서 용량 20의 전체 임상 반응 상태를 유지하였다.
개별 구성 요소에 대한 모든 반응자는 1이상의 MCID 개선을 보였다(도 13(b) 및 도 14). 6MWT의 경우, 환자 13명 중 7명(54%)이 상기 구성 요소에만 반응하였다. 6MWT의 평균 변화는 모든 환자에게서 32미터, 7명의 반응자에게서 66미터였다. GMFM-D의 경우: 기준선 결손이 있는 환자 8명 중 5명(63%)이 상기 구성 요소에만 반응을 보였다(평균 MCID 1.84, 범위 1.21 내지 3.33). GMFM-E의 경우: 기준선 결손이 있는 환자 8명 중 5명(63%)이 상기 구성 요소에만 반응을 보였다(평균 MCID 4.79, 범위 1.67 내지 8.33). 개별 이동성 구성요소에 대한 반응자의 비율은 용량 8에 비해 용량 20에서 실질적으로 더 컸다.
페그질라르기나제 20 용량 후 모든 환자의 데이터는 혈장 아르기닌의 현저하고 지속적인 감소, 중요한 질병 징후의 개선, 및 79%의 임상 반응률을 보여주었다. 1/2상 및 OLE 시험은 6MWT, GMFM-D 또는 GMFM-E를 페그질라르기나제의 임상적 이점을 포착하기 위한 도구로서 활용하는 것이 가치가 있음을 입증한다. 페그질라르기나제는 내약성이 좋았고 치료 관련 부작용 비율은 시간이 지남에 따라 감소하였다. 페그질라르기나제 치료 후 아르기닌 조절의 개선 및 임상적 이점은 중추적인 3상 PEACE 시험(NCT03921541)의 주요 평가변수 및 설계 요소에 대한 추가 검증을 제공한다.
실시예 20: 3상 임상 시험 설계
아르기나아제 1 결핍증이 있는 아동 및 성인에게서 Co-rhARG1-PEG의 효능 및 안전성에 대한 무작위, 이중 맹검, 위약 대조 3상 연구를 본 발명의 방법에 의해 생산된 Co-rhARG1-PEG를 사용하여 실시하고 있다. 상기 시험은 현재 아르기나아제 1 결핍증 임상 평가변수 또는 PEACE(CAEB1102-300A; NCT03921541)에 대한 페질라기나아제 효과( P egzilarginase E ffect on A rginase 1 D eficiency C linical E ndpoints, PEACE)로 진행 중이다.
상기 3상 시험에 대한 연구 설계는 하기의 그래픽으로 도시되어 있다:
Figure pct00008
주요 선정 기준
a. ARG1-D 진단을 받고 혈장 아르기닌 수치가 250 μmol/L 이상인 2세 이상의 환자들에 대하여, 의학적 지침 200 μmol/L 미만으로 혈장 아르기닌을 달성한 환자의 비율에 관한 통계적 시험을 실시할 수 있다.
b. 맹검 기간 동안 안정적이고 일관된 식단을 유지할 수 있어야 한다.
c. 맹검 기간 동안 안정적인 용량의 암모니아 제거제, 항간질 치료 및/또는 경련 약물을 유지할 수 있어야 한다.
d. 임상 평가를 실시하고 성공적으로 완료할 수 있어야 하며, 표 16에 도시된 대로 2차 임상 반응 평가변수의 구성 요소들 중 하나에서 기준선 결손이 있어야 한다.
주요 배제 기준
a. 치료 시작 전 6주 이내에 입원이 필요한 고암모니아혈증 반응
b. 제1 페그질라르기나제 투여 전 3주 이내의 활동성 감염
c. 질레트 기능 평가 설문지(Gillette Functional Assessment Questionnaire, GFAQ)에서 평가할 수 없거나 GFAQ에서 1점으로 정의되는 극도의 이동성 장애(어떠한 조치도 취할 수 없음)
d. 이전에 페그질라르기나제에 대한 중재 연구에 참여했거나 현재 다른 임상 시험에 참여 중
e. 폴리에틸렌 글리콜에 과민증의 병력
주요 임상 반응 평가변수에 대한 기준선 결손의 정의
평가 구성요소 기준선 결손의 정의
시간 제한 보행 시험* 2MWD(m) 하위 15번째 백분위수 연령 및 성별
총 운동 기능 측정* 파트 D파트 E 39중 35 미만
72중 68 미만
2MWD = 도보 2분 거리; GMFM = 총 운동 기능 측정; 파트 D = 서 있음; 파트 E = 걷기, 달리기, 점프*NIH 도구상자(미국 워싱턴 DC 소재의 미국 보건복지부) 운동 영역 데이터 세트(2분 도보 지구력 시험)
상기 3상 시험의 1차 평가변수는 혈장 아르기닌 감소(활성 및 위약군에 대한 개별 환자의 기준선으로부터의 변화의 치료 수단을 기반으로 한 24주차에 혈장 아르기닌 수준의 기준선으로부터의 변화)이다.
2차 평가변수 측정에는 다음이 포함된다:
a. 임상 반응 평가변수: 임상 반응자는 표 17에 정의된 24주차의 2MWT, GMFM-D 또는 GMFM-E 임상 반응 평가변수들 중 적어도 하나가 개선된 환자로 정의한다.
b. 임상 반응 평가변수의 각 개별 구성요소에 대한 반응률
c. 기타 임상 결과 평가
i. 기능적 이동성 척도 5, 50, 500 미터
ii. 질레트 기능 평가 설문지(GFAQ)
iii. 바인랜드(Vineland) 적응 행동 척도 - II
d. 면역원성을 포함한 안전성 평가
e. 혈장 아르기닌이 200 μM 미만이고 정상 범위(40-115μM) 내에 있는 환자의 비율
f. 페그질라르기나제의 약동학적 프로파일 특성화
임상 반응자를 정의하는 임상 반응 평가변수
평가 구성요소 반응의 정의
2MWT 보행 거리 9% 초과의 개선
GMFM 파트 D GMFCS 기준 1.5 내지 3.3점 개선
파트 E GMFCS 기준 1.8 내지 4.0점 개선
연구의 총 기간은 장기 공개 연장 기간(3-4주 선별 기간, 24주 치료 기간에 이어서 최대 150주의 공개 연장 기간)을 포함하여 대상체 당 약 178주가 예상된다. 대상체는 매주 1회 Co-rhARG1-PEG 또는 부피 조정된 위약을 매주 IV 주입(약 30분)을 통해 투여받게 된다. 혈장 아르기닌 값에만 기초한 Co-rhARG1-PEG의 용량 변경은 투여 알고리즘에 따라 맹검이 아닌 약사 및/또는 의사에 의해 실시될 것이다. 맹검 장기 연장 기간 중 처음 8주 이후부터, 대상체는 조사자 및 후원자의 승인 하에 피하 투여에 의해 Co-rhARG1-PEG를 투여받을 수 있는 선택사항을 가지게 된다. 초기 mg/kg 피하 용량은 IV 용량과 동일할 수 있다.
Co-rhARG1-PEG에 할당된 대상체는 용량 수준 2(하기 표 18을 참조), 0.10 mg/kg에서 시작한다. 방문 5부터 시작하여 필요한 경우, 혈장 아르기닌 값을 기반으로 하는 용량 변경은 하기의 투여 알고리즘에 따라 비맹검 의사에 의해 실시될 것이다:
Figure pct00009
혈장 아르기닌 수준이 150 μM 초과인 경우, 단일 168시간 샘플을 사용하여 상기 샘플 이전의 2회 용량이 a) mg/kg 단위의 동일한 용량 수준이고, b) 연속적(누락된 용량 없음)인 경우 2회 용량 수준(0.20 mg/kg을 초과하지 않음) 만큼 용량을 증가시킨다.
Figure pct00010
2개의 연속 168시간 샘플의 혈장 아르기닌 수준(누락된 용량에 관계없이)이 모두 50 μM 미만인 경우, 상기 용량을 0.05 mg/kg 미만으로 감소하지 않도록 하기 표에서 1회 용량 수준만큼(표 17을 참조) 감소시킨다.
Co-rhARG1-PEG에 대한 용량 조정
용량 수준(a) 투여
1(최소 가능 용량) 0.05 mg/kg
2(개시 용량) 0.10 mg/kg
3 0.15 mg/kg
4(최대 가능 용량) 0.20 mg/kg
(a) 페그질라기나제 투여는 수준 2, 0.10 mg/kg에서 시작한다. 용량 증가는 필요시 2회 용량 수준만큼 실시한다. 용량 감소는 1회 용량 수준만큼 실시한다.
통계적 고려사항
1차 분석은 엄격한 사전 지정된 기준을 충족하는 마지막 4개의 혈장 아르기닌 측정 결과의 평균을 기반으로 24주 투여 후 페그질라기나제로 치료받은 환자와 위약을 투여한 환자의 혈장 아르기닌 수준에서 기준선으로부터의 평균 감소를 비교할 것이다.
위약과 페그질라기나제로 무작위 배정된 10명 및 20명의 환자 표본 크기는 120 μM의 일반적인 SD로 추정되는 양측 만-위트니-윌콕슨(Mann-Whitney-Wilcoxon) 검정을 사용하여 0.05 유의 수준에서 평균 혈장 아르기닌 수준 200 μM의 차이를 입증하기 위해 98% 검정력을 달성하였다.
또한, 상기 대상체의 수는 피셔의 정확 검정(Fisher's Exact Test)을 사용하여 0.05 유의 수준에서 임상 반응 평가변수에 대한 군 비율 간에 40%의 통계적으로 유의한 차이를 검출하는 80% 이상의 검정력을 제공한다.
실시예 21: 부위 특이적 PEG화 분석
예시적인 부위 특이적 PEG화 분석이 도 15에 제시된다. 3개의 Co-rhARG1-PEG 배치를 분석하였다. 펩티드 매핑은 Co-rhARG1-PEG 원료의약품, Co-아르기나아제 l 중간체(비 페길화) 로트 및 해당 참조 표준을 구아니딘-HCl로 변성시키고 DTT로 환원시키고 요오도아세트아미드로 알킬화하여 실시하였다. 상기 샘플을 50 mM 트리스 완충액 8.0으로 희석하였다. 각 샘플은 37°C에서 약 5시간 동안 서열분석 등급 트립신으로 분해하였다. 생성된 펩티드는 0.05% 트리플루오로 아세트산에서 아세토니트릴 구배를 사용하여 워터스 애퀴티(Waters Acquity) ВЕН 300 С18 컬럼, 2.1 Х 150 mm, 워터스 C/N 186003687에서 분리하였다. 펩티드의 LC-MS 및 MS/MS 단편화는 워터스 제보(Waters Xevo) G2-XS QTOF MS/MS에서 수득하였다.
알 수 있는 바와 같이, 3개의 배치 중 어느 것도 위치 K3, K149, K190, K195, K29, K265 또는 K283에서 PEG화를 나타내지 않았다. 또한, 3개의 배치 모두 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K312 및 K321 부위에서 PEG화를 나타내었다. 일부 배치는 K222 및 K223 부위에서 낮은 빈도의 페길화를 보였다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 구현예", "특정 구현예들", "다양한 구현예들", "하나 이상의 구현예들" 또는 "하나의 구현예"에 대한 참조는 구현예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 개시의 적어도 하나의 구현예에 포함된다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 "하나 이상의 구현예들에서", "특정 구현예들에서", "다양한 구현예들에서", "일 구현예에서" 또는 "하나의 구현예에서"와 같은 문구의 출현은 본 개시의 동일한 구현예를 반드시 언급하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구조, 재료, 또는 특성은 하나 이상의 구현예들에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
본원의 개시가 특정 구현예들을 참조하여 설명을 제시하였지만, 이들 구현예들은 단지 개시의 원리 및 적용을 예시하는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 개시내용에 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 개시는 첨부된 청구범위 및 그 균등물의 범위 내에 있는 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Aeglea BioTherapeutics, Inc. <120> METHODS FOR PRODUCTION OF HUMAN RECOMBINANT ARGINASE 1 AND USES THEREOF <130> A0016 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys 1 5 10 15 Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp 35 40 45 Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln 50 55 60 Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala 65 70 75 80 Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu 85 90 95 Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg 100 105 110 Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile 115 120 125 Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val 130 135 140 Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly 145 150 155 160 Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile 165 170 175 Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu 180 185 190 Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly 195 200 205 Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg 210 215 220 Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr 225 230 235 240 Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly 245 250 255 Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu 260 265 270 Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val 275 280 285 Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly 290 295 300 Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro 305 310 315 320 Lys <210> 2 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized DNA Sequence <400> 2 atgtctgcga agagccgtac gatcggcatt attggtgcgc cgttctctaa aggtcagcca 60 cgcggtggtg tggaagaggg tccgacggtt ctgcgtaagg ccggtttatt agaaaagctg 120 aaagagcagg agtgcgacgt taaggactac ggtgacttac cattcgcgga catcccgaat 180 gatagcccgt tccaaatcgt taagaatccg cgctctgtgg gtaaagcaag cgagcagtta 240 gcaggtaagg tggccgaggt caagaaaaac ggtcgtatta gcctggtttt aggcggtgat 300 catagcttag caattggctc tatctctggt catgcccgtg tgcacccaga tttaggtgtc 360 atttgggttg acgcccatac ggatatcaat acgccattaa cgaccaccag cggcaatctg 420 catggccagc cggttagctt cttactgaag gagctgaagg gtaaaattcc agatgttccg 480 ggctttagct gggtcacgcc atgtatttct gccaaggata tcgtgtacat tggcttacgt 540 gacgtcgacc caggtgagca ctacatctta aagaccctgg gtatcaagta tttcagcatg 600 acggaagtgg accgcttagg catcggcaag gtgatggagg agacgctgag ctatctgctg 660 ggccgtaaga aacgtccaat ccatctgagc ttcgatgttg acggcttaga cccgagcttt 720 acgccagcca ccggcacgcc ggtcgttggt ggtttaacgt atcgcgaagg cctgtatatc 780 acggaggaaa tctataagac gggtttactg agcggtctgg acattatgga ggttaatcca 840 agcttaggta agacgccgga agaagttacc cgtaccgtta acacggcggt cgcgatcacg 900 ttagcatgtt tcggtttagc ccgcgagggc aaccataaac caattgatta tctgaatcca 960 ccgaagtga 969 <210> 3 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser 1 5 10 15 Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Phe 20 25 30 Ser Gln Gly Gln Lys Arg Lys Gly Val Glu His Gly Pro Ala Ala Ile 35 40 45 Arg Glu Ala Gly Leu Met Lys Arg Leu Ser Ser Leu Gly Cys His Leu 50 55 60 Lys Asp Phe Gly Asp Leu Ser Phe Thr Pro Val Pro Lys Asp Asp Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Asn Leu Ile Val Asn Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn Gln 85 90 95 Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Asp Gly Tyr Ser Cys 100 105 110 Val Thr Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ser Gly 115 120 125 His Ala Arg His Cys Pro Asp Leu Cys Val Val Trp Val Asp Ala His 130 135 140 Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His Gly 145 150 155 160 Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Arg Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro Gln 165 170 175 Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile 180 185 190 Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu 195 200 205 Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu 210 215 220 Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Arg Thr Phe Asp Leu Leu Ile Gly Lys 225 230 235 240 Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp Pro 245 250 255 Thr Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr 260 265 270 Arg Glu Gly Met Tyr Ile Ala Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu Leu 275 280 285 Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro Gln Leu Ala Thr Ser Glu 290 295 300 Glu Glu Ala Lys Thr Thr Ala Asn Leu Ala Val Asp Val Ile Ala Ser 305 310 315 320 Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp Gln Leu 325 330 335 Pro Thr Pro Ser Ser Pro Asp Glu Ser Glu Asn Gln Ala Arg Val Arg 340 345 350 Ile

Claims (45)

  1. 정제된 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제를 제조하는 방법으로서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은:
    a. 생물반응기에서 rhARG를 생성하는 대장균 세포를 배양하는 단계;
    b. 상기 대장균 세포를 용해시키는 단계;
    c. 상기 용해물로부터 세포 파괴물을 제거하는 단계;
    d. 양이온 교환 컬럼에 세포 용해물을 로딩하는 단계;
    e. 고염 용액으로 상기 rhARG를 용출시키는 단계;
    f. 상기 용출된 rhARG를 코발트 염과 함께 배양하여 코발트 치환 rhARG(Co-rhARG)를 형성하는 단계;
    g. 상기 Co-rhARG를 음이온 교환 컬럼에 적용하고 통과액을 수집하는 단계;
    h. 상기 통과액을 제3 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
    i. 상기 고염 용액을 사용하여 상기 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 상기 Co-rhARG를 용출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    양이온 교환 수지 1리터당 60 g 이하의 rhARG가 상기 양이온 교환 컬럼에 로딩되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 양이온 교환 컬럼으로부터 상기 rhARG를 용출시키는 단계는 최대 약 0.5 M 염 농도의 고염 용액을 사용하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 양이온 교환 컬럼으로부터 상기 rhARG를 용출시키는 단계는 약 0.1 M 염 농도의 고염 용액을 사용하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 양이온 교환 컬럼으로부터 상기 rhARG를 용출시키는 단계는 약 0.0 내지 약 0.5 M 염 농도의 구배를 사용하는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 양이온 교환 컬럼으로부터 상기 rhARG를 용출시키는 단계는 약 0.0 내지 0.2 M 염 농도의 구배를 사용하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코발트 염은 Co2+ 염을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코발트 염은 CoCl2 염을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3 크로마토그래피 컬럼은 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼을 포함하는, 방법.
  10. 1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 rhARG 또는 Co-rhARG를 PEG화 반응물과 반응시켜 PEG화된 단백질을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 PEG화된 단백질은 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321에서 하나 이상의 PEG화된 아미노산 잔기를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 PEG화된 단백질은 K16의 약 15% 내지 약 60%, K32의 약 35% 내지 약 80%, K38의 약 20% 내지 약 85%, K40의 약 10% 내지 약 60%, K47의 약 10% 내지 약 60%, K67의 약 40% 내지 약 90%, K74의 약 30% 내지 약 95%, K82의 약 30% 내지 약 98%, K87의 약 15% 내지 약 65%, K88의 약 25% 내지 약 70%, K152의 약 25% 내지 약 85%, K154의 약 15% 내지 약 65%, K171의 약 20% 내지 약 75%, K222의 0% 내지 약 30%, K223의 0% 내지 약 35%, K312의 0% 내지 약 45%, 및 K321의 0% 내지 약 45% 중 하나 이상으로 PEG화된, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PEG화된 단백질은 적어도 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K312 및 K321에서 PEG화된 아미노산 잔기를 포함하는, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PEG화된 단백질은 K3, K149, K190, K195, K29, K265 및 K283에서 PEG화된 아미노산 잔기를 포함하지 않는, 방법.
  15. 정제된 PEG화된 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제를 제조하는 방법으로서,
    재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은:
    a. 생물반응기에서 rhARG를 생성하는 대장균을 배양하는 단계;
    b. 상기 대장균 세포를 용해시키는 단계;
    c. 상기 용해물로부터 세포 파괴물을 제거하는 단계;
    d. 양이온 교환 컬럼에 상기 세포 용해물을 로딩하는 단계;
    e. 고염 용액으로 상기 rhARG를 용출시키는 단계;
    f. 상기 용출된 rhARG를 10 mM CoCl2와 함께 배양하여 코발트 치환 rhARG(Co-rhARG)를 형성하는 단계;
    g. 상기 Co-rhARG를 음이온 컬럼에 적용하고 통과액을 수집하는 단계;
    h. 상기 통과액을 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼에 적용하는 단계;
    i. 고염 용액을 사용하여 상기 MMC 컬럼으로부터 상기 상기 Co-rhARG를 용출시키는 단계;
    j. 과량의 몰의 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르를 첨가하는 단계;
    k. 과잉 PEG를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 정제된 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제를 제조하는 방법으로서,
    재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은:
    a. 생물반응기에서, 약 36℃ 내지 약 38℃ 및 pH 약 7.0 내지 약 7.4에서 rhARG를 생성하는 대장균 세포를 교반 및 통기를 실시하면서 배양하는 단계;
    i. 상기 생물반응기의 온도를 약 29℃로 조절하는 단계;
    ii. 대장균 세포를 rhARG를 생성하도록 유도하는 단계;
    iii. 상기 대장균 세포를 약 18시간 동안 배양하는 단계;
    iv. 상기 대장균 세포를 원심분리에 의해 회수하는 단계;
    b. pH 약 7.2 내지 약 7.6 및 약 15℃ 이하에서 25 mM HEPES의 고압 균질화에 의해 상기 대장균 세포를 용해시키는 단계;
    c. 세포 파괴물을 상기 용해물로부터 15℃ 이하에서 원심분리에 의해 제거한 다음, 0.8 마이크론 필터로 상기 용해물을 여과한 다음, 0.5 마이크론 필터로 여과하는 단계;
    d. 상기 세포 용해물을 양이온 교환 컬럼에 로딩한 다음, pH 7.2-7.6의 25 mM HEPES로 상기 컬럼을 세척하는 단계;
    e. 실온에서 25 mM HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7.2-7.6을 포함하는 고염 용액으로 상기 rhARG를 용출시키는 단계;
    f. 상기 용출된 rhARG를 10 mM CoCl2와 실온에서 약 2 내지 약 8시간 동안 배양하여 코발트 치환 rhARG(Co-rhARG)를 형성하는 단계;
    i) Co-rhARG를 50 mM 트리스(Tris), pH 8.1-8.5로 교환하는 단계;
    g. 상기 Co-rhARG를 음이온 교환 컬럼에 적용하고 통과액을 수집하는 단계;
    h. 상기 통과액을 캡토(Capto) 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼에 적용하는 단계;
    i. 50 mM 트리스, 250 mM NaCl, pH 8.1-8.5를 포함하는 고염 용액을 이용하여 상기 Co-rhARG를 상기 MMC 컬럼으로부터 용출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 정제된 재조합 PEG화된 재조합 코발트 치환 인간 아르기나아제를 제조하는 방법으로서,
    재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은:
    a. 생물반응기에서, 약 36℃ 및 약 38℃ 및 pH 약 7.0 내지 약 7.4에서 rhARG를 생성하는 대장균을 교반 및 통기를 실시하면서 배양하는 단계;
    i) 상기 생물반응기의 온도를 약 29℃로 조절하는 단계;
    ii) 대장균을 rhARG를 생성하도록 유도하는 단계;
    iii) 상기 대장균을 약 18시간 동안 배양하는 단계;
    iv) 상기 대장균을 원심분리에 의해 회수하는 단계;
    b. pH 약 7.2 내지 약 7.6 및 약 15℃ 이하에서 25 mM HEPES의 고압 균질화에 의해 상기 대장균 세포를 용해시키는 단계;
    c. 세포 파괴물을 용해물로부터 15℃ 이하에서 원심분리에 의해 제거한 다음, 약 0.8 마이크론 필터로 상기 용해물을 여과한 다음, 약 0.5 마이크론 필터로 여과하는 단계;
    d. 상기 세포 용해물을 양이온 교환 컬럼에 로딩한 다음, pH 7.2-7.6의 25 mM HEPES로 상기 컬럼을 세척하는 단계;
    e. 실온에서 25 mM HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7.2-7.6을 포함하는 고염 용액으로 상기 rhARG를 용출시키는 단계;
    f. 상기 용출된 rhARG를 10 mM CoCl2와 실온에서 약 2 내지 약 8시간 동안 배양하여 코발트 치환 rhARG(Co-rhARG)를 형성하는 단계;
    i) Co-rhARG를 50 mM 트리스, pH 8.1-8.5로 교환하는 단계;
    g. 상기 Co-rhARG를 음이온 교환 컬럼에 적용하고 통과액을 수집하는 단계;
    h. 상기 통과액을 캡토 다중모드 크로마토그래피(MMC) 컬럼에 적용하는 단계;
    i. 50 mM 트리스, 250 mM NaCl, pH 8.1-8.5(MMC 완충액)를 포함하는 고염 용액을 이용하여 상기 Co-rhARG를 상기 MMC 컬럼으로부터 용출시키는 단계;
    i) 상기 MMC 완충액을 20 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, 1.5% 글리세롤, pH 7.4(완충액 1)로 교환하고 단백질 농도를 약 5.0 mg/mL로 조절하는 단계;
    ii) 완충액 1을 0.1 M 인산나트륨, pH 8.1-8.5(완충액 2)로 교환하고 단백질 농도를 약 10.0 mg/mL로 농축하는 단계;
    j. 과량의 몰의 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르 5,000 Da 근사 분자량을 첨가하는 단계로서, 약 19몰의 메톡시 PEG 숙신이미딜 카르복시메틸 에스테르가 단백질 1몰 당 첨가되고, 상기 혼합물을대략 pH 8.4에서 약 30분 내지 약 4시간 동안 배양하는 단계;
    k. 완충액 2를 20 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, 1.5% 글리세롤, pH 7.4로 교환하여 과량의 PEG를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 Co-rhARG 또는 Co-rhARG-PEG를 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 단백질은 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321 중 하나 이상에서 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 결합되는, 조성물.
  20. 재조합 인간 아르기나아제(rhARG) 단백질을 포함하는 조성물로서,
    서열번호 1과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 단백질은 비천연 금속 보조인자와 복합체로 존재하고, 상기 비천연 금속 보조인자는 코발트이며, 상기 단백질은 K16, K32, K38, K40, K47, K67, K74, K82, L87, K88, K152, K154, K171, K222, K223, K312 및 K321 중 하나 이상에서 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 결합되는, 조성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 H100, D123, H125, D127, D231, D233, W121, D180, S229, C302 및 E255로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 조성물.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 D180S, S229C, S229G, C302F, C302I, E255Q, D180E, 및 S229A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 조성물.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 C302에서 상기 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 조성물.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함하는, 조성물.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 절단된 아르기나아제 I 단백질인, 조성물.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 인간 아르기나아제(rhARG)는 외인성 단백질 단편을 추가로 포함하는, 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 외인성 단백질 단편은 면역글로불린의 Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역의 일부를 포함하는, 조성물.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Co-rhARG-PEG의 고유 활성도는 약 400 U/mg 내지 약 700 U/mg의 범위인, 조성물.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질은 시험관내 분석시 pH 7.4에서 약 200 mM-1 s-1 내지 약 4,000 mM-1 s-1의 범위의 아르기닌 가수분해에 대한 kcat/Km을 나타내는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 단백질은 시험관내 분석시 pH 7.4에서 약 400 mM-1 s-1 내지 약 2,500 mM-1 s-1의 범위의 아르기닌 가수분해에 대한 kcat/Km을 나타내는, 조성물.
  31. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG:Co-rhARG의 몰비는 약 7몰/몰 내지 약 15몰/몰의 범위인, 조성물.
  32. 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    유리 PEG 농도는 100 μg/mL 이하인, 조성물.
  33. 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물의 총 코발트 함량은 약 9 μg/mL 내지 약 15 μg/mL 범위인, 조성물.
  34. 제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 이미징 모세관 등전점 집속(iCIEF)에 로딩될 때 적어도 9개의 피크를 생성하고, 피크 1은 20% 미만, 피크 2는 30% 미만, 피크 3+ 4는 10-30% 범위, 피크 5는 15-30% 범위, 피크 6은 10-25% 범위, 피크 7은 25% 미만, 피크 8은 15% 미만, 및 피크 9는 8% 미만인, 조성물.
  35. 제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 iCIEF에 로딩될 때 적어도 9개의 피크를 생성하고, 피크 1은 5-7% 범위, 피크 2는 8-11% 범위, 피크 3+4는 16-20% 범위, 피크 5는 21-24% 범위, 피크 6은 21-22% 범위, 피크 7은 14-15% 범위, 피크 8은 5-8% 범위, 및 피크 9는 2-3% 범위인, 조성물.
  36. 제18항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 Co-rhARG 또는 Co-rhARG-PEG 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥내 또는 피하 투여용으로 제제화된, 약학적 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    상기 조성물은 인산칼륨, 염화나트륨 및 글리세롤을 포함하는, 약학적 조성물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 50 mM NaCl, 약 1 mM K2HPO4, 약 4 mM KH2PO4, 및 약 1.5% w/v 글리세롤을 포함하는, 약학적 조성물.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 아르기나아제 1 결핍증을 치료하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 정맥내 투여되는, 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 피하 투여되는, 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물의 투여는 PEG화되지 않은 효소의 중량을 기준으로 0.1 mg/kg의 용량으로 개시되는, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자의 혈장 아르기닌 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용량은 하기의 알고리즘인:
    a) 혈장 아르기닌 수준이 150 μM 초과인 경우, 단일 168시간 샘플을 사용하여 상기 샘플 이전의 2회 용량이 a) mg/kg 단위의 동일한 용량 수준이고, b) 연속적(누락된 용량 없음)인 경우 하기 표의 2회 용량 수준(0.20 mg/kg을 초과하지 않음) 만큼 용량을 증가시키고,
    b) 2개의 연속 168시간 샘플의 혈장 아르기닌 수준(누락된 용량에 관계없이)이 모두 50 μM 미만인 경우, 상기 용량을 0.05 mg/kg 미만으로 감소하지 않도록 하기 표에서 1회 용량 수준만큼 감소시키는, 알고리즘에 따라 조절되는, 방법.
    Figure pct00011

    (a) 페그질라기나제 투여는 수준 2, 0.10 mg/kg에서 시작한다. 용량 증가는 필요시 2회 용량 수준만큼 실시한다. 용량 감소는 1회 용량 수준만큼 실시한다.
KR1020227010296A 2019-08-30 2020-08-28 인간 재조합 아르기나아제 1의 제조 방법 및 이의 사용 KR20220082813A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962894319P 2019-08-30 2019-08-30
US62/894,319 2019-08-30
PCT/US2020/048536 WO2021041904A1 (en) 2019-08-30 2020-08-28 Methods for production of human recombinant arginase 1 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220082813A true KR20220082813A (ko) 2022-06-17

Family

ID=72433097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227010296A KR20220082813A (ko) 2019-08-30 2020-08-28 인간 재조합 아르기나아제 1의 제조 방법 및 이의 사용

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20210189371A1 (ko)
EP (1) EP4022052A1 (ko)
JP (1) JP2022545738A (ko)
KR (1) KR20220082813A (ko)
CN (1) CN114729344A (ko)
AU (1) AU2020335905A1 (ko)
BR (1) BR112022003633A2 (ko)
CA (1) CA3149592A1 (ko)
IL (1) IL290817A (ko)
MX (1) MX2022002437A (ko)
TW (1) TW202122409A (ko)
WO (1) WO2021041904A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350698B (zh) * 2021-11-30 2023-07-18 新泰市佳禾生物科技有限公司 人重组精氨酸酶i生产菌及其构建方法
WO2023201228A1 (en) * 2022-04-11 2023-10-19 Aeglea Biotherapeutics, Inc. Treatment of arginase 1 deficiency

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3064579T3 (da) * 2008-10-31 2020-12-21 Aerase Inc Farmaceutiske sammensætninger og medicinske anvendelsesformer af konstruerede humane arginaser
JP2012531893A (ja) * 2009-06-29 2012-12-13 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム アルギナーゼ製剤および方法
WO2012061015A2 (en) * 2010-11-03 2012-05-10 Scott & White Healthcare L-citrulline supplementation during arginine depletion therapy with arginase
CN105112391B (zh) * 2015-09-22 2018-07-06 浙江道尔生物科技有限公司 一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用途
LT3496743T (lt) * 2016-08-08 2022-04-11 Aerase, Inc. Kompozicijos ir metodai, skirti vėžio gydymui arginino deplecija ir imunoonkologiniais preparatais
TW201910513A (zh) * 2017-08-16 2019-03-16 香港商鎧耀波麗堂（香港）有限公司 胺基酸耗竭治療的組合物及方法
JP2021505620A (ja) * 2017-12-05 2021-02-18 イーレイズ・インコーポレーテッド アルギナーゼ１欠損症を治療するための方法及び組成物
WO2021257523A1 (en) * 2020-06-15 2021-12-23 Aeglea Biotherapeutics, Inc. Use of arginase for treatment of influenza infections

Also Published As

Publication number Publication date
US20210189371A1 (en) 2021-06-24
CA3149592A1 (en) 2021-03-04
AU2020335905A1 (en) 2022-03-10
JP2022545738A (ja) 2022-10-28
EP4022052A1 (en) 2022-07-06
IL290817A (en) 2022-04-01
US20240110172A1 (en) 2024-04-04
CN114729344A (zh) 2022-07-08
MX2022002437A (es) 2022-06-02
TW202122409A (zh) 2021-06-16
BR112022003633A2 (pt) 2022-06-07
WO2021041904A1 (en) 2021-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240110172A1 (en) Methods for production of human recombinant arginase 1 and uses thereof
KR101910124B1 (ko) 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
RU2179034C2 (ru) ЛЕЧЕНИЕ В СЛУЧАЕ ДЕФИЦИТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А
EP2750686B1 (en) Polypeptide comprising frataxin and a c-terminal mitochondria penetrating peptide for use in the treatment of friedreich&#39;s ataxia
CN109153709B (zh) 神经生长因子突变体
EA013565B1 (ru) Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение
CN109111517B (zh) 一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用
US20220054598A1 (en) Polyethylene glycol-modified urate oxidase
WO2022194311A4 (zh) 一种IL-17RA抗体Fc融合蛋白及其用途
WO2021257523A1 (en) Use of arginase for treatment of influenza infections
US6866844B2 (en) Precursor N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, methods of treatment using said enzyme and methods for producing and purifying said enzyme
CA3197424A1 (en) Urate oxidase preparation and use thereof
US7078485B2 (en) N-terminal modified recombinant human endostatin and its production
US9943575B2 (en) Pharmaceutical compositions of tenecteplase
CN108949730A (zh) 一种重组变构胶原酶的制备方法及其应用
WO2011085574A1 (zh) 全人TNFα单克隆抗体及其制备方法与应用
JP2022546837A (ja) ヒト組換えヒポシアル酸付加エリスロポエチン、その精製方法及び処置用途
CN112142856B (zh) 一种用于改善脑卒中兴奋性毒性损伤的特异性降解ndrg2靶向肽及其应用
EP4335459A1 (en) Pharmaceutical composition for treatment of mucopolysaccharidosis type 1
CN112210003A (zh) 一种重组载脂蛋白j及其类似物的晶体结构及应用
WO2022245924A1 (en) Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating adolescent subjects
EP4157331A1 (en) Treatment of homocystinuria and hyperhomocysteinemia using cystathionine-gamma-lyase
CN118440925A (zh) 一种低免疫原性门冬酰胺酶突变体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination