JPH04356483A - 酸開裂性架橋試薬 - Google Patents
酸開裂性架橋試薬Info
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D207/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D207/444—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5
- C07D207/448—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide
- C07D207/452—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, directly attached to the ring nitrogen atom
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【0001】
【発明の背景】本発明はアミノ基を有する物質の液体媒
質への制御された放出及びかかる放出において用いる化
合物に関する。
質への制御された放出及びかかる放出において用いる化
合物に関する。
【0002】アミノ含有物質の液体媒質への放出を制御
することが望ましい状態が多数有る。例として、細胞集
団或は細胞集団の内の特定部分へのアミノ基含有薬剤又
は細胞毒素の放出を制御するのが望ましいことがあろう
。また、例えば、ペプチド或はタンパク質等の大きなア
ミノ基含有分子の複合体における空間的関係を分析する
際に、種々の架橋タンパク質或はペプチドの開裂を制御
するのが望ましいこともあろう。[「ペプチド」なる用
語は、本出願中、タンパク質を、いかに大きいものであ
っても、並びに短い鎖のペプチドを含むのに用いる。]
することが望ましい状態が多数有る。例として、細胞集
団或は細胞集団の内の特定部分へのアミノ基含有薬剤又
は細胞毒素の放出を制御するのが望ましいことがあろう
。また、例えば、ペプチド或はタンパク質等の大きなア
ミノ基含有分子の複合体における空間的関係を分析する
際に、種々の架橋タンパク質或はペプチドの開裂を制御
するのが望ましいこともあろう。[「ペプチド」なる用
語は、本出願中、タンパク質を、いかに大きいものであ
っても、並びに短い鎖のペプチドを含むのに用いる。]
【0003】制御した放出が望ましい特定の状態の1つ
は、生物学的に活性な化合物を細胞膜を通して内細胞構
造に送達し、例えば、そこで化合物は細胞膜の外側媒質
中に捕えられるならば低い又は減じた作用を有するが、
細胞内で一担放出されれば一層効力が出る。
は、生物学的に活性な化合物を細胞膜を通して内細胞構
造に送達し、例えば、そこで化合物は細胞膜の外側媒質
中に捕えられるならば低い又は減じた作用を有するが、
細胞内で一担放出されれば一層効力が出る。
【0004】また、生物学的に活性な化合物を異種細胞
集団中の選択細胞に送達することも望ましい。例えば、
ウィルス感染細胞或は変化した細胞或は悪性細胞等の病
気にかかった或は感染した細胞を治療する際に、細胞毒
素を病気にかかった細胞或は悪性の細胞に送達すること
が望ましく、正常の細胞に送達することは望ましくない
。
集団中の選択細胞に送達することも望ましい。例えば、
ウィルス感染細胞或は変化した細胞或は悪性細胞等の病
気にかかった或は感染した細胞を治療する際に、細胞毒
素を病気にかかった細胞或は悪性の細胞に送達すること
が望ましく、正常の細胞に送達することは望ましくない
。
【0005】悪性細胞を生物学的に活性な化合物の目標
にするのに開示される1つのアプローチは、抗体−毒素
結合体(conjugate )を用いる。抗体は悪性
細胞に対して特異でありかつ毒素を悪性細胞に送達する
。このような系は、有効であるためには、標的細胞への
選択性の高い毒素を、活性物質の効能を不必要に低減さ
せないで送達すべきである。これらの問題は、目標が生
体内で正常の細胞を害しないで感染した或は病気にかか
った細胞を破壊することである場合に特に重要である。
にするのに開示される1つのアプローチは、抗体−毒素
結合体(conjugate )を用いる。抗体は悪性
細胞に対して特異でありかつ毒素を悪性細胞に送達する
。このような系は、有効であるためには、標的細胞への
選択性の高い毒素を、活性物質の効能を不必要に低減さ
せないで送達すべきである。これらの問題は、目標が生
体内で正常の細胞を害しないで感染した或は病気にかか
った細胞を破壊することである場合に特に重要である。
【0006】種々の開裂性二官能価の架橋剤が知られて
いる。ランバート(Lambert )等(1981年
)のJ. Mol. Biol. 149巻、451〜
476頁及びワング(Wang)等(1974年)のI
sr. J. Chem. 12巻、375〜389頁
は、開裂性ジスルフィド結合を含有する二官能価架橋試
薬を開示している。この試薬は生化学系の特性を示すの
に用いられる。ルッター(Lutter)等(1974
年)のFEBS Letters 48巻、288〜
292頁は、過ヨウ素酸塩酸化によって開裂することの
できるvic−グリコール結合を有する二官能価架橋試
薬を開示している。
いる。ランバート(Lambert )等(1981年
)のJ. Mol. Biol. 149巻、451〜
476頁及びワング(Wang)等(1974年)のI
sr. J. Chem. 12巻、375〜389頁
は、開裂性ジスルフィド結合を含有する二官能価架橋試
薬を開示している。この試薬は生化学系の特性を示すの
に用いられる。ルッター(Lutter)等(1974
年)のFEBS Letters 48巻、288〜
292頁は、過ヨウ素酸塩酸化によって開裂することの
できるvic−グリコール結合を有する二官能価架橋試
薬を開示している。
【0007】カールソン(Carlsson)等(19
78年)のBiochem J. 173巻、723
〜737頁は、二官能価試薬N−スクシンイミジル−3
−(2−ピリジルジチオ)プロピオネートを用いて2つ
の異るタンパク質間にジスルフィド結合を形成する手順
について開示している。
78年)のBiochem J. 173巻、723
〜737頁は、二官能価試薬N−スクシンイミジル−3
−(2−ピリジルジチオ)プロピオネートを用いて2つ
の異るタンパク質間にジスルフィド結合を形成する手順
について開示している。
【0008】より詳細には、ある種のモノクローナル抗
体、毒素及びそれらの結合体が知られている。ビテッタ
(Vitetta )等(1983年)、サイエンス、
219巻、644〜650頁及びエドワーズ(Edwa
rds )(1983年)、Pharmacol、 T
her. 23巻、147〜177頁は、細胞−表面
構造に特異な毒素とモノクロナール抗体とのジスルフィ
ド結合した結合体を開示している。 これらの結合体を用いて毒素を抗体が認識する表面構造
を有する特異細胞を標的にしている。
体、毒素及びそれらの結合体が知られている。ビテッタ
(Vitetta )等(1983年)、サイエンス、
219巻、644〜650頁及びエドワーズ(Edwa
rds )(1983年)、Pharmacol、 T
her. 23巻、147〜177頁は、細胞−表面
構造に特異な毒素とモノクロナール抗体とのジスルフィ
ド結合した結合体を開示している。 これらの結合体を用いて毒素を抗体が認識する表面構造
を有する特異細胞を標的にしている。
【0009】ラマクリシュナン(Ramakrishn
an)等(1984年)キャンサーリサーチ、44巻、
1398〜1404頁は、アメリカヤマゴボウ(pok
ewood)抗ウィルス性タンパク質(PAP)をモノ
クローナル抗体である抗チミン(Thy )1.1に接
合させることを開示している。この結合体を用いてチミ
ン1.1−陽性標的白血病細胞におけるタンパク質合成
を選択的に抑制している。 この結合体を形成するのに用いるリンカーはN−スクシ
ンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネー
トである。ジスルフィド結合を開裂すれば、遊離のPA
P毒素を産生する。
an)等(1984年)キャンサーリサーチ、44巻、
1398〜1404頁は、アメリカヤマゴボウ(pok
ewood)抗ウィルス性タンパク質(PAP)をモノ
クローナル抗体である抗チミン(Thy )1.1に接
合させることを開示している。この結合体を用いてチミ
ン1.1−陽性標的白血病細胞におけるタンパク質合成
を選択的に抑制している。 この結合体を形成するのに用いるリンカーはN−スクシ
ンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネー
トである。ジスルフィド結合を開裂すれば、遊離のPA
P毒素を産生する。
【0010】リッツ(Ritz)等(1980年)、ネ
ーチャー、283巻、583〜585頁は、通常の急性
リンパ芽球白血病抗原に特異なモノクローナル抗体(J
5)を開示している。
ーチャー、283巻、583〜585頁は、通常の急性
リンパ芽球白血病抗原に特異なモノクローナル抗体(J
5)を開示している。
【0011】バービエリ(Barbieri)等(19
82年)バイオケミストリージャーナル、203巻、5
5〜59頁はアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質
−S(「PAP−S」)として知られる抗ウィルスタン
パク質の精製及び部分特性表示について開示している。
82年)バイオケミストリージャーナル、203巻、5
5〜59頁はアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質
−S(「PAP−S」)として知られる抗ウィルスタン
パク質の精製及び部分特性表示について開示している。
【0012】スターペ(Stirpe)等(1980年
)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J.
Biol. Chem.),255巻、6947〜6
953頁はタンパク質毒素であるゲロニン(gelon
in )の製造法について開示している。
)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J.
Biol. Chem.),255巻、6947〜6
953頁はタンパク質毒素であるゲロニン(gelon
in )の製造法について開示している。
【0013】ネビル(Neville )等の米国特許
4,359,457号は抗チミン1.2モノクローナル
抗体とリシン(ricin )との結合体をリンパ腫に
対する腫瘍抑制組成物として使用することを開示してい
る。使用する結合剤はm−マレイミドベンゾイル−N−
ヒドロキシスクシンイミドである。
4,359,457号は抗チミン1.2モノクローナル
抗体とリシン(ricin )との結合体をリンパ腫に
対する腫瘍抑制組成物として使用することを開示してい
る。使用する結合剤はm−マレイミドベンゾイル−N−
ヒドロキシスクシンイミドである。
【0014】上記のアプローチは抗体−毒素結合体の毒
性に依存するか、或は毒素の放出を標的細胞に送達する
前に一時的に制御し及び空間的に回避するのが困難であ
り得る現象であるジスルフィド結合開裂に依存する。
性に依存するか、或は毒素の放出を標的細胞に送達する
前に一時的に制御し及び空間的に回避するのが困難であ
り得る現象であるジスルフィド結合開裂に依存する。
【0015】カービィ(Kirby )等(1970年
)、Proc. Biochem. Soc. Sym
p. 31巻、99〜103頁は、マレイン酸アミドが
pH3より低い所で急速に加水分解され、かつマレイン
アミド酸の置換がその速度を増大させ、t−ブチル置換
基が最大の増加を与え、メチル置換基が最小の増加を与
えることを開示している。
)、Proc. Biochem. Soc. Sym
p. 31巻、99〜103頁は、マレイン酸アミドが
pH3より低い所で急速に加水分解され、かつマレイン
アミド酸の置換がその速度を増大させ、t−ブチル置換
基が最大の増加を与え、メチル置換基が最小の増加を与
えることを開示している。
【0016】ジクソン(Dixon )等(1968年
)、Biochem J.109巻、312〜314頁
は無水2−メチルマレイン酸(「シトラコン酸」)をブ
ロッキング剤として使用するアミノ基の可逆ブロッキン
グについて開示している。シトラコニル残基とインシュ
リンのリジン残基との間のアミド基はpH6.5におい
て開裂されなかった。pHを3.5に下げ一晩中20℃
においた場合にブロッキング基の全放出があり、インシ
ュリンは変わらないままであった。
)、Biochem J.109巻、312〜314頁
は無水2−メチルマレイン酸(「シトラコン酸」)をブ
ロッキング剤として使用するアミノ基の可逆ブロッキン
グについて開示している。シトラコニル残基とインシュ
リンのリジン残基との間のアミド基はpH6.5におい
て開裂されなかった。pHを3.5に下げ一晩中20℃
においた場合にブロッキング基の全放出があり、インシ
ュリンは変わらないままであった。
【0017】
【発明の要約】温和な酸性条件下でアミノ基含有物質の
制御された放出を可能にする一群の架橋剤を見出した。 発明は、一面において、アミノ基含有物質のアミノ窒素
と第二化合物のスルフヒドリル機能との間の酸開裂性結
合を形成するのに適した架橋試薬を特徴とする。架橋試
薬は下記の単位:
制御された放出を可能にする一群の架橋剤を見出した。 発明は、一面において、アミノ基含有物質のアミノ窒素
と第二化合物のスルフヒドリル機能との間の酸開裂性結
合を形成するのに適した架橋試薬を特徴とする。架橋試
薬は下記の単位:
【0018】
【化10】
(式中、R1 及びR2 は独立に、H,C5 又はそ
れ以下のアルキル基から選び、Aは橋(ブリッジ)単位
を含む)を含む。或は、架橋試薬は下記の単位:
れ以下のアルキル基から選び、Aは橋(ブリッジ)単位
を含む)を含む。或は、架橋試薬は下記の単位:
【00
19】
19】
【化11】
(式中、R2 はH,C5 又はそれ以下のアルキル基
から選び、Aはブリッジ単位を含み、s=2〜5である
)を含む。
から選び、Aはブリッジ単位を含み、s=2〜5である
)を含む。
【0020】発明は、第2の面において、アミノ基含有
化合物をスルフヒドリル基含有化合物と架橋させて生じ
る架橋ヘテロダイマー複合体を特徴とする。アミノ基含
有化合物は複合体から、アミド結合を加水分解してアミ
ノ基含有化合物を再生する程に媒質のpHを下げること
によって放出される。発明の初めの2つの面の好ましい
実施態様において、ブリッジは下記の単位A:
化合物をスルフヒドリル基含有化合物と架橋させて生じ
る架橋ヘテロダイマー複合体を特徴とする。アミノ基含
有化合物は複合体から、アミド結合を加水分解してアミ
ノ基含有化合物を再生する程に媒質のpHを下げること
によって放出される。発明の初めの2つの面の好ましい
実施態様において、ブリッジは下記の単位A:
【002
1】
1】
【化12】
(ここで、R3 −R6 は独立にH、ハロゲン、C5
又はそれ以下のアルコキシ及びアルキル基、第三アミン
から選び;Bはマレイミド機能へのリンカーである)を
含む。R3 −R6 及びBは、単位Aの環に結合され
たイオウが対応するチオフェノール化合物において、A
においてスルフィド基を形成する間にOH− によって
引き起こされる競争副反応を回避するような十分に低い
pKaを有するように選ぶ。例えば、チオフェノールの
pKaは10.0より低い。
又はそれ以下のアルコキシ及びアルキル基、第三アミン
から選び;Bはマレイミド機能へのリンカーである)を
含む。R3 −R6 及びBは、単位Aの環に結合され
たイオウが対応するチオフェノール化合物において、A
においてスルフィド基を形成する間にOH− によって
引き起こされる競争副反応を回避するような十分に低い
pKaを有するように選ぶ。例えば、チオフェノールの
pKaは10.0より低い。
【0022】また、好ましい実施態様において、Aにお
ける芳香族環のスルフィド機能を(CH2 )k (k
は1〜5である)を含む基によってマレイン酸機能に結
合させる。最も好ましくは、Bはアミド機能であってそ
の窒素をAの芳香族環にスルフィド機能に対しパラに結
合させかつそのカルボニル機能を(CH2 )q (q
=1〜5である)或はアリール基[最も好ましくは、マ
レイミド結合がカルボニル結合に対しメタ或はパラであ
る未置換アリール基]によってマレイミド基の窒素に結
合させたものを含む。
ける芳香族環のスルフィド機能を(CH2 )k (k
は1〜5である)を含む基によってマレイン酸機能に結
合させる。最も好ましくは、Bはアミド機能であってそ
の窒素をAの芳香族環にスルフィド機能に対しパラに結
合させかつそのカルボニル機能を(CH2 )q (q
=1〜5である)或はアリール基[最も好ましくは、マ
レイミド結合がカルボニル結合に対しメタ或はパラであ
る未置換アリール基]によってマレイミド基の窒素に結
合させたものを含む。
【0023】また、生成した架橋複合体の好ましい実施
態様において、アミノ基含有物質は選択細胞に送達され
るべき生物学的に活性な物質であり、かつスルフヒドリ
ル基含有化合物はそれらの細胞について選択性の結合物
を含む。化合物は、発明の第4の面に関連して下記に一
層完全に説明する通りの活性物質を選択細胞に送達する
方法で用いる。
態様において、アミノ基含有物質は選択細胞に送達され
るべき生物学的に活性な物質であり、かつスルフヒドリ
ル基含有化合物はそれらの細胞について選択性の結合物
を含む。化合物は、発明の第4の面に関連して下記に一
層完全に説明する通りの活性物質を選択細胞に送達する
方法で用いる。
【0024】発明は、第3の面において、チオフェノー
ル含有機能を含む化合物に活性化置換マレイン酸誘導体
を結合させる置換反応によって架橋剤を合成する方法を
特徴とする。反応はチオフェノールのスルフヒドリル基
をイオン化し、それによって競争SN2 ’置換反応を
回避する程に高くかつOH− の競争反応を回避する程
に低いpHにおいて行う。次いで、生成した中間体をマ
レイミド機能に結合させる。合成方法の好適な実施態様
において、置換反応をpH約9.5〜11.5において
行い、最も好ましくはpHは10.5〜11.5、又は
約11.0である。また、好適な実施態様において、チ
オフェノール含有機能はアミン窒素を含むアミド結合に
よってマレイミド機能に結合されるアミンを含む。
ル含有機能を含む化合物に活性化置換マレイン酸誘導体
を結合させる置換反応によって架橋剤を合成する方法を
特徴とする。反応はチオフェノールのスルフヒドリル基
をイオン化し、それによって競争SN2 ’置換反応を
回避する程に高くかつOH− の競争反応を回避する程
に低いpHにおいて行う。次いで、生成した中間体をマ
レイミド機能に結合させる。合成方法の好適な実施態様
において、置換反応をpH約9.5〜11.5において
行い、最も好ましくはpHは10.5〜11.5、又は
約11.0である。また、好適な実施態様において、チ
オフェノール含有機能はアミン窒素を含むアミド結合に
よってマレイミド機能に結合されるアミンを含む。
【0025】発明は、第4の面において、活性物質を選
択細胞の細胞−表面受容体に特異なスルフヒドリル−機
能化細胞−結合物に架橋させて形成した複合体に細胞を
露呈させることによって、生物学的に活性なアミノ基含
有物質を異質細胞集団の選択部分に送達する方法を特徴
とする。化合物は選択的にそれらの細胞に結合し、かつ
活性物質と架橋のマレイン酸機能との間のアミド結合を
開裂する程に低いpHに暴露されて活性物質を複合体か
ら放出する。
択細胞の細胞−表面受容体に特異なスルフヒドリル−機
能化細胞−結合物に架橋させて形成した複合体に細胞を
露呈させることによって、生物学的に活性なアミノ基含
有物質を異質細胞集団の選択部分に送達する方法を特徴
とする。化合物は選択的にそれらの細胞に結合し、かつ
活性物質と架橋のマレイン酸機能との間のアミド結合を
開裂する程に低いpHに暴露されて活性物質を複合体か
ら放出する。
【0026】第4の面の好適な実施態様において、生物
学的に活性な物質はペプチド又はタンパク質であり、最
も好ましくはリボソームを不活性化してタンパク質合成
を不活性化する細胞毒性物質である。細胞結合物はJ5
抗体或はT3,T4,T11又はT12のT細胞表面抗
原に対する抗体等の細胞−表面抗原を認識する抗体、例
えばモノクローナル抗体である。
学的に活性な物質はペプチド又はタンパク質であり、最
も好ましくはリボソームを不活性化してタンパク質合成
を不活性化する細胞毒性物質である。細胞結合物はJ5
抗体或はT3,T4,T11又はT12のT細胞表面抗
原に対する抗体等の細胞−表面抗原を認識する抗体、例
えばモノクローナル抗体である。
【0027】また、好適な送達方法において、抗体は表
面抗原を含有する細胞の膜を横断して輸送されるもので
あり、そのため架橋複合体が細胞内に移送される。複合
体は一担細胞の中に入れば活性物質、例えばリボソーム
不活性化毒素を放出するのに十分な酸性度を自然に示す
特異な細胞画分に暴露され、こうして活性物質を有効か
つ選択的に放出する。
面抗原を含有する細胞の膜を横断して輸送されるもので
あり、そのため架橋複合体が細胞内に移送される。複合
体は一担細胞の中に入れば活性物質、例えばリボソーム
不活性化毒素を放出するのに十分な酸性度を自然に示す
特異な細胞画分に暴露され、こうして活性物質を有効か
つ選択的に放出する。
【0028】発明はアミノ基含有物質か或は液体媒質系
の他の成分のどちらかを変質させ得る酸化又は還元条件
又は極端なpH値を必要としない点で温和な注意深く制
御する条件下でアミノ基含有物質を液体媒質に送達する
ことを可能にする。その上、開裂は生体内系と一致する
程に温和であるだけでなく実際天然に起きる細胞内現象
によってもたらされるpHにおいて起きる。有利なこと
に、アミノ含有物質はそのpHにおいて確実に放出され
るが、より高いpH値において安定に結合される。好ま
しくは、アミノ置換基の放出はpH3.5〜5.5にお
いて、最も好ましくはpH4.0〜5.0、又は約4.
5において達成される。その上、架橋及び放出プロセス
はユニットをアミノ基含有物質に付加したり、或はアミ
ノ基含有物質からユニットを減じたりしない。
の他の成分のどちらかを変質させ得る酸化又は還元条件
又は極端なpH値を必要としない点で温和な注意深く制
御する条件下でアミノ基含有物質を液体媒質に送達する
ことを可能にする。その上、開裂は生体内系と一致する
程に温和であるだけでなく実際天然に起きる細胞内現象
によってもたらされるpHにおいて起きる。有利なこと
に、アミノ含有物質はそのpHにおいて確実に放出され
るが、より高いpH値において安定に結合される。好ま
しくは、アミノ置換基の放出はpH3.5〜5.5にお
いて、最も好ましくはpH4.0〜5.0、又は約4.
5において達成される。その上、架橋及び放出プロセス
はユニットをアミノ基含有物質に付加したり、或はアミ
ノ基含有物質からユニットを減じたりしない。
【0029】その他の特徴及び利点は下記の好適な実施
態様の説明及び請求の範囲の記載から明らかになるもの
と思う。
態様の説明及び請求の範囲の記載から明らかになるもの
と思う。
【0030】
【好適な実施態様の説明】今、発明の好適な実施態様の
説明にとりかかる。
説明にとりかかる。
【0031】発明の特に好ましい2つの実施態様がある
。1つは上述した通りに生物学的に活性なタンパク質又
はペプチドを細胞に送達する細胞送出(cell−de
livery)剤である。他方はリボソーム複合体又は
多ユニット酵素等の大きなアミノ基含有分子を1個又は
それ以上含む複合体を評価する道具である。複合体の架
橋部材によって、架橋成分を切り離し、次いで架橋成分
を分析するためにそれらの構造を変更しないで架橋成分
の結合を断つ(decouple)ことが可能である。 複合体の部材及び架橋物質の出現及び消失を分析するこ
とは、生命系の成分を評価し、かつそれによりこれらの
系の治療の効果及びこれらの系における異常を追跡する
道具を提供する。
。1つは上述した通りに生物学的に活性なタンパク質又
はペプチドを細胞に送達する細胞送出(cell−de
livery)剤である。他方はリボソーム複合体又は
多ユニット酵素等の大きなアミノ基含有分子を1個又は
それ以上含む複合体を評価する道具である。複合体の架
橋部材によって、架橋成分を切り離し、次いで架橋成分
を分析するためにそれらの構造を変更しないで架橋成分
の結合を断つ(decouple)ことが可能である。 複合体の部材及び架橋物質の出現及び消失を分析するこ
とは、生命系の成分を評価し、かつそれによりこれらの
系の治療の効果及びこれらの系における異常を追跡する
道具を提供する。
【0032】
【細胞送出実施態様】細胞に送達されるべき好ましい生
物学的に活性な物質はタンパク質又はペプチド薬剤又は
酵素である。特に好適な実施態様において、活性物質は
選択細胞に送達されるべき細胞毒素である。このような
毒素は上述しかつアービン(Irvin )(1975
年)、Pharmac. Ther. 21巻、37
1〜387頁におけるアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタ
ンパク質PAP、PAPII及びPAP−Sを含む。そ
の他のペプチド細胞毒素はリシンA鎖、アブリンA鎖、
モデシン(modeccin)A鎖並びにゲロニン及び
バービエリ(Barbieri)等(1982年)、C
ancer Surv 1巻、489〜520頁に記載
されているようなその他の単一鎖リボソーム不活性化タ
ンパク質を含む。
物学的に活性な物質はタンパク質又はペプチド薬剤又は
酵素である。特に好適な実施態様において、活性物質は
選択細胞に送達されるべき細胞毒素である。このような
毒素は上述しかつアービン(Irvin )(1975
年)、Pharmac. Ther. 21巻、37
1〜387頁におけるアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタ
ンパク質PAP、PAPII及びPAP−Sを含む。そ
の他のペプチド細胞毒素はリシンA鎖、アブリンA鎖、
モデシン(modeccin)A鎖並びにゲロニン及び
バービエリ(Barbieri)等(1982年)、C
ancer Surv 1巻、489〜520頁に記載
されているようなその他の単一鎖リボソーム不活性化タ
ンパク質を含む。
【0033】ペプチド毒素は試薬に容易に結合されかつ
細胞内に極めて微小な量で存在すれば細胞タンパク質合
成を抑制する極めて効力のある毒素であるが故に好まし
い。しかしながら、ペプチドでないその他のアミノ基含
有細胞毒素もまた発明の範囲内にある。かかる細胞毒素
又は細胞毒性薬剤の例はメルファラン、ブレオマイシン
、アドリアマイシン、ダウノマイシンである。
細胞内に極めて微小な量で存在すれば細胞タンパク質合
成を抑制する極めて効力のある毒素であるが故に好まし
い。しかしながら、ペプチドでないその他のアミノ基含
有細胞毒素もまた発明の範囲内にある。かかる細胞毒素
又は細胞毒性薬剤の例はメルファラン、ブレオマイシン
、アドリアマイシン、ダウノマイシンである。
【0034】上述した活性物質は、結合物を細胞表面の
特徴に結合させることによって選択細胞に送達する。好
適な結合物は細胞表面抗原に対する抗体である。特に好
適なものは、病気にかかった、感染した、トランスホー
ムした或は悪性の細胞に特異であるが正常の細胞に特異
でない細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体である
。特に、しかし排除するものでなく、それらは細胞によ
って取り上げられる抗体である。細胞による活性物質の
かなりの取り上げを可能にする十分な数の抗原が正常細
胞に存在しないならば、正常な(すなわち、非標的)細
胞が特異的な抗原を完全に欠くことは必要でない。
特徴に結合させることによって選択細胞に送達する。好
適な結合物は細胞表面抗原に対する抗体である。特に好
適なものは、病気にかかった、感染した、トランスホー
ムした或は悪性の細胞に特異であるが正常の細胞に特異
でない細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体である
。特に、しかし排除するものでなく、それらは細胞によ
って取り上げられる抗体である。細胞による活性物質の
かなりの取り上げを可能にする十分な数の抗原が正常細
胞に存在しないならば、正常な(すなわち、非標的)細
胞が特異的な抗原を完全に欠くことは必要でない。
【0035】かかる抗体の1つは、ハイアリアフロリダ
、コウルタ−イミュノロジー(Coulter Imm
unology)から入手し得る上述したJ5である。 その他の例はイマイ等(1983年)、Cancer
Imm、15巻、206頁以降に記載されているような
メラノーマ表面抗原に対する抗体である。コウルターイ
ミュノロジーから入手し得るその他の適当な抗体はT細
胞、T3,T4,T11,T12等のT細胞リンパ腫に
見られる表面抗原に対する抗体を含む。本実施態様にお
けるその他の結合物はトランスフェリン等の非抗体細胞
膜輸送因子及びインシュリン等のタンパク質ホルモンを
含む。
、コウルタ−イミュノロジー(Coulter Imm
unology)から入手し得る上述したJ5である。 その他の例はイマイ等(1983年)、Cancer
Imm、15巻、206頁以降に記載されているような
メラノーマ表面抗原に対する抗体である。コウルターイ
ミュノロジーから入手し得るその他の適当な抗体はT細
胞、T3,T4,T11,T12等のT細胞リンパ腫に
見られる表面抗原に対する抗体を含む。本実施態様にお
けるその他の結合物はトランスフェリン等の非抗体細胞
膜輸送因子及びインシュリン等のタンパク質ホルモンを
含む。
【0036】生物学系評価
架橋によって評価すべき好適な系はリボソーム、膜等の
細胞構造及び複合タンパク質を含む。系の1つの成分を
スルフヒドリル基で機能化し、かつ上述した架橋剤を用
いてその成分をスルフヒドリル基に隣接したアミノ基含
有物質に架橋させる。例えば、機能化した酵素基質を用
いて酵素触媒反応の進行の間に架橋することにより酵素
の結合領域を確立することができる。
細胞構造及び複合タンパク質を含む。系の1つの成分を
スルフヒドリル基で機能化し、かつ上述した架橋剤を用
いてその成分をスルフヒドリル基に隣接したアミノ基含
有物質に架橋させる。例えば、機能化した酵素基質を用
いて酵素触媒反応の進行の間に架橋することにより酵素
の結合領域を確立することができる。
【0037】架橋剤
上に挙げた2つの実施態様の内のいずれかにおいて、ア
ミノ基含有物質とスルフヒドリル基とを連結させるリン
カーが極めて重要である。アミノ基含有物質は、その活
性を変えないで、好ましくはその構造を変えないでリン
カーに連結されかつリンカーから開放されるべきである
。
ミノ基含有物質とスルフヒドリル基とを連結させるリン
カーが極めて重要である。アミノ基含有物質は、その活
性を変えないで、好ましくはその構造を変えないでリン
カーに連結されかつリンカーから開放されるべきである
。
【0038】こうして、アミノ結合はタンパク質構造に
影響を与えない温和な条件下で形成されるべきである。 同時に、結合は早過ぎて開裂されず、しかも生物学的系
の繊細な成分に適合し得る温和な条件下で開裂される強
いものであるべきである。開裂部位はアミノ基含有物質
のアミノ基とリンカーとの結合位置になるべきであり、
それによりこの物質は付加成分を伴わずかつ何らの切除
を受けることなくそのまま開放される。
影響を与えない温和な条件下で形成されるべきである。 同時に、結合は早過ぎて開裂されず、しかも生物学的系
の繊細な成分に適合し得る温和な条件下で開裂される強
いものであるべきである。開裂部位はアミノ基含有物質
のアミノ基とリンカーとの結合位置になるべきであり、
それによりこの物質は付加成分を伴わずかつ何らの切除
を受けることなくそのまま開放される。
【0039】上述したように、アミノ基含有物質の窒素
への開裂性アミド結合を形成するのに無水マレイン酸機
能が適当である。また、複合体の第2化合物のスルフヒ
ドリル機能への安定な結合を形成するのにマレイミド構
成要素(entity)が適している。
への開裂性アミド結合を形成するのに無水マレイン酸機
能が適当である。また、複合体の第2化合物のスルフヒ
ドリル機能への安定な結合を形成するのにマレイミド構
成要素(entity)が適している。
【0040】上記のマレイミド構成要素と無水マレイン
酸構成要素との間のブリッジが自然のプロセスにより(
すなわち、生体内系における酵素により)望ましくない
時又は場所において開裂されるならば、結合物の選択性
が失われ、かつ毒素又は潜在的毒性活性を有する化合物
が細胞の外の媒質中に標的細胞を選択する手段を持たな
いで存在することになるから、該ブリッジは重要である
。ブリッジに関するその他の制約は複合体の他の成分に
関する適合性及び不活性でありかつそれらの成分を害し
ない条件下での形成の容易性である。
酸構成要素との間のブリッジが自然のプロセスにより(
すなわち、生体内系における酵素により)望ましくない
時又は場所において開裂されるならば、結合物の選択性
が失われ、かつ毒素又は潜在的毒性活性を有する化合物
が細胞の外の媒質中に標的細胞を選択する手段を持たな
いで存在することになるから、該ブリッジは重要である
。ブリッジに関するその他の制約は複合体の他の成分に
関する適合性及び不活性でありかつそれらの成分を害し
ない条件下での形成の容易性である。
【0041】好適なブリッジについては、上記「発明の
要約」において詳細に説明している。今、例示のために
、次式:
要約」において詳細に説明している。今、例示のために
、次式:
【0042】
【化13】
を有する下記の好適な架橋試薬の2つの特定の代表例の
合成及び使用について説明する。
合成及び使用について説明する。
【0043】第1の例においてWは(CH2 )5 で
あり、第2の例においてWは
あり、第2の例においてWは
【化14】
である。
【0044】架橋結合の合成
第1例の合成を第1図に示す。かいつまんで言えば、架
橋試薬6は下記の主工程によって合成することができる
: 1.2−ブロモメチルマレイン酸無水物(化合物2)を
加水分解する; 2.生成したマレイン酸誘導体(化合物3)に4−アミ
ノチオフェノールを反応させて化合物4とする;3.化
合物4に6−マレイミド−カプロン酸のアシルクロリド
を反応させて二酸を作り、これを脱水させて化合物6を
生成する。無水物(2)を希薄水溶液中で加水分解しか
つ完全に加水分解した後すぐに二酸(3)を中和して2
−(ブロモメチル)マレイン酸(3)の対応するフマレ
ート類似体への異性化を回避する工程を採用する。生成
したブロモメチルフマル酸誘導体はすべて下記に一層詳
細に説明する通りに化合物(4)を精製する際に除く。
橋試薬6は下記の主工程によって合成することができる
: 1.2−ブロモメチルマレイン酸無水物(化合物2)を
加水分解する; 2.生成したマレイン酸誘導体(化合物3)に4−アミ
ノチオフェノールを反応させて化合物4とする;3.化
合物4に6−マレイミド−カプロン酸のアシルクロリド
を反応させて二酸を作り、これを脱水させて化合物6を
生成する。無水物(2)を希薄水溶液中で加水分解しか
つ完全に加水分解した後すぐに二酸(3)を中和して2
−(ブロモメチル)マレイン酸(3)の対応するフマレ
ート類似体への異性化を回避する工程を採用する。生成
したブロモメチルフマル酸誘導体はすべて下記に一層詳
細に説明する通りに化合物(4)を精製する際に除く。
【0045】反応混合物のpHを、p−アミノチオフェ
ノールを対応するチオフェノレートアニオンに転化させ
る程に上げてブロモメチルマレイン酸の(望ましいSN
2置換よりもむしろ)望ましくないSN 2’置換反
応を抑制する。上述した合成の特定の詳細は次の通りで
ある。
ノールを対応するチオフェノレートアニオンに転化させ
る程に上げてブロモメチルマレイン酸の(望ましいSN
2置換よりもむしろ)望ましくないSN 2’置換反
応を抑制する。上述した合成の特定の詳細は次の通りで
ある。
【0046】1.2[2−(4−アミノフェニル−2−
チアエチル]−マレイン酸(4) ローセン(Laursen )等(1971年)、J.
Med. Chem. 14巻、619〜621頁の
方法のグリーンリー(Greenlee)及びウッドワ
ード(Woodward)(1980年)、テトラヘド
ロン、36巻、3367〜3375頁による変法に従っ
て、化合物1から2−(ブロモメチル)−マレイン酸無
水物(2)を作る。この物質(2g)を水(20ml)
中室温において約1時間加水分解して2−(ブロモメチ
ル)−マレイン酸(3)とし、かつ溶液を1N Na
OH(21.2mL)で中和し、ガス抜きし、N2 下
に保つ。溶液を、脱気した1N NaOH(11.6
mL)中にN2 下穏やかに加熱しながら溶解しかつろ
過して不溶性二量体を除いておいたあらかじめ調製して
おいた4−アミノチオフェノール(1.51g)の溶液
に加える。ろ液を脱気水(12mL)で希釈した後に上
記化合物3の溶液に加える。最終反応溶液を1N N
aOHで約pH11.0にもたらしかつN2 下室温に
おいて一晩中撹拌する。次いで、溶液をろ過して少量の
ビス−(4−アミノフェニル)−ジスルフィドを除き、
氷冷し、1N HClで酸性にして黄色沈殿を与える
。n−ブタノールを加え(40mL)かつ混合物を氷上
5分間激しく撹拌する。これは化合物4のフマル酸類似
体を除く。次いで、固体をろ過によって集め、0.1N
HCl及び水で続けて洗浄し、最後に真空デシケー
ター中P2 O5 で乾燥して中和化合物4を生じる。
チアエチル]−マレイン酸(4) ローセン(Laursen )等(1971年)、J.
Med. Chem. 14巻、619〜621頁の
方法のグリーンリー(Greenlee)及びウッドワ
ード(Woodward)(1980年)、テトラヘド
ロン、36巻、3367〜3375頁による変法に従っ
て、化合物1から2−(ブロモメチル)−マレイン酸無
水物(2)を作る。この物質(2g)を水(20ml)
中室温において約1時間加水分解して2−(ブロモメチ
ル)−マレイン酸(3)とし、かつ溶液を1N Na
OH(21.2mL)で中和し、ガス抜きし、N2 下
に保つ。溶液を、脱気した1N NaOH(11.6
mL)中にN2 下穏やかに加熱しながら溶解しかつろ
過して不溶性二量体を除いておいたあらかじめ調製して
おいた4−アミノチオフェノール(1.51g)の溶液
に加える。ろ液を脱気水(12mL)で希釈した後に上
記化合物3の溶液に加える。最終反応溶液を1N N
aOHで約pH11.0にもたらしかつN2 下室温に
おいて一晩中撹拌する。次いで、溶液をろ過して少量の
ビス−(4−アミノフェニル)−ジスルフィドを除き、
氷冷し、1N HClで酸性にして黄色沈殿を与える
。n−ブタノールを加え(40mL)かつ混合物を氷上
5分間激しく撹拌する。これは化合物4のフマル酸類似
体を除く。次いで、固体をろ過によって集め、0.1N
HCl及び水で続けて洗浄し、最後に真空デシケー
ター中P2 O5 で乾燥して中和化合物4を生じる。
【0047】2.マレイミド−二酸5.ケラー(Kel
ler)及びルディンガー(Rudinger)(19
74年)、Helv. Chim. Acta, 58
巻、531〜541頁の方法に従って6−マレイミド−
カプロン酸を作り、かつ塩化チオニルでその酸塩化物に
変える。6−マレイミド−カプロン酸(1.06g)を
乾燥THF(10mL)中に溶解し、SOCl2 (0
.51mL)で処理し、溶液を水分を除外して1.5時
間還流する。溶液を真空で蒸発乾固させ、かつ残留油を
乾燥THF(5ml)中に溶解する。この溶液を乾燥T
HF(15ml)及びN−エチルモルホリン(2.16
mL)中化合物4(1.16g)の溶液に10分かけて
滴下する。2時間後、溶液を減圧下で蒸発乾固させ、残
留油を取り上げて酢酸エチルに入れかつ溶液を冷0.1
N HClで、次いで水で洗浄する。酢酸エチル溶液
を乾燥させかつ溶媒を蒸発によって除く。次いで、溶離
液として酢酸2%を含有するCHCl3 −MeOH(
95:5、v/v)を有するシリカゲルのフラッシュク
ロマトグラフィーによって粗生成物を精製する。最後に
純生成物をMeOH−H2 O(1:2、v/v)中D
owex50(H+ 形)のカラムの中に通す。溶媒を
蒸発しかつ油状残留物を高真空下で乾燥して脆性固形フ
ォームを収率55%(976mg)で与える。
ler)及びルディンガー(Rudinger)(19
74年)、Helv. Chim. Acta, 58
巻、531〜541頁の方法に従って6−マレイミド−
カプロン酸を作り、かつ塩化チオニルでその酸塩化物に
変える。6−マレイミド−カプロン酸(1.06g)を
乾燥THF(10mL)中に溶解し、SOCl2 (0
.51mL)で処理し、溶液を水分を除外して1.5時
間還流する。溶液を真空で蒸発乾固させ、かつ残留油を
乾燥THF(5ml)中に溶解する。この溶液を乾燥T
HF(15ml)及びN−エチルモルホリン(2.16
mL)中化合物4(1.16g)の溶液に10分かけて
滴下する。2時間後、溶液を減圧下で蒸発乾固させ、残
留油を取り上げて酢酸エチルに入れかつ溶液を冷0.1
N HClで、次いで水で洗浄する。酢酸エチル溶液
を乾燥させかつ溶媒を蒸発によって除く。次いで、溶離
液として酢酸2%を含有するCHCl3 −MeOH(
95:5、v/v)を有するシリカゲルのフラッシュク
ロマトグラフィーによって粗生成物を精製する。最後に
純生成物をMeOH−H2 O(1:2、v/v)中D
owex50(H+ 形)のカラムの中に通す。溶媒を
蒸発しかつ油状残留物を高真空下で乾燥して脆性固形フ
ォームを収率55%(976mg)で与える。
【0048】3.架橋用試薬6.
乾燥THF(3ml)中の化合物5(200mg)を乾
燥THF(2mL)中ジシクロヘキシルカルボジイミド
(110mg)の溶液で0℃において処理する。反応混
合物を室温において45分間撹拌し、次いでろ過して沈
降ジシクロヘキシル尿素をなくす。ろ液を真空で濃縮し
て乾固させ、生成した油を乾燥ジオキサン(2mL)中
に溶解しかつ再度ろ過する。最後に、ジオキサンを凍結
乾燥して除き、茶色がかった固体が残る。架橋用試薬の
第2例は、上記工程2の6−マレイミドカプロン酸クロ
リドの代りにp−マレイミドベンゾイルクロリドを用い
上述した化合物6と同じ方法で作る。
燥THF(2mL)中ジシクロヘキシルカルボジイミド
(110mg)の溶液で0℃において処理する。反応混
合物を室温において45分間撹拌し、次いでろ過して沈
降ジシクロヘキシル尿素をなくす。ろ液を真空で濃縮し
て乾固させ、生成した油を乾燥ジオキサン(2mL)中
に溶解しかつ再度ろ過する。最後に、ジオキサンを凍結
乾燥して除き、茶色がかった固体が残る。架橋用試薬の
第2例は、上記工程2の6−マレイミドカプロン酸クロ
リドの代りにp−マレイミドベンゾイルクロリドを用い
上述した化合物6と同じ方法で作る。
【0049】架橋
上述した2つの架橋剤を用いて下記に説明する通りにペ
プチド薬剤又は毒素を細胞−特異抗体に架橋させること
ができる。説明する特定例は上述した毒素ゲロニン及び
モノクローナル抗体J5を利用する。第2図はこれらの
工程を図解する。
プチド薬剤又は毒素を細胞−特異抗体に架橋させること
ができる。説明する特定例は上述した毒素ゲロニン及び
モノクローナル抗体J5を利用する。第2図はこれらの
工程を図解する。
【0050】ゲロニンは、上に挙げたスターペ等(19
80年)が記載する通りにゲロニウムムルチフロラム(
Geloniummultiflorum )(トウダ
イグサ科(Euphorbiaceae)からの種子か
ら得られる。種子はインド、カルカッター1、クライブ
ロウ10、ユナイティッドケミカルアンドアライドプロ
ダクツからニュージャージー、ノースバーゲン、ミア(
Meer)コーポレーションから入手し得る。pH7.
2のリン酸ナトリウム緩衝液100mM中のゲロニン(
1.47mg/mL)の試料を、DMSO中の12倍過
剰量の化合物6で20℃において30分間処理する。次
いで、EDTA(1mM)を含有するpH7.0のリン
酸ナトリウム緩衝液100mMで平衡にさせた4℃のセ
ファデックス(Sephadex)G−25(超微細(
superfine ))のカラムに試料をかけて新し
く生成された化合物7から過剰の化合物6を除く。
80年)が記載する通りにゲロニウムムルチフロラム(
Geloniummultiflorum )(トウダ
イグサ科(Euphorbiaceae)からの種子か
ら得られる。種子はインド、カルカッター1、クライブ
ロウ10、ユナイティッドケミカルアンドアライドプロ
ダクツからニュージャージー、ノースバーゲン、ミア(
Meer)コーポレーションから入手し得る。pH7.
2のリン酸ナトリウム緩衝液100mM中のゲロニン(
1.47mg/mL)の試料を、DMSO中の12倍過
剰量の化合物6で20℃において30分間処理する。次
いで、EDTA(1mM)を含有するpH7.0のリン
酸ナトリウム緩衝液100mMで平衡にさせた4℃のセ
ファデックス(Sephadex)G−25(超微細(
superfine ))のカラムに試料をかけて新し
く生成された化合物7から過剰の化合物6を除く。
【0051】次いで、化合物7を用いて、抗体1モル当
り2.0モルのスルフヒドリル基を導入するために下記
に説明する通りに2−イミノチオランで改質しておいた
モノクローナル抗体J5への架橋結合を形成する。
り2.0モルのスルフヒドリル基を導入するために下記
に説明する通りに2−イミノチオランで改質しておいた
モノクローナル抗体J5への架橋結合を形成する。
【0052】リン酸カリウム(7mM)と、NaCl(
100mM)と、EDTA(1mM)とを含有するpH
8.0のトリエタノールアミン−HCl緩衝液60mM
中のJ5抗体(2mg/ml)をガス抜きし、次いで2
−イミノチオラン(mM)で窒素下0℃において90分
間処理する。2−イミノチオラン塩酸塩(0.5M)の
原液を先に説明した[ランバート等(1978年)、バ
イオケミストリー、17巻、5406〜5416頁]通
りにして作る。反応はNaCl(50mM)及びEDT
A(1mM)を含有するpH5.8のビストリス−アセ
テート緩衝液5mMで平衡にさせたセファデックスG−
25(微細)のカラムに4℃で通すゲルろ過によって終
了させる。この方法で抗体に導入したスルフヒドリル基
をエルマン(Ellman)、Arch. Bioch
em. Biophys. 382巻、70〜77頁の
方法によりスペクトル高度測定法により定量する。
100mM)と、EDTA(1mM)とを含有するpH
8.0のトリエタノールアミン−HCl緩衝液60mM
中のJ5抗体(2mg/ml)をガス抜きし、次いで2
−イミノチオラン(mM)で窒素下0℃において90分
間処理する。2−イミノチオラン塩酸塩(0.5M)の
原液を先に説明した[ランバート等(1978年)、バ
イオケミストリー、17巻、5406〜5416頁]通
りにして作る。反応はNaCl(50mM)及びEDT
A(1mM)を含有するpH5.8のビストリス−アセ
テート緩衝液5mMで平衡にさせたセファデックスG−
25(微細)のカラムに4℃で通すゲルろ過によって終
了させる。この方法で抗体に導入したスルフヒドリル基
をエルマン(Ellman)、Arch. Bioch
em. Biophys. 382巻、70〜77頁の
方法によりスペクトル高度測定法により定量する。
【0053】下記に説明する通りに、この誘導化抗体を
、ゲロニン1モル当り0.7基のマレイミド置換基のレ
ベルを有する化合物7の5倍モル過剰量と混合する。 J5の置換基のレベルが高くなれば抗体に対する収率を
増大させ、他方、ゲロニンの置換基の低いレベルは架橋
反応混合部中に生成される高分子量の凝集物の量を減少
させる。ゲルろ過及びカルボキシメチルセルロース精製
した後の結合体の最終収率はJ5に対して37%である
。
、ゲロニン1モル当り0.7基のマレイミド置換基のレ
ベルを有する化合物7の5倍モル過剰量と混合する。 J5の置換基のレベルが高くなれば抗体に対する収率を
増大させ、他方、ゲロニンの置換基の低いレベルは架橋
反応混合部中に生成される高分子量の凝集物の量を減少
させる。ゲルろ過及びカルボキシメチルセルロース精製
した後の結合体の最終収率はJ5に対して37%である
。
【0054】NaCl(50mM)及びEDTA(1m
M)を含有するpH5.8のビストリス−アセテート緩
衝液5mM中の改質J5(8mg、0.05μモル)に
0℃においてEDTA(1mM)を含有するpH7.0
のリン酸ナトリウム緩衝液100mM(11mL)中5
倍モル過剰量の化合物7(8mgのゲロニン)を混合し
、次いでpH8.0の0.5Mトリエタノールアミン−
HCl緩衝液(0.15mM)を混合して最終のpHを
7.0にする。混合物を0℃において2時間培養し、次
いで新しく作ったエタノール(0.26mL)中N−エ
チルマレイミド(1mM)を加えて全ての残留遊離スル
フヒドリル基をブロックする。0℃において30分した
後に、不混和性の限外ろ過ユニット(ミリポアコーポレ
ーション、CX−10フィルター)を使用して溶液を1
3mLに濃縮しながら氷上に保つ。次いで、NaCl(
15mM)及びNaN3 (0.4mM)を含有するp
H7.0のリン酸ナトリウム緩衝液5mMで4℃におい
て平衡にさせたセファクリル(Sephacryl )
S−300のカラム(95cm×2.6cm)に混合物
をかける。 ゲルろ過は結合体及び天然のJ5(Mv=160,00
0)と非架橋ゲロニン[Mv=30,500;ソープ(
Thorpe)等(1981年)、Euro. J.
Biochem. 116巻、447〜454頁]及び
いくつかの高分子量凝集物とを分離する。分子量範囲1
60,000〜220,000に相当しかつポリアクリ
ルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動により
天然のJ5と架橋結合体8の両方を含有することが示さ
れる主ピークをプールしかつ同じ緩衝液中で平衡にさせ
たカルボキシメチルセルロース(ワットマン(What
man )CM−52)のカラム(5mLの床容積)の
中に通す。カラムを1カラム容積の緩衝液で洗浄しかつ
溶離液を一緒にする。これらのイオン強度及びpHの精
確な条件下で、天然のJ5はカラムによって留められ、
他方タイプ8の架橋複合体は保持されないで通過する。 電荷に関してモノクローナル抗体は不均一である[コワ
ン(Cowan )等(1973年)、FEBS L
ett. 343〜346頁]。これらの実験で用いる
J5の試料を変質する前に同じ条件下でカルボキシメチ
ルセルロースカラムの中に通す。カラムに留められたJ
5のみを架橋実験において用いる。J5は1.0MのN
aClを含有する緩衝液でカラムから溶出される(収率
66%)。
M)を含有するpH5.8のビストリス−アセテート緩
衝液5mM中の改質J5(8mg、0.05μモル)に
0℃においてEDTA(1mM)を含有するpH7.0
のリン酸ナトリウム緩衝液100mM(11mL)中5
倍モル過剰量の化合物7(8mgのゲロニン)を混合し
、次いでpH8.0の0.5Mトリエタノールアミン−
HCl緩衝液(0.15mM)を混合して最終のpHを
7.0にする。混合物を0℃において2時間培養し、次
いで新しく作ったエタノール(0.26mL)中N−エ
チルマレイミド(1mM)を加えて全ての残留遊離スル
フヒドリル基をブロックする。0℃において30分した
後に、不混和性の限外ろ過ユニット(ミリポアコーポレ
ーション、CX−10フィルター)を使用して溶液を1
3mLに濃縮しながら氷上に保つ。次いで、NaCl(
15mM)及びNaN3 (0.4mM)を含有するp
H7.0のリン酸ナトリウム緩衝液5mMで4℃におい
て平衡にさせたセファクリル(Sephacryl )
S−300のカラム(95cm×2.6cm)に混合物
をかける。 ゲルろ過は結合体及び天然のJ5(Mv=160,00
0)と非架橋ゲロニン[Mv=30,500;ソープ(
Thorpe)等(1981年)、Euro. J.
Biochem. 116巻、447〜454頁]及び
いくつかの高分子量凝集物とを分離する。分子量範囲1
60,000〜220,000に相当しかつポリアクリ
ルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動により
天然のJ5と架橋結合体8の両方を含有することが示さ
れる主ピークをプールしかつ同じ緩衝液中で平衡にさせ
たカルボキシメチルセルロース(ワットマン(What
man )CM−52)のカラム(5mLの床容積)の
中に通す。カラムを1カラム容積の緩衝液で洗浄しかつ
溶離液を一緒にする。これらのイオン強度及びpHの精
確な条件下で、天然のJ5はカラムによって留められ、
他方タイプ8の架橋複合体は保持されないで通過する。 電荷に関してモノクローナル抗体は不均一である[コワ
ン(Cowan )等(1973年)、FEBS L
ett. 343〜346頁]。これらの実験で用いる
J5の試料を変質する前に同じ条件下でカルボキシメチ
ルセルロースカラムの中に通す。カラムに留められたJ
5のみを架橋実験において用いる。J5は1.0MのN
aClを含有する緩衝液でカラムから溶出される(収率
66%)。
【0055】不混和性の限外ろ過膜(ミリポア、CX−
30)を用い、非架橋のモノマータンパク質から分離し
た精製複合体8を含有する溶液を、トリエタノールアミ
ン(0.5mM)及びNaCl(145mM)を含有す
るpH7.8のリン酸ナトリウム緩衝液10mMに対し
て透析し、最終的にミレックス(Millex)−GV
ろ過膜(0.22μm、ミリポア)に通して無菌ろ過し
た後に4℃において貯蔵する。
30)を用い、非架橋のモノマータンパク質から分離し
た精製複合体8を含有する溶液を、トリエタノールアミ
ン(0.5mM)及びNaCl(145mM)を含有す
るpH7.8のリン酸ナトリウム緩衝液10mMに対し
て透析し、最終的にミレックス(Millex)−GV
ろ過膜(0.22μm、ミリポア)に通して無菌ろ過し
た後に4℃において貯蔵する。
【0056】酸開裂
正常な細胞及びJ5抗体によって認識される表面抗原を
示す通常の急性リンパ芽球白血病細胞を含む細胞集団に
、精製複合体8又は上述した第2架橋剤例を用いて作っ
た対応する複合体を施すことができる。複合体中のJ5
成分は、リッツ等(1980年)、J. Immuno
l. 125巻、1506〜1514頁に記載されてい
る通りにナマルワ(Namalwa )細胞における間
接免疫蛍光法によって判断されるように、表面抗原を有
する細胞に選択的に結合する能力を保持する。複合体8
のゲロニン成分は、ニューイングランドニュークリアカ
ンパニーから入手し得る系のようなウサギ網状赤血球溶
解産物系によって求められる通りに、本来の非架橋ゲロ
ニンに比べてタンパク質合成を停止する能力が低いこと
を示す。
示す通常の急性リンパ芽球白血病細胞を含む細胞集団に
、精製複合体8又は上述した第2架橋剤例を用いて作っ
た対応する複合体を施すことができる。複合体中のJ5
成分は、リッツ等(1980年)、J. Immuno
l. 125巻、1506〜1514頁に記載されてい
る通りにナマルワ(Namalwa )細胞における間
接免疫蛍光法によって判断されるように、表面抗原を有
する細胞に選択的に結合する能力を保持する。複合体8
のゲロニン成分は、ニューイングランドニュークリアカ
ンパニーから入手し得る系のようなウサギ網状赤血球溶
解産物系によって求められる通りに、本来の非架橋ゲロ
ニンに比べてタンパク質合成を停止する能力が低いこと
を示す。
【0057】このように、複合体は細胞認識能力を有し
、一担、抗体が細胞に結合すれば、複合体が細胞区画の
中に吸収され、そこで開裂が起きる。特に、受容体−介
在エンドサイト−シスにより吸収される受容体はエンド
ソーム又はリセプトソームとして知られる酸性化区画を
通過する[de Duve (1983年)、Eur.
J. Biochem. 137巻、391〜39
7頁]。こうして、複合体を短時間活性アミノ基含有物
質を開裂するのに十分な酸性pHに暴露させる。
、一担、抗体が細胞に結合すれば、複合体が細胞区画の
中に吸収され、そこで開裂が起きる。特に、受容体−介
在エンドサイト−シスにより吸収される受容体はエンド
ソーム又はリセプトソームとして知られる酸性化区画を
通過する[de Duve (1983年)、Eur.
J. Biochem. 137巻、391〜39
7頁]。こうして、複合体を短時間活性アミノ基含有物
質を開裂するのに十分な酸性pHに暴露させる。
【0058】複合体8からの本来のゲロニンの開裂は、
およそpH5より低いところで相対的に速く収率が良好
である。例えば、37℃及びpH4において、全ゲロニ
ンの30%以上が5時間までに開裂され、かつ50%以
上が10時間後に開裂される。pH5において、およそ
15%が5時間後に開裂され、かつおよそ25%が10
時間後に開裂される。pH6より高い所では、ゲロニン
へのアミド結合は比較的に安定である。
およそpH5より低いところで相対的に速く収率が良好
である。例えば、37℃及びpH4において、全ゲロニ
ンの30%以上が5時間までに開裂され、かつ50%以
上が10時間後に開裂される。pH5において、およそ
15%が5時間後に開裂され、かつおよそ25%が10
時間後に開裂される。pH6より高い所では、ゲロニン
へのアミド結合は比較的に安定である。
【0059】所定の薬剤−抗体複合体について、当業者
は収率及び放出速度を放出環境において経験するpH及
び温度条件について測定することができかつそれを基に
して標的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複
合体の量を決めることができる。例えば、薬剤放出はポ
リアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を使用して求めることができる。
は収率及び放出速度を放出環境において経験するpH及
び温度条件について測定することができかつそれを基に
して標的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複
合体の量を決めることができる。例えば、薬剤放出はポ
リアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を使用して求めることができる。
【0060】変動するpH条件下でゲロニンの放出速度
を試験する方法は下記の手順により例示される。8の試
料(0.54mg/mL)をクエン酸−ホスフェート緩
衝液100mMで1:2(v/v)に希釈して最終のp
H値4.0,5.0,6.0,にする。溶液を37℃に
おいて培養し、かつ試料を異る時間で抜き出してゲロニ
ン活性を分析し、かつポリアクリルアミド/ドデシル硫
酸ナトリウムゲル電気泳動により分析する。前者用の試
料はリン酸ナトリウム(9mM)と、NaCl(18m
M)と、牛の血清アルブミン(0.2mg/mL)とを
含有するpH8.8のトリス−HCl緩衝液150mM
に10倍に希釈し、次いで検定する前に4℃において保
存する。最終のpHは8.5である。ポリアクリルアミ
ドゲル分析用の試料(50μL)は、リン酸カリウム(
5mM)及びNaCl(70mM)を含有するpH7.
8のトリエタノールアミン−HCl緩衝液5mMの上に
浮かぶVSWP−025透析膜(ミリポア)の上に置き
、かつ4℃において2時間透析し、その後の試料のpH
は7.8である。
を試験する方法は下記の手順により例示される。8の試
料(0.54mg/mL)をクエン酸−ホスフェート緩
衝液100mMで1:2(v/v)に希釈して最終のp
H値4.0,5.0,6.0,にする。溶液を37℃に
おいて培養し、かつ試料を異る時間で抜き出してゲロニ
ン活性を分析し、かつポリアクリルアミド/ドデシル硫
酸ナトリウムゲル電気泳動により分析する。前者用の試
料はリン酸ナトリウム(9mM)と、NaCl(18m
M)と、牛の血清アルブミン(0.2mg/mL)とを
含有するpH8.8のトリス−HCl緩衝液150mM
に10倍に希釈し、次いで検定する前に4℃において保
存する。最終のpHは8.5である。ポリアクリルアミ
ドゲル分析用の試料(50μL)は、リン酸カリウム(
5mM)及びNaCl(70mM)を含有するpH7.
8のトリエタノールアミン−HCl緩衝液5mMの上に
浮かぶVSWP−025透析膜(ミリポア)の上に置き
、かつ4℃において2時間透析し、その後の試料のpH
は7.8である。
【0061】タンパク質複合体を特性表示する最後に、
架橋試料6をランバート等(1981年)J. Mol
. Biol. 149巻、451〜476頁;ワング
(Wang)等(1974年)、Isr. J. Ch
em. 12巻、375〜389頁;ロマン(Loma
nt)等(1976年)J. Mol. Biol.
104巻、243〜261頁;ルッター(Lutter
)等(1974年)FEBS Letters48巻
、288〜292頁;又はコギンズ(Coggins
)等(1976年)バイオケミストリー15巻、252
7〜2532頁に記載されている通りに用いて多数のポ
リペプチド鎖を含有する複合構造を分析することができ
る。
架橋試料6をランバート等(1981年)J. Mol
. Biol. 149巻、451〜476頁;ワング
(Wang)等(1974年)、Isr. J. Ch
em. 12巻、375〜389頁;ロマン(Loma
nt)等(1976年)J. Mol. Biol.
104巻、243〜261頁;ルッター(Lutter
)等(1974年)FEBS Letters48巻
、288〜292頁;又はコギンズ(Coggins
)等(1976年)バイオケミストリー15巻、252
7〜2532頁に記載されている通りに用いて多数のポ
リペプチド鎖を含有する複合構造を分析することができ
る。
【0062】関心のある鎖をスルフヒドリル基で機能化
しかつ架橋試薬6に暴露させる。隣接する鎖のアミノ基
はpH7又はそれ以上において開裂性アミド結合を形成
する。鎖を変性させないpH(例えば、pH4〜5)に
おけるアミド結合の加水分解は、例えばSDSゲル電気
泳動によって追跡し、関心のある鎖に隣接する鎖を同定
することができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件
下で加水分解を制御し得ることが特に重要である。また
、架橋結合を任意のアミノ含有鎖部位に形成することが
でき、かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の有
効性に依存しないことも重要である。
しかつ架橋試薬6に暴露させる。隣接する鎖のアミノ基
はpH7又はそれ以上において開裂性アミド結合を形成
する。鎖を変性させないpH(例えば、pH4〜5)に
おけるアミド結合の加水分解は、例えばSDSゲル電気
泳動によって追跡し、関心のある鎖に隣接する鎖を同定
することができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件
下で加水分解を制御し得ることが特に重要である。また
、架橋結合を任意のアミノ含有鎖部位に形成することが
でき、かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の有
効性に依存しないことも重要である。
【0063】その他の実施態様
その他の実施態様は次の請求の範囲内にある。例えば、
その他の薬剤送達複合体及びタンパク質評価架橋剤は請
求の範囲内にある。
その他の薬剤送達複合体及びタンパク質評価架橋剤は請
求の範囲内にある。
【図1】一群の架橋試薬を調製するフローダイヤグラム
である。
である。
【図2】第1図において調製した試薬によって架橋した
特定の複合体を調製するフローダイヤグラムである。
特定の複合体を調製するフローダイヤグラムである。
Claims (8)
- 【請求項1】 下記の化合物: 【化1】 [式中、R1 及びR2 は独立にH,C5 又はそれ
以下のアルキル基から選び、Aは下記の単位を含む【化
2】 (式中、R3 、R4 、R5 及びR6 は独立にH
、ハロゲン、C5 又はそれ以下のアルコキシ及びアル
キル基、及び第三アミンから選び、Bはマレイミド機能
へのリンカーである)]、及び 【化3】 (式中、R2 及びAは上に定義した通りであり、s=
2〜5である)の内の1つを含む架橋試薬。 - 【請求項2】 下記の単位: 【化4】 [式中、n=1〜5であり、R1 及びR2 は独立に
H,C5 又はそれ以下のアルキル基から選び、Wは(
CH2 )q (q=1〜5)であるか或は下記の単位
:【化5】 の内の1つである]を含む請求項1記載の試薬。 - 【請求項3】 n=1であり、かつW=(CH2 )
5 である請求項2記載の架橋試薬。 - 【請求項4】 アミノ基含有物質のアミノ窒素とスル
フヒドリル機能を含有する物質との間の酸開裂性架橋を
形成するのに適した架橋試薬を製造する方法であって、
前記架橋試薬が下記の単位: 【化6】 (式中、R1 及びR2 は独立にH,C5 又はそれ
以下のアルキル基から選び、Aはブリッジ単位を含む)
;及び【化7】 (式中、R2 及びAは上に定義した通りであり、s=
2〜5である)の内の1つを含み、活性化置換マレイン
酸機能を与え、該活性化置換マレイン酸機能をチオフェ
ノール含有機能を含む複合体に、該チオフェノールのス
ルフヒドリル基をイオン化させる程に高いpHにおいて
行なう置換反応によって結合させ、該チオフェノール含
有機能をマレイミド窒素に結合させることを含む、前記
架橋試薬の製造方法。 - 【請求項5】 前記pHが9.5〜11.5である請
求項4記載の方法。 - 【請求項6】 前記マレイン酸機能をカルボキシル基
にアルファの炭素におけるハロゲン化アルキル機能によ
って活性化させる請求項4記載の方法。 - 【請求項7】 前記チオフェノール含有機能がアミン
を含み、かつ前記マレイミド機能をアミノ窒素に窒素と
のアミド結合を形成することによって結合させる請求項
4記載の方法。 - 【請求項8】 アミノ基含有物質を液体媒質に制御し
て放出するための酸開裂性複合体に細胞を露呈させるこ
とにより生物学的に活性なアミノ基含有物質を選択的に
細胞集団の膜に送達する方法であって、前記複合体がア
ミノ基含有物質と、スルフィド結合物質と、スルフィド
結合物質とアミノ基含有物質との間の酸開裂性リンカー
とを含み、下記の2つの単位: 【化8】 (式中、X及びYの内の1方はO− であり、X及びY
の内の他方はアミノ基含有物質の残基であってそのアミ
ノ窒素はマレイン酸機能のカルボニル基とアミド結合を
形成するものであり;Zはスルフィド結合物質であり、
その結合のイオウを含み;R1 及びR2 は独立にH
,C5又はそれ以下のアルキル基から選び;Aはブリッ
ジ単位である);及び 【化9】 (式中、X,Y,Z,R2 及びAは上に定義した通り
であり、s=2〜5である)の内の1つを含むみ、スル
フィド結合物質が細胞−表面受容体に対する抗体であり
かつアミノ基含有物質が生物学的に活性であり、複合体
をこの架橋複合体のアミノ基含有物質のアミノ基の窒素
とマレイン酸機能のカルボニル基との間のアミド結合を
加水分解する程に低いpHに露呈させ、それにより複合
体が活性物質を細胞に送達する方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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US06/645,614 US4542225A (en) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | Acid-cleavable compound |
US645614 | 1984-08-29 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04356483A true JPH04356483A (ja) | 1992-12-10 |
JPH0684372B2 JPH0684372B2 (ja) | 1994-10-26 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60502504A Expired - Lifetime JPH06102679B2 (ja) | 1984-08-29 | 1985-05-23 | 酸開裂性化合物 |
JP3211453A Expired - Lifetime JPH0684372B2 (ja) | 1984-08-29 | 1991-07-30 | 酸開裂性架橋試薬 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60502504A Expired - Lifetime JPH06102679B2 (ja) | 1984-08-29 | 1985-05-23 | 酸開裂性化合物 |
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EP (2) | EP0408157B1 (ja) |
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DE (2) | DE3588090T2 (ja) |
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