CN103890246A - 可溶性多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明一般地涉及表现出高稳定性和溶解度的多肽(例如抗体分子)。特别地,本发明涉及包含在还原性或细胞内环境中表现出可溶性表达和折叠之成对VL和VH结构域的多肽。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸,涉及所述多肽或多核苷酸的文库,以及涉及在研究、诊断和治疗应用中使用所述多肽的方法。
Description
技术领域
本发明一般地涉及表现出高稳定性和溶解度的多肽(例如抗体分子)。特别地,本发明涉及包含在还原性或细胞内环境中表现出可溶性表达和折叠的成对VL和VH结构域的多肽。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸,涉及所述多肽或多核苷酸的文库,以及涉及在研究、诊断和治疗应用中使用所述多肽的方法。例如所述多肽可用于筛选方法以鉴定与特定靶分子相结合的多肽。
背景技术
脊椎动物抗体谱(antibody repertoire)通过对两种免疫球蛋白(Ig)折叠之异二聚体的祖先基因(ancestral gene)进行复制和多样化而形成。由免疫系统产生的多样性不仅依赖于Ig基因的种系基因(germline gene)家族,而且来自B细胞和T细胞发育过程中亚结构域外显子的体内重组以形成在外显子边界处具有额外多样性的众多独特的谱系,这发生于Ig蛋白的表面暴露环(surface-exposed loop)。这一重组过程称为V(D)J重组,在两个可变轻(VL)外显子和三个可变重(VH)外显子分别重组以形成抗体之轻链和重链的N端抗原结合结构域之后这样称呼。然而,由于经复制的基因偏离其祖先配对(ancestral pair),突变的累积效应导致了可变结构域的异二聚体单元之间不那么完美的界面契合(interfacialfit)。选择压力不是对任一基因施加,而是对作为整体的家族施加。这样,最大的多样性(其对于免疫系统来说是好事)可导致对于个体家族成员来说不那么理想的折叠稳定性。此外,该结合结构域本身可具有不同的折叠稳定性。由众多偏离的亚单位形成功能性异二聚体的需要通过在结构域的β-片层之间存在保守二硫键来补偿。然而,界面可仍然是不稳定的契合,需要ER中的折叠检查点。
通过抗体可变结构域施加的蛋白质契合,作为“共有序列”方法的结果,一些配对具有低折叠稳定性并且倾向于在细菌/哺乳动物宿主中较差地表达,以及倾向聚集。此外,在几乎所有情况下,对于将在VL和VH结构域内形成片层间二硫键有总的需要。这就需要对于在细菌宿主(例如大肠杆菌)中表达抗体文库来说,抗体在细胞的周质(具有二硫化物分子伴侣的氧化性空间)中表达,并且经常作为VL和VH结构域之间的融合(单链抗体;scFv)。然而,输出至周质需要通过内膜排泄,这在对于抗体之高表达所期望的水平下饱和,导致远低于胞质表达的产率。
除了在大肠杆菌胞质中较便宜地产生scFv抗体的优势之外,能够在还原性环境中折叠的抗体支架也将能够用作哺乳动物胞质中的亲和试剂。这将能够扩展抗体作为科学试剂在胞质或细胞核中用于成像或阻断蛋白质功能以及类似地在治疗和诊断中的用途。
由于几乎所有哺乳动物抗体在胞质中是不可溶的,一些团队已经寻找折叠形成稳定异二聚体的罕见基因组合以用作支架从而构建进一步的多样性。所采用的寻找胞质可溶性抗体的方法是对抗体克隆在胞质中稳定表达的偶然事件的观察(Tavladoraki等,1999;Vaccaro等,2006),其可以形成细胞内抗体(“胞内抗体”)支架的基础,或者作为替代地,采用进化方法来使scFv基因向稳定性进化,无论体内(Martineau等,1998;Visintin等,1999;Auf der Maur等,2002;Fisher和DeLisa,2009)或体外(Contreras-Martinez和Delisa,2007;Jermutus L.,等2001)。此外,已经证明单结构域抗体(其中仅单个的、未成对的、可变结构域与靶抗原结合)在胞质中是可溶且稳定的。已经描述了当在胞质中表达两种骆驼科(camelid)单结构域抗体时,所述抗体是折叠且可溶的(Kirchhofer A1.,等,2010;Saerens等,2005)。
用于在细菌胞质溶胶中产生细胞内抗体的另一策略是使用大肠杆菌突变体,所述大肠杆菌突变体具有将胞质中蛋白质的氧化还原状态从还原改变为氧化的突变。这产生了在大肠杆菌胞质中折叠的且部分地和/或完全地氧化的scFv(He等,1995;Jurado P.,等,2002)。
使用酵母双杂交(Y2H)系统来从scFv文库体内筛选与抗原相结合之scFv的两个团队编译了用于其可溶性克隆的序列。第一团队(Tse等,2002)发现VH3进化枝(clade)与进化枝VLκ1和4配对。通过对多种可溶性scFv进行比对,他们编译了用于可溶性VL和VH基因的共有序列,其几乎准确地匹配家族VH3和VLκ1的Morphosys HuCALTM文库编译的家族共有序列(Knappik等,2000)。使用Y2H的第二团队在WO03/097697中报道了其可溶性scFv是与VH3、VH1a或VH1b进化枝之成员最密切地相关的序列,其与VLκ1或VLλ1或VLλ3进化枝最密切相关的成员相组合。然而,其最优的构造是与VH1b配对的VLλ3。然而,关键要注意的是,没有一个报道的序列与最接近的同源免疫球蛋白基因之种系序列的翻译准确地匹配,在整个序列中具有多个突变。推测这是由于这两个团队使用预筛选的噬菌体文库以在酵母转化的限制步骤之前富集抗原结合克隆。然而,这意味着在每个基因中,一个或更多个突变可对胞质中的scFv折叠赋予稳定化作用。
目前为止,还没有发表关于具有准确鉴别对应于VL和VH基因之人种系氨基酸序列的细胞内抗体的报道。这样的抗体将会是有利于建造多样性的支架,因为这允许胞质表达的高产率,将以氧化的形式提供较高的稳定性,将提供更高的结构稳定性以确保环多样性的更大耐受性,以及将包含完全天然的序列,通过产生全抗体来产生较低的患者排斥。
我们在此报道了应用先前描述于WO2011/075761的蛋白质展示方法来筛选人scFv文库以及分离与人种系序列具有相同骨架区的可溶性scFv基因。此外,我们证明了显著的热稳定性和移植到scFv支架上之CDR3的耐受性。
发明概述
在一个方面,本发明提供了包含多种不同多肽的多肽文库,其包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区(scaffold region)具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种的支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);
其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点(antigen-binding site);并且
其中至少两种多肽在所述VH和/或VL可变区中一个或更多个互补性决定区(CDR)中存在的氨基酸序列上彼此不同。
优选地,所述VH和/或VL可变结构域的一个或更多个CDR中氨基酸的序列是随机或半随机的,或来自人抗体。
在另一方面中,本发明提供了构建多肽文库的方法,所述方法包括制备多种不同的多肽,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中至少两种多肽在所述VH和/或VL可变区中一个或更多个CDR中存在的氨基酸序列上彼此不同。
在另一方面中,本发明提供了包含多种不同多核苷酸的多核苷酸文库,
其中每种多核苷酸编码多肽,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);
其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中至少两种多核苷酸彼此的不同在于编码下述多肽:所述多肽在所述VH和/或VL可变区中包含一个或更多个不同的CDR。
优选地,所述多核苷酸编码的所述VH和/或VL可变结构域的一个或更多个CDR中的氨基酸序列是随机或半随机的,或者来自人抗体。
在另一方面中,本发明提供了构建多核苷酸文库的方法,所述方法包括制备编码多肽的多种不同多核苷酸,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);
其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中至少两种多核苷酸彼此的不同在于编码下述多肽:所述多肽在所述VH和/或VL可变区中包含一个或更多个不同CDR的多肽。
在另一方面中,本发明提供分离的和/或重组的多肽,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);
其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点。
所述VL优选地包含与如SEQ ID NO6所示IGLV3-1的支架区具有至少90%同一性的支架区。
优选地,所述多肽是可变片段(Fv),例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)或更高阶的(higher order)多肽复合物。更优选地,所述多肽是scFv并且所述VH和VL通过肽接头连接在一起。
优选地,本发明的多肽中VH和/或VL可变区的支架区与任一给定序列的支架区具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
本发明的多肽优选地在还原性条件下可溶。此外,本发明的多肽优选地在还原性条件下产生时可溶并且能够稳定地形成抗原结合位点。
在另一个优选的实施方案中,本发明的多肽与化合物缀合。所述化合物可以选自:放射性同位素、可检测的标签、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、提高所述多肽在对象中之半衰期的化合物、及其混合物。
在另一方面中,本发明提供了分离的或外源的多核苷酸,其编码本发明的多肽或其重链或轻链可变区之多肽。
在另一方面中,本发明提供了包含本发明之多核苷酸的载体(vector)。
在另一方面中,本发明提供了包含本发明之多肽、本发明之多核苷酸或本发明之载体的宿主细胞。
在另一方面中,本发明提供了用于筛选与靶分子相结合之多肽的方法,所述方法包括将本发明的多肽与靶分子相接触,并且确定所述多肽是否与所述靶分子相结合。在这样的一些方法中,优选如果编码所述多肽的多核苷酸在宿主细胞中或在无细胞表达系统中表达以产生所述多肽。当在细胞内表达所述多肽时,这种表达可发生在宿主细胞(例如细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物)的胞质和/或周质(periplasm)中。
在一个优选的实施方案中,所述宿主细胞是细菌细胞并且所述方法包括:
a)培养包含编码本发明多肽之多核苷酸的细菌细胞,从而产生所述多肽,
b)透化所述细菌细胞,其中所述多核苷酸和所述多肽保留在经透化细菌细胞内,
c)将经透化的细菌细胞与靶分子相接触,从而使所述靶分子扩散到所述经透化的细菌细胞中,以及
d)确定本发明的多肽是否与所述靶分子相结合。
本发明的筛选方法可以使用本文中所描述的任意多肽进行。优选地,本发明的筛选方法包括筛选本发明的文库。这样,所述筛选方法可包括表达本发明的多肽或多核苷酸文库以及在这些文库中鉴定与靶分子相结合的多肽。优选地,这样的筛选方法在还原性条件下进行。例如,这样的方法可以在宿主细胞中进行。在一个优选的实施方案中,这样的方法在宿主细胞的胞质中进行。优选地,所述宿主细胞是细菌细胞,例如革兰氏阴性细菌细胞。在一个优选的实施方案中,所述细菌是大肠杆菌细胞。
在另一方面中,本发明提供包含多种宿主细胞的宿主细胞文库,所述宿主细胞包含本发明的多肽,其中至少一种宿主细胞包含这样的多肽,其与文库中另一种宿主细胞中存在的多肽在VH和/或VL可变结构域中一个或更多个CDR中存在的氨基酸序列不同。在本发明的宿主细胞文库中的一种或更多种宿主细胞可以包含一种或更多种编码本发明之多肽的多核苷酸。例如,在所述宿主细胞文库中的宿主细胞可以含有一种编码VH的多核苷酸和另一种编码VL的多核苷酸。
在另一方面中,本发明提供组合物,其包含本发明之多肽、多核苷酸和/或载体、以及可药用载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。
在另一方面中,本发明提供试剂盒(kit),其包含本发明之多肽、本发明之多核苷酸和/或本发明、以及能够透化细菌细胞的试剂(agent)。
在另一方面中,本发明提供了本发明之多肽在治疗或诊断应用中的用途。
如将是显而易见的那样,根据情况作适当变动后,本发明的一个方面中优选的特性和特征可适用于本发明的任何其他方面。
贯穿本说明书的词“包括”或变体例如“包含”或“含有”将被理解为意指包括所陈述的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组,但不排除任何其他元素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。
在下文中通过以下非限制性实施例并参照附图的方式描述本发明。
附图简述
图1示出良好表达的可溶性scFv克隆的典型外观(1A,以及插图),以及良好表达但不可溶性scFv克隆(1B,以及插图)。
图2示出所选择的与VL基因IGLV3-1、IGLV3-21和IGLV6-57具有高度相似性(similarity)或总同一性(total identity)的可溶性克隆的多重比对(multiple alignment)。
图3展示出两个克隆(一个IGLV3-1和一个IGLV3-21)在提高的温度下表达的行为。
图4展示出当在25℃下于大肠杆菌胞质溶胶中表达时IGLV3-1克隆溶解性。scFv::127::FLAG融合蛋白完整地在可溶性(S)级分中。
图5展示出具有用J1或J2替换λJ区之初始克隆(#8.93)的热稳定性行为。
图6A展示出具有多样化IGLV3-1CDR3的4个独立克隆的溶解性和高表达。
图6B展示出具有多样化IGHV3-23CDR3克隆之完整群体的样品。
图7举例说明在本文中描述的优选可变区中的示例性CDR(用粗体和/或下划线表示)。
图8举例说明编码具有可变CDR3区之IGLV3-1::IGHV3-23支架的多核苷酸序列以及响应的经翻译氨基酸序列的实例。CDR用下划线和粗体表示。肽接头序列用斜体表示。
图9示出SNAP配体标记的IGLV3-1::IGHV3-23scFv文库,展示出可溶性文库成员的高频率。
图10示出通过RED筛选分离结合mAG的scFv。克隆34对于mAG结合是阳性的。克隆25是阴性的。
图11举例说明具有通过RED筛选分离之完整α-mAG scFv的IGLV3-1::IGHV3-23scFv支架,其作为存在于可溶性级分(S)中的C-端His6FLAG融合蛋白而克隆,且在不可溶性级分(P)中没有蛋白质。使用α-FLAG单克隆抗体进行检测。
图12示出与IMAC Ni琼脂糖结合的α-mAG scFv His6FLAG对mAG的结合。
图13展示出α-mAG scFv与mAG相互作用的特异性(通过从大肠杆菌裂解物“拉下(pull-down)”未经纯化的mAG)。α-mAG scFv His6FLAG与IMAC Ni-琼脂糖树脂相结合,添加在总大肠杆菌细胞裂解物中的mAG(泳道6和7)导致具有mAG预期大小(约26KD)之蛋白质的结合。
图14示出来自使用封装裂解缺陷型噬菌体展示gpD::α-mAG scFv融合蛋白的“掺杂的(doped)”mAG文库筛选的FACS阶段的抓屏(screen-grab)(上图)。含有经封装噬菌体的mAG阳性细胞在右侧门(gate)中。使用RED方法诱导从FACS筛选回收的噬菌体用于复制和gpD::α-mAG表达以及用mAG标记(下图)。
序列表要点
SEQ ID NO:1-编码IGHV3-23的多核苷酸序列(NCBI Ref.NT_026437.12)。
SEQ ID NO:2-编码IGHV3-23的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:3-IGHV3-23的氨基酸序列
SEQ ID NO:4-编码IGLV3-1的多核苷酸序列(NCBI Ref.NT_011520.12)。
SEQ ID NO:5-编码IGLV3-1的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:6-IGLV3-1的氨基酸序列
SEQ ID NO:7-编码IGLV3-21的多核苷酸序列(NCBI Ref.NT_011520.12)。
SEQ ID NO:8-编码IGLV3-21的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:9-IG Ly3-21的氨基酸序列
SEQ ID NO:10-编码IGLV6-57的多核苷酸序列(NCBI参考:NW_001838745.1)。
SEQ ID NO:11-编码IGLV6-57的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:12-IGLV6-57的氨基酸序列
SEQ ID NO:13-编码IGLV1-51的多核苷酸序列(NCBI参考序列:NT_011520.12)
SEQ ID NO:14-编码IGLV1-51的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:15-IGLV1-51的氨基酸序列
SEQ ID NO:16-编码IGLV1-40的多核苷酸序列(NCBI参考序列:NT_011520.12)
SEQ ID NO:17-编码IGLV1-40的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:18-IGLV1-40的氨基酸序列
SEQ ID NO:19-编码IGLV1-44的多核苷酸序列(NCBI参考序列:NT_011520.12)。
SEQ ID NO:20-编码IGLV1-44的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:21-IGLV1-44的氨基酸序列
SEQ ID NO:22-编码IGLV1-47的多核苷酸序列(NCBI参考序列:NT_011520.12)
SEQ ID NO:23-编码IGLV1-47的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:24-IGLV1-47的氨基酸序列
SEQ ID NO:25-编码IGLV3-19的多核苷酸序列(NCBI参考序列:NT_011520.12)
SEQ ID NO:26-编码IGLV3-19的多核苷酸序列,排除内含子。
SEQ ID NO:27-IGLV3-19的氨基酸序列
SEQ ID NO:28-优选的肽接头
SEQ ID NO:29-CDR变体序列
SEQ ID NO:30-作为替代的CDR变体序列
SEQ ID NO:31-引物HVK1F1
SEQ ID NO:32-引物HVK1F2
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SEQ ID NO:83-翻译的序列
SEQ ID NO:84-编码具有可变CDR3区之IGLV3-1::IGHV3-23支架的多核苷酸序列
SEQ ID NO:85-由SEQ ID NO:84之多核苷酸编码的氨基酸序列
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SEQ ID NO:109-CDR3环H10
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SEQ ID NO:111-Anti-mAG-BioHis6scFv序列
SEQ ID NO:112-gpD::α-mAG scFv融合构建体多核苷酸序列
SEQ ID NO:113-gpD::α-mAG scFv融合蛋白序列
SEQ ID NO:114-野生型人IGLV3-1
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SEQ ID NO:116-可溶性克隆8.184
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SEQ ID NO:119-可溶性人IGLV3-21克隆8.39
SEQ ID NO:120-野生型人IGLV3-21
SEQ ID NO:121-可溶性人IGLV3-21克隆9.19
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SEQ ID NO:124-可溶性克隆16.1
SEQ ID NO:125-可溶性克隆16.121
发明详述
一般技术和定义
除非另外特别地定义,本文中所使用的所有技术和科学术语应当采用与本技术领域(例如,在蛋白质化学、生物化学、细胞培养、分子遗传学、微生物学和免疫学中)普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另有说明,在本发明中使用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准操作。这样的技术通过例如以下来源的文献描述和阐明:J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,JohnWiley and Sons(1984);J.Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001);R.Scopes,Protein Purification-Principals and Practice,第3版,Springer(1994);T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:A PracticalApproach,卷1和2,IRL Press(1991);D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach,卷1-4,IRL Press(1995和1996);以及EM.Ausubel等(编辑),Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括到目前为止所有的更新);Ed Harlow和David Lane(编辑),Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988);以及J.E.Coligan等(编辑),Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括到目前为止所有的更新)。
术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”在本文中通常可互换使用。本文中使用的术语“外源性多肽”是指由外源性多核苷酸编码的多肽。本文中使用的术语“外源性多核苷酸”是指多核苷酸序列对于其所引入的细胞来说是外来的,或者序列与其所引入的细胞中的序列是同源的,但是处于宿主细胞核酸中通常不出现所述多核苷酸的位置。
本文中使用的术语“抗体”、“抗体分子”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体、多抗体(multibody)、异缀合(heteroconjugate)抗体、嵌合抗体(包括完整分子及其片段,例如Fab、F(ab′)2、Fv和scFv以及其他抗体样分子)。技术人员将会知晓,抗体通常被认为是包含由多个多肽链构成之可变区(例如轻链可变区(VL)和重链可变区(VH))的蛋白质。抗体还可以包含恒定结构域,其可以设置成恒定区或恒定片段或可结晶片段(fragment crystallisable,Fc)。抗体可以与一个或几个密切相关的抗原特异性地结合。全长抗体通常包含共价连接的两个重链(约50至70kD)和两个轻链(各约23kD)。轻链通常包含可变区和恒定结构域,并且在哺乳动物中是κ轻链或λ轻链。重链通常包含可变区和通过铰链区与另外的恒定结构域相连的一个或两个恒定结构域。哺乳动物的重链是下列类型之一:α、δ、ε、γ或μ。每个轻链还与重链之一共价相连。例如,两个重链以及重链与轻链可以通过链间二硫键和/或通过非共价相互作用连在一起。链间二硫键(如果存在)的数目可根据抗体的不同类型而变化。每个链具有N端可变区(VH或VL,其中每个长度为约110个氨基酸)以及在C端的一个或更多个恒定结构域。轻链的恒定结构域(长CL,其长度为约110个氨基酸)经常与重链的第一恒定结构域(CH,其长度为约330至340个氨基酸)对齐并且通过二硫键与其键合。轻链可变区经常与重链可变区对齐。抗体重链可以包含2个或更多个另外的CH结构域(例如CH2、CH3等)并且可包含可在CH1和Cm恒定结构域之间确认的铰链区。抗体可以是任意类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。优选地,所述抗体是鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(优选人)抗体。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长化(primatized)抗体、人抗体和嵌合抗体。
本文中使用的术语“可变区”是指如本文中所定义之抗体的轻链和重链的一部分,其包含CDR(即,CDR1、CDR2和CDR3)和骨架区(framework region,FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变区。VL是指轻链的可变区。
本文中使用的术语“支架区”是指除了CDR残基之外的所有可变区残基。
本文中使用的术语“骨架区”(FR)将被理解为意指除了CDR残基之外的可变区残基的连续序列。这样,所有FR一起构成“支架区”。天然抗体的每个可变区通常具有四个FR,确定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是根据Kabat定义的,示例性轻链FR(LCFR)残基定位于约残基1至23(LCFR1)、35至49(LCFR2)、57至88(LCFR3)和98至107(LCFR4)。注意λLCFR1不包含残基10,其包含于κLCFR1。示例性重链FR(HCFR)残基定位于约残基1至30(HCFR1)、36至49(HCFR2)、66至94(HCFR3)和103至113(HCFR4)。
本文中使用的术语“互补性决定区”(CDR,即CDR1、CDR2和CDR3或高变区)是指免疫球蛋白可变区的氨基酸残基,其存在对于抗原结合是必要的。每个可变区通常具有被确定为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。每个CDR可以包含来自如由Kabat(1987和/或1991)定义的“互补性决定区”的氨基酸残基。例如,在重链可变区中,CDRH1在残基31至35之间,CDRH2在残基50至65之间并且CDRH3在残基95至102之间。在轻链中,CDRL1在残基24至34之间,CDRL2在残基50至56之间并且CDRL3在残基89至97之间。这些CDR还可包含大量插入,例如Kabat(1987和/或1991)中所述。
本文中使用的术语“恒定区”(CR或可结晶片段或Fc)是指抗体的一部分,其包含至少一个恒定结构域并且其通常(尽管不是必须)被糖基化并且其与一个或更多个受体和/或补体级联的组分(例如赋予效应子功能)相结合。重链恒定区可选自以下五种亚型中的任一种:α、δ、ε、γ或μ。此外,多种亚类(例如重链的IgG亚类)的重链负责不同的效应子功能,并且因此通过选择期望的重链恒定区,可产生具有期望效应子功能的蛋白质。优选的重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)和γ3(IgG3)。
“恒定结构域”是抗体中的结构域,其序列在相同类型(例如,IgG或IgM或IgE)的抗体中高度相似。抗体的恒定区通常包含多个恒定结构域,例如γ、α和δ重链的恒定区包含三个恒定结构域并且γ、α和δ重链的Fc包含两个恒定结构域。μ和ε重链的恒定区包含四个恒定结构域并且Fc区包含两个恒定结构域。
本文中使用的术语“Fv”应当被理解为任意蛋白质,无论包含多种多肽还是单一多肽,其中VL和VH缔合并形成具有抗原结合位点(即能够特异性地与抗原相结合)的复合物。VH和VL可以以单一多肽链或以不同多肽链形成抗原结合位点。此外本发明的Fv(以及本发明的任意多肽)可以具有多个抗原结合位点,所述多个抗原结合位点可以或不可以与相同的抗原结合。术语“Fv”应当理解为包括直接衍生于抗体的片段以及对应于使用重组方式产生的此类片段的蛋白质。在一些优选的实施方案中,所述VH不与重链恒定区(CH)1相连和/或所述VL不与轻链恒定区(CL)相连。含有多肽或蛋白质的示例性Fv包括Fab片段、Fab’片段、F(ab')片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体、或更高阶的复合物,或者与恒定区或其结构域(例如CH2或CH3结构域)相连的上述任一种。“Fab片段”由抗体的单价抗原结合片段组成,并且可以例如通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以产生完整轻链和重链的一部分组成的片段来产生或者可以通过重组方式产生。可以例如通过用胃蛋白酶处理整个免疫球蛋白,随后还原以产生由完整轻链和重链的一部分组成的分子来获得抗体的“Fab′片段”。以这种方式处理每个抗体获得的两个Fab′片段。Fab′片段也可通过重组方式产生。抗体的“F(ab′)2片段”由两个Fab′片段通过两个二硫键连在一起形成的二聚体组成,并且通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子获得,无需后续的还原。“Fab2”片段是重组片段,其包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段。
“单链Fv”或“scFv”是含有免疫球蛋白之可变区片段(Fv)的重组分子,其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。下文提供了落入该术语范围内的含有多肽之示例性Fv的详细讨论。
本文中使用的术语“抗原结合位点”应当被理解为意指由能够与抗原特异性结合的多肽形成的结构。抗原结合位点不需要是连续的氨基酸,甚至不需要是在单一多肽链中。例如,由两条不同多肽链产生的Fv中,抗原结合位点由一些列与抗原相互作用的VL和VH之区域构成,并且其通常(但不总是)在每个可变区的一个或更多个CDR中。
本文中被命名为CDR和FR的任意氨基酸位置根据Kabat(1987和1991)定义。技术人员将能够容易地在本发明的进行中使用其他编号系统,例如Chothia和Lesk(1987和/或1989)和/或Al-Lazikani等(1997)的高变换编号系统。
技术人员将会知晓,“二硫键”是通过巯基偶联形成的共价键。所述键也被成为SS-键或二硫桥(disulfide bridge)。在多肽中,二硫键通常发生在两个半胱氨酸残基的巯基之间。
技术人员还将会知晓,术语“非还原性条件”包括足以使蛋白质中的巯基(-SH)基团氧化的条件,例如容许二硫键形成。因此,术语“还原性条件”包括不足以使蛋白质中的巯基(-SH)基团氧化的条件,例如不容许二硫键形成。
本文中使用的术语“抗原”应当被理解为意指主要针对其可使抗体应答出现的任意的物质组合物。示例性抗原包括蛋白质、肽、多肽、碳水化合物、磷酸基团、磷光体肽(phosphor-peptide)或多肽,糖基化肽或肽等。
本文中对可变区及其一部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可以进一步通过Kabat(1987和/或1991)、Bork等(1994)和/或Chothia和Lesk(1987和1989)或Al-Lazikani等(1997)中的讨论来阐明,。
本文中使用的术语“缀合”、“缀合的”或其变化形式广泛地用于指可用于本文中公开的方法中的化合物与其他试剂之间任意形式的共价键或非共价键缔合。
术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应当被理解为意指“X和Y”或“X或Y”并且应当对两种含义或对含义之一提供清楚的支持。
本文中使用的术语“约”是指指定值+/-5%的范围。
如将通过以下描述理解的,本发明人应用了蛋白质展示方法以鉴别可在细胞的胞质中以可溶性形式表达并且展示出出乎意料水平的可溶性、热稳定性、以及对CDR多样化之耐受的多肽(例如抗体)。本发明人进一步证明,仅使用抗体可变结构域之骨架区中的种系序列,人免疫球蛋白谱(immunoglobulin repertoire)具有用于胞质可溶性和稳定性的潜力。
保留封装展示(Retained Encapsulated Display,RED):
本发明人已经鉴别了可以在细胞的胞质中以可溶性形式表达并且使用保留封装展示(RED)的方法展示出出乎意料水平的可溶性、热稳定性、以及对CDR多样化之耐受的多肽。RED是用于革兰氏阴性细菌的蛋白质展示平台,这描述于WO2011/075761(其内容通过引用整体并入本文)。在RED中待展示的蛋白质在细胞的周质或胞质中表达。然后用去污剂或有机溶剂透化细胞膜,同时完整的留下细胞壁。展示蛋白质通过细胞壁被保留,通过与蛋白质融合将其分子量提高至高于细胞壁的孔隙率限制(例如与四聚体单体融合),或者通过与蛋白质结构域融合(所述蛋白质结构域与DNA、细胞壁自身或这二者结合)。通过在经透化细胞的细胞壁内共保留质粒和基因组DNA提供对于展示系统所需的表型-基因型连锁。
多肽:
人抗体谱含有功能性和假基因可变区(由Lefranc总结,2000)。这些可以作为外显子从非免疫谱系中基因组DNA或者从免疫细胞(其已经经历了V(D)J重排)来源的mRNA克隆,以准备可以用于表达抗体的遗传构建体。在这样的过程期间,轻链和重链的可变结构域可以作为单体scFv或以形成二价或更高价的排列被克隆。还可以从可变结构域的下游克隆恒定区以产生Fab或全长抗体。
在所有形式中,为了获得正确折叠并且在抗体的产生期间维持稳定性和可溶性,编码抗体的遗传构建体必须几乎总是在使得结构域内二硫键可以在β片层之间形成的条件下(即在非还原性条件下)表达。这样,在哺乳动物中,抗体插入内质网(ER)和高尔基体用于分泌或膜插入。如果在细菌宿主(例如大肠杆菌)中表达,其必须引导至二硫键伴侣DsbA、B和C存在的周质空间。如果抗体在非氧化性环境中(例如在细胞的胞质中),稳定化二硫键的缺乏导致错误折叠和降解,或者如果在大肠杆菌胞质中以高水平表达,作为亚细胞包涵体(inclusion body)而聚集。
本发明人已经鉴别了包含抗体可变区支架的多肽,其甚至在多肽于非氧化(还原)性环境中表达时能够形成抗原结合位点。
因此,本发明提供了分离的和/或重组的多肽,所述多肽包含通过肽接头与免疫球蛋白可变结构域之VLλ1、3或6家族的抗体轻链可变区(VL)相连的免疫球蛋白可变结构域之VH3家族的抗体重链可变区(VH),其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点。
本发明的多肽可以以任意已知形式的抗体或抗体片段来提供。因而,本发明的多肽可以是:(i)抗体;(ii)单一结构域抗体;(iii)单链Fv(scFv);(iv)双抗体、三抗体、四抗体;(v)融合蛋白,其包含(ii)-(iv)中任一种和抗体的Fc结构域或其结构域;(vi)融合蛋白,其包含(ii)-(iv)中任一种和能够与免疫效应细胞或任意其他已知形式的抗体相结合的蛋白质。
优选地,本发明的多肽是Fv。例如,本发明的多肽优选地是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或更高阶的多肽复合物。
最优选地,本发明的多肽是scFv。scFv包含在单多肽链中的VH和VL区。优选地,所述多肽链还在VH和VL之间还包含多肽接头,其使得scFv能够形成期望的用于抗原结合的结构(即,用于所述单多肽链的VH和VL彼此相互缔合以形成抗原结合位点)。这与本发明的双抗体或更高阶的多聚物截然不同,其中来自不同多肽链的可变区彼此相互缔合或结合。所述肽接头可以包含12个或更多个氨基酸残基。例如,所述肽接头可以包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸或更多个。优选地,所述肽接头包含超过12个氨基酸残基,且(Gly4Ser)3(即GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:28))是用于scFv的更偏好的接头之一。另一些合适的多肽在本领域中是已知的。本发明的多肽优选地包含免疫球蛋白可变区之VH3家族的VH的支架区和/或免疫球蛋白可变结构域之VLλ1、3或6家族的VL的支架区。这样,本发明的多肽优选地包含本文中公开的任意可变区的所有氨基酸残基,不包括CDR残基。CDR残基可以由本领域技术人员容易地鉴定,参考Kabat(1987和/或1991)、Bork等(1994)和/或Chothia和Lesk(1987和1989)或Al-Lazikani等(1997)中的讨论。这样本发明的多肽可包含本文中公开的任意可变区的所有FR。所述多肽还可以包含一个或更多个本文中公开的可变区之CDR。所述多肽还可以包含一个或更多个未在本文中公开的可变区中存在的CDR。因此,一个或更多个来自不同来源的CDR可以插入到本文中公开的可变区的支架区。这种可能性的进一步讨论包含于下文中。
在一个优选的实施方案中,本发明的scFv包含通过肽接头与免疫球蛋白可变结构域之VLλ1、3或6家族的VL相连接的免疫球蛋白可变结构域之VH3家族的VH的支架区。在更优选的一些实施方案中,本发明的scFv包含IGHV3-23的支架区和IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21和IGLV6-57中任一种的支架区。最优选地,本发明的scFv包含IGHV3-23的支架区和IGLV3-1的支架区。
本发明的多肽可以用其与参考序列的百分比同一性来定义。这一百分比同一性可以通过本领域中已知的任意合适的方法计算。用于比较经比对序列的数种算法是已知的,并且可以用于确定本发明之多肽与参考序列的百分比同一性。例如,氨基酸和多核苷酸序列可以手动比较或通过利用基于计算机的序列比较和鉴定工具进行比较,其使用例如BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool;Altschul等,1993)的算法;还参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),比对的Clustal方法(Higgins and Sharp,1989)等,其中用于每个特定序列比较的合适的参数可按照本领域技术人员将会理解的方式来选择。
优选地,本发明的多肽是分离的和/或重组的多肽。本文中使用的术语“分离的”或“纯化的”旨在意指这样的多肽,其通常已经从脂质、核酸、其他多肽和肽、以及在其天然状态中与其相关的污染分子分离。优选地,所述分离的多肽至少60%没有、优选地至少75%没有、以及更优选地至少90%没有与其天然相关的组分。
在多肽的上下文中,术语“重组”是指这样的多肽,当通过细胞或在无细胞表达系统中产生时,所述多肽与天然状态相比具有改变的量或改变的速率。在一个实施方案中,所述细胞是不天然产生所述多肽的细胞。然而,所述细胞可以是包含非内源性基因(其导致改变的,优选提高量的待产生之肽)的细胞。如本文中所描述的重组多肽包括未从转基因(重组)细胞或无细胞表达系统(所述多肽在其中产生)的其他组分分离的多肽,并且在这样的细胞或无细胞体系中产生的多肽随后被纯化以除去至少一些其他组分。
本发明的多肽优选地包含来自鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(优选人)抗体的氨基酸序列。因此在本发明的多肽中包含的可变区和/或支架区可以是鼠(小鼠或大鼠)或灵长类(优选人)可变区和/或支架区。
优选地,本发明的多肽是可溶性的。用于确定多肽之可溶性的方法是本领域中公知的,例如J.Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd版,Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001)中的描述。多肽如果(例如)不能从经裂解的和/或经透化的细胞级分中通过物理分离(例如通过离心)分离,则所述多肽可以被确定为是可溶性的。此外,如果本发明的多肽在细胞的胞质中不形成包涵体,则所述多肽可以被确定是可溶性的。因此,如果当多肽在宿主细胞中表达时,所述多肽保留在通过任何合适的机械、去污剂和/或酶方法裂解宿主细胞后产生的可溶性级分中,则所述多肽可以被认为是可溶性的。合适的机械方法包括例如使用声处理。合适的去污剂方法包括例如使用n-辛基-β-D-硫代葡糖苷(8TGP)。合适的酶方法包括例如使用溶菌酶。优选地,本发明的多肽可在细胞裂解物的可溶性级分中保留的水平为至少25%,例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、或至少95%。
本发明的多肽优选地能够稳定地形成抗原结合位点。因此,所述多肽优选地能够在足以允许检测多肽抗原复合物的水平上与靶抗原相结合。这样的检测可以在合适的实验条件下进行,例如在温度为至少5℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃或至少50℃。
缀合物
本发明的多肽可以使用本领域中已知的任意方法与一个或更多种化合物缀合。多肽可以与之缀合的化合物实例选自:放射性同位素、可检测的标签、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、提高所述多肽在对象中之半衰期的化合物及其混合物。示例性治疗剂包括但不限于抗血管发生剂(anti-angiogenic agent)、抗新血管形成剂(anti-neovascularization)和/或其他血管形成剂(vascularization agent)、抗增殖剂、促凋亡剂、化疗剂或治疗性核酸。
毒素包括对细胞有害的(例如杀死细胞)任意试剂。多这些类药物的描述是本领域中已知的,并且其作用的机理参见Goodman等,Goodman和Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第8版,Macmillan Publishing Co.,1990。与制备免疫球蛋白-免疫毒素缀合物相关的另一些技术在例如Vitetta(1993)和US5,194,594中提供。示例性毒素包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(alfa-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S),苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制因子、多花白树毒蛋白(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯类(tricothecenes)。参见例如WO93/21232。
用于形成包含本发明之多肽的免疫缀合物的合适的化疗剂包括:auristatin和美登素(maytansine)、泰素(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮(1-de-hydrotestosterone)、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素、抗代谢物类(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂(例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼)、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物例如卡铂)、抗生素类(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、柔红霉素(以前称为道诺霉素)、多柔比星、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素(plicamycin)、氨茴霉素(AMC))。
合适的血管发生抑制剂(抗血管发生剂)的实例包括但不限于:尿激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂(例如马立马司他(marimastat)、新伐司他(neovastat)、BAY12-9566、AG3340、BMS-275291和类似药剂)、内皮细胞迁移和增殖的抑制剂(例如TNP-470、角鲨胺(squalamine)、2甲氧基雌二醇、康普瑞汀(combretastatins)、内皮抑素(endostatin)、血管抑素、青霉胺、SCH66336(Schering-Plough Corp,Madison,NJ)、R115777(Janssen Pharmaceutica,Inc,Titusville,NJ)和类似药剂)、血管发生性生长因子拮抗剂(例如ZD6474、SU6668、针对血管发生剂的抗体和/或其受体(例如VEGF、bFGF和血管生成素-1)、沙立度胺、沙立度胺类似物(例如CC5013)、Sugen5416、SU5402、抗血管发生核酶(例如angiozyme)、干扰素α(例如干扰素α2a)、苏拉明(suramin)和类似药剂)、VEGF-R激酶抑制剂和其他抗血管发生的酪氨酸激酶抑制剂(例如SU011248)、内皮细胞特异性整合素/生存信号的抑制剂(如vitaxin和类似药剂)、铜拮抗剂/螯合剂(如四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)、卡托普利和类似药剂)、羧胺三唑(carboxyamido-triazole,CAI)、ABT-627、CM101、白介素-12(IL-12)、IM862、PNU145156E以及抑制血管发生的核苷酸分子(例如反义-VEGF-cDNA、编码血管抑素的cDNA、编码p53的cDNA和编码缺陷型VEGF受体-2的cDNA)和类似药剂。血管发生、新血管形成和/或其他血管形成之抑制剂的另一些实例是抗血管发生的肝素衍生物和相关分子(例如,肝素酶III(heperinase III))、替莫唑胺、NK4、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、环氧合酶-2抑制剂、低氧诱导因子1的抑制剂、抗血管发生的大豆异黄酮类、奥替普拉(oltipraz)、烟曲霉素及其类似物、生长抑素类似物、多硫酸戊聚糖(pentosanpolysulfate)、替可加兰钠(tecogalan sodium)、达肝素(dalteparin)、肿瘤抑素(tumstatin)、血小板反应蛋白(trombospondin)、NM-3、卡贝塔汀(combrestatin)、血管能抑素(canstatin)、阿瓦斯汀(avastatin)、针对其他相关靶标的抗体(例如抗α-v/β-3整合素和抗高分子激肽原(kininostatin)mAb)和类似药剂。
在一个实例中,如本文所描述的根据任意实施方案的多肽与其他多肽缀合或连接,所述其他多肽包括本发明的其他多肽或者包含免疫球蛋白可变区的多肽,例如免疫球蛋白或从其衍生的多肽(例如,如本文中所述的多肽)。不排除其他蛋白质。另外的蛋白质对技术人员来说将是显而易见的,包括例如免疫调节剂或延长半衰期的蛋白质或多肽或者与血清白蛋白相结合的其他蛋白质等。
示例性的免疫调节剂包括细胞因子和趋化因子。术语“细胞因子”是从一个细胞群释放的、在另一细胞发挥作用的、作为细胞间介质的蛋白质或肽的通用术语。细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素,例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、和牛生长激素;甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)、肝生长因子;前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳激素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β,缪勒氏抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、促性腺激素相关肽、抑制素(inhibin)、激活蛋白(activin)、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神经生长因子例如NGF-B、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子-I或胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ;集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF),白介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12,IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和LIF。
趋化因子通常作为化学引诱物来将免疫效应细胞募集至趋化因子表达的部位。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-α或MIP1-β。技术人员将意识到已知某些细胞因子具有化学引诱作用并且可以归类为术语趋化因子。
示例性血清白蛋白结合肽或蛋白质描述于US20060228364或US20080260757。
多种放射性核素可用于放射性缀合蛋白的产生。实例包括但不限于低能量辐射原子核(例如适合用于诊断目的),例如13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In等。优选地,放射性核素是发射γ、光子或正电子的放射性核素,具有半衰期适合于在施用和定位至成像部位之间的时间流逝之后允许放射性或检测。本发明还涵盖高能量放射性核(例如用于治疗目的),例如125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。这些同位素通常产生具有短的路径长度的高能量α-或β-粒子。这样的放射性核素杀死与其非常靠近的细胞,例如缀合物已经附着或者进入的肿瘤细胞。它们对未定位的细胞影响很小的或没有影响并且基本上没有免疫原性。或者,高能量同位素可以通过其他稳定同位素的热辐射产生,例如在硼中子俘获治疗中(Guan等,1998)。
在另一个实施方案中,所述多肽与用于在细胞中预靶标的“受体”(例如链霉亲和素)缀合,其中缀合物施用于患者,随后通过使用清除剂从循环移除未结合的缀合物并且随后施用与治疗剂(例如放射性核素)缀合的“配体”(例如亲和素)。
本发明的蛋白质可以被修饰以含有另外的非蛋白质部分,其在本领域中是已知的并且可容易地获得。优选地,适合用于蛋白质之衍生的部分是水溶聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环(dioxolane)、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(无论是均聚物或随机共聚物)、以及聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(PPG)均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如,甘油、POG)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可以在生产中具有优势。
聚合物分子通常特征为具有例如约2个至约1000个或约2个至约300个重复单元。
例如,水可溶性聚合物(包括但不限于PEG、聚(氧化乙烯)(PEO)、聚氧乙烯(POE)、聚乙烯醇、羟乙基纤维素或葡聚糖)通常与蛋白质缀合以提高蛋白质的稳定性或尺寸等。
PEG、PEO或POE是指环氧乙烷的寡聚物或聚合物。在聚乙二醇的情况中,这些寡聚物或聚合物通过例如环氧乙烷的阴离子开环聚合产生,这是与通过氢氧根离子在环氧化物环上的亲核攻击。用于蛋白质修饰的PEG之更加有用的形式之一是单甲氧基PEG(mPEG)。
用于与本发明的多肽缀合的特别优选的化合物列在表1中。
表1:用于缀合的优选化合物
在本发明的一个实例中,间隔区(spacer)部分包括在其所缀合的化合物和多肽之间。本发明的间隔区部分可以是可切割的或不可切割的。例如,间隔区部分可以是氧化还原可切割的间隔区部分,使得所述间隔区部分在具有较低的氧化还原电位的环境(例如在胞质和其他具有更高浓度的带有游离巯基之分子的区域)中是可切割的。由于氧化还原电位的变化而可以被切割的隔离区部分的实例包括含有二硫化物的那些。切割刺激可以根据缀合蛋白的细胞内摄取来提供,其中胞质的较低氧化还原电位有利于切割间隔区部分。
在另一个实施方案中,pH降低导致间隔区的切割,从而将化合物释放到靶细胞中。pH降低牵涉到许多生理和病理过程,如内体运输、肿瘤生长、炎症和心肌缺血。pH从生理的7.4下降至内体中的5至6或溶酶体中的4至5。可以用于靶向癌细胞之溶酶体或内体的酸敏感性间隔区部分的实例包括具有酸可切割键的那些,例如见于缩醛、缩酮、原酸酯类、腙类、三苯甲基类、顺-乌头基类(cis-aconityls)、或硫代氨甲酰基类(thiocarbamoyls)中的那些(参见实例美国专利No.4,569,789、4,631,190、5,306,809和5,665,358)。
可切割的间隔区部分可以对生物学上供应的与特定靶细胞相关的切割剂(例如溶酶体或肿瘤相关酶)敏感。可以被酶促切割的连接部分的实例包括但不限于肽或脂。示例性酶可切割的连接部分包括对肿瘤相关蛋白酶(例如组织蛋白酶B(cathepsin B)或纤溶酶(plasmin))敏感的那些。组织蛋白酶B可切割的位点包括二肽序列缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸和/或缬氨酸-丙氨酸。
蛋白质复合物
本发明的多肽优选地与一个或更多个化合物缀合,这使其特别适合用于本文中提及的RED测定。例如,所述多肽可以与至少第二多肽(下文中称为“第二多肽”)相缔合以形成蛋白质复合物,所述蛋白质复合物具有使得所述蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞内的分子量。所述多肽可以与所述第二多肽相缔合,通过例如共价键(例如二硫桥)或通过非共价缔合。“非共价键缔合”是指不涉及原子间键的分子相互作用。例如,非共价相互作用涉及离子键、氢键、疏水相互作用、以及范德华力。非共价力可用于在蛋白质或蛋白质复合物中将分离的多肽链连在一起。因此,所述多肽和第二多肽可以作为分离的多肽由相同或不同的载体表达,或者所述多肽中的一种或两种都可以由已经整合到细菌细胞基因组中的编码所述多肽的DNA表达。
或者,在蛋白质复合物中相缔合的所述多肽和第二多肽可以是融合蛋白。本文中使用的“融合蛋白”是指杂合蛋白,其由两种或更多种多肽或其片段组成,通过表达编码两种多肽中每一种之至少一部分的多核苷酸而产生。
蛋白质复合物通过分子大小保留在经透化细菌细胞中
所述第二多肽可以是具有足够的分子大小(即足够的分子量或分子半径)的任意多肽,使得至少一些与用于筛选期望活性的多肽形成的复合物不能从经透化的细菌细胞扩散。因此,所述蛋白质复合物在所述细胞的透化之后保留在细菌细胞内。本领域技术人员将意识到第二多肽的性质(包括其分子量以及其是否是球状或杆状(丝状)蛋白)将确定其阻止或抑制蛋白质复合物通过细菌细胞壁扩散。在一个实施方案中,所述第二多肽的分子量为至少约30kDa或至少约40、50、60、70、80、90、100、120、130、140、150或更大的kDa。在一个实施方案中,所述第二多肽为至少约120kDa。
在一个实施方案中,所述第二多肽形成具有大于经透化细菌细胞排除孔大小之分子大小的多聚体。本文中使用的术语“多聚体”及其语法上的变化形式是指两个或更多个不同分子之间形成多聚体复合物。所述多聚体可以包含例如两个或更多个相同蛋白质的分子(即同多聚体)或者两个或更多个不同或非同一蛋白质的混合物(即异多聚体)。适用于在本发明的方法中形成多聚体的蛋白质包括形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体以及包含七个或更多个亚单位的更高阶多聚体的那些。
多聚体蛋白质包括同二聚体,例如PDGF受体α和β同种型、促红细胞生成素受体、MPL和G-CSF受体;异二聚体,其每个亚单位具有配体结合和效应子结构域,例如PDGF受体αβ同种型;以及具有带完全不同功能的组成亚单位的多聚体,例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、和GM-CSF受体。可以在本发明的方法中使用的其他多聚体蛋白质的非限制性实例包括参与DNA的合成和复制的因子,例如参与产生mRNA的DNA聚合酶蛋白,例如TFIID和TFIIH;细胞,核及其他膜相关的蛋白质,例如激素和其他信号转导受体、主动转运蛋白和离子通道,血液中的多聚体蛋白,包括血红蛋白、纤维蛋白原和冯维勒布兰德因子(vonWillabrand′s factor);在细胞内形成结构的蛋白质,例如肌动蛋白、肌球蛋白、以及微管蛋白和其他细胞骨架蛋白;在细胞外环境中形成结构的蛋白质,例如胶原蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白;参与细胞内和细胞外转运的蛋白质,例如驱动蛋白(kinesin)和动力蛋白(dynein),SNARE家族的蛋白质(可溶性NSF附着蛋白受体)和网格蛋白(clathrin);有助于调节染色质结构的蛋白质,例如组蛋白和精蛋白、Swi3p、Rsc8p和moira;多聚体转录因子例如Fos、Jun和CBTF(CCAAT盒转录因子);多聚体酶,例如乙酰胆碱酯酶和乙醇脱氢酶;伴侣蛋白例如GroE、Gro EL(伴侣蛋白60)和Gro ES(伴侣蛋白10);抗毒素,例如蛇毒、肉毒中毒(botulism)毒素、链球菌(Streptococcus)超抗原;溶素(1ysin)(来自噬菌体和病毒的酶);以及大多数变构蛋白质。在一个实施方案中,多聚体蛋白是大肠杆菌蛋白质。形成多聚体的大肠杆菌蛋白质的非限制性实例包括L-鼠李糖异构酶(RhnA,例如NCBI登录CAA43002)、β-半乳糖苷酶(β-gal,例如NCBI登录YP001461520)、甜菜碱醛脱氢酶(BetB,例如NCBI登录AAA23506)、谷氨酸-5-激酶(G5K,例如NCBI登录AAB08662)、谷胱甘肽合成酶(GshB,例如NCBI登录AP_003504)、以及中链醛脱氢酶(YdcW,例如NCBI登录AP_002067)。
在一个实施方案中,所述多肽具有足以使所述多肽保留在细菌细胞壁内的分子大小。因此,本领域的技术人员将意识到,为了将所述多肽保留在经透化的细菌细胞内,这样的多肽不一定与第二蛋白质相缔合。
DNA结合蛋白
本发明人已经发现,DNA在透化后保留在细菌细胞内。因此,在一个实施方案中,所述多肽与DNA结合蛋白缔合以形成蛋白质复合物,所述蛋白质复合物结合DNA并且在保留在细菌细胞内部。本文中使用的“DNA结合蛋白’’是指包含DNA结合结构域的任意蛋白质,所述DNA结合结构域包含至少一个识别双链或单链DNA的模体(motif)。如本领域技术人员已知的,DNA结合结构域包括螺旋-转角-螺旋、锌指、亮氨酸拉链、翼状螺旋(winged helix)、翼状螺旋转角螺旋、螺旋-环-螺旋、识别DNA的免疫球蛋白折叠、或B3结构域。多肽与DNA结合蛋白的缔合有利地提供了提高的DNA(例如编码本发明筛选方法中之多肽的质粒)回收。
DNA结合蛋白的实例包括细菌感受态蛋白,例如但不限于:大肠杆菌DNA结合蛋白、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorhoeae)DNA结合蛋白(例如ComE)、腺病毒E2蛋白、AraC转录因子、碱性螺旋-环-螺旋转录因子、碱性亮氨酸拉链转录因子、丁酸盐响应因子、着丝粒蛋白B、COUP转录因子、早期生长反应转录因子、G盒(G-box)结合因子、GATA转录因子、HMGA蛋白、同源结构域蛋白、I-κB蛋白、整合宿主因子、干扰素调节因子、干扰素刺激基因因子3、Kruppel样转录因子、亮氨酸响应调节蛋白、基质附着区结合蛋白、甲基-CpG结合蛋白、MutS同源物2蛋白、髓性-淋巴性白血病蛋白、NF-κB、NF1转录因子、核呼吸因子(nuclear respiratory factor)、癌基因蛋白p55、起点识别复合物、成对盒转录因子、POU结构域因子、原癌基因因子、Rad51重组酶、Rad52DNA修复和重组蛋白、复制蛋白A、复制蛋白C、视网膜母细胞瘤蛋白、Smad蛋白、SOX转录因子、T盒结构域蛋白、TCF转录因子、端粒结合蛋白、Toll样受体9、反式激活蛋白、以及翼状螺旋转录因子。在一个实施方案中,DNA结合蛋白是大肠杆菌DNA结合蛋白。在另一个实施方案中,DNA结合蛋白是淋病奈瑟菌蛋白,例如ComE。
细胞壁结合蛋白
所述多肽可以与细菌细胞壁结合蛋白相缔合。技术人员将理解,细胞壁结合蛋白的选择将取决于宿主细胞种类,因为不同的细菌具有不同的细胞壁组成。尽管细菌具有由肽聚糖(PG)构成的细胞壁,但是物种之间的化学修饰可影响跨物种结合。技术人员将能够容易地确定适合用于在特定细菌种类中的细胞壁结合蛋白。
细菌细胞壁结合蛋白包括已知具有结构域结构的蛋白质,从而使得天然结构中所述多肽链的一部分能够识别并结合细菌细胞壁上的特定分子或分子构象。因此,术语“细菌细胞壁结合蛋白”包括作为与细菌细胞壁特异性结合的蛋白质之一部分的蛋白质结构域。细菌细胞壁结合蛋白的实例包括由噬菌体编码的细胞壁水解酶、细菌的细胞壁水解酶和不同的自溶素(autolysin)。还涵盖由噬菌体和其他病毒的DNA编码的受体分子。当细菌细胞壁结合蛋白来自噬菌体来源的水解酶(其能够与细菌特异性结合)时,所述细菌细胞壁结合蛋白保持其结合能力,但是优选地不具有显著的水解活性。
在一个实施方案中,细胞壁结合蛋白与大肠杆菌的细胞壁非共价结合。例如,对于大肠杆菌宿主细胞,有内源PG结合蛋白,所述PG结合蛋白具有发生在PAL、OmpA、YiaD、YfiB和MotB中的保守的约100个氨基酸的PG结合结构域(Parsons等,2006)。然而,已经表明,来自另一些生物体的蛋白质在大肠杆菌中很好的表达并且与细胞壁高亲和力地结合,例如,来自假单胞菌(Pseudomonas)噬菌体(KzPG)的约70个氨基酸的PG结合结构域(Briers等,2009)。因此,可以将来自于结合PG之蛋白质的PG结合结构域用作本发明方法中的细菌细胞壁结合蛋白。
在一个示例性实施方案中,所述PG结合结构域可以与本发明的多肽融合,并且在细菌细胞的胞质溶胶中表达。在膜透化之后,PG结合结构域与细胞壁结合,导致目的多肽保留在经透化细胞内。本领域技术人员将理解,为了潜在地进一步增强目的多肽在细胞内的保留,多肽可以与细菌细胞壁结合蛋白之外的DNA结合蛋白缔合。
或者,所述多肽可以与能够与细菌细胞壁共价连接的蛋白质缔合。优选地,所述蛋白质包含周质靶向信号。因此,所述多肽在细菌细胞的胞质溶胶中表达,但是靶向周质,其中所述多肽在膜透化之前与细胞壁连接。
通过非限制性实例,共价附着到细胞壁上的细菌细胞壁结合蛋白可以是能够与细胞壁结合的脂蛋白,并且其缺少用于外膜附着所必需的功能性N端信号序列。例如,脂蛋白可以是大肠杆菌LPP。LPP是一种丰富的大肠杆菌蛋白质,其形成三聚体的卷曲螺旋。在其天然形式中,一端通过脂化束缚于外膜,另一端通过C端赖氨酸与细胞壁共价结合。脂蛋白还可以包含使脂蛋白靶向周质的序列,例如OmpF周质靶向序列。在一个实施方案中,脂蛋白是缺少用于外膜附着所必需的功能性N端信号序列的大肠杆菌脂蛋白。
在本说明书的教导下,本领域技术人员将能够鉴定或设计与细胞壁共价连接并且适用于本发明方法的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中,本发明的多肽是融合多肽,其包含KzPG结构域和选自间隔区、SNAP和/或DBP的一个或更多个其他结构域。在一个特别的实施方案中,所述融合多肽包含一个或更多个间隔区以及KzPG、SNAP和DBP结构域。
多核苷酸
本发明还提供了编码本发明之多肽的多核苷酸。优选地,所述核苷酸是分离的或重组的多核苷酸。
术语“分离的多核苷酸”旨在意指通常已经从在其天然状态中与其缔合或连接的多核苷酸序列分离的多核苷酸序列。优选地,所述分离的多核苷酸至少60%不含、至少75%不含、并且更优选至少90%不含与其天然缔合的其他组分。此外,本文中术语“多核苷酸”与术语“核酸分子”、“基因”和“mRNA”可互换使用。
术语“重组”在多核苷酸的上下文中是指与其天然状态相比以改变的量存在于细胞中或无细胞表达系统中的多核苷酸。在一个实施方案中,所述细胞是不天然包含所述多核苷酸的细胞。然而,所述细胞可以是包含非内源性多核苷酸导致所编码多肽之量改变(优选提高)的细胞。本发明的重组多核苷酸包括已经从其所存在于的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统中分离的多核苷酸,并且在这样的细胞或无细胞表达系统中产生的多核苷酸随后被纯化,以除去至少一些其他组分。
“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任意片段。其可以是基因组或人工来源的DNA或RNA,双链或单链,并且与碳水化合物、脂质、蛋白质或其他材料组合以实施本文中所限定的特定活性。
可以使用本技术领域中的标准方法来分离编码包含可变区之多肽的DNA。例如,引物可以设计为与在目的区侧翼的可变区内的保守区退火,并且这些引物可以随后用于扩增插入的核酸,例如通过PCR。合适的方法和/或引物在本领域中是已知的和/或描述于例如Borrebaeck(编辑),1995和/或Froyen等,1995。用于这样的扩增方法的模板DNA的合适来源可以来自例如杂交瘤、转染瘤和/或表达包含可变区之蛋白质的细胞(例如本文中的描述)。
本发明的多核苷酸可以编码本发明的完整多肽。或者,所述多核苷酸可以编码本发明之多肽的重链或轻链。因此,各自编码重链或轻链之一的两种多肽可以在单个细胞中产生和表达以产生本发明的多肽。
优选地,所述多核苷酸编码可变区的支架区以及一个或更多个CDR。最优选地,本发明的多核苷酸编码可变区的支架区和所有三个CDR。本发明的多核苷酸可以被诱变以在CDR的氨基酸序列中以及还可能在支架区的氨基酸序列中产生变化。本领域技术人员将会知晓用于该目的的合适方法。
本发明的多核苷酸还可编码蛋白质缀合物,其能够或不能够如本文中所述与本发明的多肽缀合。
多肽产生
本文中公开的多肽可以通过本领域中已知的任意方法合成,例如通过重组多肽的产生和回收以及通过多肽的化学合成。因此,本发明还提供了用于产生本发明之多肽的方法。
本发明的多肽可以在还原性或非还原性条件下产生。优选地,本发明的多肽在还原性条件下(例如在宿主细胞的胞质中)产生。
在重组多肽的情况中,编码所述重组多肽的核酸优选地放置于一个或更多个表达载体中,其随后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中,所述宿主细胞例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞,例如猿COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,以在重组宿主细胞中获得蛋白质的合成。关于编码免疫球蛋白之DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等,(1993)和Plückthun(1992)。实现这些目的的分子克隆技术是本领域中已知的并且描述于例如Ausubel或Sambrook。很多种克隆和体外扩增方法适合用于重组核酸的构建。产生重组免疫球蛋白的方法也是本领域中已知的。参见US4,816,567、US5225539、US6054297、US7566771或US5585089。
分离之后,编码本发明之多肽的核酸优选地插入到表达构建体或可复制载体中用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于在无细胞系统或在细胞中表达。优选地,所述核酸与启动子可操作地相连。
如本文所用的,术语“启动子”采用其最宽泛的含义并且包括基因组的转录调节序列,包括TATA盒或起始元件,其是准确的转录起始所需要的,带有或不带有额外的改变核酸表达的调节元件(例如上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子),例如响应于发育和/或外部刺激,或者以组织特异方式。在本上下文中,术语“启动子’’也用于描述重组体、合成或融合核酸、或衍生物,其赋予、激活或增强与其可操作地相连之核酸的表达。优选的启动子可以包含额外的一个或更多个调节元件的拷贝以进一步增强所述核苷酸的表达和/或改变所述核苷酸的空间表达和/或时间表达。
本文中使用的术语“可操作地相连”意指安置与核酸有关的启动子,从而使所述核酸的表达被所述启动子控制。
本发明还考虑无细胞表达系统。例如,编码本发明之多肽的核酸可以与合适的启动子(例如T7启动子)可操作地相连,并且所产生的表达构建体暴露于足以转录和翻译的条件。已经描述用于体外表达或无细胞表达的典型表达载体,并且其包括但不限于TNT T7和TNT T3系统(Promega)、pEXP1-DEST和pEXP2-DEST载体(Invitrogen)。
用于在细胞中表达的很多载体是可得的。载体组分通常包括但不限于下列的一种或更多种:信号序列、编码本发明之多肽的序列(例如,源自本发明提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。技术人员将知晓用于表达蛋白质的合适的序列。例如,示例性的信号序列包括原核分泌信号(例如,pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定的肠毒素II)、酵母分泌信号(例如,转化酶前导序列、α因子前导序列、或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如,单纯疱疹病毒的gD信号)
在一个优选的实施方案中,将编码本发明之多肽的多核苷酸插入到特别适合用于在本文中所述RED系统中表达的载体。因此,所述载体可以特别地适合用于在细菌细胞内表达。例如,所述载体可以包含用于将编码本发明之多肽插入到所述载体中的位点,以及编码第二多肽的开放阅读框,所述第二多肽与本发明的多肽缔合以形成可以保留在内部或可以附着至经透化细菌细胞之细胞壁的蛋白质复合物。合适的载体描述于WO2011/075761中。
优选地,所述载体还能够在细菌细胞内独立于宿主基因组地复制。合适的载体包括质粒、病毒和黏粒以及线性DNA元件,例如大肠杆菌的线性噬菌体N15和/或复制独立于细菌细胞基因组的染色体外DNA。
技术人员将能够容易地确定适合用于在本发明的方法中表达多肽的细菌菌株。本领域技术人员将理解适合用于本发明之方法的革兰氏阴性细菌,包括例如沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌、志贺菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、鲍特杆菌属(Bordetella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)和嗜组织菌属(Histophilus)。在一个优选的实施方案中,所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。
可以包含在本发明之载体中的示例性启动子包括在原核生物中有活性的那些(例如,phoA启动子,β-内酰胺酶和乳糖启动子系统,碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子)。这些启动子对于在包括真细菌的原核生物中的表达是有用的,所述真细菌例如革兰氏阴性和革兰氏阳性生物,例如肠杆菌科如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌属(Serratia)例如黏质沙雷菌(Serratia marcescans)、和志贺菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、以及链霉菌属(Streptomyces)。优选地,所述宿主是大肠杆菌。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446),尽管其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)、DH5α或DH10B也是合适的。
在哺乳动物细胞中有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-α启动子(EF1),小核RNA启动子(U1a和U1b)、α-肌球蛋白重链启动子、猿病毒40启动子(SV40)、劳斯肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、p-肌动蛋白启动子;杂合调节元件,包括CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL1651);人胚肾系(用于在悬浮培养物中生长的293或亚克隆的293细胞;幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
适合用于在酵母细胞(例如选自以下的酵母细胞:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe))中表达的典型启动子包括但不限于:ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
适合用于在昆虫细胞中表达的典型启动子包括但不限于OPEI2启动子、从桑蚕(Bombyx muri)中分离的昆虫肌动蛋白启动子、果蝇属(Drosophila sp.)dsh启动子(Marsh等,2000)和可诱导的金属硫蛋白启动子。用于重组蛋白表达的优选的昆虫细胞包括选自以下的昆虫细胞:BT1-TN-581-4细胞和草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞(例如,sf19细胞、sr21细胞)。适合用于表达核酸片段的昆虫包括但不限于果蝇属。还考虑使用草地贪夜蛾。
用于将分离的核酸分子或包含所述核酸分子的核酸构建体引入到细胞中用于表达的方式是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入到细胞中的方式包括显微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、通过脂质体介导的转染(例如通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击(microparticle bombardment)(例如通过使用包被DNA的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA)等。
用于产生本发明之蛋白质的宿主细胞可以在多种培养基中培养,取决于所用的细胞类型。可市购的培养基例如Ham′s F10(Sigma)、最低极限培养基((MEM),Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM),Sigma)适合用于培养哺乳动物细胞。用于培养本文中所讨论的其他细胞类型的培养基是本领域中已知的。
支架序列:
目前为止,胞内抗体(intrabody)(抗体分子,其序列已经被改造或演化为更高稳定性,从而使得其可以在胞质中高效地折叠)之结构区的序列(即非CDR序列)与同源种系基因组序列显著地不同。如本文中所公开的,该发明人已经筛选并确定与同源种系基因组序列一致或密切相关的人抗体可变区序列,并且其在非氧化性环境中表达时允许正确折叠和提高的稳定性。用于在本发明中使用的优选序列如下文所述。对于任何本文中所描述的可变区序列,应理解的是,本领域技术人员将能够鉴定CDR(例如其中很多已经在NCBI数据库中鉴定)和保留的支架区。在本文中描述的每个可变区中CDR的具体实例在图7中显示。
IGHV3-23
在一个优选的实施方案中,本发明的多肽包含免疫球蛋白可变结构域之VH3家族的重链可变区(VH)。优选地,所述VH为IGHV3-23(SEQ IDNO:3)。
IGHV3-23,也称作DP-47,属于人Ig可变结构域的VH3家族。VH3家族占VH基因的功能性成员的43%(22/51)并且IGHV3-23在VH谱中已被引用最高度表达的基因(Stewart等,1993)。还发现其在B细胞中以高频率产生Ig重排(Brezinschek等,1997)。由于其在天然Ig谱中的高频率,其也频繁地从人V区的噬菌体展示文库中分离(Griffiths等,1994)。其也被用作合成文库中的支架伴侣(Jirholt等,1998;Pini等,1998;Soderlind等,2000;Ge等,2010)。IGHV3-23在本发明人的研究中还被选作重链可变区伴侣以鉴别稳定的、可溶性抗体可变区支架。
优选地,本发明的多肽包含抗体重链可变区(VH),其包含与SEQ IDNO:3之IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区。例如,所述支架区可以与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性。优选地,本发明的多肽包含抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少96%同一性的支架区。所述支架区包含所有排除CDR残基的可变区残基。因此,本发明的多肽可以包含支架区,其包含SEQ ID NO:3的第1-25、33-51、60-98位氨基酸(或者支架区,其氨基酸序列与这些氨基酸的序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性)。或者,本发明的多肽可以包含支架区,其包含SEQ ID NO:3的第1-25和33-98位氨基酸(或者支架区,其氨基酸序列与这些氨基酸的序列具有至少至少90%、95%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性)。在另一个替代方案中,本发明的多肽可以包含支架区,其包含SEQID NO:3的第1-51和60-98位氨基酸(或者支架区,其氨基酸序列与这些氨基酸的序列具有至少至少90%、95%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性)。
本发明的多肽可以包含任意CDR序列。因此,本发明的多肽可以包含IGHV3-23的CDR序列(即,SEQ ID NO:3第26-32、52-59位氨基酸)。或者,本发明的多肽可以包含任意其他CDR序列。因此,VH3可变区的支架区可以作为可插入任何给定CDR序列的模板。可以随机产生CDR序列。作为替代或补充,所述CDR序列可以是半随机产生的(随机的给CDR中的每个特定氨基酸位置分配一个选自所有可能氨基酸之子集的氨基酸残基,已知所述子集在CDR中的给定氨基酸位置是必须的或特别偏好的)。
或者,所述CDR序列可以来自另一个抗体。因此,来自例如人抗体的CDR可以移植到VH3可变结构域支架。应理解,本领域技术人员可使用多种方法以确保如本文中所限定的支架区包含取自人抗体的一个或更多个CDR序列。优选地,这样的方法包括将一个或更多个CDR编码序列克隆到编码本发明之多肽的多核苷酸中,如在下文中更详细的描述。所述CDR编码序列可以通过靶向或随机诱变而另外地变化,以提供多种包含多种不同不同CDR序列的多肽。这样的方法可以应用在CDR1、CDR2和CDR3中的任一个或其组合。
可以以任意组合将任意一个或更多个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)的序列引入本文中所描述的可变结构域支架。优选地,至少将CDR3的序列引入本文中所描述的VH3可变结构域支架。
此外,引入本文所述的VH3可变结构域支架的CDR序列的长度可以变化。例如,可将15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的CDR3序列插入所述支架。本发明人发现长度少于12个(例如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个,并且最优选7个)氨基酸的缩短的CDR3序列表现出增强的稳定性。
IGHV3-23的IGK和IGL轻链伴侣
本发明的发明人,仅通过应用scFv融合在其RED平台中可溶的标准(与先前进行的在体内将抗体结合抗原靶标的功能性筛选相反并且其因此筛选从其各自的种系序列充分地突变的抗体)能够筛选在V区内还没有突变的天然轻链。因此,他们能够鉴别在IGHV3-23scFv融合之后赋予可溶性的种系序列。这具有显著的益处,确保VL和VH结构域的构建的人工支架文库在序列上与丰富的人抗体蛋白质是一致的,从而最小化免疫识别并拒绝延长任何衍生物的暴露。
因此,本发明的多肽优选地包含与人种系IGHV3-23序列组合的免疫球蛋白可变结构域之VLλ1、3或6家族的抗体轻链可变区(VL)。优选的VLλ1、3或6家族成员包括IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ IDNO:9所示)和IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示)。因此,本发明的多肽优选地包含抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一的支架区具有至少90%的同一性的支架区:IGLVl-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLVl-44(如SEQ ID NQ:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)和IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示)。例如,所述支架区与以下任一的支架区有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)和IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示)。
最优选地,IGHV3-23的VL伴侣是IGLV3-1(SEQ ID NO:6)。因此,本发明的多肽优选地包含抗体轻链可变区(VL),其包含与IGLV3-1(SEQID NO:6)的支架区至少90%同一性的支架区。例如,所述支架区与IGLV3-1(SEQ ID NO:6)的支架区有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。IGLV3-1的支架区可以包含SEQ IDNO:6的氨基酸1-23、32-48、56-89。从而,本发明的多肽可包含抗体轻链可变区(VL),其包含SEQ ID NO:6的氨基酸1-23、32-48、56-89(或者其氨基酸序列与这些氨基酸序列有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性)。
编码具有可变CDR3区之IGLV3-1::IGHV3-23支架的多核苷酸序列的优选实例和对应的经翻译氨基酸序列在图8中举例说明。
优选地,本发明的多肽包含VL可变结构域的支架区(例如本发明的多肽可以包含IGHV3-1的支架区,例如SEQ ID NO:6的氨基酸1-23、32-48、56-89)。再者,本发明的多肽可以包含任意CDR序列。因此本发明的多肽可以包含以下任意的氨基酸序列:IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21和/或IGLV6-57。或者,本发明的多肽可以包含任意其他CDR序列。因此,VL可变结构域的支架区可以作为可插入任意给定CDR的模板,如以上描述的关于VH3可变结构域支架。因此,所述CDR序列可以是随机产生的。作为替代或补充,所述CDR序列可以是半随机产生的(通过随机的将选自所有可能氨基酸之子集的氨基酸残基分配到CDR中的每个特定氨基酸位置,已知所述子集在CDR中的给定氨基酸位置是特别偏好的)。
或者,所述CDR序列可以来自其他抗体。因此,可以将来自例如人抗体的CDR移植到VL可变结构域支架上。本领域的技术人员将意识到多种不同的方法是可用的以确保如本文所限定的支架区包含一个或更多个取自人抗体的CDR序列。此外,人抗体的CDR序列在插入本文中所描述的VL可变结构域支架之前可以被随机的诱变。
可以将CDR1、CDR2和CDR3之序列的一个或更多个以任意组合插入本文中所描述的VL可变结构域支架。优选地,至少将CDR3的序列插入本文中所描述的VL可变结构域支架。
此外,插入到本文所述的VL可变结构域支架的CDR序列中的长度可以变化。例如,可将15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的CDR3序列插入所述支架。本发明人发现长度少于12个(例如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个,并且最优选7个)氨基酸的缩短的CDR3序列表现出增强的稳定性。
合成的多肽文库
可以在多种蛋白质展示平台中克隆并表达多肽序列的文库以选择针对期望靶标的亲和蛋白。因此,本发明提供了包含多种本发明之多肽的文库。在一个优选的实施方案中,所述文库可以通过鉴别“亲本”多肽或多核苷酸序列并改变所述序列来产生多种变体序列以形成文库。可以通过合适的方法例如通过位点定向诱变或随机诱变进行改变。文库构建的合适的方法是本领域中已知的。
如以上表明的,可以直接地从生物来源克隆可变结构域,使得结构序列和CDR二者都如通过V(D)J重组形成而存在。或者,所述抗体可以部分地区或全部地用CDR和从头合成组装的结构区合成。例如,单个人工支架代表一对通常表达的或特别稳定的,可以用于在宿主生物体中最优表达的抗体基因。甚至可以在单个反应中使用重叠寡核苷酸组装完整的支架和CDR,例如由Ge等(2010)所描述。
用于在抗原结合CDR中构建多样性的方法已经被现有技术完全地描述了。它们包括从mRNA、从天然的或预免疫的免疫细胞获得CDR;通过分析经核对的抗体序列来设计并合成CDR;用基于经核对的抗体序列的加权氨基酸分布来设计与合成CDR;采用随机的、无偏倚的CDR区。
每个Ig结构域(VL和VH)有三个CDR区(CDR1、CDR2和CDR3),其长度可变并且与抗原的界面接触有不同的频率。对VL和VH二者,在体内最多的变体CDR是CDR3,其环由V-J结构域(VL)或V-D-J结构域(VH)的外显子连接之间的重组形成。这代表了天然的免疫系统。然而,一旦B细胞被刺激用于扩增,随后也经常发生体细胞超突变以使CDR1和2多样化。
然而,用于将可变结构域的经克隆scFv文库构建到单个或数个VL和VH支架中是常见的,由于CDR多样性受限于CDR3,用氨基酸组合物和环长度变化计算靶结合。
在由本发明描述的稳定多肽的实例中,这允许scFv的整体(而不是天然变化的CDR3环区)变得与同源抗体基因的种系序列相同或相近。这允许筛选酷似人天然抗体谱的亲和蛋白,从而将可以启动患者免疫识别的经改造支架的序列差异最小化。由此,在本发明中,多肽文库可以包含在CDR3序列中彼此不同的多肽。
可以利用单一支架构建人工抗体文库或者其可以由多种支架构成。因此,本发明的文库可以包含一个或更多个具有本文中公开的重链和轻链可变区支架的特定组合的多肽以及一个或更多个具有本文中公开的重链和轻链可变区支架的另一不同组合的多肽。
例如,所述文库可以包含:
-一个或更多个包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的多肽,所述抗体重链可变区(VH)包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区,所述抗体轻链可变区(VL)包含与IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)的支架区具有至少90%同一性的支架区,其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点,以及
-一个或更多个包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的多肽,所述抗体重链可变区(VH)包含与如SEQ LD NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区,所述抗体轻链可变区(VL)包含与以下任意一个或更多个的支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(人SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-19(如SEQID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所述)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示),其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点。
由此,本发明的文库可以包含一个或更多个多肽,其具有本文中公开的重链和轻链可变区骨架的任意重组。
多种支架可以代表两大类人Ig基因,即与κ和λ轻链类配对的重链,或者它们可以是单一轻链支架与多种重链的混合物,或者轻链支架与单一重链的混合物。多个支架还可以从最稳的代表不同亚类的单一成员产生,或者可以是仅仅最稳定支架(属于任意类)的组合。
在本发明的例子中,多肽文库优选地由支架区构成,所述支架区与人IGHV3-23基因相同或近似相同(例如至少90、95、96、97、98或99%相同),与人基因的支架区(IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21或IGLV6-53)相同或近乎相同(例如至少90、95、96、97、98或99%相同)的序列可操作地相连接。所述文库可以以经验证的模式(例如scFv)构成重链和轻链基因的单一支架配对或者可以成为IGHV3-23基因与前述轻链基因之一种或更多种的支架对。本发明人证实从这些支架构建的文库在大肠杆菌胞质中具有优越的和期望的稳定性和可溶性。实际上,它是优越的胞内抗体文库,其与其同源种系基因同源的理想序列的不同仅存在于CDR环区。
本领域技术人员将会意识到,用于筛选具有作为VH基因(IGHV3-23)之伴侣的胞质可溶性多肽的方法,也可以用于筛选其他可变区(无论VL还是VH)的可溶性伴侣。此外,筛选胞质可溶性多肽的方法可以使用单一支架的变体迭代(iterate)以发现提高其稳定性和可溶性的突变。例如,已经被鉴定的任意支架对(IGHV3-23与IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21或IGLV6-57)可以用作在单一支架上变体之其他文库的模板,意图在亲本支架具有差的可溶性之温度下进行胞质筛选。
本领域有经验的从业人员还将意识到,多肽文库可以由前述的以低于100%丰度存在的多肽构成。由本发明描述的50%多肽,或者由本发明描述的25%多肽,或者由本发明描述的10%多肽构成的文库,将仍然起作用以产生具有期望稳定性特性的亲和蛋白。因此,本发明的多肽文库可以包含除了本发明的那些之外的多肽。
此外,尽管本发明人已经出人意料的发现用于描述的VH和VL结构域的在序列上与人种系基因相同或近乎相同的scFv支架在大肠杆菌胞质中具有优越的和期望的稳定性和可溶性,本领域有经验的从业人员将意识到,可以获得的这些序列比已报道的更有多态性,但仍作为有期望的可溶性特性的亲和蛋白。因此,本发明提供具有序列与本公开的支架区序列至多10%或5%相异,并且仍然起作用以产生具有期望可溶性和/或稳定性特性的亲和蛋白。因此,本发明的多肽可以包含与本文中公开的任意支架区序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的支架区序列。
本发明提供了多肽文库和多核苷酸文库(例如,DNA文库)二者。DNA文库是含有编码所述多肽之DNA插入片段(DNA片段)的重组载体的集合。DNA插入片段的来源可以是基因组、cDNA、合成或半合成。
编码本发明之多肽的DNA文库的克隆和构建可以使用本领域已知的方法进行。例如,Lutz和Patrick(2004)已经回顾了产生文库变异性的方法和用于在蛋白质工程中基因重组的策略。为了筛选展示的多肽变体,可以采用用于表面展示文库并且适用于本发明方法的策略(Becker等,2004;Kenrick等,2007;Miller等,2006;Daugherty等,2000)。
可以将核酸文库引入到大量的细菌细胞中,导致在每个细菌细胞中表达文库的成员。除了被表达之外,所述多肽被保留在经透化的细菌细胞中或者附着至细胞壁,以评价其功能或特征。多肽的核酸文库,例如,可以通过多种方法包括通过突变(例如点突变、缺失或插入或者通过重组事件)来引入。用于变体之文库的产生方法是本领域中已知的,并且包括易错PCR、DNA修复受损的细菌中DNA的合成、以及DNA的化学修饰。用于通过重组产生文库的方法是本领域中已知的并且包括基因洗牌(geneshuffling)、在高度重组发生的细菌中组装DNA、合成核酸文库组装等,或者其任意组合。以这种方式,编码多肽之多核苷酸的文库可以引入到大量的细菌细胞中,导致在每个细菌细胞中文库的一个或更多个成员的表达。
在一些实施方案中,文库包含多肽的两个或更多个变体,其中每个变体包含具有在氨基酸序列中(例如在CDR序列中)微小改变的独特多肽。文库可以具有至少2、至少5、至少10、至少50、至少100、至少1000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000、至少107或更多个成员。
筛选方法
本文中公开的多肽(或抗体)文库可以用于筛选与靶分子结合的多肽。应理解,可以在每个表达不同多肽或多肽变体的细胞之文库的情况中,或者在表达单一多肽的细胞之单一类型的情况中筛选或选择多肽。术语“靶分子’’是指与多肽结合或由多肽修饰的分子并且可以是例如抗原、酶、抗体、受体等。因此“靶分子”可以用于指底物例如酶底物或被评价用于结合的分子(例如,配体、表位、抗原、多聚化伴侣例如均二聚体伴侣或杂二聚体伴侣等,或其任意组合)。
因此,本发明提供了筛选与靶多肽结合之多肽的方法,所述方法包括将本发明的多肽与靶多肽相接处,并且确定本发明的多肽是否与靶多肽结合。优选地,在这样的方法中使用多种本发明的多肽。
许多合适的筛选方法是本领域中已知的,其可以根据本发明使用。
例如,所述方法可以包括蛋白质展示方法。最早的蛋白质展示方法是噬菌体展示(Smith,1985),在所述方法中,目的蛋白质与噬菌体的一种外壳蛋白(outer-coat protein)融合,从而其可以与野生型的蛋白质拷贝一起存在。例如,可以采用基于使用与pIII蛋白融合的M13丝状噬菌体的展示平台。
其他合适的展示方法包括“体外”展示方法,其中使用细胞翻译提取来表达蛋白质,并通过物理连接实现多肽与编码核酸之间的偶联(例如核糖体展示、mRNA展示)或通过附着到共用骨架上或膜内的封装,例如,在体外区室化(in vitro compartmentalization,IVC)中,其中mRNA在微团悬液中翻译,所述微团悬液还包含用于mRNA和蛋白质二者的微珠(磁性或琼脂糖)捕获系统。
另一个合适的多肽展示的方法是微生物表面展示,其包括将表达的多肽靶向定位到微生物细胞外部,所述微生物为革兰氏阴性或革兰氏阳性真细菌或酵母。蛋白质与将其连接到细胞表面的锚定结构域融合。锚定结构域可具有指导脂化或与细胞壁共价连接的模体,或其可与暴露的环区内的内在膜蛋白融合。
本申请证明本发明的多肽和多核苷酸用于包含无细胞表达系统的筛选方法时是特别有效的。在这样的表达系统中使用本发明的多肽和多核苷酸极大加快了多肽的筛选过程,表现出靶多肽的高表达、高溶解度和高亲和力。本发明的多肽(特别在还原性条件下)展示出高溶解度、稳定性和表达所产生的益处。
因此,本发明的多肽和多核苷酸特别适合用于这样的筛选方法,所述筛选方法包括本文中所描述的任意无细胞或体外表达系统或本领域中已知的其他方法。例如,本发明的多肽和多核苷酸序列特别适合用于包括核糖体展示、mRNA展示、顺式展示(cis-display)(其中表达的多肽保持与其编码多核苷酸序列相缀合)或本领域中已知的其他此类方法的筛选方法。
此外,本申请表明本发明的多肽和多核苷酸在用于基于蛋白质展示方法的筛选方法时是特别有效的。例如,本发明的多肽和多核苷酸在用于包括噬菌体展示(例如,裂解性λ噬菌体、M13丝状噬菌体、裂解缺陷型噬菌体和其他本领域中已知的方法)的筛选方法时是特别有效的。在一个实例中,本发明的多肽和多核苷酸在用于包括λ噬菌体的筛选方法时出人意料地有效。
此外,本发明的多肽和多核苷酸可以用于基于裂解缺陷型噬菌体(例如,如描述于国际专利申请号PCT/AU2012/000761,其内容通过引用全文并入本文)与本文中和WO2011/075761中所描述的RED系统相组合的筛选方法。
试剂盒
用于实施本发明方法的必要组分可以以试剂盒的形式方便地提供。如将被本领域技术人员理解的,在试剂盒中的多种组分可以以单个容器或等等分量供应,或可以将溶液组分以不同的组合并且在不同浓度组合来实现本发明方法的最佳性能。确定试剂盒的哪些组分可以组合使得所述组分在使用前保持处于稳定的形式在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的试剂盒通常将以最小量含有载体,其包含用于将编码本发明之多肽的多核苷酸插入载体的位点,和编码第二多肽的开放阅读框,所述第二多肽与第一多肽缔合以形成可以保留在经透化细菌细胞内的或者可以附着至其细胞壁的蛋白质复合物。优选地,所述试剂盒还含有用于透化细菌细胞的试剂。在一个实施方案中,所述试剂盒还包含细菌细胞,优选革兰氏阴性细菌。其他另外的组分,或者由终端使用者提供的其他组分(如果需要)也可以包括在试剂盒中。
用途
本发明的多肽可用于多种应用(包括研究、诊断和治疗应用)。依赖于所述多肽所结合的抗原,所述多肽可用于将化合物递送至细胞(例如杀死细胞或阻止生长)和/或用于成像和/或用于体外测定。在一个实例中,所述多肽可用于成像和将细胞毒剂递送至细胞,即所述多肽与可检测的标签和细胞毒剂相缀合或者组合物包含蛋白质混合物的组合物,其中一些蛋白质与细胞毒剂缀合并且一些蛋白质与可检测标签缀合。
本文中所描述的多肽还可以充当抑制剂来抑制(其可以降低或阻止)(a)(例如配体、抑制剂)与受体结合,(b)受体信号功能,和/或(c)刺激功能。充当受体功能之抑制剂的多肽可以直接地或间接地(例如通过引起构象改变)阻断配体结合。鉴于本文中所描述的优选多肽的稳定性和大小,本文中所描述的多肽可以特别地适合于涉及在宿主细胞内发生结合相互作用的应用。
药物组合物和治疗方法
本发明的多肽(同义词:活性成分)可用于肠胃外、表面、经口或局部施用、气雾剂施用、或用于预防性或治疗性治疗的透皮施用。所述药物组合物可以以多种依赖于施用方法的单位剂型来施用。例如,适合用于经口施用的单位剂型包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂和锭剂或通过肠胃外施用。应当意识到,本发明的药物组合物经口施用时应当避免被消化。这通常通过将蛋白质与组合物复合以使其抗酸性和抗酶水解,或通过将化合物包装在合适的抗性载体(例如脂质体)中。保护蛋白质免受被消化的方式是本领域中已知的。
通常地,多肽的治疗有效量将被配制成组合物用于向对象施用。短语“治疗有效量”是指量足以促进、诱导和/或增强在对象中的治疗或其他治疗效果。如将是显而易见的,本发明的蛋白质在这些制剂中的浓度可以很大的不同,并且将主要基于根据所选特定施用方式和患者需求的流体体积、黏度、体重等进行选择。取决于疾病的类型和严重程度,治疗有效量可以是约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的分子,或者例如通过一次或更多次分开的施用,或者通过持续的输注。典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。待施用于患者的蛋白质的示例性剂量范围为患者体重的约0.1至约10mg/kg。对于重复施用持续数天或更长的,取决于条件,持续治疗直到发生疾病症状的期望抑制。示例性的施用方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量,之后每周维持约2mg/kg蛋白质的剂量。其他剂量方案可以是有用的。该治疗的进展易于通过常规技术和测定进行监测。
或者,本发明的多肽以浓缩剂量配制,其在施用于患者前稀释到治疗有效剂量。
本发明的药物组合物对于肠胃外施用是特别有的,例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下、经皮或其他这样的途径(包括蠕动施用和直接滴注到肿瘤或疾病部位中(腔内施用))注射。用于施用的组合物通常将包含本发明之蛋白质溶于可药用载剂(优选地水载剂)的溶液。可使用多种水载剂,例如缓冲盐水等。其他示例性载剂包括水、盐水、林格液(Ringer′ssolution)、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用非水载剂例如混合油和油酸乙酯。还可以使用脂质体作为载剂。所述载剂可以含有少量的添加剂(例如缓冲剂或防腐剂)以增强等张性和化学稳定性。所述组合物可以含有所需的可药用的辅助物质以接近生理条件,例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等,例如,乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
用于制备药物组合物的技术是本领域中公知的,如由Remington′sPharmaceutical Sciences,16th版Mack Publishing Company,1980示例。
WO2002/080967描述用于施用包含蛋白质的气雾化组合物用于治疗例如哮喘的组合物和方法,其也适用于施用本发明的蛋白质。
本发明化合物的合适的剂量将根据特定的蛋白质、待诊断/治疗/预防的病症和/或被治疗的对象而变化。确定合适的剂量在技术人员的能力之内,例如通过开始用亚最佳剂量和递增地改变剂量以确定最佳的或有用的剂量。或者,使用来自细胞培养测定或动物研究的数据,以确定用于治疗/预防的合适剂量,其中合适的剂量在循环浓度范围内,所述循环浓度包括具有很少或没有毒性之活性化合物的ED50。所述剂量可以在此范围内变化,根据所使用的剂型和施用的途径。可以从细胞培养测定初步地估计治疗/预防有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆溶度范围包括如在细胞培养中确定的IC50(即化合物的浓度实现症状的半最大化抑制)。这样的信息可以用于更精确地确定在人中的有用剂量。可以通过例如高效液相色谱法测量血浆中的水平。
本发明的多肽可以在药物组合制剂或作为联合治疗的剂量方案中与第二化合物组合。药物组合制剂或剂量方案的第二化合物优选地具有与蛋白质之组合的互补活性,使得它们不会不利地互相影响。
所述第二化合物可以是化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。这样的分子以有效用于预期目的的量合适地存在于组合中。含有本发明之蛋白质的药物组合物还可以具有治疗有效量的化学治疗剂,例如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合剂。还可以使用药物“缓慢释放”胶囊或组合物。缓慢释放制剂一般设计为长时间地给出恒定的药物水平并且可以用于递送本发明的化合物。
本发明还提供了在对象中治疗或预防病症的方法,所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明之蛋白质。
本文中使用的术语“预防”在预防病症的情况中包括施用本文中所描述之量的蛋白质足以阻止或阻碍特定疾病或病症的至少一种症状的发生。
本文中使用的“治疗”包括施用治疗有效量的本文汇中描述之抑制剂和/或药剂足以降低或消除特定疾病或病症的至少一种症状。
本文中使用的术语“对象”应当被理解为意指任何动物(包括人),优选哺乳动物。示例性对象包括但不限于人、灵长类、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如狐狸、鹿)。优选地,所述哺乳动物是人或灵长类。更优选地,所述哺乳动物是人。
本文中使用的“病症”是正常功能的干扰或中断,并且不限定于任何特定的条件,并且将包括疾病或紊乱。在一个实例中,所述病症是癌症或免疫病理疾病。
示例性的癌症包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃癌症(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。
免疫病理学是具有免疫病因之疾病的研究并且免疫学疾病是任何由免疫球蛋白与抗原的反应引起的病症。因此,“免疫病理疾病”可以被定义为从对象的免疫系统与抗原的反应产生的疾病。免疫病理疾病包括自身免疫疾病和超敏应答(例如I型:过敏性反应(anaphylaxis)、麻疹(hives)、食物过敏、哮喘,II型:自身免疫性溶血性贫血、输血反应,III型:血清病、坏死性脉管炎(necrotizing vasculitis)、肾小球肾炎、类风湿关节炎、狼疮,IV型:接触性皮炎,移植排斥)。自身免疫性疾病包括风湿性疾病(如,例如,类风湿关节炎、干燥综合征(siogren′s syndrome)、硬皮病、狼疮(例如SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎,冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)、骨关节炎、自身免疫性胃肠和肝疾病(例如,炎性肠病(例如,溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、和乳糜泻(celiac disease)、脉管炎(例如,ANCA相关脉管炎(包括Churg-Strauss脉管炎、Wegener肉芽肿病和多动脉炎),自身免疫性神经病(例如,多发性硬化症、眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonusmyoclonus syndrome)、重症肌无力、视神经脊髓炎、和自身免疫性多发性神经病(autoimmune polyneuropathies))、肾疾病(例如,肾小球肾炎,Goodpasture综合征和Berger病),自身免疫性皮肤病学疾病(例如银屑病、荨麻疹、麻疹、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液学疾病(例如,血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎(uveitis)、自身免疫性听觉疾病(例如内耳疾病和听力损失),白塞病(Behcet′s disease),雷诺综合征(Raynaud′s syndrome),器官移植和自身免疫性内分泌疾病(例如,糖尿病相关自身免疫病,例如胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM),爱迪生病(Addison′s disease)和自身免疫性甲状腺病(例如,格雷夫斯病(Graves′disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、干燥综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
在另一个实施方案中,所述疾病是炎性疾病。炎症是身体组织对发炎或损伤的保护性应答并且可以是急性的或慢性的。因此,炎性疾病包括涉及以下的疾病:中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞,其中发生细胞因子释放、组胺释放、氧化爆发(oxidative burst)、吞噬作用、其他颗粒酶释放和趋化作用。超敏应答(根据如上所定义的免疫病理疾病)还可以被视为炎性疾病(急性或慢性),因为其常常涉及补体激活和招募/浸润多种白细胞例如嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞等。
本发明的组合物将以与剂型匹配的方式并且以治疗/预防有效的量施用。以多种方式(例如通过摄取或注射或吸入)容易地施用制剂。
另一些治疗方案可以与本发明的多肽联合施用。联合治疗可以以同时或依次的方案施用。当依次施用时,所述组合可以在两次或更多次施用中施用。联合施用包括共同施用,使用分开的制剂或单一的药物制剂并且以任一顺序持续施用,其中优选地有两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性的时间段。
现在将参照下列非限制性实施例来进一步描述本发明。
实施例
实施例1.将人VL亚文库克隆到IGHV3-23展示载体中
筛选用于将会在大肠杆菌胞质中充分表达并可溶的IGHV3-23的人轻链伴侣,本发明人克隆了所有10个λ和5个κ功能性轻链家族作为与IGHV3-23融合的scFv。所述scFv文库被克隆到阿拉伯糖可诱导的表达构建体中并且与赋予细胞壁结合的下游结构域(肽聚糖(PG)结合结构域)、表达报道子结构域(SNAP;New England Biolabs)和DNA结合结构域(DBP)以该次序进一步融合。当外部和内部细菌宿主细胞膜通过去污剂或有机溶剂透化时,这些下游结构域能够通过将融合蛋白锚定到DNA和细胞壁二者保持scFv部分。
可以从来自人外周血单核细胞(PBMC)制备的cDNA扩增λ和κ轻链家族。分别地在7和11次PCR反应中扩增κ和λ轻链亚家族。每个亚文库独立地第一次筛选以广泛地表征含有明显可溶性成员之文库的百分比。随后作为单个克隆筛选含有可评估的可溶性成员百分比(>1%)的亚文库。
寡核苷酸引物基于由Hust和Dubel(2010)描述的序列,具有末端修饰用于通过BsmBI克隆。对初始设计的针对轻链的C1恒定结构域的反向引物进行进一步的改变。这被认为包含非必要的序列和经设计针对轻链之J区域的简并引物。用于扩增轻链区的寡核苷酸序列列于表2中。
表2.用于扩增轻链区的寡核苷酸序列
使用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)在两轮PCR中扩增用于λ和κ轻链亚文库的VL基因。使用BsmBI(New England Biolabs)将每个亚文库克隆到RED展示载体中。估计每个文库生产约20至40,000个集落。
实施例2.使用保留封装展示(RED)筛选人scFv融合
作为可溶性的初始筛选,刮取每个文库平板并悬于10mL的LB/甘油(10%)中。悬液的一部分(约50uL)在1mL的LB培养基(每升10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl)中于37℃生长1小时并且随后用0.2%阿拉伯糖诱导并在25℃进一步生长2小时。在这一点,通过将细菌沉淀在LB培养基中0.5%正辛基-β-D-硫代葡糖苷(8TGP)中在25℃下重悬10分钟以对细胞进行透化。经透化细胞通过在LB培养基中沉淀并重悬洗涤一次,在通过添加SNAP-表面488试剂(S9124S;New EnglandBiolabs)标签经诱导的scFv融合蛋白并且在25℃孵育20分钟之前。经标记的细胞随后通过在PBS中沉淀和重悬而再次洗涤,然后安放样品用于通过荧光显微术观察。
显微镜检查显示尽管所有文库在每个视野内有一些细胞,其表现为良好表达且可溶,仅发现代表Vλ1、Vλ3和Vλ6进化枝的亚文库具有>1%的细胞具有可溶性形态。因此除了Vλ1、Vλ3和Vλ6以外的所有亚文库被认为是不具有足够高频率的可溶性克隆并且不再继续筛选。
将亚文库Vλ1、Vλ3和Vλ6稀释涂板以产生单个克隆并单独地筛选可溶性。因此,将亚文库Vλ1、Vλ3和Vλ6稀释涂板允许清楚地挑选单个集落,随后对其进行诱导用于表达并如上所述准备用于显微术。
图1表明,良好表达的可溶性scFv克隆的典型外观(1A和插图),伴随良好表达的但不溶的cFv克隆(1B和插图)。所述细胞在如上所述的透化之后用SNAP荧光团标记。不溶性克隆的独特聚集与可溶性克隆的更分散和周边定位有所不同。
然后经证明可溶性表达的scFv克隆在37℃于100μg/mL氨苄青霉素选择下过夜生长,使用标准方法(Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001))制备质粒并且用所述表达构建体的上游启动子区中的引物测序。然后使用NCBI BLAST算法针对人基因组GenBank数据库分析测序文件。
图2代表经选择可溶性克隆的多重比对,所述经选择可溶性克隆与VL基因IGLV3-1、IGLV3-21和IGLV6-57高度相似或完全一致。使用CLUSTAL X准备所述多重比对。在比对之上的可溶性克隆(通过分离编号列出)的图像对应于下面的比对序列。
克隆通过分离和测序检查。
筛选779个可溶性个体的亚文库成员产生IGLV1-40(SEQ ID NO:18)的11个克隆,IGLV1-44(SEQ ID NO:21)的2个克隆,IGLV1-47(SEQ ID NO:24)的3个克隆,IGLV1-51(SEQ ID NO:15)的3个克隆,IGLV3-1(SEQ ID NO:6)的25个克隆,IGLV3-19(SEQ ID NO:27)的2个克隆,IGLV3-21(SEQ ID NO:9)的4个克隆,IGLV6-57(SEQID NO:12)的18个克隆。可溶性scFv克隆之序列的分析显示对于成员IGLV1-40、IGLV1-51、IGLV3-1和IGLV3-19有明显的天然(naive)序列,其在体内B细胞呈递期间未经亲和力选择或成熟。此外,某些IGLV6-57克隆有高可溶性,与种系序列的翻译比仅具有1个(2个克隆)或2个(1个克隆)氨基酸改变,总体的同一性分别为99%和98%。
因此,与Tse等,(2002)(其发现包含VH3结构域的可溶性抗体与VLκ1和4伴侣完全配对)在酵母的胞质中先前筛选可溶且稳定之人抗体的结果相反,本发明人发现VLκ亚文库作为一类具有差的表观可溶性,伴随>99%的VLκ亚文库克隆特异性地与IGHV3-23结构域配对,在大肠杆菌中较差地表达或者显示错误折叠的信号。Tissot等(WO03/097697)还对可溶性人scFv进行了Y2H筛选,并且报道其可溶性scFv是与VH1a、VH1b或VH3之成员最密切相关的序列,与序列组合的进化枝与VLκ1或VLλ1或VLλ3进化枝的成员最密切地相关。然而,其最优构造是与VH1b配对的VLλ3。
然而,Tse等(2002)和Tissot(WO03/097697)二者都应用功能性筛选(即抗体与抗原靶标体内结合)作为可溶性的进一步要求,其具有阳性Y2H信号的产出抗体需要以下二者:1)可溶性,和2)靶标结合,并且由此根据需要基本上从其种系序列突变。
在与IGHV3-23结构域可溶性融合的筛选中分离的VL成员的大多数是IGLV3-1,也称作DPL23。虽然一些克隆具有众多突变,显著数目与IGLV3-1种系V序列(SEQ ID NO:4)相同,表明当所述种系序列与IGHV3-23结伴时在胞质中固有的稳定和溶解度。
IGLV3-1在人免疫系统中有适度的高表达,占λ轻链的15%(Knappik等,2000),但不是最丰富的经表达λ成员(DPL11)。在已发表的文献中未表征,缺乏任何特定引用,并且没有报道具有高度一致的结构。尽管先前已经构建使用IGHV3-23的人工scFv支架文库,主要基于其体内的相对表达水平选择VL伴侣,即高表达的DPK22(Pini等,1998;和Ge等,2010)、DPL3(亦称IGLV1-47)(Kobayashi等,1997;Soderlind et a1,2000)和DPL16(亦称IGLV3-19)(Viti等,2000)。
Ewert等(2003)在Morphosys HuCALTM文库上进行的人可变结构域谱的热稳定性的总体分析是仅有的已发表报道。在其题为“BiophysicalProperties of Human Antibody Variable Domains”的文章中,作者检测了当在大肠杆菌周质中表达时,单个结构域的稳定性以及结构域对(VL::VH)的稳定性二者。
已表明,与IGHV3-23相关的VH3共有序列对于重链可变区的热稳定性和可溶性最稳定,而Vκ3共有序列是最稳定的轻链可变区。
产生最稳定配对的VH::VL组合是H3::κ3、H1b::κ3、H5::κ3和H3::κ1之间形成的那些。值得注意的是,没有一个最稳定的配对包括VL3家族。此外,使用VH3伴侣(IGHV3-23)构建我们的scFv文库,(以其自身)不足以在大肠杆菌胞质中表达时赋予融合蛋白稳定性,由于在大多数亚文库中绝大多数的克隆是错误折叠或差表达的。
总之,在现有技术的基础上,使用结构域IGHV3-23和IGLV3-1的组合作为scFv融合不能预测在还原性环境(例如大肠杆菌胞质)中表达时具有增强的稳定性和可溶性。
实施例3.scFv克隆的热稳定性测试
在25℃诱导并表达的VL亚文库的初始筛选之后,对所述scFv克隆进行进一步的筛选以对克隆和家族的热稳定性进行评级(grade)。
每个克隆在透化和用SNAP标记之前,在26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃和38℃的温度下诱导90分钟,如实施例2的描述。使用荧光显微术对克隆的可溶性进行评分,如实施例2的描述。
图3展示出两个克隆(一个IGLV3-1和一个IGLV3-21)的行为,在提高的温度下表达。所述scFv融合蛋白保持可溶,直到至少用于IGLV3-1克隆的36℃,但是IGLV3-21克隆在32℃至34℃显示错误折叠的迹象。
这一表达温度梯度表明,与IGLV3-1和IGLV6-57相关的或一致的scFv克隆被判定为具有最佳可溶性的类别,尽管其他λ基因的个体克隆也被表现出不同程度的可溶性。图4展示出从筛选分离的每类VL结构域的代表性克隆的可溶性。
通过显微术scFv之表观可溶性不是人为的,这通过将所述scFv片段、以及来自人Titin的下游127结构域亚克隆到具有C端FLAG表位的表达构建体中进行确认。scFv::127::FLAG融合蛋白用阿拉伯糖在范围为26℃至38℃的温度下诱导并且使用超声处理裂解大肠杆菌。通过离心(14K1分钟)从不溶的碎片和蛋白质聚集体分离可溶性蛋白质。
图4展示出IGLV3-1在大肠杆菌中于25℃表达时优异的可溶性。scFv::127::FLAG融合蛋白完全在可溶性的级分中。其未显示出总蛋白中的小级分的N端切割,但是这在蛋白质在非变性条件下提取时消失,表明其由8TGP洗涤剂的透化释放的周质蛋白酶的相互作用引起。
因此,由于来自大肠杆菌中可溶性筛选的IGLV3-1的高频恢复,其还表征用于可溶性scFv文库的示例性支架的必要特性,在胞质中于接近37℃的温度下稳定并且耐受多样化的CDR3环。在大肠杆菌胞质中在温度范围28℃至38℃下测试IGLV3-1的热稳定性。发现当与轻链J1和J2区、以及使用简并寡核苷酸作为引物在PBMC cDNA的PCR期间形成的J区偶联时,直至36℃都高度可溶。在36℃及以上,其表现一定程度的错误折叠。这通过免疫荧光和通过FLAG-标记的scFv的Western印记二者进行确认。
实施例4.IGLV3-1J结构域交换
用于扩增VL结构域的在表2中列出的简并寡核苷酸序列不得不将7个不同的λJ区引入人基因组(表3)。由此,通过筛选分离的克隆具有杂交λJ区,其代表可能降低其折叠稳定性的非典型序列。
表3.人λJ区
对具有骨架区之种系序列的最稳定IGLV3-1克隆的J区进行比较显示出与J区1和2/3最高的相似性。因此,用种系λJ1或J2/3序列(表3)替代杂交J区(“VFGTGTKLIIS'’(SEQ ID NO:79))以检测IGLV3-1支架的热稳定性会不会被进一步提高。在温度30℃、32℃、34℃、36℃和38℃之间测试变体。主观上地,感觉受测试克隆的λJ1比J2/3或者初始杂交J区给出稍微更好的折叠和可溶性。
图5表明具有λJ区替换为J1或J2的初始克隆(#8.93)的热稳定性行为。
实施例5.IGLV3-1和IGHV3-23对CDR3多样化的耐受
对于可用作亲和力文库骨架的scFv,其需要耐受在CDR3区的替换。对于在还原性环境(例如大肠杆菌胞质溶胶)中表达的scFv(其中缺乏稳定对结构域内二硫键的稳定),这是尤其真实的。
为测试优选的scFv支架(IGLV3-1::IGHV3-23)的稳定性,每个结构域的CDR3区被分别地多样化。因此,测试IGLV3-1和IGHV3-23基因二者对CDR3多样化的耐受。图2示出两个序列的围绕CDR3的区,以及假想的多样化。IGLV3-1 CDR3的2个氨基酸被“-NNNGGNNN-"(SEQ ID NO:29)区替代(其中N是除Trp、Gin、Lys、Glu、Met以外的氨基酸)。类似地,12个氨基酸的IGHV3-23 CDR3被“-NNNGGNNN-”(SEQ ID NO:29)区替代。分别地测试每个结构域的可溶性和作为克隆的混合文库的表达。此外,还测试随机挑选的单个克隆并对其进行测序以确定期望的多样性。
IGLV3-1 CDR3从91位残基起被替换,通过使用(反向)寡核苷酸序列的PCR修饰IGLV3-1结构域:
GATCAGGGTCTGAGACGAGACCGTCACTTTCGTACCGGTGCCGAACACCACAGTANNANNANNTCCGCCANNANNANNGTCCCACGCCTGACAGTAATAGTCAGC(SEQ ID NO:80)
该序列的(Fev/comp)翻译给出(其中“N”是除Trp、Gln、Lys、Glu、Met以外的氨基酸):
...ADYYCQAWD(91)NNNGGNNN TVVFGTGTKVTVS S(SEQ ID NO:81)
IGLV3-1CDR3替代是轰动性的成功。具有在30℃下出现具有蛋白质诱导的群体是具有很好表达的可溶性克隆。单独分析了40个克隆并且36个被评定为具有优秀的可溶性和表达。对4个失败的克隆和16个其他具有良好可溶性和表达之克隆的整个vL结构域进行测序。确认4个失败的克隆由于在用于扩增基因的长寡核苷酸引物中框移(frameshift)而失败。具有正确阅读框的所有其他受测试的克隆具有氨基酸的随机混合物,并且表现出种系IGLV3-1骨架非常耐受CDR3多样化。
因此,对于IGLV3-1,多样化的CDR3文库于30℃在大肠杆菌胞质中表达时的可溶性出人意料的高。约90%的克隆是可溶性的且具有高表达。10%的克隆具有低表达或不表达,或者错误折叠,进行测序,显示出框移,主要在必要的约100碱基长的反向引物区。在使用长寡核苷酸构建合成文库时,碱基缺失是常见的错误,并且其他团体已经发展了基于抗生素选择以富集框内(in-frame)等位基因的预筛选策略。(例如Ge等,2010)
VH结构域的CDR3区,IGHV3-23使用反向高核苷酸替代,类似于以上描述的方法,从残基98起通过使用(反向)寡核苷酸序列的PCR修饰IGHV3-23结构域:
GATCAGGGTCTGAGACCCGCTGCTCACGGTAACCATGGTACCTTGACCCCAAATATCAAACGCANNANNANNGCCANNANNANNTTTCGCACAGTAGTAAACAGC(SEQ ID NO:82)
该序列的(Fev/comp)翻译给出(其中“N”是除Trp、Gln、Lys、Glu、Met以外的氨基酸):
VYYCAK(98)NNNGNNN AFDIWGQGTMVT(SEQ ID NO:83)
经证明IGHV3-23与IGLV3-1结构域对CDR3多样化刚好一样强。80%受测试克隆显示出可溶性、高表达,而20%差表达的在测序后可以解释为是由于在骨架中的保守错配,或更常见地,在长的寡核苷酸引物的区域中单碱基对的缺失,从而改变蛋白质翻译的框。
因此,对于IGHV3-23,多样化的CDR3文库于30℃在大肠杆菌胞质中表达时的可溶性再次出人意料地高(约80%)。另外,融合蛋白的框移是很多阴性结果的原因。将CDR3环从12个氨基酸缩短至7个与亲代克隆相比也提高了该文库的可溶性。
图6A展示出具有经多样化IGLV3-1CDR3的4个独立克隆的可溶性和高表达。图6B展示出具有经多样化IGHV3-23CDR3之克隆的整个群体的样本。因此,概括地说,IGLV3-1::IGHV3-23骨架是构建亲和力文库的示例性支架,即与人种系序列有同一性并且保持与具有多样化序列的CDR3环之替代的强可溶性。此外,将所述支架与RED蛋白质展示方法在大肠杆菌胞质中组合能够同时筛选亲和力蛋白稳定性、表达二者和与靶分子的结合。所述支架在大肠杆菌胞质的还原性环境中是高度稳定和可溶性的,所述胞质中缺乏稳定的结构域内二硫键,其对于几乎所有其他scFv蛋白的折叠和稳定性是基本要求。该支架将能够在大肠杆菌胞质中低成本地产生亲和力试剂,用于研究、治疗或诊断用途,以及这样的试剂在哺乳动物细胞的胞质中用于靶向内源形蛋白质的用途。
实施例6.构建多样化的IGLV3-1::IGHV3-23scFv文库
多样化IGLV3-1::IGHV3-23支架,使用实施例5描述的策略将氨基酸序列‘NNNGGNNN’(SEQ ID NO:86)和‘NNNGNNN’(SEQ ID NO:87)分别引入VL和VH的CDR3区。
多样性的引入首先通过创建由如下的IGLV3-1之骨架序列和IGHV3-23之J区组成的基本支架:
骨架序列:
ATG GGA GAC GGT CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCG TGG GACtgagacctagacggtctct gcg TTT GAT ATT TGG GGT CAA GGT ACC ATG GTT ACCGTG AGC AGC TCG TCT CaG ACC(SEQ ID NO:88).
用PG和DNA结合结构域元件通过侧翼BsmBI位点将所述骨架克隆到RED胞质表达载体中。间插序列(VL J区和IGHV3-23骨架)(SEQ IDNO:89)在独立的质粒上编码,其充当使用简并引物(SEQ ID NO:90和91)之PCR的模板,所述简并引物分别包含VL和VH区在5’和3’端二者的CDR3多样性。这些引物序列具有末端BsaI限制位点,其能够将PCR产物无缝地克隆到支架中的合适取向的BsaI位点中。
间插序列:
ACT GTG GTG TTC GGC acc ggt acg aaa gtg acT gtc TCA TCT CAG ACC
GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAAGTCCAACTGCTGGAGTCCGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCATCCGGTTTTACTTTCAGCAGCTACGCGATGTCGTGGGTGCGCCAGGCACCGGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCGCCATCAGCGGTAGCGGCGGTTCTACGTATTATGCGGACAGCGTCAAGGGCCGTTTCACCATCAGCCGTGACAATTCCAAAAACACCCTGTACTTGCAGATGAACAGCTTGCGTGCGGAAGATACGGCTGTTTACTACTGTGCGAAA(SEQ ID NO:89)
简并引物1:
gatcag ggtctca ggac NNT NNT NNT ggc gga NNT NNT NNT ACT GTG GTG TTCGGC acc ggt acg aaa gtg(SEQ ID NO:90)
简并引物2:
GATCAGGGTCTCAACGCANNANNANNGCCANNANNANNTTTCGCACAGTAGTAAACAGCCGTATCTTC(SEQ ID NO:91)
用BsaI切割10μg的基本支架载体。使用Sureclean(Bioline)将经切割载体沉淀。使用引物SEQ ID No:90和91从核心骨架作为模板的PCR产生含有CDR3多样性区的插入片段。凝胶纯化2μg的插入片段PCR,然后用BsaI消化。使用Sureclean沉淀PCR消化产物。使用T4DNA连接酶连接等摩尔量的经消化载体和PCR插入片段。将连接热灭活并顺次电穿孔进入银大肠杆菌(Argentum E.coli)细胞(Alchemy Bio)。将经电穿孔细胞涂到15cm LB+羧苄青霉素(40μg/mL)+葡萄糖(0.1%)琼脂平板上。总文库大小>1×108个独立克隆。
文库构建的质量通过经多样化scFv的表达评估。如前所指出的,可溶性、部分可溶性或不可溶性融合伴侣的表达可通过在RED展示系统中使用肽聚糖(PG)结合结构域和发光表达报道子例如SNAP(New EnglandBiolabs)通过scFv的外观直接评估。可溶性融合蛋白显著地均匀地分布在细胞之周界周围,由于其自由的扩散,一旦膜被透化则与细胞壁结合(例如图1A)。比较而言,不溶性融合蛋白形成浓密着色的聚集体,其不迁移至细胞壁(例如图1B)。部分可溶性融合具有各自的一些特性。我们之前已经发现在以上所述的融合蛋白的外观与在Western印记中可溶性/不溶级分中出现的量之间有极佳的相关性。
通过这一经验标准,我们多样化的scFv文库由约90%可溶性并且良好表达的成员组成,其表明IGLV3-1::IGHV3-23支架对插入的CDR3多样性的耐受。图9是经表达文库之样品的SNAP标记图像。
为了进一步确认文库由随机的VL和VH CDR3区构成,对10个独立的克隆进行测序。测序显示CDR3环(在表4中显示)的组成是期望的,通过用于简并性的“NNT”核酸三联体产生密码子多样性,即不存在终止密码子和氨基酸W、Q、M、K和E。
表4.在随机文库中样本CDR3环序列
克隆 | VL CDR3 | VH CDR3 |
l | PFGGGGYV(SEQ ID NO:92) | PPHGAPA(SEQ ID NO:93) |
2 | LCIGGVAS(SEQ ID NO:94) | HNSGNNF(SEQ ID NO:95) |
3 | FVSGGIST(SEQ ID NO:96) | FNFGNAY (SEQ ID NO:97) |
4 | INSGGASF(SEQ ID NO:98) | XXXGTNY(SEQ ID NO:99) |
5 | SRAGGCNG(SEQ ID NO:100) | FDYGHCI(SEQ ID NO:101) |
6 | TNRGGVCA(SEQ ID NO:102) | TAAGVPF(SEQ ID NO:103) |
7 | 混合的克隆 | 混合的克隆 |
8 | FSTGGCAF(SEQ ID NO:104) | AICGATA (SEQ ID NO:105) |
9 | FXGGGDGT(SEQ ID NO:106) | PYRGSFF(SEQ ID NO:107) |
10 | IIPGGLYA(SEQ ID NO:108) | PVIGSNT(SEQ ID NO:109) |
实施例7.筛选与mAG1靶标结合的IGVL3-1::IGVH3-23文库
针对与靶蛋白质mAG结合的克隆对多样化文库进行筛选。Azami-绿色(AG)是维多利亚水母(Aequorea victoria)绿色荧光蛋白(GFP)的远直向同源物(distal ortholog)。尽管序列一致性低(5%),相似的绿色荧光具有在492 nm的吸收峰和在510 nm的发射峰。单体形式(mAG)由Karasawa等(2003)报道并且为了在大肠杆菌中最优地表达而通过DNA2.0(USA)重编码。包含C端大肠杆菌BirA生物素化模体和6×His标签以辅助纯化和mAG基质附着。mAG-BioHis6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:110所列。
mAG BioHis6蛋白序列:
MVSVIKPEMKIKLCMRGTVNGHNFVIEGEGKGNPYEGTOILDLNVTEGAPLPFAYDILTTVFQYGNRAFTKYPADIQDYFKQTFPEGYHWERSMTYEDOGICTATSNISMRGDCFFYDIRFDGTNFPPNGPVMQKKTLKWEPSTEKMYVEDGVLKGDVNMRLLLEGGGHYRCDFKTTYKAKKEVRLPDAHKIDHIUEILKHDKDYNKVKLYENAVARYSMLPSQAKSGGLNDIFEAQKIEWHEDTGGSHHHHHH (SEQ IDNO:110)
诱导多样化文库的1010细胞(代表约100倍冗余)用于RED展示,如实施例2和WO 2011/075761中所述。经透化细胞悬于50 mL PBS中并且用经纯化的mAG标记,所述mAG已与MACS链霉亲和素缀合的微珠预结合(130-048-102,Miltenyi Biotec)。细胞和微珠在4℃轻轻地搅拌过夜。随后将其加载到3×LS柱上(130-042-401,Miltenyi Biotec),所述3×LS柱被固定在磁性支持物上。每个柱用50mL的PBS洗涤。细胞用10mLPBS洗脱,汇集并沉淀(pelleted)。通过碱裂解从细胞沉淀中分离在RED展示载体中编码文库的质粒DNA。然后将质粒电穿孔返回到银细胞(Argentum cell)中并重复诱导、结合和柱纯化。亲和筛选四次重复之后,通过荧光显微镜观察到低丰度的RED经透化细胞与mAG蛋白结合。在第五次重复通过FACS分选mAG结合的经透化细胞。用于FACS的细胞使用SNAP配体标签,以对融合蛋白表达和mAG进行归一化。在从2.46×108总事件中收集4,428mAG次阳性事件期间,细胞群体的FACS示出丰度大约在105个细胞中一次结合事件。来自作为FACS产出的mAG阳性细胞的scFv通过使用在scFv序列侧翼的寡核苷酸引物的PCR回收并且产物被再克隆回到RED展示载体中。分析对mAG结合阳性的细胞的最终筛选产出,示出克隆的约40%(23/60)为mAG1阳性。因此,FACS阶段能够从文库背景中以约105倍富集阳性细胞。
图10示出将mAG与RED经透化细胞相结合用于克隆,对于mAG结合为阴性(克隆25)或阳性(克隆34)。
对20个mAG阳性克隆进行测序并且发现所有20个一致。结合mAG的IGLV3-1::IGHV3-23克隆的蛋白质序列在以下SEQ ID NO:111中列出(CDR3序列加粗且放大的字体表示,并且肽接头用下划线表示)。发现VL CDR3为‘FNLGGCGD’并且VH CDR3为‘HIDGPVA',其符合所设计的多样性。
抗m AG结合scFv:
Anti-mAG binding scFv:
MGDGQSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRP
SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDFNLGGCGDTVVFGTGTKVTVSSQTGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIDGPVAAFDIWGQGTMVTVSSSSQTSILVA(SEQ ID N0:111)
为了确定α-mAG scFv的性质,将该基因与C端6×His和FLAG表位标签克隆到表达载体中。用阿拉伯糖诱导scFv表达并且细胞用0.5%8TGP透化以将可溶性scFv释放到上清液中。将不可溶性细胞物质沉淀并且两种提取物的样品都与SDS-PAGE加载染料一起煮沸并在15%SDS-PAGE凝胶上电泳。将分开的蛋白质转移至硝酸纤维膜并用α-FLAG小鼠单克隆抗体探测。图11展示出α-mAG scFv几乎完全在可溶性级分中。
为了证明α-mAG scFv对mAG蛋白是特异性的而不仅是“黏着”抗体,α-mAG scFv经透化细胞用结构上和功能上与mAG相关的蛋白质EGFP进行标记。这些细胞,尽管结合mAG,但不结合EGFP(数据未示出)。为了进一步评价α-mAG scFv的特异性,还将α-mAG scFvHis6-FLAG蛋白与IMAC Ni琼脂糖树脂结合。“干净”mAG蛋白质(移除His6和FLAG标签)的粗制细胞裂解物与树脂混合。洗去游离的蛋白质。在图12中的荧光显微术成像表明与α-mAG scFv连接的树脂珠结合mAG,而对照珠没有。结合的蛋白质用咪唑洗脱并在SDS-PAGE凝胶上电泳。凝胶的考马斯染色(图13)证实在α-mAG scFv样品中的一个条带为mAG蛋白质的正确大小,并且没有对mAG细胞裂解物明显特异的其他条带。
因此,本发明可以用于成功地产生含有随机CDR3环之scFv多肽的文库并且对其进行筛选以鉴定显示特异性结合活性的scFv。
实施例8.使用α-mAG IGLV3-1::IGHV3-23scFv的λ噬菌体展示
为了证实在胞质的还原性环境中表现出增强的稳定性并产生折叠的支架的效用,克隆α-mAG IGLV3-1::IGHV3-23scFv作为与λ噬菌体gpD衣壳蛋白的C端融合。λ噬菌体作为用于蛋白质展示的示例性载剂已经被报道了很久,其具有多种优于丝状噬菌体的优势。λ衣壳蛋白(gpD)在每个噬菌体头上存在约400个拷贝,并且是强的并且耐受展示伴侣,允许每衣壳加载的gpD>80%成为重组融合蛋白,同时维持感染生存能力(Vaccaro等,2006)。此外,其耐受与其N或C末端的融合。
因此,λ噬菌体或等同的包装载体与标称的丝状噬菌体的单分子展示相比具有文库蛋白质的多价展示。该多价展示可导致从结合溶液中捕获噬菌体的显著效率,至多近100%捕获(Mikawa等,1996)。此外通过可市购的试剂盒可以促进λ噬菌体文库的组装,所述试剂盒能高效地包装λ(至多2×109pfu/μg)。
然而,λ噬菌体没有享有使用丝状噬菌体用于抗体展示的普及性,则是由于单一的事实:λ和相关噬菌体例如P2/P4、P22、T7和T4具有溶菌的生活方式,这通过其在胞质中组装而引起。由于绝大多数抗体支架没有氧化的结构域间二硫桥无法有效地折叠,这很大程度上妨碍了使用λ噬菌体用于抗体展示。
我们鉴定了多个用于形成胞质稳的定scFv支架之IGHV3-23结构域的IGLV伴侣,这使得我们能够展示出用于抗体筛选的λ展示的示例性应用。将s-mAG scFv作为C端融合克隆至与λgpD衣壳蛋白,在阿拉伯糖可诱导的araBAD启动子和araC调节子的控制下表达融合蛋白。与其他λ展示平台类似地将该单元克隆到λ噬菌体基因组中(Mikawa等,1996;Sternberg和Hoess,1995;Minenkova等,2003),具有显著不同所用的λ基因组为cI857gpD+RS-遗传起源的。RS基因(其构成对细胞裂解所必要的λ内溶素(R)和孔蛋白(porin)(S)基因)的缺失描述于国际专利申请号PCT/AU2012/000761,在λ类展示(lambdoid display)中使用裂解缺陷噬菌体。用于λ类展示的裂解缺陷噬菌体载体使得感染性噬菌体颗粒在胞质内包装。这些颗粒在细胞内持续聚集,其衣壳融合蛋白以高密度结合至其表面,直到其生长被研究者暂停,通过处理宿主细胞用于胞质RED展示。所产生的制备物可以由此通过FACS筛选融合蛋白抗原结合。为了释放封装在经透化细胞(其已经通过FACS对抗原结合阳性分选)内的噬菌体颗粒,仅需要添加溶菌酶。对于该任务,可以购买商业的高活性溶菌酶制剂(例如Epicentre的Ready-Lyse)。为了完成亲和力选择克隆的回收,可以将感染性的噬菌体颗粒感染到大肠杆菌细胞中并作为溶源体而生长。因此,本领域的从业者应理解,与胞质稳定的人抗体支架相结合地使用裂解缺陷的噬菌体使得能够以无噬菌体形式高频率地捕获多价文库克隆,最终的筛选通过FACS进行。重要的是,在筛选形式中发生的这种改变没有任何对重构型文库表达构建体的需要。因此,这是具有双能力的筛选系统,具有低克隆选择性的高度平行性筛选(无噬菌体淘选)和具有高克隆选择性但低通量的筛选(经封装噬菌体的FACS)。
为了证明使用本发明之多肽的λ噬菌体展示的益处,将模型α-mAGscFv融合(作为本发明多肽的很多合适的实例之一)克隆为与λ衣壳蛋白gpD基因的C端融合。
所用的gpD::s-mAG scFv融合构建体的DNA序列为:
ATGACGAGCAAAGAAACCTTTACCCATTACCAGCCGCAGGGCAACAGTGACCCGGCTCATACCGCAACCGCGCCCGGCGGATTGAGTGCGAAAGCGCCTGCAATGACCCCGCTGATGCTGGACACCTCCAGCCGTAAGCTGGTTGCGTGGGATGGCACCACCGACGGTGCTGCCGTTGGCATTCTTGCGGTTGCTGCTGACCAGACCAGCACCACGCTGACGTTCTACAAGTCCGGCACGTTCCGTTATGAGGATGTGCTCTGGCCGGAGGCTGCCAGCGACGAGACGAAAAAACGGACCGCGTTTGCCGGAACGGCAATCAGCATCGTTGGAGGTAGCGGCGGATCGGATGACGACGATAAGTCTAGAAATGGCGGAGACGGTCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACTTTAATCTTGGCGGATGTGGTGATACTGTGGTGTTCGGCACCGGTACGAAAGTGACTGTCTCATCTCAGACCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAAGTCCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCATCCGGTTTTACTTTCAGCAGCTACGCGATGTCGTGGGTGCGCCAGGCACCGGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCGCCATCAGCGGTAGCGGCGGTTCTACGTATTATGCGGACAGCGTCAAGGGCCGTTTCACCATCAGCCGTGACAATTCCAAAAACACCCTGTACTTGCAGATGAACAGCTTGCGTGCGGAAGATACGGCTGTTTACTACTGTGCGAAACATATTGATGGCCCTGTTGCTGCGTTTGATATTTGGGGTCAAGGTACCATGGTTACCGTGAGCAACTCGAGCGATTACAAGGACGATGATGACAAATAA(SEQ ID NO:112)
所用的gpD::α-mAG scFv融合蛋白的序列为:
MTSKETFTHYQPQGNSDPAHTATAPGGLSAKAPAMTPLMLDTSSRKLVAWDGTTDGAAVGILAVAADQTSTTLTFYKSGTFRYEDVLWPEAASDETKKRTAFAGTAISIVGGSGGSDDDDKSRNGGDGQSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDFNLGGCGDTVVFGTGTKVTVSSQTGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIDGPVAAFDIWGQGTMVTVSNSSDYKDDDDK*(SEQ ID NO:113)
然后将gpD::α-mAG scFv融合克隆到λ展示载体中,在araBAD启动子的控制下。通过在42℃加热溶源体克隆15分钟诱导宿主细胞用于λ封装(λ遗传背景是cI857gpD+RS-,具有温度敏感的cI抑制子)。温度诱导后立即用0.2%阿拉伯糖诱导融合蛋白。培养物在32℃进一步通气培养75分钟。将细胞沉淀并在三分之一培养物体积的LB培养基+0.5%8TGP中重悬,并且在25℃孵育10分钟以通过用于筛选的RED方法透化细胞。为了释放噬菌体,将万分之一培养物体积的Ready-Lyse(Epicentre)添加到悬液中。添加一滴氯仿以灭活任何活细胞并且释放的噬菌体颗粒用溶原体形成单位(cfu/mL)滴定。制备两种噬菌体储液,一种带有具有经克隆gpD::α-mAG scFv融合的构建体,另一种为空构建体。将gpD::α-mAG scFv融合稀释到109个空构建体中1个克隆,以模拟仅有几个阳性克隆的起始scFv文库密度。随后针对生物素化mAG结合链霉亲和素珠支持物淘选此“掺杂的”文库。根据本领域从业人员已知的一般用于噬菌体淘选的方进行淘选。进行两轮淘选,最后一轮回收到宿主大肠杆菌菌种中作为溶源体。第三轮的筛选通过FACS进行。溶源体细胞按照以上描述的用于噬菌体之加热诱导伴随gpD::α-mAG scFv融合的阿拉伯糖诱导进行处理。然而,替代用溶菌酶处理释放噬菌体颗粒,经透化的细胞改为与mAG蛋白孵育。将经透化的细胞洗涤一次,在TBS+10mM MgSO4中重悬并且随后通过FACS对mAG结合(即mAG阳性细胞将被标记为绿色)进行分选。图14(上)示出FACS分选在操作中的截屏,表明mAG阳性细胞的发生率。FACS后的mAG阳性细胞的最终发生率通过荧光显微术(图14,下)评估为20%。
因此,已经证明与本发明的稳定且可溶性scFv支架相结合的λ衣壳展示可有力地从相对高起始稀释度(109中1个)分离结合克隆。此外,当与裂解缺陷噬菌体组合并通过RED教导的方法处理时,能够进一步放大有益性质以包括FACS筛选的能力,而无需再克隆文库成员。
这些方法的组合极大地加快了用于筛选具有理想性质(高表达、高可溶性和高亲和力)之抗体克隆的过程。
本领域技术人员将理解,可以对在特定实施方案中示出的本发明进行多种改变和/或修改而不偏离广泛描述的本发明的范围。因此,在所有方面中,认为呈现的实施方案是说明性的而不是限制性的。
本文中讨论和/或引用的所有出版物整体并入本文。
本说明书中包含的文件、行为、材料、设备、文献等的任何讨论仅是为了提供本发明内容。不应当将其认为是承认这些事件中的任一种或全部形成了现有技术基础的一部分,或者是本发明相关领域中的一般常识,如同其存在于本申请的每一条权利要求的优先权日之前。
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Claims (29)
1.包含多种不同多肽的多肽文库,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中所述多肽的至少两种在所述VH和/或VL可变区中一个或更多个互补性决定区(CDR)中存在的氨基酸序列上彼此不同。
2.权利要求1所述的文库,其中在所述VH和/或VL可变结构域的一个或更多个CDR中的氨基酸序列是随机或半随机的或者来自人抗体。
3.构建多肽文库的方法,所述方法包括制备多种不同的多肽,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中所述多肽的至少两种在所述VH和/或VL可变区中一个或更多个CDR中存在的氨基酸序列上彼此不同。
4.多核苷酸文库,其包含多种不同的多核苷酸,其中每种多核苷酸编码多肽,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中所述多核苷酸的至少两种彼此的不同在于编码下述多肽:所述多肽在所述VH和/或VL可变区中包含一个或更多个不同的CDR。
5.权利要求4所述的文库,其中所述多核苷酸编码的所述VH和/或VL可变结构域的一个或更多个CDR中的氨基酸序列是随机或半随机的或者来自人抗体。
6.构建多核苷酸文库的方法,所述方法包括制备编码多肽的多种不同多核苷酸,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点;并且
其中所述多核苷酸的至少两种彼此的不同在于编码下述多肽:所述多肽在所述VH和/或VL可变区中包含一个或更多个不同的CDR。
7.分离的和/或重组的多肽,所述多肽包含:
i)抗体重链可变区(VH),其包含与如SEQ ID NO:3所示IGHV3-23的支架区具有至少90%同一性的支架区;以及
ii)抗体轻链可变区(VL),其包含与以下任一种支架区具有至少90%同一性的支架区:IGLV1-40(如SEQ ID NO:18所示)、IGLV1-44(如SEQ ID NO:21所示)、IGLV1-47(如SEQ ID NO:24所示)、IGLV1-51(如SEQ ID NO:15所示)、IGLV3-1(如SEQ ID NO:6所示)、IGLV3-19(如SEQ ID NO:27所示)、IGLV3-21(如SEQ ID NO:9所示)、IGLV6-57(如SEQ ID NO:12所示);其中所述VH和所述VL能够形成抗原结合位点。
8.权利要求7所述的多肽,其中所述VL包含与如SEQ ID NO.6所示IGLV3-1的支架区具有至少90%同一性的支架区。
9.权利要求7或权利要求8所述的多肽,其是可变片段(Fv)。
10.权利要求7至9中任一项所述的多肽,其是Fab片段、Fab’片段、F(ab')片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或更高阶的多肽复合物。
11.权利要求10所述的多肽,其中所述多肽是scFv并且所述VH和所述VL通过肽接头连接在一起。
12.权利要求7至11中任一项所述的多肽,其中所述VH和/或VL可变区的支架区与任一给定序列的支架区具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
13.权利要求7至12中任一项所述的多肽,其在还原性条件下可溶。
14.权利要求7至13中任一项所述的多肽,当在还原性条件下产生时所述多肽可溶并且能够稳定地形成抗原结合位点。
15.权利要求7至14中任一项所述的多肽,其与化合物缀合。
16.权利要求15所述的多肽,其中所述化合物选自:放射性同位素、可检测的标签、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、提高所述多肽在对象中之半衰期的化合物、及其混合物。
17.分离的和/或外源的多核苷酸,其编码权利要求7至16中任一项所述的多肽或其重链或轻链可变区。
18.载体,其包含权利要求17所述的多核苷酸。
19.宿主细胞,其包含权利要求7至16中任一项所述的多肽、权利要求17所述的多核苷酸或权利要求18所述的载体。
20.筛选与靶分子相结合之多肽的方法,所述方法包括将权利要求7至16中任一项所述的多肽或权利要求1、2、4和5中任一项所述的文库与靶分子相接触,以及确定权利要求7至16中任一项所述的多肽是否与所述靶分子相结合。
21.权利要求20所述的方法,其中编码权利要求7至16中任一项所述之多肽的多核苷酸在宿主细胞中或在无细胞表达系统中表达以产生权利要求7至16中任一项所述的多肽。
22.权利要求21所述的方法,其中所述多核苷酸在宿主细胞的胞质和/或周质中表达。
23.权利要求22所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
24.权利要求23所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞,并且所述方法包括:
a)培养包含编码权利要求7至16中任一项所述多肽之多核苷酸的细菌细胞,从而产生所述多肽,
b)透化所述细菌细胞,其中所述多核苷酸和所述多肽保留在经透化的细菌细胞内,
c)将所述经透化的细菌细胞与靶分子相接触,从而使所述靶分子扩散到所述经透化的细菌细胞中,以及
d)确定权利要求7至16中任一项所述的多肽是否与所述靶分子相结合。
25.权利要求21所述的方法,其中所述无细胞表达系统包括核糖体展示系统、mRNA展示系统或顺式展示系统。
26.宿主细胞文库,其包含多种宿主细胞,所述宿主细胞包含权利要求7至16中任一项所述的多肽,其中至少一种宿主细胞包含这样的多肽,其与文库中另一宿主细胞中存在的多肽在VH和/或VL可变结构域中一个或更多个CDR中存在的氨基酸序列上不同。
27.组合物,其包含权利要求7至16中任一项所述的多肽、权利要求17所述的多核苷酸和/或权利要求18所述的载体,以及可药用载剂。
28.试剂盒,其包含权利要求7至16中任一项所述的多肽、权利要求17所述的多核苷酸和/或权利要求18所述的载体,以及能够透化细菌细胞的试剂。
29.权利要求7至16中任一项所述多肽在治疗或诊断应用中的用途。
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Class et al. | Patent application title: Modified Variable Domain Molecules And Methods For Producing And Using Same Inventors: Daniel Christ (Darlinghurst, AU) Kip Dudgeon (Darlinghurst, AU) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140625 |