KR20230018488A - 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용 - Google Patents

신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용 Download PDF

Info

Publication number
KR20230018488A
KR20230018488A KR1020227046331A KR20227046331A KR20230018488A KR 20230018488 A KR20230018488 A KR 20230018488A KR 1020227046331 A KR1020227046331 A KR 1020227046331A KR 20227046331 A KR20227046331 A KR 20227046331A KR 20230018488 A KR20230018488 A KR 20230018488A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
val
gly
leu
thr
Prior art date
Application number
KR1020227046331A
Other languages
English (en)
Inventor
준팡 장
Original Assignee
선전 이뮤노테라피 바이오테크 씨오., 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 선전 이뮤노테라피 바이오테크 씨오., 엘티디. filed Critical 선전 이뮤노테라피 바이오테크 씨오., 엘티디.
Publication of KR20230018488A publication Critical patent/KR20230018488A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

신종 코로나바이러스(SARS-COV-2) 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용을 제공한다. 상기 결합 분자는 SARS-COV-2의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, SARS-COV-2-Spike 단백질과 인체 세포 ACE2 수용체의 결합을 효과적으로 차단할 수 있어, 세포에 대한 SARS-COV-2의 감염 과정을 차단하여 SARS-COV-2의 감염 및 증폭을 억제할 수 있다.

Description

신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용
본 발명은 2020년 6월 2일 자로 제출된 중국 특허 출원 CN202010491549.0의 우선권을 주장한다. 선출원에서 개시된 내용은 전체적인 인용을 통해 본 발명에 통합된다.
본 발명은 신종 코로나바이러스(SARS-COV-2) 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용에 관한 것으로, 의약생물 기술분야에 속한다.
신종 코로나바이러스 폐렴(COVID-19)은 전 세계적으로 누적 감염자가 400만명 을 넘어섰고, 감염자 수는 여전히 빠르게 증가되고 있으며, 현재 COVID-19에 대한 임상적으로 특이적이고 효과적인 치료 수단이 부족한 실정이다. 중국의 전염병 상황은 전반적으로 통제되었지만, 해외 전염병 상황은 폭발적으로 발생하여 빠르게 증가하고 있다. 또한, 점점 더 많은 연구에서 신종 코로나바이러스(SARS-COV-2) 감염이 만성 보균 상태일 수 있음을 나타내고, 일부 퇴원 환자 중 재양성 환자에서 바이러스가 장기간 인체에 존재할 수 있음을 시사하기도 한다. 현재로서는 장기 보균의 메커니즘, 시간 등 핵심 요인이 명확하지 않으며, 향후 SARS-COV-2의 재발을 방지하는 것이 매우 중요하다. COVID-19의 영향으로 중국과 세계 각국에서 발생하는 경제적 손실, 사회적 부담 및 다른 부정적인 영향은 측정하기 어렵다.
현재 COVID-19에 대한 특효약은 없으며, 효과적인 약물의 빠른 개발이 시급하다. 국내외 많은 R&D 기관들이 COVID-19에 대한 치료 전략 연구에 박차를 가하고 있다. 이미 개발된 렘데시비르, 파비피라비르 등 광역 소분자 항바이러스제는 COVID-19에 대해 일정한 치료 효과가 있지만, SARS-COV-2에 대해 특이성이 없고 치료 효과가 한정적이므로, COVID-19의 특효약이 되기 어렵다.
본 발명은, 기존의 항바이러스제가 신종 코로나바이러스에 대해 특이성이 없고 치료 효과가 한정적이므로 COVID-19의 특효약이 되기 어려운 문제에 대해, 신종 코로나바이러스(SARS-COV-2) 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용을 제공한다.
본 발명의 제1 측면은 SARS-COV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 신종 코로나바이러스(SARS-COV-2) 스파이크 단백질 결합 분자를 제공하며, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 중의 CDR1, CDR2 및 CDR3은,
1) SEQ ID NO : l로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 2로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 3으로 표시되는 CDR3;
2) SEQ ID NO : 4로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 5로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 6으로 표시되는 CDR3;
3) SEQ ID NO : 7로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 8로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 9로 표시되는 CDR3;
4) SEQ ID NO : 10으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 11로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 12로 표시되는 CDR3;
5) SEQ ID NO : 13으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 14로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 15로 표시되는 CDR3;
6) SEQ ID NO : 16으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 17로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 18로 표시되는 CDR3;
7) SEQ ID NO : 19로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 20으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 21로 표시되는 CDR3;
8) SEQ ID NO : 22로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 23으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 24로 표시되는 CDR3;
9) SEQ ID NO : 25로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 26으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 27로 표시되는 CDR3;
10) SEQ ID NO : 28로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 29로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 30으로 표시되는 CDR3;
11) SEQ ID NO : 31로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 32로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 33으로 표시되는 CDR3;
12) SEQ ID NO : 34로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 35로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 36으로 표시되는 CDR3;
13) SEQ ID NO : 37로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 38로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 39로 표시되는 CDR3;
14) SEQ ID NO : 40으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 41로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 42로 표시되는 CDR3;
15) SEQ ID NO : 43으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 44로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 45로 표시되는 CDR3;
16) SEQ ID NO : 46으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 47로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 48로 표시되는 CDR3;
17) SEQ ID NO : 49로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 50으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 51로 표시되는 CDR3;
18) SEQ ID NO : 52로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 53으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 54로 표시되는 CDR3;
19) SEQ ID NO : 55로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 56으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 57로 표시되는 CDR3;
20) SEQ ID NO : 58로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 59로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 60으로 표시되는 CDR3;
21) SEQ ID NO : 61로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 62로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 63으로 표시되는 CDR3;
22) SEQ ID NO : 64로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 65로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 66으로 표시되는 CDR3;
23) SEQ ID NO : 67로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 68로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 69로 표시되는 CDR3;
24) SEQ ID NO : 70으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 71로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 72로 표시되는 CDR3;
25) SEQ ID NO : 73으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 74로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 75로 표시되는 CDR3;
26) SEQ ID NO : 76으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 77로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 78로 표시되는 CDR3; 및
27) SEQ ID NO : 79로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 80으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 81로 표시되는 CDR3의 조합으로부터 선택되는 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 도메인 항체이다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 단일 도메인 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나와 비교하여 하나 또는 복수의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자는 면역글로불린 Fc 영역을 더 포함한다.
본 발명의 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자에는 면역글로불린 Fc 영역이 포함되어 상기 결합 분자가 이량체를 형성하도록 하면서 상기 분자의 체내 반감기를 진일보로 연장할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 Fc 영역은 IgG(IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgAl, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM과 같은 상이한 서브타입의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgGl의 Fc 영역이다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 109이다.
본 발명의 일 실시예로서, SEQ ID NO : 110 ~ 136 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 Fc 영역에 융합된 결합 분자는 안정성 및 생물학적 활성이 더 향상되고, SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합에 대한 KD 값이 더 감소된다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자는,
SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합에 대한 KD 값이 1×10-8M 미만인 특징 a;
SARS-COV-2와 인체 세포 수용체 ACE2의 결합을 차단하는 특징 b; 및
SARS-COV-2의 감염 및 증폭을 억제하는 특징 c 중 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 제2 측면은 상기 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 RNA, DNA 또는 cDNA이고, 인공 합성 방식을 통해 획득될 수 있고, 적절한 천연 유래에서 분리되어 획득될 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 상기 핵산 분자 및 이의 발현 조절 요소를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 통상적으로 적어도 하나의 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하고, 이는 하나 또는 복수의 적절한 발현 조절 요소(프로모터, 인핸서, 터미네이터, 통합 인자, 선택 마커, 리더 서열, 리포터 유전자 등)에 작동 가능하게 연결된다. 특정 숙주 세포에서의 발현에 대해 상기 요소 및 이의 서열의 선택은 당업자의 상식이다.
본 발명의 제4 측면은 상기 핵산 분자를 포함하고 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 이종 단백질을 발현하기 위한 세포로 박테리아 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포를 포함한다.
본 발명의 제5 측면은 상기 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자의 획득 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 a; 및
단계 a의 배양물에서 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 수집하는 단계 b를 포함한다.
특정된 핵산 분자를 발현 벡터에 재조합하고 형질전환 또는 형질감염 방법을 통해 숙주 세포에 진입하여 발현하는 것, 선택 마커, 단백질 발현의 유도 방법, 배양 조건 등은 본 기술분야에 공지된 것이다. 아울러, 단백질 결합 분자의 분리 및 정제 기술은 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자는 화학 합성과 같은 본 기술분야에 공지된 기타 단백질의 생성 방법을 통해 획득될 수도 있다.
본 발명의 제6 측면은 치료 모이어티에 접합된 상기 어느 하나에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 포함하는 면역 접합체를 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 상기 어느 하나에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자 및/또는 상기 면역 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 “약학적으로 허용 가능한 담체”는 생리학적으로 상용되는 임의의 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입을 통해)에 적합하다. 투여 경로에 따라 활성 화합물, 즉 결합 분자, 면역 접합체를 하나의 재료에 패키징하여, 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하며, 이는 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 필요에 따라 기타 보조제 및 보조 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제8 측면은 신종 코로나바이러스 폐렴의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 상기 약학적 조성물의 응용을 제공한다.
본 발명의 제9 측면은 상기 어느 하나에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 포함하는 SARS-COV-2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 제10 측면은 SARS-COV-2 검출용 키트의 사용 방법을 제공하며, 상기 어느 하나에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자와 SARS-COV-2 스파이크 단백질 사이에 복합체가 형성될 수 있는 조건 하에, 검출 샘플과 대조 샘플을 상기 어느 하나에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자에 접촉시켜 복합체의 형성을 검출하며; 상기 검출 샘플과 대조 샘플 사이의 복합체 형성의 차이를 통해 샘플 중의 SARS-COV-2의 존재를 판단한다.
본 발명에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질(SARS-COV-2-Spike 단백질) 결합 분자는 SARS-COV-2-Spike 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, SARS-COV-2-Spike 단백질과 인체 세포 ACE2 수용체의 결합을 효과적으로 차단하여, 세포에 대한 SARS-COV-2의 감염 과정을 차단하여 SARS-COV-2의 감염 및 증폭을 억제한다. 본 발명에 따른 SARS-COV-2-Spike 단백질 결합 분자는 또한 SARS-COV-2-Spike 단백질과의 결합 특이성이 우수하고 생물학적 활성 및 안정성이 높으며 독성 및 부작용이 없는 특성을 갖는다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 추출된 전체 RNA의 아가로스 겔 전기영동 이미지이고, M: DNA marker 2000, 레인 1: 전체 RNA이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 nested PCR에 의해 증폭된 단일 도메인 항체 유전자의 Step1-PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동 이미지이고, M: DNA marker 2000, 레인 1: 증폭 산물이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 nested PCR에 의해 증폭된 단일 도메인 항체 유전자의 Step2-PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동 이미지이고, DNA marker 2000, 레인 1 및 레인 2: 증폭 산물이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 표적 단일 도메인 항체 유전자 및 벡터 pHENl의 SfiI 및 Notl 이중 절단 산물의 아가로스 겔 전기영동 이미지이고, DNA marker 2000, 레인 1: pHENl; 레인 2: sfil/notI 절단 후의 pHENl; 레인 3: sfil/notI 절단 후의 단일 도메인 항체 유전자이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 라이브러리 삽입율을 측정하기 위한 콜로니 PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동 이미지이고, M: DNA marker 2000; 레인 1 ~ 48: 선택된 48개의 콜로니이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 일수 변화에 따른 치료군과 대조군 붉은털 원숭이의 바이러스 부하 변화 그래프이다.
정의
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 본 기술분야의 통상적인 의미를 갖고, 상기 의미는 당업자에 의해 이해된 바와 같다. 또한, 달리 명시되지 않는 한 구체적으로 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고, 상기 방식은 당업자에 의해 이해된 바와 같다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 중쇄 항체든 일반적인 4쇄 항체든 상호교환하여 사용될 수 있는 용어 “항체” 또는 “면역글로불린”은 전장 항체, 이의 단일 사슬 및 이의 모든 부분, 도메인 또는 단편(항원 결합 도메인 또는 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 포함하는 일반적인 용어로 사용된다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 “서열”(예를 들어 “면역글로불린 서열”, “항체 서열”, “단일 가변 도메인 서열”, “단일 도메인 항체 서열” 또는 “단백질 서열” 등 용어 중)은 본 명세서에서 보다 한정된 설명이 요구되지 않는 한 일반적으로 관련 아미노산 서열을 포함할 뿐만 아니라 상기 서열을 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 용어 “면역글로불린 가변 도메인”은 기본적으로 본 기술분야 및 하기에서 각각 “프레임워크 영역 1” 또는 “FR1”, “프레임워크 영역 2” 또는 “FR2”, “프레임워크 영역 3” 또는 “FR3”, 및 “프레임워크 영역 4” 또는 “FR4”로 지칭되는 4개의 “프레임워크 영역”으로 구성된 면역글로불린 도메인을 의미하고, 상기 프레임워크 영역은 본 기술분야 및 하기에서 각각 “상보성 결정 영역 1” 또는 “CDR1”, “상보성 결정 영역 2” 또는 “CDR2”, 및 “상보성 결정 영역 3” 또는 “CDR3”으로 지칭되는 3개의 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”에 의해 이격된다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로 표시될 수 있다. 면역글로불린 가변 도메인은 항원 결합 부위를 가지므로 항체에 항원 특이성을 부여한다.
전통적인 IgG 항체 분자는 일반적으로 경쇄 및 중쇄로 구성되고, 경쇄는 1개의 가변 영역(VL) 및 1개의 불변 영역(CL)을 포함하며, 중쇄는 1개의 가변 영역 (VH) 및 3개의 불변 영역(CH1, CH2, CH3)을 포함한다. 단일 도메인 항체(Single domain antibody, sdAb)는 항체 경쇄가 결실되어 중쇄 가변 영역만 있는 항체의 일종을 의미하며, 이는 분자량이 작아 나노바디(Nanobody)로도 지칭된다. 단일 도메인 항체는 기타 항원 결합 도메인 없이 에피토프에 특이적으로 결합한다. 단일 도메인 항체는 단일 면역글로불린 도메인으로 형성된 안정적이고 효율적인 소형 항원 인식 유닛이다.
본 기술분야에서 단일 도메인 항체 중의 각 CDR의 아미노산 잔기의 총 수는 상이할 수 있다.
단일 도메인 항체 중의 아미노산 잔기의 총 수는 통상적으로 110 내지 120의 범위 내에 있고, 종종 112 내지 115 사이에 있다. 다만 작은 서열과 긴 서열도 본 발명에 따른 목적에 적합할 수 있다.
단일 도메인 항체 및 이를 포함하는 폴리펩티드의 기타 구조적 특성 및 기능적 특성은 하기와 같이 요약될 수 있다.
단일 도메인 항체(경쇄 가변 도메인이 존재하지 않고 경쇄 가변 도메인과 상호작용하지 않는 경우에 항원에 기능적으로 결합하도록 자연적으로 “설계”됨)는 작은 단일 기능적 항원 결합 구조 유닛, 도메인 또는 폴리펩티드로 사용될 수 있다. 단일 도메인 항체와 일반적인 4쇄 항체를 구별하는 VH 및 VL 도메인, 이러한 VH 및 VL 도메인 자체는 통상적으로 단일 항원 결합 단백질 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 실제 적용에 적합하지 않지만, 기능적 항원 결합 유닛(예를 들어, Fab 단편과 같은 일반적인 항체 단편의 형태; 또는 VL 도메인에 공유 결합되는 VH 도메인으로 구성된 scFv의 형태)을 제공하기 위해 특정 형태 또는 기타 형태로 조합될 필요가 있다.
상기 독특한 특성으로 인해, 단일 도메인 항체를 사용하거나 큰 폴리펩티드의 일부로 사용하여 일반적인 VH 및 VL 도메인, scFv 또는 일반적인 항체 단편(예를 들어, Fab- 또는 F(ab')2- 단편)을 사용하는 것보다 우수한 많은 유의한 장점을 제공하며, 예를 들어 단일 도메인 항체는 단일 도메인만 필요로 하여 높은 친화력 및 높은 선택성으로 항원에 결합하여, 2개의 별도의 도메인이 존재할 필요가 없고, 상기 2개의 도메인이 적절한 공간 형태 및 배열로 존재(예를 들어, scFv는 일반적으로 특별히 설계된 링커를 사용해야 함)하도록 확보할 필요도 없으며; 단일 도메인 항체는 단일 유전자에서 발현될 수 있고 번역 후 접힘 또는 변형이 필요 없으며; 단일 도메인 항체는 다가 및 다중 특이적 형식으로 쉽게 개조될 수 있고; 단일 도메인 항체는 가용성이 높고 응집 경향이 없으며; 단일 도메인 항체는 열, pH, 프로테아제 및 기타 변성제 또는 조건에 대해 매우 안정적이므로, 제조, 저장 또는 운송 과정에서 냉동 기기를 사용하지 않아, 비용, 시간 및 환경 절약을 달성하며; 단일 도메인 항체는 제조가 용이하고 상대적으로 저렴하며, 심지어 생산에 필요한 규모에서도 이와 같으며; 단일 도메인 항체는 일반적인 4쇄 항체 및 이의 항원 결합 단편에 비해 상대적으로 작기 때문에(약 15 kDa 또는 일반적인 IgG의 1/10 크기), 일반적인 4쇄 항체 및 이의 항원 결합 단편에 비해 높은 조직 침투성을 보이고 고용량 투여가 가능하며; 단일 도메인 항체는 소위 캐비티 결합 특성(특히 일반적인 VH 도메인에 비해 연장된 CDR3 루프로 인해)을 나타낼 수 있어, 일반적인 4쇄 항체 및 이의 항원 결합 단편이 도달할 수 없는 표적 및 에피토프에 도달할 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 결합하는 단일 도메인 항체의 획득 방법은 하기 문헌에 이미 공개되어 있다. R. vanderLinden et al., Journal of Immunological Methods, 240(2000) 185 ~ 195; Li et al., JBiol Chem., 287(2012)13713 ~ 13721; Deffar et al., African Journal of Biotechnology Vol.8(12), pp. 2645 ~ 2652, 17June, 2009 및 W094/04678.
또한, 당업자는 하나 또는 복수의 상기 CDR을 기타 “스캐폴드”(인간 스캐폴드 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 포함하지만 이에 한정되지 않음)에 “이식”할 수 있음을 이해할 것이다. 상기 CDR 이식에 적합한 스캐폴드 및 기술은 본 기술분야에 공지되어 있다.
일반적으로, 용어 “특이성”은 특정 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질(예를 들어, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인) 분자가 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 에피토프의 개수를 의미한다. 항원 결합 분자의 친화력 및/또는 결합력에 기반하여 이의 특이성을 결정할 수 있다. 항원과 항원 결합 단백질의 해리 평형 상수(KD)로 표시되는 친화력은 에피토프와 항원 결합 단백질의 항원 결합 부위 사이의 결합 강도의 척도이며, KD 값이 작을수록 에피토프와 항원 결합 분자 사이의 결합 강도는 강해진다(또는, 친화력은 결합 상수(KA)로 표시될 수도 있고, 1/KD임). 당업자는 특정 관심 항원에 따라 공지된 방식으로 친화력을 측정할 수 있음을 이해할 것이다. 결합력은 항원 결합 분자(예를 들어 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드)와 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합력은 항원 결합 분자 상의 항원 결합 부위와의 친화력, 및 항원 결합 분자 상에 존재하는 관련 결합 부위의 개수와 관련이 있다.
본 발명에 사용된 용어 “SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자(SARS-C0V-2-Spike 단백질 결합 분자)”는 SARS-C0V-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자는 SARS-C0V-2 스파이크 단백질에 대한 본 발명에서 정의된 단일 도메인 항체 또는 이의 접합체를 포함할 수 있다. SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자는 또한 소위 “SMIP”(“소형 모듈 면역 약물”), 또는 면역글로불린 슈퍼패밀리 항체(IgSF) 또는 CDR 이식 분자를 포함한다.
본 발명의 “SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자”는 SARS-C0V-2 스파이크 단백질에 결합하는 단일 도메인 항체와 같은 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 “SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자”는 SARS-C0V-2 스파이크 단백질에 결합하는 단일 도메인 항체와 같은 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 하나 또는 복수의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자는 “형식화된” SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자라고도 지칭된다. 형식화된 SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자는 SARS-C0V-2 스파이크 단백질에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 외에도 링커 및/또는 효과기 기능을 갖는 부분을 포함할 수 있는 바, 예를 들어 반감기 연장 부분(예를 들어, 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인), 및/또는 융합 파트너(예를 들어, 혈청 알부민) 및/또는 접합된 중합체(예를 들어, PEG) 및/또는 Fc 영역이다. 본 발명의 “SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자”는 또한 상이한 항원에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중 특이적 항체를 포함한다.
통상적으로, 본 발명의 SARS-C0V-2 스파이크 단백질 결합 분자는 Biacore 또는 KinExA 측정에서 측정된, 바람직하게는 10-8 내지 10-12 mol/L(M), 보다 바람직하게는 10-9 내지 10-11 mol/L, 보다 더 바람직하게는 10-10 내지 10-12, 가장 바람직하게는 10-11 내지 10-12 또는 보다 낮은 해리 상수(KD)를 가질 것이다. 10-4M을 초과하는 임의의 KD 값은 일반적으로 비특이적 결합을 지시하는 것으로 간주된다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원 결합 단백질의 특이적 결합은 예를 들어 본 명세서에 따른 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정, 및/또는 경쟁적 결합 측정(예를 들어, 효소 면역 측정(EIA)) 및 샌드위치 경쟁적 측정을 포함하는 공지된 임의의 적절한 방식으로 측정될 수 있다.
아미노산 잔기는 본 기술분야에 공지되고 합의된 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 표시된다. 상기 보존적 아미노산 치환은 본 기술분야에 공지된 것이고, 예를 들어 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 (1) 작은 지방족 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (2) 극성 음전하를 띤 잔기 및 이의(전하를 띠지 않은) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (3) 극성 양전하를 띤 잔기: His, Arg 및 Lys; (4) 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (5) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp의 그룹 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 기타 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 Gly 또는 Ser에 의한 Ala의 치환; Lys에 의한 Arg의 치환; Gln 또는 His에 의한 Asn의 치환; Glu에 의한 Asp의 치환; Ser에 의한 Cys의 치환; Asn에 의한 Gln의 치환; Asp에 의한 Glu의 치환; Ala 또는 Pro에 의한 Gly의 치환; Asn 또는 Gln에 의한 His의 치환; Leu 또는 Val에 의한 Ile의 치환; Ile 또는 Val에 의한 Leu의 치환; Arg, Gln 또는 Glu에 의한 Lys의 치환; Leu, Tyr 또는 Ile에 의한 Met의 치환; Met, Leu 또는 Tyr에 의한 Phe의 치환; Thr에 의한 Ser의 치환; Ser에 의한 Thr의 치환; Tyr에 의한 Trp의 치환; Trp 또는 Phe에 의한 Tyr의 치환; Ile 또는 Leu에 의한 Val의 치환이다.
2개의 폴리펩티드 서열 사이의 “서열 동일성”은 서열 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 서열 동일성 정도를 평가하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 동일성은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 예를 들어, NCBI 데이터베이스의 BLAST 프로그램을 사용하여 동일성을 결정할 수 있다. 서열 동일성의 결정에 대해, 예를 들어 Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, NewYork, 1991을 참조할 수 있다.
천연 생물학적 유래 및/또는 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 획득하는 반응 매질 또는 배지와 비교하여, 이가 상기 유래 또는 매질(배지)에서 통상적으로 이와 관련된 적어도 하나의 기타 성분(예를 들어, 기타 단백질/폴리펩티드, 기타 핵산, 기타 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염 물질, 불순물 또는 미량 성분)과 분리되었을 때, 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 “기본적으로 분리된” 것으로 간주된다. 특히, 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배 및 최대 1000배 또는 1000배 이상으로 정제되었을 때 “기본적으로 분리된” 것으로 간주된다. 적합한 기술(예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 적합한 크로마토그래피 기술)에 의해 결정된 “기본적으로 분리된” 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 바람직하게는 기본적으로 균질적인 것이다.
실시예 1
SARS-COV-2-Spike 단백질에 대한 단일 도메인 항체의 스크리닝
1.1 라이브러리의 구축
1.1.1 면역
신종 코로나바이러스의 Spike-RBD 단백질로 라마를 면역화하고, 1, 2, 4, 6주차에 면역화하며, 매회 면역 용량을 200 ug으로 총 4회 면역화한다.
1.1.2 전체 RNA 추출
6주차에 면역화된 라마의 말초 혈액을 50 ml 취하고, 림프구를 분리하며, Trizol로 림프구의 전체 RNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계를 사용하여 추출된 RNA를 검출한 결과, OD260/280=1.99, OD260/230=1.43이며, 이는 추출된 RNA가 유의하게 분해되지 않고, 순도가 좋음을 나타내며; 전체 RNA 농도는 809.3 ng/μL이다. 추출된 전체 RNA로 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 28S 및 18S의 두 밴드가 보인다.
1.1.3 RNA 역전사
RNA 역전사 시스템은 하기와 같다.
Step 1(표 1)
Oligo dT(2.5 μM) 1 μL
dNTP(10 mM each) 1 μL
전체 RNA 2.428 μg
H20 Up to 10 μL
골고루 혼합한 후, 65℃에서 5분 동안 배양하고 신속하게 아이스 배스에서 배양한다.
Step 2(표 2)
Step 1 반응액 10 μL
5×PrimeScript Buffer 4 μL
RNase inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL
PrimeScript RTase(200 U/μL) 0.5 μL
RNase free H20 Up to 20 μL
골고루 혼합한 후, 역전사하여 cDNA를 획득하고, 역전사 조건은 42℃, 30 min; 50℃, 15 min; 70℃, 15 min이다.
1.1.4 단일 도메인 항체(VHH) 유전자 증폭
Nested PCR을 사용하여 VHH 유전자를 증폭하고, 방법은 하기와 같다.
Step 1(표 3)
10× Ex Taq Buffer(Mg2+ plus) 5 μL
dNTP mixture(each 2.5 mM) 4 μL
Primer For-1(10 mM each) 1.5 μL
Primer Rev-1(10 mM each) 1.5 μL
cDNA 1 μL
Ex Taq 효소 0.25 μL
H20 Up to 50 μL
골고루 혼합한 후, PCR 반응을 수행하고, 반응 조건은 98℃ 10 s, 50℃ 30 s, 72℃ 1 min이고, 총 20 사이클이다. 증폭 프라이머의 서열은 Primer For-1:5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3'(SEQ ID NO : 138); Primer Rev-1:5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'(SEQ ID NO : 139)이다.
PCR 산물은 DNA 정제 키트로 정제 및 농축한 후, 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 획득된 아가로스 겔 전기영동 이미지는 도 2에 도시된 바와 같으며, DNA 산물 겔 회수 키트를 사용하여 750 bp의 밴드를 회수하고, 자외선 분광 광도계로 정량화한다.
Step 2(표 4)
10×Ex Taq Buffer(Mg2+ plus) 5 μL
dNTP mixture(2.5 mM each) 4 μL
Primer For-2(10 mM each) 2 μL
Primer Rev-2(10 mM each) 2 μL
Step 1 DNA 템플릿 1 μL
Ex Taq 0.25 μL
H20 Up to 50 μL
골고루 혼합한 후, PCR 반응을 수행하고, 반응 조건은 98℃ 10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s이고, 총 20 사이클이다. 증폭 프라이머의 서열은 Primer For-2:5'-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3'(SEQ ID NO : 140); Primer Rev-2:5'-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3'(SEQ ID NO : 141)이다.
획득된 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 아가로스 겔 전기영동 이미지는 도 3에 도시된 바와 같으며, DNA 산물 겔 회수 키트를 사용하여 회수하고, 자외선 분광 광도계로 정량화한다. 최종적으로 약 500 bp의 표적 유전자(VHH) 200 μL를 획득하고, 농도는 400 ng/μL이다.
1.1.5 라이브러리 형질전환
획득된 표적 유전자 및 벡터 pHEN1을 SfiI 및 Not1로 이중 절단하고, 절단된 산물은 아가로스 겔 전기영동을 수행하며, 그 결과는 도 4에 도시된 바와 같고, 절단된 표적 유전자 및 pHEN1을 T4 DNA 리가아제로 연결한 후, 대장균 전기변환 컴피턴트 세포 TG1로 형질전환시켜, SARS-COV-2-Spike 단백질에 대한 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리를 구축하며, J2-Lib로 명명하였다. 총 15회 형질전환하고, 혼합 후 6개의 Φ150 mm 배양 접시(암피실린을 포함하는 LB 고체 배지)에 균일하게 도포한다.
각각 0.1 μL, 0.01 μL, 0.001 μL 및 0.0001 μL의 혼합된 형질전환 용액을 Φ90 mm 배양 접시(암피실린을 포함하는 LB 고체 배지)에 균일하게 도포하고, 라이브러리 용량의 계산(콜로니 수가 30 ~ 300인 플레이트를 기준으로 계수함)에 사용하며, 표 5에 도시된 바와 같이 계산된 라이브러리 용량은 1.395×108 cfu이다.
세균액 부피(μL) 0.1 0.01 0.001 0.0001
콜로니 수 풀 플레이트 93 12 1
라이브러리 용량의 계산에 사용되는 상기 배양 접시에서 48개의 콜로니를 선택하여 콜로니 PCR을 수행하고, PCR 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동을 수행하여, 라이브러리의 표적 유전자 삽입율을 측정하며, 아가로스 겔 전기영동은 도 5에 도시된 바와 같이, 라이브러리 삽입율이 100%이고 라이브러리 실제 용량이 1.395×108 cfu임을 나타낸다.콜로니 PCR 시스템은 하기와 같다(표 6).
10×Ex Taq Buffer(Mg2+ plus) 5 μL
dNTP mixture(each 2.5 mM) 4 μL
Primer For-1(10 mM each) 1.5 μL
Primer Rev-1(10 mM each) 1.5 μL
콜로니 현탁액 1 μL
Ex Taq 효소 0.25 μL
H20 Up to 50 μL
콜로니 PCR 반응 조건은 98℃ 10 s, 50℃ 30 s, 72℃ 1 min이고, 총 30 사이클이다.
1.1.6 라이브러리 레스큐
상기 J2-Lib 유전자 라이브러리에서 10 ~ 100배 라이브러리 용량의 생세포를 취하여 접종 및 배양하고, 대수기까지 배양한 후 M13K07 파지를 사용하여 레스큐하며, 레스큐 배양 후 원심분리하여 파지를 수집하고, PEG-NaCl로 파지를 정제하여, 파지 디스플레이 라이브러리를 획득하며, J2-PDL로 명명하고, 적정 농도는 3.4×1013 cfu/mL이다. 특이적 파지의 후속 친화성 스크리닝에 직접 사용할 수 있다.
1.2 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체에 대한 스크리닝
플레이트를 3 μg/웰의 Spike-RBD 단백질(스파이크 단백질 수용체 결합 영역 단백질)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 방치하며; 1 wt% 탈지 분유로 실온에서 2시간 동안 차단하고, 100 μl의 파지(8×1011 tfu, 1.1.6에서 구축된 파지 디스플레이 라이브러리 J2-PDL에서 유래)를 첨가하며, 실온에서 1시간 동안 작용시켰다. 그 다음 PBST(PBS에 0.05 vt% Tween 20이 포함됨)로 5회 용출하여, 결합되지 않은 파지를 세척하며; 트리에틸아민(100 mM)으로 Spike-RBD 단백질에 특이적으로 결합한 파지를 해리하고, 대수성장기의 대장균 TG1을 감염시키며, 다음 라운드의 스크리닝을 위해 파지를 생산하고 정제하였다. 동일한 스크리닝 과정을 3 ~ 4 라운드 반복하였다. 이로부터 양성 클론이 풍부해지고, 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 항체 라이브러리에서 Spike-RBD 단백질 특이적 항체를 스크리닝하는 목적을 달성하였다. 획득된 양성 파지를 시퀀싱하여 항체 유전자 서열을 획득하였다.
획득된 항체 유전자 서열을 각각 pcDNA3.4 벡터에 구축하고, HEK-293 세포로 항체를 발현하며, proteinA 매질로 배지 상층액의 항체를 정제 및 수집하였다. 정제된 항체와 Spike-RBD가 코팅된 플레이트를 배양하여 ELISA 측정을 수행하였다. Spike-RBD 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 획득하였다.
서열 정렬 소프트웨어 Vector NTI에 따라 획득된 항체 서열을 분석하였다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 모두 동일한 클론을 동일한 항체 균주로 간주하고, CDR 서열이 상이한 클론을 상이한 항체 균주로 간주하였다. 총 27개의 상이한 단일 도메인 항체 균주를 획득하고, 단일 도메인 항체 서열은 SEQ ID NO : 82 ~ 108과 같으며, SEQ ID NO : 1 ~ 81에서 27개의 그룹의 CDR1-3 서열을 각각 보유하고, 구체적으로 표 7에 나타낸 바와 같다.
단일 도메인 항체 CDR1 CDR2 CDR3
C0V2-114-1 SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 2 SEQ ID NO : 3
C0V2-187-2 SEQ ID NO : 4 SEQ ID NO : 5 SEQ ID NO : 6
COV2-360-3 SEQ ID NO : 7 SEQ ID NO : 8 SEQ ID NO : 9
C0V2-143-4 SEQ ID NO : 10 SEQ ID NO : 11 SEQ ID NO : 12
C0V2-13-5 SEQ ID NO : 13 SEQ ID NO : 14 SEQ ID NO : 15
C0V2-356-6 SEQ ID NO : 16 SEQ ID NO : 17 SEQ ID NO : 18
C0V2-115-7 SEQ ID NO : 19 SEQ ID NO : 20 SEQ ID NO : 21
C0V2-22-8 SEQ ID NO : 22 SEQ ID NO : 23 SEQ ID NO : 24
C0V2-116-9 SEQ ID NO : 25 SEQ ID NO : 26 SEQ ID NO : 27
C0V2-122-10 SEQ ID NO : 28 SEQ ID NO : 29 SEQ ID NO : 30
C0V2-171-11 SEQ ID NO : 31 SEQ ID NO : 32 SEQ ID NO : 33
C0V2-136-12 SEQ ID NO : 34 SEQ ID NO : 35 SEQ ID NO : 36
C0V2-237-13 SEQ ID NO : 37 SEQ ID NO : 38 SEQ ID NO : 39
C0V2-353-14 SEQ ID NO : 40 SEQ ID NO : 41 SEQ ID NO : 42
C0V2-121-15 SEQ ID NO : 43 SEQ ID NO : 44 SEQ ID NO : 45
C0V2-324-16 SEQ ID NO : 46 SEQ ID NO : 47 SEQ ID NO : 48
C0V2-120-17 SEQ ID NO : 49 SEQ ID NO : 50 SEQ ID NO : 51
C0V2-153-18 SEQ ID NO : 52 SEQ ID NO : 53 SEQ ID NO : 54
C0V2-39-19 SEQ ID NO : 55 SEQ ID NO : 56 SEQ ID NO : 57
C0V2-124-20 SEQ ID NO : 58 SEQ ID NO : 59 SEQ ID NO : 60
C0V2-18-21 SEQ ID NO : 61 SEQ ID NO : 62 SEQ ID NO : 63
C0V2-119-22 SEQ ID NO : 64 SEQ ID NO : 65 SEQ ID NO : 66
C0V2-151-23 SEQ ID NO : 67 SEQ ID NO : 68 SEQ ID NO : 69
C0V2-214-24 SEQ ID NO : 70 SEQ ID NO : 71 SEQ ID NO : 72
C0V2-331-25 SEQ ID NO : 73 SEQ ID NO : 74 SEQ ID NO : 75
C0V2-32-26 SEQ ID NO : 76 SEQ ID NO : 77 SEQ ID NO : 78
C0V2-336-27 SEQ ID NO : 79 SEQ ID NO : 80 SEQ ID NO : 81
1.3 SARS-COV-2-Spike 단백질에 대한 단일 도메인 항체의 평가 및 동정
1.3.1 숙주 박테리아 대장균에서 단일 도메인 항체의 발현, 정제
획득된 상이한 CDR1-3의 27개의 단일 도메인 항체의 유전자 코딩 서열을 각각 발현 벡터 PET32b(Novagen, 제품번호: 69016-3)에 재조합하고, 시퀀싱에 의해 동정된 올바른 재조합 플라스미드를 각각 발현 숙주 박테리아 BL1(DE3)(Tiangen Biotech, 제품번호: CB105-02)로 형질전환시키며, 100 μg/mL의 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 이를 도포하고, 37℃에서 밤새 배양한다. 단일 콜로니를 선택하여 접종하고 밤새 배양하며, 2일째에 밤새 배양된 균주를 옮겨 증폭하고, 37℃의 진탕기에서 OD 값이 0.5 ~ 1이 될 때까지 배양하며, 0.5 mM의 IPTG를 첨가하여 유도하고, 28℃의 진탕기에서 배양한다. 2일째에 원심분리하여 균체를 수집하고, 수집된 균체를 파쇄하여 항체 조추출액을 획득한다. 그 다음 27개의 단일 도메인 항체 단백질을 90% 이상의 순도로 정제한다.
1.3.2 경쟁적 ELISA에 의한 Spike-RBD 단백질과 수용체 ACE2의 결합에 대한 SARS-C0V-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체의 차단 효과의 조사
먼저 HEK293 세포(pCDNA4, Invitrogen, Cat V86220) 발현을 통해 Spike-RBD 단백질과 ACE2 단백질을 획득한다. 그 다음 Thermo사의 Biotinlytion 키트를 사용하여 비오틴화된 ACE2 단백질을 획득한다.
플레이트를 0.5 μg/웰의 Spike-RBD 단백질로 4℃에서 밤새 코팅한 후, 각 웰에 1.3.1에서 정제된 100 ng의 단일 도메인 항체 및 5 μg의 비오틴화된 ACE2 단백질을 첨가하고, 대조군을 설정하며, 대조군 1의 웰에 단일 도메인 항체를 첨가하지 않고, 대조군 2의 웰에 비오틴화된 ACE2 단백질을 첨가하지 않으며, 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 그 다음 SA-HRP(Sigma사에서 구입)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 발색액을 첨가하며, 450 nm의 파장에서 흡수 값을 판독한다. 샘플 OD 값이 대조군 OD 값 대비 0.8 미만인 경우, 단일 도메인 항체는 차단 효과가 있는 것으로 간주된다.
결과는 표 8에 나타낸 바와 같이, 27개의 상이한 단일 도메인 항체 균주가 Spike 단백질/ACE2 단백질 상호작용에 대해 차단 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
샘플 OD
대조군 1 2.250
대조군 2 0.041
C0V2-114-1 0.213
C0V2-187-2 0.181
C0V2-360-3 0.132
C0V2-143-4 0.157
C0V2-13-5 0.195
C0V2-356-6 0.192
C0V2-115-7 0.216
C0V2-22-8 0.412
C0V2-116-9 0.388
C0V2-122-10 0.293
C0V2-171-11 0.358
C0V2-136-12 0.196
C0V2-237-13 0.147
C0V2-353-14 0.223
C0V2-121-15 0.361
C0V2-324-16 0.431
C0V2-120-17 0.382
C0V2-153-18 0.153
C0V2-39-19 0.248
C0V2-124-20 0.328
C0V2-18-21 0.384
C0V2-119-22 0.258
C0V2-151-23 0.152
C0V2-214-24 0.423
C0V2-331-25 0.169
C0V2-32-26 0.188
C0V2-336-27 0.197
생물안전도가 P3인 실험실에서, VERO 세포 모델을 바이러스로 감염시켜, 정제된 27개의 단일 도메인 항체를 각각 배양 시스템에 첨가하고, 구체적인 조작은 다음과 같다. 104/웰의 VERO 세포를 96웰 플레이트에 첨가하고, 24시간 후 PBS로 세포를 2회 세척하며, 27개의 단일 도메인 항체를 각각 바이러스와 혼합하여 96웰 플레이트에 첨가하고, 항체의 초기 농도는 100 μg/mL이며, 그 다음 10개의 구배, 5개의 중복 웰로 2배 각각 희석하고, 37도에서 2시간 동안 배양하며, 5일차에 VERO 세포에 병변이 발생하였는지 여부를 검출한다. 단일 도메인 항체 처리 후 세포에 병변이 발생하지 않으면, 단일 도메인 항체가 바이러스를 중화시키고 VERO 세포의 바이러스 감염을 차단하는 효과가 있음을 나타낸다.
검출 결과에 따르면, 상기 27개의 단일 도메인 항체 처리 후 VERO 세포에는 모두 병변이 발생하지 않았고, 바이러스만 첨가하고 단일 도메인 항체를 첨가하지 않은 VERO 세포에는 대부분 병변이 발생하고 사멸되었으며, 이는 획득된 27개의 단일 도메인 항체 모두가 세포의 바이러스 감염 과정을 차단할 수 있음을 나타내고, 이는 효과적인 중화 항체임을 보여준다.
실시예 2
1.1 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체의 Fc 융합 단백질의 제조
단백질 데이터베이스 Uniprot 상의 인간 면역글로불린(IgGl)의 불변 영역 아미노산 서열에 따라, 인간 IgGl-Fc 영역 아미노산 서열(SEQ ID NO : 109)을 획득한다. PCR을 역전사하여 인간 PBMC 전체 RNA에서 인간 IgGl-Fc를 코딩하는 핵산 단편(핵산 서열은 SEQ ID NO : 137과 같음)을 획득한 다음, overlapping PCR을 통해 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 획득하고, 벡터 pCDNA4(Invitrogen, Cat V86220)에 재조합한다.
SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질의 핵산 단편을 포함하는 성공적으로 구축된 pCDNA4 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켜 발현한다. 구체적으로 재조합 발현 플라스미드를 Freestyle293 배지로 희석하고 형질전환에 필요한 PEI(Polyethylenimine) 용액에 첨가하며, 플라스미드/PEI 혼합물을 각각 HEK293 세포 현탁액에 첨가하고, 37℃, 10% CO2, 100 rpm의 진탕기에서 배양하며; 50 μg/L의 IGF-1을 더 첨가한다. 4시간 후 EX293 배지, 2 mM의 글루타민 및 50 μg/L의 IGF-1을 더 첨가하고, 120 rpm에서 진탕 배양하였다. 24시간 후 3.8 mM의 VPA를 첨가한다. 5일 동안 배양한 후, 발현 배양 상층액을 수집하고, Protein A 친화성 크로마토그래피로 정제하여 SARS-C0V-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질을 획득한다.
획득된 27개의 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질의 서열은 SEQ ID NO : 110 ~ 136과 같다.
1.2 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질의 기능 동정
SPR 방법을 통해 SARS-COV-2-Spike 단백질에 대한 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질의 결합 능력을 동정하였다. 구체적인 조작은 다음과 같다. spike-RBD에 대한 획득된 27개의 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질의 결합 동역학을 표면 플라즈몬 공명(SRP) 방법을 통해 BIAcoreX100 기기를 사용하여 측정하고, spike-RBD 단백질을 CM5 바이오센서 칩에 직접 코팅하여 약 1000개의 반응 단위(response units, RU)를 획득하였다. 동역학 측정의 경우, SARS-C0V-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc의 융합 단백질을 HBS-EP+1×완충액(GE, cat#BR-1006-69)으로 3배 연속 희석(1.62 nm에서 1000 nm까지)하고, 25℃에서 120 s 동안 샘플을 주입하며, 해리 시간은 30분이고, 10 mM의 글리신-HCl(pH 2.0)을 첨가하여 120 s 동안 재생시켰다. 간단한 일대일 Languir 결합 모델(BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 융합 단백질과 SARS-C0V-2-Spike 단백질의 결합 속도(kon), 해리 속도(koff) 및 평형 해리 상수(kD)(koff/kon 비율로 계산)를 계산하였다. 계산 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다.
항체 번호 결합 속도(kon) 해리 속도(koff) 평형 해리 상수(kD; koff/kon)
C0V2-114-1-FC 1.74E+06 1.52E-05 0.87E-12
C0V2-187-2-FC 1.52E+05 3.26E-05 2.14E-11
C0V2-360-3-Fc 2.12E+06 3.45E-04 1.63E-11
C0V2-143-4-FC 3.12E+06 6.25E-05 2.00E-12
C0V2-13-5-Fc 1.45E+06 1.23E-05 0.85E-12
C0V2-356-6-Fc 5.23E+05 5.68E-04 1.09E-10
C0V2-115-7-Fc 1.25E+05 1.68E-05 1.34E-11
C0V2-22-8-Fc 1.89E+05 5.96E-04 3.15E-10
C0V2-116-9-FC 2.56E+06 6.84E-05 2.67E-12
C0V2-122-10-Fc 3.51E+06 9.23E-05 2.63E-12
C0V2-171-ll-Fc 4.23E+06 4.26E-05 1.01E-12
C0V2-136-12-Fc 5.36E+04 5.63E-04 1.05E-9
C0V2-237-13-FC 5.47E+06 5.78E-05 1.06E-12
C0V2-353-14-Fc 9.23E+06 6.34E-05 0.69E-12
C0V2-121-15-Fc 1.29E+06 2.68E-05 2.08E-12
C0V2-324-16-Fc 4.85E+06 3.71E-05 0.76E-12
C0V2-120-17-Fc 6.52E+07 3.64E-04 0.56E-12
C0V2-153-18-Fc 2.56E+06 3.15E-05 1.23E-12
C0V2-39-19-Fc 1.89E+05 2.46E-05 1.30E-11
C0V2-124-20-FC 3.62E+06 3.51E-05 0.97E-12
C0V2-18-21-Fc 5.23E+06 3.99E-05 0.76E-12
C0V2-119-22-Fc 1.86E+06 4.22E-05 2.27E-12
C0V2-151-23-Fc 2.58E+06 3.22E-05 1.25E-12
C0V2-214-24-FC 6.32E+06 1.29E-05 0.20E-12
C0V2-331-25-Fc 4.23E+06 3.56E-05 0.84E-12
C0V2-32-26-Fc 4.26E+06 3.14E-05 0.74E-12
C0V2-336-27-Fc 1.56E+06 6.31E-05 4.04E-12
표 9로부터 알 수 있다시피, SARS-COV-2-Spike 단백질에 대한 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질의 결합 속도는 높고, 해리 속도는 낮으며, 평형 해리 상수 KD는 1.05E-9 미만이고, 이는 융합 단백질이 SARS-COV-2-Spike 단백질에 더 빠르게 결합할 수 있고 해리되기 쉽지 않음을 나타내며, 또한 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질은 하나의 차단형 항체로 매우 우수한 차단 효과를 가짐을 나타낸다.
1.3 경쟁적 ELISA에 의한 Spike 단백질/ACE2의 상호작용에 대한 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질의 차단 능력의 동정
HEK293 세포 발현으로 ACE2 단백질을 획득한다. Thermo사의 Biotinlytion kit를 이용하여 비오틴화된 단백질 ACE2-Biotin을 획득한다.
플레이트를 0.5 μg/웰의 Spike-RBD 단백질로 4℃에서 밤새 코팅한 후, 각 웰에 획득된 27개의 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질 200 ng 및 ACE2-Biotin 5 ug을 첨가하며, 대조군 1에 융합 단백질을 첨가하지 않고, 대조군 2에 ACE2-Biotin을 첨가하지 않으며, 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 세척 후 SA-HRP(Sigma사에서 구입)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시키며, 세척 후 발색액을 첨가하고, 450 nm의 파장에서 흡수 값을 판독한다. 결과는 표 10에 나타낸 바와 같다.
샘플 OD
대조군 1 2.319
대조군 2 0.021
C0V2-114-1 0.135
C0V2-187-2 0.163
C0V2-360-3 0.175
C0V2-143-4 0.129
C0V2-13-5 0.195
C0V2-356-6 0.137
C0V2-115-7 0.253
C0V2-22-8 0.321
C0V2-116-9 0.297
C0V2-122-10 0.203
C0V2-171-11 0.192
C0V2-136-12 0.196
C0V2-237-13 0.107
C0V2-353-14 0.256
C0V2-121-15 0.410
C0V2-324-16 0.302
C0V2-120-17 0.188
C0V2-153-18 0.124
C0V2-39-19 0.199
C0V2-124-20 0.278
C0V2-18-21 0.264
C0V2-119-22 0.156
C0V2-151-23 0.201
C0V2-214-24 0.303
C0V2-331-25 0.142
C0V2-32-26 0.167
C0V2-336-27 0.129
결과에 따르면, SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질은 Spike 단백질과 ACE2 사이의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
1.4 Spike 단백질 결합에 대한 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질의 특이성 분석
인간 HEK293 세포를 이용하여 일시적 형질감염시켜, 현재 공지된 7가지 코로나바이러스(SARS-C0V-2, HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKUl, SARS-CoV, MERS-CoV) Spike 단백질 전장 유전자를 갖는 플라스미드(pCDNA4, Invitrogen, Cat V86220)를 획득하고, 멤브레인에서 Spike 단백질을 일시적으로 발현시켰다. 상기 플라스미드는 Spike 단백질 C 말단을 EGFP에 융합시켜, 녹색 형광 강도를 통해 멤브레인 상의 Spike 단백질의 발현 수준을 조사할 수 있다. 구축된 세포를 0.5%의 PBS-BSA Buffer에 재현탁시키고, SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질을 첨가하는 동시에 음성 대조군을 설정하며, 얼음 위에서 20분 동안 배양한다. 세척 후 eBioscience 이차 항체 anti-hIg-PE를 첨가하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양한다. 세척 후 세포를 500 μl의 0.5% PBS-BSA Buffer에 재현탁시키고, 유세포 분석기로 검출한다. 결과에 따르면, 27개의 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체-Fc 융합 단백질은 SARS-COV-2-Spike 단백질에만 특이적으로 결합하고, 기타 코로나 바이러스의 Spike 단백질에 결합하지 않는다.
1.5 세포의 SARS-COV-2 감염을 차단하는 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질
사전 투여(SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질 100 μg/붉은털 원숭이)된 15마리의 건강한 붉은털 원숭이 및 사전 투여되지 않은 15마리의 건강한 붉은털 원숭이와 SARS-COV-2에 감염된 2마리의 붉은털 원숭이를 동일한 환경에서 10일 동안 사육한다. 10일 후 관찰을 통해 사전 투여된 15마리의 건강한 붉은털 원숭이는 모두 이상이 없고, 바이러스 핵산 검사에서 모두 음성인 것에 대하여, 사전 투여되지 않은 15마리의 건강한 붉은털 원숭이 중 12마리에서 감염 증상이 나타났고, 바이러스 핵산 검출에서 모두 양성인 것을 발견하였다.
상기 시험 결과는 본 발명에 따른 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체가 신종 코로나바이러스 감염을 완전히 차단할 수 있고 우수한 예방 작용을 가짐을 나타낸다.
상기 SARS-COV-2 바이러스에 감염되고 증상이 나타난 12마리의 붉은털 원숭이 중 6마리(치료군)를 본 발명에 따른 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질(SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질 100 μg/붉은털 원숭이)로 투여 치료하고, 기타 6마리(대조군)는 투여 치료를 하지 않았다. 치료 후 6일 동안 1일 1회 바이러스 부하 검출을 수행한다. 검츨 결과, 치료군의 6마리의 붉은털 원숭이의 혈액 1 ml당 신종 코로나바이러스의 평균 부하는 대조군에 비해 현저히 감소되고, 도 6에 도시된 바와 같다. 여기서 신종 코로나바이러스의 부하의 검출 과정은 다음과 같다. 투여 치료된 붉은털 원숭이(치료군)와 투여 치료되지 않은 붉은털 원숭이(대조군)의 혈액을 각각 채취하고, 혈액 내 바이러스의 핵산을 추출하여 검출하였다. 검출 과정은 다음과 같다. RNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 지침에 따라 SARS-C0V-2의 RNA를 추출하고, 획득된 RNA를 50 μL의 용출 buffer에 용해시킨 다음 템플릿으로 하여 RT-PCR 증폭을 수행한다. RT-PCR 산물을 템플릿으로 하고, 프라이머 RBD-qF1(5'-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3', SEQ ID NO : 142) 및 RBD-qR1(5'-CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-3', SEQ ID NO : 143)로 바이러스 S 영역 유전자를 증폭한다. HiScriptR II One Step qRT-PCR SYBRRGreen Kit(Vazyme Biotech Co.,Ltd) 키트를 사용하고, 키트의 지침에 따라 조작하며, PCR 증폭 조건은 50℃ 3 min, 95℃ 10 s, 60℃ 30 s이고, 40 사이클이며, 사용된 PCR 증폭기는 ABI 정량적 PCR 기기이다.
상기 체내 실험 결과에 따르면, 본 발명의 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질은 SARS-COV-2에 감염된 붉은털 원숭이 체내에서 세포의 SARS-COV-2 감염 및 증식을 억제하는 현저한 효과를 나타낸다.
1.6 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질의 안정성 연구
500 mM의 탄산수소암모늄을 염기성 파괴 시약으로 사용하고, 37℃ 에서 48시간 동안 처리한다. 1% 과산화수소를 산화제로 선택하고, 실온에서 10시간 동안 처리한다.
경쟁적 ELISA 방법을 사용하여 처리 전후의 상기 27가지 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성 변화를 검출한다. 48시간 염기 처리 후 경쟁적 ELISA 활성은 0시간 염기 처리에 대해 평균 107%이고; 10시간 산화 후 경쟁적 ELISA 활성은 0시간 산화에 대해 평균 111%이다.
이는 본 발명에 따른 27가지 SARS-COV-2-Spike 단백질 단일 도메인 항체와 Fc 융합 단백질이 높은 안정성을 가짐을 나타낸다.
상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 사상과 원칙 내에서 이루어진 임의의 수정, 균등치환 또는 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 포함되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> SHENZHEN IMMUNOTHERAPY BIOTECH CO., LTD. <120> SARS-COV-2 SPIKE PROTEIN BINDING MOLECULE AND APPLICATION THEREOF <130> PN194476FPSW <150> CN 202010491549.0 <151> 2020-06-02 <160> 143 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 1 Gly Leu Ser Leu Glu His Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 2 Ile Ser Asp Ser Gly Ala Thr Arg 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> CDR3 <400> 3 Ser Ala Thr Pro Gly Ala Phe Arg Thr Cys Ala Phe Arg Asp Phe Ser 1 5 10 15 His Leu Ala Asn 20 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 4 Gly Leu Ser Leu Glu His Tyr Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 5 Ile Asp Ser Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 6 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Ser Leu His Gln Thr Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 7 Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr Ala 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 8 Ile Thr Lys His Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> CDR3 <400> 9 Ala Ala Asp His Arg Ala Leu Arg Phe Gly Cys Ala Val Val Pro Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Asp Tyr 20 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 10 Gly Leu Thr Leu Asn Asn Asn Thr 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 11 Ile Ser Pro Ser Gly Ile Val Thr 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> CDR3 <400> 12 Ala Val Leu Gln Trp Asn Gly Ala Gly Leu Pro Ser Pro Leu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 13 Gly Phe Thr Leu Gly Asn Tyr Glu 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 14 Ile Ser Arg Ser Gly Val Ile Phe 1 5 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> CDR3 <400> 15 Ala Ala Arg Phe Arg Ala Gly Leu Val Gln Ser Leu Cys Gln Ser Thr 1 5 10 15 Pro Glu Phe Tyr Gln Asp 20 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 16 Gly Phe Thr Leu Gly Asn Tyr Ala 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 17 Ile Ser Leu Ser Gly Asp Ile Ile 1 5 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> CDR3 <400> 18 Ala Ala Pro Phe Pro Ser Leu Leu Tyr Cys Ser Leu Cys Pro Ser Asn 1 5 10 15 Pro Glu Phe Cys Arg His 20 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 19 Gly Phe Ser Leu Asp Gly Tyr Ala 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 20 Ile Gly Arg Leu Gly Thr Thr Thr 1 5 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> CDR3 <400> 21 Ala Ala Lys Arg Ser Thr Trp Phe Gly Cys Ser Thr Leu Asp Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 22 Gly Phe Thr Leu Asp Arg Tyr Ala 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> CDR2 <400> 23 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 24 Ala Ala Gly Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Cys Ser Arg Gln Ala Arg Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 25 Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 26 Ile Ser Ser Ser Gly Thr Ser Thr 1 5 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 27 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Ser Leu His Gln Thr Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 28 Gly Ala Thr Ser Asp Ile Tyr Ala 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 29 Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 30 Ala Ala Ala Ser Pro Ser Trp His Tyr Cys Ser Gly Tyr Glu His Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Asp <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 31 Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 32 Ile Ser Pro Ser Gly Thr Ser Thr 1 5 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 33 Ala Ala Ala Asn Pro Ser Tyr Tyr Tyr Cys Ser Gly Tyr Pro His Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Asp <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 34 Gly Phe Thr Phe His Tyr Tyr Ala 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 35 Ile Ser Ser Gly Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 36 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Leu His Tyr Cys Ser Gly Leu Val Gly Glu 1 5 10 15 Tyr Glu Tyr <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 37 Phe Lys Ser Tyr His Ile Ala Trp 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 38 Ser Leu Thr Gly Ala Ser Ile Thr 1 5 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> CDR3 <400> 39 Ala Ala Arg Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Arg Asn Glu Ala 1 5 10 15 Met Tyr Ala Tyr 20 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 40 Gly Phe Arg Leu Gly Gly Tyr Ala 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 41 Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ile Ser 1 5 <210> 42 <211> 24 <212> PRT <213> CDR3 <400> 42 Ala Ala Pro Ser Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Arg Arg Leu Pro Cys Gly 1 5 10 15 Ile Asp Ser Gln Asp Tyr Gln Thr 20 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 43 Phe Asp Asp Phe Ala Ile Gly Trp 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 44 Ser Ala Arg Gly Ile Val Asn Thr 1 5 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> CDR3 <400> 45 Ala Ala Leu Val Gly Leu Asn Asp Arg Ser Leu Pro His Glu Ala Glu 1 5 10 15 Glu Tyr Asp Tyr 20 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 46 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ser 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 47 Phe Ser Ser Leu Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> CDR3 <400> 48 Ala Ala Thr Arg Gly Ser Ser Trp Tyr Trp Tyr Arg Pro Ser Glu Tyr 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 49 Gly His Thr Gly Ser Thr Tyr Ile 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 50 Ile Ser Arg Ser Gly Ile Leu Arg 1 5 <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 51 Ala Ala Arg Asp Ser Leu Thr Gly Val Ile Gly Asn Thr Pro Gly Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 52 Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr Val 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 53 Ile Ser Arg Ser Gly Ile Ile Thr 1 5 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> CDR3 <400> 54 Ala Ala Ala Gln Thr Gln Val Leu Pro Thr Glu Asp Arg Ser Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 55 Gly Arg Thr Phe Thr Arg Tyr Pro 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 56 Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr 1 5 <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 57 Ala Val Asp Asn Ala Pro Thr Ser Ser Leu Pro Leu Thr Pro Gly Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 58 Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> CDR2 <400> 59 Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr 1 5 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> CDR3 <400> 60 Ala Ala Asn Arg Gly Arg Phe Thr Gly Trp Arg Ser Leu Thr Asp Tyr 1 5 10 15 Thr Tyr <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 61 Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Ala 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 62 Ile Ser Pro Ser Arg Ile Ile Thr 1 5 <210> 63 <211> 19 <212> PRT <213> CDR3 <400> 63 Ala Ala Asp Ser Ser Tyr Gly Gly Arg Leu Gly Arg Arg Ile Asp Asp 1 5 10 15 Tyr Glu Tyr <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 64 Gly Ser Gly Val Ser Thr Gly Ser 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> CDR2 <400> 65 Tyr Thr Ser Val Gly Ser Ile 1 5 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> CDR3 <400> 66 Ala Phe Phe Val Pro Phe Gly Asp Thr Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 67 Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr 1 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 68 Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> CDR3 <400> 69 Ala Ala Gly Leu Ser Pro Leu Met Leu Thr Ala Ser Arg Arg Tyr Glu 1 5 10 15 Tyr <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 70 Gly Arg Thr Val Ser Met Tyr Ala 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 71 Ile Ser Arg Ser Gly Arg Ser Thr 1 5 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> CDR3 <400> 72 Ala Ala Arg Asp Gly Gly Leu His Tyr Ala Leu Tyr Val Glu Ala Ser 1 5 10 15 His Tyr Asn Tyr 20 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 73 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 74 Leu Asp Val Thr Gly Arg Ser Thr 1 5 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> CDR3 <400> 75 Ala Ala Val Tyr Thr Pro Phe Arg Phe Ala Phe Lys Thr Asp Pro Asp 1 5 10 15 Arg Gln Asp His 20 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 76 Gly Arg Thr Phe Gly Thr Tyr Arg 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 77 Ile Phe Trp Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> CDR3 <400> 78 Ala Ala Arg Ala Pro Thr Thr Gln Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> CDR1 <400> 79 Gly Arg Thr Leu Ser Thr Tyr Glu 1 5 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> CDR2 <400> 80 Val Thr Pro Thr Gly Phe Gly Thr 1 5 <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> CDR3 <400> 81 Ala Gly Ser Gly Lys Gly Leu Gly Ser Leu Gln Arg Ser Pro Asp Asp 1 5 10 15 <210> 82 <211> 127 <212> PRT <213> VHH1 <400> 82 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Ser Leu Glu His Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Asp Ser Gly Ala Thr Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ala Thr Pro Gly Ala Phe Arg Thr Cys Ala Phe Arg Asp Phe Ser 100 105 110 His Leu Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 83 <211> 126 <212> PRT <213> VHH2 <400> 83 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Ser Leu Glu His Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Asp Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Ser Leu His Gln Thr Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 84 <211> 127 <212> PRT <213> VHH3 <400> 84 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Thr Lys His Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp His Arg Ala Leu Arg Phe Gly Cys Ala Val Val Pro Gly 100 105 110 Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 85 <211> 123 <212> PRT <213> VHH4 <400> 85 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn Asn Asn 20 25 30 Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Gly Ile Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Leu Gln Trp Asn Gly Ala Gly Leu Pro Ser Pro Leu Gly Ser 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 129 <212> PRT <213> VHH5 <400> 86 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asn Tyr 20 25 30 Glu Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Val Ile Phe Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Phe Arg Ala Gly Leu Val Gln Ser Leu Cys Gln Ser Thr 100 105 110 Pro Glu Phe Tyr Gln Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 87 <211> 129 <212> PRT <213> VHH6 <400> 87 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Leu Ser Gly Asp Ile Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Phe Pro Ser Leu Leu Tyr Cys Ser Leu Cys Pro Ser Asn 100 105 110 Pro Glu Phe Cys Arg His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 88 <211> 125 <212> PRT <213> VHH7 <400> 88 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Gly Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Gly Arg Leu Gly Thr Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Lys Arg Ser Thr Trp Phe Gly Cys Ser Thr Leu Asp Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 89 <211> 125 <212> PRT <213> VHH8 <400> 89 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Arg Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Cys Ser Arg Gln Ala Arg Arg Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 90 <211> 126 <212> PRT <213> VHH9 <400> 90 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Ser Leu His Gln Thr Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 91 <211> 126 <212> PRT <213> VHH10 <400> 91 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ala Thr Ser Asp Ile Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Ser Pro Ser Trp His Tyr Cys Ser Gly Tyr Glu His Glu 100 105 110 Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 92 <211> 126 <212> PRT <213> VHH11 <400> 92 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Asn Pro Ser Tyr Tyr Tyr Cys Ser Gly Tyr Pro His Glu 100 105 110 Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 93 <211> 126 <212> PRT <213> VHH12 <400> 93 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Leu His Tyr Cys Ser Gly Leu Val Gly Glu 100 105 110 Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 94 <211> 127 <212> PRT <213> VHH13 <400> 94 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Phe Lys Ser Tyr His Ile Ala 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ser Leu Thr Gly Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Arg Asn Glu Ala 100 105 110 Met Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 95 <211> 131 <212> PRT <213> VHH14 <400> 95 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Arg Leu Gly Gly Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ile Ser Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Ser Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Arg Arg Leu Pro Cys Gly 100 105 110 Ile Asp Ser Gln Asp Tyr Gln Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 96 <211> 127 <212> PRT <213> VHH15 <400> 96 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Phe Asp Asp Phe Ala Ile Gly 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ser Ala Arg Gly Ile Val Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Val Gly Leu Asn Asp Arg Ser Leu Pro His Glu Ala Glu 100 105 110 Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 97 <211> 125 <212> PRT <213> VHH16 <400> 97 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Phe Ser Ser Leu Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Arg Gly Ser Ser Trp Tyr Trp Tyr Arg Pro Ser Glu Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 98 <211> 126 <212> PRT <213> VHH17 <400> 98 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly His Thr Gly Ser Thr Tyr 20 25 30 Ile Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Ile Leu Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Asp Ser Leu Thr Gly Val Ile Gly Asn Thr Pro Gly Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 99 <211> 124 <212> PRT <213> VHH18 <400> 99 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gln Thr Gln Val Leu Pro Thr Glu Asp Arg Ser Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 126 <212> PRT <213> VHH19 <400> 100 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Asp Asn Ala Pro Thr Ser Ser Leu Pro Leu Thr Pro Gly Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 101 <211> 124 <212> PRT <213> VHH20 <400> 101 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asn Arg Gly Arg Phe Thr Gly Trp Arg Ser Leu Thr Asp Tyr Thr 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 102 <211> 126 <212> PRT <213> VHH21 <400> 102 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Arg Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Ser Ser Tyr Gly Gly Arg Leu Gly Arg Arg Ile Asp Asp 100 105 110 Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 103 <211> 116 <212> PRT <213> VHH22 <400> 103 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Tyr Thr Ser Val Gly Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Phe Val Pro Phe Gly Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 124 <212> PRT <213> VHH23 <400> 104 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser 20 25 30 Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Ser Pro Leu Met Leu Thr Ala Ser Arg Arg Tyr Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 105 <211> 127 <212> PRT <213> VHH24 <400> 105 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Asp Gly Gly Leu His Tyr Ala Leu Tyr Val Glu Ala Ser 100 105 110 His Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 106 <211> 127 <212> PRT <213> VHH25 <400> 106 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Leu Asp Val Thr Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Tyr Thr Pro Phe Arg Phe Ala Phe Lys Thr Asp Pro Asp 100 105 110 Arg Gln Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 107 <211> 119 <212> PRT <213> VHH26 <400> 107 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Thr Tyr 20 25 30 Arg Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Phe Trp Ser Gly Gly Gly Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Ala Pro Thr Thr Gln Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 108 <211> 123 <212> PRT <213> VHH27 <400> 108 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Glu Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Val Thr Pro Thr Gly Phe Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gly Lys Gly Leu Gly Ser Leu Gln Arg Ser Pro Asp Asp 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 109 <211> 232 <212> PRT <213> Fc <400> 109 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 110 <211> 359 <212> PRT <213> VHH1-Fc <400> 110 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Ser Leu Glu His Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Asp Ser Gly Ala Thr Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ala Thr Pro Gly Ala Phe Arg Thr Cys Ala Phe Arg Asp Phe Ser 100 105 110 His Leu Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 111 <211> 358 <212> PRT <213> VHH2-Fc <400> 111 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Ser Leu Glu His Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Asp Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Ser Leu His Gln Thr Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 112 <211> 359 <212> PRT <213> VHH3-Fc <400> 112 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Thr Lys His Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp His Arg Ala Leu Arg Phe Gly Cys Ala Val Val Pro Gly 100 105 110 Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 113 <211> 355 <212> PRT <213> VHH4-Fc <400> 113 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn Asn Asn 20 25 30 Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Gly Ile Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Leu Gln Trp Asn Gly Ala Gly Leu Pro Ser Pro Leu Gly Ser 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser 115 120 125 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 145 150 155 160 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 165 170 175 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 180 185 190 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 195 200 205 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 210 215 220 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 225 230 235 240 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 245 250 255 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 260 265 270 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 275 280 285 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 290 295 300 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 305 310 315 320 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 325 330 335 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 340 345 350 Pro Gly Lys 355 <210> 114 <211> 361 <212> PRT <213> VHH5-Fc <400> 114 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asn Tyr 20 25 30 Glu Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Val Ile Phe Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Phe Arg Ala Gly Leu Val Gln Ser Leu Cys Gln Ser Thr 100 105 110 Pro Glu Phe Tyr Gln Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 130 135 140 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 165 170 175 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 180 185 190 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 195 200 205 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 210 215 220 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 225 230 235 240 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 245 250 255 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 260 265 270 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 275 280 285 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 290 295 300 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 305 310 315 320 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 325 330 335 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 340 345 350 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 <210> 115 <211> 361 <212> PRT <213> VHH6-Fc <400> 115 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Leu Ser Gly Asp Ile Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Phe Pro Ser Leu Leu Tyr Cys Ser Leu Cys Pro Ser Asn 100 105 110 Pro Glu Phe Cys Arg His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 130 135 140 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 165 170 175 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 180 185 190 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 195 200 205 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 210 215 220 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 225 230 235 240 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 245 250 255 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 260 265 270 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 275 280 285 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 290 295 300 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 305 310 315 320 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 325 330 335 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 340 345 350 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 <210> 116 <211> 357 <212> PRT <213> VHH7-Fc <400> 116 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Gly Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Gly Arg Leu Gly Thr Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Lys Arg Ser Thr Trp Phe Gly Cys Ser Thr Leu Asp Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 130 135 140 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 260 265 270 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 117 <211> 357 <212> PRT <213> VHH8-Fc <400> 117 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Arg Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Cys Ser Arg Gln Ala Arg Arg Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 130 135 140 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 260 265 270 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 118 <211> 358 <212> PRT <213> VHH9-Fc <400> 118 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Ser Leu His Gln Thr Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 119 <211> 358 <212> PRT <213> VHH10-Fc <400> 119 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ala Thr Ser Asp Ile Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Ser Pro Ser Trp His Tyr Cys Ser Gly Tyr Glu His Glu 100 105 110 Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 120 <211> 358 <212> PRT <213> VHH11-Fc <400> 120 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Asn Pro Ser Tyr Tyr Tyr Cys Ser Gly Tyr Pro His Glu 100 105 110 Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 121 <211> 358 <212> PRT <213> VHH12-Fc <400> 121 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Gly Ser Leu His Tyr Cys Ser Gly Leu Val Gly Glu 100 105 110 Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 122 <211> 359 <212> PRT <213> VHH13-Fc <400> 122 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Phe Lys Ser Tyr His Ile Ala 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ser Leu Thr Gly Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Arg Asn Glu Ala 100 105 110 Met Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 123 <211> 363 <212> PRT <213> VHH14-Fc <400> 123 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Arg Leu Gly Gly Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ile Ser Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Ser Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Arg Arg Leu Pro Cys Gly 100 105 110 Ile Asp Ser Gln Asp Tyr Gln Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 130 135 140 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 145 150 155 160 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 165 170 175 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 180 185 190 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 195 200 205 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 210 215 220 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 225 230 235 240 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 245 250 255 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 260 265 270 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 275 280 285 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 290 295 300 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 325 330 335 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 340 345 350 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 <210> 124 <211> 359 <212> PRT <213> VHH15-Fc <400> 124 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Phe Asp Asp Phe Ala Ile Gly 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ser Ala Arg Gly Ile Val Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Val Gly Leu Asn Asp Arg Ser Leu Pro His Glu Ala Glu 100 105 110 Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 125 <211> 357 <212> PRT <213> VHH16-Fc <400> 125 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Phe Ser Ser Leu Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Arg Gly Ser Ser Trp Tyr Trp Tyr Arg Pro Ser Glu Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 130 135 140 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 260 265 270 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 126 <211> 358 <212> PRT <213> VHH17-Fc <400> 126 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly His Thr Gly Ser Thr Tyr 20 25 30 Ile Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Ile Leu Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Asp Ser Leu Thr Gly Val Ile Gly Asn Thr Pro Gly Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 127 <211> 356 <212> PRT <213> VHH18-Fc <400> 127 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gln Thr Gln Val Leu Pro Thr Glu Asp Arg Ser Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 130 135 140 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 145 150 155 160 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 165 170 175 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 180 185 190 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 195 200 205 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 210 215 220 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 245 250 255 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 260 265 270 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 275 280 285 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 290 295 300 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 305 310 315 320 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 325 330 335 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 340 345 350 Ser Pro Gly Lys 355 <210> 128 <211> 358 <212> PRT <213> VHH19-Fc <400> 128 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Asp Asn Ala Pro Thr Ser Ser Leu Pro Leu Thr Pro Gly Glu 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 129 <211> 356 <212> PRT <213> VHH20-Fc <400> 129 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asn Arg Gly Arg Phe Thr Gly Trp Arg Ser Leu Thr Asp Tyr Thr 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 130 135 140 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 145 150 155 160 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 165 170 175 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 180 185 190 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 195 200 205 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 210 215 220 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 245 250 255 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 260 265 270 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 275 280 285 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 290 295 300 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 305 310 315 320 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 325 330 335 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 340 345 350 Ser Pro Gly Lys 355 <210> 130 <211> 358 <212> PRT <213> VHH21-Fc <400> 130 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Pro Ser Arg Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Ser Ser Tyr Gly Gly Arg Leu Gly Arg Arg Ile Asp Asp 100 105 110 Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 131 <211> 348 <212> PRT <213> VHH22-Fc <400> 131 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Tyr Thr Ser Val Gly Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Phe Val Pro Phe Gly Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 160 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 165 170 175 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 195 200 205 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 210 215 220 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 225 230 235 240 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 245 250 255 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 260 265 270 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 275 280 285 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 290 295 300 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 305 310 315 320 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 325 330 335 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 132 <211> 356 <212> PRT <213> VHH23-Fc <400> 132 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser 20 25 30 Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Ser Pro Leu Met Leu Thr Ala Ser Arg Arg Tyr Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 130 135 140 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 145 150 155 160 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 165 170 175 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 180 185 190 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 195 200 205 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 210 215 220 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 245 250 255 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 260 265 270 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 275 280 285 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 290 295 300 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 305 310 315 320 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 325 330 335 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 340 345 350 Ser Pro Gly Lys 355 <210> 133 <211> 359 <212> PRT <213> VHH24-Fc <400> 133 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Asp Gly Gly Leu His Tyr Ala Leu Tyr Val Glu Ala Ser 100 105 110 His Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 134 <211> 359 <212> PRT <213> VHH25-Fc <400> 134 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Leu Asp Val Thr Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Tyr Thr Pro Phe Arg Phe Ala Phe Lys Thr Asp Pro Asp 100 105 110 Arg Gln Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 135 <211> 351 <212> PRT <213> VHH26-Fc <400> 135 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Thr Tyr 20 25 30 Arg Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Phe Trp Ser Gly Gly Gly Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Ala Pro Thr Thr Gln Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 115 120 125 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 145 150 155 160 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 165 170 175 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 180 185 190 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 195 200 205 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 210 215 220 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 225 230 235 240 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 245 250 255 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 260 265 270 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 275 280 285 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 290 295 300 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 305 310 315 320 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 325 330 335 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 350 <210> 136 <211> 355 <212> PRT <213> VHH27-Fc <400> 136 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Glu Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Val Thr Pro Thr Gly Phe Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gly Lys Gly Leu Gly Ser Leu Gln Arg Ser Pro Asp Asp 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser 115 120 125 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 145 150 155 160 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 165 170 175 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 180 185 190 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 195 200 205 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 210 215 220 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 225 230 235 240 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 245 250 255 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 260 265 270 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 275 280 285 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 290 295 300 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 305 310 315 320 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 325 330 335 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 340 345 350 Pro Gly Lys 355 <210> 137 <211> 705 <212> DNA <213> Fc <400> 137 cgtacggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 60 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420 tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 705 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Primer For-1 <400> 138 gtcctggctg ctcttctaca agg 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Primer Rev-1 <400> 139 ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23 <210> 140 <211> 32 <212> DNA <213> Primer For-2 <400> 140 ctagtgcggc cgctggagac ggtgacctgg gt 32 <210> 141 <211> 29 <212> DNA <213> Primer Rev-2 <400> 141 gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> RBD-qF1 <400> 142 caatggttta acaggcacag g 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> RBD-qR1 <400> 143 ctcaagtgtc tgtggatcac g 21

Claims (22)

  1. SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자로서,
    SARS-COV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 중의 CDR1, CDR2 및 CDR3은,
    1) SEQ ID NO : l로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 2로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 3으로 표시되는 CDR3;
    2) SEQ ID NO : 4로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 5로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 6으로 표시되는 CDR3;
    3) SEQ ID NO : 7로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 8로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 9로 표시되는 CDR3;
    4) SEQ ID NO : 10으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 11로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 12로 표시되는 CDR3;
    5) SEQ ID NO : 13으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 14로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 15로 표시되는 CDR3;
    6) SEQ ID NO : 16으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 17로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 18로 표시되는 CDR3;
    7) SEQ ID NO : 19로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 20으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 21로 표시되는 CDR3;
    8) SEQ ID NO : 22로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 23으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 24로 표시되는 CDR3;
    9) SEQ ID NO : 25로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 26으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 27로 표시되는 CDR3;
    10) SEQ ID NO : 28로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 29로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 30으로 표시되는 CDR3;
    11) SEQ ID NO : 31로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 32로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 33으로 표시되는 CDR3;
    12) SEQ ID NO : 34로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 35로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 36으로 표시되는 CDR3;
    13) SEQ ID NO : 37로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 38로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 39로 표시되는 CDR3;
    14) SEQ ID NO : 40으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 41로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 42로 표시되는 CDR3;
    15) SEQ ID NO : 43으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 44로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 45로 표시되는 CDR3;
    16) SEQ ID NO : 46으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 47로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 48로 표시되는 CDR3;
    17) SEQ ID NO : 49로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 50으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 51로 표시되는 CDR3;
    18) SEQ ID NO : 52로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 53으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 54로 표시되는 CDR3;
    19) SEQ ID NO : 55로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 56으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 57로 표시되는 CDR3;
    20) SEQ ID NO : 58로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 59로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 60으로 표시되는 CDR3;
    21) SEQ ID NO : 61로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 62로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 63으로 표시되는 CDR3;
    22) SEQ ID NO : 64로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 65로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 66으로 표시되는 CDR3;
    23) SEQ ID NO : 67로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 68로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 69로 표시되는 CDR3;
    24) SEQ ID NO : 70으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 71로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 72로 표시되는 CDR3;
    25) SEQ ID NO : 73으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 74로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 75로 표시되는 CDR3;
    26) SEQ ID NO : 76으로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 77로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 78로 표시되는 CDR3; 및
    27) SEQ ID NO : 79로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO : 80으로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 81로 표시되는 CDR3의 조합으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 SEQ ID NO : 82 ~ 108 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역글로불린 Fc 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 면역글로불린 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgGl의 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 109인 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  11. 제10항에 있어서,
    SEQ ID NO : 110 ~ 136 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합에 대한 KD 값이 1×10-8M 미만인 특징 a;
    SARS-COV-2와 인체 세포 수용체 ACE2의 결합을 차단하는 특징 b; 및
    SARS-COV-2의 감염 및 증폭을 억제하는 특징 c 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  13. 제7항에 있어서,
    SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합에 대한 KD 값이 1Х10-8M 미만인 특징 a;
    SARS-COV-2 스파이크 단백질과 인체 세포 수용체 ACE2의 결합을 차단하는 특징 b; 및
    SARS-COV-2의 감염 및 증폭을 억제하는 특징 c 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자.
  15. 제14항에 따른 핵산 분자 및 이의 발현 조절 요소를 포함하는 발현 벡터.
  16. 제14항에 따른 핵산 분자를 포함하고 발현하는 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자의 획득 방법으로서,
    상기 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자의 발현을 허용하는 조건 하에 제16항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 a; 및
    단계 a의 배양물에서 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 수집하는 단계 b를 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자의 획득 방법.
  18. 면역 접합체로서,
    치료 모이어티에 접합된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
  19. 약학적 조성물로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자 및/또는 제18항에 따른 면역 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 신종 코로나바이러스 폐렴의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 제19항에 따른 약학적 조성물의 응용.
  21. SARS-COV-2 검출용 키트로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-COV-2 검출용 키트.
  22. 제21항에 따른 키트의 사용 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자와 SARS-COV-2 스파이크 단백질 사이에 복합체가 형성될 수 있는 조건 하에, 검출 샘플과 대조 샘플을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 SARS-COV-2 스파이크 단백질 결합 분자에 접촉시켜 복합체의 형성을 검출하며;
    상기 검출 샘플과 대조 샘플 사이의 복합체 형성의 차이를 통해 샘플 중의 SARS-COV-2의 존재를 판단하는 것을 특징으로 하는 키트의 사용 방법.
KR1020227046331A 2020-06-02 2021-03-08 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용 KR20230018488A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010491549.0A CN111647077B (zh) 2020-06-02 2020-06-02 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用
CN202010491549.0 2020-06-02
PCT/CN2021/079568 WO2021244089A1 (zh) 2020-06-02 2021-03-08 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230018488A true KR20230018488A (ko) 2023-02-07

Family

ID=72344706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227046331A KR20230018488A (ko) 2020-06-02 2021-03-08 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 분자 및 이의 응용

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230331822A1 (ko)
EP (1) EP4159757A4 (ko)
JP (1) JP2023527927A (ko)
KR (1) KR20230018488A (ko)
CN (1) CN111647077B (ko)
AU (1) AU2021285330A1 (ko)
WO (1) WO2021244089A1 (ko)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CR20220552A (es) 2020-04-02 2023-01-17 Regeneron Pharma Anticuerpos contra glicoproteína de espícula anti-sars-cov-2 y fragmentos de unión al antígeno
EP3972987B1 (en) 2020-04-10 2023-06-07 Akston Biosciences Corporation Antigen specific immunotherapy for covid-19 fusion proteins and methods of use
CN111647077B (zh) * 2020-06-02 2021-02-09 深圳市因诺赛生物科技有限公司 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用
MX2022016215A (es) * 2020-06-15 2023-05-30 Neuome Peptides Pte Ltd Dispositivo de ensayo de flujo lateral para deteccion de analitos y metodo de deteccion de los mismos.
EP4211159A1 (en) * 2020-09-14 2023-07-19 Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd. Neutralizing antibodies against sars-cov-2
EP3970798A1 (en) * 2020-09-18 2022-03-23 NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen Sars-cov-2-nanobodies
CN112062840A (zh) 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用
CN114456260B (zh) * 2020-09-23 2023-05-12 深圳市因诺赛生物科技有限公司 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用
WO2022061720A1 (zh) * 2020-09-25 2022-03-31 中国科学技术大学 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
AU2021350020A1 (en) * 2020-09-25 2023-04-27 DNARx Systems and methods for expressing biomolecules in a subject
WO2022075921A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-14 Hummingbird Bioscience Holdings Limited Sars-cov-2 spike protein antigen-binding molecules
CN112409488B (zh) * 2020-10-23 2022-07-01 中国科学院上海药物研究所 针对多种冠状病毒的单克隆抗体及应用
KR20220054080A (ko) * 2020-10-23 2022-05-02 주식회사 와이바이오로직스 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
EP3992205A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-04 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Sars coronavirus-2 spike protein binding compounds
CN112316130B (zh) * 2020-11-05 2023-11-28 武汉科技大学 一种SARS-CoV2粘膜免疫疫苗及其应用
WO2022095968A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Shanghaitech University ANTIBODIES AGAINST SARS-CoV-2 SPIKE PROTEIN
CN112625136B (zh) * 2020-11-18 2022-02-11 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途
WO2022139680A1 (en) * 2020-12-21 2022-06-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sars-cov-2 binding molecules and uses thereof
CN112782401A (zh) * 2021-02-08 2021-05-11 聊城大学 一种体外快速检测新型冠状病毒的方法及应用
CN112898437B (zh) * 2021-03-24 2024-02-02 思格(苏州)生物科技有限公司 一种新冠病毒抗原及其制备方法与应用
CN115160434B (zh) * 2022-05-26 2023-05-02 广东菲鹏制药股份有限公司 人源化单域抗体及其应用和药物
CN114773464B (zh) * 2022-06-20 2022-08-26 北京市疾病预防控制中心 一种针对新冠病毒omicron株S蛋白的单域抗体VHH-2及编码序列和应用
EP4335870A1 (en) * 2022-09-06 2024-03-13 NantCell, Inc. Peptide therapeutics against sars-cov-2 spike protein

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2162823T5 (es) 1992-08-21 2010-08-09 Vrije Universiteit Brussel Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.
CN110974950B (zh) * 2020-03-05 2020-08-07 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗
CN111153991A (zh) * 2020-02-26 2020-05-15 北京博奥森生物技术有限公司 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111088283B (zh) * 2020-03-20 2020-06-23 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗
CN111647077B (zh) * 2020-06-02 2021-02-09 深圳市因诺赛生物科技有限公司 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111647077B (zh) 2021-02-09
EP4159757A1 (en) 2023-04-05
CN111647077A (zh) 2020-09-11
JP2023527927A (ja) 2023-06-30
WO2021244089A1 (zh) 2021-12-09
AU2021285330A1 (en) 2023-01-19
EP4159757A4 (en) 2023-11-08
US20230331822A1 (en) 2023-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111647077B (zh) 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用
US10253104B2 (en) Bispecific antibodies against CD3ϵ and BCMA
US7884054B2 (en) Methods for identifying functional antibodies
CN114456260B (zh) 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用
US9212231B2 (en) TRAIL R2-specific multimeric scaffolds
CN113164781B (zh) 拮抗性cd40单克隆抗体及其用途
CN110698562B (zh) 抗人msln单克隆抗体
KR20180055824A (ko) 항 메소텔린 완전 인간 항체 및 메소텔린을 타겟팅하는 면역효과 세포
KR20140091031A (ko) 저밀도 지단백질-관련 단백질 6 (lrp6) - 반감기 연장제 구축물
CN113527488A (zh) 一种靶向人程序性死亡配体1（pd-l1）的单可变域抗体及其衍生物
CN111479825A (zh) 特异性结合分子
KR20200143730A (ko) 3가 삼중 특이성 항체 구조물
CN110092826B (zh) CTLA-4类似物CFN13及CFN13-Fc基因和蛋白
RU2804458C2 (ru) Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с 5t4 и 4-1bb, и относящиеся к ним композиции и способы
CN115433274A (zh) 靶向人血清白蛋白（hsa）的纳米抗体及其应用
CN109706164A (zh) 微环dna表达连接人和猴cd20与效应细胞抗原的桥接分子及其应用
CN114805581A (zh) 靶向il13ra2的抗体、嵌合抗原受体及其用途