JPH11503428A

JPH11503428A - メタドン誘導体ならびにタンパク質およびポリペプチドメタドン誘導体結合体および標識

Info

Publication number: JPH11503428A
Application number: JP8530280A
Authority: JP
Inventors: エフ．ベーチラー，ケニース
Original assignee: バイオサイトダイアグノスティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 1999-03-26
Also published as: EP0827502A1; DE69611037D1; AU5173996A; EP0827502B1; DE69611037T2; US5710256A; WO1996031496A1; CA2217154A1; ATE197709T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、メタドンおよびメタドン代謝産物に対する抗体またはレセプターの調製のための抗原（タンパク質またはポリペプチド）への共有結合のために合成される、メタドン誘導体に関する。得られた抗原は、標準的な方法を用いて抗体またはレセプター産生のために使用され得る。一旦生成されると、抗体またはレセプター、ならびにタンパク質、ポリペプチド、または標識に共有結合する誘導体は、イムノアッセイプロセスにおいて使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】メタドン誘導体ならびにタンパク質およびポリペプチドメタドン誘導体結合体および標識発明の分野本発明は、液体サンプルにおけるメタドンおよびメタドンの選択された代謝産物の検出のためのリガンドレセプターアッセイ（イムノアッセイを含む）の分野にある。より詳細には、本発明は、メタドン代謝産物に対する抗体の調製に使用するため、ならびにイムノアッセイプロセスで使用するための、新規のメタドン誘導体ならびにタンパク質およびポリペプチドのメタドン誘導体結合体および標識の合成方法に関する。発明の背景メタドンは、モルヒネの代用として最初に使用された。なぜなら、メタドンは、モルヒネの薬理学的特性の多くを有するからである。メタドンはまた、モルヒネとほぼ同様に強力な鎮痛効果があるが、メタドンの臨床的使用は、麻薬常用者の処置のためであった。麻薬常用者をモニターおよび処置するために、メタドン維持の患者のモニターにより、メタドンおよびメタドン代謝産物を迅速に検出する抗体および診断に対する医療上の必要性が生じている。メタドンおよびメタドン代謝産物に対する抗体の調製は、メタドン誘導体を抗原性ポリペプチドまたはタンパク質に共有結合させるために、メタドン誘導体の合成を必要とする。さらに、メタドン誘導体は、抗体のスクリーニングにおける使用およびイムノアッセイプロセスにおける使用のために、種々のポリペプチド、タンパク質、または標識に共有結合する。メタドン誘導体は、測定が求められるメタドン代謝産物の構造を模倣すべきである。従って、タンパク質、ポリペプチド、または標識に共有結合するメタドン誘導体のタイプの選択および合成が重要である。さらに、メタドン誘導体は、水溶液中で安定かつ可溶性であることが必要である。免疫化およびイムノアッセイのためのメタドン化合物および結合体は、米国特許第3,843,696号、同第3,966,556号、同第4,104,367号および欧州特許出願第380 019号に記載されている。発明の要旨本発明は、メタドンおよびメタドン代謝産物に対する抗体の調製のための抗原（タンパク質またはポリペプチド）への共有結合のために合成される新規のメタドン誘導体に関する。得られる新規の抗原は、標準的な方法を用いて抗体の産生のために使用され得る。一旦生成されると、抗体、ならびにタンパク質、ポリペプチド、または標識に共有結合する新規の誘導体は、イムノアッセイプロセスにおいて使用され得る。定義本発明に従って、そして本明細書中に使用されるように、以下の用語は特に指示がない限り、以下の意味で定義される。「薬物」は、生体系に投与された場合、自発的化学反応あるいは酵素触媒反応または代謝反応のいずれかの結果として、固有の活性を生じる任意の化合物およびリガンドを意味する。薬物は、生体系によって薬物の誘導体に代謝され得る。薬物およびそれらの代謝産物の一般例は、メタドン、モルヒネ、バルビツレート、テトラヒドロカンナビノール、フェンシクリジン、アンフェタミン、メタンフェタミン、オピエート、ベンゾジアゼピン、コカイン、エストロン-3-グルクロニド、プレグナンジオール-グルクロニド、コチニン、リセルグ酸、ジエチルアミド、プロポキシフェン、アナボリックステロイド、三環系抗うつ薬である。「薬物誘導体」は、リガンド誘導体、薬物、薬物代謝産物または連結基に結合する薬物アナログを意味する。「薬物代謝産物」は、生化学的経路あるいは代謝経路における薬物の上流または下流の化合物、または中間体を意味する。「標識」は、シグナル発生要素またはシグナルを生じ得る手段（例えば、染料または酵素）を意味する。薬物誘導体の標識への結合は、共有結合、吸着プロセス、キレートなどにおけるような疎水性結合および／または静電的結合、またはこれらの結合および相互作用の組合せによるものであり得る。「結合ドメイン」は、リガンドに結合するレセプターの部分に会合する分子構造をいう。より詳細には、結合ドメインは、天然または合成のポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸であって、それらのアミノ酸配列がタンパク質の特定の領域を示し、該ドメインが単独または他のドメインとの組合せで、所望のリガンド／レセプター結合対の結合特性に同一または類似である結合特性を示すものをいう。結合活性が示される限り、このようなドメインの具体的な配列も具体的な境界も重要ではない。同様に、この文脈で使用される結合特性は、結合活性が示される限り、親和性、アビジチーおよび特異性、ならびにその組合せまでの範囲を必然的に包含する。「連結基」は、タンパク質、ポリペプチドまたは標識と薬物または薬物誘導体との間の「化学の手」を意味する。当業者が認識するように、必要な化学構造を達成するためには、各反応物は、必要な反応性基を含む必要がある。このような基の代表的な組合せは、アミド結合を形成するアミノ基とカルボキシル基、エステル結合を形成するカルボキシ基と水酸基、あるいはアルキルアミノ結合を形成するアミノ基とハロゲン化アルキル基、またはジスルフィドを形成するチオールとチオール、あるいはチオエステルを形成するチオールとマレイミドまたはハロゲン化アルキルである。明らかに、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、および他の官能基は、存在しない場合には公知の方法により導入し得る。同様に、当業者が認識するように、広範な種々の連結基を使用し得る。結合の構造は、薬物または薬物誘導体がタンパク質、ポリペプチドまたは標識に結合するように形成された安定な共有結合であるべきである。いくつかの場合において、連結基は、リガンドとレセプターとの所望の結合特性を増強するために親水性または疎水性のいずれかであるように設計され得る。共有結合は、リガンドおよび連結基が供される溶液条件に関して安定であるべきである。一般に、好ましい連結基は、１〜20個の炭素および０〜10個のヘテロ原子（NH，O、S）由来であり、そして分枝鎖または直鎖であり得る。前記のことを限定することなく、化学的に適合性の原子の組合せのみが連結基を構成ことは当業者には明白である。例えば、炭素-炭素結合と組み合わされたアミド、エステル、チオエーテル、チオエステル、ケト、ヒドロキシル、カルボキシル、エーテル基は、化学的に適合性の連結基の受容可能な例である。連結基を含む他の化学的に適合性の化合物は、この定義の節で記載されており、そして本明細書中で参考として援用される。「ヒドロカルビル」は、水素および他の元素が結合する炭素鎖からなる有機基をいう。この用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリール基を含み、飽和結合および不飽和結合の混合物を有する基、炭素環式環を含み、そしてこのような基の組合せを含む。それは、直鎖、分枝鎖、環式構造、またはそれらの組合せのことを意味し得る。「アリール」は、共役π電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基のことをいい、炭素環式アリール、複素環式アリールおよびビアリール基を包含し、それらの全てが必要に応じて置換可能であり得る。「炭素環式アリール基」は、芳香環上の環原子が炭素原子である基をいう。炭素環式アリール基は、単環式炭素環式アリール基および必要に応じて置換されたナフチル基を包含する。「単環式炭素環式アリール」は、必要に応じて置換されたフェニルをいい、好ましくは、フェニル、または１〜３つの置換基（有利には、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、ハロゲン、シアノ、トリハロメチル、低級アシルアミノ、低級アミノまたは低級アルコキシカルボニルなど）で置換されたフェニルである。「必要に応じて置換されたナフチル」は、1-もしくは２-ナフチル、または低級アルキル、低級アルコキシ、またはハロゲンで好ましくは置換された１-もしくは２-ナフチルをいう。「複素環式アリール基」は、芳香環中の環原子として１〜３個のヘテロ原子、そして、残りの環原子として炭素を有する基をいう。適切なヘテロ原子は酸素、硫黄、および窒素を含み、そしてフラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、N- 低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルなどを包含し、それらは必要に応じて置換される。「必要に応じて置換されたフラニル」は、２-もしくは３-フラニル、または低級アルキルもしくはハロゲンにより好ましくは置換された２-もしくは３-フラニルをいう。「必要に応じて置換されたピリジル」は、２-、３-、もしくは４-ピリジル、または低級アルキルもしくはハロゲンにより好ましくは置換された２-、３-、もしくは４-ピリジルをいう。「必要に応じて置換されたチエニル」は、２-もしくは３-チエニル、または低級アルキルもしくはハロゲンにより好ましくは置換された２-もしくは３-チエニルをいう。「ビアリール」は、本明細書中で規定された炭素環式アリールまたは複素環式アリールにより、フェニル環の結合の点に対して、オルト、メタ、またはパラで（有利にはパラで）置換されたフェニルをいう；ビアリールはまた、-C₆H₄-Ar置換基として示され、ここで、Arはアリールである。「アラルキル」は、アリール基で置換されたアルキル基をいう。適切なアラルキル基は、ベンジル、ピコリルなどを含み、そして、必要に応じて置換され得る。「低級」は、本明細書中で、７個まで（７個を含む）の炭素原子、好ましくは４個まで（４個を含む）の炭素原子、そして有利には１または２個の炭素原子を含むようにそれぞれ規定される有機基または化合物に関していう。このような基は、直鎖または分枝鎖であり得る。用語（a）「アルキルアミノ」、（b）「アリールアミノ」および（c）「アラルキルアミノ」は、それぞれ、-NR'R基をいい、ここでそれぞれ、（a）Rは、アルキルであり、そしてR'は、水素またはアルキルである；（b）Rはアリールであり、そしてR'は、水素またはアリールである、そして（c）Rはアラルキルであり、そしてR'は水素またはアラルキルである。用語「アシル」は、ヒドロカルビル-CO-またはHCO-をいう。用語「アシルアミノ」は、それぞれ（RCONCR）-および（RCO₂N）-をいい、ここで、各Rは、独立して水素またはヒドロカルビルである。用語「ヒドロカルビルオキシカルボニルメチル」は、基ROC(O)O-をいうべきであり、ここでRは、ヒドロカルビルである。用語「低級カルボアルコキシメチル」または「低級ヒドロカルビルオキシカルボニルメチル」は、10または10未満の炭素原子を含むヒドロカルビル基を有するヒドロカルビル-OC(O)CH₂-をいう。用語「カルボニル」は、-C(O)-をいう。用語「カルボキサミド(carboxamide)」または「カルボキサミド(carboxamido) 」は、-CONR₂をいい、ここで、各Rは、独立に水素またはヒドロカルビルである。用語「低級ヒドロカルビル」は、10個または10個未満の炭素原子の任意のヒドロカルビル基をいう。用語「アルキル」は、直鎖、分枝鎖、および環状基を含む飽和脂肪族基をいう。用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を含む不飽和ヒドロカルボニル基をいい、そして直鎖、分枝鎖、および環状基を含む。用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を含む不飽和ヒドロカルビル基をいい、そして直鎖、分枝鎖、および環状基を含む。用語「ヒドロカルビルオキシカルボニルアミノ」は、ウレタン、すなわちヒドロカルビル-O-CONR-をいい、ここで、Rは、Hまたはヒドロカルビルであり、ここで、各ヒドロカルビルは、独立して選択される。用語「ジ（ヒドロカルビルオキシカルボニル）アミノ」は、（ヒドロカルビル -O-CO）₂N-をいい、ここで、各ヒドロカルビルは独立して選択される。用語「ヒドロカルビルアミノ」は、-NRR'をいい、ここで、Rはヒドロカルビルであり、そしてR'は独立して選択されるヒドロカルビルまたは水素である。用語「メルカプト」は、SHまたは互変体形態いう。用語「メチン」は、をいう。用語「メチレン」は、-CH₂-をいう。用語「アルキレン」は、二価の直鎖または分枝鎖飽和脂肪族基をいう。用語「オキシ」は、-O-（酸素）をいう。用語「チオ」は、-S-（硫黄）をいう。「ジスルフィド」は、-S-S-をいう。「チオエステル」は、をいう。「チオエーテル」は、C-S-Cをいう。「エステル」は、をいう。「分析物」は、検出および/または測定されることが求められる天然起源または合成起源の物質を意味する。この物質は、この分析物と特異的に相互作用し得る特異的結合パートナーを有する。「リガンド」は、リガンドレセプターへの結合パートナーを意味する。検出された場合、試料中の分析物の存在を推測するために使用し得る物質であり、ハプテン、ホルモン、抗原、抗体、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、前述の物質の代謝産物、およびその他の、診断上利益があり、そして特異的結合パートナー（すなわち、リガンドアッセイのリガンドレセプター）を有し得る天然起源または合成起源の物質が無制限に含まれる。「レセプター」は、結合リガンド（代表的には抗体）またはそのフラグメントを結合し得るレセプターをいうが、それはアッセイ設計に応じて、他のリガンドであり得る。「リガンド-レセプターアッセイ」は、リガンドとそのリガンドに特異的に相互作用し得るリガンドレセプターとの間の複合体の形成により検出され得る分析物のためのアッセイを意味する。リガンド-レセプターアッセイは、競合的、または非競合的であり得、均一または不均一であり得る。「免疫原」は、免疫応答を誘発する化学的または生化学的構造、決定基、抗原またはその一部を意味し、例えば、ポリリシン、ウシ血清アルブミン、およびキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）を含む。「抗原性」は、抗体の形成を誘導し得る化学的または生化学的構造、決定基、抗原またはその一部を意味する。図面の説明図１〜４は、本発明の化合物の構造を示す。図５および６は、それぞれ実施例３および実施例４の構造を示す。好適な実施態様の詳細な説明抗体の生成およびイムノアッセイプロセスで一般に使用される新規化合物を記述する。これらの化合物は、メタドン誘導体およびおよびメタドンの代謝産物の誘導体である。メタドンの加工（elaboration）は、メタドン分子のいずれかの末端で行われ得る。すなわち、エチルケト基が、別の脂肪族ケト基（タンパク質、ポリペプチドまたは標識への誘導体の付着を補助するためのアミン、カルボン酸またはチオール官能基を含む）で置換され得る。さらに、メタドン分子の反対側の末端も加工され得る。例えば、ノルメタドンを用いて出発し、そしてハロアルキルチオエステルで２級アミンをアルキル化するか、またはカルボン酸チオエステルでアシル化する。メタドン代謝産物（例えば、2-エチリデン-1,5-ジメチル-3,3-ジフェニルピロリジン（EDDP）および2-エチル-5-メチル-3,3-ジフェニルピロリン（EMDP））の加工は、それぞれ、ピロリジンまたはピロリン環上で行われ得る。個々の誘導体合成は、メタドンまたはメタドン代謝産物誘導体の特性が、所望の結合相互作用を可能にする様式で抗体またはレセプターに適切に提示されることを可能にすべきである。タンパク質、ポリペプチドまたは標識とメタドンまたはメタドン代謝産物誘導体との間の連結基の合成は、薬物誘導体とレセプターとの所望の結合を達成するように設計される。例えば、誘導体は、タンパク質、ポリペプチドまたは標識表面から移動させられ、誘導体それ自身を、レセプターの結合ドメインに提示することを可能にし得る。一般に、本発明の化合物は以下の式を有する：ここで、Rは、以下の１つを含む連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（Ｈ、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基である。さらに、免疫原性タンパク質またはポリペプチド分子あるいはタンパク質、ポリペプチド分子または標識（これは、上記分子または標識と、またこの式を有する化合物とに対する、アミド、ジスルフィド、チオエーテルまたはエステル結合を介して誘導体化されている）の一般的形態は、以下の通りである：ここで、Pは、抗原性タンパク質または抗原性ポリペプチドあるいはタンパク質、ポリペプチドまたは標識であり；ここで、ｘは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、Rは、以下の１つを含む連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（HN、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基であり；ここで、Bは、最終的にタンパク質、ポリペプチドまたは標識に結合し、以下からなる群より選択される連結基である：ここで、Zは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有する連結基であり、そして分枝鎖状または直鎖状であり得る。一般に、本発明の化合物はまた以下の式を有する：ここで、R'は、０〜５個の炭素原子を有する、飽和脂肪族基または不飽和脂肪族基であるか；（または、R'が０の場合は水素である）。ここで、Rは以下の１つを含む連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基である。さらに、免疫原性タンパク質またはポリペプチド分子あるいはタンパク質またはポリペプチド分子または標識（これは、上記分子または標識と、またこの式を有する化合物とに対する、アミド、ジスルフィド、チオエーテルまたはエステル結合を介して誘導体化されている）の一般的形態は、以下の通りである：ここで、Pは、抗原性タンパク質または抗原性ポリペプチドあるいはタンパク質、ポリペプチドまたは標識であり；ここで、ｘは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、R'は、０〜５個の炭素原子を有する、飽和脂肪族基または不飽和脂肪族基である。ここで、Rは、以下の１つを含む連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基である。ここで、Bは、最終的にタンパク質、ポリペプチドまたは標識に結合し、以下からなる群より選択される連結基である：ここで、Zは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（heterocarbo n）（NH、Ｏ、Ｓ）を有する連結基であり、そして分枝鎖状または直鎖状であり得る。一般に、本発明の化合物はまた以下の式を有する：ここで、Rは、以下の１つを有する、飽和または不飽和の連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基である。さらに、免疫原性タンパク質またはポリペプチド分子あるいはタンパク質、ポリペプチド分子または標識（これは、上記分子または標識と、またこの式を有する化合物とに対する、アミド、ジスルフィド、チオエーテルまたはエステル結合を介して誘導体化されている）の一般的形態は、以下の通りである：ここで、Pは、抗原性タンパク質または抗原性ポリペプチドあるいはタンパク質、ポリペプチドまたは標識であり；ここで、ｘは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、Rは、以下の１つを含む連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有する連結基であり、そして分枝鎖状または直鎖状であり；ここで、Bは、最終的にタンパク質、ポリペプチドまたは標識に結合し、以下からなる群より選択される連結基である：ここで、Zは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基であり得る。一般に、本発明の化合物はまた、以下の式を有する：ここで、R'は、-CH₃または-CH₂CH₃である。ここで、Rは、以下の１つを含む、飽和または不飽和の連結基である：さらに、免疫原性タンパク質またはポリペプチド分子あるいはタンパク質、ポリペプチド分子または標識（これは、上記分子または標識と、またこの式を有する化合物とに対する、アミドまたはエステル結合を介して誘導体化されている）は、以下の通りである：ここで、Pは、抗原性タンパク質または抗原性ポリペプチドあるいはタンパク質、ポリペプチドまたは標識であり；ここで、ｘは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、R'は、-CH₃または-CH₂CH₃であり；ここで、Rは、以下の１つを含む連結基である：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有し、分枝鎖状または直鎖状のいずれかの連結基であり；ここで、Bは、最終的にタンパク質、ポリペプチドまたは標識に結合し、以下からなる群より選択される連結基である：ここで，Zは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有する連結基であり、そして分枝鎖状または直鎖状であり得る。本発明の好適な（ベストモードの）化合物は、以下の式を有する：ここで、Rは、以下の１つを含む連結基である：さらに、好適な（ベストモードの）免疫原性タンパク質またはポリペプチド分子あるいはタンパク質、ポリペプチド分子または標識（上記分子または標識と、この式を有する化合物とに対する、アミドまたはエステル結合を介して誘導体化されている）は、以下の通りである：ここで、Pは、抗原性タンパク質または抗原性ポリペプチドあるいはタンパク質、ポリペプチドまたは標識であり；ここで、ｘは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、Zは、１〜20個の炭素原子および０〜10個のヘテロ原子（NH、Ｏ、Ｓ）を有する連結基であり、そして分枝鎖状または直鎖状であり得る。特に興味深いのは、メタドンのエチルケト基をチオエステル官能基を有する連結基で置換することによって合成されるメタドン誘導体である。メタドン誘導体はまた、ノルメタドン前駆体の２級アミンのアルキル化またはアシル化によって合成され得る。アルキル化反応は、種々の鎖長のハロゲン化アルキルカルボン酸を用いて行われ得、例えば、3-ヨードプロピオン酸またはエチル-3-ヨードプロピオネートが反応して、N-アルキル化カルボン酸メタドン誘導体を形成し得る。これは、次いで、アミノアルキルチオールエステル（例えば、ホモシステインチオラクトン）とさらに反応してメタドンのチオールエステル誘導体を合成し得る。アシル化反応もまた、ノルメタドンと種々の鎖長のアルキルチオエステルカルボン酸（例えば、3-アセチルチオプロピオン酸）とを用いて行われ、メタドンのアミドチオエステル誘導体を合成し得る。メタドン代謝産物（例えば、EDDPおよびEMDP）への連結アームの結合は、それぞれ、ピロリジンおよびピロリン環の誘導体化を経て行われ得る。EDDP分子のチオールエステル誘導体を合成する場合、例えば、メタドンのエチルケト官能基の、アルキルカルボン酸への加工（実施例２）、またはアルキルチオエステルへの加工（実施例３）がまず行われ、次いで、メタドンチオエステル誘導体がノルメタドンチオエステル誘導体に転換され、その結果、２級アミンのシッフ塩基およびケト官能基が形成され得る。さらに、シッフ塩基の、不飽和アルキル置換体への異性化（これは、EDDP構造を模倣する）は、次いで、それぞれ、EDDPの2エチレンアルキルカルボン酸誘導体（図１）またはEDDPの2-エチレンアルキルチオエステル誘導体（図２）を形成する。EDDPのエチレンカルボン酸誘導体（図１）は、アミノアルキルチオエステル（例えば、ホモシステインチオラクトン）とさらに反応し、EDDPのチオエステル誘導体を形成し得る（図２）。本発明の別の局面では、EMDPのチオエステル誘導体の合成が達成され得る。EM DPのシッフ塩基を、例えば、シアノ水素化ホウ酸ナトリウムで還元し、そして得られたEMDP誘導体の２級アミンは、種々の鎖長のハロゲン化アルキルカルボン酸（例えば、3-ヨードプロピオン酸）でアルキル化されて、EMDP誘導体のN-アルキル化カルボン酸（これは、アミノアルキルチオエステル（例えば、ホモシステインチオラクトン）とさらに反応し、EMDPのチオエステル誘導体を合成し得る（図３））を形成し得るか、または種々の鎖長のカルボン酸アルキルチオエステル（例えば、3-アセチルチオプロピオン酸）でアシル化されて、EMDPのチオエステル誘導体を形成し得る（図４）。得られたメタドンまたはメタドン代謝産物誘導体のチオエステルは、希塩基（例えば、0.01M水酸化カリウム）中で加水分解し、チオール反応性基（例えば、マレイミド、ハロゲン化アルキルまたはチオール）と反応するチオール基を生成する。当業者は、本明細書中に記載される合成ストラテジーの多様性を認識し得る。これらの化合物は、チオールまたはチオールエステルとして合成され、その結果、タンパク質、ポリペプチドまたは標識との共有結合は、穏やかな条件下（例えば、pH７のタンパク質溶液中で）で容易に起こり得る。タンパク質、ポリペプチドまたは標識を、マレイミドまたはハロゲン化アルキルまたはチオールを分子に組込む試薬と反応させる。これらの試薬およびこれらを使用するための方法は、 Pierce（Rockford、IL）から入手可能である。例えば、タンパク質、ポリペプチドまたは標識上にマレイミド基を組み込むために、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スクシンイミジル 4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）またはm-マレイミドベンゾイル-N -ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を使用し得る。タンパク質、ポリペプチドまたは標識にハロゲン化アルキルを導入するために、N-スクシンイミジル (4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB）（これもまた、Pierceから入手可能）を使用し得る。タンパク質、ポリペプチドまたは標識にチオール基を導入するために、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）（これもまた、Pierceから入手可能）を使用し得る。チオール反応性基（例えば、マレイミド、ハロゲン化アルキルまたはチオール）を、薬物チオールとの反応の前に、タンパク質、ポリペプチドまたは標識に組込み得るが、薬物チオールはまた、タンパク質、ポリペプチドまたは標識との反応の前に、チオール反応性化合物と反応し得る。また、種々の長さのビス-マレイミド化合物が、チオールを含有するタンパク質、ポリペプチドまたは標識と反応し、メタドン誘導体と共有結合し得る。逆に、ビス-マレイミド化合物は、チオール誘導体と反応し、次いで、チオール含有タンパク質、ポリペプチドまたは標識と反応し得る。通常、ビス-マレイミドは、Pierceからのビス-マレイミドヘキサン、Sigma Ch emical Co.（St．Louis，MO）からのN,N'-ビス(3マレイミドプロピオニル)-2-ヒドロキシ-1,3-プロパンジアミン、およびAldrich Chem．Co.（Milwaukee，WI）からの1,1'-(メチレンジ-4,1-フェニレン)-ビスマレインイミドである。これらのチオールメタドン誘導体はまた、分子に誘導体を組み込む手段として、チオール含有ポリペプチド、タンパク質または標識分子と共にジスルフィドを形成し得る。抗体の生成、およびイムノアッセイプロセスにおける使用のための、薬物誘導体、免疫原ならびにタンパク質およびポリペプチド結合体の使用は、例えば、米国特許第4,067,774号、同第4,952,336号、同第5,028,535号および同第5,089,391 号に記載される。実験実施例実施例１ 2,2- ジフェニル-4-ジメチルアミノペンタンニトリルの調製水素化ナトリウム（オイル中80%分散体の19.5g、0.65mol）を、1Lの３ッ口丸底フラスコに添加し、そしてヘキサン（150mL）で２回粉末化して、オイルを除去した。テトラヒドロフラン（THF）（150mL）をこのフラスコに添加し、次いで、撹拌子を入れた。得られた懸濁液をアルゴン下で撹拌しながら、THF（150mL）中のジフェニルアセトニトリル（58g、0.3mol）の溶液を、滴下漏斗を通して、4 0分間にわたって滴下した。添加の間、発熱するので、冷水浴中でフラスコを冷却する必要があった。室温で、さらに10分間撹拌した後、フラスコに還流凝縮器を備え付け、そして氷浴中に配置した。得られた緑色懸濁液を、次いで、2-ジメチルアミノイソプロピルクロライド塩酸塩（54g、0.34mol）を、一部ずつ分けて、添加漏斗を通して、15分間にわたって撹拌しながら処理した。黄色混合物をマントルヒーター上で５時間還流すると、その間に濃密になった。次いで、これを薄めた。冷却後、THFをエバポレートし、残渣の黄色固体を、水（150mL）で処理し、そしてエーテルで抽出した（２×150mL）。抽出物を水で洗浄し（３×100mL）、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥した。エーテルをエバポレートした後、濃密なオイル状のオレンジ色の残渣を、氷冷ヘキサンで処理し、白色固体を得た。内容物を氷/水浴中で30分間撹拌し、そして固体を濾過して集め、氷冷ヘキサンで洗浄した。真空デシケーター中で乾燥した後、44.9g（5 4%）の白色固体を得た。融点88-89℃。この生成物をさらに精製することなく、つぎの工程に使用した。実施例２ 7,7- ジフェニル-6-ケト-9-ジメチルアミノデカン酸塩酸塩の調製この化合物は文献（米国特許第3,843,696号）の手順に従って調製され、前工程からの2,2-ジフェニル4-ジメチルアミノペンタンニトリル（10g）を用いて出発し、8.5gの生成物を得た。実施例３ 1-N-(2- ブチロチオラクトン)アミド-6,6-ジフェニル-5-ケト-8-ジメチルアミノノナン（dimethylaminononanane）の調製乾燥DMF（100mL）中のホモシステインチオラクトン塩酸塩（1.84g、11.96mmol ）の撹拌された懸濁液に、ピリジン（3mL、37.08mmol）を添加した。10分後、完全に溶液になった時、乾燥DMF（20mL）中の7,7-ジフェニル-6-ケト-9-ジメチルアミノデカン酸塩酸塩（5g、11.96mmol）の溶液を添加し、次いで、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（2.52g、13.16mmol）を添加した。黄色溶液をアルゴン下で５時間撹拌した。DMFをエバポレートし、残渣のオイルを水（100mL）で処理し、そして塩化メチレンで抽出した（３×50mL）。抽出物をエバポレートし、コハク色のオイルを得た。これを、0.5Mリン酸カリウム/0.1Mホウ酸カリウムpH７緩衝液（100mL）で処理し、そして酢酸エチルで抽出した（３×50mL）。抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてエバポレートした。ゴム状残渣を、エーテル（100mL）で処理し、脱色木炭（decol orizing charcoal）を添加し、そして混合物をセライトを通して濾過した。薄黄色の濾液を、撹拌しながら、エーテル（10mL）中の塩化水素の溶液（IM）を滴下してpH１〜２まで酸性化した。得られたクリーム色の固体（これは沈殿した）を濾過して集め、エーテル（50mL）で洗浄した。真空デシケーター中で乾燥した後、クリーム色の吸湿性固体を得た（4.1g）。これは85%の純度であった（HPLCより）。この生成物の少量（60mg）を、C18逆相セミ分取（semi-preparative）HPLCカラムを用い、20mMリン酸カリウムpH4.6/メタノール（50分間にわたって、0-100% ）で溶出し精製した。生成物の画分（34-37分で溶出したもの）をエバポレートした。残渣を塩化メチレン（5mL）で処理し、そして不溶性緩衝性塩（buffer salt）から濾過した。濾液をエバポレートし、真空乾燥後、35mgの1-N-(2-ブチロチオラクトン)アミド-6,6-ジフェニル-5-ケト-8-ジメチルアミノノナンリン酸塩を白色の吸湿性固体として得た。この生成物の純度はここで、100％である（HPLCより）。 NMR（DMSO d-6）δ8.08(m，1H)，δ7.32(m，10H)，δ2.29(s，6H)，δ1.20(m ，4H)，δ0.43(d，3H)実施例４ 1-N-( システイン)アミド-6-6-ジフェニル-5-ケト-8-ジメチルアミノノナンの調製 1-N-(2-ブチロチオラクトン)アミド-6-6-ジフェニル-5-ケト-8-ジメチルアミノノナン（1.0mg、1.6μmol）をジメチルホルムアミド/水（70/30(v/v)）（65μ L）中に溶解した。1N水酸化カリウム溶液（16μL）を添加し、そして溶液を室温で３分間静置した。0.5Mリン酸カリウム/0.1Mホウ酸カリウムpH７緩衝液（これは、次いで、塩酸中で1Nとした）を、直ちに、pH７が達成されるまで、５μLインクリメント中に添加した。溶液中の表題化合物を使用し、溶液中で遊離しているか、あるいはタンパク質、ポリペプチドまたは標識と結合しているチオール反応性基（例えば、マレイミド、ハロゲン化アルキルまたはチオール）と反応させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｄ 333/36 Ｃ０７Ｄ 333/36 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 14/705 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/531 33/531 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．次式の化合物であって：ここで、Rが以下の基から選択される連結基であり：ここで、Aが１〜20個の炭素および０〜10個のヘテロ原子（NH、O、S）を有する分枝鎖または直鎖の連結基である、化合物。２．次式の化合物へと誘導体化された、免疫原性タンパク質もしくは免疫原性ポリペプチド分子またはタンパク質もしくはポリペプチド分子あるいは標識であって：ここで、Pは、抗原性タンパク質もしくは抗原性ポリペプチドまたはタンパク質、ポリペプチドあるいは標識であり；ここで、xは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、Rは、以下からなる群から選択される連結基であり；およびここで、Aは、１〜20個の炭素および0〜10個のヘテロ原子（NH、O、S）を有する分枝鎖または直鎖の連結基であり；ここで、Bは、タンパク質、ポリペプチド、または標識に最終的に結合する、以下の群から選択される連結基であり；ここで、Zは、1〜20個の炭素および0〜10個のヘテロ原子（NH、O、S）を有する連結基であり、そして分枝鎖または直鎖であり得る。３．請求項２に記載の化合物を含む抗原に応答して調製される、レセプター。４．次式の化合物であって：ここで、R'が、０〜5個の炭素原子を有する飽和または不飽和の脂肪族基（またはR'が0個の炭素の場合、水素）であり；ここで、Rが、以下の群から選択される連結基であり；ここで、Aが、１〜20個の炭素原子、および０〜10個のヘテロ原子（NH、O、S ）を有する分枝鎖または直鎖の連結基である、化合物。５．次式の化合物へと誘導体化された、免疫原性タンパク質もしくは免疫原性ポリペプチド分子またはタンパク質もしくはポリペプチド分子あるいは標識であって：ここで、Pは、抗原性タンパク質もしくは抗原性ポリペプチドまたはタンパク質、ポリペプチド、あるいは標識であり；ここで、xは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、R'は、０〜５個の間の炭素原子を有する飽和または不飽和の脂肪族基（または、R'が０個の炭素の場合、水素）であり；ここで、Rは、以下の基から選択される連結基であり：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子、および０〜10個のヘテロ原子（NH、O、S ）を有する分枝鎖または直鎖の連結基であり；ここで、Bは、タンパク質、ポリペプチド、または標識に最終的に結合する、以下の群から選択される連結基であり：ここで、Zは、１〜20個の炭素原子、および０〜10個のヘテロ原子（NH、O、 S）を有する連結基であり、分枝鎖または直鎖のいずれかであり得る。６．請求項５に記載の化合物を含有する抗原に応答して調製される、レセプター。７．次式の化合物であって：ここで、Rが、以下の群から選択される飽和または不飽和の連結基であり：ここで、Aが、１〜20個の炭素原子、および０〜10個のヘテロ原子（NH、O、S ）を有する連結基であり、分枝鎖または直鎖のいずれかである、化合物。８．次式の化合物へと誘導体化された、免疫原性タンパク質もしくは免疫原性ポリペプチド分子またはタンパク質もしくはポリペプチド分子あるいは標識であって：ここで、Pは、抗原性タンパク質もしくは抗原性ポリペプチドまたはタンパク質、ポリペプチド、あるいは標識であり；ここで、xは、少なくとも１であり、かつ100を越えず；ここで、Rは、以下からなる群より選択される連結基であって：ここで、Aは、１〜20個の炭素原子、および０〜10ヘテロ原子（NH、O、S）を有する連結基であり、分枝鎖または直鎖のいずれかであり；ここで、Bは、タンパク質、ポリペプチド、または標識に最終的に結合する、以下からなる群より選択される連結基であって：ここで、Zは、１〜20個の炭素原子、および０〜10個のヘテロ原子（NH、O、S ）を有する連結基であり、分枝鎖または直鎖のいずれかであり得る。９．請求項８に記載の化合物を含む抗原に応答して調製される、レセプター。１０．次式の化合物であって：ここで、Rが、以下の式：からなる群から選択される連結基である、化合物。１１．次式の化合物へと誘導体化された、免疫原性タンパク質もしくは免疫原性ポリペプチド分子またはタンパク質もしくはポリペプチド分子あるいは標識：