CN114269749A - 5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二氨基化合物及其抗体偶联物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的内容涉及5H‑吡咯并[3,2‑d]嘧啶‑2,4‑二氨基化合物和/或其抗体偶联物，及其药物组合物，制备所述偶联物的方法，以及使用所述偶联物和组合物进行治疗的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是要求于2019年6月10日提交的美国临时申请号62/859,638的权益的国际申请，其全部内容通过引用并入本发明。
发明领域
本发明提供了5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二氨基化合物和/或其抗体偶联物，以及包含所述化合物和/或偶联物的药物组合物，制备所述化合物和/或偶联物的方法，以及使用所述化合物、偶联物和组合物进行治疗的方法。所述化合物、偶联物和组合物可用于治疗和预防细胞增殖和癌症的方法，检测细胞增殖和癌症的方法，以及诊断细胞增殖和癌症的方法。所述化合物、偶联物和组合物还可用于治疗、预防、检测和诊断自身免疫性疾病或病症的方法。
发明背景
先天免疫系统通过Toll样受体(TLR)识别结构上保守的病原体相关分子模式，Toll样受体通常在免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞上表达。TLR的激活诱导先天(快速、非特异性)和/或适应性(更慢、更特异性)免疫应答，例如细胞因子的诱导和/或吞噬细胞的共刺激和/或T细胞应答的激活。在TLR中，TLR3、7、8和9在细胞内体中表达，而其他(TLR1、2、4、5、6、10和11)位于质膜上。由于细胞内衔接蛋白的不同使用，每个TLR引起对病原体的特异性细胞应答。TLR7是一种在内体膜上表达的细胞内受体，与TLR8密切相关。TLR7识别来自细胞内病原体的核苷和核苷酸。TLR7的激活可诱导产生1型干扰素和炎症反应。Saitoh,S-Iet al.,Nature Communications 2017,8,文章编号:1592。
恶性细胞利用TLR的天然免疫调节功能来促进它们的存活，侵袭和规避抗肿瘤免疫应答。目前的研究已经证实了TLR激活在不同恶性肿瘤中的特定作用，在某些情况下促进疾病发展，而在其它情况下限制癌症的生长。Braunstein M.J.et al.,TargetOncol.2018,13(5),583-598。
已经发现一些TLR激动剂通过间接激活耐受宿主免疫系统以破坏癌细胞来诱导抗肿瘤活性。使用TLR7激动剂，如咪喹莫特、洛索立宾、CL264(在苄基基团上含有甘氨酸的9-苄基-8-羟基腺嘌呤衍生物)、ssRNA40、R848和SM-276 001，无论是单独使用还是作为疫苗佐剂，都可在几种鼠模型中诱导强免疫应答，从而产生抗肿瘤治疗功效。TLR7激动剂注射剂降低肿瘤的发展并调节结肠癌、肾癌和乳腺癌的全身和肿瘤内免疫应答。与TLR7刺激相关的抗肿瘤作用已在人类皮肤癌和宫颈上皮内瘤变中得到证实。Dajon,M.et al.,Oncoimmunology.2015,4(3),e991615。
TLR7靶向可以为抗炎和/或抗癌疗法提供新的治疗选择。本领域需要针对炎症和/或免疫调节疾病，特别是癌症的新疗法。TLR7激动剂的抗体偶联物可用于将治疗或诊断有效负载部分递送至表达肿瘤抗原的靶细胞，以治疗和/或诊断此类疾病。
发明摘要
本发明提供了式(I-P)、式(I)及其子式所示5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二氨基化合物、包含所述化合物的组合物、制备所述化合物的方法、以及使用所述化合物、偶联物和组合物治疗细胞增殖和/或癌症和/或炎症的方法。所述偶联物可用于治疗和预防细胞增殖和癌症的方法、检测细胞增殖和癌症的方法、以及诊断细胞增殖和癌症的方法。所述偶联物可用于治疗和预防炎性疾病和病症的方法。
一方面，本发明提供了式(I)所示化合物，
其中，R1a、R1b、R2a、R2b、R3、R4、R5、环A和环B如本发明详细描述部分所定义。
本发明还提供了包含式(I-P)、式(I)及其子式所示化合物的残基的抗体偶联物。在一些或任一实施方案中，所述偶联物具有式(V)所示结构，
其中Ab是抗体或其抗原结合片段，L是连接体，PA是包含式(I-P)、式(I)、(II)或(III)所示残基的有效负载或其实施方案，和下标n是从1至30的整数；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物。
另一方面，本发明提供了包含式(I-P)、(I)、(II)或(III)所示化合物或其实施方案的组合物，或包含式(I-P)、式(I)及其子式所示化合物和其实施方案的残基的抗体偶联物。在一些或任一实施方案中，所述偶联物具有式(V)所示结构，
其中Ab是抗体或其抗原结合片段，L是连接体，PA是包含式(I-P)、式(I)、(II)或(III)所示残基的有效负载或其实施方案，下标n从1至30的整数；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。可以使用任何合适的药物组合物。另一方面，本发明提供了包含了式(I-P)、(I)、(II)或(III)所示化合物或其实施方案、所述抗体偶联物(如式(V)所示抗体偶联物)或所述药物组合物的试剂盒。
另一方面，本发明提供了使用本发明所述的式(I-P)、式(I)、(II)或(III)所示化合物或其实施方案、或所述抗体药物偶联物的方法。在一些实施方案中，所述方法是将一个或多个有效负载基团部分递送至靶细胞或组织的方法。在一些实施方案中，所述方法是治疗方法。在一些实施方案中，所述方法是诊断方法。在一些实施方案中，所述方法是分析方法。在一些实施方案中，所述化合物和/或抗体药物偶联物用于治疗疾病或病症。在一些方面，所述疾病或病症选自癌症、和/或炎性疾病或病症
本发明还提供了本发明所述化合物及其抗体偶联物用于治疗癌症和/或炎性疾病或病症的用途。
另一方面，本发明提供了式(IV)所示连接体有效负载，
其中，R、SG、W6、HP、X、W1和PA如本发明详细描述部分所定义。
附图简要说明
图1提供了证明化合物10刺激人PBMC(外周血单核细胞)中几种免疫细胞型活化的能力的体外数据——单核细胞(图1A)、B细胞(图1B)、cDC(图1C)和pDC(图1D)。
图2提供了证明化合物10刺激来自食蟹猴(cyno)PBMC的几种免疫细胞型活化的能力的体外数据——单核细胞(图2A)、B细胞(图2B)和cDC(图2C)。
图3提供了证明化合物10刺激来自小鼠脾细胞的几种免疫细胞型活化的能力的体外数据——单核细胞(图3A)、巨噬细胞(图3B)、cDC(图3C)和pDC(图3D)。
图4提供了证明化合物10刺激人PBMC产生细胞因子释放的能力的体外数据——IL-6(图4A)、MCP-1(图4B)和IL1Ra(图4C)。
图5提供了证明化合物10从食蟹猴(cyno)PBMC产生细胞因子释放的能力的体外数据——IL-6(图5A)和MCP-1(图5B)。
图6提供了证明化合物10从小鼠脾细胞产生细胞因子释放的能力的体外数据——IL-6(图6A)、MCP-1(图6B)、TNFa(图6C)和IP-10(图6D)。
图7提供了某些化合物在患有已建立的MC38-hFolRα肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性的体内数据。图7A显示了剂量相关的最小体重减轻(<给药前的10％)。化合物2治疗MC38-hFolRα对肿瘤生长的抗肿瘤作用显示于图7B。
详细说明
本发明描述了用于治疗癌症和/或炎性病症的Toll样受体7(TLR7)激动剂及其抗体偶联物。在一些情况下，本发明所述的化合物对TLR7具有选择性并且不影响TLR8。
1.定义
除非另有定义，本发明使用的所有技术用语、符号说明及其他科学术语是意图具有本发明所属技术领域中具有通常知识者所通常了解的意义。在一些情况下，具有通常了解意义的用语是于本发明定义以供清楚和/或轻易地参照，且在本发明纳入此类定义不应被视为表示与本领域所通常了解者的差异。在本发明中描述或指涉的技术和程序通常为所属技术领域中具有通常知识者所广为理解且经常使用常规方法采用，诸如例如广为使用的Green&Sambrook.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.(2012),ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY和Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons中所述的分子克隆方法。当适当时，涉及使用自商业途径获得的试剂盒及试剂的方法通常根据厂商定义的方案和条件/参数进行，除非另有说明。
本发明使用的单数形式“一个/种/项”和“所述”包括复数指涉物，除非上下文另外清楚说明。
术语“约/大约”表示且涵盖所示值以及此值以上及以下的范围。在某些实施方案，术语“约/大约”表示指定数值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案，术语“约/大约”表示指定数值±此数值的一个标准偏差。在某些实施方案中，例如，对于对数刻度(例如，pH)，术语“约/大约”表示指定数值±0.3、±0.2或±0.1。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的蛋白质，所述蛋白质通常包含两对多肽链：一对轻(L)链和一对重(H)链。在“完整免疫球蛋白”中，所有四个这些链通过双硫键互相连接。免疫球蛋白的结构已进行详细表征。参见例如Paul,Fundamental Immunology 7thed.,Ch.5(2013)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。简而言之，各重链一般包含重链可变区(VH或VH)和重链恒定区(CH或CH)。重链恒定区一般包含三个结构域，缩写为CH1(或CH1)、CH2(或CH2)和CH3(或CH3)。各轻链一般包含轻链可变区(VL或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区一般包含一个结构域，缩写为CL或CL。
术语“抗体”在本发明中以其最广泛的意义使用。抗体包括完整抗体(例如完整免疫球蛋白)及抗体片段(例如抗体的抗原结合片段)。抗体包含至少一个抗原结合结构域。抗原结合结构域的一个实例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。
VH区和VL区可进一步细分为散布有更保守区域的高变区(“高变区(HVR)”，又称为“互补决定区(CDR)”)。所述更保守区域称为框架区(FR)。各VH和VL通常包含以下列顺序排列的三个CDR和四个FR(自N端至C端)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR参与抗原结合，并影响抗原的特异性和抗体的结合亲和性。参见Kabat et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest 5th ed.(1991)Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD，其全文以引用方式并入本发明。
任何脊椎动物物种的轻链可根据恒定结构域的序列，归属于称为κ和λ的两种类型中的一种。
任何脊椎动物物种的重链可归属于以下五种不同类型(或同型)中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类型也分别被命名为α、δ、ε、γ和μ。IgG及IgA类型进一步根据序列差异及功能分成子类。人表达下列子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
CDR的氨基酸序列边界可通过所属技术领域中具有通常知识者使用一些已知编号方案的任一种进行确定，包括Kabat et al.,同上(“卡巴(Kabat)”编号方案)；Al-Lazikaniet al.,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“柯西亚(Chothia)”编号方案)；MacCallum etal.,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“接触(Contact)”编号方案)；Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；和Honegge and Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)所述的那些进行确定，其各自通过引用其全文并入本发明。
CDR可以例如使用抗体编号软件例如Abnum来进行归属，所述软件可从
www.bioinf.org.uk/abs/abnum/获得，并记载在Abhinandan and Martin,Immunology,2008,45:3832-3839中，其全文通过引用并入本发明。
当指称抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，Kabat etal.，同上所报告)。除非另外说明，EU编号方案是用于指本发明所述的抗体重链恒定区中的残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段包括例如Fv片段、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、scFv(sFv)片段、和scFv-Fc片段。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
“Fab”片段除了所述重链和轻链可变结构域以外，包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段可通过例如木瓜蛋白酶消化全长抗体或重组方法来生成。
“F(ab′)2”片段含有两个在铰链区附近通过双硫键连接的Fab′片段。F(ab′)2片段可通过例如胃蛋白酶消化完整抗体或重组方法来生成。F(ab′)片段可通过例如用β-巯乙醇处理进行解离。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含在单一多肽链中的VH结构域和VL结构域。VH和VL通常由肽连接体进行连接。参见Plückthun A.(1994).Antibodies fromEscherichia coli.In Rosenberg M.&Moore G.P.(Eds.),The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies vol.113(pp.269-315).Springer-Verlag,New York，其全文以引用方式并入本发明。
“scFv-Fc”片段包含附接至Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可附接至scFv的C端。Fc结构域之后可视scFv中的可变结构域的方向性(即VH-VL或VL-VH)而为VH或VL。可使用任何所属技术领域中已知或本发明所述的合适Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包含IgG1 Fc结构域。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质抗体的族群的抗体。基本上同质抗体的族群包含实质上类似且与相同表位结合的抗体，不包括在产生单克隆抗体期间正常出现的变体。此类变体通常仅以少量存在。单克隆抗体一般通过包括自多个抗体选择单一抗体的过程而得到。例如，选择过程可为自多个克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。所选抗体可进一步改变，例如改善对靶标的亲和性(“亲和性成熟)”、将抗体人源化、改善其在细胞培养物中的生成量、和/或减少其在受试者中的免疫原性。
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分是衍生自特定来源或物种，然而重链和/或轻链的其余部分是衍生自不同来源或物种的抗体。
非人抗体的“人源化”形式是指含有最少衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中一个或多个CDR的残基经非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基置换。供体抗体可为任何合适的非人抗体，诸如具有所需特异性、亲和性或生物效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长动物抗体。在一些例子中，接受者抗体的所选框架区残基经供体抗体的对应框架区的残基进行置换。人源化抗体亦可包含不存在于接受者抗体或供体抗体的残基。可进行此类修饰以进一步改善抗体功能。进一步细节参见Jones et al.,Nature,1986,321:522-525；Riechmann et al.,Nature,1988,332:323-329；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，各文献的全文以引用方式并入本发明。
“人抗体”为具有对应由人或人细胞生成的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列、或衍生自利用人抗体贮库或人抗体编码序列(例如获自人来源或重新设计)的非人来源的抗体。人抗体特别排除人源化抗体。
“分离的抗体”是指已与其天然环境中的组分进行分离和/或自其中回收的抗体。天然环境的组分可包括酶类、激素类及其他蛋白性或非蛋白性物质类。在一些实施方案，分离的抗体经纯化至例如通过使用转杯式定序仪足以获得至少15个N端或内部氨基酸序列残基的程度。在一些实施方案，分离的抗体经纯化至以凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)在还原或非还原条件下通过考马斯蓝(Coomassie blue)或银染色检测为均质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。在一些态样中，分离的抗体通过至少一个纯化步骤制备得到。
在一些实施方案，分离的抗体经纯化至至少80重量％、85重量％、90重量％、95重量％或99重量％。在一些实施方案，分离的抗体经纯化至至少80％、85％、90％、95％或99％，按体积计。在一些实施方案，分离的抗体是以包含至少85重量％、90重量％、95重量％、98重量％、99重量％至100重量％的抗体的溶液提供。在一些实施方案，分离的抗体是以包含至少85％、90％、95％、98％、99％至100％(按体积计)的抗体的溶液提供。
“亲和性”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伙伴(例如抗原)之间非共价相互作用的总和强度。除非另外表明，本发明中所使用的“结合亲和性”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伙伴Y的亲和性通常可以解离常数(KD)表示。亲和性可通过本领域已知的常用方法进行测定，包括本发明所述的那些。亲和性可使用例如表面等离子体共振(SPR)技术诸如
仪器进行测定。在一些实施方案，亲和性是在25℃下测定。
关于抗体与靶分子结合，术语“特异性结合”、“与…特异性结合”、“对...具有特异性”、“选择性结合”和“对...具有选择性”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原的表位意指与非特异性或非选择性交互作用有测定上不同的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合相较于对照分子的结合来测定。特异性结合亦可通过与模拟针对靶标的抗体结合位点的对照分子竞争来测定。在此情况下，如果抗体与靶标的结合被对照分子竞争性抑制，则表明特异性结合。
“亲和性成熟”抗体是指在一个或多个CDR或FR中具有一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致所述抗体对其抗原的亲和性相较于不具有改变的亲本抗体增加。在一个实施方案，亲和性成熟抗体对目标抗原具有纳摩尔或皮摩尔的亲和性。亲和性成熟抗体可使用本领域已知的多种方法生成。举例来说，Marks et al.(Bio/Technology,1992,10:779-783，其全文以引用方式并入本发明)描述了由VH和VL结构域替换产生的亲和性成熟。CDR和/或框架残基的随机致突变性描述于例如：Barbas et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91:3809-3813)；Schier et al.,Gene,1995,169:147-155；Yelton et al.,J.Immunol.,1995,155:1994-2004；Jackson et al.,J.Immunol.,1995,154:3310-33199；和Hawkins et al,J.Mol.Biol.,1992,226:889-896中，各文献全文均以引用方式并入本发明。
术语“氨基酸”是指二十个常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)和不太常见的吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。天然氨基酸还包括瓜氨酸。天然编码的氨基酸包括22种天然存在的氨基酸的翻译后变体，例如异戊烯基化氨基酸类，异戊二烯基化氨基酸类，豆蔻酰化氨基酸类，棕榈酰化氨基酸类，N-连接的糖基化氨基酸类，O-连接的糖基化氨基酸类，磷酸化氨基酸类和酰化氨基酸类。术语“氨基酸”还包含非天然(或非自然)或合成的α、β、γ或δ氨基酸，其包括但不限于蛋白质中发现的氨基酸，即，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在某些实施方案中，所述氨基酸呈L-构型。或者，所述氨基酸可以是丙氨酰基、缬氨酰基、亮氨酰基、异亮氨酰基、脯氨酰基、苯丙氨酰基、色氨酰基、蛋氨酰基、甘氨酰基、丝氨酰基、苏氨酰基、半胱氨酰基、酪氨酰基、天冬酰胺酰基、谷氨酰胺酰基、天冬氨酰基、谷氨酰基、赖氨酰基、精氨酰基、组氨酰基、β-丙氨酰基、β-缬氨酰基、β-亮氨酰基、β-异亮氨酰基、β-脯氨酰基、β-苯丙氨酰基、β-色氨酰基、β-蛋氨酰基、β-甘氨酰基、β-丝氨酰基、β-苏氨酰基、β-半胱氨酰基、β-酪氨酰基、β-天冬酰胺酰基、β-谷氨酰胺酰基、β-天冬氨酰基、β-谷氨酰基、β-赖氨酰基、β-精氨酰基或β-组氨酰基的衍生物。非天然氨基酸不为蛋白质氨基酸或其翻译后经修饰变体。特别地，术语“非天然氨基酸”是指不为20种常见氨基酸之一或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸或其翻译后经修饰变体的氨基酸。
术语“偶联物”或“抗体偶联物”是指与一个或多个有效负载基团部分连接的抗体。所述抗体可以是本发明所述的任何抗体。所述有效负载可以是本发明所述的任何有效负载。所述抗体可通过共价键直接连接至有效负载，或者所述抗体可通过连接体间接连接至有效负载。通常，连接体与抗体共价连接，并且还与有效负载共价连接。术语“抗体药物偶联物”或“ADC”是指偶联物，其中至少一个有效负载是治疗性基团部分，例如药物。
“pAMF”突变是指添加或置换至多肽中的变体苯丙氨酸残基，即，对叠氮甲基-L-苯丙氨酸。
术语“有效负载(payload)”是指可与抗体偶联的分子基团部分。在特定实施方案中，有效负载选自由本发明所述的治疗性基团部分和/或标记基团部分组成的组。
术语“连接体”是指能够形成至少两个共价键的分子基团部分。通常，连接体能够与抗体形成至少一个共价键，并且与有效负载形成至少另一个共价键。在某些实施方案，连接体可与抗体形成一个以上的共价键。在某些实施方案，连接体可与有效负载形成一个以上的共价键，或可与一个以上的有效负载形成多个共价键。在连接体与抗体或有效负载或两者形成键之后，其余的结构，即是在形成一个或多个共价键之后连接体的残基，在本发明中仍可称为“连接体”。术语“连接体前体”是指具有能够与抗体或有效负载或两者形成共价键的一个或多个活性基团的连接体。在一些实施方案，连接体是可切割的连接体。譬如，可切割的连接体可以是通过生物不稳定功能进行释放，其可被工程化或可不被工程化。在一些实施方案，连接体是不可切割的连接体。譬如，不可切割的连接体可以是在抗体降解后释放的连接体。
当提及本发明提供的化合物时，除非另有说明，以下术语具有以下含义。除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如果本发明术语有多个定义，除非另有说明，否则以本章节中的定义为准。
本发明使用的术语“烷基”，除非另有说明，是指饱和的直链或支链烃。在某些实施方案中，所述烷基基团是一级、二级或三级烃。在某些实施方案中，所述烷基基团包括1-10个碳原子，即C1-C10烷基。在某些实施方案中，所述烷基基团包含具有1-6个碳原子的饱和的直链或支链烃，即C1-C6烷基或低级烷基。所述术语包括取代和未取代的基团部分。所述术语包括取代和未取代的烷基基团，包括卤代烷基基团。在一些或任一实施方案中，烷基未被取代。在一些或任一实施方案中，烷基是经取代的。在某些实施方案中，所述烷基基团为氟化烷基基团。可用来取代烷基基团的基团部分的非限制性实例选自由以下组成的组：卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯(sulfate)、膦酸、磷酸酯或膦酸酯，其是未保护的、或必要时被保护的，如本领域技术人员已知的，例如在Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,JohnWiley and Sons,Second Edition,1991中所教导的，通过引用并入本发明中。在某些实施方案中，所述烷基基团选自由甲基、CF3、CCl3、CFCl2、CF2Cl、乙基、CH2CF3、CF2CF3、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基所组成的组。
本发明使用的术语“亚烷基”，除非另有说明，是指二价的烷基基团，如本发明所述定义。在一些或任一实施方案中，亚烷基未被取代。
“烯基”是指烯属不饱和烃基基团，在某些实施方案中，具有多达约11个碳原子或2-6个碳原子，其可以是直链或支链的，并且具有至少1个或1-2个烯基不饱和位点。
“亚烯基”是指二价的如本发明所定义的烯基。低级亚烯基是C2-C6-亚烯基。
“炔基”是指炔属不饱和烃基基团，在某些实施方案中，具有多达约11个碳原子或2-6个碳原子，其可以是直链或支链的，并且具有至少1个或1-2个炔基不饱和位点。炔基基团的非限制性实例包括炔属乙炔基(-C≡CH)、炔属炔丙基(-CH2C≡CH)等。
“亚炔基”是指二价的如本发明所定义的炔基。低级亚炔基是C2-C6-亚炔基。
本发明使用的术语“芳基”，除非另有说明，是指苯基、联苯基或萘基。所述术语包括取代和未取代的基团部分。芳基基团可被任何所描述的基团取代，包括但不限于选自由以下组成的组的一个或多个基团部分：卤素(氟、氯、溴或碘)、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸、磷酸酯或膦酸酯，其是未保护的、或者必要时被保护的，如本领域技术人员已知的，例如，在Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,Second Edition,1991中所教导的，其中芳基氨基和芳氧基取代基中的芳基未被进一步取代。
本发明使用的术语“亚芳基”，除非另有说明，是指二价的芳基基团，如本发明所述定义。
“亚烷基芳基”是指如本发明所定义的亚芳基基团，其中所述芳基环被一个或两个烷基基团取代。“取代的亚烷基芳基”是指亚烷基芳基，如本发明所述定义，其中所述亚芳基基团被进一步取代，如芳基中所定义。
“亚芳基烷基”是指-CH2-亚芳基-、-亚芳基-CH2-、或-CH2-亚芳基-CH2-基团，其中亚芳基如本发明所定义。“取代的亚芳基烷基”是指亚芳基烷基，如本发明所述定义，其中所述亚芳基烷基基团是经取代的，如芳基中所定义。
“烷氧基”和“烷氧基基团”是指基团-OR″，其中R″是烷基或环烷基。举例来说，烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基等。
“烷氧基羰基”是指-C(O)-烷氧基基团(radical)，其中烷氧基如本发明所定义。
“氨基”是指-NH2基团。
本发明使用的术语“烷基氨基”，除非另有说明，是指基团-NHR″，其中R″是C1-10烷基，如本发明所述定义。在一些或任一实施方案中，所述烷基氨基是C1-6烷基氨基。
本发明使用的术语“环烷基”，除非另有说明，是指饱和的环状烃。在某些实施方案中，所述环烷基可以是饱和的、和/或桥接的、和/或非桥接的、和/或稠合的二环基团。在某些实施方案中，所述环烷基包含3-10个碳原子，即C3至C10环烷基。在一些实施方案中，所述环烷基具有3-15(C3-15)、3-10(C3-10)或3-7(C3-7)个碳原子。在某些实施方案中，所述环烷基为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己基甲基、环庚基、双环[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、十氢化萘基或金刚烷基。在一些或任一实施方案中，环烷基被1、2或3个独立地选自卤素(氟、氯、溴或碘)、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、烷基氨基和烷氧基的基团取代。
本发明使用的术语“亚环烷基”是二价的环烷基基团，如本发明所述定义。低级亚环烷基是指C3-C6-亚环烷基。
本发明使用的术语“二烷基氨基”，除非另有说明，是指基团-NR″R″，其中各R″独立地为C1-10烷基，如本发明所述定义。在一些或任一实施方案中，所述二烷基氨基是二-C1-6烷基氨基。
“羧基”或“羧基基团”是指基团-C(O)OH。
本发明使用的“稠合双环芳基”是萘基。
本发明使用的“低级亚杂烷基”是指低级亚烷基基团，其中1、2或3个碳原子被独立地选自N、O和S(O)0-2的杂原子替代。
术语“杂环基”或“杂环的”是指一价的单环非芳香族环体系和/或含有至少一个非芳香族环的多环体系，其中一个或多个所述非芳香族环原子是独立地选自O、S、或N的杂原子和非芳香族环的其余环原子是碳原子，以及其中任何芳香族环原子是任选地独立地选自O、S或N的杂原子和非芳香族环的其余环原子是碳原子。在某些实施方案，所述杂环基或杂环基基团具有3至20、3至15、3至10、3至8、4至7、4至11、或5至6个环原子。杂环基基团通过非芳香族环与所述分子的其余部分连接。在某些实施方案中，所述杂环基为单环、二环、三环或四环环体系，其可包括稠合的或桥接的环体系，并且其中氮原子或硫原子可任选被氧化，氮原子可任选被季铵化，且一些环可以是部分或完全饱和的或芳香性的。所述杂环基可于其非芳香族环的任何杂原子或碳原子处与所述主体结构连接，从而形成稳定的化合物。杂环烷基是指杂环，其为一价的、单环或多环的、非芳香族环体系。在一些或任一实施方案中，杂环烷基是一价的、单环的或多环的、完全饱和的环体系。这样的杂环和/或杂环烷基基团的实例包括但不限于，2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛基、3,9-二氮杂双环[3.3.2]癸基、吖庚因基、苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻喃基、苯并噁嗪基、β-咔啉基、苯并二氢吡喃基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异噁嗪基、二氢呋喃基、二氢异吲哚基、二氢吡喃基、二氢吡唑基、二氢吡嗪基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氧杂环戊烷基、1,4-二噻烷基(1,4-dithianyl)、呋喃酮基、咪唑烷基、咪唑啉基、吲哚啉基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并二氢吡喃基、异香豆素基、异二氢吲哚基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、噁唑烷酮基、噁唑烷基、环氧乙烷基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、噻吗啉基、噻唑烷基、四氢喹啉基和1,3,5-三硫杂环己烷基。在某些实施方案中，杂环基也可如本发明所述的任选地被取代。在一些或任一实施方案中，杂环基和杂环烷基分别被1、2或3个独立地选自卤素(氟、氯、溴或碘)、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、烷基氨基和烷氧基的基团取代。在一些实施方案中，杂环烷基基团可包含1、2、3或4个杂原子。本领域技术人员可以认识到，4个原子组成的杂环烷基通常可包含1或2个杂原子，5-6个原子组成的杂环烷基通常可包含1、2或3个杂原子，和7-10个原子组成的杂环烷基通常可包含1、2、3或4个杂原子。
“亚杂环烷基”是指二价的杂环烷基，如本发明所述定义。
“N-连接杂环烷基”或“N-连接杂环基”是指如前所定义的包含至少1个N的杂环烷基，其中所述杂环烷基通过非芳香族环上的N原子连接到主体结构。在一些或任一实施方案中，所述N-连接杂环烷基和/或N-连接杂环基是完全饱和的。
术语“杂芳基”是指一价的单环芳香族基团和/或多环芳香族基团，其中至少一个芳香族环在环中含有一个或多个独立选自O、S和N的杂原子。杂芳基基团的每个环可含有一个或两个O原子、一个或两个S原子和/或1-4个N原子，条件是各环中杂原子的总数为4个或更少，且每个环含有至少一个碳原子。在某些实施方案中，所述杂芳基具有5-20、5-15或5-10个环原子。杂芳基可通过氮原子或碳原子连接到所述分子的其余部分。在一些实施方案中，单环杂芳基基团包括但不限于呋喃基、咪唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁二唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、四唑基、三嗪基和三唑基。二环杂芳基基团的实例包括但不限于苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并呲喃基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并噁唑基、呋喃并吡啶基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲哚嗪基、吲哚基、吲唑基、异苯并呋喃基、异苯并噻吩基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、萘啶基、噁唑并吡啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、吡咯并吡啶基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噻二唑并嘧啶基和噻吩并吡啶基。三环杂芳基基团的实例包括但不限于吖啶基、苯并吲哚基、咔唑基、二苯并呋喃基、咟啶基(perimidinyl)、菲咯啉基、菲啶基、吩吡嗪基(phenarsazinyl)、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基和呫吨基。在某些实施方案中，杂芳基还可如本发明所述被任选取代。“取代的杂芳基”是如对芳基所定义的取代的杂芳基。
术语“亚杂芳基”是指二价的杂芳基基团，如本发明所定义。“取代的亚杂芳基”是如对芳基所定义的取代的亚杂芳基。
“部分饱和的杂芳基”是指包含至少一个非芳香族环和至少一个芳香族环的多环(例如，双环、三环)稠合环体系，其中一个或多个非芳香族环原子和/或一个或多个芳香族环原子是独立地选自O、S和N的杂原子，其余环原子是碳原子。部分饱和的杂芳基基团通过芳香族环与所述分子的其余部分连接。在某些实施方案中，所述部分饱和的杂芳基基团具有6-20、6-15、6-10、6-8或8-11个环原子。在某些实施方案中，所述部分饱和的杂芳基基团具有8、9、10或11个环原子(在一些实施方案中是9或10个)。所述部分饱和的杂芳基可于其芳香环的任何杂原子或碳原子处与所述主体结构连接，从而产生稳定的化合物。在一些或任一实施方案中，氧代基团可作为环原子之一上的取代基存在。部分饱和的杂芳基基团由以下之一组成或包含以下一项或多项：苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻喃基、苯并噁嗪基、苯并二氢吡喃基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异噁嗪基、二氢呋喃基、二氢异吲哚基、二氢吡喃基、二氢吡唑基、二氢吡嗪基、四氢吡嗪基、二氢吡嗪酮基、二氢吡啶基、四氢吡啶基tetrahydropyridinyl、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、呋喃酮基、咪唑啉基、吲哚啉基、四氢吲哚基tetrahydroindolyl、异二氢吲哚基(异吲哚啉基)、四氢异吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并二氢吡喃基、异香豆素基、异二氢吲哚基(异吲哚啉基)、二氢异噁唑基、噁嗪基、二氢噁嗪基、氧代-噁唑基、二氢噁唑基、二氢哌啶酮基(dihydropiperidonyl)、二氢-4-哌啶酮基(dihydro-4-piperidonyl)、二氢吡唑基、二氢吡唑啉基、二氢吡咯基、氮杂双环[2.2.2]辛-2-烯基、二氢呋喃基、四氢异喹啉基、二氢吡喃基、吡喃基、二氢噻吩基、噁噻嗪基(oxathiazinyl)、二氢噻唑基、四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪基。在某些实施方案中，所述部分饱和的杂芳基基团是苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻喃基、苯并噁嗪基、苯并二氢吡喃基、色酮基、香豆素基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异噁嗪基、二氢异吲哚基、吲哚啉基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并二氢吡喃基、异香豆素基、异二氢吲哚基(异吲哚啉基)、四氢异喹啉基、四氢喹啉基或5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪基。在某些实施方案中，部分饱和的杂芳基还可如本发明所述任选被取代。
“螺杂环的”或“螺杂环”或“螺杂环烷基”是指杂环，如本发明所定义，其包含通过一个共同原子彼此连接的两个环。螺杂环的非限制性实例包括通过一个共同原子连接到另一个环的氮杂环丁烷、吗啉环和/或哌啶环(例如，如下所示的环B)：
本发明使用的术语“保护基团”，除非另有说明，是指加至氧、氮或磷原子上以防止其进一步反应或用于其它目的的基团。各种各样的氧保护基团和氮保护基团对有机合成领域的技术人员而言是已知的。
“药学上可接受的盐”是指本发明提供的化合物的任何盐，其保留其生物学特性，并且是无毒的或在其他方面对于医药用途是不合需要的。此类盐可衍生自本领域公知的各种有机和无机反离子。此类盐包括但不限于：(1)与有机或无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，氨基磺酸，乙酸，三氟乙酸，三氯乙酸，丙酸，己酸，环戊基丙酸，乙醇酸，戊二酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，山梨酸，抗坏血酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，苦味酸，肉桂酸，扁桃酸，邻苯二甲酸，月桂酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙烷二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，4-氯苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲苯磺酸，樟脑酸，樟脑磺酸，4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，苯甲酸，谷氨酸，羟萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，环己基氨基磺酸，奎尼酸，粘康酸等形成的酸加成盐；或(2)当母体化合物中存在酸性质子，则(a)被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，或碱金属或碱土金属氢氧化物如氢氧化钠、钾、钙、镁、铝、锂、锌和钡，或氨，置换时形成的盐，或(b)与有机碱，例如脂族、脂环族或芳香族有机胺类如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等配位形成碱加成盐。
仅作为示例而非限制，药学上可接受的盐进一步包括，钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；当所述化合物含有碱性官能团时，无毒有机或无机酸的盐，如氢卤化物类例如盐酸盐和氢溴酸盐，硫酸盐，磷酸盐，氨基磺酸盐，硝酸盐，乙酸盐，三氟乙酸盐，三氯乙酸盐，丙酸盐，己酸盐，环戊基丙酸盐，乙醇酸盐，戊二酸盐，丙酮酸盐，乳酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，山梨酸盐，抗坏血酸盐，苹果酸盐，马来酸盐，富马酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，苯甲酸盐，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐，苦味酸盐，肉桂酸盐，扁桃酸盐，邻苯二甲酸盐，月桂酸盐，甲烷磺酸盐(甲磺酸盐)，乙磺酸盐，1,2-乙烷二磺酸盐，2-羟基乙磺酸盐，苯磺酸盐(苯磺酸盐)，4-氯苯磺酸盐，2-萘磺酸盐，4-甲苯磺酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸盐，葡庚糖酸盐，3-苯基丙酸盐，三甲基乙酸盐，叔丁基乙酸盐，月桂基硫酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，谷氨酸盐，羟基萘甲酸盐，水杨酸盐，硬脂酸盐，环己基氨基磺酸盐，奎尼酸盐，粘康酸盐等。
就组合物而言，术语“基本上不含”或“基本上不存在”是指组合物包含至少85重量％或90重量％，在某些实施方案中，包含95重量％、98重量％、99重量％或100重量％的所述化合物的指定对映异构体。在某些实施方案，在本发明提供的方法和化合物中，所述化合物基本上不含对映异构体。
同理，就组合物而言，术语“分离的”是指组合物包含至少85重量％、90重量％、95重量％、98重量％、99重量％至100重量％的所述化合物，其余的包含其他化学物质或对映异构体。
“溶剂化物”是指本发明提供的化合物或其盐进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的量的溶剂。当所述溶剂是水时，所述溶剂化物是水合物。
“同位素组成”是指对于给定原子存在的每种同位素的量，“天然同位素组成”是指给定原子的天然存在的同位素组成或丰度。含有其天然同位素组成的原子在本发明中也可被称为“非富集的”原子。除非另有指明，否则本发明所述化合物的原子意在表示所述原子的任何稳定同位素。譬如，除非另有说明，当位置被具体指定为“H”或“氢”时，所述位置被理解为具有其天然同位素组成的氢。
“同位素富集”是指在分子中的给定原子处代替所述原子的天然同位素丰度的特定同位素的量的掺入百分比。例如，给定位置1％的氘富集是指给定样品中1％的所述分子在所述指定位置含有氘。由于氘的天然分布为约0.0156％，所以使用非富集起始物料合成的化合物中任何位置的氘富集为约0.0156％。本发明提供的化合物的同位素富集可使用本领域普通技术人员已知的常规分析方法，包括质谱法和核磁共振光谱法进行测定。
“同位素富集的”是指具有除所述原子的天然同位素组成以外的同位素组成的原子。“同位素富集的”还可指含有至少一个具有除所述原子的天然同位素组成之外的同位素组成的原子的化合物。
本发明使用的“烷基”、“亚烷基”、“烷基氨基”、“二烷基氨基”、“环烷基”、“芳基”、“亚芳基”、“烷氧基”、“烷氧基羰基”、“氨基”、“羧基”、“杂环基”、“杂环烷基”、“杂芳基”、“亚杂芳基”、“部分饱和的杂芳基”、“螺-杂环基”、“羧基”和“氨基酸”基团在存在氢原子的一个或多个位置处，任选地包含氘，和其中所述原子的氘组成并非天然同位素组成。
本发明使用的“烷基”、“烷基氨基”、“二烷基氨基”、“环烷基”、“芳基”、“亚芳基”、“烷氧基”、“烷氧基羰基”、“氨基”、“羧基”、“杂环基”、“杂环烷基”、“杂芳基”、“亚杂芳基”、“部分饱和的杂芳基”、“螺-杂环基”、“羧基”和“氨基酸”基团任选地以除所述天然同位素组成之外的量包含C-13。
本发明使用的EC50是指特定测试化合物的剂量、浓度或量，其引发在特定测试化合物诱导、引发或加强的特定响应最大表达的50％时的剂量依赖性响应。
本发明使用的IC50是指在测定此响应的测试中达到最大响应的50％抑制的特定测试化合物的量、浓度或剂量。
本发明使用的术语“受试者”和“患者”在此处可互换使用。术语“受试者”是指动物，诸如包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、犬、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴如食蟹猴、黑猩猩和人)的哺乳动物，例如是人。在某些实施方案中，所述受试者对当前的丙型肝炎感染治疗无效或无反应。在另一实施方案中，所述受试者是农场动物(例如，马、牛、猪等)或宠物(例如，犬或猫)。在某些实施方案中，所述受试者是人。
本发明使用的术语“治疗剂”和“治疗药物/药剂”是指可用于治疗或预防疾病/病症或其一种或多种症状的任何药物/药剂。在某些实施方案中，术语“治疗剂”包括本发明提供的化合物和/或抗体偶联物。在某些实施方案中，治疗剂是已知可用于或已经或当前正用于治疗或预防疾病/病症或其一种或多种症状的药物/药剂。
本发明使用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指当向受试者施用时可有效治疗疾病或病症的抗体或组合物的量。在一些实施方案，治疗有效量或有效量是指当施用于受试者时有效预防或改善疾病或疾病进展或导致症状改善的抗体或组合物的量。“治疗有效量”可根据，尤其是所述化合物，所述病症及其严重程度，以及待治疗的所述受试者的年龄、体重等而变化。
在某些实施方案，“治疗/处理”任何疾病或病症是指改善存在于受试者的疾病或病症。在另一实施方案中，“治疗”或“处理”包括改善至少一种物理参数，此参数可能无法被所述受试者感知。在又一实施方案中，“治疗”或“处理”包括调节所述疾病或病症，不论是物理学上(例如稳定可感知的症状)或生理学上(例如稳定生理参数)或两者兼具。在另一实施方案中，“治疗”或“处理”包括推迟或预防所述疾病或病症发作，或推迟或预防所述疾病或病症复发。在又一实施方案中，“治疗”或“处理”包括减少或消除疾病或病症，或延缓疾病或病症或疾病或病症的一种或多种症状的进展，或降低疾病或病症或疾病或病症的一种或多种症状的严重程度。
本发明使用的术语“抑制生长”(例如，指涉细胞，诸如肿瘤细胞)旨在包括同不与抗体或抗体偶联物接触的相同细胞的生长相比，当与抗体或抗体偶联物接触时细胞生长(例如，肿瘤细胞生长)的任何可测定的减少。在一些实施方案中，生长可以被抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、或100％。细胞生长的减少可通过多种机制发生，包括但不限于抗体内化、细胞凋亡、坏死和/或效应子功能介导的活性。
本发明使用的术语“预防剂”和使用的“预防药物/药剂”是指可用于预防疾病/病症或其一种或多种症状的任何药物/药剂。在某些实施方案中，术语“预防剂”包括本发明提供的化合物。在某些其他实施方案中，术语“预防剂”并非本发明提供的化合物。例如，预防剂是已知可用于或已经或正在用于预防或阻止疾病/病症发作、发展、进展和/或严重程度的药物/药剂
本发明使用的短语“预防有效量”是指足以导致预防或减少与疾病/病症相关的一种或多种症状的发展、复发或发作的治疗/疗法(例如，预防剂)的量，或者增强或改善另一种治疗/疗法(例如，另一种预防剂)的预防效果的量。
在本发明所示的一些化学结构中，某些取代基、化学基团和原子用曲线/波浪线(例如，
)描绘，所述曲线/波浪线与一个或多个键相交以表示通过其来连接所述取代基、化学基团和原子的原子。例如，在某些结构中，例如但不限于
所述曲线/波浪线表示与所示化学实体连接的偶联物或连接体-有效负载结构主链中的原子。在一些结构中，例如但不限于
所述曲线/波浪线表示与所示化学实体连接的抗体或抗体片段中的原子以及与所示化学实体连接的偶联物或连接体-有效负载结构主链中的原子。
术语“位点特异性”是指多肽在所述多肽中预定序列位置处的修饰。修饰是在多肽的单个可预测残基上，几乎没有或没有变化。在特定实施方案，将修饰的氨基酸，例如通过重组或合成引入所述序列位置处。类似地，基团部分可“位点特异性”连接至多肽中特定序列位置处的残基。在某些实施方案中，多肽可包含一个以上的位点特异性修饰。
2.有效负载——式(I-P)和(I)及其子式所示化合物
本发明提供了可调节与Toll样受体7/8相关的疾病或病症的活性的化合物。所述吡唑并喹啉化合物可以如本发明所述形成并用于治疗与Toll样受体7/8相关的疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病或病症是癌症或炎性疾病或病症。
本发明所述的实施方案包括所述化合物以及它们的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或它们的混合物。
一方面，本发明提供了式(I-P)所示化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基、或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和–CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C1-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C1-6环烷基、芳基或杂芳基取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，和其中环烷基、芳基和杂芳基分别任选地进一步被卤素、羟基、烷基或卤代烷基取代。
另一方面，本发明提供了式(I)所示化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-6个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-6个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且任分别选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H，
其中q1是1、2或3，和–CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地进一步被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷基和卤代烷基的基团取代。
在一组实施方案中，式I所示化合物具有式(II)所示结构：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环A是6个原子组成的芳基环或6个原子组成的杂芳基环，其中Y1、Y2、Y3和Y4各自独立地选自C和N；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-6个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-6个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和-CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，其中R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地被1或2个(在一些实施方案中是1个)独立地选自卤素、羟基、烷基和卤代烷基的基团取代。
在式(I-P)、(I)和/或式(II)所示化合物的一些实施方案中，环A是苯基环。在式(I-P)、(I)和/或式(II)所示化合物的一些实施方案中，环A是单环杂芳基环。在式(I-P)、(I)和/或式(II)所示化合物的一些实施方案中，环A是吡啶基。在式(I-P)、(I)和/或式(II)所示化合物的一些实施方案中，环A是稠合双环杂芳基环。在式(I-P)和(I)所示化合物的一些实施方案中，环A是环烷基环。在式(I-P)和(I)所示化合物的一些实施方案中，环A是杂环烷基环。
在式(I-P)、(I)和/或式(II)所示化合物的一些实施方案中，在环A上，至少一个-OR4位于相对于基团
的邻位，其中各
分别表示附接至通式其余部分的连接点。
在一组实施方案中，式(I-P)、(I)和/或式(II)所示化合物具有式(III)所示结构：
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环B是N连接氮杂环丁烷基环，所述N连接氮杂环丁烷基环被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是N-连接哌啶基环、N-连接哌嗪基环、N-连接吗啉基环、或N-连接三唑基环，所述N-连接哌啶基环、N-连接哌嗪基环、N-连接吗啉基环、或N-连接三唑基环被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是未取代的2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛基或3,9-二氮杂双环[3.3.2]癸基；
或者
环B是5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中所述杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基、和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和-CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-3烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环丙基；
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，其中R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地被卤素、羟基、烷基、或卤代烷基取代。
在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R1a和R1b各自为H。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R2a和R2b各自为H。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b各自为H。
在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R4是甲基、乙基、丙基或异丙基。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R4是甲基。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R4是乙基。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R4是丙基。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R4是异丙基。在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R4是丁基、异丁基、戊基、新戊基、或已基。
在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代；其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地被卤素、羟基、烷基或卤代烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基和C1-6二烷基氨基的R5a基团取代。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被1或2个羟基取代。在一些这样的情况下，R5是支链C1-6烷基，所述支链C1-6烷基任选地被1或2个羟基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被羟基或烷氧基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5为
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C3-6烷基，所述C3-6烷基任选地被C3-6环烷基取代。在一些这样的情况下，R5是-CH2-环丙基或-CH2-环丁基。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被芳基或杂芳基取代；其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中芳基和杂芳基分别任选地进一步被卤素、烷基、或卤代烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是C3-6环烷基，所述C3-6环烷基任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代；其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中的任一基团任选地被卤素、羟基、烷基、或卤代烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，R5是未取代的C3-6环烷基。在一些这样的情况下，R5是环丙基或环丁基。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基、和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基、和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基、和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被1-3个R3取代的完全饱和的杂环烷基环。在式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被连接到同一碳原子的2个R3取代的完全饱和的杂环烷基环，所述连接到同一碳原子的2个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中螺杂环烷基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代。
在式(I-P)、(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被1-2个R3取代的N-连接氮杂环丁基环，被1-2个R3取代的N-连接哌啶基环，被1-2个R3取代的N-连接三唑基环，被1-2个R3取代的N-连接吗啉基环，或被1-2个R3取代的N-连接哌嗪基环。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被2个R3取代的N-连接氮杂环丁基环，被2个R3取代的N-连接哌啶基环，被2个R3取代的N-连接吗啉基环，或被2个R3取代的N-连接哌嗪基环；其中所述2个R3连接至同一碳原子，且同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基，所述螺杂环烷基任选地被1或2个C1-C6烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B被1或2个选自NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(C3-C6环烷基)、杂环烷基、四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪基、-C(R3c)2NH2、OH、
5个原子组成的杂芳基(任选地被1或2个烷基取代)、和-O-CH2-苯基-CH2NH2的基团取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被1-2个R3取代的N-连接氮杂环丁基环。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是未取代的2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛基、或3,9-二氮杂双环[3.3.2]癸基。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是哌啶环或吗啉基环，所述哌啶环或吗啉基环被1-3个R3取代。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被1-3个R3取代的哌嗪基环。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，环B是被1-3个R3取代的5-6个原子组成的杂芳基。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，
中的环B是被1-3个R3取代的4、5、或6个原子组成的完全饱和的杂环烷基环。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，
中的环B是被连接至同一碳原子的2个R3取代的4、5、或6个原子组成的完全饱和的杂环烷基环，其中所述连接至同一碳原子的2个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基，其中螺杂环烷基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些实施方案中，
是
和/或
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。在一些这样的实施方案中，在一种情况下，R5是戊基，和
是一个或多个上述基团。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；环B是被2个R3取代的N-连接氮杂环丁烷基，所述2个R3同与之连接的所述原子一起形成螺杂环烷基。在一些这样的实施方案中，所述螺杂环烷基选自螺氮杂环丁烷基、螺吗啉基、螺(偕二甲基)吗啉基、或螺哌啶基，所述各螺杂环烷基分别如本发明所述任选地被取代。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；环B是被1-2个R3取代的氮杂环丁烷环，其中各R3独立地选自-OH、-NH2、-CH3、
及其组合。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；环B是N-连接氮杂环丁烷，所述N-连接氮杂环丁烷被
取代。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；环B是N-连接氮杂环丁烷，所述N-连接氮杂环丁烷被本发明和/或本段中描述的R3的任何组合取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环B是N-连接吗啉基或N-连接哌啶基，所述N-连接吗啉基或N-连接哌啶基被2个R3取代，所述2个R3同与之连接的所述原子一起形成螺杂环烷基。在一些这样的实施方案中，所述螺杂环烷基是氮杂环丁烷基环或哌啶基环。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环B是被部分饱和的杂芳基取代的N-连接哌啶基环。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环B是被杂芳基环取代的哌嗪基环，所述杂芳基环任选地被C1-3烷基取代。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环B是被1-2个R3取代的N-连接杂芳基。在一些这样的实施方案中，环B是被1-2个R3取代的N-连接三唑基。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R3是甲基。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环B是N-连接环，所述N-连接环被本发明和/或本段中描述的R3的任何组合取代。
在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环A是苯基环，所述苯基环在基团
的邻位被1个甲氧基基团取代，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。在式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的一些或任一前述实施方案中，R1a、R1b、R2a和R2b是H；R5是戊基；和环A是苯基环，所述苯基环在基团
的邻位被两个甲氧基基团取代，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
一方面，式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，选自由以下组成的组：
上述化合物用作本发明所述抗体药物偶联物中的有效负载。除上述有效负载外，分子有效负载可以是本领域技术人员可能希望偶联至多肽的任何分子实体。在某些实施方案中，所述有效负载是治疗性基团部分(例如，式(I-P)、式(I)或其子式所示的化合物，如本发明所述)。在此类实施方案中，所述抗体偶联物可用于将治疗性基团部分(例如，式(I-P)、式(I)或其子式所示的TLR7激动剂，如本发明所述)靶向其分子靶标。本领域技术人员已知的其他TLR7激动剂包括但不限于，4-氨基-2-丁氧基-7,8-二氢-8-[[3-(1-吡咯烷基甲基)苯基]甲基]-6(5H)-蝶啶酮(维托莫德(vesatolimod)，GS9620，CAS号1228585-88-3)、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹诺酮-4-胺(咪喹莫特(imiquimod)，CAS号99011-02-6)、1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(雷西莫特(resiquimod)，CAS号144875-48-9)、N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺(3M-001)、2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(3M-002)、4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α,α-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹诺酮-1-乙醇水合物(3M-003)、N-(1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)甲磺酰胺(CAS号642473-62-9，3M-011或854A)、和N-(4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)甲磺酰胺(CAS号532959-63-0，3M-852A，PF-4878691)、2-甲基-1-(2,2,4-三甲基戊-4-烯-1-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(S-34240)、洛索立宾(loxoribine)、CL264、ssRNA40、R848、和SM-276 001。
3.偶联物
本发明提供了针对TLR7激动剂(例如，本发明所述任何TLR7激动剂)的抗体的偶联物。所述偶联物包含经由连接体直接或间接共价连接至有效负载的合适抗原(例如，肿瘤抗原)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体与一个有效负载连接。在进一步的实施方案中，所述抗体与一个以上有效负载连接。在某些实施方案中，所述抗体与1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个有效负载连接。因此，药物与抗体的比率(DAR)可能在1至30之间变化。
所述有效负载可以是技术人员认为有用的任何有效负载。在某些实施方案中，所述有效负载是治疗性基团部分。在某些实施方案中，所述有效负载是诊断性基团部分，例如标记。有用的有效负载在以下章节和示例中进行了描述。
所述连接体可以是能够与抗体形成至少一个键且与有效负载形成至少一个键的任何连接体。有用的链接体在以下章节和示例中进行了描述。
抗体通常是包含多个多肽链的蛋白质。在某些实施方案中，抗体是异源四聚体，其包含两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链。每条轻链可通过一个共价二硫键与重链连接。每条重链可通过一个或多个共价二硫键与另一条重链连接。每条重链和每条轻链也可具有一个或多个链内二硫键。如本领域技术人员已知的，每条重链通常包含可变结构域(VH)，然后是多个恒定结构域。每条轻链通常在一个末端包含可变结构域(VL)以及包含恒定域结构域。如本领域技术人员已知的，抗体通常对其靶分子即抗原具有选择性亲和性。
本发明提供的抗体可具有本领域技术人员已知的任何抗体形式。它们可以是全长，也可以是片段。示例性全长抗体包括IgA、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM等。示例性片段包括Fv、Fab、Fc、scFv、scFv-Fc等。
在某些实施方案中，所述偶联物的抗体包含1、2、3、4、5或6个本发明所述的CDR序列。在某些实施方案中，所述偶联物的抗体包含本发明所述的重链可变结构域(VH)。在某些实施方案中，所述偶联物的抗体包含本发明所述的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，所述偶联物的抗体包含本发明所述的重链可变结构域(VH)和本发明所述的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，所述偶联物的抗体包含本发明所述的成对的重链可变结构域和轻链可变结构域(VH-VL对)。
在某些实施方案中，所述抗体偶联物可由包含一个或多个活性/反应性基团(reactive groups)的抗体形成。在某些实施方案中，所述抗体偶联物可由包含所有天然编码的氨基酸的抗体形成。本领域技术人员将认识到，几种天然编码的氨基酸包括能够与有效负载偶联或与连接体偶联的活性基团。所述这些活性基团包括半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链和氨基末端基团。在这些实施方案中，所述抗体偶联物可包含与抗体活性基团的残基连接的有效负载或连接体。在这些实施方案中，所述有效负载前体或连接体前体包含能够与抗体活性基团形成键的活性基团。典型的活性基团包括马来酰亚胺类基团，活化的碳酸酯类(包括但不限于对硝基苯酯)，活化的酯类(包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯、和醛类)。特别有用的活性基团包括马来酰亚胺和琥珀酰亚胺，例如N-羟基琥珀酰亚胺，其用于形成与半胱氨酸和赖氨酸侧链连接的键。其他活性基团在以下章节和示例中进行描述。
在进一步的实施方案中，所述抗体包含具有活性基团的一个或多个经修饰的氨基酸，如本发明所述。通常，经修饰的氨基酸不为天然编码的氨基酸。所述这些经修饰的氨基酸可包含用于与连接体前体或有效负载前体形成共价键的活性基团。本领域技术人员可使用活性基团将多肽连接至能够与经修饰的氨基酸形成共价键的任何分子实体。因此，本发明提供了包含抗体的偶联物，所述抗体包含经修饰的氨基酸残基，所述经修饰的氨基酸残基经由连接体直接或间接连接至有效负载。示例性经修饰的氨基酸在以下章节中进行描述。通常，经修饰的氨基酸具有能够与具有互补活性基团的连接体或有效负载形成键的活性基团。
在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于抗体的多肽链中的选定位置。所述这些位置被识别为提供非天然氨基酸置换的最佳位点。每个位点均能够携带具有最佳结构、功能和/或生成抗体的方法的非天然氨基酸。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了稳定的抗体。可通过本领域技术人员显而易见的任何技术来测定稳定性。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了具有最佳功能特性的抗体。例如，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体对其靶抗原的结合亲和性几乎没有或没有损失。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的结合。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了可被有利制得的抗体。例如，在某些实施方案中，抗体在其合成方法中显示出有利的性质。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体在生成产量上几乎没有损失或没有损失。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出提高的生成产量。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出几乎没有或没有tRNA抑制的损失。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体在生成中可显示出增强的tRNA抑制。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了具有有利溶解性的抗体。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体的溶解度几乎没有损失或没有损失。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的溶解度。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了具有有利表达的抗体。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出几乎没有或没有表达损失。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的表达。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了具有有利折叠性的抗体。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体在适当折叠中几乎没有损失或没有损失。在某些实施方案中，与不具有位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的折叠性。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供了能够有利地偶联的抗体。如下所述，几种非天然氨基酸具有侧链或官能团，其可直接或间接经由连接体促进抗体与第二药物偶联。在某些实施方案中，与在其他位置不具有相同或其他非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的偶联效率。在某些实施方案中，与在其他位置不具有相同或其他非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的偶联产率。在某些实施方案中，与在其他位置不具有相同或其他非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可显示出增强的偶联特异性。
在一些实施方案中，一个或多个非天然氨基酸位于抗体的至少一条多肽链中的选定位点特异性位置。多肽链可以是抗体的任何多肽链，没有限制，包括轻链或重链。位点特异性位置可在抗体的任何结构域中，包括任何可变结构域和任何恒定结构域。
在某些实施方案中，本发明提供的抗体在位点特异性位置处包含一个或一个以上非天然氨基酸。在某些实施方案中，本发明提供的抗体在位点特异性位置处包含两个非天然氨基酸。在某些实施方案中，本发明提供的抗体在位点特异性位置处包含三个非天然氨基酸。在某些实施方案中，本发明提供的抗体在位点特异性位置处包含三个以上的非天然氨基酸。
在某些实施方案，本发明提供的抗体包含一个或多个非天然氨基酸，其各自位于独立地选自由以下重链残基或轻链残基组成的组的位置处：HC-F404、HC-K121、HC-Y180、HC-F241、HC-221、LC-T22、LC-S7、LC-N152、LC-K42、LC-E161、LC-D170、HC-S136、HC-S25、HC-A40、HC-S119、HC-S190、HC-K222、HC-R19、HC-Y52、或HC-S70，(根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)或EU编号方案)，或其翻译后经修饰的变体。在某些实施方案中，本发明提供的抗体包含一个或多个非天然氨基酸，其各自位于独立地选自由以下组成的组的位置处：HC-180、HC-222、LC-7、或LC-42，(根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)或EU编号方案)，或其翻译后经修饰的变体。在这些指定名称中，HC表示重链残基，和LC表示轻链残基。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于HC-F404处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于HC-Y180处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于HC-F404和HC-Y180处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于HC-K222处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于LC-S7处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于LC-K42处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于HC-Y180、HC-K222、LC-S7、和/或LC-K42处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸位于HC-F241、HC-K121、和/或HC-S190处。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸是相同的。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸是不同的。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸是本发明式(30)所示残基。
在一些实施方案中，所述抗体序列可包含与转谷氨酰胺酶偶联相容的Q-标记序列。在一些实施方案中，所述一个或多个谷氨酰胺残基位于独立地选自由以下组成的组的Q标记处：LLQGA、YAHQAHY、YRYRQ、PNPQLPF、PKPQQFM、GQQQLG、WALQRPH、WELQRPY、YPMQGWF、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG、GSPLAQSHGG、GLLQGGG、GLLQGG、GLLQ、LLQLLQGA、LLQGA、LLQYQGA、LLQGSG、LLQYQG、LLQLLQG、SLLQG、LLQLQ、LLQLLQ、LLQGR、LLQGPA、LLQGPP或GGLLQGPP。
在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标记包含至少一个Gln。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标记包含氨基酸序列XXQX，其中X是任何氨基酸(例如，常见氨基酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gin、Ile、Met、Pro、Thr、Lys或Trp或非常见氨基酸)。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标记(Q标记)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：LLQGG、LLQG、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG、GSPLAQSHGG、GLLQGGG、GLLQGG、GLLQ、LLQLLQGA、LLQGA、LLQYQGA、LLQGSG、LLQYQG、LLQLLQG、SLLQG、LLQLQ、LLQLLQ、LLQGR。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标记(Q标记)包含选自由LLQGPA、LLQGPP或GGLLQGPP组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标记(Q标记)包含选自由LLQGG和LLQGA组成的组的氨基酸序列。在此类实施方案中，在转谷氨酰胺酶存在的情况下，带有氨基基团的连接体有效负载可偶联至抗体中一个或多个谷氨酰胺(Q)残基的侧链。
在某些实施方案中，本发明提供了式(C1)或(C2)所示偶联物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、区域异构体、或互变异构体，其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段的残基；
PA是有效负载；
W1、W2、W3、W4和W5各自独立地为单键，或各自独立地不存在，或各自独立地为二价连接基团；
EG不存在，或EG为消除基团；
在式(C1)或(C2)的结构骨架中的各RT不存在或是释放引发基团，或RT，当与EG连接且EG是消除基团是，是H或释放引发基团；
各HP是单键，或各HP不存在，或各HP是一价亲水基团或二价亲水基团；
SG是单键，或SG不存在，或SG是二价间隔基团；
R′是末端偶联基团的二价残基；和
下标n是选自1至30的整数。
在一些实施方案中，n是选自1至8的整数。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。在一些实施方案中，n是7。在一些实施方案中，n是8。
3.1连接基团
连接基团有助于将消除基团、释放引发基团、疏水基团、间隔基团和/或偶联基团结合到化合物上。有用的连接基团是本领域技术人员已知的并且对本领域技术人员而言是显而易见的。本发明提供了有用的连接基团的实例。在某些实施方案中，连接基团指称为W1、W2、W3、W4或W5。在某些实施方案中，连接基团可包含二价酮、二价酯、二价醚、二价酰胺、二价胺、亚烷基、亚芳基、硫化物、二硫化物、亚羰基、或其组合。在某些实施方案中，连接基团可包含–C(O)–、–O–、–C(O)NH–、–C(O)NH-烷基–、–OC(O)NH–、–SC(O)NH–、–NH–、–NH-烷基–、–C(O)N(CH3)–、–C(O)N(CH3)-烷基–、-N(CH3)-、–N(CH3)-烷基–、–N(CH3)CH2CH2N(CH3)–、–C(O)CH2CH2CH2C(O)–、–S–、–S-S–、–OCH2CH2O–、或其反向基团(例如–NHC(O)–)、或其组合。
3.2消除基团
消除基团有助于体内和/或体外将本发明所述的化合物或偶联物的生物学活性部分与所述化合物或偶联物的其余部分分离开来。消除基团还可连同释放引发基团一起促进本发明所述化合物或偶联物的生物学活性部分的分离。例如，消除基团和释放引发基团可在释放反应中反应，以在体内和/或体外从所述化合物或偶联物中释放本发明所述的化合物或偶联物的生物学活性部分。通过释放引发基团引发释放反应后，消除基团切割生物活性基团部分或生物活性基团部分的前药形式，并形成稳定的无毒实体，所述实体对此生物活性基团部分的活性没有进一步影响。
在某些实施方案，所述消除基团在本发明中指称为EG。有用的消除基团包括本发明所述的那些。在某些实施方案中，所述消除基团是：
其中各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-。在各个结构中，苯环可与1、2、3个、或在某些情况下4个REG基团连接。在第二和第三结构中，本领域技术人员将认识到，EG与RT连接，所述RT如上式(C1)的上述说明所示，不在式(C1)的主链内。在一些实施方案中，各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-。在进一步的实施方案中，各REG独立地是选自由H、-NO2、-CN、氟、溴和氯组成的组。在某些实施方案中，所述消除基团是
在某些实施方案中，所述消除基团是
在某些实施方案中，所述消除基团是
在某些实施方案中，所述消除基团是
在一些实施方案中，所述消除基团是：
其中Z可以是CH或N，各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、和二烷基氨基-C(O)-。在各个结构中，苯环可与1、2、3个、或在某些情况下4个REG基团连接。在第二和第三结构中，本领域技术人员将认识到，EG与RT连接，所述RT如上式(C1)的上述说明所示，不在式(C1)的主链内。在一些实施方案中，各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、和二烷基氨基-C(O)-。在进一步的实施方案中，各REG独立地选自由H、-NO2、-CN、氟、溴和氯组成的组。在一些实施方案中，所述EG中的每个REG是H。在某些实施方案中，所述消除基团是
在某些实施方案中，所述消除基团是
在某些实施方案中，所述消除基团是
3.3释放引发基团
释放引发基团促进体内和/或体外将本发明所述的化合物或偶联物的生物学活性部分与所述化合物或偶联物的其余部分分离开来。释放引发基团还可连同消除基团一起促进本发明所述化合物或偶联物的生物学活性部分的分离。例如，消除基团和释放引发基团可在释放反应中反应，以在体内和/或体外从所述化合物或偶联物中释放本发明所述的化合物或偶联物的生物学活性部分。在某些实施方案中，释放引发基团可通过具有高的肿瘤：非肿瘤特异性的生物驱动反应来起作用，例如在肿瘤环境中过表达的酶的蛋白水解作用。
在某些实施方案中，所述释放引发基团在本发明中指称为RT。在某些实施方案中，RT是二价的且连接在式(C1)的主链内。在其他实施方案中，RT是一价的且如上所述连接至EG。有用的释放引发基团包括本发明所述的那些。在某些实施方案中，所述释放引发基团包含天然或非天然氨基酸的残基或糖环的残基。在某些实施方案中，所述释放引发基团是：
本领域技术人员将认识到，第一结构是二价的且可连接在式(C1)的主链内或如式(C2)所示在其主链内，和第二结构是一价的且可与上述式(C1)所示的EG连接。
在某些实施方案中，所述释放引发基团是
在某些实施方案中，所述释放引发基团是
在一些实施方案中，所述释放引发基团是具有以下结构的蛋白酶可切割的R1-Val-X1肽：
其中R1是与化合物其余部分连接的键或
和R2是-CH3、-CH2CH2CO2H、或-(CH2)3NHCONH2；具有以下结构的豆荚蛋白(legumain)可切割的Ala-Ala-Asn(AAN)或Ala-Ala-Asp(AAD)肽：
其中Z是OH或NH2；或具有以下结构的β-葡萄糖醛酸酶可切割的β-葡糖苷酸：
本领域技术人员将认识到，
均为二价结构且可连接在式(C1)的主链内或如式(C2)所示在其主链内。结构式
是一价的且可与上述式(C1)所示的EG连接。
3.4亲水基团
亲水基团有助于增加本发明所述化合物的亲水性。据信增加的亲水性使得在水溶液(例如在生物系统中存在的水溶液)中具有更大的溶解度。亲水基团也可用作间隔基团，其在本发明中将进一步详细描述。
在某些实施方案，所述亲水基团在本发明中指称为HP。有用的亲水基团包括本发明所述的那些。在某些实施方案，所述亲水基团是二价聚(乙二醇)。在某些实施方案，所述亲水基团是下式所示的二价聚(乙二醇)：
其中m是选自1至13的整数，任选地选自1至4的整数，任选地选自2至4的整数，或任选地选自4至8的整数。
在一些实施方案中，所述亲水基团是具有下式的二价聚(乙二醇)：
在一些其他实施方案中，所述亲水基团是具有下式的二价聚(乙二醇)：
在其他实施方案中，所述亲水基团是具有下式的二价聚(乙二醇)：
在其他实施方案中，所述亲水基团是具有下式的二价聚(乙二醇)：
在一些实施方案中，所述亲水基团可带有具有下式的链表示的磺酸：
3.5间隔基团
间隔基团有助于使偶联基团与本发明所述化合物的其他基团间隔开来。所述间隔可导致本发明所述化合物与第二化合物的更有效偶联以及活性分解代谢物的更有效切割/裂解。所述间隔基团还可稳定所述偶联基团，并导致改善的总体抗体-药物偶联物性质。
在某些实施方案中，所述间隔基团在本发明中指称为SG。有用的间隔基团包括本发明所述的那些。在某些实施方案中，所述间隔基团是：
在某些实施方案中，所述间隔基团W4与所述亲水基团组合以形成下式所示的聚(乙二醇)：
其中m是选自1至13的整数，任选地选自1至4的整数，任选地选自2至4的整数，或任选地选自4至8的整数。
在一些实施方案中，所述SG是
在一些实施方案中，所述二价聚(乙二醇)具有下式所示结构：
在一些其他实施方案中，所述二价聚(乙二醇)具有下式所示结构：
在其他实施方案中，所述二价聚(乙二醇)具有下式所示结构：
在其他实施方案中，所述二价聚(乙二醇)具有下式所示结构：
在一些实施方案中，所述亲水基团可带有具有下式的链表示的磺酸：
3.6偶联基团及其残基
偶联基团促进本发明所述有效负载与第二化合物(例如，本发明所述的抗体)偶联。在某些实施方案，所述偶联基团在本发明中指称为R。偶联基团可通过本领域技术人员已知的任何合适的反应机理进行反应。在某些实施方案中，如本发明详细描述的，偶联基团通过[3+2]炔-叠氮化物环加成反应、反电子需求Diels-Alder连接反应、硫醇-亲电反应、或羰基-氧胺反应进行反应。在某些实施方案中，所述偶联基团包含炔、应变炔、四嗪、硫醇、对乙酰基-苯丙氨酸残基、氧胺、马来酰亚胺、或叠氮化物。在某些实施方案中，所述偶联基团是：
偶联之后，形成偶联基团的二价残基并连接至第二化合物的残基。二价残基的结构由用于形成偶联物的偶联反应的类型来确定。
在某些实施方案中，当通过[3+2]炔-叠氮化物环加成反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基包含三唑环或含三唑环的稠合环状基团。在某些实施方案中，当通过应变促进的[3+2]炔-叠氮化物环加成(SPAAC)反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基是：
在某些实施方案中，当通过四嗪反电子需求Diels-Alder连接反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基包含在环中具有至少两个相邻氮原子的稠合双环。在某些实施方案中，当通过四嗪反电子需求Diels-Alder连接反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基是：
在某些实施方案中，当通过硫醇-亲电反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基包含琥珀酰亚胺亚基(succinimidylene)和一个硫键。在某些实施方案中，当通过硫醇-亲电反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基是：
在某些实施方案中，使用以下基团通过硫醇-N-羟基琥珀酰亚胺反应形成偶联物：
所述形成偶联物涉及的反应包括以下步骤：
所产生的偶联基团的二价残基是：
在某些实施方案中，当通过羰基-氧胺反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基包含非天然氨基酸的二价残基。在某些实施方案中，当通过羰基-氧胺反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基是：
在某些实施方案中，当通过羰基-氧胺反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基包含肟键。在某些实施方案中，当通过羰基-氧胺反应形成偶联物时，所述偶联基团的二价残基是：
在一些实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体；其中EG包含亚苯基、亚羧基、氨基、或其组合。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体；其中EG是：
其中各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、和二烷基氨基-C(O)-。在各个结构中，苯环可与1、2、3个、或在某些情况下4个REG基团连接。在第二和第三结构中，本领域技术人员将认识到，EG与RT连接，所述RT如上式C1的上述说明所示，不在式C1的主链内。在一些实施方案中，各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、和二烷基氨基-C(O)-。在进一步的实施方案，各REG独立地选自由H、-NO2、-CN、氟、溴和氯组成的组。
在一些实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体；其中EG包含亚苯基、亚羧基、氨基、或其组合。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体；其中EG是：
其中Z可以是CH或N，各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-。在各个结构中，苯环可与1、2、3个、或在某些情况下4个REG基团连接。在第二和第三结构中，本领域技术人员将认识到，EG与RT连接，所述RT如上式C1的上述说明所示，不在式C1的主链内。在一些实施方案中，各REG独立地选自由以下组成的组：H、烷基、联苯基、-CF3、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-。在进一步的实施方案中，各REG独立地选自由H、-NO2、-CN、氟、溴和氯组成的组。在一些实施方案中，所述EG中的每个REG是H。
在一些实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体；其中RT包含天然或非天然氨基酸的残基或糖环的残基。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中RT是：
本领域技术人员将认识到，第一结构是二价的且可连接在如式(C2)所示的主链内，和第二结构是一价的且可与上述式(C1)所示的EG连接。
在一些实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体；其中RT包含天然或非天然氨基酸的残基或糖环的残基。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中RT是：
其中R1是与所述化合物其余部分连接的键或
和R2是-CH3、-CH2CH2CO2H、或-(CH2)3NHCONH2；具有以下结构的豆荚蛋白(legumain)可切割的Ala-Ala-Asn(AAN)或Ala-Ala-Asp(AAD)肽：
其中Z是OH或NH2；或具有以下结构的β-葡萄糖醛酸酶可切割的β-葡糖苷酸：
本领域技术人员将认识到，
均为二价结构且可连接在式(C1)的主链内或如式(C2)所示在其主链内。结构式
是一价的且可与上述式(C1)所示的EG连接。
在一些实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中HP包含聚(乙二醇)。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中HP是：
其中m是选自1至13的整数。
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中SG包含C1-C10亚烷基、C4-C6亚烷基、亚羰基、或其组合。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中SG是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中，W1、W2、W3、W4和W5各自独立地为单键，或各自独立地不存在，或各自独立地包含二价酮、二价酯、二价醚、二价酰胺、二价胺、亚烷基、亚芳基、硫化物、二硫化物、亚羰基、或其组合。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中，W1、W2、W3、W4和W5各自独立地为单键，或各自独立地不存在，或各自独立地包含–C(O)–、–O–、–C(O)NH–、–C(O)NH-烷基–、–OC(O)NH–、–SC(O)NH–、–NH–、–NH-烷基–、–C(O)N(CH3)–、–C(O)N(CH3)-烷基–、–N(CH3)–、–N(CH3)-烷基–、–N(CH3)CH2CH2N(CH3)–、–C(O)CH2CH2CH2C(O)–、–S–、–S-S–、–OCH2CH2O–、或其反向基团(例如–NHC(O)–)、或其组合。
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′包含三唑基环。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是三唑基环或含有三唑基环的稠合环基团。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′包含在环中具有至少两个相邻氮原子的稠合双环。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′包含硫键。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′包含非天然氨基酸的二价残基。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′包含肟键。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′包含肟键。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中Ab是已知可用于与本发明所述有效负载和本发明所述任选连接体偶联的任何化合物的残基。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中Ab是抗体链或其抗原结合片段的残基。
一方面，本发明提供了包含本发明所述有效负载和连接至抗体的本发明所述任选连接体的抗体偶联物，其中Ab是所述抗体的残基。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是所述抗体的残基；和R′包含三唑环或含有三唑环的稠合双环基团。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是所述抗体的残基；和R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是所述抗体或其抗原结合片段的残基；和R′包含稠合双环，其中所述稠合双环在环中具有至少两个相邻氮原子。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是所述抗体的残基；和R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′包含硫键。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′包含非天然氨基酸的二价残基。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′包含肟键。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′包含肟键。在实施方案中，本发明提供了具有式(C1)或(C2)所示结构的抗体偶联物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或互变异构体，其中：Ab是多肽的残基；和R′是：
在实施方案中，本发明提供了具有以下任一结构的偶联物及其区域异构体，其中Ab表示抗体或其抗原结合片段的残基，而PA表示有效负载基团部分。本领域技术人员可以认识到Ab可在多个位点结合。本发明提供了各种区域异构体及其混合物。
在实施方案中，本发明提供了具有以下任一结构的偶联物，其中Ab表示抗体的残基，而PA表示有效负载基团部分：
在实施方案中，本发明提供了具有以下任一结构的偶联物，其中Ab表示抗体或其抗原结合片段的残基，而PA表示有效负载基团部分：
在实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的偶联物，其中Ab表示抗体或其抗原结合片段的残基，而PA表示有效负载基团部分：
在任一前述实施方案中，所述偶联物包含n个数目的PA基团部分，其中n是选自1至8的整数。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。在一些实施方案中，n是7。在一些实施方案中，n是8。本领域技术人员将认识到式(101a)和(101b)是基于抗体所连接的三唑环中的氮原子的区域异构体。类似地，式(102a)和(102b)、(103a)和(103b)、(104a)和(104b)、(105a)和(105b)是成对的区域异构体。
在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置404处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置180处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置241处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置222处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体1偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)编号系统的轻链位置7处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(30)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)编号系统的轻链位置42处。在某些实施方案中，PA是本发明所述式(I)所示化合物的残基。
本领域技术人员将认识到，诸如式(30)所示的氨基酸作为残基掺入至多肽和抗体中。例如，式(30)所示的残基可以具有以下式(30')所示的结构：
进一步的修饰，例如在-N3处的修饰，也包含在本发明的术语残基内。
在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置404处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置180处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置241处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据EU编号系统的重链位置222处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)编号系统的轻链位置7处。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含以下式(56)所示的非天然氨基酸的残基，其位于根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)编号系统的轻链位置42处。在某些实施方案中，PA是本发明所述的式(I-P)、(I)、(II)、和/或(III)所示化合物的残基。所述式(56)所示的非天然氨基酸如下所示。
在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示抗体偶联物，其中Ab包含对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含位于根据EU编号系统的重链位置404处的对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含位于根据EU编号系统的重链位置180处的对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含位于根据EU编号系统的重链位置241处的对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含位于根据EU编号系统的重链位置222处的对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含位于根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)编号系统的轻链位置7处的对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明提供了式101a至105b任一所示的抗体偶联物，其中Ab包含位于根据卡巴(Kabat)或柯西亚(Chothia)编号系统的轻链位置42处的对叠氮甲基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸残基。在某些实施方案中，PA是本发明所述式(I)所示化合物的残基。
在特定实施方案中，本发明提供了本发明所述式(I-P)、式(I)、式(II)和/或式(III)所示化合物的抗体药物偶联物。一方面，本发明提供了具有式(V)所示结构的抗体药物偶联物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物，
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
L是连接体；
PA是有效负载(例如，式(I-P)、(I)、(II)、和/或(III)所示化合物的残基)；和
下标n是选自1至30的整数。
在式(V)的一些情况中，
是
在一些或任实施方案中，其中W1、W2、W3、W4、SG、RT、HP、EG和R′如本发明式(C1)和(C2)所定义。在式(V)的一些其他情况中，
是
在一些或任何实施方案中，其中W1、W6、SG、X、HP、和R′如本发明式(VI)所定义。
另一方面，本发明提供了具有式(VI)所示结构的抗体偶联物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物，其中：
W1，在每次出现时，分别独立地为键，或分别独立地不存在，或分别独立地为二价连接基团；
X，在每次出现时，分别独立地不存在，或分别独立地为
下标b是选自1至10的整数；
RA，当存在时，在每次出现时，分别独立地选自C1-3烷基；
RT，当存在时，在每次出现时，分别独立地为释放引发基团；
HP，当存在时，在每次出现时，分别独立地为亲水基团；
W6，在每次出现时，分别独立地为肽的残基、或分别独立地不存在；
SG，在每次出现时，分别独立地不存在、或分别独立地为二价间隔基团；
R′，在每次出现时，分别独立地为偶联基团的二价残基；
下标n是选自1至30的整数；
Ab是抗体或其抗原结合片段；和
PA，在每次出现时，分别独立地为式(I-P)、(I)、(II)、或(III)所示化合物的残基，其中，PA经由-NR3a-、-C(R3c)2NH-中的所述-NH-、R3的杂环烷基中的所述N原子、R3的部分饱和的杂芳基中的所述N原子、-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-中的所述-NH-、或环B中的N原子连接至所述分子其余部分。在另一实施方案中，本发明提供了具有式(VI-P)所示结构的抗体偶联物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物，其中：
W1是键，或W1不存在，或W1是二价连接基团；
X，在每次出现时，分别独立地不存在，或分别独立地为
下标b是选自1至10的整数；
RA，当存在时，在每次出现时，分别独立地选自C1-3烷基；
RT，当存在时，在每次出现时，分别独立地为释放引发基团；
HP，当存在时，是亲水基团；
W6，在每次出现时，分别独立地为肽、或分别独立地不存在；
SG，在每次出现时，分别独立地不存在，或分别独立地为二价间隔基团；
R′，在每次出现时，分别独立地为偶联基团的二价残基；
下标n是选自1至30的整数；
Ab是抗体或其抗原结合片段；和
PA是如下化合物的有效负载
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，各自独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基、或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和–CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；或者两个R3c同与之连接的碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C1-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C1-6环烷基、芳基或杂芳基取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，其中环烷基、芳基和杂芳基分别任选地进一步被卤素、羟基、烷基和卤代烷基取代；和
其中PA经由R3中的氨基基团或环B中的氨基基团连接至所述分子其余部分。
在一些实施方案中，所述式(VI)所示化合物具有式(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、或(VIe)所示结构：
其中B′是螺杂环烷基，所述螺杂环烷基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；或
其中R3′是杂环烷基或部分饱和的杂芳基，其中R3′的每个基团分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，条件是：至少一个氮原子存在于所述R3′环中且与W1连接；或者R3′是-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-，其中所述NH与W1相连。
在式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、和(VIe)的一些情况中，SG不存在，或SG是
其中下标d是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。在一些情况中，SG是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、和(VIe)的一些情况中，W1，当存在时，是
其中下标e是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。在一些情况中，W1，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、和(VIe)的一些情况中，当W6是肽的残基时，所述肽的残基可包含天然和/或非天然氨基酸残基。在式(VI)的一些情况中，W6，当存在时，是三肽残基。在某些此类情况中，W6是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。在式(VI)的一些情况中，W6，当存在时，是二肽残基。在某些此类情况下，W6，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、和(VIe)的一些情况中，RT是
其中
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、和(VIe)的一些情况中，HP，当存在时，是PEG基团。在式(VI)的一些情况中，HP，当存在时，是
其中下标b是选自1至10的整数，和
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(VI)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)、和(VIe)的一些情况下，R′是：
在特定实施方案中，本发明所述抗体偶联物选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或区域异构体的混合物；
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点；
L是连接体；和
Ab是抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明所述的式(VI)所示抗体药物偶联物选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或区域异构体的混合物。
如本发明所用，当抗体与连接体前体偶联时，为方便起见，本发明所述的偶联物在一些或任何实施方案中如下所描述：
在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：抗BCMA、抗Muc16、曲妥珠单抗(trastuzumab)、索非妥珠单抗(sofitizumab)、抗GFP、和抗FolRa，或其抗原结合片段。
在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段包含Y180(pAMF)突变、F404 pAMF突变、或Y180 pAMF突变和F404 pAMF突变两者。
在式(V)或(VI)的任一前述实施方案中，下标n是1-30、1-10、1-8、1-6、1-4、或1-2。在一些情况下，下标n是1。在一些情况下，下标n是2。在一些情况下，下标n是3。在一些情况下，下标n是4。在一些情况下，下标n是5。在一些情况下，下标n是6。在一些情况下，下标n是7。在一些情况下，下标n是8。在一些情况下，下标n是大于8的数字。
本发明呈现的实施方案的范围还涵盖抗体药物偶联物，其中所述抗体选自批准用于临床试验或临床使用的开发的各种治疗性抗体。这样的治疗性抗体包括但不限于，利妥昔单抗(
IDEC/Genentech/罗氏)(参见例如，美国专利号5,736,137)，批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20、目前正由Genmab开发的抗CD20，在美国专利号5,500,362中描述的抗CD20抗体，AME-133(Applied Molecular Evolution)，hA20(Immunomedics,Inc.)，HumaLYM(Intracel)，和PRO70769(PCT申请号PCT/US2003/040426)，曲妥珠单抗(
Genentech)(参见例如，美国专利号5,677,171)，批准用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗(rhuMab-2C4，
)，目前正由Genentech开发；抗Her2抗体(美国专利号4,753,894)；西妥昔单抗(
Imclone)(美国专利号4,943,533；PCT公开号WO 96/40210)，用于多种癌症临床试验的嵌合抗EGFR抗体；ABX-EGF(美国专利号6,235,883)，目前正由Abgenix-Immunex-Amgen开发；HuMax-EGFR(美国专利号7,247,301)，目前正由Genmab开发；425、EMD55900、EMD62000、和EMD72000(Merck KGaA)(美国专利号5,558,864；Murthy,et al.(1987)Arch.Biochem.Biophys.252(2):549-60；Rodeck,etal.(1987)J.Cell.Biochem.35(4):315-20；Kettleborough,et al.(1991)Protein Eng.4(7):773-83)；ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT公开号WO 95/20045；Modjtahedi,et al.(1993)J.Cell.Biophys.22(I-3):129-46；Modjtahedi,et al.(1993)Br.J.Cancer 67(2):247-53；Modjtahedi,et al.(1996)Br.J.Cancer 73(2):228-35；Modjtahedi,et al.(2003)Int.J.Cancer 105(2):273-80)；TheraCIM hR3(YMBiosciences，加拿大；和Centro de Immunologia Molecular，古巴)(美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883；Mateo,et al.(1997)Immunotechnol.3(1):71-81)；mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research，Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth,etal.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100(2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX，National Cancer Institute)(PCT公开号WO 01/62931A2)；和SC100(Scancell)(PCT公开号WO 01/88138)；阿仑单抗(
Millenium)，目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的人源化mAb；莫罗单抗CD3(Orthoclone
)，由Ortho Biotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体；替伊莫单抗
由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体；吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)
由Celltech/Wyeth开发的抗CD33(P67蛋白)抗体；阿法赛特
由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合；阿昔单抗
由Centocor/Lilly开发；巴利昔单抗
由Novartis开发；帕利珠单抗
由Medimmune开发；英夫利昔单抗
由Centocor开发的抗TNFα抗体；阿达木单抗
由Abbott开发的抗TNFα抗体；
由Celltech开发的抗TNFα抗体；戈利木单抗(CNTO-148)，由Centocor开发的全人源TNF抗体；依那西普
由Immunex/Amgen开发的p75TNF受体Fc融合；Ienercept，由罗氏先前开发的p55TNF受体Fc融合；ABX-CBL，正由Abgenix开发的抗CD147抗体；ABX-IL8，正由Abgenix开发的抗IL8抗体；ABX-MA1，正由Abgenix开发的抗MUC18抗体；Pemtumomab(R1549，90Y-muHMFG1)，正由Antisoma开发的抗MUC1；Therex(R1550)，正由Antisoma开发的抗MUC1抗体；AngioMab(AS1405)，正由Antisoma开发；HuBC-1，正由Antisoma开发；Thioplatin(AS1407)，正由Antisoma开发；
(那他珠单抗)，正由Biogen开发的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体；VLA-1mAb，正由Biogen开发的抗VLA-1整合素抗体；LTBR mAb，正由Biogen开发的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体；CAT-152，正由Cambridge Antibody Technology开发的抗TGF-β抗体；ABT 874(J695)，正由Abbott开发的抗IL-12p40抗体；CAT-192，正由CambridgeAntibody Technology和Genzyme开发的抗TGFβ1抗体；CAT-213，正由Cambridge AntibodyTechnology开发的抗Eotaxin1抗体；
正由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗Blys抗体；TRAIL-R1 mAb，正由CambridgeAntibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体；
(贝伐单抗，rhuMAb-VEGF)，正由Genentech开发的抗VEGF抗体；正由Genentech开发的抗HER受体家族抗体；抗组织因子(ATF)，正由Genentech开发的抗组织因子抗体；
(奥马珠单抗)，正由Genentech开发的抗IgE抗体；
(依法利珠单抗)，正由Genentech和Xoma开发的抗CD11a抗体；MLN-02抗体(原名LDP-02)，正由Genentech和MilleniumPharmaceuticals开发；HuMax CD4，正由Genmab开发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，正由Genmab和Amgen开发的抗IL15抗体；HuMax-Inflam，正由Genmab和Medarex开发；HuMax-Cancer，正由Genmab和Medarex和Oxford GcoSciences开发的抗乙酰肝素酶I抗体；HuMax-Lymphoma，正由Genmab和Amgen开发；HuMax-TAC，正由Genmab开发；正由IDEC Pharmaceuticals开发的IDEC-131和抗CD40L抗体；IDEC-151(克立昔单抗(Clenoliximab))，正由IDECPharmaceuticals开发的抗CD4抗体；IDEC-114，正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD80抗体；IDEC-152，正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD23；正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体；BEC2，正由Imclone开发的抗独特型抗体；IMC-1C11，正由Imclone开发的抗KDR抗体；DC101，正由Imclone开发的抗flk-1抗体；正由Imclone开发的抗VE钙粘蛋白抗体；
(拉贝珠单抗(Iabetuzumab))，正由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；
(依帕珠单抗)，正由Immunomedics开发的抗CD22抗体；AFP-Cide，正由Immunomedics开发；MyelomaCide，正由Immunomedics开发；LkoCide，正由Immunomedics开发；ProstaCide，正由Immunomedics开发；MDX-010，正由Medarex开发的抗CTLA4抗体；MDX-060，正由Medarex开发的抗CD30抗体；正由Medarex开发的MDX-070；正由Medarex开发的MDX-018；正由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发的
(IDM-1)和抗Her2抗体；
其是正由Medarex和Genmab开发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，正由Medarex和Genmab开发的抗IL15抗体；CNTO 148，正由Medarex和Centocor/J&J开发的抗TNFα抗体；CNTO 1275，其是正由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体；MOR101和MOR102，正由MorphoSys开发的抗细胞间黏附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体；MOR201，正由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；
(维西珠单抗)，正由ProteinDesign Labs开发的抗CD3抗体；
正由Protein Design Labs开发的抗γ干扰素抗体；抗α5β1干扰素抗体，正由Protein Design Labs开发；抗IL-12，正由Protein DesignLabs开发；ING-1，正由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体；
(奥马珠单抗)，正由Genentech和Novartis开发的人源化抗IgE抗体；以及MLN01，正由Xoma开发的人源化抗β2整合素抗体。在另一实施方案中，所述治疗剂包括KRN330(Kirin)；huA33抗体(A33，Ludwig Institute forCancer Research)；CNTO 95(αV整合素，Centocor)；MEDI-522(αVβ3整合素，Medimmune)；伏洛昔单抗(αVβ1整合素，Biogen/PDL)；人mAb 216(B细胞糖基化抗原表位，NCl)；BiTE MT103(双特异性CD19×CD3，MedImmune)；4G7×H22(双特异性B细胞×FcγR1，Medarex/MerckKGa)；rM28(双特异性CD28×MAPG，欧洲专利号EP1444268)；MDX447(EMD82633)(双特异性CD64×EGFR，Medarex)；卡妥索单抗(removab)(双特异性EpCAM×抗CD3，Trion/Fres)；厄妥索单抗(双特异性HER2/CD3，Fresenius Biotech)；奥戈伏单抗(oregovomab)(OvaRex)(CA-125，ViRexx)；
(WX G250)(碳酸酐酶IX，Wilex)；CNTO 888(CCL2，Centocor)；TRC105(CD105(内皮糖蛋白)，Tracon)；BMS-663513(CD137激动剂，Brystol MyersSquibb)；MDX-1342(CD19，Medarex)；希普利珠单抗(Siplizumab)(MEDI-507)(CD2，Medimmune)；奥法木单抗(Humax-CD20)(CD20，Genmab)；利妥昔单抗(Rituxan)(CD20，Genentech)；维妥珠单抗(veltuzumab)(hA20)(CD20，Immunomedics)；依帕珠单抗(CD22，Amgen)；鲁昔单抗(IDEC 152)(CD23，Biogen)；莫罗莫那-CD3(CD3，Ortho)；HuM291(CD3 fc受体，PDL Biopharma)；HeFi-1(CD30，NCl)；MDX-060(CD30，Medarex)；MDX-1401(CD30，Medarex)；SGN-30(CD30，Seattle Genentics)；SGN-33(林妥珠单抗)(CD33，SeattleGenentics)；扎诺木单抗(Zanolimumab)(HuMax-CD4)(CD4，Genmab)；HCD122(CD40，Novartis)；SGN-40(CD40，Seattle Genentics)；Campath1h(阿仑单抗)(CD52，Genzyme)；MDX-1411(CD70，Medarex)；hLL1(EPB-1)(CD74.38，Immunomedics)；加利昔单抗(Galiximab)(IDEC-144)(CD80，Biogen)；MT293(TRC093/D93)(切割的胶原蛋白，Tracon)；HuLuc63(CS1，PDL Pharma)；易普利单抗(ipilimumab)(MDX-010)(CTLA4，Brystol MyersSquibb)；曲美木单抗(Tremelimumab)(Ticilimumab，CP-675,2)(CTLA4，Pfizer)；HGS-ETR1(马帕木单抗)(DR4TRAIL-R1激动剂，Human Genome Science/Glaxo Smith Kline)；AMG-655(DR5，Amgen)；Apomab(DR5，Genentech)；CS-1008(DR5，Daiichi Sankyo)；HGS-ETR2(来沙木单抗)(DR5TRAIL-R2激动剂，HGS)；西妥昔单抗(爱必妥)(EGFR，Imclone)；IMC-11F8，(EGFR，Imclone)；尼妥珠单抗(EGFR，YM Bio)；帕尼单抗(Vectabix)(EGFR，Amgen)；扎妥木单抗(Zalutumumab)(HuMaxEGFr)(EGFR，Genmab)；CDX-110(EGFRvIII，AVANTImmunotherapeutics)；阿德木单抗(adecatumumab)(MT201)(Epcam，Merck)；依决洛单抗(edrecolomab)(Panorex，17-1A)(Epcam，Glaxo/Centocor)；MORAb-003(叶酸受体a，Morphotech)；KW-2871(神经节苷脂GD3，Kyowa)；MORAb-009(GP-9，Morphotech)；CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex)；曲妥珠单抗(赫赛汀)(HER2，Celldex)；帕妥珠单抗(rhuMAb2C4)(HER2(DI)，Genentech)；阿泊珠单抗(apolizumab)(HLA-DRβ链，PDL Pharma)；AMG-479(IGF-1R，Amgen)；抗IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche)；CP751871(IGF1-R，Pfizer)；IMC-A12(IGF1-R，Imclone)；BIIB022(IGF-1R，Biogen)；MIK-β-1(IL-2Rb(CD122)，HoffmanLaRoche)；CNTO328(IL6，Centocor)；抗KIR(1-7F9)(杀伤细胞Ig样受体(KIR)，Novo)；Hu3S193(Lewis(y)，Wyeth，Ludwig Institute of Cancer Research)；hCBE-11(LTβR，Biogen)；HuHMFG1(MUC1，Antisoma/NCL)；RAV12(N-连接碳水化合物抗原表位，Raven)；CAL(甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-RP)，University of California)；CT-011(PD1，CureTech)；MDX-1106(ONO-4538)(PD1，Medarex/Ono)；MAb CT-011(PD1，Curetech)；IMC-3G3(PDGFRa，Imclone)；巴维昔单抗(bavituximab)(磷脂酰丝氨酸，Peregrine)；huJ591(PSMA，CornellResearch Foundation)；muJ591(PSMA，Cornell Research Foundation)；GC1008(TGFb(泛)抑制剂(IgG4)，Genzyme)；英夫利昔单抗(Remicade)(TNFa，Centocor)；A27.15(转铁蛋白受体，Salk Institute，INSERN WO 2005/111082)；E2.3(转铁蛋白受体，Salk Institute)；贝伐单抗(Avastin)(VEGF，Genentech)；HuMV833(VEGF，Tsukuba Research Lab，PCT公开号WO/2000/034337，University of Texas)；IMC-18F1(VEGFR1，Imclone)；IMC-1121(VEGFR2，Imclone)。
有用的双特异性亲本抗体的实例包括但不限于，具有针对肿瘤细胞抗原的一种抗体和针对细胞毒触发分子的另一种抗体的那些双特异性亲本抗体，诸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；具有特异性与肿瘤抗原结合的一种抗体和与毒素结合的另一种抗体的双特异性抗体，诸如抗皂草素/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱；用于转化酶激活前药的双特异性抗体，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其将磷酸丝裂霉素(mitomycinphosphate)前药催化转化成丝裂霉素醇)；可被用作纤维蛋白溶解剂的双特异性抗体，诸如抗血纤维蛋白/抗组织纤溶酶原激活剂(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)；用于靶向细胞表面受体的免疫复合物双特异性抗体，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的双特异性抗体，诸如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于体外或体内的肿瘤检测的双特异性抗体，如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA，抗p185HER2/抗半抗；作为疫苗佐剂的双特异性抗体(参见Fanger,M W et al.,Crit Rev Immunol.1992；12(34):101-24，通过引用将其并入本发明)；和作为诊断工具的双特异性抗体，诸如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β半乳糖苷酶(参见Nolan,O et R.O'Kennedy,Biochim BiophysActa.1990Aug.1；1040(1):1-11，通过引用将其并入本发明)。三特异性抗体的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
在任一上述实施方案中，其中抗体偶联物具有式(V)和(VI)所示结构，所述带括号的结构可与所述抗体的一个或多个非天然氨基酸共价连接，其中所述一个或多个非天然氨基酸位于独立地选自由以下组成的组的位点处：根据卡巴(Kabat)或卡巴(Kabat)的EP编号方案的HC-F241、HC-F404、HC-Y180、和LC-K42、和其组合物。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-F404处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-Y180处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-F241处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点LC-K42处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-F404和HC-Y180处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-F241、HC-F404和HC-Y180处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，至少一个带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-F404处的非天然氨基酸共价连接，和至少一个带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-Y180处的非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-Y180和LC-K42处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在一些实施方案中，所述带括号的结构与位于所述抗体的位点HC-F404和LC-K42处的一个或多个非天然氨基酸共价连接。在特定实施方案中，各非天然氨基酸具有式(30)所示的残基。
在另一些实施方案中，所述抗体偶联物可具有选自由以下组成的组的另外的有效负载：标记，染料，聚合物，水溶性聚合物，聚乙二醇，聚乙二醇的衍生物，光交联剂，细胞毒性化合物，放射性核素，药物，亲和性标记，光亲和性标记，活性化合物，树脂，第二蛋白质或多肽或多肽类似物，抗体或抗体片段，金属螯合剂，辅因子，脂肪酸，碳水化合物，多核苷酸，DNA，RNA，反义多核苷酸，肽，水溶性树状聚合物，环糊精，抑制性核糖核酸，生物材料，纳米粒子，自旋标记物，荧光团，含金属的基团部分，放射性基团部分，新型官能团，与其他分子共价相互作用或非共价相互作用的基团，光笼蔽基团部分，可光异构的基团部分，生物素，生物素衍生物，生物素类似物，掺入重原子的基团部分，化学可切割的基团，光可切割的基团，细长的侧链，碳连接的糖，氧化还原活性剂，氨基硫代酸，毒性基团部分，同位素标记的基团部分，生物物理探针，磷光基团，化学发光基团，电子致密基团，磁性基团，插入(intercalating)基团，生色团，能量转移剂，生物活性剂，可检测标记，小分子，或其任何组合。在实施方案中，所述有效负载是标记，染料，聚合物，细胞毒性化合物，放射性核素，药物，亲和性标记，树脂，蛋白质，多肽，多肽类似物，抗体，抗体片段，金属螯合剂，辅因子，脂肪酸，碳水化合物，多核苷酸，DNA，RNA，肽，荧光团，或碳连接的糖。在另一实施方案，所述有效负载是标记，染料，聚合物，药物，抗体，抗体片段，DNA，RNA，或肽。
在某些实施方案中，所述抗体偶联物包含一种或多种水溶性聚合物。多种大分子聚合物和其它分子可以连接至本发明所述的多肽，以调节多肽的生物学特性，和/或向多肽提供新的生物学特性。这些大分子聚合物可经由天然编码的氨基酸、经由非天然编码的氨基酸、或天然或经修饰的氨基酸的任意官能取代基、或附加至天然或经修饰的氨基酸的任意取代基或官能团，而连接至多肽。聚合物的分子量可以是宽范围的，包括但不限于，在约100Da和约100,000Da之间，或更大。
所选聚合物可以是水溶性的，以使其所连接的蛋白质不会在水性环境如生理环境中沉淀。所述聚合物可以是支化的或非支化的。优选地，对于最终产品制剂的治疗用途，所述聚合物将是药学上可接受的。
在某些实施方案中，聚乙二醇分子与多肽分子的比例将变化，它们在反应混合物中的浓度也将变化。通常，最佳的比率(就反应效率而言，存在最小过量的未反应的蛋白质或聚合物)可以由所选择的聚乙二醇的分子量和可用的反应基团的数量来确定。就分子量而言，通常聚合物的分子量越高，可以连接到蛋白质上的聚合物分子的数量就越少。类似地，当优化这些参数时，应当考虑聚合物的支化。通常，分子量越高(或分支越多)，聚合物：蛋白质比越高。
所述水溶性聚合物可以是任何结构形式，包括但不限于直链的、叉形的或支链的。通常，所述水溶性聚合物是聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但也可以使用其他水溶性聚合物。举例来说，PEG用于描述某些实施方案。
PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可商业采购获得，或使用本领域熟知的方法(Sandler and Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,Vol.3,pages 138-161)、通过乙二醇的开环聚合制得。术语“PEG”广泛用于包括任何聚乙二醇分子，不考虑PEG的末端的大小或修饰，并且可以表示为由下式与多肽连接：X′O–(CH2CH2O)n–CH2CH2–Y，其中n为2至10,000，X为H或末端修饰，包括但不限于C1-4烷基，和Y为多肽的连接点。
在一些情况下，PEG在一端用羟基或甲氧基进行终止，即，X′是H或CH3(“甲氧基PEG”)。可替代性地，所述PEG可以用反应性基团来终止，从而形成双官能聚合物。典型反应基团可以包括通常用于与以下官能团进行反应的那些反应基团：存在于20种常见氨基酸中的官能团(包括但不限于，马来酰亚胺基团、活化的碳酸酯(包括但不限于，对硝基苯基酯)、活化的酯(包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)；以及对20种常见氨基酸是惰性的、但与存在于非天然编码氨基酸中的增补的官能团特异性反应的官能团(包括但不限于，叠氮基、炔基)。应注意的是，在上式中由Y表示的、所述PEG的另一端，将通过天然存在或非天然编码的氨基酸直接或间接地连接到多肽。举例来说，Y可以是多肽的胺基团(包括但不限于，赖氨酸的ε胺或N末端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲连接。可替代性地，Y可以是硫醇基团(包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基团)的马来酰亚胺连接。可替代性地，Y可以是经由20种常见氨基酸通常不可获得的残基的连接。例如，PEG上的叠氮基团可以与多肽上的炔基团进行反应，以形成Huisgen[3+2]环加成产物。可替代性地，PEG上的炔基可以与存在于非天然编码的氨基酸如本发明所描述的经修饰的氨基酸中的叠氮基团反应，以形成类似产物。在一些实施方案中，如适用，强亲核试剂(包括但不限于，肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与存在于非天然编码的氨基酸中的醛或酮基团反应以形成腙、肟或缩氨基脲，所述腙、肟或缩氨基脲在某些情况下，可以通过用适当的还原剂处理被进一步还原。可替代性地，所述强亲核试剂可以经由非天然编码的氨基酸并入到多肽，并用于与存在于水溶性聚合物中的酮或醛基团进行优先反应。
根据实际所需，可以使用任何分子质量的PEG，包括但不限于，根据所需从约100道尔顿(Da)至约100,000Da或更大(包括但不限于，有时0.1-50kDa或10-40kDa)。支链PEG包括但不限于，其中各个链具有从1至100kDa(包括但不限于，1-50kDa或5-20kDa)的范围的分子量的PEG分子。广泛的PEG分子描述于，包括但不限于，Shearwater Polymers公司的产品目录和Nektar Therapeutics的产品目录，其通过引用并入本发明。
通常，PEG分子的至少一个末端可用于与抗体反应。例如，具有用于与氨基酸侧链反应的炔基团部分和叠氮基团部分的PEG衍生物可以用于将PEG附接至如本发明所述的非天然编码的氨基酸。如果所述非天然编码的氨基酸包含叠氮，那么PEG通常将要么含有炔基团部分以实现形成[3+2]环加成产物，或要么含有膦基团的活化的PEG物种(即，酯，碳酸酯)以实现形成酰胺连键。可替代性地，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有叠氮部分以实现形成[3+2]Huisgen环加成产物。如果非天然编码的氨基酸包含羰基基团，所述PEG通常将包含有效的亲核试剂(包括但不限于，酰肼、肼、羟胺、或氨基脲官能团)，以便实现分别形成相应的腙、肟、和缩氨基脲键。在其它替代性方案中，可以使用本发明所描述的反应基团的相反的定位，即，非天然编码的氨基酸中的叠氮基团部分可与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施方案中，具有PEG衍生物的多肽变体包含化学官能团，所述化学官能团与存在于非天然编码的氨基酸的侧链上的化学官能团反应。
在某些实施方案中，所述有效负载是含有叠氮或乙炔的、包含水溶性聚合物主链的聚合物，其具有从约800Da至约100,000Da的平均分子量。所述水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)。然而，应该理解，包括但不限于聚乙二醇和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)(poly(dextran))和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物，也适合于使用，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用旨在涵盖和包括所有这样的分子。术语PEG包括但不限于，任一种形式的聚(乙二醇)，包括双官能的PEG、多臂的PEG、衍生化的PEG、叉状的PEG、支化的PEG、悬垂的PEG(即，具有悬垂于聚合物主链的一个以上官能团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解的键的PEG。
所述聚合物主链可以是直链的或支化的。支化的聚合物主链在本领域中通常是已知的。通常，支化的聚合物具有中央分支核部分和连接到该中央分支核的多个线型聚合物链。PEG通常以支化的形式使用，所述支化的形式可以通过将环氧乙烷加成至各种多元醇，例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇来制备。所述中央分支部分也可源自于数个氨基酸，例如赖氨酸。所述支化的聚(乙二醇)可以通式的形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R源自核部分，例如甘油、甘油寡聚物、或季戊四醇，且m表示臂的数目。多臂的PEG分子，例如在以下文献中所描述的那些，也可以用作所述聚合物主链：专利号为5,932,462、5,643,575、5,229,490、4,289,872的美国专利；美国专利申请2003/0143596；WO 96/21469；和WO 93/21259，通过引用将其每一个以其整体的形式并入本发明。
支化的PEG也可以是由PEG(-YCHZ2)n表示的叉状的PEG的形式，其中Y是连接基团，且Z是以限定长度的原子链连接至CH的活化的末端基团。
另一种支化的形式的悬垂的PEG，具有反应基团，如羧基，该羧基是沿所述PEG主链而不是在PEG链的末端。
除了这些形式的PEG之外，所述聚合物还可以用在主链中的弱的或可降解的键来制备。例如，PEG可以用聚合物主链中的受到水解的酯键来制备。如本发明所示，该水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。本领域技术人员理解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括本领域中已知的所有形式，包括但不限于本发明所公开的那些。
许多其它聚合物也适合于使用。在一些实施方案中，具有从2至约300个末端的、水溶性的聚合物主链是特别适合的。合适的聚合物的实例包括但不限于，其他聚(亚烷基二醇)(如聚(丙二醇)(“PPG”))、它们的共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、它们的三元共聚物、它们的混合物等。尽管聚合物主链的各链的分子量可以变化，但通常在约800Da至约100,000Da的范围内，通常为约6,000Da至约80,000Da。
本领域的普通技术人员将认识到，实质上水溶性的主链的前述清单决不是详尽无遗的，其仅仅是说明性的，具有本发明所描述的性质的所有聚合物材料都被认为适合于使用。
在一些实施方案中，聚合物衍生物是“多官能”，意味着聚合物主链具有至少两个末端，并可能多达约300个末端用官能团进行官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括但不限于，具有两个末端的线型聚合物，其中各末端被连接至可以是相同或不同的官能团。
4.连接体
在某些实施方案，所述抗体可通过能够与抗体氨基酸和有效负载基团反应的一个或多个连接体，与有效负载进行连接。所述一个或多个连接体可以是本领域技术人员显而易见的任何连接体。
术语“连接体”在本发明中用于指通常由于化学反应而形成的基团或键，并且通常是共价键。
有用的连接体包括本发明所述的那些。在某些实施方案，所述连接体是本领域技术人员已知的任何二价或多价连接体。有用的二价连接体包括亚烷基、取代的亚烷基、亚杂烷基、取代的亚杂烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、和取代的亚杂芳基。在某些实施方案，所述连接体是C1-10亚烷基或C1-10亚杂烷基。在一些实施方案，所述C1-10亚杂烷基是PEG。
在某些实施方案，所述连接体是水解稳定的。水解稳定的键是指所述键在水中基本稳定，并且在有用的pH值下不与水反应，包括但不限于在生理条件下长时间(甚至无限期)地不与水反应。在某些实施方案，所述连接体是水解不稳定的。水解不稳定或可降解的键是指所述键在水或水溶液(包括例如血液)中可降解。酶不稳定或可降解的键是指所述键可被一种或多种酶降解。
如本领域所理解的，PEG和相关聚合物均可在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的连接体基团中包括可降解的键。例如，由PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基团反应所形成的酯键通常在生理条件下水解以释放所述药剂/药物。
其他可水解降解的键包括但不限于碳酸酯/盐键；胺和醛反应产生的亚胺键；醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；酰肼与醛的反应产物腙键；醛和醇的反应产物缩醛键；甲酸酯和醇的反应产物原酸酯键；由胺基团(包括但不限于位于聚合物如PEG的末端的胺基团)与肽的羧基形成的肽键；和由亚磷酰胺基团(包括但不限于位于聚合物末端的亚磷酰胺基团)与寡核苷酸的5'-羟基形成的寡核苷酸键。
许多不同的可切割连接体是本领域技术人员已知的。参见美国专利号4,618,492、4,542,225和4,625,014。从这些连接体基团释放药物的机理包括例如光不稳定键的辐照和酸催化的水解。美国专利号4,671,958，例如，包括对包含连接体的免疫偶联物的描述，所述连接体在体内被患者补体系统的蛋白水解酶在靶位点进行切割。可根据多肽和与其连接的分子之间所需的空间关系来预定或选择连接体的长度。鉴于已报道了将多种放射诊断性化合物、放射治疗性化合物、药物、毒素、和其他药物附接至多肽上的大量方法，本领域技术人员将能够确定用于将给定药物附接至多肽的合适方法。
连接体可具有宽范围的分子量或分子长度。分子量较大或较小的连接体可用于在多肽和连接的实体之间提供所需的空间关系或构象。具有较长或较短分子长度的连接体也可用于在多肽和连接的实体之间提供所需的空间或柔性。类似地，在多肽到达其靶标之前或之后，可利用具有特定形状或构象的连接体为多肽或连接的实体赋予特定形状或构象。可选择存在于连接体每个末端上的官能团，以在所需条件下调节多肽或有效负载的释放。多肽和连接的实体之间的空间关系的此种优化可为分子提供新的、经调节的或所需的性质。
在一些实施方案，本发明提供的水溶性双功能连接体具有哑铃结构，其包括：a)叠氮化物、炔、肼、酰肼、羟胺、或位于聚合物主链的至少第一端上的含羰基的基团部分；和b)位于聚合物主链的第二端上的至少第二官能团。所述第二官能团可与所述第一官能团相同或不同。在一些实施方案，所述第二官能团不与所述第一官能团反应。在一些实施方案，提供了包含支链分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。例如，所述支链分子结构可以是树枝状结构。
在一些实施方案，所述连接体衍生自选自由以下组成的组的连接体前体：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基SPDB)，N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)，N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)，马来酰亚胺PEG NHS，N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)，N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)，或2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。在具体实施方案中，所述连接体衍生自连接体前体N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。
在一些实施方案中，所述连接体衍生自选自由以下组成的组的连接体前体：二肽类、三肽类、四肽类和五肽类。在此类实施方案中，所述连接体可由蛋白酶进行切割。示例性二肽类包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(AF或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(FK或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；和N-甲基缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽类包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)，甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)，和甘氨酸-(甲氧基乙氧基乙基)丝氨酸-缬氨酸(gly-val-citalanine OMESerValAla)。
在一些实施方案中，连接体包含自降解(self-immolative)间隔基团。在某些实施方案中，所述自降解(self-immolative)间隔基团包含对氨基苄基。在一些实施方案中，对氨基苄醇经由酰胺键连接至氨基酸单元，并且在苄醇与有效负载之间形成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯、或碳酸酯(Hamann et al.(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中，所述连接体包含对氨基苄氧基羰基(PAB)。自降解(self-immolative)间隔基团的其他实例包括但不限于电子上与PAB基团相似的芳族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物类(美国专利号7,375,078；Hay et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻氨基-或对氨基-苄基缩醛类。在一些实施方案中，可使用在酰胺键水解后经历环化的间隔基团，例如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺类(Rodrigues et al.(1995)Chemistry Biology 2:223)，适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm et al.(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)，和2-氨基苯基丙酸酰胺类(Amsberry,et al.(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基的α-碳的连接键是可用于偶联物的自降解(self-immolative)间隔基团的另一实例(Kingsbury et al.(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在某些实施方案中，可将连接体前体组合以形成更大的连接体。例如，在某些实施方案中，连接体包含二肽缬氨酸-瓜氨酸和对氨基苄氧基羰基。所述这些也称为citValCit--PAB连接体。
在某些实施方案中，所述有效负载可通过能够与抗体氨基酸基团反应的一个或多个连接体基团连接至所述连接体，在本发明中称为连接体-有效负载。所述一个或多个连接体可以是本领域技术人员显而易见的任何连接体或本发明所阐述的那些连接体。
连接体前体可以如本发明实施例部分所述和/或通过标准技术制备，或从商业来源获得，例如，WO 2019/055931、WO 2019/055909、WO 2017/132617、WO 2017/132615，它们各自通过引用整体并入本发明。
本发明公开了其他连接体，例如下文所讨论的连接体前体(A)-(H)和(J)-(M)。
4.1连接体-有效负载
一方面，本发明提供了如式(IV)所示连接体有效负载化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物，其中：
W1是单键，或W1不存在，或W1是二价连接基团；
X不存在，或X是
下标b是选自1至10的整数；
各RA，当存在时，在每次出现时，分别独立地选自C1-3烷基；
RT，当存在时，是释放引发基团；
各HP，当存在时，分别是亲水基团；
W6是肽的残基，或W6不存在；
SG不存在，或SG是二价间隔基团；
R是H、或末端偶联基团；和
PA经由-NR3a-、-C(R3c)2NH-中的所述-NH-、R3的杂环烷基中的所述N原子、R3的部分饱和的杂芳基中的所述N原子、-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-中的所述-NH-、或环B中的N原子连接至所述分子其余部分。在一实施方案中，本发明提供了式(IV-P)所示连接体有效负载化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物，其中：
W1是单键，或W1不存在，或W1是二价连接基团；
X不存在，或X是
下标b是选自1至10的整数；
RA，当存在时，在每次出现时，分别独立地选自C1-3烷基；
RT，当存在时，是释放引发基团；
HP，当存在时，是亲水基团；
W6是肽，或W6不存在；
SG不存在，或SG是二价间隔基团；
R是H、末端偶联基团、或末端偶联基团的二价残基；和
PA是式(I)所示有效负载，
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，各自独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基或部分饱和的杂芳基，或者连接到同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和–CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C1-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C1-6环烷基、芳基或杂芳基取代；其中杂芳基包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子；其中环烷基、芳基和杂芳基分别任选地进一步被卤素、羟基、烷基或卤代烷基取代；和
其中PA经由R3中的氨基基团或环B中的氨基基团连接至所述分子其余部分。
在式(IV)的一些实施方案中，PA是本发明所述的式(I)、(II)或(III)所示化合物或任何化合物的组的任何残基。
在一些实施方案中，所述式(IV)所示化合物具有式(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)、或(IVe)所示结构：
其中B′是螺杂环烷基，所述螺杂环烷基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；或
其中R3′是杂环烷基或部分饱和的杂芳基，其中R3′的每个基团分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，条件是：至少一个氮原子存在于所述R3′环中且与W1连接；或者R3′是-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-，其中所述NH与W1连接。
在式(IV)的一些情况中，SG不存在，或SG是
其中下标d是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，SG是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，W1，当存在时，是
其中下标e是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，W1，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，W6是肽的残基且包含天然和/或非天然氨基酸。在式(IV)的一些情况中，W6，当存在时，是三肽残基。在式(IV)的一些情况中，W6，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，W6，当存在时，是二肽残基。在式(IV)的一些情况中，W6，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，RT是
其中
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，HP，当存在时，是PEG基团。在式(IV)的一些情况中，HP，当存在时，是
其中下标b是选自1至10的整数，和
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
在式(IV)的一些情况中，R是：
在一些实施方案中，式(VI)所示连接体有效负载化合物选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或区域异构体的混合物。
5.抗体特异性
所述偶联物包含选择性结合人抗原的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与人抗原的同源物结合。在一些态样中，所述抗体与选自猴、小鼠、犬、猫、大鼠、牛、马、山羊和绵羊的物种的人抗原的同源物结合。在一些态样中，所述同源物是食蟹猕猴同源物。在一些态样中，所述同源物是小鼠或鼠类同源物。
在一些实施方案中，所述抗体包含轻链。在一些态样中，所述轻链是κ轻链。在一些态样中，所述轻链是λ轻链。
在一些实施方案中，所述抗体包含重链。在一些态样中，所述重链是IgA。在一些态样中，所述重链是IgD。在一些态样中，所述重链是IgE。在一些态样中，所述重链是IgG。在一些态样中，所述重链是IgM。在一些态样中，所述重链是IgG1。在一些态样中，所述重链是IgG2。在一些态样中，所述重链是IgG3。在一些态样中，所述重链是IgG4。在一些态样中，所述重链是IgA1。在一些态样中，所述重链是IgA2。
在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段。在一些态样中，所述抗体片段是Fv片段。在一些态样中，所述抗体片段是Fab片段。在一些态样中，所述抗体片段是F(ab′)2片段。在一些态样中，所述抗体片段是Fab′片段。在一些态样中，所述抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些态样中，所述抗体片段是scFv-Fc片段。
在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在一些实施方案中，所述抗体是亲和性成熟抗体。
本发明提供的抗体偶联物可用于治疗多种疾病和病症，包括癌症(例如，本发明所述任何癌症)。在一些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物可用于治疗实体肿瘤的癌症。
6.糖基化变体
在某些实施方案中，抗体可经改变以增加、降低或消除其糖基化的程度。多肽的糖基化通常不是“N-连接”就是“O-连接”。
“N-连接”糖基化是指碳水化合物基团部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸均为供碳水化合物基团部分与天冬酰胺侧链进行酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，多肽中有任何此类三肽序列的存在即产生可能的糖基化位置。
“O-连接”糖基化是指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的一个连接至羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸亦可被使用。
在抗体中添加或删除N-连接糖基化位置可通过改变氨基酸序列以产生或移除一或多个上述三肽序列而完成。添加或删除O-连接糖基化位点可通过在抗体序列中或向抗体序列(视情况而定)添加、删除或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基而完成。
7.经修饰的氨基酸
当所述抗体偶联物包含经修饰的氨基酸时，所述经修饰的氨基酸可以是从业者认为合适的任何经修饰的氨基酸。在特定实施方案，所述经修饰的氨基酸包含活性基团，所述活性基团可用于形成与连接体前体或与有效负载前体连接的共价键。在某些实施方案，所述经修饰的氨基酸是非天然氨基酸。在某些实施方案，所述活性基团选自由氨基、羧基、乙酰基、肼基、酰肼基、脲氨基(semicarbazido)、磺酰基、叠氮基和炔基组成的组。经修饰的氨基酸还描述于例如WO 2013/185115和WO 2015/006555中，其各自通过引用其全文并入本发明。
术语“氨基酸的残基”和“氨基酸残基”是指氨基酸与合适的偶联配偶体进行酰胺偶联或肽偶联的产物；其中，例如，在氨基酸的酰胺偶联或肽偶联之后，水分子被排出，导致其中掺入了氨基酸残基的产物。在一些实施方案中，所述氨基酸残基具有
所示结构，其中Ra是氨基酸的侧链。在一些实施方案中，所述氨基酸残基具有
所示结构，其中Rb是氨基酸侧链的残基，例如，天冬氨酸侧链中C(O)OH的C(O)残基或赖氨酸侧链中NH2的NH残基。
术语“肽的残基”和“肽残基”是指氨基酸与合适的偶联配偶体进行酰胺偶联或肽偶联的产物；其中，例如，在氨基酸的酰胺偶联或肽偶联之后，水分子被排出，导致其中掺入了肽残基的产物。在一些实施方案中，所述肽残基具有
所示结构，其中n是2或更多，和其中Ra是氨基酸的侧链。在一些实施方案中，所述肽残基具有
所示结构，其中n是2或更多，其中Rb是氨基酸侧链的残基，例如，天冬氨酸侧链中C(O)OH的C(O)残基或赖氨酸侧链中NH2的NH残基。在一些实施方案中，n是2-50、2-25、2-10、1-5、或2-3。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。
在某些实施方案，所述氨基酸残基具有以下通式之一所示结构：
本领域技术人员将认识到抗体通常由L-氨基酸组成。但是，对于非天然氨基酸，本发明方法和组合物为从业者提供了在位点特异性位置处使用L-、D-或外消旋非天然氨基酸的能力。在某些实施方案，本发明所述的非天然氨基酸包括天然氨基酸的D-形式和天然氨基酸的外消旋形式。
在上述通式中，波浪线表示连接至抗体的多肽链其余部分的键。可将这些非天然氨基酸掺入多肽链中，就如同将天然氨基酸掺入相同多肽链中一样。在某些实施方案，所述非天然氨基酸如通式中所示通过酰胺键掺入多肽链中。
在上述通式中，R表示没有限制的任何官能团，只要氨基酸残基与天然氨基酸残基不同即可。在某些实施方案，R可以是疏水基团、亲水基团、极性基团、酸性基团、碱性基团、螯合基团、活性基团、治疗性基团部分或标记基团部分。在某些实施方案，R是选自由R1NR2zR3z、R1zC(＝O)R2z、R1zC(＝O)OR2z、R1zN3、R1zC(≡CH)组成的组。在所述这些实施方案中，R1z选自由键、亚烷基、亚杂烷基、亚芳基、亚杂芳基组成的组。R2z和R3z各自独立地选自由H、烷基和杂烷基组成的组。
在一些实施方案，所述非天然编码的氨基酸包括侧链官能团，其与20种常见氨基酸中不存在的官能团(包括但不限于叠氮基、酮、醛、和氨氧基团)有效且选择性地反应以形成稳定偶联物。例如，可使包含含有叠氮基官能团的非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽与聚合物(包括但不限于，聚(乙二醇))反应，或者与含有炔基团部分的第二多肽反应，以形成稳定偶联物，即通过叠氮化物和炔官能团的选择性反应，从而形成Huisgen[3+2]环加成产物。
适用于本发明并且可用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码的氨基酸包括但不限于，与羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔类活性基团反应的那些。在一些实施方案，非天然编码的氨基酸包含糖基团部分。此类氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基(glucosaminyl)-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-氨基半乳糖基(galactosaminyl)-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸，N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺，和O-氨基甘露糖基(mannosaminyl)-L-丝氨酸。此类氨基酸的实例还包括氨基酸和糖之间天然存在的N-或O-连接键被自然界不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)所替代的实例。此类氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖类，例如2-脱氧葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本发明提供的许多非天然编码的氨基酸是可商购得到的，例如购自Sigma-Aldrich(圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(Mo.)，USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的子公司，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)或Peptech(伯灵顿(Burlington)，马萨诸塞州(Mass)，美国)。可如本发明提供的或使用本领域技术人员已知的标准方法任选地合成不能商购的那些。有关有机合成技术，参见例如，Fessendon与Fessendon撰写的“OrganicChemistry”(1982,Second Edition,Willard Grant Press,Boston Mass.)；March撰写的“Advanced Organic Chemistry”(Third Edition,1985,Wiley and Sons,New York)；和Carey与Sundberg撰写的“Advanced Organic Chemistry”(Third Edition,Parts A andB,1990,Plenum Press,New York)。还可参见美国专利申请公开号2003/0082575和2003/0108885，其通过引用并入本发明。除了含有非天然侧链的非天然氨基酸外，可适用于本发明的非天然氨基酸还任选地包含经修饰的骨架结构，包括但不限于，如式II和III的结构所示：
其中Z通常包括OH、NH2、SH、NH-R”、或S-R”；X和Y可以相同或不同，通常分别包含S或O，并且R和R”，任选地相同或不同，通常分别独立地选自上述R基团的相同成分列表，用于具有式I所示结构的非天然氨基酸以及氢。例如，本发明的非天然氨基酸任选地包含氨基基团或羧基基团中的取代，如式II和III所示。这种类型的非天然氨基酸包括但不限于α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐，包括但不限于具有对应于常见的二十种天然氨基酸或非天然侧链的侧链。此外，α-碳上的取代任选地包括但不限于L、D或α-α-二取代的氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其他结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9个原子组成的环脯氨酸类似物，P和y氨基酸，例如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸是基于天然氨基酸(例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等)，并且适合用于本发明。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸类、邻位取代的酪氨酸类、和间位取代的酪氨酸类，其中所述取代的酪氨酸包含，包括但不限于酮基团(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、巯基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等。此外，也可考虑多取代的芳基环。可适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于α-羟基衍生物类、γ-取代的衍生物类、环状衍生物类、和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物类。可适用于本发明的示例苯丙氨酸类似物包括但不限于对位取代的苯丙氨酸类、邻位取代的苯丙氨酸类、和间位取代的苯丙氨酸类，其中所述取代基包含，包括但不限于羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基团(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明的非天然氨基酸的具体实例包括但不限于，对乙酰基-L-苯丙氨酸，O-甲基-L-酪氨酸，L-3-(2-萘基)丙氨酸，3-甲基-苯丙氨酸，O-4-烯丙基-L-酪氨酸，4-丙基-L-酪氨酸，三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸，L-多巴(Dopa)，氟化苯丙氨酸，异丙基-L-苯丙氨酸，对叠氮基-L-苯丙氨酸，对叠氮基-甲基-L-苯丙氨酸，对酰基-L-苯丙氨酸，对苯甲酰基-L-苯丙氨酸，L-磷酸丝氨酸，膦酰丝氨酸(phosphonoserine)，膦酰酪氨酸，对碘-苯丙氨酸，对溴苯丙氨酸，对氨基-L-苯丙氨酸，异丙基-L-苯丙氨酸，和对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。例如，发明名称为“In vivo incorporation of unnatural aminoacids”的WO 2002/085923中提供了可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构的实例。还可参见Kiick et al.,(2002)Incorporation of azides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24，用于其他蛋氨酸类似物。
许多适用于本发明的非天然氨基酸是可商购的，例如购自Sigma(美国)或Aldrich(密尔沃基(Milwaukee)，威斯康星州(Wis.)，美国)。如本发明所提供或在各种出版物中所提供的，或使用本领域技术人员已知的标准方法，任选地合成那些不能商购的化合物。有关有机合成技术，参见例如，Fessendon与Fessendon撰写的“Organic Chemistry”(1982,Second Edition,Willard Grant Press,Boston Mass.)；March撰写的“Advanced OrganicChemistry”(Third Edition,1985,Wiley and Sons,New York)；和Carey与Sundberg撰写的“Advanced Organic Chemistry”(Third Edition,Parts A and B,1990,Plenum Press,New York)。描述非天然氨基酸合成的其他出版物包括，例如发明名称为“In vivoincorporation of Unnatural Amino Acids”的WO 2002/085923；Matsoukas et al.,(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid from PhthylatedIntermediates.J.Chem.Soc.,3315-3319；Friedman,O.M.&Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-TumorAgents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.et al.(1988)AbsoluteConfiguration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.&Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines asConformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and IminiumIon Cyclization.J.Org.Chem.1989:1859-1866；Barton et al.,(1987)Synthesis ofNovel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-a-Amino-Adipic Acids,L-a-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron Lett.43:4297-4308；和Subasinghe et al.,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis ofbeta-heterocyclic 2-aminopropanoic acidderivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitizedsite.J.Med.Chem.35:4602-7。还可参见于2003年12月22日提交的发明名称为“ProteinArrays”，序列号为10/744,899和于2002年12月22日提交的序列号为60/435,821的美国专利申请。
具有羰基反应性基团的氨基酸允许通过亲核加成或羟醛缩合反应等多种反应来连接分子(包括但不限于PEG或其他水溶性分子)。
示例性的含羰基氨基酸可以表示如下：
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、或取代的芳基；R2是H、烷基、芳基、取代的烷基、和取代的芳基；R3是H、氨基酸、多肽、或氨基末端修饰基团；和R4是H、氨基酸、多肽、或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基和R2是简单的烷基(即，甲基、乙基、或丙基)，并且酮基团部分位于相对于所述烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基和R2是简单的烷基(即，甲基、乙基、或丙基)，并且酮基团部分位于相对于所述烷基侧链的间位。
在一些实施例中，带有相邻羟基和氨基基团的非天然编码的氨基酸可掺入至多肽中作为“掩蔽”醛官能团。例如，5-羟基赖氨酸于邻近ε胺处含有羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及于温和条件下添加摩尔浓度过量的偏过碘酸钠，以避免在多肽内的其他位点发生氧化。氧化反应的pH值通常是约7.0。典型反应涉及将约1.5摩尔浓度过量的偏过碘酸钠添加至多肽缓冲溶液中，随后在暗处温育约10分钟。参见例如美国专利号6,423,685，其通过引用并入本发明。
羰基官能团可在水溶液中在温和条件下以选择性方式与含有肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂反应，以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲键。参见例如Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基基团的独特反应性允许于存在其他氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。参见例如Cornish,V.W.,et al.,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.,et al.,Science 276:1125-1128(1997)。
含有亲核基团(如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码的氨基酸可与多种亲电子基团反应以形成偶联物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物)。
示例性的含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可以表示如下：
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、或取代的芳基、或R1不存在；X是O、N、或S，或X不存在；R2是H、氨基酸、多肽、或氨基末端修饰基团；和R3是H、氨基酸、多肽、或羧基末端修饰基团。
在一些实施方案中，n是4，R1不存在，和X是N。在一些实施方案中，n是2，R1不存在，和X不存在。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O、且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、含肼和含氨基脲的氨基酸可购自商业来源。例如，L-谷氨酸-γ-酰肼可购自Sigma Chemical(St.Louis,Mo.)。其他商业上不可获得的氨基酸可由本领域普通技术人员制备。参见例如美国专利号6,281,211，其通过引用并入本发明。
含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码的氨基酸的修饰的多肽可与含有醛或具有类似化学反应性的其他官能团的多种分子有效且选择性地反应。参见例如Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮及其他亲电子基团的反应性显著大于20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基基团或赖氨酸和N末端的氨基基团)。
含有氨基氧基(也称为羟胺)基团的非天然编码的氨基酸允许其与多种亲电子基团反应以形成偶联物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物)。与肼、酰肼和氨基脲相似地，氨基氧基基团的增强的亲核性允许其与含有醛或具有类似化学反应性的其他官能团的多种分子有效且选择性地反应。参见例如Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。鉴于与肼基团反应的结果是对应的腙，然而，肟一般由氨基氧基基团与含羰基的基团(如酮)的反应产生。
含有氨氧基基团的示例性氨基酸可以表示如下：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、或取代的芳基、或R1不存在；X是O、N或S，或X不存在；m是0-10；Y═C(O)或Y不存在；R2是H、氨基酸、多肽、或氨基末端修饰基团；和R3是H、氨基酸、多肽、或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，和Y不存在。在一些实施方案中，n是2，R1和X均不存在，m是0，和Y不存在。
可由容易获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备含氨基氧基的氨基酸。参见例如M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。已从天然来源中分离出一些含氨基氧基的氨基酸，如L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸(Rosenthal,G.et al.,Life Sci.60:1635-1641(1997))。其他含氨基氧基的氨基酸可由本领域普通技术人员制备。
叠氮和炔烃官能团的独特反应性使得其极其适用于多肽及其他生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物，具体而言脂肪族叠氮化物，和炔烃通常对常见化学反应条件是稳定的。具体而言，叠氮和炔烃官能团对见于天然存在的多肽中的20种常见氨基酸的侧链(即R基团)均是惰性的。然而，当使叠氮和炔基团紧密靠近时，表现出二者的“弹簧承载(spring-loaded)”性质且其通过Huisgen[3+2]环加成反应以选择性地且有效地反应以产生对应的三唑。参见例如Chin J.,et al.,Science 301:964-7(2003)；Wang,Q.,et al.,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.,et al.,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参见例如，Padwa,A.,inCOMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,Vol.4,(ed.Trost,B.M.,1991),p.1069-1109；Huisgen,R.in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY,(ed.Padwa,A.,1984),p.1-176)而非亲核取代，带有含叠氮和炔烃侧链的非天然编码的氨基酸的掺入使所得多肽于非天然编码的氨基酸的位置处被选择性修饰。涉及含叠氮或炔烃的抗体的环加成反应可在室温于水溶液条件下以催化量的使Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂存在下通过添加Cu(II)(包括但不限于催化量的CuSO4形式)进行。参见例如，Wang,Q.,et al.,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.,et al.,J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。示例性的还原剂包括(包括但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁、对苯二酚、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+、和所施加的电势。
在一些情况下，在需要叠氮与炔烃之间的Huisgen[3+2]环加成反应的情况下，抗原结合多肽可包含含炔烃基团部分的非天然编码的氨基酸，且待附接至氨基酸的水溶性聚合物可包含叠氮基团部分。或者，还可进行逆反应(即与氨基酸上的叠氮基团部分和存在于水溶性聚合物上的炔烃基团部分)。
叠氮官能团还可选择性地与含有芳基酯的水溶性聚合物反应且由芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得的胺接着与临近的酯键有效反应以产生对应的酰胺。参见例如E.Saxon和C.Bertozzi,Science 287,2007-2010(2000)。含叠氮的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
包含芳基酯和膦基团部分的示例性水溶性聚合物可表示如下：
其中，X可以是O、N或S，或X不存在；Ph是苯基；W是水溶性聚合物；和R可以是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基基团。示例性R基团包含但不限于–CH2、–C(CH3)3、–OR′'、–NR′'R′”、–SR′'、-卤素、–C(O)R′'、-CONR′'R′”、–S(O)2R′'、–S(O)2NR′'R′”、–CN和–NO2。R′'和R′”各自独立地是H，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基、包含但不限于被1-3个卤素取代的芳基，取代或未取代的烷基，烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基基团。当本发明的化合物包含一个以上R基团时，例如，当存在一个以上这些基团时，所选的各R基团分别独立地是各R′'和R′”基团。当R”和R”'连接到同一氮原子时，它们可以与所述氮原子结合形成5-、6-或7-个原子组成的环。例如，-NR”R”'旨在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上对取代基的讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”是指包含与除氢基团以外的基团连接的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括但不限于-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括但不限于-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮官能团还可选择性地与含有硫酯的水溶性聚合物反应且由芳基膦基团部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得的胺接着与硫酯键有效反应以产生对应的酰胺。包含硫酯和膦基团部分的示例性水溶性聚合物可表示如下：
其中，n是1-10；X可为O、N或S，或X不存在；Ph是苯基；和W是水溶性聚合物。
示例性的含炔氨基酸可以表示如下：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、或取代的芳基，或R1不存在；X是O、N或S，或X不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽、或氨基末端修饰基团；和R3是H、氨基酸、多肽、或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X不存在，m是0，且乙炔基团部分位于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，且炔丙氧基基团位于相对于所述烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施方案中，n是1，R1和X均不存在，和m是0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔烃的氨基酸是商业上可获得的。例如，炔丙基甘氨酸可购自Peptech(Burlington,Mass.)。或者，含炔烃的氨基酸可根据标准方法制备。例如，对炔丙基氧基苯丙氨酸可按照例如Deiters,A.,et al.,J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述合成，且4-炔基-L-苯丙氨酸可如Kayser,B.,et al.,Tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所述合成。其他含炔烃氨基酸可由本领域普通技术人员制备。
示例性的含叠氮化物氨基酸可以表示如下：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、或取代的芳基，或R1不存在；X是O、N或S，或X不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽、或氨基末端修饰基团；和R3是H、氨基酸、多肽、或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X不存在，m是0，且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是0-4，R1和X均不存在，m＝0。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是2，且对叠氮基乙氧基基团部分位于相对于所述烷基侧链的对位。
含叠氮基氨基酸可购自商业来源。例如，4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-ImpexInternational,Inc.(Wood Dale,Ill.)。对于商业上不可获得的那些含叠氮基氨基酸，叠氮基可使用本领域普通技术人员已知的标准方法相对容易地制备，包括但不限于经由合适的离去基团(包括但不限于卤化物、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)的移位(displacement)或经由打开受适当保护的内酯。参见例如March的Advanced Organic Chemistry(第三版，1985,Wiley and Sons,New York)。
β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑烷而选择性修饰含有醛基的多肽和其他生物分子。参见例如J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施方案中，可以将β-取代的氨基硫醇氨基酸掺入抗体中，接着与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施方案中，水溶性聚合物、药物偶联物或其他有效负载(payload)可通过形成噻唑烷与包含β取代的氨基硫醇氨基酸的抗体多肽偶联。
有用的非天然氨基酸的具体实例包括但不限于，对乙酰基-L-苯丙氨酸，O-甲基-L-酪氨酸，L-3-(2-萘基)丙氨酸，3-甲基-苯丙氨酸，O-4-烯丙基-L-酪氨酸，4-丙基-L-酪氨酸，三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸，L-多巴(Dopa)，氟化苯丙氨酸，异丙基-L-苯丙氨酸，对叠氮基-甲基-L-苯丙氨酸，对叠氮基-L-苯丙氨酸，对酰基-L-苯丙氨酸，对苯甲酰基-L-苯丙氨酸，L-磷酸丝氨酸，膦酰丝氨酸，膦酰酪氨酸，对碘-苯丙氨酸，对溴苯丙氨酸，对氨基-L-苯丙氨酸，异丙基-L-苯丙氨酸，和对炔丙基氧基-苯丙氨酸。其他有用的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸，N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺，和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。
在特定实施方案，所述非天然氨基酸选自对乙酰基-苯丙氨酸，对乙炔基-苯丙氨酸，对炔丙基氧基苯丙氨酸，对叠氮基-甲基-苯丙氨酸，和对叠氮基-苯丙氨酸。一种特别有用的非天然氨基酸是对叠氮基苯丙氨酸。此氨基酸残基是本领域技术人员已知的，用于促进例如与带有炔基的化合物的Huisgen[3+2]环加成反应(所谓的“点击”化学反应)。此反应使本领域技术人员能够在非天然氨基酸的位点特异性位置处容易且快速地与抗体偶联。
在某些实施方案，第一活性基团是炔基部分(包括但不限于，在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯基丙氨酸中，其中所述炔丙基基团有时也称为乙炔基团部分)，和第二活性基团是叠氮基部分，可使用[3+2]环加成化学。在某些实施方案，第一活性基团是叠氮基部分(包括但不限于，在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，和第二活性基团是炔基部分。
在上述通式中，各L表示二价连接体。所述二价连接体可以是本领域技术人员已知的任何二价连接体。通常，所述二价连接体能够与功能基团部分R以及非天然氨基酸的同源活性基团(例如α碳)形成共价键。有用的二价连接体是键、亚烷基、取代的亚烷基、亚杂烷基、取代的亚杂烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、和取代的亚杂芳基。在某些实施方案，L是C1-10亚烷基或C1-10亚杂烷基。
用于本发明所述方法和组合物中的非天然氨基酸具有以下四种性质中的至少一种：(1)非天然氨基酸侧链上的至少一个官能团具有与20种常见的基因编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的化学反应性正交的至少一种特征和/或活性和/或反应性，或至少与存在于包括非天然氨基酸的多肽中的天然氨基酸的化学反应性正交；(2)引入的非天然氨基酸对20种常见的基因编码氨基酸基本上是化学惰性的；(3)非天然氨基酸可稳定地掺入多肽中，优选具有与天然存在氨基酸相当的稳定性的多肽，或在典型的生理条件下，进一步优选，此种掺入可通过体内系统进行；和(4)非天然氨基酸包括肟官能团或可通过与试剂反应而转化为肟基的官能团，优选在不破坏包括非天然氨基酸的多肽的生物学特性的条件下(除非此种生物学特性的破坏是修饰/转化的目的)进行，或其中所述转化可在pH为约4至约8的水性条件下进行，或其中非天然氨基酸上的反应性位点是亲电性位点。可将任何数目的非天然氨基酸引入多肽。非天然氨基酸还可包括经保护或经掩蔽的肟或经保护或经掩蔽的基团，其在所述经保护的基团脱保护或所述经掩蔽的基团脱掩蔽之后可转化成肟基团。非天然氨基酸还可包括经保护或经掩蔽的羰基或二羰基基团，其可在所述经保护的基团脱保护或所述经掩蔽的基团脱掩蔽之后转化为羰基或二羰基，从而可与羟胺类化合物或肟类化合物反应形成肟基团。
在进一步的实施方案，可用于本发明所述方法和组合物中的非天然氨基酸包括但不限于，含可光活化的交联剂的氨基酸类，自旋标记的氨基酸类，荧光氨基酸类，金属结合氨基酸类，含金属的氨基酸类，放射性氨基酸类，具有新型官能团的氨基酸类，与其他分子共价相互作用或非共价相互作用的氨基酸类，光笼蔽和/或可光异构的氨基酸类，含生物素或生物素类似物的氨基酸类，糖基化氨基酸类(例如糖取代的丝氨酸)，其他碳水化合物修饰的氨基酸类，含酮的氨基酸类，含醛的氨基酸类，含聚乙二醇或其他聚醚的氨基酸类，重原子取代的氨基酸类，化学可切割和/或光可切割的氨基酸类，与天然氨基酸类相比具有细长侧链的氨基酸类(包括但不限于聚醚类或长链烃类，包括但不限于大于约5个或大于约10个碳原子)，碳连接的含糖氨基酸类，氧化还原活性氨基酸类，含氨基硫代酸的氨基酸类，和含一个或多个毒性基团部分的氨基酸类。
在一些实施方案，非天然氨基酸包含糖基团部分。此类氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸，N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺，和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。此类氨基酸的实例还包括氨基酸和糖类之间天然存在的N-或O-连接键被自然界不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)所替代的实例。此类氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖类，例如2-脱氧葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
经由非天然氨基酸的掺入而掺入到抗体的化学部分提供了多肽的各种优势和操作(manipulations)。例如，羰基或双羰基官能团的独特反应性(包括酮或醛官能团)允许用多种含肼或羟胺试剂中的任一种在活体内或体外选择性修饰抗体。重原子非天然氨基酸，例如，可以用于相位测定(phasing)X射线结构数据。利用非天然氨基酸位点特异性引入重原子也在选择重原子位置方面提供了选择性和灵活性。光敏非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于，苯基叠氮化物)侧链的氨基酸)，例如，允许多肽在活体内和体外进行有效的光交联。光敏非天然氨基酸的实例包括但不限于，例如，对-叠氮基-苯丙氨酸和对-苯甲酰基-苯丙氨酸。然后，可以通过激发光敏基团提供的时序控制(temporal control)，而任意交联具有光敏非天然氨基酸的抗体。在非限制性实例中，可以用同位素标记的、包括但不限于甲基来取代非天然氨基酸的甲基，以在包括但不限于使用核磁共振和振动光谱中，作为局部结构和动力学的探针。
具有亲电反应基团的氨基酸允许经由各种化学反应(包括但不限于亲核加成反应)而连接分子的各种反应。这样的亲电反应基团包括羰基或二羰基(包括但不限于酮或醛基团)、类似于羰基或二羰基的基团(其具有类似于羰基或二羰基基团的反应性，且结构上类似于羰基或二羰基基团)、经掩蔽的羰基或经掩蔽的二羰基(其可以很容易转化成羰基或二羰基基团)、或经保护的羰基或经保护的二羰基(其一旦去保护具有类似于羰基或二羰基基团的反应性)。这样的氨基酸包括具有式(AA)结构的氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')-、-NR′'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R′')-、-CON(R′')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R′')-、-CSN(R′')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')C(O)O-、-S(O)kN(R′')-、-N(R′')C(O)N(R′')-、-N(R′')C(S)N(R′')-、-N(R′')S(O)kN(R′')-、-N(R′')-N═、-C(R′')═N-、-C(R′')═N-N(R′')-、-C(R′')═N-N═、-C(R′')2-N═N-、和-C(R′')2-N(R′')-N(R′')-，其中B中的各R′'独立地是H、烷基或取代的烷基；J是
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；J中的各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、或保护基、或当多于一个的R″基团存在时，两个R″任选地形成杂环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基，或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；或-A-B-J-R基团一起形成双环或三环环烷基或杂环烷基，所述双环或三环环烷基或杂环烷基含有至少一个羰基(包括二羰基)、经保护的羰基(包括经保护的二羰基)、或经掩蔽的羰基(包括经掩蔽的二羰基)；或-J-R基团一起形成单环或双环环烷基或杂环烷基，所述单环或双环环烷基或杂环烷基含有至少一个羰基(包括二羰基)、经保护的羰基(包括经保护的二羰基)、或经掩蔽的羰基(包括经掩蔽的二羰基)；条件是：当A是亚苯基，且各R3是H时，B是存在的；以及当A是-(CH2)4-，且各R3是H时，B不是-NHC(O)(CH2CH2)-；当A和B是不存在的，且各R3是H时，R不是甲基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
在某些实施方案中，式(AA)的化合物在偏酸性(mildly acidic)条件下、在水性条件中至少1个月是稳定的。在某些实施方案中，式(AA)的化合物在偏酸性条件下至少2周是稳定的。在某些实施方案中，式(AA)的化合物在偏酸性条件下至少5天是稳定的。在某些实施方案中，这样的酸性条件是pH 2至8。
在式(AA)化合物的某些实施方案中，B是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(R″)═N-N(R″)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(R″)═N-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CON(R″)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或取代的亚烷基)-、或-S(O)2(亚烷基或取代的亚烷基)-。在式(AA)化合物的某些实施方案中，B是-O(CH2)-、-CH═N-、-CH═N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(═O)CH2-、或-S(O)2CH2-。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R是C1-6烷基或环烷基。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R是-CH3、-CH(CH3)2、或环丙基。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R1是H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(tetrafluoroacetyl)(TFA)、或苄氧羰基(Cbz)。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R1是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R2是OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R2是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R2是多核苷酸。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R2是核醣核酸(RNA)。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R2是tRNA。在式(AA)化合物的某些实施方案中，所述tRNA特定地识别选择密码子(selectorcodon)。在式(AA)化合物的某些实施方案中，所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、卵白石密码子、独特密码子(unique codon)、罕用密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子所组成的组。在式(AA)化合物的某些实施方案中，R2是阻抑tRNA。
在式(AA)化合物的某些实施方案中，
上式选自以下所组成的组：(i)A是取代的低级亚烷基、C4-亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基、或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′')-、-C(O)N(R′')-、-CON(R′')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R′')-、-N(R′')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')C(O)O-、-N(R′')C(S)-、-S(O)N(R′')-、-S(O)2N(R′')-、-N(R′')C(O)N(R′')-、-N(R′')C(S)N(R′')-、-N(R′')S(O)N(R′')-、-N(R′')S(O)2N(R′')-、-N(R′')-N═、-C(R′')═N-N(R′')-、-C(R′')═N-N═、-C(R′')2-N═N-、和-C(R′')2-N(R′')-N(R′')-所组成的组；(ii)A是任选的，且当其存在时是取代的低级亚烷基、C4-亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基、或取代的亚芳烷基；B是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′')-、-C(O)N(R′')-、-CON(R′')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R′')-、-N(R′')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')C(O)O-、-N(R′')C(S)-、-S(O)N(R′')、-S(O)2N(R′')、-N(R′')C(O)N(R′')-、-N(R′')C(S)N(R′')-、-N(R′')S(O)N(R′')-、-N(R′')S(O)2N(R′')-、-N(R′')-N═、-C(R′')═N-N(R′')-、-C(R′')═N-N═、-C(R′')2-N═N-、和-C(R′')2-N(R′')-N(R′')-所组成的组；(iii)A是低级亚烷基；B是任选的，且当其存在时是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′')-、-C(O)N(R′')-、-CSN(R′')-、-CON(R′')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')C(O)O-、-N(R′')C(S)-、-S(O)N(R′')、-S(O)2N(R′')、-N(R′')C(O)N(R′')-、-N(R′')C(S)N(R′')-、-N(R′')S(O)N(R′')-、-N(R′')S(O)2N(R′')-、-N(R′')-N═、-C(R′')═N-N(R′')-、-C(R′')═N-N═、-C(R′')2-N═N-、和-C(R′')2-N(R′')-N(R′')-所组成的组；以及(iv)A是亚苯基；B是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′')-、-C(O)N(R′')-、-CON(R′')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R′')-、-N(R′')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R′')C(O)O-、-N(R′')C(S)-、-S(O)N(R′')、-S(O)2N(R′')、-N(R′')C(O)N(R′')-、-N(R′')C(S)N(R′')-、-N(R′')S(O)N(R′')-、-N(R′')S(O)2N(R′')-、-N(R′')-N═、-C(R′')'N-N(R′')-、-C(R′')═N-N═、-C(R′')2-N═N-、和-C(R′')2-N(R′')-N(R′')-所组成的组；J是
各R'独立地是H、烷基、或取代的烷基；R1是任选的，且当其存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是任选的，且当其存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基；且R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
在某些实施方案中，所述非天然氨基酸可以具有式BB所示结构：
或其盐，其中：D是–Ar-W3–或–W1-Y1-C(O)-Y2-W2–；Ar是
各W1、W2、和W3独立地为键或低级烷基；各X1独立地为–NH–、–O–、或–S–；各Y1独立地为键、-NH-、或-O-；各Y2独立地为键、-NH-、-O-、或N-连接或C-连接的亚吡咯烷基；Z1、Z2、和Z3中的一个为-N-，而Z1、Z2、和Z3中的其他独立地为-CH-。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸具有式BBa所示结构：
其中D是式BB的上下文中定义的。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸具有式BBb所示结构：
或其盐，其中W4是C1-C10亚烷基。在另一实施方案中，W4是C1-C5亚烷基。在一实施方案中，W4是C1-C3亚烷基。在一实施方案中，W4是C1亚烷基。在特定实施方案中，所述非天然氨基酸选自由以下组成的组：
或其盐。此类非天然氨基酸可以是盐的形式，或者可以掺入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，并且任选地进行翻译后修饰。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式CC所示结构：
或其盐，其中Ar是：
V是单键、低级亚烷基，或–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在、或是低级亚烷基，而另一个是–NH–、–O–、或–S–；Z1、Z2、和Z3中的一个是–CH–或–N–，而Z1、Z2、和Z3中的其他独立地是-CH-；和R是低级烷基。在某些实施方案中，当Ar是
和V是-NH-时，那么Z1、Z2、和Z3中的一个是–N–。在某些实施方案中，V是单键、-NH-、或-CH2NH-。
在某些实施方案中，Ar是：
Z1、Z2、Z3和X1是式CC的上下文中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在本段所述的某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在本段所述的某些实施方案中，Z1是N。在本段所述的某些实施方案中，Z2是N。在本段所述的某些实施方案中，Z3是N。在本段所述的某些实施方案中，Z1是CH，Z3是CH，和X1是S。
在某些实施方案中，Ar是：
Z1、Z2和Z3是式CC的上下文中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在本段所述的某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在本段所述的某些实施方案中，Z1是N。在本段所述的某些实施方案中，Z2是N。在本段所述的某些实施方案中，Z3是N。
在某些实施方案中，Ar是：
Z1、Z3和X1是式CC的上下文中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在本段所述的某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在本段所述的某些实施方案中，Z1是N。在本段所述的某些实施方案中，Z3是N。在本段所述的某些实施方案中，Z1是CH，Z3是CH，和X1是S。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式CCa：
其中Ar、V、和R是式CC的上下文中定义的。
在实施方案中，提供了式CC和CCa中任一所示的化合物，其中V是单键。在另一实施方案中，提供了式CC和CCa中任一所示的化合物，其中V是-NH-。在另一实施方案中，提供了式CC和CCa中任一所示的化合物，其中V是–CH2NH–。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式DD所示结构：
或其盐，其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式EE所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式FF所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式GG所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式HH所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式JJ所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式KK所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式LL所示结构：
或其盐；其中V和R是式CC中定义的。在本段所述的某些实施方案中，V是–W1–W2–；W1和W2中的一个是不存在的、或是–CH2–，而另一个是–NH–、–O–、或–S–。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-。在某些实施方案中，V是单键、–NH–、或-CH2NH-；和R是甲基。
在某些实施方案中，所述经修饰的氨基酸具有式51-62任一所示结构：
或其盐。
在某些实施方案中，所述非天然氨基酸选自由以上化合物30、53、56、59、60、61和62组成的组。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸是化合物30。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸是化合物56。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是化合物61。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是化合物62。
8.化合物的形式和制剂
在一些实施方案中，本发明提供了：
(a)本发明所述的化合物，例如，式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示化合物，和其药学上可接受的盐及组合物；
(b)本发明所述的化合物，例如，式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示化合物，和其药学上可接受的盐及组合物用于治疗和/或预防癌症(例如，胰腺癌、多发性骨髓瘤)；
(c)制备本发明所述的化合物的方法，例如，制备式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示化合物的方法，所述方法如本发明别处和/或实施例部分更详细描述的；
(d)药物制剂，其包含本发明所述的化合物，例如式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示的化合物，或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或稀释剂；
(e)药物制剂，其包含本发明所述的化合物，例如式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示的化合物，或其药学上可接受的盐以及一种或多种其他有效抗癌剂、任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中；
(f)式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示的化合物、或包含式I和/或II和/或III和/或V和/或VI化合物的药物组合物用于治疗癌症和/或炎症的用途。该用途包括施用有效量的本发明所述的化合物，例如式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示的化合物、其药学上可接受的盐或组合物；或者
(g)治疗癌症和/或炎症的方法，包括施用有效量的本发明所述的化合物，例如式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示的化合物，其药学上可接受的盐或组合物，与一种或多种有效抗癌剂组合和/或交替施用。
光学活性化合物
应当理解，本发明提供的化合物具有几个手性中心，并可以光学活性形式和外消旋体形式存在并被分离。一些化合物可能表现出多态性。应当理解，具有本发明所述的有用性质的本发明提供的化合物的任何外消旋体、旋光体、非对映体、多晶型或立体异构体形式、或其混合物均包含在本发明范围内。本领域众所周知，应如何制备旋光体形式(例如，通过重结晶技术拆分外消旋体，由光学活性起始物料合成，手性合成，或通过使用手性固定相进行色谱分离)。
同样，大多数氨基酸是手性的(指定为L或D，其中L对映异构体是天然存在的构型)并且可作为单独的对映异构体存在。
获得光学活性物质的方法的实例是本领域已知的，并至少包括以下内容。
i)晶体的物理分离——通过手工分离单个对映异构体的宏观晶体的技术。如果存在单独对映异构体的晶体，即所述物质是聚集体，并且所述晶体在视觉上是不同的，则可使用所述技术；
ii)同时结晶——通过使单个对映异构体从外消旋体溶液中分别结晶的技术，只要后者是固态的聚集体；
iii)酶促拆分——借助对映异构体与酶的不同反应速率，部分或完全分离外消旋体的技术；
iv)酶促不对称合成——通过合成的至少一个步骤使用酶促反应来得到所需对映异构体的对映异构体纯的或富集的合成前体的合成技术；
v)化学不对称合成——通过在生成产物的不对称性(即手性)的条件下由非手性前体合成所需对映异构体的合成技术，其可使用手性催化剂或手性助剂来实现；
vi)非对映体分离——使外消旋化合物与对映体纯的试剂(手性助剂)反应，将单个对映异构体转化为非对映异构体。然后凭借它们此时更明显的结构差异，从而通过层析法或结晶法将所得非对映异构体分离，并随后除去手性助剂以获得所需对映异构体的技术；
vii)一级和二级不对称转化——通过来自外消旋体的非对映异构体平衡以产生非对映异构体相对于所需对映异构体在溶液中的优势，或者非对映异构体相对所需对映异构体优先结晶扰乱平衡，使得最终原则上所有物质由所需对映异构体转化为结晶非对映异构体。然后从所述非对映异构体中释放所需的对映异构体的技术；
viii)动力学拆分——所述技术是指由于动力学条件下对映异构体与手性、非外消旋试剂或催化剂的不等反应速率而实现外消旋体的部分或完全拆分(或进一步拆分已部分拆分的化合物)；
ix)由非外消旋前体进行的对映特异性合成——通过由非手性起始物料得到所需对映异构体，并且其中所述立体化学完整性在合成过程中没有或仅受到最小程度损害的合成技术；
x)手性液相色谱法——借助于它们与固定相的不同相互作用，使外消旋体的对映异构体在液体流动相中进行分离的技术。所述固定相可由手性材料制成，或者所述流动相可包含另外的手性材料以引起不同的相互作用；
xi)手性气相色谱法——使外消旋体挥发并通过其在气相流动相中与含有固定的非外消旋手性吸附剂相的色谱柱的不同相互作用进行分离对映异构体的技术；
xii)手性溶剂萃取——通过使一种对映异构体优先溶解形成特定的手性溶剂而使对映异构体分离的技术；
xiii)跨手性膜转运——使外消旋体与薄膜屏障接触的技术。所述屏障通常分离两种可混溶的流体，其中一种含有外消旋体，而驱动力如浓度或压差导致优先转运穿过所述膜屏障。分离是由于膜的非外消旋手性特性而发生的，其仅允许所述外消旋体的一种对映异构体通过。
在一些实施方案中，本发明提供了式(I-p)和/或式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示化合物的组合物，其包含所述化合物的基本纯的指定对映异构体。在某些实施方案中，在本发明的方法和化合物中，所述化合物基本上不含其他对映异构体。在一些实施方案，组合物包含所述化合物的至少85重量％、90重量％、95重量％、98重量％、99重量％、或100重量％的化合物，其余部分包含其他化学物质或对映异构体。
同位素富集的化合物
本发明还提供了同位素富集的化合物，包括但不限于同位素富集的式(I-p)、和/或式I和/或II和/或III和/或V和/或VI所示的化合物。
先前已采用某些类别的药物证明了药物的同位素富集(例如氘化)可改善药代动力学(“PK”)、药效学(“PD”)和毒性情况。参见例如Lijinsky et.al.,FoodCosmet.Toxicol.,20:393(1982)；Lijinsky et.al.,J.Nat.Cancer Inst.,69:1127(1982)；Mangold et.al.,Mutation Res.308:33(1994)；Gordon et.al.,DrugMetab.Dispos.,15:589(1987)；Zello et.al.,Metabolism,43:487(1994)；Gatelyet.al.,J.Nucl.Med.,27:388(1986)；Wade D,Chem.Biol.Interact.117:191(1999)。
药物的同位素富集可用于，例如，(1)减少或消除不需要的代谢物，(2)增加母体药物的半衰期，(3)减少达到所需效果的剂量次数，(4)减少达到所需效果的必要剂量的量，(5)增加活性代谢物的形成(如果有形成)，和/或(6)减少特定组织中有害代谢物的产生和/或为联合治疗创造更有效的药物和/或更安全的药物，无论所述联合治疗是否有意或无意。
替换其同位素之一的原子通常会导致化学反应的反应速率变化。此现象被称为动力学同位素效应(“KIE”)。譬如，如果在化学反应中的速率确定步骤(即，具有最高过渡态能量的步骤)期间C-H键断裂，那么用氘取代氢将导致反应速率降低，并且过程会放缓。此现象被称为氘动力学同位素效应(“DKIE”)。参见，例如Foster et al.,Adv.Drug Res.,vol.14,pp.1-36(1985)；Kushner et al.,Can.J.Physiol.Pharmacol.,vol.77,pp.79-88(1999)。
DKIE的大小可表示为其中C-H键断裂的给定反应与氘取代氢的相同反应的速率之间的比值。所述DKIE的范围可从约1(无同位素效应)至非常大的数值，例如50或更多，这意味着当氘取代氢时反应可以慢50倍或更多倍。高DKIE值可能部分归因于被称为隧道效应的现象，其是不确定性原理的结果。隧道效应归因于氢原子的较小质量，并且发生是因为涉及质子的过渡态有时可在没有所需活化能的情况下形成。由于氘的质量大于氢，因此统计学上发生此现象的可能性要低得多。
氚(“T”)是氢的放射性同位素，用于研究、聚变反应堆、中子发生器和放射性药物中。氚是在原子核中有2个中子，原子量接近3的氢原子。它以非常低的浓度自然存在于环境中，最常见的是T2O。氚慢慢衰减(半衰期＝12.3年)，并释放出不能穿透人体皮肤外层的低能量β粒子。内照射是与此同位素相关的主要危害，但它必须大量摄入才会造成重大的健康风险。与氘相比，在达到危险级别之前必须消耗较少量的氚。用氚(“T”)替换氢产生比氘更强的键，并在数值上产生更大的同位素效应。类似地，其他元素的同位素替代，包括但不限于，13C或14C替代碳，33S、34S、或36S替代硫，15N替代氮，和17O或18O替代氧，均可导致类似的动力学同位素效应。
譬如，通过推测限制反应性物质如三氟乙酰氯的生成，使用DKIE来降低氟烷的肝毒性。但是，此方法可能不适用于所有药物类别。例如，氘掺入可导致代谢转换。代谢转换的概念断言异种原体在被I期酶隔离时可在化学反应(如氧化)之前瞬时结合并以各种构象重新结合。这一假设得到了许多I期酶中相对大量的结合口袋和许多代谢反应的混杂性的支持。代谢转换可导致已知代谢物的不同比例以及全新的代谢物。此种新的代谢特征可能会传递或多或少的毒性。
动物体为了从其循环系统中除去诸如治疗剂的外来物质而表达各种酶。例如，所述这些酶包括细胞色素P450酶类(“CYPs”)、酯酶类、蛋白酶类、还原酶类、脱氢酶类和单胺氧化酶类，以与这些外来物质反应并将所述这些外来物质转化为更大极性的中间体或代谢物用于肾脏排泄。药物化合物的一些最常见代谢反应涉及将碳-氢(C-H)键氧化成碳-氧(C-O)或碳-碳(C-C)π键。所得代谢物在生理条件下可能是稳定的或不稳定的，并且相对于母体化合物可具有显著不同的药代动力学、药效学以及急性和长期毒性特征。对于许多药物而言，此种氧化反应很快。因此这些药物通常需要多次或高剂量的日剂量给药。
因此，与具有天然同位素组成的类似化合物相比，本发明提供的化合物的某些位置处的同位素富集将产生可检测的KIE，所述KIE将影响本发明所述化合物的药代动力学、药理学和/或毒理学特征。
9.式(I)及其子式所示化合物的制备
合成方案1
在一组实施方案中，式(I)的化合物如以上合成方案1中所示制备。化合物1.1与化合物1.2反应以得到中间体1.3。该反应可以在任何合适的碱(例如，碳酸铯、碳酸钠、碳酸钾)和任何合适的非质子溶剂(例如，DMF、THF、二氧六环)的存在下进行。化合物1.3中的氯与胺R5-NH2反应以得到中间体1.4，该反应在任何合适的碱(例如，DIPEA、TEA)和非质子溶剂(例如，NMP、DMF)的存在下进行。在任何合适的还原剂(例如，LAH、DIBAL)存在下，化合物1.4中的酯基团被还原为醇(化合物1.5)。在合适的试剂(例如，亚硫酰氯、亚硫酰溴、三氟甲磺酸盐)和溶剂(例如，二氯甲烷、二氯乙烷)的存在下，将化合物1.5中的羟基转化为离去基团(例如，氯、溴、三氟甲磺酸酯)以得到化合物1.6。在碱(例如，DIPEA、TEA)和溶剂(例如，二氯甲烷、二氯乙烷)的存在下，化合物1.6与适当保护的二胺反应，然后除去保护基团，得到式(I)的化合物。用于合成式(I)及其子式所示化合物的其他方法在实施例部分中描述。如本发明所用，“式(I)及其子式所示的化合物”是指式(I)和/或式(II)和/或式(III)所示的化合物。
9.抗体偶联物的制备
9.1.抗原制备
用于分离抗体的蛋白质可以是完整的抗原或抗原片段。完整的蛋白质或抗原片段可以是分离的蛋白质或细胞表达的蛋白质形式。可用于生成抗体的其他形式的抗原对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
9.2.单克隆抗体
单克隆抗体可例如使用最先由Kohler et al.,Nature,1975,256:495-497(通过引用其全文并入本发明)描述的杂交瘤方法获得，和/或通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567，通过引用其全文并入本发明)获得。单克隆抗体亦可例如使用基于噬菌体或酵母的文库获得。参见例如美国专利号8,258,082和8,691,730，其各自通过引用其全文并入本发明。
在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物经免疫以诱发生成或能够生成抗体的淋巴细胞，所述抗体将与用于免疫的蛋白质特异性结合。或者，淋巴细胞可于体外进行免疫。然后淋巴细胞与骨髓瘤细胞使用合适融合剂诸如聚乙二醇进行融合，以形成杂交瘤细胞。参见Goding J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 3rd ed.(1986)Academic Press,San Diego,CA，其通过引用其全文并入本发明。
将杂交瘤细胞接种并于含有一或多种抑制未融合、亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质的合适培养基中生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨喋呤及胸苷(HAT培养基)，此类物质预防HGPRT缺乏性细胞的生长。
有用的骨髓瘤细胞为有效融合、支持所选抗体生成细胞稳定大量生成抗体且对诸如HAT培养基的存在或不存在的培养基条件敏感的骨髓瘤细胞。其中，较佳的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如衍生自MOP-21和MC-11小鼠肿瘤的那些(可得自Salk InstituteCell Distribution Center,San Diego,CA)，以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国菌种保存中心(American Type Culture Collection),Rockville,MD)。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞亦曾描述用于生成人单克隆抗体。参见例如Kozbor,J.Immunol.,1984,133:3001，其通过引用其全文并入本发明。
在识别生成所需特异性、亲和性和/或生物活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可将所选克隆通过限制稀释程序进行亚克隆并通过标准方法使其生长。参见Goding，同上。适用此目的的合适培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以动物的腹水肿瘤的形式于体内生长。
编码单克隆抗体的DNA可利用常规方法轻易地进行分离及测序(例如通过使用能与编码所述单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。因此，杂交瘤细胞可作为编码具有所需性质抗体的DNA的有用来源。一经分离后，可将DNA置于表达载体中，接着将表达载体转染至本来不生成抗体的宿主细胞诸如细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))、酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia sp.))、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以生成单克隆抗体。
9.3.人源化抗体
人源化抗体可通过将非人单克隆抗体的大部分或所有结构部分置换为对应的人抗体序列来生成。因此，生成其中只有抗原特异性可变基团或CDR的杂交分子是由非人序列构成的杂交分子。得到人源化抗体的方法包括例如在下列中描述的那些方法：Winter andMilstein,Nature,1991,349:293-299；Rader et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:8910-8915；Steinberger et al.,J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078；Queen etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033；及美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762及6,180,370；其各自通过引用其全文并入本发明。
9.4.人抗体
人抗体可通过多种所属技术领域中已知技术生成得到，例如使用转基因动物(例如，人源化小鼠)。参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:2551；Jakobovits et al.,Nature,1993,362:255-258；Bruggermann et al.,Year inImmuno.,1993,7:33；及美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807；其各自通过引用其全文并入本发明。人抗体亦可衍生自噬菌体展示库(参见例如Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,1991,227:381-388；Marks et al.,J.Mol.Biol.,1991,222:581-597；及美国专利号5,565,332和5,573,905；其各自通过引用其全文并入本发明)。人抗体亦可由体外经激活的B细胞生成(参见例如美国专利号5,567,610和5,229,275，其各自通过引用其全文并入本发明)。人抗体亦可衍生自基于酵母的文库(参见例如美国专利号8,691,730，通过引用其全文并入本发明)。
9.5.偶联
所述抗体偶联物可通过标准技术制备得到。在某些实施方案，在适于由抗体与有效负载形成键的条件下，使抗体与有效负载前体接触，以形成抗体-有效负载偶联物。在某些实施方案，在适于由抗体与连接体形成键的条件下，使抗体与连接体前体接触。在适于由抗体-连接体与有效负载形成键的条件下，使所得抗体-连接体与有效负载前体接触，以形成抗体-连接体-有效负载偶联物。在某些实施方案，在适于由有效负载与连接体形成键的条件下，使有效负载前体与连接体前体接触。在适于由有效负载-连接体与抗体形成键的条件下，使所得有效负载-连接体与抗体接触，以形成抗体-连接体-有效负载偶联物。本发明公开了用于制备抗体偶联物的合适连接体，并且在下文实施例中描述了用于偶联的示例性条件。
在一些实施方案中，通过使如本发明公开的抗体与具有(A)-(H)和(J)-(M)任一所示结构的连接体前体接触来制备偶联物：
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的–CH2-(伯氨基或仲氨基)基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至作为环B的一部分的-NH部分或R3的螺杂环。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至作为环B的一部分的-NH部分或R3的螺杂环。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至作为环B的一部分的-NH部分或R3的螺杂环。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至R3的伯氨基或仲氨基基团。
其中COMPD是式(I-P)、和/或式(I)、和/或(II)、和/或(III)的化合物的剩余部分，其连接至作为环B的一部分的-NH部分或R3的螺杂环。
10.载体、宿主细胞和重组方法
实施方案还涉及提供编码抗体的分离的核酸，载体和包含所述核酸的宿主细胞，以及用于生成所述抗体的重组技术。
为了重组生成抗体，编码所述抗体的核酸可经分离且插入可复制载体以进行进一步克隆(即扩增DNA)或表达。在一些态样中，所述核酸可通过同源重组生成，例如美国专利号5,204,244中所述，其通过引用其全文并入本发明。
许多不同载体是本领域已知的。载体组分通常包括但不限于下列一个或多个：信号序列、复制起点、一或多个标记基因、增强子元件、启动子、转录终止序列，例如美国专利号5,534,615中所述，其通过引用其全文并入本发明。
合适宿主细胞的示例性实例提供于下。这些宿主细胞并无限制之意。
合适宿主细胞包括任何原核(例如，细菌性)、低等真核(例如，酵母)、或高等真核(例如，哺乳动物)细胞。合适原核细胞包括真细菌(eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)(大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(黏质沙雷氏菌(S.marcescans))、志贺氏菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacilli)(枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(绿脓杆菌(P.aeruginosa))、和链霉菌属(Streptomyces)。一个有用的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294，尽管其他菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776和大肠杆菌W3110亦是适合的。
除了原核细胞之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母菌亦为抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或俗称面包酵母是经常使用的低等真核宿主微生物。然而，一些其他属、种和株为可得且可用，诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda(例如SF9))、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(乳酸克鲁维酵母菌(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母菌(K.fragilis)、保加利亚克鲁维酵母菌(K.bulgaricus)、魏氏克鲁维酵母菌(K.wickeramii)、瓦特克鲁维酵母菌(K.waltii)、果蝇克鲁维酵母菌(K.drosophilarum)、耐热克鲁维酵母菌(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母菌(K.marxianus))、耶氏酵母属(Yarrowia)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、假丝酵母属(Candida)(白色念珠菌(C.albicans))、里氏木霉(Trichoderma reesia)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、许旺酵母属(Schwanniomyces)(西方许旺酵母(S.occidentalis))，和丝状真菌诸如例如青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)(小巢状曲菌(A.nidulans)和黑色曲菌(A.niger))。
可用的哺乳动物宿主细胞包括COS-7细胞、HEK293细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)；小鼠赛托利(sertoli)细胞；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)等。
用于生成本发明的抗体的宿主细胞可在多种培养基中进行培养。市售培养基诸如例如Ham'sF10、最低必需培养基(MEM)、RPMI-1640和达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)适合用于培养所述宿主细胞。此外，可使用Ham et al.,Meth.Enz.,1979,58:44；Barnes et al.,Anal.Biochem.,1980,102:255；和美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655和5,122,469或WO 90/03430以及WO87/00195中描述的任何培养基。其各自通过引用其全文并入本发明。
必要时任何这些培养基皆可补充激素类和/或其他生长因子类(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(诸如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲剂类(诸如HEPES)、核苷酸类(诸如腺苷和胸苷)、抗生素类、微量元素类(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、以及葡萄糖或等效能量来源。亦可包括本领域技术人员所知的适当浓度的任何其他必要补充剂。
培养条件诸如温度、pH值等均为选用于表达宿主细胞先前所使用的培养条件，且对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
使用重组技术时，抗体可于细胞内、细胞周质间隙(periplasmic space)中生成，或直接分泌至培养基中。若抗体是在细胞内生成，则第一步骤是将颗粒碎片(不论是宿主细胞或经细胞溶解的片段)通过例如离心或超滤去除。例如，Carter et al.(Bio/Technology,1992,10:163-167)描述了将分泌至大肠杆菌细胞周质间隙的抗体进行分离的程序。简言之，使细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。细胞碎片可通过离心去除。
在一些实施方案，抗体是于无细胞系统中生成。在一些态样中，无细胞系统如Yinet al.,mAbs,2012,4:217-225中所述的体外转录和转译系统，其原文以引用方式并入本发明。在一些态样中，无细胞系统利用来自真核细胞或来自原核细胞的无细胞萃取物。在一些态样中，原核细胞是大肠杆菌(E.coli)。抗体的无细胞表达可能是有用的，例如在抗体以不溶性聚集体形式在细胞中累积或细胞周质表达的产量较低的情况下。在无细胞体系中生成的抗体可能是非糖基化的，具体取决于细胞的来源。
抗体经分泌至培养基中时，首先利用商用蛋白质浓缩过滤器例如
或
超过滤装置，将取自此表达系统的上清液大致浓缩。上述任何步骤可包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白质水解，并可包括抗生素以防止伺机污染物生长。
自细胞制备的抗体组合物可利用例如羟磷灰石层析、胶体电泳、透析及亲和层析进行纯化，其中以亲和层析为特别有用的纯化技术。蛋白质A作为亲和性配体的适当性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白质A可用来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.,1983,62:1-13，通过引用其全文并入本发明)。蛋白质G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.,1986,5:1567-1575，通过引用其全文并入本发明)。
最常用于附着此亲和性配体的基质为琼脂糖，但亦可使用其他基质。使用机械稳定性基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可达成比琼脂糖更快的流速以及更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，可使用BakerBond
树脂来纯化。
亦可使用其他蛋白质纯化技术诸如离子交换管柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶层析法、肝素
层析法、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀，且这些技术可由本领域技术人员施用。
在经过任何初步纯化步骤之后，包含所述目的抗体及污染物的混合物可经低pH疏水交互作用层析法处理，使用pH介于约2.5至约4.5的洗脱缓冲液，通常在低盐浓度(例如约0至约0.25M的盐)下进行。
11.药物组合物和给药方法
可使用本领域可获得的方法和本发明公开的那些方法将本发明提供的抗体偶联物配制成药物组合物。本发明提供的任何抗体偶联物均可提供于合适的药物组合物中，并通过合适的给药途径进行给药。
本发明提供的方法包括施用包含至少一种本发明提供的抗体偶联物以及一种或多种相容的并且药学上可接受的载体的药物组合物。在此种情况下，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，尤其是人类的那些。术语“载体”包括与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏(Freund’s)佐剂(完全和不完全))、辅料或媒剂。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物静脉内施用时，水可用作载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药用载体的实例描述于Martin,E.W.,Remington’s Pharmaceutical Sciences中。
在临床实践中，本发明提供的药物组合物或抗体偶联物可通过本领域已知的任何途径进行施用。示例性给药途径包括但不限于吸入、动脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、经鼻、肠胃外、肺部、和皮下途径。在一些实施方案，将本发明提供的药物组合物或抗体偶联物进行肠胃外施用/给药。
用于肠胃外施用的组合物可以是乳剂或无菌溶液。肠胃外组合物可包括例如丙二醇、聚乙二醇、植物油类、和可注射的有机酯类(例如油酸乙酯)。所述这些组合物还可包含润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。灭菌可以几种方式进行，例如使用细菌过滤器、通过辐照或通过加热。肠胃外组合物也可以无菌固体组合物的形式制得，其可在使用时在无菌水或任何其他可注射无菌介质中溶解。
在一些实施方案，本发明提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本发明提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性抗体偶联物。
所述药物组合物可包含一种或多种药用辅料。可使用任何合适的药用辅料，并且本领域普通技术人员能够选择合适的药用辅料。合适辅料的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。特定辅料是否适合掺入药物组合物或剂型中取决于本领域众所周知的多种因素，包括但不限于将剂型施用于受试者的方式以及剂型中的特异性抗体。如果需要，所述组合物或单一单位剂型还可包含少量湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。因此，以下提供的药用辅料仅是示例性的，并无限制之意。其他药用辅料包括，例如，于Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe et al.(Eds.)6th Ed.(2009)中所述的那些，其全文以引用方式并入本发明。
在一些实施方案，所述药物组合物包含消泡剂。可使用任何合适的消泡剂。在一些态样中，消泡剂选自醇、醚、油、蜡、聚硅氧烷、表面活性剂、和其组合。在一些态样中，消泡剂选自矿物油、植物油、乙烯基双硬脂酰胺、石蜡、酯蜡、脂肪醇蜡、长链脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、硅二醇、氟硅氧烷、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基硅氧烷-二氧化硅、醚、辛醇、癸酰醇、去水山梨醇三油酸酯、乙醇、2-乙基-己醇、二甲聚硅氧烷(dimethicone)、油醇、二甲基硅油(simethicone)、和其组合。
在一些实施方案，所述药物组合物包含助溶剂。助溶剂的例示实例包括乙醇、聚乙二醇(poly(ethylene)glycol)、丁二醇、二甲基乙酰胺、甘油、和丙二醇。
在一些实施方案，所述药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的例示实例包括乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化物、二乙醇胺、单乙醇胺、甘胺酸、甲硫氨酸、瓜尔豆胶、和谷氨酸一钠。
在一些实施方案，所述药物组合物包含载体或填料。载体或填料的例示实例包括乳糖、麦芽糊精、甘露醇、山梨醇、几丁聚糖、硬脂酸、黄原胶、和瓜尔豆胶。
在一些实施方案，所述药物组合物包含表面活性剂。表面活性剂的例示实例包括d-α生育酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、多库酯钠、二十二烷酸甘油酯、单油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(macrogol 15hydroxystearate)、肉豆蔻醇、磷脂质类、聚氧乙烯烷基醚类、聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧甘油酯类、月桂基硫酸钠、去水山梨醇酯、和维生素E聚乙烯(乙二醇)琥珀酸酯。
在一些实施方案，所述药物组合物包含防结块剂。防结块剂的例示实例包括磷酸钙(三价)、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、和氧化镁。
可与药物组合物一起使用的其他辅料包括例如，白蛋白、抗氧化剂类、抗菌剂类、抗真菌剂类、生物可吸收聚合物类、螯合剂类、控释剂类、稀释剂类、分散剂类、溶解增强剂类、乳化剂类、胶凝剂类、软膏基质类、渗透促进剂类、防腐剂类、增溶剂类、溶剂类、稳定剂类、和糖类。此类药剂中的每一种的具体实例描述于例如Handbook of PharmaceuticalExcipients,Rowe et al.(Eds.)6th Ed.(2009),The Pharmaceutical Press中，其全文以引用方式并入本发明。
在一些实施方案，所述药物组合物包含溶剂。在一些态样中，溶剂是盐水溶液，诸如无菌等渗盐水溶液或右旋糖溶液。在一些态样中，溶剂是注射用水。
在一些实施方案，所述药物组合物呈颗粒形式，诸如微粒或纳米粒子。微粒和纳米粒子可由任何合适的材料(诸如聚合物或脂质)形成。在一些态样中，微粒或纳米粒子是胶束、脂质体或聚合物囊泡。
本发明进一步提供了包含抗体偶联物的无水药物组合物和剂型，因为在一些实施方案，水可促使某些抗体降解。
本发明提供的无水药物组合物和剂型可利用无水或低湿度含量成份以及低水分或低湿度条件制备。若预期在制造、包装和/或储存期间会显著接触水分和/或湿度，则包含乳糖和至少一种包含一级或二级胺的活性成份的药物组合物和剂型可为无水。
无水药物组合物应以维持其无水特性的方式进行制备和储存。因此，可利用已知能预防暴露至水的材料包装无水组合物，以使它们能被包括于适当处方的试剂盒中。适当包装的实例包括但不限于密封箔类、塑料类、单位剂量容器类(例如小瓶)、泡罩包装类、以及带状包装类。
本发明提供的不含乳糖的组合物可包含本领域众所周知的辅料，并且包含例如在美国药典(USP)SP(XXI)/NF(XVI)中列出的那些。通常，不含乳糖组合物包含药学上相容的并且药学上可接受的量的活性成分、粘合剂/填充剂、和润滑剂。示例性不含乳糖剂型包含活性成分、微晶纤维素、预糊化淀粉、和硬脂酸镁。
本发明还提供了药物组合物和剂型，其包含一种或多种降低抗体或抗体偶联物分解速率的辅料。此类辅料在本发明中称为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂，例如抗坏血酸、pH缓冲剂、或盐缓冲剂。
11.1.肠胃外剂型
在某些实施方案，本发明提供了肠胃外剂型。肠胃外剂型可通过各种途径对受试者给药，包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内、瘤内和腹膜内、和动脉内给药。例如，本发明的抗体偶联物可作为推注或通过在一段时间内连续输注经静脉内施用于人，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内或肿瘤内途径施用于人。所述抗体偶联物也适合通过瘤周、病灶内或病灶周途径施用，以发挥局部以及全身治疗作用。由于其给药通常绕过受试者对抗污染物的天然防御，因此肠胃外剂型通常为无菌或可在施用至受试者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于即用注射溶液、可立即溶解或悬浮于药学上可接受的注射用媒剂的干燥产品、即用注射悬浮液、以及乳液。
可被用于提供肠胃外剂型的适当媒剂是本领域技术人员已知的。实例包括但不限于：注射用水USP；磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水性媒剂诸如但不限于氯化钠注射液、林格氏(Ringer’s)注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；水混溶性媒剂诸如但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及非水性媒剂诸如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苄酯。
增加一种或多种本发明所公开的抗体的溶解度的辅料亦可被纳入所述肠胃外剂型中。
11.2.剂量及单位剂量形式
在人的治疗中，医生将根据预防性或治疗性疗法以及根据所需治疗的受试者的年龄、体重、病况及其他特定因素决定他认为最适当的剂量学。
在某些实施方案中，本发明提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本发明提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性抗体。
抗体偶联物或组合物能有效预防或治疗病症或所述病症的一种或多种症状的量将随所述疾病或病况的性质及严重性而异，亦随所述抗体的给药途径而异。所述频率和剂量亦将根据每位受试者的特定因素而异，所述这些因素取决于所施用的特定疗法(例如治疗剂或预防剂)，病症、疾病或病况的严重性，给药途径，以及所述受试者的年龄、身体、体重、反应及既往病史。有效剂量可由体外或动物模型测试系统所衍生的剂量响应曲线外推得到。
在某些实施方案中，组合物的示例性剂量包括每千克受试者或样本体重的毫克或微克量的抗体(例如每千克约10微克至每千克约50毫克、每千克约100微克至每千克约25毫克，或每千克约100微克至每千克约10毫克)。在某些实施方案中，经施用以预防、治疗、处理或改善受试者病症或所述病症的一种或多种症状的本发明提供的抗体偶联物的剂量(以抗体重量计)是0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、或15mg/kg受试者体重或更多。在另一实施方案中，经施用以预防、治疗、处理或改善受试者病症或所述病症的一种或多种症状的组合物或本发明提供的组合物的剂量是0.1mg至200mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至10mg、0.1mg至7.5mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25mg至7.5mg、0.25mg至5mg、0.25mg至2.5mg、0.5mg至20mg、0.5至15mg、0.5至12mg、0.5至10mg、0.5mg至7.5mg、0.5mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至7.5mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。
剂量可根据合适时程进行施用，例如每周一次、二次、三次或四次。某些情况可能必须使用在本发明公开范围以外的抗体偶联物剂量，其对于本领域普通技术人员而言是显而易见。另外，应注意临床医师或主治医师将了解如何以及何时应结合受试者反应予以中断、调整或终止治疗。
不同的治疗有效量可适用于不同疾病和病况，其对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。类似地，足以预防、处理、治疗或改善此类病症，但不足以造成或足以减少与本发明提供的抗体有关的不良反应的量亦涵盖于本发明所述的剂量及剂量频率时程中。另外，当对受试者施用本发明提供的组合物的多重剂量时，并非所有剂量均需相同。举例来说，对受试者施用的剂量可增加至改善所述组合物的预防或治疗效果，或其可降低至减少特定受试者所经历的一种或多种不良反应。
在某些实施方案中，治疗或预防可以本发明提供的抗体偶联物或组合物的一种或多种负荷剂量开始，然后用一种或多种维持剂量维持。
在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物或组合物的剂量可进行施用以使所述抗体在受试者血液或血清中达到稳态浓度。所述稳态浓度可通过技术人员可用的测定技术进行测定，或可根据所述受试者的物理特征如身高、体重和年龄来确定。
在某些实施方案中，可重复施用所述相同的组合物，和所述施用可相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其他实施方案中，可重复施用所述相同的预防剂或治疗剂，和所述施用可相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。
11.3.组合疗法和制剂配方
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与本发明公开的一种或多种化学治疗剂组合的组合物、治疗制剂配方、和治疗方法或用途，以及包含向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。化学治疗剂的实例包括但不限于苯达莫司汀(
Cephalon)、维奈妥拉(Venetoclax)(
Abbvie，Genentech)、地诺单抗(Denosumab)(
Amgen；
Amgen)、卡非佐米(Carfilzomib)(
Amgen)、伊沙佐米(Ixazomib)(
Takeda)、厄洛替尼(
Genentech/OSI Pharm)、硼替佐米(
Millennium Pharm)、氟维司群(
AstraZeneca)、舒尼替尼(SU11248，Pfizer)、来曲唑(
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(
Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(
Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、亚叶酸(Leucovorin)、雷帕霉素(西罗莫司，
Wyeth)、拉帕替尼(
GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(Lonafarnib，SCH 66336)、索拉非尼(BAY43-9006，Bayer Labs)、和吉非替尼(
AstraZeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)，烷化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和
环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类和甲基氨基吖啶类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素类(cryptophycins，特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin，包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和乌拉莫司汀(uracil mustard)；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫斯汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔(enediyne)抗生素类(例如刺孢霉素(calicheamicin)，尤其是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白生色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团类(related chromoprotein enediyne antibiotic chromophores)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素类(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、
(多柔比星)、吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉基-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和去氧多柔比星(deoxydoxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C(mitomycin C)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物类，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、普拉地内酯B(pladienolide B)、喋罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物类，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物类，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素类(anti-adrenals)，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；伊达曲杀(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素类化合物(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素类(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
多糖复合物(polysaccharide complex)(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如
(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、
(不含氢化蓖麻油(Cremophor-free))，紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂(AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)，和
(多西他赛；Rhone-PoulencRorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；
(吉西他滨)；6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物类，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
(长春瑞滨)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；伊达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；卡培他滨
伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；以及上述任何物质的药学上可接受的盐类、酸类和衍生物类。
以治疗性应用而言，本发明抗体偶联物是以药学上可接受的剂型(诸如所属技术领域中已知且如上文所讨论的剂型)向哺乳动物(通常为人)施用。例如，可向人静脉内推注或通过连续输注一段时间、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、或肿瘤内途径施用本发明所述抗体偶联物。亦可将抗体偶联物合适地通过肿瘤周围、病灶内、或病灶周围途径进行施用，以发挥局部以及全身性治疗作用。腹膜内途径可特别适用于例如治疗卵巢肿瘤。
与本发明公开的抗体偶联物组合施用的药物可在施用所述抗体偶联物之前、同时或之后立即施用。在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物按照第一给药方案施用，并且一种或多种第二药剂按照它们自己的给药方案施用。以本发明目的而言，认为此类施用方案是与附加治疗活性组分“组合”的抗体偶联物的施用。实施方案包括其中将本发明抗体偶联物与一种或多种本发明公开的化学治疗剂或免疫调节剂共同配制的药物组合物。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR，也称为TNFRSF18)、可诱导T细胞共刺激(ICOS，也称为CD278)、CD96、脊髓灰质炎病毒受体相关2(PVRL2，也称为CD112R，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为B7-H3和CD274)、程序性细胞死亡配体2(PD-L2，也称为B7-DC和CD273)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，也称为CD223)、B7-H4、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，也称为OX40和CD134)及其配体OX40L(CD252)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO-1)、吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO-2)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA，也称为CD272)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2A受体(A2Ar)和T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA蛋白)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA4、PD-1或PD-L1的抑制剂。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂包含PD-1或PD-L1通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂包含抑制PD-1或PD-L1活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂选自由以下组成的组：CA-170、BMS-8、BMS-202、BMS-936558、CK-301和AUNP12。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂选自由以下组成的组：阿维鲁单抗(avelumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、度伐单抗(durvalumab)、AMP-224(GlaxoSmithKline)、MEDI0680/AMP-514(AstraZeneca)、PDR001(Novartis)、cemiplimab、TSR-042(Tesaro，GlaxoSmithKline)、替雷利珠单抗(Tizlelizumab)/BGB-A317(Beigene)、CK-301(Checkpoint Therapeutics)、BMS-936559(Bristol-Meyers Squibb)、西米普利(cemiplimab)(Regeneron)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、信迪利单抗(sintilimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、genolimzumab、和A167(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical)。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂选自由以下组成的组：MGA012(Incyte/MacroGenics)、PF-06801591(Pfizer/Merck KGaA)、LY3300054(Eli Lilly)、FAZ053(Novartis)、PD-11(Novartis)、CX-072(CytomX)、BGB-A333(Beigene)、BI 754091(Boehringer Ingelheim)、JNJ-63723283(Johnson and Johnson/Jannsen)、AGEN2034(Agenus)、CA-327(Curis)、CX-188(CytomX)、STI–A1110(Servier)、JTX-4014(Jounce)、AM0001(Armo Biosciences，Eli Lilly)、CBT-502(CBT Pharmaceuticals)、FS118(F-Star/Merck KGaA)、XmAb20717(Xencor)、XmAb23104(Xencor)、AB122(Arcus Biosciences)、KY1003(Kymab)、RXI-762(RXi)。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂选自由以下组成的组：PRS-332(Pieris Pharmaceuticals)、ALPN-202(Alpine ImmuneScience)、TSR-075(Tesaro/Anaptys Bio)、MCLA-145(Merus)、MGD013(Macrogenics)、MGD019(Macrogenics)、RO7121661(Hoffman-La Roche)、LY3415244(Eli Lilly)。在一些实施方案中，所述一种或多种PD-1或PD-L1抑制剂选自例如在WO 2016/077397、WO 2018/156777和于2018年5月23日提交的国际申请号PCT/US2013/034213中描述的抗PD1单特异性或双特异性抗体。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种LAG3抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种LAG3抑制剂包含LAG3通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种LAG3抑制剂包含抑制LAG3活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种LAG3抑制剂独立地选自由以下组成的组：IMP321(Eftilagimod alpha，Immutep)、relatilimab(Brisol-Myers Squibb)、LAG525(Novartis)MK4280(Merck)、BI 754111(Boehringer Ingelheim)、REGN3767(Regeneron/Sanofi)、Sym022(Symphogen)和TSR-033(Tesaro/GSK)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种TIM3抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种TIM3抑制剂包含TIM3通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种TIM3抑制剂包含抑制TIM3活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种TIM3抑制剂独立地选自由以下组成的组：TSR-022(Tesaro)、LY3321367(Eli Lilly)、Sym023(Symphogen)和MBG453(Novartis)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种TIGIT抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种TIGIT抑制剂包含TIGIT通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种TIGIT抑制剂包含抑制TIGIT活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种TIGIT抑制剂独立地选自由以下组成的组：BMS-986207(BMS)、tiragolumab(RG6058，Genentech)、ASP-8374(Potenza Therapeutics)、etigilimab、AB-154(Arcus)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种T细胞活化V结构域Ig抑制因子(VISTA)的抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种VISTA抑制剂包含VISTA通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种VISTA抑制剂包含抑制VISTA活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种VISTA抑制剂独立地选自由以下组成的组：PMC-309(PharmaAbcine Inc)、HMBD-002(HummingbirdBioscience Pte Ltd)、JNJ-61610588(Janssen)、CA-170(Aurigene DiscoveryTechnologies Ltd)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种CSF1R抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种CSF1R抑制剂包含CSF1R通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种CSF1R抑制剂包含抑制CSF1R活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种CSF1R抑制剂独立地选自由以下组成的组：AMG 820(Amgen)、Emactuzumab(Roche)、IMC-CS4(LY3022855)(Eli Lilly)、MCS110(Novartis)、cabiralizumab(FPA008)(Five Prime Therapeutics)、JNJ-40346527(Johnson and Johnson)、BLZ945(Novartis)、ARRY-382(Array Biopharma)、PLX7486(Plexxicon)和Pexidartinib(Plexxicon)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种CD73抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种CD73抑制剂包含CD73通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种CD73抑制剂包含抑制CD73活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种CD73抑制剂独立地选自由以下组成的组：MEDI9447(Medimmune)、IPH-5301(Innate Pharma)、AB680(Arcus)、和BMS-986179(Bristol-Myers Squibb)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种CD39抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种CD39抑制剂包含CD39通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种CD39抑制剂包含抑制CD39活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种CD39抑制剂独立地选自由以下组成的组：CPI-444(Corvus)、PBF-509(Pablobio，Novartis)、MK-3814(Merck)、和AZD4635(AstraZeneca)、TTX-030(Tizona Therapeutics)、IPH-5201(Innate Pharma)、SRF-617(SurfaceOncology)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种A2a受体(A2aR)抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种A2aR抑制剂包含A2aR信号通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种A2aR抑制剂包含抑制A2a受体活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种A2aR抑制剂独立地选自由以下组成的组：CPI-444(Corvus)、PBF-509(Pablobio，Novartis)、MK-3814(Merck)、和AZD4635(AstraZeneca)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种TGF-β抑制剂包含TGF-β信号通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种TGF-β抑制剂包含抑制TGF-β受体活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种TGF-β抑制剂独立地选自由以下组成的组：AVID200(Formation Biologics)、LY3200882(Eli Lilly)、M7824(Merck KGaA)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种B7-H4抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种B7-H4抑制剂包含B7-H4通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种B7-H4抑制剂包含抑制B7-H4活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种B7-H4抑制剂独立地选自由FPA-150(FivePrime Therapeutics)组成的组。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种KIR抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种KIR抑制剂包含KIR通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种KIR抑制剂包含抑制KIR活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种KIR抑制剂独立地选自由以下组成的组：Lirilumab(IPH-2102，BMS-986015)(Bristol Myers Squibb)、TRL-8605(Trellis Bioscience Inc)、IPH-41(IPH 4101)(Innate Pharma S.A.)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，也称为OX40和CD134)及其配体OXO40L(CD252)的抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种TNFRSF4/OX40或OX40L的抑制剂包含TNFRSF4/OX40通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种TNFRSF4/OX40或OX40L的抑制剂包含抑制TNFRSF4/OX40活性的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂降低TNFRSF4/OX40和OX40L之间的相互作用。在一些实施方案中，所述一种或多种TNFRSF4/OX40或OX40L的抑制剂独立地选自由以下组成的组：INCAGN-1949(Incyte Corp)、GSK-3174998(Glaxo Smith Kline)、PF-04518600(PF-8600)(Pfizer Inc)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)通路的抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是IDO-1抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是IDO-2抑制剂。在一些实施方案中，所述一种或多种IDO通路抑制剂包含IDO通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种IDO通路抑制剂包含抑制IDO-1或IDO-2的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种IDO-1或IDO-2抑制剂独立地选自由以下组成的组：LY-3381916(EliLilly)、BMS-986205(Bristol-Myers Squibb)、KHK2455(Kyowa Kirin PharmaceuticalDevelopment,Inc.)、Indoximod(NewLink Genetics)、Epacadostat(INCB24360)(IncyteCorp)、GDC-0919(navoximod)(NewLink Genetics)。
在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是IDO-2抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是针对IDO-2的抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是针对IDO-2的单克隆抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是针对IDO-2的人或人源化抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂降低一种或多种免疫检查点蛋白例如IDO-2的表达或活性。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种CEACAM1抑制剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种CEACAM1抑制剂包含CEACAM1通路的小分子阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种CEACAM1抑制剂包含抑制CEACAM1的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种CEACAM1抑制剂独立地选自由以下组成的组：PB-04123(Pangaea Oncology S.A)、CM-24(MK-6018)(Merck Sharpe Dohme)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR，也称为TNFRSF18)的激活剂/激动剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种GITR激动剂包含GITR通路的小分子激动剂。在一些实施方案中，所述一种或多种GITR激动剂包含激活GITR活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种GITR激动剂包含激活GITR活性的重组蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种GITR激动剂独立地选自由以下组成的组：BMS-986156(Bristol Myers Squibb)、TRX-518(Leap Therapeutics)、INCAGN-1876(Incyte Corp)、MK-1248(Merck and Co Inc)、MK-4166(Merck and co)、GWN-323(Novartis)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种可诱导T-细胞共刺激(ICOS，也称为CD278)的激活剂/激动剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种ICOS激动剂包含ICOS通路的小分子激动剂。在一些实施方案中，所述一种或多种ICOS激动剂包含激活ICOS活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种ICOS激动剂包含激活ICOS活性的重组蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种ICOS激动剂独立地选自由以下组成的组：Vopratelimab(JTX-2011)(Jounce Therapeutics)、GSK-3359609(GSK)、BMS-986226(BMS)、KY-1044(Kymab Ltd)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种肿瘤坏死因子受体超家族成员5(CD40)的激活剂/激动剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种CD40激动剂包含CD40通路的小分子激动剂。在一些实施方案中，所述一种或多种CD40激动剂包含激活CD40活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种CD40激动剂包含激活CD40活性的重组蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种CD40激动剂独立地选自由以下组成的组：APX005M(Apexigen)、CP-870,893(Pfizer)、ABBV-927(Abbvie)SEA-CD40(Seattle Genetics)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种STING(干扰素基因刺激剂)通路的激活剂/激动剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种STING激动剂包含STING通路的小分子激动剂。在一些实施方案中，所述一种或多种STING激动剂包含激活STING活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种STING激动剂包含激活STING活性的重组蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种STING激动剂独立地选自由以下组成的组：MK-1454(Merck)、ADU-S100(Aduro)、和SB11285(SpringbankPharmaceuticals)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明提供的任何抗体偶联物与一种或多种RIG-I信号的激活剂/激动剂组合的组合物、治疗制剂配方和治疗方法或用途，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。在一些实施方案中，所述一种或多种RIG-I激动剂包含RIG-I通路的小分子激动剂。在一些实施方案中，所述一种或多种RIG-I激动剂包含激活RIG-I活性的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种RIG-I激动剂包含激活RIG-I活性的重组蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种RIG-I激动剂独立地选自由以下组成的组：RGT100(MK4621，Merck)、和KIN1148(Kineta Inc)。
在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物与
(硼替佐米(bortezomib))、
(卡非佐米(Carfilzomib))、
(伊沙佐米(Ixazomib))组合施用。在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物与
(帕比司他(panobinostat))组合施用。在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物与
(达雷木单抗(daratumumab))组合施用。在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物与
(埃罗妥珠单抗(elotuzumab))组合施用。在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物与
(帕米磷酸盐(pamidronate))或
(唑来膦酸(zolendronic acid))组合施用。在某些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物与
(地诺单抗(denosumab))或
(地诺单抗(denosumab))组合施用。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体偶联物与放射疗法和/或光动力疗法(PDT)联合施用。
12.治疗性应用
以治疗性应用而言，本发明抗体偶联物是以药学上可接受的剂型(诸如所属技术领域中已知且如上文所讨论的剂型)向哺乳动物(通常为人)施用。例如，可向人静脉内推注或通过连续输注一段时间、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、或肿瘤内途径施用本发明所述抗体偶联物。亦可将抗体偶联物合适地通过肿瘤周围、病灶内、或病灶周围途径进行施用，以发挥局部以及全身性治疗作用。腹膜内途径可特别适用于例如治疗卵巢肿瘤。
本发明提供的抗体偶联物可用于治疗本发明所述的任何疾病或病症(例如，炎性和/或增殖性疾病或病症)。在一些实施方案，所述疾病或病症是可通过抗原的过表达来诊断的疾病或病症。在一些实施方案，所述疾病或病症是可得益于抗体治疗的疾病或病症。在一些实施方案，所述疾病或病症是癌症。
任何合适癌症可用本发明提供的抗体偶联物进行治疗。例示性合适癌症包括例如：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、不明原因原发灶癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、纤维性组织细胞瘤、尤文氏(Ewing)肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、肾癌、兰格罕氏(Langerhans)细胞组织细胞增生症、喉癌、唇及口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维性组织细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔氏(Merkel)细胞癌、间皮瘤、原发灶不明的转移性颈部鳞状细胞癌、涉及NUT基因的中线道癌、口癌、多发性内分泌瘤症候群、多发性骨髓瘤、蕈状肉芽肿、骨髓发育不良症候群、骨髓发育不良/骨髓增生性肿瘤、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、副甲状腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂及输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样肿瘤、唾液腺癌、赛扎里氏(Sezary)症候群、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎样肿瘤、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌，和威尔姆氏(Wilms)肿瘤。
在一些实施方案，用本发明提供的抗体偶联物治疗的疾病是胃癌、结直肠癌、肾细胞癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、间皮瘤、和/或起源于上皮的癌症。在特定实施方案，所述疾病是结直肠癌。在一些实施方案，所述疾病是卵巢癌。在一些实施方案，所述疾病是乳腺癌。在一些实施方案，所述疾病是肺癌。在一些实施方案，所述疾病是头颈癌。在一些实施方案，所述疾病是肾细胞癌。在一些实施方案，所述疾病是脑癌。在一些实施方案，所述疾病是子宫内膜癌。在特定实施方案中，所述疾病是非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、肾癌和乳腺癌、皮肤癌和/或宫颈上皮内瘤变。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，包括施用有效剂量的本发明提供的抗体偶联物或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的本发明所述的对治疗癌症有效的抗体偶联物与对治疗或预防感染有效的第二药剂组合的步骤。在某些实施方案中，所述抗体偶联物呈药物组合物或剂型的形式，如本发明别处所述。
在某些实施方案中，所述受试者是未接受治疗的受试者。在进一步的实施方案中，所述受试者之前已经接受过癌症治疗。例如，在某些实施方案中，所述受试者对单一药剂治疗方案没有应答。
在某些实施方案中，所述受试者是由于与治疗相关的一个或多个不良事件而停止一些其他治疗的受试者。
在某些实施方案中，所述受试者已经接受一些其他抗癌疗法并且在施用本发明提供的方法之前停止该疗法。在进一步的实施方案中，所述受试者已经接受治疗且继续接受该治疗并同时施用本发明提供的抗体偶联物。根据本领域技术人员的判断，本发明所述的抗体偶联物可以与用于治疗癌症的其他疗法共同施用。在某些实施方案中，本发明提供的方法或组合物可以与降低剂量的其他治疗癌症的疗法共同施用。
在某些实施方案中，本发明提供了对一些其他抗癌剂治疗难治性的受试者的治疗方法。在一些实施方案中，所述受试者可以是对一些其他抗癌治疗应答不佳的受试者。
16.诊断性应用
在一些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物是用于诊断性应用。这些测定可用于例如对疾病例如癌症进行诊断和/或预后。
在一些诊断性和预后性应用中，抗体偶联物可经可检测基团部分进行标记。合适的可检测基团部分包括但不限于放射性同位素、荧光标记、以及酶-底物标记。在另一实施方案中，抗体偶联物不需要进行标记，且所述抗体偶联物的存在可使用与抗体偶联物特异性结合的经标记的抗体进行检测。
13.亲和性纯化试剂
本发明提供的抗体偶联物可用来作为亲和性纯化试剂。在此过程中，可使用所属技术领域中广知的方法，将抗体偶联物固定在固相诸如树脂或滤纸上。使经固定的抗体偶联物与含有待纯化的抗原(或其片段)的样本接触，之后将支持物用合适溶剂洗涤，此举将基本上移除样本中除了目的蛋白质(其与经固定的抗体结合)以外的所有物质。最终，将支持物用另一合适溶剂诸如甘氨酸缓冲液(pH 5.0)洗涤，此举将自抗体释放蛋白质。
14.试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供的抗体偶联物是以试剂盒形式提供，即提供预定量的试剂的包装组合附带执行程序的使用说明。在一些实施方案中，所述程序是诊断性测定。在其他实施方案中，所述程序是治疗性程序。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于重构抗体偶联物的溶剂。在一些实施方案中，所述抗体偶联物是以药物组合物形式提供。
在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本发明提供的抗体偶联物或组合物、任选的第二药剂或组合物、以及向医疗服务人员提供关于治疗病症的用法的信息的说明。说明可以印刷形式或电子介质(例如软盘、CD、或DVD)的形式提供，或者以可获得此类说明的网站地址的形式提供。本发明提供的抗体偶联物或组合物或第二药剂或组合物的单位剂量可包括这样的剂量，即当施用于受试者时，所述化合物或组合物的治疗或预防有效血浆水平可在受试者中维持至少1天。在一些实施方案中，化合物或组合物可作为无菌水性药物组合物或干粉(例如冻干)组合物被包括在内。
在一些实施方式中，本发明提供了合适的包装。如本发明所用，“包装”包括通常用于系统中的固体基质或材料，并能够在固定限度内容纳本发明提供的化合物和/或适用于受试者的第二试剂。这些材料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料和塑料箔层压封套等。如果使用电子束杀菌技术，包装应具有足够低的密度，以允许对内容物进行杀菌。
实施例
本发明使用的，用于所述这些工艺、方案和实施例的所述符号和惯例，无论特定缩写是否进行具体定义，均与当代科学文献，譬如，美国化学会杂志或生物化学杂志中使用的那些一致。具体而言，但不限于，以下缩写可用于实施例和整个说明书中：aq(水的)；atm(大气)；DIBAL(二异丁基氢化铝)；DIPEA(二异丙基乙胺)；g(克)；mg(毫克)；mL(毫升)；μL(微升)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；mmol(毫摩尔)；h、hr或hrs(小时)；min(分钟)；MTBE(甲基叔丁基醚)；MS(质谱)；eq(当量)；NMP(N-甲基吡啶)；ESI(电喷雾电离)；RB(圆底)；rt(室温)；HPLC(高压液相色谱)；LAH(氢化铝锂)；LCMS(液相色谱-质谱)；THF(四氢呋喃)；AcOH(醋酸)；DBCO(二苯并环辛炔胺)；DCM(二氯甲烷)；DMF(二甲基甲酰胺)；Boc(叔丁氧羰基)；DMSO(二甲亚砜)；DMSO-d6(氘代二甲基亚砜)；EtOAc(乙酸乙酯)；MeOH(甲醇)；和BOC(叔丁氧羰基)。
对于所有下述实施例，可利用本领域技术人员已知的标准检测和纯化方法。除非另有说明，所有温度均以℃(摄氏度)表示。所有反应均在室温下进行，除非另有说明。在此说明的合成方法旨在通过使用具体实施例来举例说明可应用的化学，而不是本发明公开内容的范围的表示。如本发明所用，FOLR1也称为FolRa、或FolRα。
化合物的制备
实施例1
化合物2、3、4、5和6的合成
合成方案2显示了化合物2、3、4、5和6的合成
合成方案2
4-((2-氨基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.3)的制备：
烘干的250mL圆底烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺(可商购)(1.1)(5.5g，33mmol)、4-(溴甲基)-3-甲氧基-苯甲酸甲酯(1.2)(8.45g，32.6mmol)、无水DMF(35mL)、碳酸铯(10.63g，32.63mmol)。混合物用氩气冲洗，然后在室温下在N2气氛下搅拌过夜。LCMS显示反应完成；将反应混合物缓慢倒入500mL H2O中，形成固体；过滤除去固体；粗品经在MTBE中研磨、过滤、真空干燥以得到化合物4-[(2-氨基-4-氯-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基]-3-甲氧基-苯甲酸甲酯(1.3)(11.3g，32.6mmol，99％产率)。LCMS(ESI)m/z 347(M+H)。
(4-((2-氨基-4-氯-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇1.4a的合成：
烘干的250mL圆底烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入4-[(2-氨基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)]-3-甲氧基-苯甲酸甲酯(1.3)(5.1g，15mmol)、无水THF(30mL)。将浆液冷却至0℃，分批加入LAH(0.56g，15mmol)。移除冰浴，反应物在室温下在N2气氛下搅拌4小时。LCMS显示反应完成。将反应体系冷却回0℃，滴加饱和Na2SO4水溶液。过滤固体，并用THF洗涤。浓缩滤液，真空干燥。LCMS(ESI)m/z 319.1(M+H)。
4-氯-5-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺1.5a的合成：
烘干的250mL烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入[4-[(2-氨基-4-氯-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基]-3-甲氧基苯基]甲醇1.4a(3g，9mmol)和DCM(25mL)。将浆液冷却至0℃，滴加亚硫酰氯(6.87mL，94.1mmol)。将反应体系升至室温(反应体系变成澄清溶液)并搅拌3小时。LCMS显示反应完成。将反应体系冷却至0℃，小心地加入1N NaOH淬灭反应。分离DCM层，用NaHCO3水溶液、盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将溶液浓缩以得到4-氯-5-[[4-(氯甲基)-2-甲氧基-苯基]甲基]吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺(1.5a)(3g，9mmol，95％产率)。LCMS(ESI)337.05(M+H)。
(1-(4-((2-氨基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)氮杂环丁烷-3-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯1.6a的合成：
烘干的25mL小瓶配有磁力搅拌棒，向其中加入4-氯-5-[[4-(氯甲基)-2-甲氧基-苯基]甲基]吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺(1.5a)(460mg，1.36mmol)、N-(氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(234.94mg，1.36mmol)、DMF(5.3667mL)和DIPEA(0.29mL，1.6mmol)。澄清溶液在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应完成。粗品经反相HPLC纯化以得到化合物1.6a。LCMS(ESI)m/z 487.3(M+H)。
(1-(4-((2-氨基-4-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)氮杂环丁烷-3-基)(甲基)氨基甲酸叔丁基1.7a的合成：
烘干的20mL小瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入N-[1-[[4-[(2-氨基-4-氯-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯1.6a(100mg，0.21mmol)、(5-甲基异噁唑-3-基)甲胺(7.04mL，0.31mmol)、NMP(2mL)和DIPEA(0.05mL，0.27mmol)。混合物用氩气冲洗，将反应体系加热至40℃并在N2气氛下在40℃下搅拌5小时。LCMS显示反应完成。反应溶液浓缩，并经反相HPLC纯化得到(1-(4-((2-氨基-4-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)氮杂环丁烷-3-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯。LCMS(ESI)m/z 563.3(M+H)。
5-(2-甲氧基-4-((3-(甲基氨基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)苄基)-N4-((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物6)的合成：
烘干的20mL小瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入N-[1-[[4-[[2-氨基-4-[(5-甲基异噁唑-3-基)甲基氨基]吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯(30mg，0.05mmol)、和DCM(1mL)。混合物冷却至0℃，加入4M HCl二氧六环溶液(0.05mL，0.21mmol)。反应体系在室温下搅拌2小时，之后LCMS显示反应完成。反应液浓缩，经制备HPLC纯化(方法：10％的CAN水溶液至90％的ACN水溶液，20分钟)，收集纯级分并冻干以得到化合物6。LCMS(ESI)m/z 463.5(M+H)。
化合物2、3、4和5通过使用上述和本发明所述的方法、使用合适的胺R5-NH2合成。
例如，化合物2的制备过程如下：
化合物1.6的合成如以下实施例2中所提供。
(1-(4-((2-氨基-4-(戊基氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)氮杂环丁烷-3-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(1.7b)
向配备有磁力搅拌棒的烘干的250mL RB烧瓶中加入5-[[4-(氯甲基)-2-甲氧基-苯基]甲基]-N4-戊基-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(100mg，0.26mmol)(化合物1.6)、N-(氮杂环丁烷-3-基)-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(可商购，60mg)、和DMF(2mL)。向澄清溶液中加入DIPEA(0.05mL)。反应体系在室温下搅拌5小时。LCMS显示反应完成后，粗品经反相HPLC纯化，得到化合物1.7b。LCMS(ESI)m/z 538.8(M+H)。
烘干的20mL小瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入N-[1-[[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯1.7b(70mg，0.13mmol)、和DCM(2mL)。将澄清溶液冷却至0℃，加入4M HCl二氧六环溶液(0.17mL，0.67mmol)，反应体系在室温下搅拌2-3小时。LCMS显示反应完成后，反应液浓缩，并经制备HPLC纯化(方法：10％的ACN水溶液至90％的ACN水溶液，20分钟)，收集纯级分，冻干得到化合物2。LCMS(ESI)m/z 438.8(M+H)。
实施例2
5-(4-((5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物10)的制备：
化合物10根据以下合成方案3制备。
合成方案3
4-((2-氨基-4-(戊基氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.4b)的制备：
烘干的250mL圆底烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入4-[(2-氨基-4-氯-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基]-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.3)(7g，20mmol)、无水NMP(20mL)、戊-1-胺(7.04mL，60.5mmol)和DIPEA(2eq)。将反应体系加热至50℃在N2气氛下在该温度下搅拌2天。LCMS显示了所需的产物峰。除去溶剂，浓缩至干，粗品经ISCO纯化(DCM至10％MeOH/DCM)以得到4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.4b)(6.5g，16mmol，82％产率)。LCMS(ESI)m/z398.2(M+H)。1HNMR(DMSO-d6):δ7.53(d,1H),7.51(d,1H),7.48(dd,1H),7.40(br s,2H),7.34(t,1H),6.45(d,1H),6.27(d,1H),5.67(s,2H),3.92(s,3H),3.83(s,3H),3.40(q,2H),1.41-1.32(m,2H),1.17-1.07(m,2H),0.97-0.87(m,2H),0.73(t,3H)。
(4-((2-氨基-4-(戊基氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(1.5)的制备：
烘干的250mL圆底烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯甲酸甲酯(1.4)(3.5g，8.8mmol)、和THF(40mL)。将混合物冷却至0℃，然后在氩气气氛下滴加DIBAL(35.22mL，1M的THF溶液，35.22mmol)。将反应体系缓慢升至室温并搅拌2小时，然后将反应体系冷却至0℃，用饱和Na2SO4水溶液淬灭反应，直至形成细的白色固体。加入过量固体Na2SO4，反应混合物用硅藻土过滤，用DCM/MeOH和几毫升DMF洗涤。减压浓缩滤液，得到化合物1.5(60％产率)。LCMS(ESI)m/z 370.2(M+H)。
5-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(1.6)的制备
烘干的250mL圆底烧瓶装有磁力搅拌棒，向其中加入[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲醇(1.5)(1.7g，4.6mmol)和无水氯仿(15mL)。将混合物冷却至0℃，然后在氩气气氛下滴加亚硫酰氯(2mL，28mmol)。反应体系缓慢升温至室温并搅拌2小时。之后，LCMS显示反应完成。浓缩溶液以除去DCM和SOCl2，并冷却至0℃，然后小心加入饱和NaHCO3溶液淬灭反应。溶液用DCM萃取。有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤除去固体，浓缩，真空干燥，得到化合物1.6。LCMS(ESI)m/z 388.1(M+H)。
Boc二胺支架与化合物1.6偶联以制备Boc保护的化合物的一般过程：
烘干的25mL圆底烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入5-[[4-(氯甲基)-2-甲氧基-苯基]甲基]-N4-戊基-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(1.6)(100mg，0.26mmol)、和Boc保护的二胺支架(1eq)和无水DMF(2mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(3eq)。反应体系在室温下在N2气氛下搅拌5小时。LCMS显示反应完成后，粗品经反相HPLC纯化以得到Boc保护的支架。
脱保护以得到5-(4-((5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物10)
烘干的250mL圆底烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入5-[[4-(氯甲基)-2-甲氧基-苯基]甲基]-N4-戊基-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(100mg，0.26mmol)(化合物1.6)、5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯盐酸盐(可商购，102.38mg)和DMF(2mL)。向澄清溶液中加入DIPEA(0.05mL)。反应体系在室温下搅拌5小时。LCMS显示反应完成后，粗品经反相HPLC纯化以得到化合物1.7。LCMS(ESI)m/z 580.7(M+H)。
烘干的20mL小瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入2-[[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]-5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯(1.7)(70mg，0.12mmol)、和DCM(0.94mL)。将澄清溶液冷却至0℃，然后加入4M HCl二氧六环溶液(0.15mL，0.60mmol)。反应体系在室温下搅拌2小时。LCMS显示反应完成后，将反应混合物浓缩，经制备HPLC纯化(方法：10％ACN水溶液至90％ACN水溶液，20分钟)，收集纯级分，冻干以获得化合物10。LCMS(ESI)m/z 480.3(M+H)。
实施例3
5-(4-((3-氨基氮杂环丁烷-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物13)的合成
N-[1-[[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(1.8)的合成
烘干的250mL圆底烧瓶装有磁力搅拌棒，向其中加入5-[[4-(氯甲基)-2-甲氧基-苯基]甲基]-N4-戊基-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(100mg，0.26mmol)(化合物1.6)、N-(氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(可商购，60mg)、和DMF(2mL)。向澄清溶液中加入DIPEA(0.05mL)，反应体系在室温下搅拌5小时。LCMS显示反应完成后，粗品经反相HPLC纯化以得到化合物1.8。LCMS(ESI)m/z 524.7(M+H)。
烘干的20mL小瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入N-[1-[[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(1.8)(70mg，0.13mmol)、DCM(2mL)。将澄清溶液冷却至0℃并加入4M HCl二氧六环溶液(0.17mL，0.67mmol)。反应体系在室温下搅拌2-3小时。LCMS显示反应完成后，反应液浓缩，并经制备HPLC纯化(方法：10％ACN水溶液至90％ACN水溶液，20分钟)，收集纯级分，冻干以得到化合物13。LCMS(ESI)m/z 424.3(M+H)。
实施例4
连接体有效负载-化合物10的合成
合成方案4显示了连接体有效负载-化合物10的合成
合成方案4
[4-[[rac-(2S)-2-[[rac-(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基2-[[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]-5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-羧酸酯(2.2)的合成
烘干的100mL烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入5-[[2-甲氧基-4-(5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基甲基)苯基]甲基]-N4-戊基-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物10)(180mg，0.38mmol)、(4-硝基苯基)[4-[[rac-(2S)-2-[[rac-(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基羧酸酯(2.1)(345.33mg，0.45mmol)、和DMF(2mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(0.2mL，1mmol)，反应体系在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应完成。除去溶剂，浓缩至干，残留物经快速色谱纯化以得到化合物2.2。LC-MS(ESI)m/z+H 1108.3。
烘干的100mL烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入[4-[[rac-(2S)-2-[[rac-(2S)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基2-[[4-[[2-氨基-4-(戊基氨基)吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基]甲基]-3-甲氧基-苯基]甲基]-5-氧杂-2,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-羧酸酯(2.2)(200mg，0.18mmol)溶于DMF(2mL)的溶液，然后加入哌啶(5eq)。澄清溶液在室温下搅拌30分钟，LCMS显示脱除Fmoc保护基，化合物2.2a的粗品经制备HPLC纯化。
烘干的100mL烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入化合物(2.2a)(150mg，0.17mmol)、DBCO-PEG4-NHS酯(122mg，0.19mmol)、和DMF(2mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(60μL，0.34mmol)。反应体系在室温下在N2气氛下搅拌2小时。LCMS显示反应完成后，粗品经制备HPLC纯化(方法：10％ACN至90％ACN，20分钟)，收集纯级分，冻干以得到连接体有效负载-化合物10。HPLC MS数据显示所需的产物纯度为98％。LC-MS(ESI)m/z+H1420.8。
连接体有效负载的制备
实施例5
连接体有效负载-化合物2的合成
合成方案5显示了连接体有效负载-化合物2的合成
合成方案5
连接体有效负载化合物2的合成：
烘干的100mL烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入5-(2-甲氧基-4-((3-(甲基氨基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)苄基)-N4–戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物2)(200mg，0.45mmol)、(4-硝基苯基)[4-[[rac-(2S)-2-[[rac-(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基羧酸酯(2.1)(385mg，0.50mmol)、和DMF(2mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(0.2mL，1mmol)，反应体系在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应完成。除去溶剂，浓缩至干，残余物经快速色谱纯化，得到化合物2.3。LC-MS(ESI)m/z+H 1065.8。
化合物2.3(200mg，0.18mmol)溶于DMF(2mL)，加入哌啶(5eq)，澄清溶液在室温下搅拌30分钟，LCMS显示脱除Fmoc保护基，化合物2.3a的粗品经制备HPLC纯化。
烘干的100mL烧瓶配备磁力搅拌棒，向其中加入上述制备的化合物(2.3a)(150mg，0.17mmol)、DBCO-PEG4-NHS酯(138mg，0.21mmol)、和DMF(2mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(0.05mL，0.31mmol)。反应体系在室温下在N2气氛下搅拌2小时。LCMS显示反应完成后，粗品经制备HPLC纯化(方法：10％ACN至90％ACN，20分钟)，收集纯级分，冻干以得到连接体有效负载化合物2。HPLC MS数据显示所需产物的纯度为98％。LC-MS(ESI)m/z+H1377.9。
实施例6
连接体有效负载-化合物13的合成
合成方案6显示了连接体有效负载-化合物13的合成
合成方案6
连接体有效负载化合物13的合成：
烘干的100mL烧瓶配备有磁力搅拌棒，向其中加入5-(4-((3-氨基氮杂环丁烷-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物13)(250mg，0.59mmol)、(4-硝基苯基)[4-[[rac-(2S)-2-[[rac-(2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基羧酸酯(2.1)(497mg，0.64mmol)和DMF(10mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(0.2mL，1mmol)，反应体系在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应完成。除去溶剂，浓缩至干，残余物经快速色谱纯化，得到化合物2.4。LC-MS(ESI)m/z+H 1051.8。
化合物2.4(250mg，0.23mmol)溶于DMF(5mL)，加入哌啶(5eq)。澄清溶液在室温下搅拌30分钟。LCMS显示脱除Fmoc保护基，化合物2.4a的粗品经制备HPLC纯化。
烘干的100mL烧瓶配备磁力搅拌棒，向其中加入上述制备的化合物(2.4a)(200mg，0.24mmol)、DBCO-PEG4-NHS酯(188mg，0.29mmol)、和DMF(5mL)。澄清溶液用氩气冲洗，然后加入DIPEA(60μL，0.31mmol)。反应体系在室温下在N2气氛下搅拌2小时。LCMS显示反应完成后，粗品经制备HPLC纯化(方法：10％ACN至90％ACN，20分钟)，收集纯级分，冻干，得到连接体有效负载化合物13。HPLC MS数据显示所需产物的纯度为98％。LC-MS(ESI)m/z+H1363.9。
实施例7
如上所示的连接体有效负载-化合物10使用与上述实施例4中描述的类似的方法制备。
Nα-Fmoc-L-2,3-二氨基丙酸、非天然氨基酸(Dap-OH)，购自Sigma Aldrich(cat#47552-1G-F)。m-PEG8-NHS购自Broadpharm(cat#BP-21103)。
化合物的生物活性
实施例8
在本实施例中，用人TLR7(或人TLR8或小鼠TLR7)和诱导型SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因转染的HEK293报告细胞评价化合物激活人TLR7(或人TLR8或小鼠TLR7)通路的体外活性。SEAP报告基因置于IFN-β最小启动子的控制之下，该启动子与五个NF-κB和AP-1结合位点融合。用TLR7激动剂刺激会激活NF-κB和AP-1，从而诱导SEAP的产生。SEAP的水平通过HEK蓝检测(HEK-Blue Detection)培养基测定。
如下评价化合物对TLR7(人和小鼠)和TLR8(仅人)报道细胞系的体外活性。5-(2-甲氧基-4-(哌嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(化合物1)是用于比较的化合物，其具有如下所示结构：
HEK293-人TLR7(hTLR7)、HEK293-小鼠TLR7(mTLR7)和HEK293-人TLR8(hTLR8)报告细胞系均购自Invivogen，所述细胞系均保留在制造商推荐的含有所需的补充抗生素的培养基中。在测定当天，用Accutase收集细胞，用Vi-CELL细胞活力分析仪进行计数。将细胞重悬于HEK蓝检测培养基中，将总共10,000个细胞接种在384孔平底板的每个孔中。将测试化合物的系列稀释液(从5μM开始的1:4系列稀释液)添加至处理孔中，将测定板在37℃下在CO2孵化器中培养24小时。然后通过分光光度法在640nm处读取板。使用对数log(抑制剂)对响应-变量的斜率，对数据进行非线性回归分析，使用GraphPad Prism进行3参数拟合。结果在表1中报告为EC50(曲线的中点，或观察到50％的最大效果时的浓度)。表1中的数据显示本发明所述的某些化合物是有效的TLR7激动剂并且对TLR8具有选择性。
表1
NA＝无活性
NC＝有活性，但由于稀释曲线不完整，EC50无法计算
实施例9
化合物10的体外细胞毒性
在KB细胞的细胞增殖试验中测试了化合物10的细胞毒性。KB细胞获自ATCC，并在补充有10％热灭活胎牛血清(Corning)、1％青霉素/链霉素(Corning)和2mmol/L-glutamax(Thermo Fisher Scientific)的Ham’s F-12：高葡萄糖DMEM(50:50)(Corning)中保持。在测定前一天，用Acutase收集KB细胞，将总共625个细胞接种在384孔平底白色聚苯乙烯板的每个孔中。化合物10以2倍的起始浓度配制在细胞培养基中。将化合物10的连续稀释液(从1000nM开始的1:4系列稀释液)添加至处理孔中。将测定板在37℃下在CO2孵化器中培养120小时。为了进行细胞活力测定，将30μL
试剂(Promega Corp.)添加至每个孔中，并按照产品说明书来处理孔板。在
酶标仪(Perkin-Elmer)上测定相对发光。使用未经处理的细胞作为对照，将相对发光读数转换为活力百分比。
化合物10即使在高达1μM的浓度下也没有显示出对KB细胞的任何细胞毒性。
实施例10
化合物10对其他TLR的刺激活性
在本实施例中，在用诱导型SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因转染的、并表达不同的人TLR(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9)或小鼠TLR(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9)的HEK293细胞上研究了化合物10刺激不同的人和小鼠TLR通路的活性。
HEK293报告细胞系购自Invivogen，细胞系保留在制造商推荐的具有所需补充抗生素的培养基中。在测定当天，用Accutase收集细胞，用Vi-CELL细胞活力分析仪进行计数。将细胞重悬于HEK蓝检测培养基中，将总共10000个细胞接种在384孔平底板的每个孔中。将连续稀释的化合物10和化合物1添加至处理孔中。将测定板在37℃下在CO2孵化器中培养16小时。HEK-BlueTM检测培养基在分泌型SEAP存在时变为紫色/蓝色，可使用分光光度法在620-655nm下检测。使用对数log(抑制剂)对响应-变量的斜率，对数据进行非线性回归分析，使用GraphPad Prism进行3参数拟合。
化合物10对人和小鼠TLR7非常特异，仅观察到对人TLR8的轻微活性。未观察到对其他人或小鼠TLR的活性。结果在表2中报告为EC50(曲线的中点，或观察到50％的最大效果时的浓度)。
表2：HEK293报告基因检测EC50总结
NA＝无活性
NC＝有活性，但由于稀释曲线不完整，EC50无法计算
实施例11
化合物10诱导的免疫细胞活化
本实施例评估了化合物10在人PBMC(外周血单核细胞)、食蟹猴(cyno)PBMC和小鼠脾细胞中刺激不同免疫细胞群(单核细胞、B细胞、和DC)活化的能力。
根据制造商的建议，使用Leukosep管和Nycoprep 1.077缓冲液从来自两个健康人供体和两个食蟹猴供体的新鲜采集的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过浸渍和70μm细胞过滤器过滤，从C57/BL6小鼠脾脏中分离小鼠脾细胞。然后使用冷冻培养基冷冻分离的PBMC或脾细胞。在测定当天，将PBMC或脾细胞在PBMC培养基(补充有10％来自Hyclone的热灭活胎牛血清、1％青霉素/链霉素和2mmol/L-glutamax的RPMI)中解冻和培养。将50μL培养基中的300k PBMC或脾细胞接种在96孔细胞培养板中。然后将50μL测试样品(以2x起始浓度配制)添加至孔中。将细胞混合物在测试样品和10μg/mL LPS-RS的存在下共培养48小时。通过Accutase收集细胞，然后用针对不同细胞群标记物和活化标记物的抗体染色。洗涤细胞，用2％PFA固定过夜，并在Attune NxT细胞仪(Thermo Fisher)上读数。单核细胞活化表示为CD14+细胞上CD86表达的增加。B细胞活化表示为CD14-/Lin+/HLA-DR+细胞上CD86表达的增加。树突细胞(DC)活化表示为CD14-/Lin-/HLA-DR+/CD123+细胞上CD86表达的增加。
TLR7激动剂化合物10在激活人PBMC中的单核细胞(图1A)、B细胞(图1B)、cDC(图1C)和pDC(图1D)方面非常有效。对于来自食蟹猴PBMC的单核细胞(图2A)、B细胞(图2B)和DC(图2C)以及来自小鼠脾细胞的单核细胞(图3A)、巨噬细胞(图3B)、cDC细胞(图3C)和pDC(图3D)，也观察到类似的免疫细胞活化。
实施例12
化合物10诱导的细胞因子释放
本实施例评估了化合物10在人PBMC、食蟹猴PBMC和小鼠脾细胞中诱导细胞因子释放的能力。化合物1和雷西莫特(resiquimod)：
在测定中用作对照。
如先前实施例中所述分离人和食蟹猴PBMC、小鼠脾细胞。测定当天，将50μL培养基中的300kPBMC或脾细胞接种在96孔细胞培养板中。然后将50μL测试样品(以2x起始浓度配制)添加至孔中。将细胞混合物在测试样品和10μg/mL LPS-RS的存在下共培养24小时(人PBMC)或48小时(食蟹猴PBMC和小鼠脾细胞)。使用细胞培养基通过ELISA测定释放的细胞因子。
TLR7激动剂化合物10刺激人PBMC中IL-6(图4A)、MCP-1(图4B)、和IL1Ra(图4C)的强释放；食蟹猴PBMC中IL-6(图5A)和MCP-1(图5B)的释放，以及小鼠脾细胞中IL-6(图6A)、MCP-1(图6B)、TNFa(图6C)和IP-10(图6D)的释放，与化合物1观察到的活性类似。
实施例13
化合物2的体内活性评价
本实施例评估了MC38-hFolRα肿瘤对化合物2(TLR7激动剂)治疗的应答。
9-10周龄的雌性C57BL/6小鼠用异氟醚麻醉，并在右后腹皮下植入1x106C38-hFolRα(工程化表达hFolRα的小鼠结肠腺癌细胞)。当平均肿瘤大小为约150mm3时，随机化并开始初始治疗(指定为治疗后第0天)。动物在第0天和第4天(q4dx2)接受化合物2的瘤内(IT)注射。表3提供了本实验的治疗组列表。将化合物2溶解于DMSO中并在PBS中配制给药溶液。每周3次监测体重和肿瘤大小。当媒剂对照组的平均肿瘤大小>1,200mm3时，达到主要研究终点。
表3
| 组别 | 疗法 | 剂量(mg/kg) | 给药频率 | 途径 | N |
| 1 | 媒剂(PBS) | - | 第0和4天 | IT | 8 |
| 2 | 化合物2 | 0.1 | 第0和4天 | IT | 8 |
| 3 | 化合物2 | 0.5 | 第0和4天 | IT | 8 |
| 4 | 化合物2 | 2 | 第0和4天 | IT | 8 |
用上述剂量的化合物2瘤内治疗患有已建立的MC38-hFolRα肿瘤的动物。图7A显示剂量>0.5mg/kg导致最小的体重减轻(约5％)，大约在第7天恢复。在施用第二剂后未观察到体重减轻。
MC38-hFolRα治疗对肿瘤生长的影响如图7B所示。当媒剂对照组的平均肿瘤大小>1,200mm3时，与第10天的媒剂对照组相比，化合物2在0.1、0.5和2mg/kg剂量时表现出显著的功效(p<0.0001)，分别导致55％、61％、和80％的肿瘤生长抑制(TGI)。
本实验表明，化合物2(TLR7激动剂)具有良好的耐受性，并显著延缓了MC38-hFolRα肿瘤的生长。
实施例14
抗体-药物偶联和DAR比值测定
抗体-药物偶联如在Zimmerman ES,et al.2014,Bioconjugate Chem.,25(2),pp351-361中所述。简而言之，纯化的抗体或其抗原结合片段与本发明所述的TLR7激动剂偶联。将储备药物溶解于DMSO中，终浓度为5mM。用PBS将连接体有效负载稀释至1mM，然后将其添加至纯化的蛋白质样品中，最终药物浓度为100μM。将混合物在室温(20℃)下孵育17小时。反应样品通过在制剂缓冲液中平衡的Zeba板(Thermo Scientific)中的7000MWCO树脂，去除未掺入的药物。然后将滤液通过
Q板(Pall Corp.)以去除内毒素。
纯化后，纯化的抗体或抗体药物偶联物样品在Caliper GXII系统上通过与在相同Protein Express LabChip(Caliper Life Sciences#760499)上运行的
质量标准进行比较来定量。按照Protein Express Reagent Kit中的规定制备用于分析的样品，不同之处在于，在Caliper系统上分析之前，所述样品在65℃下加热10分钟。
抗体药物偶联物在37℃下用10mM TCEP(Pierce)还原10分钟。将30μL的TA30(30％的乙腈，70％的0.1％三氟乙酸)添加至还原的样品中。将20mg的super-DHB(Sigma，产品编号50862)溶解于TA50(50％的乙腈，50％的0.1％三氟乙酸)中以生成样品基质。接下来，将0.5μL的TA30中的样品添加至0.8μL的TA50中的super-DHB基质中，然后沉积至MALDI样品板上。在Bruker Autoflex Speed MALDI仪器上采集光谱，使用以下初始设置：质量范围7000–70000Da，采样率和数字化仪设置为0.05、0.1、0.5、1、2，实时平滑设置为高，无基线偏移调整。开启高压，将离子源1调整为20kV。200ns脉冲离子提取，偏转矩阵抑制，抑制高达6000Da。峰检测算法是质心算法，信噪比阈值为20，峰宽为150m/z、高度为80％，使用基线校正法TopHat。平滑算法是SavtzkyGolay，宽度为10m/z，循环数为10。所有样品的DAR测定为每个偶联物曲线下解卷积质谱面积的加权平均值。
实施例15
连接体有效负载化合物2偶联方法：连接体有效负载化合物2溶于DMSO中，终浓度为5nM。在抗体浓度为1mg/mL、化合物2与pAMF的比例为3:1、和25％DMSO的1xPBS中进行偶联。反应混合物在室温下孵育过夜。通过LC/MS测定偶联效率。通过阳离子交换去除未偶联的连接体有效负载化合物2。偶联物在补充有9％蔗糖的10mM Na3PO4(pH7.4)缓冲液中配制。
连接体有效负载化合物10偶联方法：连接体有效负载化合物10溶于DMSO中，终浓度为5nM。在抗体浓度为1mg/mL、化合物10与pAMF的比例为3:1、和25％DMSO的1xPBS中进行偶联。反应混合物在室温下孵育过夜。通过LC/MS测定偶联效率。
| mAbs | DAR | ||
| 1 | 抗FolR1 H01 Y180F404 | 连接体有效负载化合物2 | 3.9 |
| 2 | 抗GFP Y180F404 | 连接体有效负载化合物2 | 3.8 |
| 3 | 抗FolR1 B10 F404 | 连接体有效负载化合物2 | 1.9 |
| 4 | 抗FolR1 H01 Y180F404 | 连接体有效负载化合物10 | 3.9 |
等效物
本发明以上阐述的内容可包括具有独立效用的多个不同的发明。尽管已以其优选形式公开了这些发明中的每一个，但本发明公开和示出的特定实施方案不应视为局限用意，因为各种变体均有可能。本发明的主题包括在本发明中公开的各种元件/元素、特征、功能和/或性质的所有新颖及非显而易见的组合和次组合。下列权利要求项特别指出某些被视为新颖及非显而易见的组合及次组合。以特征、功能、元件和/或性质的其他组合及次组合体现的发明可在本申请案、主张本申请案的优先权的申请案或相关申请案中主张。此权利要求项不论是否关于不同发明或关于相同发明且不论范畴相较于原始权利要求项是否更广、更窄、相等或不同，亦被视为包括在本发明的发明主题内。
在不脱离本发明范围情况下，可将本发明或附图中所述的任何实施方案的一个或多个特征与本发明或附图中所述的任何其他实施方案的一个或多个特征组合。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本发明，如同每个单独的出版物或专利申请均被具体地和单独地指出通过引用并入。尽管出于清楚理解的目的已通过图示和示例的方式对上述发明进行了详细描述，但根据本发明教导，对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围情况下，可对其进行某些改变/变化和修改/修饰。
Claims (63)
1.式(I)所示化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基、或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中所述杂环烷基包含1或2个独立地选自N、S和O的杂原子；和其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-6个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-6个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中所述杂环烷基包含1或2个独立地选自N、S和O的杂原子；和其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2、和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H，
其中q1是1、2或3，和–CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中所述R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地进一步被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷基和卤代烷基的基团取代。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基、或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和-CH2-芳基-CH2NH2；
R5是C1-6环烷基、C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C1-6环烷基、芳基或杂芳基取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个选自N、S和O的杂原子，和其中环烷基、芳基和杂芳基分别任选地进一步被卤素、羟基、烷基、或卤代烷基取代。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有式(II)所示结构：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环A是6个原子组成的芳基环或6个原子组成的杂芳基环，其中Y1、Y2、Y3和Y4各自独立地选自C和N；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基进一步被1-3个R3取代；或5-6个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-6个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地进一步被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2、和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和-CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中所述R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地进一步被1或2个独立地选自卤素、羟基、烷基和卤代烷基的基团取代。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其中环A是苯基环。
5.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其中环A是杂芳基环。
6.根据权利要求1-3和5任一项所述的化合物，其中环A是单环杂芳基环。
7.根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其中，在环A上，至少一个-OR4位于相对于基团
的邻位，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
8.根据权利要求1-7任一项所述的化合物，其具有式(III)所示结构：
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环B是N-连接氮杂环丁烷基环，所述N-连接氮杂环丁烷基环被1-2个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是N-连接哌啶基、N-连接哌嗪基、N-连接吗啉基、或N-连接三唑基，所述N-连接哌啶基、N-连接哌嗪基、N-连接吗啉基、或N-连接三唑基进一步被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是未取代的2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛基或3,9-二氮杂双环[3.3.2]癸基；
或者
环B是5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中所述杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；和其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2、和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H、
和-CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-3烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环丙基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中所述R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地被卤素、羟基、烷基、或卤代烷基取代。
9.根据权利要求1-8任一项所述的化合物，其中R1a和R1b各自为H。
10.根据权利要求1-8任一项所述的化合物，其中R2a和R2b各自为H。
11.根据权利要求1-10任一项所述的化合物，其中R1a、R1b、R2a和R2b各自为H。
12.根据权利要求1-11任一项所述的化合物，其中R4是甲基、乙基、丙基或异丙基。
13.根据权利要求1-12任一项所述的化合物，其中R4是甲基。
14.根据权利要求1-13任一项所述的化合物，其中R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被1或2个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、和C1-6二烷基氨基的R5a基团取代。
15.根据权利要求1-13任一项所述的化合物，其中R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被羟基或烷氧基取代。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中R5是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
17.根据权利要求1-13任一项所述的化合物，其中R5是C1-6烷基，所述C1-6烷基任选地被1个芳基或杂芳基取代；其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中芳基和杂芳基分别任选地进一步被卤素、烷基、或卤代烷基取代。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中R5是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
19.根据权利要求1-18任一项所述的化合物，其中
中的环B是被1-3个R3取代的4、5或6个原子组成的完全饱和的杂环烷基环。
20.根据权利要求1-18任一项所述的化合物，其中
中的环B是被连接至同一碳原子的2个R3取代的4、5或6个原子组成的完全饱和的杂环烷基环，其中所述连接至同一碳原子的2个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中螺杂环烷基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且任选地被1-2个C1-3烷基取代。
21.根据权利要求1-18任一项所述的化合物，其中
是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
22.化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，其选自由以下组成的组：
23.药物组合物，其包含权利要求1-22任一项所述的化合物、以及药学上可接受的载体。
24.治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的权利要求1-22任一项所述的化合物、或权利要求23所述的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
26.式(IV)所示化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物，其中：
W1是单键，或W1不存在，或W1是二价连接基团；
X不存在，或X是
下标b是选自1至10的整数；
RA，当存在时，在每次出现时，分别独立地选自C1-3烷基；
各RT，当存在时，分别为释放引发基团(release trigger group)；
HP，当存在时，是亲水基团；
W6是肽的残基，或W6不存在；
SG不存在，或SG是二价间隔基团；
R是H、或末端偶联基团(conjugating group)；和
PA是式(I)所示残基：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基、或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中所述杂环烷基包含1或2个独立地选自N、S和O的杂原子；和其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-6个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-6个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中所述杂环烷基包含1或2个独立地选自N、S和O的杂原子；和R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2、和环烷基；
R3b在每次出现时，分别独立地选自H，
其中q1是1、2或3，和–CH2-芳基-CH2NH2；
R3c在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基，或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中所述R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地进一步被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷基和卤代烷基的基团取代；和
其中PA经由-NR3a-、-C(R3c)2NH-中的所述-NH-、R3的杂环烷基中的所述N原子、R3的部分饱和的杂芳基中的所述N原子、-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-中的所述-NH-、或环B中的N原子连接至所述分子其余部分。
27.根据权利要求26所述的化合物，其具有式(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)所示结构：
其中B′是螺杂环烷基，所述螺杂环烷基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；或
其中R3′是杂环烷基或部分饱和的杂芳基，其中R3′的每个基团分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，条件是：至少一个氮原子存在于所述R3′环中且与W1连接；或者R3′是-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-，其中所述NH与W1连接。
28.根据权利要求26或27所述的化合物，其中SG不存在，或SG是
其中下标d是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
29.根据权利要求26-28任一项所述的化合物，其中SG是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
30.根据权利要求26-29任一项所述的化合物，其中W1，当存在时，是
其中下标e是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
31.根据权利要求26-30任一项所述的化合物，其中W1，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
32.根据权利要求26-31任一项所述的化合物，其中W6，当存在时，是三肽残基。
33.根据权利要求26-32任一项所述的化合物，其中W6，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
34.根据权利要求26-31任一项所述的化合物，其中W6，当存在时，是二肽残基。
35.根据权利要求26-31和34任一项所述的化合物，其中W6，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
36.根据权利要求26-35任一项所述的化合物，其中RT是
其中
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
37.根据权利要求26-36任一项所述的化合物，其中HP，当存在时，是
38.根据权利要求26-37任一项所述的化合物，其中R是偶联基团。
39.根据权利要求26-38任一项所述的化合物，其中R是：
40.根据权利要求26-39任一项所述的化合物，其中PA选自由以下组成的组：
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
41.根据权利要求26-40任一项所述的化合物，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物。
42.抗体药物偶联物，其具有式(V)所示结构：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物；
其中，
Ab是抗体或其抗原结合片段；
L是连接体；
PA是式(I)所示残基；和
下标n是选自1至30的整数。
43.根据权利要求42所述的抗体药物偶联物，其具有式(VI)所示结构：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物；
其中，
各W1分别独立地为单键，或各W1分别独立地不存在，或各W1分别独立地为二价连接基团；
各X在每次出现时，分别独立地不存在，或分别独立地为
下标b是从1至10的整数；
各RA，当存在时，在每次出现时，分别独立地选自C1-3烷基；
各RT，当存在时，在每次出现时，分别独立地为释放引发基团；
各HP，当存在时，分别独立地为亲水基团；
各W6分别独立地为肽的残基，或分别独立地不存在；
各SG，在每次出现时，分别独立地不存在，或分别独立地为二价间隔基团；
各R′，在每次出现时，分别独立地为偶联基团的二价残基；
下标n是选自1至30的整数；
Ab是抗体或其抗原结合片段；和
各PA分别为式(I)所示残基：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物；
其中，
R1a、R1b、R2a和R2b，在每次出现时，各自独立地选自H和C1-6烷基；
环A是环烷基、杂环烷基、单环芳基、单环杂芳基、稠合双环芳基、或稠合双环杂芳基，其中杂环烷基和各杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子；
环B是4个原子组成的N-连接杂环烷基，所述4个原子组成的N-连接杂环烷基被1-2个R3取代；其中所述杂环烷基包含1或2个独立地选自N、S和O的杂原子；和其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是5-6个原子组成的N-连接杂环烷基，所述5-6个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-6个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-6个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中所述杂环烷基包含1或2个独立地选自N、S和O的杂原子；和其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
或者
环B是7-10个原子组成的N-连接杂环烷基，所述7-10个原子组成的N-连接杂环烷基被1-3个R3取代；或5-10个原子组成的N-连接杂芳基，所述5-10个原子组成的N-连接杂芳基被1-3个R3取代；其中R3在每次出现时，分别独立地为-N(R3a)2、-OR3b、-C(R3c)2NH2、C1-6烷基、杂环烷基、杂芳基、或部分饱和的杂芳基，或者连接至同一碳原子的两个R3同与之连接的所述碳原子一起形成螺杂环烷基；其中R3中的杂环烷基、螺杂环烷基、杂芳基和部分饱和的杂芳基分别包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，且分别任选地被1-2个C1-3烷基取代；
R3a，在每次出现时，分别独立地选自H、C1-6烷基、-C(＝O)-CH2NH2、和环烷基；
R3b，在每次出现时，分别独立地选自H，
其中q1是1、2或3，和-CH2-芳基-CH2NH2；
R3c，在每次出现时，分别独立地选自H和C1-6烷基；或者两个R3c同与之连接的所述碳原子一起形成环烷基；
R4是C1-6烷基；和
R5是C3-6环烷基、或C1-6烷基，其中R5的每个基团任选地被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6二烷基氨基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基的R5a基团取代，其中杂芳基包含1、2、3或4个独立地选自N、S和O的杂原子，和其中所述R5a的C3-6环烷基、芳基和杂芳基中任一基团任选地进一步被1、2或3个独立地选自卤素、羟基、烷基和卤代烷基的基团取代；和
其中PA经由-NR3a-、-C(R3c)2NH-中的所述-NH-、R3的杂环烷基中的所述N原子、R3的部分饱和的杂芳基中的所述N原子、-O-CH2-(苯基)-CH2-NH-中的所述-NH-、或环B中的N原子连接至所述分子其余部分。
44.根据权利要求43所述的抗体药物偶联物，其中SG不存在，或SG是
其中下标d是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
45.根据权利要求43-44任一项所述的抗体药物偶联物，其中SG是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
46.根据权利要求43-45任一项所述的抗体药物偶联物，其中W1，当存在时，是
其中下标e是选自1至10的整数，其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
47.根据权利要求43-46任一项所述的抗体药物偶联物，其中W1，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
48.根据权利要求43-47任一项所述的抗体药物偶联物，其中W6，当存在时，是三肽残基。
49.根据权利要求43-48任一项所述的抗体药物偶联物，其中W6，当存在时，是
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
50.根据权利要求43-47任一项所述的抗体药物偶联物，其中W6，当存在时，是二肽残基。
51.根据权利要求43-47和50任一项所述的抗体药物偶联物，其中W6，当存在时，是
或
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点。
52.根据权利要求43-51任一项所述的抗体药物偶联物，其中RT是
其中
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
53.根据权利要求43-52任一项所述的抗体药物偶联物，其中HP，当存在时，是
其中下标b是选自1至10的整数，和
表示附接至所述通式其余部分的连接点。
54.根据权利要求43-53任一项所述的抗体药物偶联物，其中R是：
55.根据权利要求43所述的抗体药物偶联物，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物；
其中各
分别表示附接至所述通式其余部分的连接点；
L是连接体；和
Ab是抗体或其抗原结合片段。
56.根据权利要求43所述的抗体药物偶联物，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、或区域异构体的混合物。
57.根据权利要求43-56任一项所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：抗BCMA、抗Muc16、曲妥珠单抗(trastuzumab)、索非妥珠单抗(sofitizumab)、抗GFP、和抗FolRa，或其抗原结合片段。
58.根据权利要求43-57任一项所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Y180 pAMF突变、F404 pAMF突变、或Y180 pAMF突变和F404 pAMF突变两者。
59.药物组合物，其包含权利要求43-58任一项所述的抗体药物偶联物、以及药学上可接受的载体。
60.治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的权利要求43-58任一项所述的抗体药物偶联物、或权利要求59所述的药物组合物。
61.诊断有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包含向所述受试者施用有效量的权利要求43-58任一项所述的抗体药物偶联物、或权利要求59所述的药物组合物。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
63.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述疾病或病症是炎性疾病或病症。
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