CN103261222A - 抗体衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其涉及包含抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL23抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，及其在治疗中的用途。本发明还涉及有用的抗-IL-6抗体和抗-IL-23抗体。

Description

抗体衍生物
本公开涉及新的抗体衍生物、用于制备它们的方法、包含它们的组合物及其在治疗中的用途。 
前言 
双特异性抗体 
单特异性抗体(如天然存在的IgG)具有两个相同的抗原结合互补位，因为它们由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。双特异性抗体是改造的免疫球蛋白衍生物，其具有通常针对不同抗原或表位的两个不同的结合互补位。 
已研发了重组双特异性抗体(“双特异性剂(bispecifics)”)用于多种不同的应用，举几个例来说，可能用于癌症治疗、炎性病症和溶栓治疗。在癌症治疗中，这些应用包括效应分子(转化前体药物的酶、放射性同位素、补体成分)、效应细胞(CTL、NK细胞)的重新靶向和前体药物或化疗剂的递送。在炎症的背景中，已研发了双特异性剂来抑制两种或多种细胞因子。最近的工作探究它们作为胞内双特异性抗体(胞内抗体)的用途(Kontermann和Müller，1999)。在一项研究中，用胞内表达的双抗体来抑制两种细胞表面受体的功能性表达(Jendreyko等，2003)。 
双特异性剂必须对疾病相关抗原具有强烈和选择性的结合，并通过多种技术(如抗体人源化、转基因人源化小鼠的使用或去免疫(de-immunization))设计为无免疫原性。产生具有充分质量和足够数量的材料用于体内临床前和临床研究的困难妨碍了双特异性抗体的广泛发展。通常，高效的双特异性抗体产生需要使得能够形成稳定的同源双特异性蛋白质的新的结构形式和导致高水平产生的高效表达系统二者。已用多种方法来在原核和/或真核系统中产生双特异性抗体，主要涉及抗原结合结 构域的遗传融合。还测试了一些有限的使用化学缀合的努力。 
重组双特异性抗体在保存条件下的稳定性以及这些分子的体内稳定性和半衰期是对临床应用具有强烈影响的关键参数。双特异性剂必须足够稳定，以允许该分子在被降解前诱导治疗裨益。几项研究显示，串联scFv分子以及双抗体在生理条件下失活，半衰期取决于所测试的抗体构建体而不同。改善抗体分子稳定性的一种方法是产生二硫键稳定的分子，在VH-VL界面之间引入半胱氨酸桥来抑制VH和VL结构域的解离。但是，已报道这些二硫键稳定的双特异性双抗体在大肠杆菌(E.coli)中的产率明显降低。因此，存在对适用于治疗应用的具有改善的稳定性、半衰期和产率的其他双特异性构建体的需要。 
白细胞介素及其在TH介导的反应中的作用 
CD4+T辅助(TH)淋巴细胞代表在适应性免疫中发挥重要作用的细胞的异质群体。这些细胞包括致力于对抗病原体的效应细胞和避免对自身抗原的效应反应的调节T细胞(Treg)。术语TH源自这些细胞对帮助B细胞产生抗体至关重要的观察结果。另一方面，发现CD4+T细胞负责帮助CD8+T细胞分化为所谓细胞介导免疫的杀伤效应细胞。CD4+T细胞本身可以是免疫反应(如迟发型超敏反应)中的免疫效应细胞，其中这些细胞诱导主要表征为巨噬细胞激活的炎症反应。 
二十年前，描述了两个T辅助细胞亚群。TH1细胞产生IFNγ，它们的主要作用是对抗胞内微生物，而TH2细胞产生IL-4、IL-5和IL-13，历史上与特应性和哮喘相关。TH1和TH2细胞发育处于某些转录因子的控制之下，包括T细胞中表达的T盒(Tbet)、TH1细胞的信号转导物和转录激活物(STAT)4，及TH2细胞的GATA结合蛋白(GATA)-3和STAT6。 
TH1分化主要由IL-12和IFNγ驱动，而IL-4(在缺乏IL-12的情况下)驱动TH2分化。在CD4+T细胞中，认为IL-12信号发放连同抗原呈递使细胞分化转向T辅助(TH)1表型，并与促炎症细胞因子干扰素γ(IFN-γ)的稳健产生相关。 
最近描述的T辅助细胞的第三亚群(TH17细胞)在黏膜界面丰度高， 其中它们包含致病细菌和真菌的感染。这些细胞产生涉及嗜中性、组织重塑和修复及抗微生物蛋白质的产生的细胞因子IL-17A(也称为IL-17)、IL-17F和IL-22。TH17的分化有些争议：目前的共识是，IL-1和IL-6与TGF-β一起诱导早期TH17分化。已报道IL-21(类似于IL-2)作为TH17的生长因子发挥作用。IL-6和TGF-β的组合诱导孤独核受体类视黄醇相关孤独受体(ROR)γt和RORα(其是决定TH17谱系分化的关键转录因子)以及IL-23R。STAT3调节IL-6诱导的RORγt和RORα表达及IL-17产生。与STAT3激活相反，STAT1激活抑制TH17细胞的发育。虽然IL-6激活STAT3和STAT1二者，但已显示，在TH17细胞中，STAT3激活保持，而STAT1激活受抑制。已将IL-23与人TH17细胞的维持和激活相联系。 
最初在小鼠和人类中作为完全分化的TH17细胞的细胞因子特征描述了IL-22。但是，最近显示，不同亚群的人皮肤记忆T细胞(human skin-homing memory T cell)产生IL-22，但不产生IL-17，也不产生IFNγ。产生IL-22的T细胞的分化可以通过在IL-6和TNF的存在下刺激幼稚T细胞或通过浆细胞样树突细胞的存在来促进，且似乎独立于RORC。人TH22细胞群体共表达趋化因子受体CCR6及皮肤受体CCR4和CCR10，其导致这些细胞可以在皮肤稳态和病理学中很重要的假说。 
长期以来，认为TH1细胞是多种自身免疫病中的主要效应物，而已知TH2细胞涉及特应性和哮喘。最近，已将TH17细胞作为罪魁祸首与小鼠和人类中的多种自身免疫病和其他炎性疾病相联系。之前与TH1细胞相关的许多疾病状态(例如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，多发性硬化的模型)、胶原诱发关节炎和一些形式的结肠炎)显示由依赖IL-23的TH17细胞或其他产生IL-17的淋巴样细胞类型引起。TH17和Treg细胞功能间的失衡可以是这些疾病的一些中最重要的。 
虽然许多研究已分析了TH17细胞在肠炎和自身免疫的动物模型中的作用，但只有几项研究研究了TH17细胞在克隆病患者中的作用。在克隆病患者的固有层中发现增加数目的T细胞表达TH17细胞的主转录因子类 视黄醇相关孤独受体-ct(RORγt)。两项独立研究显示人外周血中及来自健康个体和克隆病患者的肠中的TH17细胞(Acosta-Rodriguez等，2007；Annunziato等，2007)。这两项研究显示，这些细胞表征为表达RORγt、IL23R和CCR6，而它们缺乏作为TH1细胞特征的趋化因子受体CXCR3。 
Annunziato等(2007)的研究证明他们命名为“TH17/TH1”细胞的肠中产生IL-17A的T细胞(包括还表达IL17A和IFNγ二者的T细胞群体)。Acosta-Rodriguez等(2007)鉴定了可以表征为CCR6+CCR4+表达的TH17细胞，而表达CCR6+CXCR3+的TH1细胞还包括产生IL17A和IFNγ二者的亚群。此外，最近的发现将CD161作为新的表面标记与人TH17细胞相联系，并显示这些细胞来自CD161+CD4+T细胞祖先的唯一来源。TH1和TH17细胞之间的相互作用及IFNγ对TH17细胞的作用可以比之前的推测更复杂，需要进一步的分析来阐明这些细胞谱系对克隆病及其他自身免疫病的具体贡献。 
IL-6(由IL6基因编码的蛋白质)是作为促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子二者发挥作用的白细胞介素。它由T细胞和巨噬细胞分泌来在例如感染期间和外伤后刺激免疫反应，IL-6作为抗炎症细胞因子的作用通过其对TNF-α和IL-1的抑制作用及IL-1ra和IL-10的激活来介导。 
IL-23是由两个亚基组成的异二聚体细胞因子，一个亚基称为p40(与另一细胞因子IL-12共有)，另一个亚基称为p19(由IL-23A基因编码的IL-23α亚基)(见图10A)。IL-23的两个亚基通过二硫键连接。IL-23是抗感染炎症反应的重要部分。它促进基质金属蛋白酶MMP9的上调，增加血管发生，并减少CD8+T细胞浸润。 
克隆病和溃疡性结肠炎是炎性肠病(IBD)的两种主要疾病实体。克隆病在美国具有每100,000人6.3例的平均年发病率。虽然仍未完全了解它们的确切病因，但已提出，它们的发病机理表征为遗传易感个体中过度的免疫反应。许多年以来，认为克隆病主要由TH1细胞介导，而溃疡性结肠炎是TH2样类型的炎症。这为克隆病中提高的TH1细胞因子(如IFNγ和白细胞介素12(IL-12))水平和溃疡性结肠炎中某些TH2细胞因子(如 IL-13)的提高的表达所支持。 
Ustekinumab(CNTO 1275；StelaraTM；Centocor，Inc.，Malvern，PA)是人免疫球蛋白G1κ(IgG1κ)单克隆抗体，其特异性结合IL-12和IL-23共有的p40亚基，并抑制IL-12和IL-23与细胞表面IL-12Rβ1受体相互作用，从而阻止IL-12或IL-23介导的信号级联放大。 
Tocilizumab(Actemra)是抗IL-6受体的人源化重组IgG1κ单克隆抗体。FDA于2010年1月8日批准Tocilizumab用于治疗类风湿性关节炎。 
但是，仍然存在对治疗TH17和TH22细胞介导的反应在其中发挥作用的疾病的其他有效疗法的需要。此外，由于涉及这些疾病的免疫学反应的复杂性，存在对作用于多种途径(例如TH17和TH1)的疗法的需要，只要这类双特异性构建体(例如，对IL-6和IL-23(可选地，以及IL-12)特异的构建体)形式的疗法代表重大挑战。这类二价双特异性构建体不仅需要特异性抗原结合和中和结构域，还需要稳定，在体内具有长的平均滞留期和功效。虽然已作了许多努力来产生双特异性抗体，但迄今所有的努力均未能产生这类具有长的体内滞留期的稳定分子。此外，通过遗传融合法产生双特异性剂的许多努力未成功产生易于制备的，稳定且具有高亲和力的分子。本文所述双特异性构建体首次解决了这些问题。 
已通过靶向IL23和IL17A研发了靶向TH17细胞的双特异性抗体(Mabry R.等，2009)。 
本发明旨在提供有用的双特异性抗体。 
发明人的新方法用scFv在原核系统中的高效产生和位点特异性化学缀合来产生大量双特异性蛋白质，避免了困扰产生双特异性抗体的其他方法的许多问题。关键步骤是在重折叠前使用化学附着于多肽链的柔性接头，其允许各scFv独立于其他scFv重折叠，以产生功能性双特异性构建体。 
发明人的方法涉及将非天然氨基酸的体内位点特异性掺入用于靶蛋白，该非天然氨基酸作为用于接头(如PEG)的共价和位点特异性结合的反应位点发挥作用(见WO 2007/130453，其全部内容在此引用作为参考)。 
该方法的优势是，用来将scFv与接头缀合的化学品(chemistry)与20种天然氨基酸正交。 
将非天然氨基酸掺入多肽的另一种方法描述于US7632024中(Cho等)。 
根据本发明，单链可变片段(scFv)易于大量产生，且可以容易地纯化。B细胞克隆和功能筛选后的兔抗原特异性单克隆抗体拯救允许鉴定高质量抗体。随后人源化抗体并转化为scFv。 
发明人针对具体靶标(即，人IL-6、人IL-23和人IL-12)鉴定了许多人源化单克隆抗体。 
此外，他们产生了抗体片段，并改造它们来产生用于治疗的靶向IL-6和IL-23或IL-6和IL12/23的双特异性scFv分子，在该治疗中，TH1和/或TH17细胞的抑制是有益的，包括炎性和自身免疫性疾病。 
Aliahmadi等(2009)Eur J Immunol 39，1221-1230描述了涉及抗分离的人IL-23 p19亚基的山羊多克隆血清和抗-IL-6单克隆抗体的组合的某些实验。 
发明概述 
本发明提供包含抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物的二价双特异性构建体、产生这类构建体的方法及这类构建体在治疗中的用途。 
本发明的二价双特异性构建体的抗体可以是分离的单克隆抗体，优选地，它们是分离的人单克隆抗体。 
本发明的二价双特异性构建体的抗体可以是嵌合抗体。在优选实施方案中，本发明的抗体或其衍生物的构架区已人源化。 
本发明的抗体衍生物可以包括整个可变区、可变区的重链(VH)、可变区的轻链(VL)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb或互补决定区(CDR)。本发明的抗体衍生物完全保留或基本保留它们所衍生自的抗体的抗原结合活性。在优选实施方案中，该抗体衍生物是scFv。 
本发明还提供抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物， 产生这类抗体或其衍生物的方法，及这类抗体或其衍生物单独或组合在治疗中的用途。 
可以修饰本发明的抗体和抗体衍生物(包括双特异性构建体)来掺入一个或多个非天然氨基酸。 
在实施方案中，该抗-IL-6抗体或其衍生物可以包含来自13A8抗体的CDR区的特定基序。因此，本发明提供抗-IL-6抗体或其衍生物，其包含： 
含有氨基酸序列YIYTDX1STX2YANWAKG的CDR2区，其中： 
X1选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；且 
X2选自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；且 
优选地，X1是丝氨酸或苏氨酸，X2是色氨酸或酪氨酸；(SEQ ID NO.335) 
和/或 
含有氨基酸序列RX1STLX2S的CDR5区，其中X1和X2独立地是丙氨酸或苏氨酸。(SEQ ID NO.336)。 
在实施方案中，该抗-IL-6抗体或其衍生物可以包含氨基酸序列选自SEQ ID NO10-15的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR区。CDR区可以选自可变区的重链(VH)的CDR(即SEQ ID NO.10-12)和/或选自可变区的轻链(VL)的CDR(即SEQ ID NO13-15)。在具体实施方案中，该抗-IL-6抗体或其衍生物可以包含SEQ ID NO 10-15的全部氨基酸序列。 
该抗-IL-6抗体或其衍生物可以包含抗-IL-6抗体或其衍生物的整个VH和/或VL。在具体实施方案中，该抗-IL-6抗体或其衍生物可以包含抗-IL-6抗体的VH(具有SEQ ID NO.259的序列的VH)和/或抗-IL-6抗体的VL(具有SEQ ID NO.261的序列的VL)。 
在优选实施方案中，该二价双特异性构建体，其包含抗-IL-6抗体或其衍生物，其是包含含有至少1个、至少2个或3个氨基酸序列为SEQ ID NO.10-12的CDR区的重链及含有至少1个、至少2个或3个氨基酸序列为 SEQ ID NO.13-15的CDR区的轻链的scFv。在实施方案中，该scFv可以包含SEQ ID NO.259的氨基酸序列及含有SEQ ID NO.261的氨基酸序列的轻链。 
本发明还提供抗-IL-6抗体或其衍生物，或者二价双特异性构建体，其包含以上条款(clause)的基于抗体28D2、18D4、8C8、9H4和9C8的抗-IL-6抗体或其衍生物，其中分别用对SEQ ID NO 20-25、30-35、40-45、50-55和60-65的称谓来取代对SEQ ID NO 10-15的称谓。对于基于28D2的抗-IL-6抗体和衍生物，可以用对SEQ ID NO.263和265的称谓来取代对SEQ ID NO.259和261的称谓。 
本发明还涵盖具有抗-IL-6抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列与选自SEQ ID NO.10-15的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。类似地，本发明还涵盖具有抗-IL-6抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列包含对选自SEQ ID NO.10-15的氨基酸序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在实施方案中，该CDR区包含对选自SEQ ID NO.10-15的氨基酸序列的至少一个保守氨基酸取代。 
本发明还提供包含抗-IL-6抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个与具有对应于SEQ ID NO.10-15的氨基酸序列的CDR的抗-IL-6抗体结合相同的表位的CDR区。 
在实施方案中，该抗-IL-6抗体或其衍生物选自或衍生自13A8、9H4、9C8、8C8、18D4和28D2。 
在另一实施方案中，该抗-IL-23抗体或其衍生物可以包含来自31A12抗体的CDR区的特定基序。因此，本发明提供抗-IL-23抗体或其衍生物，其包含： 
含有氨基酸序列YYAX1WAX2G的CDR2区，其中： 
X1选自丝氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；且 
X2选自赖氨酸和谷氨酰胺；(SEQ ID 337) 
和/或 
含有氨基酸序列AX1TLX2S的CDR5区，其中： 
X1选自丝氨酸和丙氨酸； 
X2选自丙氨酸和苏氨酸。(SEQ ID 338) 
如本文所使用，CDR1指VH CDR1，CDR2指VH CDR2，CDR3指VH CDR3，CDR4指VL CDR1，CDR5指VL CDR2，CDR6指VL CDR3。 
在另一实施方案中，该抗-IL-23抗体或其衍生物可以包含氨基酸序列选自SEQ ID NO 90-95的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR区。该CDR区可以选自可变区的重链(VH)的CDR(即SEQ ID NO.90-92)和/或选自可变区的轻链(VL)的CDR(即SEQ ID NO.93-95)。在具体实施方案中，该抗-IL-23抗体或其衍生物可以包含SEQ ID NO.90-95的全部氨基酸序列。 
该抗-IL-23抗体或其衍生物可以包含抗-IL-23抗体或其衍生物的整个VH和/或VL。在具体实施方案中，该抗-IL-23抗体或其衍生物可以包含抗-IL-23抗体的VH(具有SEQ ID NO.267的序列的VH)和/或抗-IL-23抗体的VL(具有SEQ ID NO.269的序列的VL)。 
在优选实施方案中，该二价双特异性构建体，其包含抗-IL-23抗体或其衍生物，其是包含含有至少1个、至少2个或3个具有SEQ ID NO.90-92的氨基酸序列的CDR区的重链及含有至少1个、至少2个或3个具有SEQ ID NO.93-95的氨基酸序列的CDR区的轻链的scFv。在实施方案中，该scFv可以包含SEQ ID NO.267的氨基酸序列及含有SEQ ID NO.269的氨基酸序列的轻链。 
本发明还提供抗-IL-23抗体或其衍生物，或者二价双特异性构建体，其包含以上条款的基于抗体49B7、16C6、34E11和35H4的抗-IL-23抗体或其衍生物，其中分别用对SEQ ID No 100-105、110-115、120-25和130-135的称谓来取代对SEQ ID NO 90-95的称谓。 
本发明还涵盖具有抗-IL-23抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列与选自SEQ ID NO. 90-95的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。类似地，本发明还涵盖包含抗-IL-23抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列包含对选自SEQ ID NO.90-95的氨基酸序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在实施方案中，该CDR区包含对选自SEQ ID NO.90-95的氨基酸序列的至少一个保守氨基酸取代。 
本发明还提供包含抗-IL-23抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个与具有对应于SEQ ID NO.90-95的氨基酸序列的CDR的抗-IL-6抗体结合相同的表位的CDR区。 
在实施方案中，该抗-IL-23抗体或其衍生物选自或衍生自31A12、34E11、35H4、49B7和16C6。这类抗体可能与IL-23的p19亚基结合。 
在另一实施方案中，该抗-IL-23抗体或其衍生物还可以结合IL-12。不受限于理论，这类抗体可能与IL-23和IL-12共有的p40亚基结合。这类抗体在本文中称为抗-IL-23/IL-12抗体。 
不排除抗体与p40结合，抑制IL-23，也抑制IL-12——这类抗体包含在“抗-IL-23抗体”的范围内。 
在实施方案中，本发明提供抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其可以包含来自45G5或22H8的CDR区的特定基序。因此，本发明提供抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其抑制IL-12和IL-23二者，其包含： 
含有氨基酸序列WX1KG的CDR2区，其中X1是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，优选是丙氨酸或缬氨酸(SEQ ID NO.358)； 
和/或 
含有氨基酸序列YAYX1GDAFDP的CDR3区，其中X1是丙氨酸或异亮氨酸；(SEQ ID NO.339) 
和/或 
含有氨基酸序列SDYFNX1的CDR3区，其中X1是异亮氨酸或缬氨酸；(SEQ ID NO.340) 
和/或 
含有氨基酸序列QX1SQX2的CDR4区，其中： 
X1是丙氨酸或丝氨酸，且 
X2选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸； 
优选地，X2是丝氨酸或苏氨酸； 
和/或(SEQ ID NO.359) 
含有氨基酸序列ASX1LA的CDR5区，其中X1是赖氨酸或苏氨酸。(SEQ ID NO.341) 
和/或 
含有氨基酸序列QSYYDX1NAGYG的CDR6区，其中X1是丙氨酸或缬氨酸。(SEQ ID NO.342) 
在实施方案中，该抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物可以包含氨基酸序列选自SEQ ID NO 140-145的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR区。该CDR区可以选自可变区的重链(VH)的CDR(即SEQ ID NO.140-142)和/或选自可变区的轻链(VL)的CDR(即SEQ ID NO.143-145)。在具体实施方案中，该抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物可以包含SEQ ID NO.140-145的全部氨基酸序列。 
该抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物可以包含抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的整个VH和/或VL。在具体实施方案中，该抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物可以包含抗-IL-23/IL-12抗体的VH(具有SEQ ID NO.271的VH)和/或抗-IL-23/IL-12抗体的VL(具有SEQ ID NO.273的VL)。 
在优选实施方案中，该二价双特异性构建体，其包含抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其是包含至少1个、至少2个或3个具有SEQ ID NO.140-142的氨基酸序列的CDR区及含有至少1个、至少2个或3个具有SEQ ID NO.143-145的氨基酸序列的CDR区的轻链的scFv。在实施方案中，该scFv可以包含含有SEQ ID NO.271的氨基酸序列的重链及含有SEQ ID NO.273的氨基酸序列的轻链。 
本发明还提供抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，或者二价双特异性构建体，其包含以上条款的基于抗体45G5、1H1、4F3、5C5和14B5的抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其中分别用对SEQ ID NO 150-155、160-165、170-175、180-185和190-195的称谓来取代对SEQ ID NO 140-145的称谓。对于基于45G5的抗-IL-23/IL-12抗体和衍生物，可以用对SEQ IDNO.275和277的称谓来取代对SEQ ID NO.271和273的称谓。 
本发明还涵盖包含抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列与选自SEQ ID NO.140-145的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。类似地，本发明还涵盖包含抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列包含对选自SEQ ID NO.140-145的氨基酸序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在实施方案中，该CDR区包含对选自SEQ ID NO.140-145的氨基酸序列的至少一个保守氨基酸取代。 
本发明还提供具有抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的二价双特异性构建体，其包含至少一个与具有对应于SEQ ID NO.140-145的氨基酸序列的CDR的抗-IL-23/IL-12抗体结合相同的表位的CDR区。在实施方案中，该表位存在于IL-12和IL-23二者共有的p40亚基上。 
在实施方案中，该抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物选自或衍生自22H8、45G5、14B5、4F3、5C5和1H1。 
应理解，上述可以形成二价双特异性构建体的部分的抗-IL-6抗体及其衍生物可以独立地与上述抗-IL-23抗体或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体及其衍生物)组合在单个二价双特异性构建体中。在这类构建体中，抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物二者都可以掺入非天然氨基酸，通过该非天然氨基酸将抗-IL-6抗体或其衍生物与抗-IL-23抗体或其衍生物偶联。 
本发明的二价双特异性构建体可以进一步在各抗体或其衍生物中的非天然氨基酸之间包含接头。本发明的二价双特异性构建体可以进一步包含 聚乙二醇分子(PEG)。该PEG分子可以可选地作为抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)之间的接头。适宜地，还可以使用其他水溶性聚合物，如聚乙烯醇、多糖、聚环氧烷、羟乙基淀粉和多元醇。 
本文所述抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)本身有用。在本发明的另一方面，本发明提供在制备本发明的二价双特异性构建体中和/或在组合治疗中具有特定用途的抗-IL-6和抗-IL-23(抗体)或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)。可以可选地修饰该抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)来增加半衰期(例如通过PEG化)。抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物可以掺入非天然氨基酸来便于连接PEG基团。 
本发明的一方面提供包含抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物(其可以例如通过抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)的组合(用于分开、顺次或分开施用)。 
本发明还涵盖包含抗-IL-6和抗-IL-23抗体衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体衍生物)的二价双特异性构建体，其中该抗体衍生物选自Fab、Fab’、F(ab)’、单链抗体(scFv)、kappabody、微抗体(Minibody)和Janusin。 
因此，本发明提供以下抗体或其衍生物： 
抗-IL-6抗体或其衍生物，其包含含有SEQ ID NO.259的氨基序列的重链及含有SEQ ID NO.261的氨基序列的轻链。 
抗-IL-23抗体或其衍生物，其包含含有SEQ ID NO.267的氨基序列的重链及含有SEQ ID NO.269的氨基序列的轻链。 
抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其包含含有SEQ ID NO.271的氨基序列的重链及含有SEQ ID NO.273的氨基序列的轻链。 
在本发明的另一方面，提供编码本发明的二价双特异性构建体的部分的多核苷酸。这类多核苷酸可以编码本文公开的抗体或其衍生物。 
本发明还提供包含这类多核苷酸的载体、包含这类载体的宿主细胞(可选地，该宿主细胞为营养缺陷型)、用于克隆和表达本文公开的抗体或其衍生物的寡核苷酸引物。本发明的具体寡核苷酸引物包括含有200-258的任一个中所示核苷酸序列之一的寡核苷酸引物。 
在本发明的另一方面，提供用于产生二价双特异性构建体的方法。该方法包括： 
(a)提供通过掺入至少一个非天然氨基酸修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物； 
(b)提供通过掺入至少一个非天然氨基酸修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物； 
(c)使该修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物与修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物反应，使得二者通过各部分的非天然氨基酸之间的连接偶联。 
该方法可以包括通过含有接头部分的连接来偶联该修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物，和该修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物，其中该接头部分的一端与该修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物的非天然氨基酸偶联，该接头部分的另一端与修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物的非天然氨基酸偶联。适宜的接头的实例为本领域已知，且包括短肽序列。本发明还提供PEG作为接头的用途。因此，在实施方案中，该接头部分可以是PEG分子。 
该方法可以包括使用含有选自以下的基团的非天然氨基酸： 
与其他部分连接之前的氮化物、氰基、氧化腈、炔、烯、应变环辛炔、应变环烯、环丙烯、降冰片烯或芳基、烷基或乙烯基卤化物、酮、醛、酮缩醇、缩醛肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有机锡、有机硅、β-甲硅烷基链烯基卤化物、β-甲硅烷链烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、哒嗪、芳基磺酸酯、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸基团。具体而言，该非天然氨基酸可以是叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含 有内部烯(如反式-巴豆烯)的氨基酸、丝氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸、吡咯赖氨酸、N-σ-邻-叠氮基苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-2-叠氮基乙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸(BocLys)、N-σ-烯丙氧基羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰基-L-赖氨酸、N-σ-烟酰-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素酰-L-赖氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-三甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹酰-L-赖氨酸、N-σ-邻，对-二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对-甲苯磺酰-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸；尤其是选自以下的基团： 
与其他部分连接之前的氮化物、炔、烯、或芳基、烷基或乙烯基卤化物、酮、醛、肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有机锡、有机硅基团。具体而言，该非天然氨基酸可以是叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有内部烯(如反式-巴豆烯)的氨基酸、丝氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸。 
该方法可以包括用通常称为Click反应的[3+2]环加成/[3+2]偶极环加成剂或氮化物-炔环加成反应(其可以通过铜(I)、钌、其他金属来催化，或通过应变和/或吸电子基团来促进)、Heck反应、Sonogashira反应、Suzuki反应、Stille偶联、Hiyama/Denmark反应、烯烃复分解反应、Diels-alder反应、羰基与肼、酰肼、烷氧基胺或羟基胺缩合来偶联该修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物，和该修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物。也可能是Staudinger连接。 
该方法还可以包括： 
(a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含具有编码抗-IL-6抗体或其衍生物的多核苷酸的载体，该抗-IL-6抗体或其衍生物通过掺入至少一个非天然 氨基酸来修饰； 
(b)提供宿主细胞，该宿主细胞包含具有编码抗-IL-23抗体或其衍生物的多核苷酸的载体，该抗-IL-23抗体或其衍生物通过掺入至少一个非天然氨基酸来修饰； 
(c)在使得宿主细胞表达该修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物或该修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物的条件下培养该宿主细胞； 
(d)分离该抗-IL-6抗体或其衍生物，和该抗-IL-23抗体或其衍生物； 
(e)使该修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物与该修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物反应，使得该修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物通过各修饰的抗体或其衍生物的非天然氨基酸之间的连接与该修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物偶联。 
如下文更详细地讨论，该方法还可以包括通过以下来掺入非天然氨基酸(例如Aha)：在具体的所选择的氨基酸编码的位置(通常是甲硫氨酸编码的位置)处掺入它，并根据需要在不希望掺入非天然氨基酸的位置处突变靶蛋白质的多核苷酸序列来消除甲硫氨酸(或其他具体的所选择的氨基酸)密码子，和/或根据需要在希望掺入非天然氨基酸的位置处突变靶蛋白质的多核苷酸序列来提供一个或多个(通常为一个)新的甲硫氨酸(或其他具体的所选择的氨基酸)密码子。 
在本发明的另一方面，选择适合包含在本发明的二价双特异性构建体中的亲本抗体的方法包括以下步骤： 
(i)选择对IL-6或IL-23特异的B细胞； 
(ii)整分出该B细胞的分开的样品(例如，放入96细胞孔板的孔中)； 
(iii)培养该B细胞； 
(iv)分别从各整分样品收集含有抗体的上清； 
(v)针对IL-6或IL-23结合测定来自各整分样品的上清(例如使用ELISA)； 
(vi)针对IL-6或IL-23活性的抑制测定来自各整分样品的上清； 
(vii)选择来自显示高水平的IL-6或IL-23活性抑制和/或强烈的IL-6 或IL-23结合的孔的抗体；并 
(viii)可选地针对IL-12活性的抑制测定来自IL-23整分样品的上清；并 
(ix)选择还显示高水平的IL-12活性和/或强烈的IL-12结合的IL-23抗体作为亲本抗体。 
在本发明的另一方面，提供上述二价双特异性构建体用于治疗。通常，上述二价双特异性构建体用于通过结合涉及TH17细胞分化的一种或多种分子或结合由激活的TH17细胞产生的一种或多种分子来治疗TH17、TH22和/或TH17和TH1介导的疾病。在具体实施方案中，这类疾病包括多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、寻常性天疱疮、器官移植排斥、克隆病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮和糖尿病。 
本发明还提供包含抗-IL-6抗体和抗-IL-23抗体的组合疗法用于治疗TH17、TH22和/或TH17和TH1介导的疾病。具体而言，提供这类组合用于治疗炎性和自身免疫性障碍。 
附图简述 
图1显示B细胞选择。针对IL-6中和(通过B9细胞系增殖测定)和IL-6结合(通过ELISA)二者测定了来自B细胞的一块96孔板的每个孔。排列来自各测定的结果进行比较。 
图2显示从V区拯救至(rescue to)scFv产生的实验方法概要。 
图3A和B显示所选择的抗-IL-6兔/人嵌合抗体的人和灵长类IL-6中和活性：在哺乳动物细胞中表达兔/人嵌合mAb。通过ELISA定量上清中的mAb。用B9细胞增殖测定测试它们对所示50pg/ml人IL-6或100pg/ml灵长类IL-6的中和。 
图3C和D显示所选择的抗-IL-6兔/人嵌合抗体的人和灵长类IL-6中和活性：在哺乳动物细胞中表达兔/人嵌合mAb。通过ELISA定量上清中的mAb。用B9细胞增殖测定测试它们对所示50pg/ml人IL-6或100pg/ml灵长类IL-6的中和。 
图3E显示所选择的抗-IL6兔/人嵌合抗体的人IL-6中和活性：在哺乳 动物细胞中表达兔/人嵌合mAb。通过ELISA定量上清中的mAb。用B9细胞增殖测定测试它们对所示50pg/ml人IL-6或100pg/ml灵长类IL-6的中和。 
图4显示B细胞选择。针对IL-23中和及IL-6结合测定了来自一块B细胞96孔板的每个孔。排列各孔的两项测定的结果进行比较。 
图5A-5I显示所选择的抗IL-23兔/人嵌合抗体的人IL-23中和活性。衍生候选mAb，并测试异二聚体重组IL-23(eBio IL23)的中和。 
图6A和6B显示灵长类和人IL-23的中和活性。用小鼠脾细胞测定针对异二聚体人IL-23(图B)或灵长类IL-23(图A)的中和，比较了几种mAb的转染上清。测量转染上清中的Ig水平来允许比较比活性。 
图7A显示IL-12和IL-23的结构。 
图7B显示IL-12和IL-23受体及其结合机制。 
图8A显示用NK92细胞系测定针对人IL-12的中和，比较了几种mAb的转染上清。 
图8B显示所选择的mAb对人IL-23的中和。 
在HEK293瞬时转染中表达了在来自B细胞克隆的初级拯救转染(primary rescue transfection)中为阳性的mAb，其中定量IgG浓度来计算EC50值。针对1200pg/ml的IL-23(eBiosciences)的中和测试了mAb。 
图8C显示所选择的mAb对人IL-23的中和。 
在HEK293瞬时转染中表达了在来自B细胞克隆的初级拯救转染中为阳性的mAb，其中定量IgG浓度来计算EC50值。针对1200pg/ml的IL-23(eBiosciences)的中和测试了mAb。 
图8D显示所选择的mAb对人IL-23的中和。 
在HEK293瞬时转染中表达了在来自B细胞克隆的初级拯救转染中为阳性的mAb，其中定量IgG浓度来计算EC50值。针对1200pg/ml的IL-23(eBiosciences)的中和测试了mAb。 
图8E显示所选择的mAb对人IL-23的中和。 
在HEK293瞬时转染中表达了在来自B细胞克隆的初级拯救转染中为 阳性的mAb，其中定量IgG浓度来计算EC50值。针对1200pg/ml的IL-23(eBiosciences)的中和测试了mAb。 
图8F-8G显示所选择的mAb对人IL-12的中和。 
在HEK293瞬时转染中表达了在来自B细胞克隆的初级拯救转染中为阳性的mAb，其中定量IgG浓度来计算EC50值。针对1000pg/ml人IL-12的中和测试了mAb。 
图8H和8I显示所选择的mAb对灵长类IL-23的中和。 
在HEK293瞬时转染中表达了在来自B细胞克隆的初级拯救转染中为阳性的mAb，其中定量IgG浓度来计算EC50值。针对1000pg/ml灵长类IL-23的中和测试了mAb。 
图9A显示在哺乳动物细胞中表达兔scFv。通过SDS PAGE定量上清中的scFv。用B9细胞增殖测定针对所示200pg/ml人IL-6的中和测试它们。 
图9B显示9C8人源化。通过将VH和VL的构架区变为人构架序列(有限地回复突变为兔构架序列)来人源化9C8(高亲和力和高效价的嵌合mAb)。为人源化9C8比较了不同的人构架序列。通过瞬时转染HEK293细胞来表达人源化mAb。用B9细胞增殖测定，针对中和50pg/ml人IL-6的能力测试了转染上清。 
图9C显示人源化的抗-IL-6mAb。通过将VH和VL的构架区变为人构架序列(有限地回复突变为兔构架序列)来人源化9C8和18D4(高亲和力和高效价的嵌合mAb)。通过瞬时转染HEK293细胞来表达人源化mAb。定量转染上清中的IgG，并用B9细胞增殖测定，针对中和50pg/ml人IL-6的能力测试了转染上清。 
图9D显示人源化的抗-IL-6mAb和scFv。通过将VH和VL的构架区变为人构架序列(有限地回复突变为兔构架序列)来人源化9C8(高亲和力和高效价的嵌合mAb)。比较2种不同的VHCDR1序列，从兔scFv产生了2种人源化9C8 scFv。兔scFv不进行人源化而直接表达，并通过瞬时转染HEK293细胞来表达人源化mAb和scFv。用B9细胞增殖测定， 针对中和50pg/ml人IL-6的能力测试了转染上清。 
图10显示用于将CDR移植至scFv形式的人V区构架上的PCR策略。VL，轻链V区；L，前导序列(信号肽)；FR，构架区；CDR，互补决定区；箭头指示各个引物及其在PCR扩增中的方向性；通过链和CDR编号来标示CDR特异性引物，H是VH，L是VL；还通过F(正向)和R(反向)来标示引物方向性；VL-FR4和VH-FR1之间的曲线代表加入用于scFv构建的20aa(G4S)4接头。 
图11A和11B显示通过人源化scFv 13A8来中和IL-6。在哺乳动物细胞中表达人源化13A8抗-IL-6 scFv。通过Ni亲和力从上清纯化scFv。用B9细胞增殖测定进行中和人IL-6(B)或灵长类IL-6(A)的测试。 
图11C显示通过抗IL-6人源化scFv来中和IL-6：在哺乳动物细胞中表达人源化9C8 scFv v3-1(来自多步法)和28D2 scFv，通过Ni层析纯化，并比较IL-6诱导的B9细胞增殖的抑制。 
图12显示抗IL-23 31A12 scFv中和IL-23。 
将31A12 mAb转化为人源化scFv，并连同亲本mAb在哺乳动物转染中表达。用IL-17诱导的小鼠脾细胞测定针对600pg/ml eBiosciences人IL-23的中和测试二者。 
图13显示人源化抗IL-23 45G5 scFv中和人IL-23：将人源化45G5 scFv与嵌合mAb 31A12和22H8相比较。所有mAb均在哺乳动物细胞中表达，纯化，并用IL-17诱导的小鼠脾细胞测定针对1.2ng/mleBiosciences人IL-23的抑制进行测试。 
图14A-14D显示改造来去除2个Met残基的人源化13A8scFv哺乳动物表达构建体的测试。在HEK细胞中表达多种双突变构建体和亲本scFv(MM)，并用体外B9生物测定针对50pg/ml人IL-6的抑制进行测试。 
图14E显示在HEK293细胞中瞬时表达的取代两个Met(仅显示H34L形式)的人源化31A12 scFv和包含亲本Met的scFv的测试。在小鼠脾细胞测定中针对600pg/ml的eBiosciences IL-23的生物学活性的抑制测试上清。 
图14F和14G显示用L或V取代H82 Met(二者都与H34L组合)的人源化45G5 scFv的测试，其与亲本45G5嵌合mAb和无Met的31A12scFv(31A12-LL)比较。全都在HEK293细胞中瞬时表达。纯化scFv和mAb，并在小鼠脾细胞测定中针对1200pg/ml的eBiosciences IL-23的生物学活性的抑制进行测试。 
图14H显示人源化抗IL-23 scFv中和人IL-23。将野生型抗IL-23 scFv22H8和45G5与所示用V或L取代H34的Met的22H8 scFv比较。 
图15显示在N或C端或在Gly/Ser接头中具有Aha的大肠杆菌28D2scFv对IL-6的中和： 
在大肠杆菌发酵中表达在N或C端或在Gly/Ser接头中具有单个Met密码子的28D2构建体，用Aha取代Met。针对50pg/ml人IL-6的中和测试这些纯化的scFv。 
图16A显示13A8c与20K线性PEG二炔的PEG化 
13A8cAha与20K PEG二炔的PEG化反应物的SDS PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：13A8c单独；泳道2：(-)对照——无铜；泳道3：200mL小规模反应混合物；泳道4：600mL反应物——离心——样品上清。扫描激光光密度测定法显示PEG化13A8cAHA的产率为70％(泳道4)。 
图16B显示31A12cAha与20K线性PEG二炔的PEG化。31A12cAha与20K PEG二炔的PEG化反应物的SDS PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：分子量标记；泳道3：(-)——无铜；泳道4：小规模反应物；泳道5：400mL反应物——离心——样品上清。扫描激光光密度测定显示PEG化31A12cAha的产率为59％(泳道5)。 
图16C显示13A8cAha与40K线性PEG二炔的PEG化。13A8c-40KPEG制备物的SDS-PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。扫描激光光密度测定显示51％的产率。 
图16D显示13A8L Aha与20K线性PEG二炔的PEG化。SDS-PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。扫描激光光密度测定显示60％的产率。 
图16E显示45G5cAha与20K线性PEG二炔的PEG化。SDS PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：(-)对照——无铜；泳道2：小规模反应物；泳道3：小规模反应物，无三唑配体；泳道4：160mL反应物——离心——样品上清；泳道6：分子量标记。扫描激光光密度测定显示PEG化45G5c.-.的产率为59％。 
图17A显示28D2c-PEG中和IL-6。针对IL-6中和测定了在不同条件下重折叠的28D2c-30KPEG的2个样品。 
图17B和C显示PEG-scFv稳定性：31A12-PEG具有69℃的Tm。13A8-PEG具有66℃的Tm。这反映为这些分子在所示溶液中的稳定性。在PBS(或所示Tween)中孵育各scFv-PEG，并测定相对于亲本scFv(来自哺乳动物表达)的效价。显示了保存温度(保存13或20天)；3X FT显示冷冻和融化的三个循环。 
图18A显示13A8c-PEG-31A12c双特异性剂的制备物：SDS-PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：分子量标记；泳道2：13A8-PEG单独；泳道3：(-)对照——无铜；泳道4：1000mL反应物。 
图18B显示13A8n-PEG-45G5c双特异性剂的制备物：SDS-PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：大规模反应物1；泳道3：大规模反应物2。 
图18C显示13A8c-PEG-22H8c双特异性剂的制备物：SDS-PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：分子量标记；泳道2：13A8c-PEG单独；泳道3：(-)对照——无铜；泳道4：1150mL反应物。 
图18D显示13A8c-40KPEG-31A12cAHA的制备物。SDS-PAGE(还原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：MW标记；泳道2：13A8c-40KPEG；泳道3：反应混合物的直接样品；泳道4：最终加工混合物的样品6uL上样；泳道5：最终加工混合物的样品12uL上样；泳道6：无铜的反应；泳道7：31A12cAHA单独。产率(2个上样的平均值)＝56％，产物与单价的比为4.5∶1。 
图18E显示13A8L-PEG-31A12c双特异性剂的制备物。SDS-PAGE(还 原，4-20％Tris-甘氨酸)。泳道1：31A12-20KPEG+13A8LAha形成双特异性剂的反应。发现反应产率为37％。 
图19A显示31A12c-PEG-13A8c中和IL-6和IL-23的功能活性。将双特异性剂对IL6和IL23的生物活性与scFv单独相比较。A：双特异性剂的13A8scFv部分的抗IL-6活性。19B：还测量了该双特异性剂的31A12cscFv部分的抗IL-23活性。从该滴定计算EC50。 
图20A显示皮下施用的28D2c scFv的大鼠PK。用1mg/kg的抗IL-6scFv 28D2c皮下处理大鼠。在所示时间点采血，用抗IL-6中和测定测量大鼠血浆中28D2的存在。 
图20B显示皮下施用的31A12c-PEG-13A8c双特异性剂的大鼠PK：用1mg/kg的31A12c-PEG-13A8c双特异性剂皮下处理大鼠。在所示时间点采血，用抗IL-6中和测定测量大鼠血浆中双特异性剂的存在。在此包含来自图20B的28D2scFv的PK数据用于比较。 
图21显示13A8n-PEG-31A12c双特异性剂的生物活性。在B9生物测定中测量双特异性剂对50pg/ml的IL-6的中和。包含哺乳动物13A8scFv蛋白质用于比较。 
图22显示13A8n-PEG-45G5对IL-6和IL-23的功能活性。显示双特异性剂对IL6和IL23的生物活性。用B9细胞系生物测定(对于IL-6)和小鼠脾细胞测定(对于IL-23)测量13A8n-PEG-45G5双特异性剂对50pg/ml人IL-6(22A)和1200pg/ml(22B)人eBiosciences IL-23的中和。从曲线计算EC50值。 
图23显示13A8c-PEG-22H8c对IL-6和IL-23的活性。显示13A8c-PEG-22H8c对IL-6和IL-23的生物活性。用B9细胞系生物测定(对于IL-6)和小鼠脾细胞测定(对于IL-23)测量13A8c-PEG-22H8双特异性剂对50pg/ml人IL-6(A)和1200pg/ml(B)人eBiosciences IL-23的中和。从曲线计算EC50值。 
图24显示13A8c-40KPEG-31A12c对IL-6和IL-23的活性。显示13A8c-40kPEG31A12c对IL-6和IL-23的生物活性。用B9细胞系生物测 定(对于IL-6)和小鼠脾细胞测定(对于IL-23)测量双特异性剂对50pg/ml人IL-6(A)和1200pg/ml(B)人eBiosciences IL-23的中和。从曲线计算EC50值。 
图25A显示大鼠中皮下施用后13A8c-40KPEG-31A12c双特异性剂、13A8c-20KPEG-31A12c双特异性剂、13A8c-PEG和裸scFv(28D2)的血清水平(如在B9测定中测量)。 
图25B显示大鼠中皮下施用后13A8c-40KPEG-31A12c双特异性剂、13A8c-20KPEG-31A12c双特异性剂、13A8c-PEG和裸scFv(28D2)血清水平的药物动力学分析结果。 
图26A显示TH17/22细胞的体外极化。在体内和体外系统中都可以产生不同的人T细胞亚群(包括TH17和TH22细胞)。 
图26B显示体外人Th17发育：按所示用抗-CD3/28单独或在LPS和TGFb的存在下体外刺激人PBMC 7天。然后按所示用PMA+洛诺霉素再刺激它们，并进行IL-17和RORC染色。 
图26C显示可以从培养的PBMC产生TH17和TH22。在混合淋巴细胞反应中观察到TH17，而随抗CD3刺激的PBMC观察到TH17和TH22。用抗CD3/28+IL-1b+LPS或异源PBMC+肽聚糖刺激PBMC 5天，然后用PMA+洛诺霉素再刺激，并进行胞内IL-17和IL-22染色。 
图27显示用所选择的scFv抑制Th17和Th22体外发育。在所示scFv的存在下在抗CD3+抗CD28和LPS+IL-1+TGFb中培养人PBMC 5天。5天后，用PMA+洛诺霉素再刺激细胞，并通过流式细胞术测定产生CD4、IL-17和IL-22的细胞的％。 
图28显示混合淋巴细胞反应。显示单独使用或组合使用的抗IL-6和IL-23scFv对TH17分化的抑制作用。在用异源PBMC刺激期间向PBMC培养物中加入所示抗IL-6 scFv和抗IL-23 scFv。5天后，洗涤细胞，用PMA+洛诺霉素再刺激，并进行IL-17染色。 
图29显示双特异性抗IL-6/IL-23抗体对TH17分化的有益抑制作用。单独或组合测试抗IL-6和抗IL-23mAb(13A8和31A12)，以及 31A12c-20KPEG-13A8c双特异性剂。在用异源PBMC刺激期间向PBMC培养物中加入mAb或双特异性剂。显示所加入的结合结构域的摩尔浓度。5天后，洗涤细胞，用PMA+洛诺霉素再刺激，并进行IL-17染色。 
图30显示TH17/22细胞的体内极化。在体内和体外系统中都可以产生不同的人T细胞亚群(包括TH17和TH22细胞)。 
图31A显示用抗IL-6和IL-23的拮抗剂的组合处理人源化scid/hu小鼠。用人异源皮肤移植已成功移入人免疫细胞的NSG小鼠，并每2天接受100mg的13A8c-PEG抗IL-6和31A12c-PEG抗IL-23(scFv-PEG)。皮肤移植30天后，回收脾，用PMA/洛诺霉素刺激单细胞悬液，并测定胞内细胞因子。通过流式细胞术分析CD3+/CD4+细胞的IL-17和IL-22产生。 
图31B显示来自抗IL-6和IL-23的拮抗剂的组合处理的人源化scid/hu小鼠的脾的CD3+/CD4+细胞中胞内细胞因子表达。如前图中所述，通过流式细胞术分析了来自处理和未处理的皮肤异源移植NSG小鼠的脾细胞CD3+/CD4+细胞的胞内IL-17和IL-22。数据显示抗IL-6和抗IL-23处理的动物中IL-17和IL-22阳性CD4+T细胞的所有群体的明显减少。按照所示TH17或TH22细胞的亚群，将数据作为处理或未处理小鼠的平均值和SEM作图。 
图32显示13A8cPEG-31A12c双特异性剂对抑制Sci/hu异源移植模型中Th17和Th22分化的作用： 
用异源人皮肤移植已建立了人免疫系统的成年scid小鼠。所示EOD处理4周后，体外激活脾细胞，通过多参数流式细胞术测量各人CD4T细胞中的细胞因子。每个点表示单只处理的小鼠或对照小鼠，每只小鼠代表3个时间点(对于所示每种细胞因子)。 
单特异性scFv抗-IL23是31A12cPEG；双特异性scFv抗IL6 IL23是13A8c-20KPEG-31A12c。未处理的小鼠接受安慰剂。如通过产生IL-17(图32A，*p＜0.05)和IL-22(图32B，p＜0.05)的CD4+人T细胞的抑制测量，13A8c-20KPEG-31A12c显著减少了Th17细胞的分化。所有其他图测量一般白细胞标记，并显示13A8c-20KPEG-31A12c并非广泛地免疫抑制 TH17/22细胞以外的白细胞。 
图33显示安慰剂处理的小鼠(A)的表皮切片的组织分析，与13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23双特异性剂处理的小鼠(B)比较，其中13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23双特异性剂显著减少银屑病的组织特征，尤其是表皮厚度。 
图34显示完成利用scid/hu异源移植模型的6个实验，在处理期间由不知情的病理学家评定临床评分，并总结在图34A中(临床评分)。组织切片分析使得能够高度定量地测量最有意义的银屑病度量，尤其是表皮厚度，其是公正的测量，显示在图34B中(定量表皮厚度)。双特异性scFv对降低银屑病临床评分和表皮厚度具有高度明显和有效的作用。 
图35A显示耳增生小鼠模型的结果：小鼠在第0、1、2和3天按20μL的体积在右耳接受rhIL-23(1μg)的皮内注射。PBS注入对侧耳作为对照。在第4天测量耳厚度。第一图显示IL-23注射耳的耳厚度，与PBS注射耳相比较。第二图显示IL-23注射耳与各动物的PBS注射耳相比的厚度增加。 
图35B显示在第-1和2天用载体或13A8c-20KPEG-31A12c(100ugi.p.)处理小鼠时耳增生模型的结果。第一图显示IL-23注射耳的耳厚度，与载体或13A8c-20KPEG-31A12c二者处理的动物中的PBS注射耳相比较。第二图显示各动物的IL-23注射耳与PBS注射耳相比较时耳厚度的增加。 
图35C显示仅在第-1天用载体或13A8c-20KPEG-31A12c或13A8c-40KPEG-31A12c(100ug i.p.)处理小鼠时耳增生模型的结果。第一图显示IL-23注射耳的耳厚度，与载体、13A8c-20KPEG-31A12c或13A8c-40KPEG-31A12c二者处理的动物中的PBS注射耳相比较。第二图显示各动物的IL-23注射耳与PBS注射耳相比较时耳厚度的增加。 
图35D显示在第-1和2天用载体或13A8c-40KPEG-31A12c(100ugi.p.)处理小鼠时耳增生模型的结果。第一图显示IL-23注射耳的耳厚度，与载体、13A8c-40KPEG-31A12c或Ustekinumab二者处理的动物中的PBS 注射耳相比较。第二图显示各动物的IL-23注射耳与PBS注射耳相比较时耳厚度的增加。 
图36A显示抗IL-23嵌合抗体与包被在ELISA平板上的IL-12的结合。包含抗IL-6抗体(13A8)作为阴性对照。在第一图中，将人IL-12包被在平板上。22H8显示强结合，而31A12和49B7显示较弱但仍为阳性的结合。在第二图中，将猴IL-12(猕猴)包被在平板上。在此，49B7、31A12和22H8都显示与猕猴IL-12的强结合。在第三图中，用人IL-12p40亚基包被平板。22H8显示强结合，而49B7和31A12与p40亚基的结合较弱。 
图36B显示NK92细胞生物测定中猕猴IL-12诱导的干扰素γ分泌的中和。31A12和22H8二者都显示强烈抑制猕猴IL-12。 
图36C显示NK92细胞生物测定中人IL-12诱导的干扰素γ分泌的中和。在此，与猕猴IL-12不同，31A12或49B不中和人IL-12。22H8中和猕猴IL-12和人IL-12二者。 
发明详述 
双特异性构建体 
本说明书尤其描述与IL-6和IL-23结合并调节其活性的二价双特异性构建体。已知IL-6和IL-23都在TH17细胞的分化和激活中发挥作用。激活的TH17细胞转而通过多种下游途径涉及介导免疫反应。这两种细胞因子在TH17分化的不同阶段发挥作用，IL-6在TH17途径的T细胞定向中非常早地发挥作用，而IL-23作用于定向TH17细胞。因此，本发明提供新的二价双特异性构建体，其抑制TH17激活途径中两个不同的点，且对由TH17产物介导的一些下游炎症反应具有附加抑制作用(例如，在成纤维细胞、内脾细胞、上脾细胞和基质细胞中)。通过靶向IL-6和IL-23二者，双特异性分子能够在TH17途径中的多个点抑制TH17介导的反应，且可能以比对应的单特异性抗体单独高的效价作用。本领域技术人员将理解，由于产生二价双特异性抗体所涉及的不确定性，保留其组成抗体的功能特征或具有改善的功能特征的稳定的二价双特异性构建体的成功产生是令人惊奇和出乎意料的结果。 
此外，本发明的二价双特异性构建体可以调节(例如抑制)TH22细胞激活。TH22是最近鉴定(Eyerich等，2009)的不同亚群的T辅助细胞，其涉及炎症和创伤愈合过程，尤其是与皮肤炎症相联系(Nograles等，2009)。它们的激活及随后作用的机制仍是研究的课题，但细胞本身表征为分泌IL-22和TNF-α，而不分泌IL-17或干扰素γ。Th22细胞尚未充分表征，但可以分离自银屑病患者，且表达与就其他T细胞亚群观察到的基因表达谱不同的基因表达谱。已报道了IL-22表达依赖于IL-23(Kreymborg等，2007)。此处进行的研究进一步表明，与依赖IL-21进行生长刺激的Th17细胞不同，Th22细胞依赖于IL-2。 
本发明的抗体和二价双特异性构建体可以对IL-23或对IL-23和IL-12二者特异。因此，本发明提供抗体和二价双特异性构建体的亚群，其结合IL-23，也靶向IL-12分子。不希望受限于理论，此亚群的抗-IL-23抗体(本文中称为抗-IL-23/IL-12抗体)可能可以结合IL-12和IL-23二者共有的p40亚基(见例如图10)。除IL-23外，靶向IL-23的p40亚基的那些可能抑制IL-12。此外，抗p40的抗体可以结合削弱IL-23活性而不抑制IL-12活性的表位。相反，预期靶向IL-23的p19亚基的那些抗体将不结合IL-12。IL-12涉及TH1介导的免疫反应，因此，这些具体的二价双特异性构建体不仅可以用于调节TH17细胞介导的免疫反应，还可以用于调节TH1细胞介导的反应。这在治疗其病因具有TH1介导的方面和TH17介导的方面二者的病症中可以尤其有利。 
因此，在实施方案中，本发明的二价双特异性构建体，其包含抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物。 
在另一实施方案中，本发明的二价双特异性构建体，其包含抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物。 
可以用体外方法和体内方法二者针对其在调节IL-23和IL-6二者活性中的用途测定本发明的二价双特异性构建体的具体实例。 
下文进一步讨论二价双特异性构建体的成分及其鉴定和制备的手段。 
亲本抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗体的产生 
可以通过标准实验技术来鉴定本发明的二价双特异性构建体中的抗体及其衍生物所基于的起始抗体。这些抗体在本文中称为亲本抗体。 
亲本抗体的选择 
在实施方案中，根据它们结合IL-6、IL-23或IL-12的能力来选择亲本抗体。可以通过测定它们的Kd值来测量亲本抗体的结合。在另一实施方案中，根据它们调节IL-6、IL-23或IL-12的活性的能力来选择亲本抗体。在优选实施方案中，根据它们结合IL-6、IL-23或IL-12的能力及它们调节IL-6、IL-23或IL-12的活性的能力来选择亲本抗体。可以针对它们抑制IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力选择亲本抗体，或者可以针对它们促进IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力选择它们。优选地，针对它们抑制IL-6、IL-23和IL-12的能力选择亲本抗体。 
亲本抗体的来源 
在实施方案中，亲本抗体或其衍生物可以获自相同或分开的动物物种。 
亲本抗体可以例如获自灵长类、啮齿类、兔形目动物、胼足亚目或软骨鱼中产生的抗体。 
亲本抗体可以获自转基因动物。例如，它们可以获自已在遗传上改变为具有人免疫系统的转基因小鼠，例如Xenomouse
Figure BDA00003166002600291
在这类转基因动物中产生的抗体可以具有由外源免疫系统产生的抗体的特征，例如，来自Xenomouse的抗体可以视为人抗体。 
在一种或多种亲本抗体获自啮齿类的情况下，有利地，该啮齿类是小鼠或大鼠。 
在抗体获自兔形目动物的情况下，有利地，该兔形目动物是兔子。 
在一种或多种亲本抗体获自胼足亚目的情况下，它们获自骆驼、美洲鸵或单峰驼。这类“骆驼”抗体的使用可以是有利的，因为已知这些物种产生仅有单个可变结构域的高亲和力抗体。在使用胼足亚目抗体的情况下，使用VHH结构域或其修饰变体是有利的。 
在一种或多种亲本抗体获自软骨鱼的情况下，有利地，该软骨鱼是鲨鱼。 
在一种或多种亲本抗体获自灵长类的情况下，有利地，该灵长类是猴或猿。 
抗体的永生化 
可以通过标准实验技术来永生化亲本抗体。因此，本发明提供从适合用于掺入本发明的二价双特异性构建体中的亲本抗体产生的单克隆抗体。 
具体抗体的组合 
本发明还提供包含抗体和/或其衍生物的组合的组合物。该组合包含IL-6抗体或其衍生物，和IL-23抗体或其衍生物。该IL-23抗体或其衍生物还可以结合IL-12。 
抗体及其衍生物的优选组合包含下文定义的IL-6抗体中的任一种，其与下文定义的抗-IL-23或抗-IL-23/IL-12抗体中的任一种组合。 
预期包含这类组合的组合物具有比单独施用时的单种抗体更高的活性。抗体或其衍生物的尤其优选的组合是抗-IL-6抗体13A8或基于13A8的衍生物，和抗-IL-23抗体31A12或基于31A12的衍生物。与任一抗原单独相比，抗体的此组合提供更高的TH17细胞活性的抑制。该组合具有比本领域已知的抗体更高的TH17细胞抑制活性。此外，它在有利地低的剂量下显示此抑制活性。 
抗体或其衍生物的尤其优选的组合包含与PEG化IL-23抗体或其衍生物组合的PEG化IL-6抗体或其衍生物。该IL-23抗体或其衍生物还可以结合IL-12(即，是IL-23/IL-12抗体)。 
抗体的人源化 
可以对二价双特异性构建体的抗体进行改变来使它们在对人施用时具有更低的免疫原性。这种改变可以包含通常称为嵌合化、人源化、CDR移植、去免疫和/或构架区氨基酸突变为对应的最接近的人种系序列(种系化(germlining))的技术中的一种或多种。对抗体进行这种改变具有这样的优势，使得否则将引出宿主免疫反应的抗体对宿主免疫系统而言更“不可见”或完全“不可见”，使得这种免疫反应不发生或减少。因此，按照此实施方案所述改变的抗体将比对应的未进行任意这种(类)改变的抗体保持 可施用更长的时期，具有降低的免疫反应相关副作用或无免疫反应相关副作用。本领域普通技术人员将理解如何确定是否及必须以什么程度改变抗体来阻止它引出不想要的宿主免疫反应。 
因此，本发明提供人源化或嵌合抗体，其已改变，使得它们包含来自一种或多种生物的氨基酸序列，或包含合成的氨基酸序列(例如，本发明的人源化或嵌合抗体可以包含与获自啮齿类的CDR区连接的人构架区)。 
具体的目的抗体 
因此，根据本发明，提供具体的人源化抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗体。这些抗体基于显示结合IL-6、IL-23或p40并调节(例如抑制)其生物活性的能力的亲本抗体。此外，本发明提供的具体抗体在永生化和人源化之后保留或基本保留这些能力。 
具体的目的人源化抗体包括以下： 
抗-IL-6抗体： 
13A8(包含SEQ ID NO.259的VH和SEQ ID NO.261的VL)； 
9H4(包含SEQ ID NO.46的VH和SEQ ID NO.48的VL)； 
9C8(包含SEQ ID NO.56的VH和SEQ ID NO.58的VL)； 
8C8(包含SEQ ID NO.36的VH和SEQ ID NO.38的VL)； 
18D4(包含SEQ ID NO.26的VH和SEQ ID NO.28的VL)；和 
28D2((包含SEQ ID NO.16的VH和SEQ ID NO.18的VL)。 
抗-IL-23抗体： 
31A12(包含SEQ ID NO.267的VH和SEQ ID NO.269的VL)； 
34E11(包含SEQ ID NO.116的VH和SEQ ID NO.118的VL)； 
35H4(包含SEQ ID NO.126的VH和SEQ ID NO.128的VL)； 
49B7(包含SEQ ID NO.96的VH和SEQ ID NO.98的VL)；和 
16C6(包含SEQ ID NO.106的VH和SEQ ID NO.108的VL)。 
抗-IL-23/IL-12抗体： 
45G5(包含SEQ ID NO.275的VH和SEQ ID NO.277的VL)； 
14B5(包含SEQ ID NO.186的VH和SEQ ID NO.188的VL)； 
4F3(包含SEQ ID NO.166的VH和SEQ ID NO.168的VL)； 
5C5(包含SEQ ID NO.176的VH和SEQ ID NO.178的VL)； 
22H8(包含SEQ ID NO.271的VH和SEQ ID NO.273的VL)；和 
1H1(包含SEQ ID NO.156的VH和SEQ ID NO.158的VL)。 
尤其优选的人源化抗体是13A8、31A12和22H8的人源化形式。 
抗体变体 
本发明还提供抗体变体例如作为二价双特异性构建体的成分。该抗体保留或基本保留结合亲和力及调节IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力(例如，与其亲本抗体相比，变体抗体的Kd值是至少80％，通过本文中公开的测定法测定，其调节生物活性的能力是其亲本抗体的至少80％)。 
可以通过突变重链和/或轻链的可变结构域来获得变体抗体或其衍生物，以改变抗体的结合特性。例如，可以在编码一个或多个CDR区的核酸分子中产生突变来提高或降低抗体对IL-6或IL-23的Kd值；提高或降低抗体调节IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力；或改变抗体的结合特异性。用位点定向诱变引入这类突变的技术为本领域公知。 
可以通过突变重链和/或轻链的可变结构域来获得其他变体抗体或其衍生物，以改变等电点(pI)，增强pH为3-7.5(最终制剂的范围)的蛋白质的稳定性，避免二硫键改组。见例如SEQ ID NO 332，31A12pI优化，其中修饰以下氨基酸：Q26R、L56R、K109-G110insR和Q142K；SEQ ID 334，13A18pI优化，其中修饰以下氨基酸：Q26R、L56R、K112-G113insR和Q145K。此外，可以通过突变重链和/或轻链的可变区来增强稳定性，以减少产物在溶液中的聚集，见例如SEQ ID NO 331，预测增强溶解性并减少产物聚集的31A12F12S突变；SEQ ID NO.333，组合pI优化和F12S突变的31A12。 
在另一实施方案中，可以在一个或多个构架区中突变核酸分子。可以在构架区或恒定区中产生突变来增加抗-IL-6或抗-IL-23抗体的半衰期。还可以在构架区或恒定区中产生突变来改变抗体的免疫原性；提供用于与另一分子共价或非共价结合的位点；或改变诸如补体结合的特性。 
因此，根据本发明，可以在单种突变抗体中的构架区、恒定区和可变区的每一个中产生突变。备选地，可以在单种突变抗体中的构架区、可变区或恒定区的仅一个中产生突变。 
序列变异 
在实施方案中，本发明提供与突变前的抗-IL-6抗体具有至少90％序列同一性的变体抗-IL-6抗体。优选地，该变体抗-IL-6抗体与突变前的抗-IL-6抗体具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。 
在实施方案中，本发明提供与突变前的抗-IL-23抗体具有至少90％序列同一性的变体抗-IL-23抗体。优选地，该变体抗-IL-23抗体与突变前的抗-IL-23抗体具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。 
在实施方案中，本发明提供与突变前的抗-IL-23/IL-12抗体具有至少90％序列同一性的变体抗-IL-23/IL-12抗体。优选地，该变体抗-IL-23/IL-12抗体与突变前的抗-IL-23/IL-12抗体具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。 
添加缺失取代 
在实施方案中，与突变前的抗-IL-6抗体相比，变体抗-IL-6抗体的VH或VL区中存在不超过10个氨基酸改变。 
在另一实施方案中，与突变前的抗-IL-23抗体相比，变体抗-IL-23抗体的VH或VL区中存在不超过10个氨基酸改变。 
在另一实施方案中，与突变前的抗-IL-23/IL-12抗体相比，变体抗-IL-23/IL-12抗体的VH或VL区中存在不超过10个氨基酸改变。 
在更优选的实施方案中，变体抗-IL-6抗体的VH或VL区中、变体抗-IL-23抗体中或变体抗-IL-23/IL-12抗体中存在不超过5个氨基酸改变，更优选不超过3个氨基酸改变。在另一实施方案中，与突变前的抗-IL-6抗体相比、与突变前的抗-IL-23抗体相比或与突变前的抗-IL-23/IL-12抗体相比，变体抗-IL-6抗体、变体抗-IL-23抗体或变体抗-IL-23/IL-12抗体的恒定区中存在不超过15个氨基酸改变，更优选存在不超过10个氨基酸改变，甚至更优选不超过5个氨基酸改变。 
抗体衍生物 
可以用本领域普通技术人员已知的技术和方法来产生抗体衍生物。本发明的抗体衍生物保留或基本保留它们所衍生自的抗体的结合亲和力及调节IL-6、IL-23或p40的生物活性的能力。抗体衍生物的实例包括衍生自本文中公开的抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗体的Fab、Fab’、F(ab)’及scFv构建体、Kappabody、微抗体和Janusin。 
Fab、Fab’、F(ab)’ 
在本发明的一个实施方案中，提供抗-IL-6抗体或变体抗-IL-6抗体的Fab、Fab’、F(ab)’片段。 
在本发明的一个实施方案中，提供抗-IL-23抗体或变体抗-IL-23抗体的Fab、Fab’、F(ab)’片段。 
在本发明的一个实施方案中，提供抗-IL-23/IL-12-23/IL-126抗体或变体抗-IL-23/IL-12抗体的Fab、Fab’、F(ab)’片段。 
单链抗体(scFv) 
在本发明的一个实施方案中，提供抗-IL-6抗体或变体抗-IL-6抗体的scFv衍生物。 
在本发明的一个实施方案中，提供抗-IL-23抗体或变体抗-IL-23抗体的scFv衍生物。 
在本发明的一个实施方案中，提供抗-IL-23/IL-12抗体或变体抗-IL-23/IL-12抗体的scFv衍生物。 
为了产生单链抗体(scFv)，将编码VH和VL的DNA片段与另一编码柔性接头的片段有效连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，VL和VH区通过该柔性接头连接(见例如Bird等(1988)Science242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.美国85：5879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554)。单链抗体可以是单价(如果仅使用单个VH和VL)、二价(如果使用两个VH和VL)或多价(如果使用超过两个VH和VL)。 
在实施方案中，用来自抗-IL-6抗体的一个或多个可变区来制备单链抗 体。在另一实施方案中，用来自抗-IL-6抗体的一个或多个CDR区来制备单链抗体。 
在实施方案中，用来自抗-IL-23抗体的一个或多个可变区来制备单链抗体。在另一实施方案中，用来自抗-IL-23抗体的一个或多个CDR区来制备单链抗体。 
在实施方案中，用来自抗-IL-23/IL-12抗体的一个或多个可变区来制备单链抗体。在另一实施方案中，用来自抗-IL-23/IL-12抗体的一个或多个CDR区来制备单链抗体。 
在优选实施方案中，抗-IL-6单链抗体衍生自上文所述的人源化抗-IL-6抗体。 
在优选实施方案中，抗-IL-23单链抗体衍生自上文所述的人源化抗-IL-23抗体。 
在优选实施方案中，抗-IL-23/IL-12单链抗体衍生自上文所述的人源化抗-IL-23/IL-12抗体。 
在实施方案中，单链抗体的轻链和重链通过具有以下氨基酸序列的接头部分连接： 
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.327)， 
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.328)， 
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.329) 
GGGGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.330)。 
本发明的接头部分可以是重复3至5次的序列GGGGS，或非整数重复的GGGGS序列，见例如SEQ ID NO.330。 
在实施方案中，本发明的单链抗体与PEG共价连接。 
Kappabody、微抗体和Janusin 
在另一实施方案中，可以用编码抗-IL-6抗体、抗-IL-23抗体或抗-IL-23/IL-12抗体的核酸分子来制备其他修饰抗体。例如，可以用标准分子生物学技术来制备“Kappa body”(ILl等，Protein Eng 10：949-57(1997))、“微抗体”(Martin等，EMBO J 13：5303-9(1994))或“Janusin” (Traunecker等，EMBO J 10：3655-3659(1991)和Traunecker等″Janusin：new molecular design for bispecific reagents″Int J Cancer Suppl 7：51-52(1992))。 
互补决定区(CDR) 
互补决定区(CDR)是见于抗原受体(例如免疫球蛋白和T细胞受体)的可变(V)结构域中的柔性环形式的相对短的氨基酸序列。免疫球蛋白和T细胞受体二者的CDR是这些分子的决定其特异性并与特异性配体接触的部分。CDR是该分子的最可变部分，并促成这些分子的多样性，允许免疫球蛋白和T细胞受体识别许多种抗原。因此，组成本发明的二价双特异性构建体的抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗体中的这些区域在决定该抗体的特异性中发挥关键作用，预期具有共同的具体CDR区的抗体将具有相同或相似的抗原特异性。因此，在本发明的一方面，抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含它们所基于的抗体的CDR区。 
还应指出，认为一些CDR区在抗体特异性中发挥比其他CDR区重要的作用。具体而言，在设计包含在二价双特异性构建体的抗体或其衍生物中，使用VH结构域的至少第三互补决定区(CDR)通常有利，因为已知这些在所有CDR区的结合特异性和亲和力中发挥主要作用。因此，本发明提供组成本发明的二价双特异性构建体的抗体和抗体衍生物包含亲本抗体的CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5和CDR6中的至少一个。优选地，组成二价双特异性构建体的抗体和抗体衍生物至少包含CDR3。 
在实施方案中，与突变前的抗-IL-6抗体相比，突变的抗-IL-6抗体具有至少一个保持未变的互补决定区(CDR)。该未变的CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6。 
在另一实施方案中，与突变前的抗-IL-23抗体相比，突变的抗-IL-23抗体具有至少一个保持未变的互补决定区(CDR)。该未变的CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6。 
在实施方案中，与突变前的抗-IL-6抗体相比，突变的抗-IL-23/IL-12 抗体具有至少一个保持未变的互补决定区(CDR)。该未变的CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6。 
CDR氨基酸序列内的基序 
本领域技术人员应理解，甚至对于单个CDR，也存在在决定具体抗体或其衍生物的特异性中尤其重要的具体区域(本文中称为基序)。这些区域的特异性可以由许多因素决定，如它们的构象及带电荷的氨基酸残基在该区域内的定位。本领域技术人员可以通过本领域已知的技术来鉴定这些基序，包括表位作图及比较已知结合相同靶标的抗体的序列。因此，本发明提供包含具有具体基序的CDR的抗体或其衍生物。 
在实施方案中，该CDR包含取自以下抗体的CDR区的至少3个、至少4个、至少5个或至少6个连续氨基酸： 
13A8(SEQ ID NO.10-15的CDR)； 
9H4(SEQ ID NO.50-55的CDR)； 
9C8(SEQ ID NO.60-65的CDR)； 
8C8(SEQ ID NO.40-45的CDR)； 
18D4(SEQ ID NO.30-35的CDR)； 
28D2(SEQ ID NO.20-25的CDR)； 
31A12(SEQ ID NO.90-95的CDR)； 
34E11(SEQ ID NO.120-125的CDR)； 
35H4(SEQ ID NO.130-135的CDR)； 
49B7(SEQ ID NO.100-105的CDR)； 
16C6(SEQ ID NO.110-115的CDR)； 
45G5(SEQ ID NO.150-155的CDR)； 
14B5(SEQ ID NO.190-195的CDR)； 
4F3(SEQ ID NO.170-175的CDR)； 
5C5(RSEQ ID NO.180-185的CD)； 
22H8(SEQ ID NO.140-145的CDR)；和 
1H1(SEQ ID NO.16-165的CDR)。 
在另一实施方案中，该CDR包含取代的取自上述CDR的连续氨基酸序列。具体而言，基序可以包含至少3个、至少4个、至少5个或至少6个残基，其中氨基酸的同一性和位置相对于序列中的其他氨基酸固定，与对应的取代前的CDR的氨基酸相比可以取代一个或两个氨基酸。优选地，该取代是保守取代。这种基序的实例可以见于22H8抗-IL-23/IL-12抗体的CDR2区内。基序可以通过下式来描述： 
氨基酸序列WX1KG，其中X1是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，优选丙氨酸或缬氨酸； 
见于本发明的抗-IL-23/IL-12抗体的CDR的共同基序的其他实例包括： 
CDR3区中的包含氨基酸序列YAYX1GDAFDP的基序，其中X1是丙氨酸或异亮氨酸；(SEQ ID NO.339) 
和/或 
CDR3区中的包含氨基酸序列SDYFNX1的基序，其中X1是异亮氨酸或缬氨酸；(SEQ ID NO.340) 
和/或 
CDR4区中的包含氨基酸序列QX1SQX2的基序，其中 
X1是丙氨酸或丝氨酸；和 
X2选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸； 
优选地，X2是丝氨酸或苏氨酸； 
和/或 
CDR5区中的包含氨基酸序列ASX1LA的基序，其中X1是赖氨酸或苏氨酸；(SEQ ID NO.341) 
和/或 
CDR6区中的包含氨基酸序列QSYYDX1NAGYG的基序，其中X1是丙氨酸或缬氨酸；(SEQ ID NO.342) 
见于本发明的IL-23抗体的CDR的共同基序的实例包括： 
CDR2区中的包含氨基酸序列YYAX1WAX2G的基序，其中 
X1选自丝氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；和 
X2选自赖氨酸和谷氨酰胺；(SEQ ID NO.337) 
和/或 
CDR5区中的包含氨基酸序列AX1TLX2S的基序，其中 
X1选自丝氨酸和丙氨酸； 
X2选自丙氨酸和苏氨酸；(SEQ ID NO.338)。 
见于本发明的IL-6抗体的CDR的共同基序的实例包括： 
CDR2区中的包含氨基酸序列YIYTDX1STX2YANWAKG的基序，其中 
X1选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；和 
X2选自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和 
优选地，X1是丝氨酸或苏氨酸，而X2是色氨酸或酪氨酸；(SEQ ID NO.335) 
和/或 
CDR5区中的包含氨基酸序列RX1STLX2S的基序，其中X1和X2独立地是丙氨酸或苏氨酸。(SEQ ID NO.336) 
掺入非天然氨基酸的修饰 
本发明提供非天然氨基酸残基掺入抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物来为抗-IL-6抗体或其衍生物、抗-IL-23或抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物提供附着点。本领域技术人员将意识到许多可能适宜的非天然氨基酸，包括例如叠氮基高丙氨酸(Aha)。其他非天然氨基酸包括叠氮基正亮氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基-氧-苯丙氨酸、间-乙炔基-苯丙氨酸、6-乙炔基-色氨酸、5-乙炔基-色氨酸、(R)-2-氨基-3-(4-乙炔基-1H-吡咯-3-基)丙酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、对-叠氮基苯丙氨酸、3-(6-氯吲哚基)丙氨酸、3-(6-溴吲哚基)丙氨酸、3-(5-溴吲哚基)丙氨酸、高烯丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸和 对-氯苯丙氨酸。在优选实施方案中，该非天然氨基酸是Aha。 
本领域技术人员还将理解，为了控制附着位点，有必要改造抗体或其衍生物的氨基酸序列，使得非天然氨基酸仅定位在将要发生附着的位置。在实施方案中，非天然氨基酸可以定位在本文公开的抗体或其衍生物的N端。在实施方案中，非天然氨基酸可以定位在本文公开的抗体或其衍生物的C端。在实施方案中，非天然氨基酸可以定位在本文公开的scFv的VH和VL部分之间的连接区中(例如SEQ ID NO.327内)。在实施方案中，待掺入二价双特异性构建体的各抗体中存在单个附着点。抗体或其衍生物、scFv和/或本发明的二价双特异性构建体的部分的实例包括SEQ ID No.287至312。 
在实施方案中，通过在掺入非天然氨基酸(如Aha)取代甲硫氨酸(Met)的营养缺陷型宿主细胞中表达抗体来达到非天然氨基酸的掺入。为了存在单个附着位点，必须改造抗体核苷酸序列来去除不定位在希望的附着位点的任意天然存在的甲硫氨酸密码子。这可以通过用其他氨基酸(通常是天然氨基酸)的密码子取代它们来达到。由于1-2个甲硫氨酸残基常见于免疫球蛋白VH区的构架区和CDR内，在VL区中不常见，有必要为这些残基找到适宜的取代，其中它们的存在不影响希望的蛋白质的表达、稳定性或功能(例如结合或靶标中和活性)。然后可以优化此无甲硫氨酸的scFv来在甲硫氨酸营养缺陷型细菌菌株中表达，纯化，重折叠，并测试生物活性。可选地，可以在序列中保留超过一个甲硫氨酸密码子，以允许掺入超过一个非天然氨基酸(如Aha)。 
如果甲硫氨酸并非天然存在于希望的附着位点，可以引入单个(或可选地，超过一个)甲硫氨酸密码子，其作为具有用于附着的化学反应位点的非天然氨基酸的插入位点。 
修饰为包含非天然氨基酸的抗体可以附着于一个或多个分开的实体。这些实体包括连接基团和/或其他类似地修饰的抗体。适宜的接头的实例为本领域已知，且包括短肽序列。本发明还提供PEG作为接头的用途。因此，在实施方案中，掺入非天然氨基酸的抗-IL-6抗体或其衍生物可以与 PEG连接基团共价连接，该PEG连接基团转而与掺入非天然氨基酸的抗-IL-23或抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物连接。然后可以纯化并重折叠这类双特异性PEG化构建体来产生稳定的生物活性治疗蛋白质。 
适宜地，本发明中的修饰为包含非天然氨基酸的抗体或其衍生物可以直接(例如，不使用连接基团)与其他类似地修饰的分子(包括但不限于其他抗体或其衍生物、染料、药物或毒素)连接。 
标记和衍生化 
本发明的二价双特异性构建体或抗体可以衍生化或与另一分子连接。一般而言，这样衍生二价双特异性构建体，使得组成抗体或其衍生物的结合活性和生物活性不受衍生化或标记的不利影响。 
例如，本发明的二价双特异性构建体可以与一种或多种其他分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、单价结合或其他方式)，如检测剂、细胞毒剂、药物和/或可以介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标记)的结合的蛋白质或肽。 
一类衍生的二价双特异性构建体是标记的二价双特异性构建体。可以用来衍生本发明的二价双特异性构建体的有用的检测剂包括荧光化合物，其包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系化合物磷光体(lanthanide phosphor)等。还可以用用于检测的酶来标记二价双特异性构建体，如辣根过氧化物酶、-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。用可检测的酶标记二价双特异性构建体时，通过加入该酶用来产生可识别的反应产物的其他试剂来检测它。 
例如，在存在物质辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入产生可检测的有色反应产物。还可以用生物素标记二价双特异性构建体，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合来检测。还可以用预先确定的由第二报道分子识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合结构域、附加表位)标记二价双特异性构建体。在一些实施方案中，通过多种长度的间隔臂附着标记来减少潜在的空间位阻。 
还可以用放射性标记的氨基酸标记二价双特异性构建体。放射性标记可以用于诊断目的和治疗目的二者。可以在诊断上使用放射性标记的二价双特异性构建体来例如测定受试者中的IL-6和/或IL-23水平。此外，可以在治疗上使用放射性标记的二价双特异性构建体来治疗由TH17途径介导的疾病。放射性标记的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核素：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。还可以通过用诸如DOTA的螯合部分的衍生化来使放射性同位素结合于抗体或双特异性剂。几种有用的成像和治疗放射性同位素与这些螯合剂紧密结合。 
还可以用诸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或糖基的化学基团衍生化二价双特异性构建体。这些基团可以用来改善抗体的生物特征，例如，增加血清半衰期或增加组织结合。 
抗体/衍生物的表达 
可以用常规重组技术表达本发明的二价双特异性构建体和组成二价双特异性构建体的抗体及其衍生物。此外，在构建体和/或抗体及其衍生物包含非天然氨基酸时，可以使用WO 2007/130453中所述的重组方法。用来表达二价双特异性构建体和抗体及其衍生物的核苷酸序列、载体、宿主细胞等是本发明的目的。 
多核苷酸 
在实施方案中，本发明提供编码上文定义的二价双特异性构建体和组成二价双特异性构建体的抗体及其衍生物的核苷酸序列。 
因此，本发明涵盖编码以下的核苷酸序列：(1)本发明的单克隆抗体；(2)本发明的人源化抗体；(3)本发明的基于(1)和(2)的变体抗体；(4)本发明的(1)至(3)的抗体的衍生物；和(5)本发明的二价双特异性构建体。 
在实施方案中，该核苷酸序列编码抗-IL-6抗体的部分。这类序列的实例在SEQ ID NO.7和9中给出，其是命名为13A8的IL-6抗体的VH和VL区的核苷酸序列。 
在实施方案中，该核苷酸序列编码抗-IL-23抗体的部分。这类序列的 实例在SEQ ID NO.87和89中给出，其是命名为31A12的抗-IL-23抗体的VH和VL区的核苷酸序列。 
在实施方案中，该核苷酸序列编码抗-IL-23/IL-12抗体的部分。这类序列的实例在SEQ ID NO.137和139中给出，其是命名为22H8的抗-IL-23/IL-12抗体的VH和VL区的核苷酸序列。 
在实施方案中，该二价双特异性构建体可以表达为单一产物。 
启动子 
在实施方案中，本发明的核苷酸序列与启动子序列有效连接。适宜的启动子的实例包括但不限于T5/Lac启动子、T7/Lac或修饰的T7/lac启动子、Trc或tac启动子、噬菌体pL或pR温度诱导型启动子、tetA启动子/操纵基因、araBAD(pBAD)启动子、rhaPBAD启动子和lac UV5启动子。其他适宜的启动子可以从Terpe，K.(2006)(Appl Microbiol Biotechnol 72：211-222)鉴定。在优选实施方案中，该启动子是T5/Lac启动子。 
载体 
在实施方案中，本发明提供包含可选地与启动子序列有效连接的本发明的核苷酸序列的载体。 
宿主细胞 
在实施方案中，本发明提供用本发明的载体转染，并能够表达包含在该载体内的核苷酸序列的宿主细胞。可选地，该宿主细胞是能够掺入非天然氨基酸取代具体的天然氨基酸(例如，AHA取代Met)的营养缺陷型细胞。适宜的真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。优选地，该宿主细胞是原核细胞，尤其是大肠杆菌B384，其是甲硫氨酸营养缺陷型细胞。备选地，该细胞是哺乳动物细胞，更优选它们是人细胞，还更优选它们是人胚肾细胞(例如HEK 293或HEK 293c18细胞)或CHO细胞。 
引物 
在本发明的实施方案中，提供用于克隆和表达抗-IL-6、抗-IL-23抗体和抗-IL-23/IL-12抗体及其衍生物的引物。这些引物的长度在10至40个核苷酸之间，优选它们的长度在15至30个核苷酸之间。由于本文公开的 抗体及其衍生物的核酸序列的公开，本领域技术人员将能够确定适宜的引物序列。具体的目的引物序列在SEQ ID NO.200-258中给出，其用于克隆和表达本文公开的抗体和scFv。 
非天然氨基酸的掺入 
WO 2007/130453中公开了用非天然氨基酸来允许将部分缀合于肽。下文也讨论了这种蛋白质工程。 
蛋白质工程方法中的第一步通常是选择一组具有希望的化学性质的非天然氨基酸。非天然氨基酸的选择取决于预先确定的化学性质和希望在靶分子或靶蛋白质中进行的修饰。一旦选择，可以从供应商购买或化学合成非天然氨基酸。可以将任意数目的非天然氨基酸掺入靶分子，且可以根据待附着的希望的化学部分的数目而变。化学部分可附着于全部非天然氨基酸或仅仅附着于一些非天然氨基酸。此外，取决于希望的结果，可以将相同或不同的非天然氨基酸掺入分子。在某些实施方案中，将至少两种不同的非天然氨基酸掺入分子，一个化学部分(如PEG)附着于非天然氨基酸残基之一，而另一化学部分(如细胞毒剂)附着于另一非天然氨基酸。 
多种非天然氨基酸可以用于本发明的方法。通常，选择或设计用于本发明的非天然氨基酸来提供在二十种天然氨基酸中不可得的附加特征。例如，可选地设计或选择非天然氨基酸来修饰它们所掺入的分子(包括蛋白质)的生物学性质。例如，可选地通过在分子(如蛋白质)中纳入非天然氨基酸来修饰以下性质：毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、对酶降解的抗性等)、便于纯化和处理、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、作为疫苗发挥作用的能力、氧化还原电位、半衰期、与其他分子反应(例如共价或非共价)的能力等。 
本文所用的“非天然氨基酸”指除硒代半胱氨酸和以下二十种遗传编码的α-氨基酸之外的任意氨基酸、修饰氨基酸或氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。式I显示α-氨基酸的一般结构： 
Figure BDA00003166002600451
非天然氨基酸通常是具有式I的任意结构，其中R基是除用于二十种天然氨基酸中的取代基之外的任意取代基。二十种天然氨基酸的结构见例如任意生物化学教科书，如L.Stryer的Biochemistry，第3版1988，Freeman and Company，New York。应注意，本文公开的非天然氨基酸可以是除以上二十种α-氨基酸之外的天然存在的化合物。因为本文公开的非天然氨基酸通常仅在侧链中与天然氨基酸不同，所以非天然氨基酸以与它们在天然存在的蛋白质中形成酰胺键的方式相同的方式与其他氨基酸(例如天然或非天然氨基酸)形成酰胺键。但是，非天然氨基酸具有使它们区别于天然氨基酸的侧链基团。例如，式I中的R可选地包含烷基、芳基、芳基卤化物、乙烯基卤化物、β-甲硅烷基链烯基卤化物、β-甲硅烷基链烯基磺酸酯、烷基卤化物、乙酰基、酮、氮丙啶、腈、硝基、氧化腈、卤化物、酰基、酮基、叠氮基、酮缩醇、缩醛、羟基、肼、氰基、卤、酰肼、链烯基、炔基、醚、硫醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯(boronate ester)、硼烷、苯基硼酸、硫醇、硒基、磺酰基、硼酸盐、硼酸(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、吡啶基、萘基、二苯甲酮、受限环，如环辛炔、环丙烯、降冰片烯硫酯、烯酮、亚胺、醛、酯、硫羰酸、羟基胺、氨基、羧酸、α-酮羧酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰酰胺、或有机硅烷、吡喃酮、四嗪、哒嗪、酰肼、肼、烷氧基胺、芳基磺酸酯、芳基卤化物、氨基硫脲、氨基脲、四唑基等或其任意组合。 
非天然氨基酸的具体实例包括但不限于：对-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、β-O-GlcNAc-L-丝氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸、α-GalNAc-L-苏氨酸、L-Dopa、 氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、吡咯赖氨酸、N-σ-邻-叠氮基苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-2-叠氮基乙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸(BocLys)、N-σ-烯丙氧基羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰基-L-赖氨酸、N-σ-烟酰-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素酰-L-赖氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-三甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹酰-L-赖氨酸、N-σ-邻，对-二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对-甲苯磺酰-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸，下文或本文其他地方所列的那些等；例如，选择对-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、β-O-GlcNAc-L-丝氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸、α-GalNAc-L-苏氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸和异丙基-L-苯丙氨酸。 
芳基取代可以发生在多种位置，例如邻位、间位、对位，并将一个或多个功能基团放置在芳基环上。其他目的非天然氨基酸包括但不限于：包含光活化交联剂的氨基酸；自旋示踪的氨基酸；染料标记的氨基酸；荧光氨基酸；金属结合的氨基酸；包含金属的氨基酸；放射性氨基酸；具有新的功能基团的氨基酸；具有改变的亲水性、疏水性、极性或形成氢键的能力的氨基酸；与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸；photocaged和/或光异构化氨基酸；包含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化的氨基 酸，如糖取代的丝氨酸、其他糖类修饰的氨基酸；包含酮的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚、多元醇、或多糖的氨基酸；可进行易位的氨基酸；可进行环加成的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割和/或光切割的氨基酸；与天然氨基酸相比具有长侧链的氨基酸，例如聚醚或长链烃，例如大于约5个或大于约10个碳；包含碳连接的糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；包含氨基硫羰酸的氨基酸；包含药物部分的氨基酸；及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。 
除包含新的侧链的非天然氨基酸外，非天然氨基酸还可选地包含例如式II和III的结构所示的修饰的主链结构： 
Figure BDA00003166002600471
其中Z通常包含OH、NH.sub.2、SH、NH.sub.2O--、NH--R′、R′NH--、R′S-或S--R′--；X和Y(其可以相同或不同)通常包含S、N或O；R和R′(其可选地相同或不同)通常选自与上文针对具有式I的非天然氨基酸所述的R基的组成相同的列表，以及氢或(CH.sub.2).sub.x或天然氨基酸侧链。例如，本文公开的非天然氨基酸可选地在式II和III所示的氨基或羧基中包含取代。此类非天然氨基酸包括但不限于：侧链对应于例如二十种天然氨基酸或对应于非天然侧链的α-羟酸、α-硫羰酸、α-氨基硫代羧酸或α-α-双取代氨基酸。它们还包括但不限于：β-氨基酸或γ-氨基酸，如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。此外，α-碳上的取代或修饰可选地包括L或D异构体，如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其他结构备选包括环氨基酸，如脯氨酸类似物，以及3-、4-、6-、7-、8-和9-元环脯氨酸类似物。一些非天然氨基酸(如芳基卤化物(对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸))提供万能的钯催化的与乙炔或乙炔反应物(acetylene  reaction)的交联反应，其允许在芳基卤化物和多种偶联配偶体之间形成碳-碳、碳-氮和碳-氧键。 
例如，许多非天然氨基酸基于诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等的天然氨基酸。酪氨酸类似物包括对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中该取代的酪氨酸包含乙酰基、苯甲酰基、氨基、肼、羟基胺、硫羟基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基等。此外，还考虑多取代的芳基环。谷氨酰胺类似物包括但不限于：α-羟基衍生物、β-取代衍生物、环衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。示例性苯丙氨酸类似物包括但不限于：间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、乙酰基等。 
非天然氨基酸的具体实例包括但不限于：邻位、间位和/或对位形式的氨基酸或氨基酸类似物(非天然氨基酸)，包括高烯丙基甘氨酸、顺式或反式巴豆基甘氨酸、6，6，6-三氟-2-氨基己酸、2-aminopheptanoic acid、正缬氨酸、正亮氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、邻-、间-或对-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、邻-、间-或对-溴苯丙氨酸、2-、3-或4-吡啶基丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、二氨基丁酸、氨基丁酸、苯并呋喃基丙氨酸、3-溴-酪氨酸、3-(6-氯吲哚基)丙氨酸、3-(6-溴吲哚基)丙氨酸、3-(5-溴吲哚基)丙氨酸、对-氯苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基-氧-苯丙氨酸、间-乙炔基-苯丙氨酸、6-乙炔基-色氨酸、5-乙炔基-色氨酸、(R)-2-氨基-3-(4-乙炔基-1H-吡咯-3-基)丙酸、叠氮基正亮氨酸、叠氮基高丙氨酸、对-乙酰基苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、对-乙基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基-氧-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-碘-酪氨酸、O-炔丙基-酪氨酸、高谷氨酰胺、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、三-O- 乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-乙酰基-L-苯丙氨酸、间-乙酰基-L-苯丙氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、炔苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、O-(2-丙炔基)-L-酪氨酸、对-乙硫基羰基-L-苯丙氨酸、对-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、高炔丙基甘氨酸、叠氮基高丙氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴-L-苯丙氨酸、二羟基-苯丙氨酸、二羟基-L-苯丙氨酸、对-硝基-L-苯丙氨酸、间-甲氧基-L-苯丙氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、三氟亮氨酸、正亮氨酸、4-、5-或6-氟-色氨酸、4-氨基色氨酸、5-羟基色氨酸、生物胞素、氨基羟基乙酸、间-羟基苯丙氨酸、间-烯丙基苯丙氨酸、间-甲氧基苯丙氨酸基团、β-GlcNAc-丝氨酸、α-GalNAc-苏氨酸、对-乙酰乙酰基苯丙氨酸、对-卤-苯丙氨酸、硒代甲硫氨酸、乙基硫氨酸、S-亚硝基-高半胱氨酸、硫代-脯氨酸、3-噻吩基-丙氨酸、高-烯丙基-甘氨酸、三氟异亮氨酸、反式和顺式-2-氨基-4-己烯酸、2-丁炔基-甘氨酸、烯丙基-甘氨酸、对-叠氮基-苯丙氨酸、对-氰基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、六氟亮氨酸、1，2，4-三唑-3-丙氨酸、2-氟-组氨酸、L-甲基组氨酸、3-甲基-L-组氨酸、β-2-噻吩基-L-丙氨酸、β-(2-噻唑基)-DL-丙氨酸、高炔丙基甘氨酸(HPG)和叠氮基高丙氨酸(AHA)等。多种非限制性非天然氨基酸的结构在图中提供，例如US 2003/0108885 A1的图29、30和31，该专利的全部内容在此引用作为参考。 
酪氨酸类似物包括对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中该取代的酪氨酸包含乙酰基、苯甲酰基、氨基、肼、羟基胺、硫羟基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基等。此外，还考虑多取代的芳基环。本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于：α-羟基衍生物、β-取代衍生物、环衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸类似物的实例包括但不限于：间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、乙 酰基等。赖氨酸类似物包括N-σ取代的，如吡咯赖氨酸、N-σ-邻-叠氮基苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-2-叠氮基乙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸(BocLys)、N-σ-烯丙氧基羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰基-L-赖氨酸、N-σ-烟酰-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素酰-L-赖氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-三甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹酰-L-赖氨酸、N-σ-邻，对-二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对-甲苯磺酰-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨。 
此外，其他实例可选地包括(但不限于)：酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤、肼、酰肼、羟基、链烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫羰酸、硼酸盐、硼酸(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟基胺、酮、酮缩醇、缩醛、应变环辛炔、应变环烯、环丙烯、降冰片烯、氧化腈、β-甲硅烷基链烯基卤化物、β-甲硅烷链烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、哒嗪、烷氧基胺、芳基磺酸酯、芳基卤化物、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸或氨基取代的氨基酸，或其任意组合；具有光活化交联剂的氨基酸；自旋示踪的氨基酸；荧光氨基酸；具有新的功能基团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合的氨基酸；包含金属的氨基酸；放射性氨基酸；photocaged氨基酸；光异构化氨基酸；包含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或糖类修饰的氨基酸；包含酮的氨基酸；包含聚乙二醇的氨基酸；包含聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割或可光切割的氨基酸；具有长侧链的氨基酸；包含毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的丝氨酸等；包含碳连接的糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；包含α- 羟基的酸；包含氨基硫羰酸的氨基酸；α、α双取代的氨基酸；β-氨基酸；和环氨基酸。 
通常，可以选择或设计本文用于某些实施方案的非天然氨基酸来提供在二十种天然氨基酸中不可得的附加特征。例如，可选地设计或选择非天然氨基酸来修饰例如它们所掺入的蛋白质的生物学性质。例如，可选地通过在蛋白质中纳入非天然氨基酸来修饰以下性质：毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、对酶降解的抗性等)、便于纯化和处理、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其他分子反应(例如共价或非共价)的能力等。 
氨基酸类似物的其他实例可选地包括(但不限于)：酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤、肼、酰肼、羟基、链烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫羰酸、硼酸盐、硼酸(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟基胺、酮、酮缩醇、缩醛、应变环辛炔、应变环烯、环丙烯、降冰片烯、氧化腈、β-甲硅烷基链烯基卤化物、β-甲硅烷链烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、哒嗪、烷氧基胺、芳基磺酸酯、芳基卤化物、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸或氨基取代的氨基酸，或其任意组合；具有光活化交联剂的氨基酸；自旋示踪的氨基酸；荧光氨基酸；具有新的功能基团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合的氨基酸；包含金属的氨基酸；放射性氨基酸；photocaged氨基酸；光异构化氨基酸；包含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或糖类修饰的氨基酸；包含酮的氨基酸；包含聚乙二醇的氨基酸；包含聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割或可光切割的氨基酸；具有长侧链的氨基酸；包含毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的丝氨酸等；包含碳连接的糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；包含α-羟基的酸；包含氨基硫羰酸的氨基酸；α、α双取代的氨基酸；β- 氨基酸；及除脯氨酸外的环氨基酸。 
适合用于本发明的方法的非天然氨基酸还包括具有附着于氨基酸侧链的糖部分的那些。在实施方案中，具有糖部分的非天然氨基酸包括具有Man、GalNAc、Glc、Fuc或Gal部分的丝氨酸或苏氨酸氨基酸。包括糖部分的非天然氨基酸的实例包括但不限于：例如，三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸；β-O-GlcNAc-L-丝氨酸；三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸；α-GalNAc-L-苏氨酸；O-Man-L-丝氨酸；四-乙酰基-O-Man-L-丝氨酸；O-GalNAc-L-丝氨酸；三-乙酰基-O-GalNAc-L-丝氨酸；Glc-L-丝氨酸；四乙酰基-Glc-L-丝氨酸；fuc-L-丝氨酸；三-乙酰基-fuc-L-丝氨酸；O-Gal-L-丝氨酸；四-乙酰基-O-Gal-L-丝氨酸；β-O-GlcNAc-L-苏氨酸；三-乙酰基-β-GlcNAc-L-苏氨酸；O-Man-L-苏氨酸；四-乙酰基-O-Man-L-苏氨酸；O-GalNAc-L-苏氨酸；三-乙酰基-O-GalNAc-L-苏氨酸；Glc-L-苏氨酸；四乙酰基-Glc-L-苏氨酸；fuc-L-苏氨酸；三-乙酰基-fuc-L-苏氨酸；O-Gal-L-苏氨酸；四-乙酰基-O-Gal-L-丝氨酸；β-N-乙酰葡糖胺-O-丝氨酸；α-N-乙酰半乳糖胺-O-苏氨酸；荧光氨基酸，如包含萘基或丹酰或7-氨基香豆素或7-羟基香豆素侧链的那些；可光切割或可光异构化的氨基酸，如包含偶氮苯或硝基苄基Cys、Ser或Tyr侧链的那些；对-羧基-甲基-L-苯丙氨酸；高谷氨酰胺；2-氨基辛酸；对-叠氮基苯丙氨酸；对-苯甲酰基苯丙氨酸；对-乙酰基苯丙氨酸；间-乙酰基苯丙氨酸；2，4-二氨基丁酸(DAB)等。本发明包括以上的未保护和乙酰化的形式。(还见，例如，标题为″Remodeling and Glycoconjugation of Peptides″的WO 03/031464 A2；标题为″Saccharide Compositions，Methods and Apparatus for their synthesis″的美国专利号6,331,418；Tang和Tirrell，J.Am.Chem.Soc.(2001)123：11089-11090；及Tang等，Angew.Chem.Int.Ed.，(2001)40：8；所有文献在此以其整体引用作为参考)。 
上文提供的许多非天然氨基酸可从例如Sigma Aldrich(美国)商业购得。可选地按US 2004/138106 A1(在此引用作为参考)的实施例中所提供或用本领域技术人员已知的标准方法合成不能商业购得的那些。对于有机 合成技术，见例如，Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，A部分和B部分，1990，Plenum Press，New York)；及WO 02/085923；所有文献在此引用作为参考。 
例如，以WO 02/085923中概述的方法(见例如该出版物的图14)合成间位取代的苯丙氨酸。通常，将NBS(N-溴丁二酰亚胺)加入间位取代的甲苯化合物，产生间位取代的苄基溴化物，然后该苄基溴化物与丙二酸化合物反应，产生间位取代的苯丙氨酸。用于间位的典型取代基包括但不限于酮、甲氧基、烷基、乙酰基等。例如，通过使NBS与3-甲基苯乙酮的溶液反应来制备3-乙酰基-苯丙氨酸。更多详情见下文实施例。用类似的合成来产生3-甲氧基苯丙氨酸。在这种情况下，苄基溴化物间位上的R基是--OCH.sub.3.(见例如Matsoukas等，J.Med.Chem.，1995，38，4660-4669，以其整体引入作为参考)。 
在一些情况下，已知的关于合成酶(例如，用来氨酰化外部突变体tRNA的外部突变体tRNA合成酶)的活性部位的信息使非天然氨基酸的设计出现偏差。例如，提供三类谷氨酰胺类似物，包括在酰胺氮上取代的衍生物(1)、γ位上是甲基的衍生物(2)及N-Cy环衍生物(3)。基于大肠杆菌GlnRS(其中关键结合部位残基与酵母GlnRS同源)的x射线晶体结构，设计类似物来弥补谷氨酰胺侧链的10.ANG.shell内的残基的一系列侧链突变，例如，可以通过增加Gln的Cy位上的空间体积来弥补活性部位Phe233突变为小的疏水性氨基酸。 
例如，可选地用N-邻苯二甲酰-L-谷氨酸1，5-酐(WO 02/085923的图23中的化合物编号4)来合成酰胺氮上具有取代基的谷氨酰胺类似物。(见例如King&Kidd，J.Chem.Soc.，3315-3319，1949；Friedman&Chatterrji，J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752，1959；Craig等，J.Org.Chem.53，1167-1170，1988；和Azoulay等，Eur.J.Med.Chem.26，201-5，1991；所有文献在此以其整体引入作为参考)。通常通过先作为邻苯二甲酰亚胺保护 胺，然后在乙酸中回流来从谷氨酰胺制备酐。然后用大量胺打开酐，在酰胺上产生一系列取代基。用肼脱保护邻苯二甲酰基产生WO 2002/085923的图23中所示的自由氨基酸。 
γ位上的取代通常通过烷化谷氨酸来达到。(见例如Koskinen&Rapoport，J.Org.Chem.54，1859-1866，1989，其在此引入作为参考)。可选地通过先用9-溴-9-苯基芴(PhflBr)烷化氨基部分(见例如Christie&Rapoport，J.Org.Chem.1989，1859-1866，1985，其在此引入作为参考)，然后用O-叔-丁基-N，N′-二异丙基异脲酯化酸部分来制备例如WO02/085923的图24中的化合物编号5所示的受保护的氨基酸。KN(Si(CH.sub.3).sub.3).sub.2的加入区域选择性地在甲酯的α位脱质子，形成烯醇化物，然后可选地用一系列烷基碘烷化该烯醇化物。叔丁酯和Phf1基团的水解产生希望的γ-甲基谷氨酰胺类似物(WO 02/085923的图24中的化合物编号2，该专利在此引入作为参考)。 
可选地按之前所述以4个步骤从Boc-Asp-Ot-Bu制备WO 02/085923的图25中的化合物编号3所示的N-Cy环类似物。(见例如Barton等，Tetrahedron Lett.43，4297-4308，1987；和Subasinghe等，J.Med.Chem.354602-7，1992；每篇文献在此引入作为参考)。如图25中所示，产生N-t-Boc-吡咯烷酮、吡咯烷酮或恶唑烷酮的阴离子，然后加入化合物7，产生Michael加成产物。然后用TFA脱保护产生自由氨基酸。 
可以通过本领域已知的多种方法来合成三氟亮氨酸(Tfl)和六氟亮氨酸(Hfl)。例如，可以以分步的方式合成5′，5′，5′-三氟-DL-亮氨酸，首先用乙醇稀释市售三氟甲基巴豆酸，并在催化剂的存在下氢化。然后，可以回流混合物，并蒸馏酯。然后，可以通过回流和蒸馏来衍生α-肟基-5′，5′，5′-三氟异己酸，然后再结晶5′，5′，5′-三氟-DL-亮氨酸。同样，可以以多个步骤从六氟丙酮和溴丙酮酸乙酯制备(S)-5，5，5，5′，5′，5′-六氟亮氨酸，其包括通过发面酵母或通过利用oxazaborolidine催化剂的儿茶酚硼烷高度对映体选择性地还原α-酮酸酯中的羰基。(更多细节见例如Rennert，Anker，Biochem.1963，2，471；Zhang等，Helv.Chim.Acta 1998，81，174-181，R.，Prot Sci.7： 419-426(1998)；Hendrickson等，Annual Rev.Biochem.73：147-176(2004)；美国专利申请号20030108885和20030082575；以及共同未决的美国临时申请号60/571,810；所有文献在此以其整体引入作为参考)。本公开的新颖性的一点涉及已掺入一个或多个氟化非天然氨基酸的富含亮氨酸拉链结构域的分子的提高的热稳定性和化学稳定性。 
同样，可以通过已公开的方法来合成高炔丙基甘氨酸(HPG)和叠氮基高丙氨酸(AHA)。例如，按照Mangold等，Mutat.Res.，1989，216，27，在此以其整体引入作为参考。 
双特异性构建体的合成 
形成双特异性剂的一般方法 
在实施方案中，可以按照以下方法制备本发明的二价双特异性构建体，该方法包括： 
(i)提供宿主细胞，该宿主细胞包含载体，该载体具有编码抗-IL-6抗体或其衍生物的多核苷酸，该抗体或衍生物通过掺入至少一个非天然氨基酸来修饰； 
(ii)提供宿主细胞，该宿主细胞包含载体，该载体具有编码抗-IL-23抗体或其衍生物的多核苷酸，该抗体或衍生物通过掺入至少一个非天然氨基酸来修饰； 
(iii)在使得宿主细胞表达该修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物，和修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物的条件下培养该宿主细胞； 
(iv)分离该抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物； 
(v)使该抗-IL-6抗体或其衍生物与该抗-IL-23抗体或其衍生物反应，使得该抗-IL-6抗体或其衍生物通过各部分的非天然氨基酸之间的连接与该抗-IL-23抗体或其衍生物偶联。 
还可以通过本领域已知的方法来制备本发明的双特异性构建体。这些包括体细胞杂交、化学偶联和重组技术。 
体细胞杂交涉及两种杂交瘤的融合及由产生的四源杂交瘤(quadroma)分泌的双特异性剂的纯化。已描述了两种不同的方法：(1) 两个已建立的杂交瘤的融合产生四源杂交瘤(Milstein和Cuello，1983；Suresh等，1986)；及(2)一个已建立的杂交瘤与衍生自用第二抗原免疫的小鼠的淋巴细胞的融合产生三源杂交瘤(trioma)(Nolan和Kennedy，1990)。用于研发bsMAb的体细胞杂交涉及与用于制备杂交瘤的那些相似的方法。但是，两种不同重链和两种不同轻链在一个细胞内的产生和随机结合导致很大比例非功能性分子的组装。需要开发复杂的纯化技术来纯化具有所需特异性的双特异性剂，且这通常妨碍大规模制备用于临床用途。但是，本发明提供用体细胞杂交制备的上文公开的二价双特异性构建体。 
本领域已知的抗体的化学偶联最初在近40年前实现。通过化学偶联两种不同的多克隆抗体产生了第一种双特异性多克隆抗体(Nisonoff和Rivers，1961)。此化学操作涉及在它们的内部重链二硫键解离两种不同抗体，并通过化学缀合交联两半分子。为了制备bsMAb，使用了与ε-氨基或铰链区硫醇基反应的大量双功能试剂。这些交联剂可以分为同双功能试剂和异双功能试剂两类。同双功能试剂与通过还原内部重链二硫键产生的自由硫醇反应。5，5-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)或邻-亚苯基双马来酰亚胺(O-PDM)可以激活MAb的Fab’片段上的硫醇基。DTNB发挥作用来再生两个Fab’之间的二硫键，而O-PDM发挥作用来在两个Fab’之间形成硫醚键。通常，O-PDM的硫醚键可以比DTNB再生的二硫键更稳定。异双功能试剂可以在蛋白质上引入使得该蛋白质能够与第二蛋白质反应的反应基团。已用N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)与伯氨基反应来引入自由硫醇基。SPDP可以组合已暴露氨基的任意两种蛋白质，包括抗体和Fab’片段，不考虑种类或同种型。但是，此方法导致分子的随机交联，因此显示批次与批次的变异和不想要的作用，如蛋白质的变性和/或抗体活性的丧失。但是，本发明提供用化学偶联制备的上文公开的二价双特异性构建体。 
还可以用重组技术来制备双特异性抗体。与通过化学交联或两个杂交瘤克隆的融合制备的常规双特异性抗体相比，这类通过遗传工程衍生的双特异性抗体提供了几个优势，包括大小上更好的控制和双特异性剂的亲和 力。通过仅用可变结构域作为构件，重组抗体缺乏抗体的Fc区，因此不诱导Fc介导的免疫效应子功能。过去几年已研发了多种不同的重组双特异性抗体形式。在它们之中，串联单链Fv分子和双抗体及其多种衍生物是最广泛用于构建重组双特异性抗体的形式。在一个共同主题中，这些分子的构建从识别不同抗原的两种单链Fv(scFv)片段(通过肽接头连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区)开始。串联scFv分子(taFv)代表用附加的肽接头简单连接两个scFv分子的直接形式。存在于这些串联scFv分子中的两个scFv片段形成分开的折叠实体。因此，可以用多种接头来连接两个scFv片段，已报道了长度为至多63个残基的接头。虽然亲本scFv片段可以在细菌中以可溶形式正常表达，但是，常观察到串联scFv分子在细菌中形成不可溶聚集体。因此，重折叠流程或哺乳动物表达系统的使用常应用于产生可溶性串联scFv分子。因此，本发明提供用上文详述的重组技术制备的上文公开的二价双特异性构建体。 
在上述优选制备方法中，该非天然氨基酸在连接前包含氮化物、氰基、氧化腈、炔、烯、应变环辛炔、应变环烯、环丙烯、降冰片烯或芳基、烷基或乙烯基卤化物、酮、醛、酮缩醇、缩醛、肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有机锡、有机硅、β-甲硅烷基链烯基卤化物、β-甲硅烷链烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、哒嗪、芳基磺酸酯、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸基团。该非天然氨基酸可以是叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有内部烯(如反式-巴豆烯)的氨基酸、丝氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、或乙烯基甘氨酸、吡咯赖氨酸、N-σ-邻-叠氮基苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-2-叠氮基乙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸(BocLys)、N-σ-烯丙氧基羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰基-L-赖氨酸、N-σ-烟酰-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素酰-L-赖 氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-三甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹酰-L-赖氨酸、N-σ-邻，对-二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对-甲苯磺酰-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸。 
例如，在上述优选制备方法中，该非天然氨基酸在连接前包含氮化物、炔、烯、或芳基、烷基或乙烯基卤化物、酮、醛、肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有机锡、有机硅基团。该非天然氨基酸可以是叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有内部烯(如反式-巴豆烯)的氨基酸、丝氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸或乙烯基甘氨酸。 
在上述优选制备方法中，用于将第一部分与第二部分偶联的反应是[3+2]偶极环加成或Click反应、Heck反应、Sonogashira反应、Suzuki反应、Stille偶联、Hiyama/Denmark反应、烯烃复分解反应、Diels-alder反应、或羰基与肼、酰肼、烷氧基胺或羟基胺缩合。 
二价双特异性构建体和抗体的PEG化 
本领域已知的重组双特异性抗体的缺点之一是它们在体内的循环时间短。双抗体、单链双抗体和串联scFv分子具有50-60kDa的分子量，这可以导致这些实体通过外渗、蛋白酶解和肾排出从循环快速清除这些实体。这些实体的示例性起始半衰期(t1/2α)低于30分钟。已采取几种方法来改善重组抗体的药物动力学。一种方法是增加这些分子的大小。还可以通过改变连接可变结构域的接头的长度来产生分子量为100-115kDa的二聚体单链双抗体分子。其他方法依赖于双特异性剂与具有长半衰期的血清蛋白质的结合。这些包括双特异性抗体与人血清白蛋白(HSA)、HSA结合肽或衍生自天然具有长半衰期的激素的肽的融合。这类方法可以应用于本发明的二价双特异性构建体。但是，本发明还提供聚乙二醇聚合物(PEG)的用途，本文首次显示其在延长本发明的二价双特异性构建体的半衰期中 尤其有利。 
PEG具有希望在最终的双特异性产物中得到并解决scFv所特有的问题的几种化学性质。PEG化应改善蛋白质溶解性并提高scFv稳定性，从而减少scFv聚集和沉淀。此外，诸如PEG的长和柔性的接头增加了两个抗体片段的物理分隔，允许它们相互独立地重折叠。这解决了通过遗传融合连接的双特异性抗原结合结构域的重折叠中常出现的问题之一(即，两种组成抗体之间不受控和不希望的交联)。 
通常通过诸如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基的反应位点来将PEG聚合物共价连接至生物分子。但是，为了达到最佳稳定性，需要紧密控制附着于靶分子的聚合物的量。PEG聚合物与蛋白质中反应位点的缀合常产生PEG修饰的蛋白质的异质混合物，其可以导致亚适的稳定化和半衰期延长，以及PEG反应位点对蛋白质活性重要(例如，它们定位在受体结合部位中或附近)时聚合物修饰的蛋白质的生物活性可能的丧失。本发明通过将二价双特异性构建体的组成抗体改造为在具体位置包含非天然氨基酸，并使PEG与这些非天然氨基酸反应来提供此问题的解决方案。 
PEG接头的使用还由于可以使用的化学合成的通用性而比上文详述的那些更有利。PEG可以容易地功能化为与掺入scFv蛋白质中的任意非天然氨基酸互补的反应配偶体。PEG还可以功能化为具有多个缀合位点，其使得能够构建多价蛋白质杂化物。取决于希望的缀合化学，可以用同双功能或异双功能PEG进行PEG功能化。此外，可以使PEG的结构适应于线性或分支变异，其可以影响药物动力学和生物活性。 
下文进一步讨论这些PEG化二价双特异性构建体的制备。 
可以通过用接头缀合两个不同的scFv抗原结合结构域来构建双特异性scFv。此策略可以以两步法实现，其中每个scFv与双功能接头缀合。包含双特异性缀合物的两个scFv各在作为特异性缀合位点的位置上包含至少一个非天然氨基酸(例如Aha)。接头可以是同双功能或异双功能，且含有与包含在scFv中的非天然氨基酸(Aha)反应的互补官能团(例如炔)。然后以下反应流程可应用于产生双特异性scFv(流程1见下) 
流程1 
Figure BDA00003166002600601
用来将scFv与接头缀合的化学品与20种天然氨基酸正交。在scFv-PEG缀合物和双特异性剂的制备中，此处使用氮化物-炔铜介导环加成。在典型顺序中，使包含叠氮基高丙氨酸(Aha)的scFv与用炔功能化的过量同双功能PEG接头反应。有限过量的PEG下的主要产物是单价PEG化scFv，然后对其进行纯化。PEG接头的自由侧炔与包含Aha的第二scFv进行第二次铜介导的氮化物-炔环加成，产生双特异性剂。 
氮化物-炔铜介导环加成(Meldal和2008；Kolb等2001)以及烯-芳基卤化物钯介导Heck反应已广泛应用于聚合物、毒素或肽与靶蛋白质的位点特异性缀合。铜介导的环加成反应与全部天然氨基酸完全正交，使得此化学品不能用来修饰生物分子，除非可以引入包含非天然的氮化物或炔的部分。这样做时，该化学品仅出现在该氮化物或炔的位置上。氮化物和炔可以引入蛋白质作为天然氨基酸的类似物，提供用于生物缀合的具体位置。 
如其他地方所指出，可以可选地通过PEG化修饰抗-IL-6和抗-IL-23或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)来提高半衰期。可以通过类似的方法来达到抗-IL-6和抗-IL-23或其衍生物的PEG化。 
适宜地，用于本发明的双特异性构建体和抗体中的PEG基团和PEG接头具有2-200kDa、例如5-60kDa、例如10-40kDa、如约20或约40kDa 的分子量。PEG基团和接头可以是直链或支链。 
药物组合物 
根据另一方面，本发明提供包含本发明的二价双特异性构建体和可药用载体的药物组合物和试剂盒。在一些实施方案中，该药物组合物或试剂盒进一步包含另一成分，如成像试剂或治疗剂。在优选实施方案中，该药物组合物或试剂盒用于诊断或治疗方法。 
药物组合物可以是例如包含诸如氯化钠、糖、氨基酸、表面活性剂等的常规赋形剂的水性制剂，例如水溶液。 
药物组合物还可以是适合通过加入水或盐水来重建的冻干产品。 
治疗方法 
根据另一方面，本发明提供本发明的二价双特异性构建体在治疗中的用途。具体而言，本发明提供TH17、TH22和TH1介导的疾病以及这些TH细胞的组合介导的疾病的治疗。 
这类可以用本发明的二价双特异性构建体治疗的疾病的实例包括炎性和自身免疫性障碍，如多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、寻常性天疱疮、器官移植排斥、克隆病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮和糖尿病。 
TH17介导的疾病的其他实例包括肌萎缩性侧索硬化症或ALS(洛盖赫里格病)、强直性脊柱炎、Asperger综合症、背痛、巴雷特食管、双向精神障碍、心律失常、乳糜泻、慢性疲劳综合症(CFS/CFIDS/，E)、慢性莱姆病(疏螺旋体病)、克隆病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、痴呆、抑郁、癫痫、纤维肌痛(FM)、胃食管反流病(GERD)、桥本甲状腺炎、肠易激综合症(IBS)、间质性膀胱炎(IC)、炎性肠病、肠易激综合症、肾结石、洛夫格雷恩综合症、红斑狼疮、躁狂症、多化学品过敏(MCS)、偏头痛、Morgellon′s、多发性硬化、重症肌无力、神经病、强迫性障碍(OCD)、骨关节炎、惊恐发作、帕金森病、风湿性多发性肌痛、体位性心动过速综合症(POTS)、前列腺炎、银屑病、银屑病关节炎、雷诺综合症/现象、反应性关节炎(莱特尔综合症)、下肢不宁综合症、反射交感性 营养不良(RSD)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、全鼻窦炎、季节性情感障碍(SAD)、舍格伦综合症、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎和眩晕。其他疾病包括来自脓毒病或出血热的细胞因子风暴、胆汁性肝硬化、斯蒂尔病、COPD、Grave眼病、perionditis、贝赫切特病、哮喘、特应性皮炎、化脓性汗腺炎、巨细胞动脉炎和心脏纤维化。 
TH22介导的疾病的其他实例包括慢性炎性疾病，如湿疹、硬皮病、哮喘和COPD。 
因此，在实施方案中，本发明提供治疗TH17介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的二价双特异性构建体。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的二价双特异性构建体用于治疗TH17介导的疾病。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的二价双特异性构建体在制备用于治疗TH17介导的疾病的药物中的用途。 
在另一实施方案中，本发明提供治疗TH22细胞介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的二价双特异性构建体。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的二价双特异性构建体用于治疗TH22细胞介导的疾病。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的二价双特异性构建体在制备用于治疗TH22细胞介导的疾病的药物中的用途。 
在另一实施方案中，本发明提供治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的二价双特异性构建体。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的二价双特异性构建体用于治疗TH17和TH1二者介导的疾病。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的二价双特异性构建体在制备用于治疗TH17和TH1二者介导的疾病的药物中的用途。 
在另一实施方案中，本发明提供治疗TH17介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合用于治疗TH17介导的疾病。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合在制备用于治疗TH17介导的疾病的药物中的用途。 
因此，在实施方案中，本发明提供治疗TH22细胞介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合用于治疗TH22细胞介导的疾病。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合在制备用于治疗TH22细胞介导的疾病的药物中的用途。 
因此，在实施方案中，本发明提供治疗TH17和TH1二者介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合用于治疗TH17和TH1二者介导的疾病。 
在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗-IL-6和抗-IL-23抗体或其衍生物的组合在制备用于治疗TH17和TH1二者介导的疾病的药物中的用途。 
本发明还提供治疗其病因具有TH17和TH22成分二者的疾病的方法。此外，本发明的待治疗的疾病的病因可以涉及全部三种TH17、TH22和TH1细胞。 
在上文所列的每个实施方案中，抗-IL-23抗体或其衍生物可以是抗-IL-23/IL-12抗体。 
剂量方案 
在本发明的另一方面，与本领域目前可得的疗法相比，可以按有利地低的剂量对患者施用本发明的用于治疗的二价双特异性构建体、抗体和抗体组合，同时仍达到相同的疗效。通过本文公开的抗体的更高的活性来便 于更低的剂量，且可能降低副作用的发生率。 
备选地，如果希望更高的活性，则可以按与本领域目前可得的疗法相比等同或更高的剂量对患者施用本发明的用于治疗的二价双特异性构建体、抗体和抗体组合。这类更高的剂量可以便于降低对患者施用二价双特异性构建体、抗体和抗体组合的频率。 
在实施方案中，本发明的二价双特异性构建体、抗体和抗体组合可以每月、每两月、每周、每两周、每天、每两天施用。 
用于测定IL-6、IL-23和IL-23/IL-12抗体亲和力和生物学活性的测定 
抗体亲和力的测定 
可以用本领域技术人员公知的方法测定抗体亲和力。为了测定抗体是否具有希望的亲和力，使得它们可能适合包含在本发明的二价双特异性抗体中的目的，提供以下详述的测定方法，但应理解，对于待进行的相同测定，将允许该方法的小变动(例如，在不同但相似的仪器或不同品牌的常用试剂的使用中)。 
平衡解离常数可以通过使用SensiQ Pioneer(ICx Nomadics，Stillwater，OK)和适合于胺偶联的羧化COOH1传感器(Ibid)的表面等离振子共振来测定。 
用胺偶联试剂(Sigma Aldrich(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，56480)、N-(3-二甲基氨基丙基)-B’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，E7750))；乙醇胺(398136)，St.Louis，MO)或用Biacore胺偶联试剂盒(BR-1000-50，GE Healthcare，Waukesha，WI)将G蛋白(6510-10，Biovision，Mountain View，CA)偶联至COOH1传感器。 
简言之，以2-10分钟之间的接触时间用2mM EDC和.5mM NHS活化羧化表面。按20-400ug/mL之间的不同浓度将G蛋白稀释入10mM乙酸缓冲液pH4.3(乙酸钠，BP334-1；冰醋酸，A490-212；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中，并按5-10μL/分钟的速率注射在活化的传感器上5和10分钟之间的不同接触时间。固定至COOH1传感芯片的G蛋白的量在400-2000反应单位(RU)的范围内。应以25μL/分钟的流速用 100μL乙醇胺覆盖剩余活化位点。 
可以通过将mAb与G蛋白包被的芯片结合，然后将各分析物(IL-6或IL-23)与其各自的mAb结合来测定兔人嵌合mAb的平衡常数。为了最小化传质效应，应调节各分析物的mAb的表面密度，使得分析物结合接近饱和，它的对应的RU落在200和300之间。将1至100nM的3x-FLAG-IL-6(见实施例1)、IL-6(CYT-213，Prospec-Tany Technogene，Rehovot，以色列)或人嵌合IL-23(34-8239，eBiosciences，San Diego，CA)稀释液注射在芯片表面上，并测量结合(Ka)和解离(Kd)速率常数。对于每个结合和解离循环，应用15uL20mM NaOH(5671-02，Mallinckrodt Baker，Philliphsburg，NJ)再生芯片表面。测定温度应维持在25℃，分析物流速为50μL/分钟，包含2分钟结合期和10-30分钟解离期。可以用上述形式连同准一级(pseudo-first-order)1∶1相互作用模型软件(Qdat，ICx Nomadics，Stillwater，OK)来测定结合速率/解离速率(ka/kd)和解离常数(KD)。 
可以按之前所述测定scFv的平衡常数；条件是应修改流程，使得表位标记的IL-6捕获在芯片表面上，并监测抗-IL-6scFv从IL-6的解离。简言之，使抗-FLAG
Figure BDA00003166002600651
M2抗体(200472，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)结合于G蛋白，然后通过抗-FLAG抗体来捕获3xFLAG-IL-6。应在1和100nM之间的一系列浓度测定抗-IL-6scFv。 
双特异性scFv的SPR 
按之前针对测量抗-IL-6部分所述进行双特异性scFv的SPR；条件是修改流程来同时测定在双特异性剂的另一端附着的抗-IL-23scFv(31A12)的结合动力学。简言之，通过首先以恒定密度(～240RU)按所述用IL-6固定双特异性剂来进行双特异性剂对IL-23的结合。用上文详述的相同参数以3至25nM的浓度测定重组人二聚体IL-23(34-8239，eBiosciences，San Diego，CA)的结合和解离。 
IL-6活性的测定 
可以用本领域技术人员公知的方法测定抗体及其衍生物调节IL-6活 性的能力。为了测定抗体是否具有希望的调节IL-6活性的能力，使得它们可能适合包含在本发明的二价双特异性抗体中的目的，提供以下详述的测定方法，但应理解，对于待进行的相同测定，将允许该方法的小变动(例如，在不同但相似的仪器或不同品牌的常用试剂的使用中)。 
可以用ELISA来评价IL-6结合。将100μl含0.25μg/ml重组IL-6(见实施例1)的PBS加入ELISA平板。应在37℃孵育平板1小时或在4℃孵育过夜。应向每个孔中加入100μl/孔的含10％山羊血清(Cat#16210-072，Invitrogen，美国)的PBS来封闭。然后应在室温孵育平板1小时。然后应用去离子水漂洗平板5次。向每个孔中加入50μl PBS/10％山羊血清。然后按50μl/孔加入测试样品。然后应在室温孵育平板1小时。然后应用去离子水漂洗平板5次。向每个孔中加入100μl1∶5000稀释在PBS/10％山羊血清中的过氧化物酶缀合的山羊抗-兔IgG(Cat.#111-035-008，Jackson Immuno Research)。然后应在室温孵育平板1小时，然后用去离子水洗涤5次。按100μl/孔加入TMB底物(Thermo Scientific，Rockford，IL.，美国)。然后应用100μl 1N H2SO4(JT Baker，Phillipsburg，NJ，美国)终止反应。然后可以用Molecular Devices M2酶标仪在450nm测量吸光度。 
可以用生物测定来评价IL-6抑制(图3)，该生物测定使用依赖于IL-6的鼠B细胞杂交瘤细胞系(B9细胞系；Aarden等，1987)。应将待测试中和活性的样品稀释在96孔组织培养板中的100μl测定培养基(RPMI 1640w/L-谷氨酰胺，10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠，50μM 2-巯基乙醇)中。然后加入50μl含IL-6(Cat.#CYT-274 Prospec-Tany Technogene)的测定培养基，并在室温孵育30分钟。然后从细胞培养瓶(flask)回收B9细胞，并在180Xg离心7分钟，沉淀重悬在不含IL-6的培养基(RPMI 1640w/L-谷氨酰胺，10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠，50μM 2-巯基乙醇)中。应离心和重悬细胞三次来去除IL-6。通过台盼蓝排除测定生存力后，应将细胞调节至1X105细胞/ml。应向各孔连同包含无IL-6培养基的对照孔中加入50μl体积的B9细胞(对应于5X103个细胞)。 
然后应在37℃、5％CO2孵育平板48小时。随后，应向每个孔中加 入20μlAlamar Blue(Cat#DAL1100，Invitrogen，美国)，并再孵育平板18小时。然后可以在Molecular Devices(Sunnyvale，CA，美国)M2酶标仪上在570和600nm读板。 
IL-23活性的测定 
可以用ELISA测定来评价IL-23结合(Aggarwal等，2003)。用直接或间接结合IL-23的方法包被ELISA平板。 
对于间接结合法，应向平板中加入100ml/孔含0.01-0.02ug/ml抗-His抗体(Cat#A00613，GenScript Corp.，New Jersey，美国)的PBS。然后应在37℃孵育平板1小时或在4℃孵育过夜。应向各孔中加入100ml/孔含10％山羊血清(Cat#16210-072，Invitrogen，美国)的PBS来封闭非特异性结合，然后应用去离子水漂洗平板5次。应加入100ml/孔含0.5mg/ml的IL-23 p40-p19-His(SEQ ID 4)的PBS/10％山羊血清，并在室温孵育平板1小时。 
对于直接结合法，应向ELISA平板中加入100ml含0.5mg/ml的IL-23p40-p19-His(SEQ ID NO.4)的PBS。然后应在37℃孵育平板1小时或在4℃孵育过夜。应向各孔中加入100ml/孔含10％山羊血清(Cat#16210-072，Invitrogen，美国)的PBS来封闭非特异性结合。然后应在室温孵育平板1小时。 
IL-23结合后，应用去离子水漂洗平板5次。应向每个孔中加入50mlPBS/10％山羊血清。然后应按50ml/孔加入测试样品。然后应在室温孵育平板1小时，并用去离子水漂洗5次。然后应向每个孔中加入100ml1∶5000稀释在PBS/10％山羊血清中的过氧化物酶缀合的山羊抗-兔IgG(Cat.#111-035-008，Jackson Immuno Research)。然后应在室温孵育平板1小时，然后用去离子水洗涤5次。按100ml/孔加入TMB底物(Thermo Scientific，Rockford，IL.，美国)。然后应用100ml 1N H2SO4(JT Baker，Phillipsburg，NJ，美国)终止反应。然后可以用Molecular Devices M2酶标仪在450nm测量吸光度。 
可以用生物测定来检测抗体介导的IL-23与IL-23受体的结合及产生 的生物活性的抑制，该生物测定基于IL-23诱导小鼠脾细胞表达IL-17的检测。 
应将5x105C57Bl/6脾细胞在200ml包含异二聚体IL-23(eBioscience cat.#14-8239或Humanzyme，Chicago，美国cat.#HZ-1049)稀释液中培养于96孔板的孔中，并在37℃孵育平板2-3天。所用培养基应是RPMI1640、10％FBS、50uM 2-巯基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸、庆大霉素和10ng/ml人IL-2(Cat#CYT-209，Prospec-Tany Technogene)。3天后，应按下文所述通过ELISA测定培养物上清的IL-17A。 
可以用ELISA测定来检测小鼠IL-17。用含1mg/ml抗-mIL-17A(eBioscience#14-7178)的100ml PBS包被平板，并在4℃孵育过夜或在37℃孵育1小时。应在去离子水中洗涤平板，并用100ml PBS/10％山羊血清封闭1小时。洗涤平板后，应向平板中加入50mlPBS/10％山羊血清和50ml培养物上清，并孵育1小时。然后应洗涤平板，加入100ml/孔含0.5mg/ml抗-mIL-17A-生物素(eBioscience#13-7179)的PBS/10％山羊血清，并在室温孵育平板1小时。然后应洗涤平板，并与100ml/孔的1∶1000稀释在PBS/10％山羊血清中的链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Labs)反应。应再次洗涤平板，并通过加入100ml/孔TMB底物(Thermo Scientific，IL，美国)来检测信号。用100ml/孔1N H2SO4终止反应后，可以在450nM读取光密度。 
IL-12(p40)活性的测定 
此外，由于IL-23的p40亚基也形成涉及TH1信号传导途径的IL-12的部分，本文公开利用它们调节IFN-γ(TH1细胞活性的产物)水平的能力来测量它们对IL-12的中和能力的测定。本领域技术人员将意识到适于测定抗体的中和作用及其对IFN-γ产生的影响的测定法，但是，提供以下测定作为适宜的测定的实例。 
可以用IL-12反应细胞系NK-92(CRL-2407，ATCC，Manassas，Virginia，美国)测定抗体的p40中和能力。应将50ml来自B细胞克隆平板的培养物上清或50ml来自抗体转染的上清转移至96孔组织培养板。应 向每个孔中加入50ml 4ng/ml的人IL-12(Cat.#Cyt-362，Prospec-Tany Technogene，Rehovot，以色列)。然后应在室温孵育平板30-60分钟，然后应向每个孔中加入100ml中的5x104NK-92细胞。然后应在37℃孵育培养物3天，并针对人干扰素-γ的产生测定它们的上清。测定培养基应是RPMI 1640、10％FBS、NEAA、丙酮酸、50mM 2-巯基乙醇、庆大霉素和10ng/ml人IL-2(Cat#Z00368，GeneScript Corporation，Piscataway，NJ，美国)。 
可以用ELISA测定来检测人干扰素-γ。用含1mg/ml抗-人干扰素-g(Cat.#Mab 1-D1K，Mabtech，Cincinnati，OH，美国)的100ml PBS包被平板，4℃过夜或在37℃1小时。然后应在去离子水中洗涤平板，并用100μl PBS/10％山羊血清封闭1小时。洗涤平板后，应向平板中加入50mlPBS/10％山羊血清和50ml培养物上清，并孵育1小时。然后应洗涤平板，加入100ml/孔含0.5mg/ml抗-人干扰素-γ-生物素(Cat#Mab7b6-1-biotin，Mabtech)的PBS/10％山羊血清，然后在室温孵育平板1小时。然后应洗涤平板，并与100ml/孔的1∶1000稀释在PBS/10％山羊血清中的链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Labs)反应。然后应再次洗涤平板，并通过加入100ml/孔TMB底物(Thermo Scientific，IL，美国)来检测信号。用100ml/孔1N H2SO4终止反应后，可以在450nM读取光密度。 
对灵长类白细胞介素(IL-6、IL-23和IL-12)的反应性 
针对灵长类白细胞介素的测定与用于测量对人测定的活性的那些相同，但用灵长类形式的细胞因子进行测定。 
用于人治疗的任意细胞因子拮抗剂的成功研发将需要最初的毒理学测试。在非人物种中最有效地显示毒理学。为了便于最初的毒理学研究，可以针对它们中和来自考虑用于研究的物种的IL-6的能力筛选本发明的抗体。 
定义 
除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义： 
“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四 聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包含主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分为K和X轻链。重链分类为a或E，并分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般见Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.编辑，第2版Raven Press，N.Y.(1989))(为了所有目的以其整体引入作为参考)。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合部位，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合部位。 
免疫球蛋白链显示通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的构架区(FR)的相同的一般结构。来自每对的两条链的CDR通过构架区排列，使得能够与特异性表位结合。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))；或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等Nature 342：878-883(1989)的定义将氨基酸分配至各结构域。 
“抗体”指完整的免疫球蛋白，或指其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶切割或化学切割来产生抗原结合部分。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段，单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体及包含足以赋予多肽特异性抗原结合的至少部分免疫球蛋白的多肽。Fab片段是由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；F(ab′)2片段是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989)由VH结构域组成。单链抗体(scFv)是这样的抗体，其中VL和VH区通过使它们成为单蛋白质 链的合成接头配对形成单价分子(Bird等，Science 242：423-426，1988和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国85：5879-5883，1988)。 
抗体可以具有一个或多个结合部位。如果存在一个以上结合部位，则结合部位可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合部位，单链抗体或Fab片段具有一个结合部位，而“双特异性”抗体具有两个不同的结合部位。可以通过包括杂交瘤融合或Fab′片段连接的多种方法来产生双特异性抗体。见例如Songsivilai&Lachmann Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等J.Immunol.148：1547-1553(1992)。 
“分离的抗体”是这样的抗体，其：(1)不与在其天然状态下伴随它的天然结合成分(包括其他天然结合的抗体)结合；(2)游离于来自相同物种的其他蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)不存在于自然界中。分离的抗体的实例包括已用IL-6亲和纯化的抗-IL-6抗体、已通过杂交瘤或其他细胞系体外合成的抗-IL-6抗体及衍生自转基因小鼠的人抗-IL-6抗体。 
术语“人抗体”包括具有一个或多个衍生自人免疫球蛋白序列的可变区和/或恒定区的所有抗体。这些抗体可以以多种方式制备，作为实例，下文描述两种方式。 
人源化抗体是衍生自非人物种的抗体，其中突变了重链和轻链的构架和恒定结构域中的某些残基来避免或废除在人类中的免疫反应。 
备选地，可以通过将来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合来产生人源化抗体。如何制备人源化抗体的实例可以见于美国专利号6,054、297,5、886,152和5,877,293中。 
术语“嵌合抗体”指包含来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。 
术语“Koff”指抗体从抗体/抗原复合物解离的离去速率常数。 
术语“Kd”指具体的抗体-抗原相互作用的解离常数。 
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任意 蛋白质决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的具有化学活性的表面结群组成，且通常具有特异的三维结构特征，以及特异的电荷特征。解离常数优选低于10nM和最优选0nM时，称抗体特异性结合抗原。 
本领域普通技术人员可以按照本说明书的教导容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。 
片段或类似物的优选的氨基酸和羧基端存在于功能结构域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库比较来鉴定结构和功能结构域。 
“IL-12”是由通过二硫键连接的p35和p40两个亚基组成的异二聚体。抗原呈递细胞(主要为髓系)表达IL-12，其通过与表达在T细胞或天然杀伤细胞表面的受体复合物结合来参与细胞介导的免疫。认为IL-12的p40亚基结合IL-12受体β1(IL-12Rβ1)受体，p35亚基结合第二受体链(IL-12Rβ2)，产生胞内信号发放。 
“IL-23”是由与p19蛋白质共价连接的IL-12的相同的p40蛋白质亚基组成的异二聚体。IL-23结合与IL-12R相关的受体，该受体共享IL-12Rβ1链，且还具有独特的IL-23R链。 
“IL-6”是在包括血细胞生成、炎症和肿瘤发生的免疫调节中具有多种生物学活性的多效细胞因子。IL-6激活由IL-6受体(IL-6R)和信号转导受体亚基gp130组成的受体复合物。IL-6R以跨膜形式和可溶形式两种形式存在。IL-6结合这两种形式，然后其可以与gp130相互作用来触发下游信号转导和基因表达。 
“TH1细胞”是涉及哺乳动物免疫反应的T调节细胞(也称为T辅助细胞)。它们的特征在于产生IFN-γ。 
“TH17细胞”是涉及哺乳动物免疫反应的T调节细胞(也称为T辅助细胞)。它们的特征在于产生IL-17。 
“TH17介导的疾病”是TH17细胞在疾病的病因中发挥作用的疾病。 
“TH22细胞”是涉及哺乳动物免疫反应的T调节细胞(也称为T辅 助细胞)。它们的特征在于产生IL-22。 
“TH22介导的疾病”是TH22细胞在疾病的病因中发挥作用的疾病。 
优选地，用计算机化比较方法来鉴定存在于其他已知结构和/或功能的蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠为已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等Science 253：164(1991)。 
优选的氨基酸取代是那些，其：(1)降低对蛋白酶解的敏感性；(2)降低对氧化的敏感性；(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力；(4)改变结合亲和力；和(4)赋予或改变这类类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包括具有不同于天然存在的肽序列的序列的多种突变蛋白质。例如，可以在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的一个或多个结构域之外的多肽部分中)产生单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代应基本上不改变亲本多肽的结构特征(例如，取代氨基酸应不倾向于破坏存在于亲本序列中的螺旋，或破坏表征该亲本多肽的其他类型的二级结构)。本领域已知的多肽二级和四级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；及Thornton等Nature 354：105(1991)中；每篇文献在此引入作为参考。 
如本文所使用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其在此引入作为参考。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸(如a-，a-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸)也可以是适合用于本发明的多肽的成分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、-羧基谷氨酸、s-N，N，N-三甲基赖氨酸、s-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、s-N-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中， 按照标准用法和惯例，左手方向是氨基端方向，右手方向是羧基端方向。 
本文提到的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，该核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。 
本文所用的术语“分离的多核苷酸”将意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合，由于它的来源，“分离的多核苷酸”：(1)不与该“分离的多核苷酸”见于自然界中的多核苷酸的全部或部分结合；(2)与在自然界中不连接的多核苷酸有效连接；或(3)不作为更大序列的部分存在于自然界中。 
本文提到的术语“寡核苷酸”包含通过天然存在和非天然存在的寡核苷酸连接连接在一起的天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸。寡核苷酸是一般包含200碱基或更少的长度的多核苷酸亚组。优选地，寡核苷酸长度为10至60个碱基，最优选长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸通常是单链，例如对于探针；但寡核苷酸可以是双链，例如用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。 
本文提到的术语“天然存在的核苷酸”包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提到的术语“修饰的核苷酸”包含具有修饰或取代的糖基等的核苷酸。本文提到的术语“寡核苷酸连接”包含诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、phosphoroamidate等的寡核苷酸连接。见例如LaPlanche等Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，87-108页(F.Eckstein编辑，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec等，美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)；其公开内容在此引入作为参考。根据需要，寡核苷酸可以包含用于检测的标记。 
除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手端是5′端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录物5′至3′添加的方向称为转录方向；DNA链上具有与RNA相同的序列且位于RNA转录物5′端的5′的序列区域称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA相同的序列且位于RNA转录物3′端的3′的序列区域称为“下游序列”。 
“有效连接的”序列包含与目的基因相邻的表达控制序列和反式或远距离作用来控制目的基因的表达控制序列。本文所用的术语“表达控制序列”指实现它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包含适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；及(如果希望)增强蛋白质分泌的序列。这类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，这类控制序列一般包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这类控制序列一般包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包含其存在为表达和加工所必需的所有成分，且还可以包含其存在有利的附加成分，例如，前导序列和融合配偶体序列。 
本文所用的术语“载体”旨在指能够转运与它连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指其他DNA区段可以连接入其中的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其他DNA区段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制。 
此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明旨在包 含这类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其执行等同的功能。 
本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指已将重组表达载体引入其中的细胞。应理解，这类术语旨在不仅指具体的主题细胞，还指这种细胞的后代。由于某些修饰可以因突变或环境影响而存在于后代中，这种后代事实上可以与亲本细胞不同，但仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围之内。 
本文提到的术语“选择性杂交”意指可检测且特异地结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在最小化与非特异性核酸的明显量的可检测的结合的杂交和洗涤条件下选择性地与核酸链杂交。可以用“高严格性”或“高度严格”条件来达到本领域已知和本文所讨论的选择性杂交条件。“高严格性”或“高度严格”条件的实例是将多核苷酸与另一多核苷酸孵育的方法，其中可以将一种多核苷酸在42℃的杂交温度下在6X SSPE或SSC、50％甲酰胺、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100pg/ml变性片段化鲑鱼精DNA的杂交缓冲液中附着固体表面(如膜)12-16小时，然后用1X SSC、0.5％SDS的洗涤缓冲液在55℃洗涤两次。还见Sambrook等，上文，9.50-9.55页。 
如果它们的序列之间存在部分或完全的同一性，则两个氨基酸序列同源。例如，85％同源性意指在为了最大匹配比对两个序列时85％的氨基酸相同。最大匹配中允许缺口(在所匹配的两个序列的任一个中)；优选缺口长度为5或更少，更优选2或更少。备选地和优选地，以突变数据矩阵和6或更大的缺口罚分使用ALIGN程序，如果它们具有超过5(按标准差单位)的比对得分，则两个蛋白质序列(或从它们衍生的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)同源，如此术语在本文中所使用。见Dayhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequence and Structure，101-110页中(卷5，National Biomedical Research Foundation(1972))及此卷的增刊2，1-10页。如果在用ALIGN程序最佳比对时它们的氨基酸大于或等于50％同一性，则更优选两个序列或其部分同源。 
本文用术语“对应于”来指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同一，或多肽序列与参考多肽序列同一。相反，本文用术语“与...互补”来指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同一。举例说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”，与参考序列“GTATA”互补。 
用以下术语来描述两个或多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”和“实质同一性”。“参考序列”是用作进行序列比较的基础的限定序列；参考序列可以是更大序列的亚组，例如，作为序列表中给出的全长cDNA或基因序列的区段，或可以包含完整的cDNA或基因序列。通常，参考序列的长度为至少18个核苷酸或6个氨基酸，长度常为24个核苷酸或8个氨基酸，长度常为至少48个核苷酸或16个氨基酸。由于两个多核苷酸或氨基酸序列可以各(1)包含在两个分子之间相似的序列(即，完整多核苷酸或氨基酸序列的部分)，且(2)可以进一步包含在两个多核苷酸或氨基酸序列之间趋异的序列，通常通过在“比较窗”上比较两个分子的序列来进行两个(或多个)分子间的序列比较，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。本文所用的“比较窗”指至少18个相邻核苷酸位置或6个氨基酸的概念性区段，其中可以将多核苷酸序列或氨基酸序列与至少18个相邻核苷酸或6个氨基酸的参考序列相比较，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的20％或更少多核苷酸序列部分可以包含添加、缺失、取代等(即缺口)。可以通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package 7.0版(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；Geneworks；或MacVector软件包)或通过检查来进行比对比较窗的最佳序列比对，并选择通过多种方法产生的最佳比对(即 在比较窗上产生最高的百分比同源性)。 
术语“序列同一性”意指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗上同一(即，以核苷酸与核苷酸或残基与残基为基础)。这样计算术语“百分比序列同一性”，在比较窗上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中存在相同核苷酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或残基的位置数来产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100来产生百分比序列同一性。本文所用的术语“实质同一性”指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中该多核苷酸或氨基酸包含这样的序列，在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗上、通常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的比较窗上与参考序列相比，该序列具有至少90％至95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性、更通常至少99％序列同一性，其中通过在比较窗上将参考序列与可以包含参考序列的总计20％或更少的缺失或添加的序列相比较来计算百分比序列同一性。参考序列可以是更大序列的亚组。 
应用于多肽的术语“实质同一性”意指两个多肽序列在最佳比对(如通过使用默认缺口权重的GAP或BESTFIT)时具有至少80％序列同一性、优选至少90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性、甚至更优选至少98％序列同一性和最优选至少99％序列同一性。 
优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。 
如本文所讨论，考虑本发明涵盖抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列 中的小变异，只要该氨基酸序列中的变异维持至少90％、更优选95％和最优选99％序列同一性。具体而言，考虑保守氨基酸取代。保守取代是发生在在其侧链中相关的氨基酸家族内的那些。遗传编码的氨基酸一般分为以下家族：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂肪族羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳香族家族。例如，可合理预期，异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、丝氨酸取代苏氨酸的分离的取代，或结构上相关的氨基酸取代氨基酸的类似取代将对产生的分子的结合或特性不具有主要作用，尤其是如果该取代不涉及构架部位内的氨基酸。可以通过测定多肽衍生物的比活性来容易地确定氨基酸改变是否产生功能肽。 
本文所用的术语“标记”或“标记的”指在抗体中掺入另一分子。在实施方案中，该标记是可检测标志，例如掺入放射性标记的氨基酸，或附着于具有可以通过标志的抗生物素蛋白(例如，包含可以通过光学或比色方法来检测的荧光标志或酶活性的链霉抗生物素蛋白)来检测的生物素酰部分的多肽。在另一实施方案中，该标记或标志可以是治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法为本领域已知，且可以使用。 
标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(FITC、罗丹明、lanthanide phosphors)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标志、生物素酰基、预先确定的由第二报道分子识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合结构域、附加表位)、磁性物质(如钆螯合物)、毒素(如百日咳毒素、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、 丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素二酮、二羟蒽二酮、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物)。在一些实施方案中，通过多种长度的间隔臂附着标记来减少潜在的空间位阻。 
术语“患者”包括人和兽受试者。 
在本说明书和权利要求中，术语“包含”将理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任意其他整数或整数组。 
实施例
从来自超免疫兔克隆的抗原特异性B细胞产生抗原结合结构域。通过抗原淘洗从兔血选择抗原特异性B细胞，并在有利于扩大激活的B细胞的培养条件下克隆。 
实施例1：IL6和IL23表达克隆的构建及融合蛋白质的纯化 
将人IL-6(DQ891463；ABM82389.1，SEQ ID NO.343和344)表达为3xFLAG-IL6-Avi融合。通过两步聚合酶链反应(PCR)扩增产生表达构建体。将产物插入质粒p3xFLAG-CMV-23(Sigma)，位于CMV启动子的下游，并与前胰蛋白酶原前导序列和三重FLAG标记符合读框。表达的IL-6(SEQ ID NO.1)包含氨基端三重FLAG标记(氨基酸序列dhdgdykdhdidykdddd；SEQ ID NO.345)和羧基端Avi标记(glndifeaqkiewhe；SEQ IS NO.346)(ALLO66-MM4-80)。通过PCR扩增IL6编码区，并插入p3xFLAG-CMV-23来表达3xFLAG-IL6和3xFLAG-IL6-myc融合。(SEQ ID NO.2) 
通过重叠寡聚物和PCR(DNA2.0)来产生猕猴IL-6(mmIL-6；NM_001042733.1；NP_001036198；SEQ ID NO.346和SEQ ID NO.347)的编码区。合成的序列编码含有氨基端信号序列(mnsfstsafgpvafslglllvlpaafpap；SEQ IS NO.349)和羧基端FLAG标记的mmIL-6。将此构建体在CMV启动子(ALLO66-MM4-143)的下游插入哺乳动物表达载体pCEP4(Invitrogen)。(SEQ ID NO.3) 
人IL-23细胞因子是p19(IL23A；检索号NT_029419)和p40(IL12B；NT 023133)蛋白质的功能性异二聚体。将IL-23二聚体表达为p40:p19融合，单个蛋白质由编码氨基酸序列VPGVGVPGVG(SEQ ID NO.352)的弹性蛋白接头(检索号NM_001081755；SEQ ID NO.351)gttcctggagtaggggtacctggggtgggc分开。用两步PCR扩增策略来产生p40:p19遗传融合，同时在每个结构域上引入6xHIS。将得到的编码p40:p19-6xHIS(SEQ ID NO.4)和p40-6xHIS:p19的构建体引入哺乳动物表达质粒pCEP4(Invitrogen)。 
将灵长类IL23异二聚体表达为在两种蛋白质之间具有弹性蛋白接头且包含3’6xHIS标记的p40(NP_001038190；NM_001044725):p19(BV209310)融合。通过重叠寡聚物和PCR来合成构建体，并克隆入p3xFLAG-CMV-13质粒，位于CMV启动子的下游，且与前胰蛋白酶原信号序列(ALLO87-MM-5-74)(SEQ ID NO.5)符合读框。 
靶蛋白质的哺乳动物表达和纯化： 
在HEK293或HEK293c18细胞中进行哺乳动物细胞因子的表达。用3μl/μg DNA的lipofectamine2000或293fectin(Invitrogen)在按约200,000细胞/cm2的密度铺平板的细胞上进行转染，每一百万个细胞使用2-2.5μgDNA。在含10％胎牛血清的DMEM中37℃孵育细胞3-4天，并收集生长培养基进行靶蛋白质的纯化。对于6xHIS标记蛋白质的纯化，向培养基中加入1/10体积的10x结合缓冲液(500mM磷酸盐缓冲液pH7.5、3M NaCl、200mM咪唑、1％Tween-20)，并在4℃对PBS过夜透析。向提取物中加入Ni-NTA小球，4℃颠倒混合2-3小时。离心收集小球，并在Ni-NTA洗涤缓冲液(50mM磷酸盐、300mM NaCl、20mM咪唑、0.1％Tween)中洗涤。用洗脱缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液pH7.5、300mM NaCl、500mM咪唑)洗脱与Ni-NTA小球结合的蛋白质。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色鉴定含有靶蛋白质的级分，并通过光密度测定法定量。组合峰级分并对PBS透析，直接用于体外测定或SPR分析。 
用M2缀合的小球(Invitrogen)从表达培养基纯化FLAG标记的蛋 白质。简言之，直接将M2小球加入表达培养基中，并在4℃孵育4-16小时。在FLAG洗涤缓冲液(20mM TrispH7.4、150mM NaCl、0.1％Tween-20、1mM乙二胺四乙酸)中洗涤小球，并通过用0.1M甘氨酸(pH2.5)或用3x FLAG肽洗涤来收集结合的蛋白质。然后立即用1/20体积的1M Tris碱中和酸洗脱液。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色鉴定峰级分并混合。将这些对PBS透析，并直接用于体外测定或SPR分析。 
实施例2：抗体亲和力的测定 
通过使用SensiQ Pioneer(ICx Nomadics，Stillwater，OK)和适合于胺偶联的羧化COOH1传感器(Ibid)的表面等离振子共振来测定平衡解离常数。用胺偶联试剂(Sigma Aldrich(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，56480)、N-(3-二甲基氨基丙基)-B’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，E7750))；乙醇胺(398136)，St.Louis，MO)或用Biacore胺偶联试剂盒(BR-1000-50，GE Healthcare，Waukesha，WI)将G蛋白(6510-10，Biovision，Mountain View，CA)偶联至COOH1传感器。 
简言之，以2-10分钟之间的接触时间用2mM EDC和.5mM NHS活化羧化表面。按20-400ug/mL之间的不同浓度将G蛋白稀释入10mM乙酸缓冲液pH 4.3(乙酸钠，BP334-1；冰醋酸，A490-212；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中，并按5-10μL/分钟的速率注射在活化的传感器上5和10分钟之间的不同接触时间。固定至COOH1传感芯片的G蛋白的量在400-2000反应单位(RU)的范围内。以25μL/分钟的流速用100μL乙醇胺覆盖剩余活化位点。 
通过将mAb与G蛋白包被的芯片结合，然后将各分析物(IL-6或IL-23)与其各自的mAb结合来测定兔人嵌合mAb的平衡常数。为了最小化传质效应，调节各分析物的mAb的表面密度，使得分析物结合接近饱和，它的对应的RU落在200和300之间。将1至100nM的3x-FLAG-IL-6(见实施例1)、IL-6(CYT-213，Prospec-Tany Technogene，Rehovot，以色列)或人嵌合IL-23(34-8239，eBiosciences，San Diego，CA)稀释液注射在芯片表面上，并测量结合(Ka)和解离(Kd)速率常数。对于每个结合和 解离循环，用15uL20mM NaOH(5671-02，Mallinckrodt Baker，Philliphsburg，NJ)再生芯片表面。测定温度维持在25℃，分析物流速为50μL/分钟，包含2分钟结合期和10-30分钟解离期。可以用上述形式连同准一级1∶1相互作用模型软件(Qdat，ICx Nomadics，Stillwater，OK)来测定结合速率/解离速率(ka/kd)和解离常数(KD)。 
按之前所述测定scFv的平衡常数；但是，修改流程，使得表位标记的IL-6捕获在芯片表面上，并监测抗-IL-6scFv从IL-6解离。简言之，使抗-FLAG
Figure BDA00003166002600831
M2抗体(200472，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)结合于G蛋白，然后通过抗-FLAG抗体来捕获3xFLAG-IL-6。在1和100nM之间的一系列浓度测定抗-IL-6scFv。 
按之前针对测量抗-IL-6部分所述进行双特异性scFv的SPR；但是，需要修改流程来测定抗-IL-23scFv(31A12)的结合动力学。简言之，通过首先按所述但以恒定密度(～240RU)用IL-6固定双特异性剂来进行双特异性剂对IL-23的结合。用上文详述的相同参数以3至25nM的浓度测定重组人二聚体IL-23(34-8239，eBiosciences，San Diego，CA)的结合和解离。 
实施例3：兔抗人IL-6单克隆抗体的产生 
3.1兔免疫： 
在第0、21和42天用Sigma Adjuvant System(Sigma S6322)中的100μg IL-6蛋白质(重组大肠杆菌衍生的人IL-6，参考序列检索号NP000591.1，获自ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，Rehovot，以色列(Cat.#CYT-213i))免疫一只新西兰白兔。采血前加强兔不少于10天。按NIH、USDA和IACUC指导将兔饲养在R&R Research Laboratories(Stanwood，WA，美国)。 
3.2B细胞克隆： 
通过静脉穿刺从每只兔收集30ml血。通过密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)(淋巴细胞-兔，Cat.#CL5050，Cedarlane Laboratories Ltd.，Ontario，加拿大)。 
3次免疫后测定免疫兔血清对人IL-6的中和活性。 
在有和无1∶3200稀释的免疫兔血清的情况下从1ng/ml滴定人IL-6。为了选择对IL-6特异的B细胞，按以下用IL-6包被6cm组织培养皿：将His标记的人IL-6(Cat.#CYT-484，Prospec-Tany Technogene，Rehovot，以色列)捕获在抗-His抗体包被的平板上。含2μg/ml抗-His抗体(Cat#A00613，GeneScript Corp.，New Jersey，美国)的PBS在6cm塑料培养皿中4℃过夜孵育或37℃孵育1小时。然后去除抗体溶液，加入4ml PBS+5％BSA 1小时。通过孵育3ml含2μg/ml His-IL-6的PBS 1小时，然后用PBS洗涤4次来捕获IL-6。将PBMC悬浮在2ml含5％BSA的PBS中，接种在抗原包被的平皿上4℃40分钟。然后用PBS洗涤平板4至8次，通过轻轻刮擦去除贴壁细胞。将这些细胞按100-500X 103细胞/ml重悬在完全培养基(RPMI 1640、10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸、50uM β-巯基乙醇)中。除100μl含有5x 105细胞/孔丝裂霉素-c处理的EL4-B5细胞(Zubler等1985)、20ng/ml重组人IL-2(GenScript Corp，Piscataway，NJ，美国)和5％来自兔脾细胞的条件培养基的完全培养基外，向96孔板的每个孔中加入100μl细胞悬液。 
简言之，将EL4-B5细胞按1x107细胞/ml的密度悬浮在含有50μg/ml丝裂霉素-c(Cat#M0503，Sigma-Aldrich)的RPMI中40分钟，并在完全培养基中洗涤6次。 
按以下制备兔条件培养基：机械分离兔脾细胞，滤过70μm筛孔，按1x106细胞/ml重悬在完全培养基(RPMI 1640、10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸、50uM β-巯基乙醇)中。在37℃的CO2(5％)培养箱中用500ng/ml的洛诺霉素和5μg/ml的伴刀豆球蛋白A(Cat#C5275，Sigma-Aldrich)或40ng/ml的PMA刺激细胞48小时。对条件培养基进行除菌过滤，并保存在-20℃用于后续实验。对于一些实验，将丝裂霉素-c处理(如EL4-B5)的正常兔脾细胞按1-2x105细胞/孔加入克隆平板。 
将含有抗原选择的细胞的平板在37℃、5％CO2下孵育7至10天。然后收集培养物上清来测定IL-6结合(ELISA)以及IL-6活性的抑制。 
用ELISA来评价IL-6结合。将100μl含0.25μg/ml重组IL-6(见实施例1)的PBS加入ELISA平板。在37℃孵育平板1小时或在4℃孵育过夜。向每个孔中加入100μl/孔的含10％山羊血清(Cat#16210-072，Invitrogen，美国)的PBS来封闭。室温孵育平板1小时。用去离子水漂洗平板5次。向每个孔中加入50μl PBS/10％山羊血清。然后按50μl/孔加入测试样品。室温孵育平板1小时。用去离子水漂洗平板5次。向每个孔中加入100μl1∶5000稀释在PBS/10％山羊血清中的过氧化物酶缀合的山羊抗-兔IgG(Cat.#111-035-008，Jackson Immuno Research)。室温孵育平板1小时，然后用去离子水洗涤5次。按100μl/孔加入TMB底物(Thermo Scientific，Rockford，IL.，美国)。用100μl 1N H2SO4(JT Baker，Phillipsburg，NJ，美国)终止反应。用Molecular Devices M2酶标仪在450nm测量吸光度。 
通过测量B9细胞响应大肠杆菌或CHO细胞衍生的IL-6(Prospec-Tany Technogene，Rehovot，以色列)的增殖，用使用依赖于IL-6的鼠B细胞杂交瘤细胞系(B9细胞系；Aarden等，1987)的生物测定来评价IL-6抑制。将待测试中和活性的样品稀释在96孔组织培养板中的100μl测定培养基(RPMI 1640w/L-谷氨酰胺、10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠，50μM 2-巯基乙醇)中。然后加入50μl含IL-6(Cat.#CYT-274Prospec-Tany Technogene)的测定培养基，并在室温孵育30分钟。从细胞培养瓶回收B9细胞，并在180Xg离心7分钟，将沉淀重悬在不含IL-6的培养基(RPMI 1640w/L-谷氨酰胺、10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠，50μM 2-巯基乙醇)中。离心和重悬细胞三次来去除IL-6。通过台盼蓝排除测定生存力后，将细胞调节至1X105细胞/ml。向每个孔连同包含无IL-6培养基的适当的对照孔中加入50μl体积的B9细胞(对应于5X103个细胞)。 
在37℃、5％CO2下孵育平板48小时。随后，向每个孔中加入20μl的Alamar Blue(Cat#DAL1100，Invitrogen，美国)，并再孵育平板18小时。在Molecular Devices(Sunnyvale，CA，美国)M2酶标仪上在570和 600nm读板。 
图1显示进行来选择产生适于进一步表征的抗体的细胞的示例性实验：针对IL-6结合(下图)和IL-6中和(上图)二者测试每个上清。适于进一步表征的上清在两种测定中都是阳性(箭头和星号)。 
3.3从兔B细胞拯救V区 
V区拯救方法总结在图2中。 
简言之，通过用反转录酶偶联聚合酶链反应(RT-PCR)扩增来捕获来自IL-6中和测试和IL-6结合测试二者都为阳性的上清的IgG可变重链和轻链。克隆这样获得的VH和VL cDNA，并连接至人恒定区构建体上，使得最终的cDNA构建体编码图3中所示的嵌合兔人IgG。 
设计从激活的兔B细胞拯救免疫球蛋白V区的引物用于从细胞裂解后捕获的mRNA合成cDNA以及随后的PCR扩增步骤，其中最后的PCR加入用于克隆入表达载体的限制酶位点。由于一只兔子可具有b9同种异型背景(Rader等，2000)，有必要设计多种cDNA引物和嵌套J区引物，因为J-κ和C-κ区使用在兔同种异型之间不同(Sehgal等，1990)。表1中显示选择用于RT和PCR步骤二者的DNA寡核苷酸引物的列表，右列中标出它们的重链/轻链特异性。 
按厂家的说明用来自Dynabeads(Cat.#610.21)的mRNA DIRECT Micro Kit裂解所选择的阳性B细胞并制备mRNA。为了回收v区，将产生自单个抗原阳性孔的mRNA用于重链和轻链二者的一步RT/PCR(Qiagen One Step RT-PCR Kit，cat.N.210212)反应。对于反应，用定位在兔IgG分子重链和轻链的恒定区中的基因特异性引物来产生单链cDNA，然后用嵌套J区引物与前导肽特异性引物一起进行第一轮PCR来产生兔可变区。表1：用于V区拯救的引物组。 
Figure BDA00003166002600871
进行第二轮PCR来将限制位点加至拯救的V区用于亚克隆入包含人IgG1重链或轻链的恒定区的载体。对重链和轻链进行分开的PCR。对于重链和轻链，加至V区的限制位点分别是HindIII/XhoI和NcoI/BsiW1。包含恒定区的载体获自InvivoGen(pFUSE-CHIg-hG1#08E07-SV和pFUSE2-CLIg-hk#08F19-SV)。自己修饰两种载体用于亚克隆策略。加入限制位点后，对PCR产物进行相关限制酶消化，凝胶纯化，并连接入适当的载体。 
亚克隆后，将连接的DNA转化入DH5α大肠杆菌(Invitrogen)。将 全部转化混合物在含有适当抗生素抗性的培养基中过夜培养。收集培养的细菌，分离并纯化(Qiagen试剂盒)质粒DNA用于嵌合抗体的瞬时HEK293表达。此时，分离的DNA可以是或不是一种具体V区同质，因为所选择的孔可以包含一个或多个不同的B细胞克隆。为了产生嵌合抗体，用来自所选择的孔的重链和轻链二者的DNA共转染HEK293细胞。细胞培养3至5天后收集上清，并通过ELISA测定IgG和抗原结合，以及IL-6中和(方法见上文)。为了检测IgG在转染上清中的存在，进行ELISA免疫测定，其利用包被于ELISA平板的抗-人IgG Fc捕获抗体，然后利用上清和人IgG标准品。用抗-人IgG(H&L)-HRP试剂和TMB底物获得Fc捕获的抗体的检测。 
在每个孔可能存在一个以上独特克隆的假设下，用DNA测序筛选每个ELISA阳性孔来确定拯救了多少个独特的重链和轻链组合。对于DNA测序，将之前分离用于转染的DNA重新转化入DH5α大肠杆菌，并接种在含有适当抗生素的琼脂平板上。从每个转化挑取多个菌落，并按厂家的说明用滚环DNA扩增试剂盒(Templiphy，GE Healthcare)处理用于DNA产生。测序产生自Templiphy反应的DNA，然后进行分析来确定每个孔的V区的复杂性。除制备DNA外，保存用于Templiphy反应的细菌用于以后的DNA分离，因为每个DNA现在代表独特的克隆。 
序列分析后，使用从Templiphy反应保存的细菌，获得来自每个拯救孔的重链和轻链二者的每个独特V区的DNA。匹配重链和轻链，并瞬时转染入HEK293。在存在一种以上可能的重链和轻链组合(非克隆孔)时，转染独特的重链和轻链对的每种可能的组合。3至5天后收集上清，通过ELISA测定IgG和抗原结合，以及IL-6中和(方法见上文)。此去褶合步骤后，选择保持希望的活性的重链和轻链组合用于人源化。 
以下抗体克隆符合抗原结合和抗原中和的标准，选择它们用于进一步研发： 
13A8： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 6(氨基酸序列)、SEQ ID 7(核苷 酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 8(氨基酸序列)、SEQ ID 9(核苷酸序列)。 
13A8克隆显示高效价，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为34pg/ml(图3A和B)，及通过SPR分析测定的高亲和力抗原结合特性：Kd1.38x10-4(s-1)；Ka6.33x105(M-1s-1)；和KD218pM。 
表2 
ID SEQ ID   序列
13A8 VH-CDR1 10 CDR1 VH SYDMS
13A8 VH-CDR2 11 CDR2 VH YIYTDSSTWYANWAKG
13A8 VH-CDR3 12 CDR3 VH GSTDYAFDTRLDL
13A8 VK-CDR1 13 CDR1 VL QASQSISNELS
13A8 VK-CDR2 14 CDR2 VL RASTLTS
13A8 VK-CDR3 15 CDR3 VL QQGYNSNDVDNV
28D2： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 16(氨基酸序列)和SEQ ID 17(核苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 18(氨基酸序列)和SEQ ID 19(核苷酸序列)。 
28D2克隆显示高效价，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为65pg/ml(图3A和B)。 
表3 
ID SEQ ID   序列
28D2 VH-CDR1 20 CDR1 VH KNAIA
28D2 VH-CDR2 21 CDR2 VH IIYAGGATTYASWAKG
28D2 VH-CDR3 22 CDR3 VH EYAGDSYYTGYTQLD
28D2 VK-CDR1 23 CDR1 VL QASEDLFSSLA
28D2 VK-CDR2 24 CDR2 VL SASTLAS
28D2 VK-CDR3 25 CDR3 VL LGLYYYLTPDPIYG
18D4： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 26(氨基酸序列)和SEQ ID 27(核 苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 28(氨基酸序列)和SEQ ID 29(核苷酸序列)。 
18D4克隆显示高效价，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为54pg/ml，及通过SPR分析测定的高亲和力抗原结合特性：Kd8.49x10-5(s-1)；Ka6.66x105(M-1s-1)；和KD128pM。 
表4 
ID SEQ ID   序列
18D4 VH-CDR1 30 CDR1 VH SYAMT
18D4 VH-CDR2 31 CDR2 VH TSYVYSGDTWYASWVKG
18D4 VH-CDR3 32 CDR3 VH VGDYDDYGAHDVFDS
18D4 VK-CDR1 33 CDR1 VL QASESISSWLS
18D4 VK-CDR2 34 CDR2 VL RASTLAS
18D4 VK-CDR3 35 CDR3 VL QQGYTGGNVDNA
8C8： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 36(氨基酸序列)和SEQ ID 37(核苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 38(氨基酸序列)和SEQ ID 39(核苷酸序列)。 
8C8克隆最初的转染上清显示抑制生物活性的高效价。随后，直接从兔IgG衍生scFv，这些显示高效价，EC50(计算为抑制200pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为510pg/ml(图12A)。 
表5 
ID SEQ ID   序列
8C8 VH-CDR1 40 CDR1 VH SSGVS
8C8 VH-CDR2 41 CDR2 VH YVSIADTISYANWAKG
8C8 VH-CDR3 42 CDR3 VH GFITYSGVL
8C8 VK-CDR1 43 CDR1 VL QASQSISNELS
8C8 VK-CDR2 44 CDR2 VL RTSTLAS
8C8 VK-CDR3 45 CDR3 VL QQGYNSNDVDNV
9H4： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 46(氨基酸序列)和SEQ ID 47(核 苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 48(氨基酸序列)和SEQ ID 49(核苷酸序列)。 
9H4克隆显示高效价，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为109pg/ml(图3C、D、E)，及通过SPR分析测定的高亲和力抗原结合特性：Kd4.75x10-5(s-1)；Ka8.16x105(M-1s-1)；和KD58pM。 
表6 
ID SEQ ID   序列
9H4 VH-CDR1 50 CDR1 VH SYDMS
9H4 VH-CDR2 51 CDR2 VH YIYTDTSTYYANWAKG
9H4 VH-CDR3 52 CDR3 VH GSTDYAFDTRLDL
9H4 VK-CDR1 53 CDR1 VL QASQSISNELS
9H4 VK-CDR2 54 CDR2 VL RTSTLAS
9H4 VK-CDR3 55 CDR3 VL QQGYNSNDVDNV
9C8： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 56(氨基酸序列)和SEQ ID 57(核苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 58(氨基酸序列)和SEQ ID 59(核苷酸序列)。 
9C8克隆显示高活性和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为400pg/ml(图3E)；Kd3.17x10-5(s-1)；Ka7.65x105(M-1s-1)；和KD42pM。 
表7 
ID SEQ ID   序列
9C8 VH-CDR1 60 CDR1 VH SYDMS
9C8 VH-CDR2 61 CDR2 VH YIYTDSSTYYANWAKG
9C8 VH-CDR3 62 CDR3 VH GSTDYAFDTRLDL
9C8 VK-CDR1 63 CDR1 VL QASQSISNELS
9C8 VK-CDR2 64 CDR2 VL RTSTLAS
9C8 VK-CDR3 65 CDR3 VL QQGYNSNDVDNV
3.4对灵长类IL-6的反应性 
用于人治疗的任意细胞因子拮抗剂的成功研发将需要最初的毒理学测试。在非人物种中最有效地显示毒理学。为了进行毒理学研究，首先有必要证明抗体中和来自考虑用于研究的物种的IL-6的能力。 
图3中显示针对非人灵长类IL-6活性的中和进行了测试的抗-IL-6嵌合抗体中的几种。 
实施例4：兔抗人IL-23单克隆抗体的产生 
4.1兔免疫 
在第0、21和42天用Sigma Adjuvant System(Sigma S6322)中的100μg IL-23蛋白质(杆状病毒衍生的由p40链(检索号NM_002187)和p19链(检索号NM_016584)组成的重组人IL-23，来自eBiosciences，San Diego CA，美国(Cat.#34-8239))免疫一只新西兰白兔(NZW)和一只B9兔。免疫至少10天后对动物进行采血。按NIH、USDA和IACUC指导将兔饲养在Research Laboratories(Stanwood，WA，美国)和Spring Valley Laboratories(Woodbine，MD，美国)。 
NZW和B9兔表达不同的免疫球蛋白基因同种异型，其对应于构架和CDR区中的差异，分离mAb结构中对应的差异。据报道，由于V区中缺乏Cys残基，将b9同种异型兔用于mAb的噬菌体展示克隆更好。所有抗IL-6mAb都克隆自NZW兔，没有一个在V区中存在Cys残基。 
测量了来自用人IL-23免疫的B9和NZW兔的高效价血清的IL-23中和活性。来自免疫兔的血清能够在接近1∶10,000的稀释度下完全中和由600pg/ml人IL-23诱导小鼠脾细胞分泌的IL-17A。 
4.2B细胞克隆 
按实施例3中选择对IL-23特异的B细胞。 
通过密度离心从每只兔制备外周血单核细胞(PBMC)(淋巴细胞-兔，Cat.#CL5050，Cedarlane Laboratories Ltd.，Ontario，加拿大)。通过用含2μg/ml IL23(eBioscience)的PBS在4℃过夜孵育或在37℃孵育1小时来产生IL-23包被的平板，用PBS洗涤4次，并用于捕获B细胞。将PBMC悬浮在2ml含5％BSA的PBS中，接种在抗原包被的平皿上4℃40分钟。 然后用PBS洗涤平板4至8次，通过轻轻刮擦去除贴壁细胞。将细胞接种在兔脾细胞条件培养基和IL4-B5细胞(见实施例1)中，并在37℃、5％CO2下孵育7至10天。然后收集培养物上清，并测试IL-23结合(ELISA)及IL-23活性的抑制。 
用ELISA测定来评价IL-23结合(Aggarwal等，2003)。用直接或间接结合IL-23的方法包被ELISA平板。 
对于间接结合法，向平板中加入100μl/孔含0.01-0.02ug/ml抗-His抗体(Cat#A00613，GenScript Corp.，New Jersey，美国)的PBS。37℃孵育平板1小时或4℃孵育过夜。向各孔中加入100μl/孔含10％山羊血清(Cat#16210-072，Invitrogen，美国)的PBS来封闭非特异性结合，然后用去离子水漂洗平板5次。加入100μl/孔含0.5μg/ml的IL-23p40-p19-His(SEQ ID 4)的PBS/10％山羊血清，并在室温孵育1小时。 
对于直接结合法，向ELISA平板中加入100μl含0.5μg/ml的IL-23p40-p19-His(SEQ ID NO.4)的PBS。37℃孵育平板1小时或4℃孵育过夜。向各孔中加入100μl/孔含10％山羊血清(Cat#16210-072，Invitrogen，美国)的PBS来封闭非特异性结合。室温孵育平板1小时。 
IL-23结合后，用去离子水漂洗平板5次。向每个孔中加入50μlPBS/10％山羊血清。然后按50μl/孔加入测试样品。室温孵育平板1小时，并用去离子水漂洗5次。向每个孔中加入100μl1∶5000稀释在PBS/10％山羊血清中的过氧化物酶缀合的山羊抗-兔IgG(Cat.#111-035-008，Jackson Immuno Research)。室温孵育平板1小时，然后用去离子水洗涤5次。按100μl/孔加入TMB底物(Thermo Scientific，Rockford，IL.，美国)。用100μl 1N H2SO4(JT Baker，Phillipsburg，NJ，美国)终止反应。用Molecular Devices M2酶标仪在450nm测量吸光度。 
用生物测定来检测抗体介导的IL-23与IL-23受体的结合及产生的生物活性的抑制，该生物测定基于IL-23诱导小鼠脾细胞表达IL-17的检测。 
将5x105C57Bl/6脾细胞在200μl包含异二聚体IL-23(eBioscience cat.#14-8239或Humanzyme，Chicago，美国cat.#HZ-1049)稀释液的培养基 中培养于96孔板的孔中，并在37℃孵育平板2-3天。培养基是RPMI 1640、10％FBS、50uM 2-巯基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸、庆大霉素和10ng/ml人IL-2(Cat#CYT-209，Prospec-Tany Technogene)。3天后，按下文所述通过ELISA测定培养物上清的IL-17A。 
为了测定IL-23抑制，将测试mAb样品按多种稀释度加至含有150-1200pg/ml IL-23的小鼠脾细胞培养物，并将IL-17A的分泌与未用mAb处理的培养物相比较。 
用ELISA测定来检测小鼠IL-17。用含1μg/ml抗-mIL-17A(eBioscience#14-7178)的100μl PBS在4℃过夜包被平板或在37℃包被1小时。在去离子水中洗涤平板，并用100μl PBS，10％山羊血清封闭1小时。洗涤平板后，向平板中加入50μlPBS/10％山羊血清和50μl培养物上清，并孵育1小时。洗涤平板，加入100μl/孔含0.5μg/ml抗-mIL-17A-生物素(eBioscience#13-7179)的PBS/10％山羊血清，室温孵育平板1小时，洗涤，并与100μl/孔1∶1000稀释在PBS/10％山羊血清中的链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Labs)反应。再次洗涤平板，并通过加入100μl/孔TMB底物(Thermo Scientific，IL，美国)来检测信号。用100μl/孔1NH2SO4终止反应后，在450nM读取光密度。用Graphpad(Prism，Mountainview，CA)软件对数据进行作图和分析。 
从IL-23免疫的兔克隆B细胞，并测试B细胞克隆上清的IL-23中和及IL-23结合。 
图7显示来自实验的实例96孔板，其中测试每种上清的IL-23结合(下图)和IL-23中和(上图)二者，适于进一步表征的上清在两种测试中都为阳性。 
4.3从激活的B细胞拯救V区 
基本上按实施例3中，通过RT-PCR来捕获来自IL-23中和测定和IL-23结合测定二者都为阳性的B细胞的IgG可变重链和轻链。 
图5A-I显示所获得的几种抗IL-23中和性mAb的人IL-23中和活性的实例。 
如图6中所示，在它们与灵长类IL-23的结合中进一步表征了几种抗体。如图8A中所示，进一步测试中和IL-23的单克隆抗体的人IL-12的中和。mAb 31A12特异性中和IL-23，而45G5和22H8中和IL-23和IL-12二者。 
可以通过几种实验方法(如交叉竞争结合测定或与线性肽结合)来达到本发明的抗体识别的表位的作图。 
可以通过单克隆抗体或其抗体片段和抗原复合物的共结晶来获得详细的表位作图。备选方法在mAb的存在下用氘标记后使用抗原肽的液相色谱质谱(LCMS)分析。非氘残基代表受mAb保护的那些。 
选择以下符合抗原结合、抗原中和及IL-23的选择性结合的标准的单克隆抗体用于进一步研发： 
31A12： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 86(氨基酸序列)；SEQ ID 87(核苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 88(氨基酸序列)；SEQ ID 89(核苷酸序列)。 
31A12mAb显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制600pg/ml的IL-23的生物活性所必需的浓度)为3286pg/ml，及通过SPR分析测定的高亲和力抗原结合特性：Kd2.02x10-4(s-1)；Ka4.79x105(M-1s-1)；和KD422pM。 
表8 
ID SEQ ID   序列
31A12 VH CDR1 90 CDR1 VH SYWMT
31A12 VH CDR2 91 CDR2 VH TIATSSTYYASWAKG
31A12 VH CDR3 92 CDR3 VH GLTTDYDLDL
31A12 VK CDR1 93 CDR1 VL QASEDIESYLA
31A12 VK CDR2 94 CDR2 VL SASTLTS
31A12 VK CDR3 95 CDR3 VL LGADDTTTV
49B7： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 96(氨基酸序列)和SEQ ID 97(核 苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 99(氨基酸序列)和SEQ ID 99(核苷酸序列)。 
49B7mAb显示高效价，EC50(计算为抑制600pg/ml的IL-23的生物活性所必需的浓度)为988pg/ml。 
表9 
ID SEQ ID   序列
49B7 VH CDR1 100 CDR1 VH DYDMS
49B7 VH CDR2 101 CDR2 VH IVYDIGTIYYAPWAEG
49B7 VH CDR3 102 CDR3 VH EAPGYSDGDI
49B7 VK CDR1 103 CDR1 VL QASETVDNNKRLS
49B7 VK CDR2 104 CDR2 VL GAATLAS
49B7 VK CDR3 105 CDR3 VL GGYKDSTDVG
16C6： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 106(氨基酸序列)和SEQ ID 107(核苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 108(氨基酸序列)和SEQ ID 109(核苷酸序列)。 
16C6mAb显示高效价，EC50(计算为抑制150pg/ml的IL-23的生物活性所必需的浓度)为219pg/ml。 
表10 
ID SEQ ID   序列
16C6 VH CDR1 110 CDR1 VH TVSGFSLNSYSMS
16C6 VH CDR2 111 CDR2 VH VIGLGGSAYYASWAK
16C6 VH CDR3 112 CDR3 VH ATYSDDNI
16C6 VK CDR1 113 CDR1 VL QASQSISSWLS
16C6 VK CDR2 114 CDR2 VL RASTLAS
16C6 VK CDR3 115 CDR3 VL LGGDGNVSN
34E11： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 116(氨基酸序列)和SEQ ID 117(核苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 118(氨基酸序列)和SEQ ID 119 (核苷酸序列)。 
34E11克隆显示高效价，EC50(计算为抑制150pg/ml的IL-23的生物活性所必需的浓度)为50pg/ml。 
表11 
ID SEQ ID   序列
34E11 VH CDR1 120 CDR1 VH TYDIN
34E11 VH CDR2 121 CDR2 VH YIYRGSPYYADWAKG
34E11 VH CDR3 122 CDR3 VH NLYSVNVL
34E11 VK CDR1 123 CDR1 VL QASQSISSRLA
34E11 VK CDR2 124 CDR2 VL SASTLAS
34E11 VK CDR3 125 CDR3 VL LGSYSNTIRT
35H4： 
可变区轻链(Vh)鉴定为SEQ ID 126(氨基酸序列)和SEQ ID 127(核苷酸序列)。 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 128(氨基酸序列)和SEQ ID 129(核苷酸序列)。 
相对于在同一B细胞克隆实验中分离的其他mAb，35H4克隆在所克隆的mAb的转染上清中显示高效价。 
表12 
ID SEQ ID   序列
35H4 VH CDR1 130 CDR1 VH DYDMS
35H4 VH CDR2 131 CDR2 VH IVYDIGTIYYAPWAEG
35H4 VH CDR3 132 CDR3 VH EAPGYSDGDI
35H4 VK CDR1 133 CDR1 VL QASETVGNNNRLS
35H4 VK CDR2 134 CDR2 VL GAATLAS
35H4 VK CDR3 135 CDR3 VL GGYKDSTDVG
实施例5：兔抗人IL-23/IL-12单克隆抗体的产生 
如图8A中所示，可能将中和IL-23的抗体进一步分为IL-23特异的那些及中和IL-23和IL-12二者的那些。IL-12和IL-23具有共同的p40多肽，而在与p40共价连接的第二链中不同(图7A)。IL-23的p19链和IL-12的p35链都是四螺旋束细胞因子样多肽。p19和p40亚基通过二硫键与共同的p40亚基连接。由于两个分子间共享p40链而存在中和IL-12和IL-23 二者的抗体。 
IL-12和IL-23受体具有共同链(IL-12Rβ1)，此外，各具有独特的受体成分(IL-23R和IL-12Rβ2)(图7B)。这些差异导致IL-12和IL-23所用靶细胞和信号传导途径的显著差异。这些受体具有与JAK2或TYK2酪氨酸激酶配对用于STAT激活的跨膜信号发放结构域。 
从用重组IL-23免疫的兔分离结合IL-23和IL-12二者的抗体(见实施例4)。选择对IL-23和IL-12二者显示结合和功能活性的B细胞克隆进行进一步表征。 
针对IL-23的中和测试来自B细胞的嵌合IgG的初级拯救转染。对成功中和IL-23的那些进行测序和亚克隆，并重新转染，定量转染上清中的mAb。确认这些mAb的抗IL-23活性(图8B-E)，然后针对IL-12(图8F-G)和灵长类IL-23(图8H，I)的中和进行测试。 
选择以下符合抗原结合、抗原中和及IL-12和IL-23的选择性结合的标准的单克隆抗体用于进一步研发： 
22H8： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 136(氨基酸序列)；SEQ ID 137(核苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 138(氨基酸序列)；SEQ ID 139(核苷酸序列)。 
mAb 22H8显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为603pg/ml，及通过SPR分析测定的高亲和力抗原结合特性：Kd8.94x10-5(s-1)；Ka4.03x105(M-1s-1)；和KD221pM。 
表13 
ID SEQ ID   序列
22H8 VH CDR1 140 CDR1 VH TYTMN
22H8 VH CDR2 141 CDR2 VH AISYDGGTAYANWAKG
22H8 VH CDR3 142 CDR3 VH GFYVYAYIGDAFDP
22H8 VK CDR1 143 CDR1 VL QSSQTVYKNNLLS
22H8 VK CDR2 144 CDR2 VL LASTLAS
22H8 VK CDR3 145 CDR3 VL LGGYDDDADTA
[0712]  45G5： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 146(氨基酸序列)；SEQ ID 147(核苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 148(氨基酸序列)；SEQ ID 149(核苷酸序列)。 
mAb 45G5显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为385pg/ml。 
表14 
ID SEQ ID   序列
45G5 VH CDR1 150 CDR1 VH VYPIN
45G5 VH CDR2 151 CDR2 VH IINDVDDTAYSAWAKG
45G5 VH CDR3 152 CDR3 VH GYLSYAYAGDAFDP
45G5 VK CDR1 153 CDR1 VL QSSQSIYNNNLLS
45G5 VK CDR2 154 CDR2 VL FASTLAS
45G5 VK CDR3 155 CDR3 VL LGGYDDDADTA
1H1： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 156(氨基酸序列)；SEQ ID 157(核苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 158(氨基酸序列)；SEQ ID 159(核苷酸序列)。 
mAb 1H1显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为603pg/ml。 
表15 
ID SEQ ID   序列
1H1 VH CDR1 160 CDR1 VH TASGLTLGSYSMT
1H1 VH CDR2 161 CDR2 VH VIGVGGTLNYASWAQ
1H1 VH CDR3 162 CDR3 VH GTYSGDSI
1H1 VK CDR1 163 CDR1 VL QASQSISSWLA
1H1 VK CDR2 164 CDR2 VL RASILTS
1H1 VK CDR3 165 CDR3 VL LGGDGHVSN
4F3： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 166(氨基酸序列)；SEQ ID 167(核 苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 168(氨基酸序列)；SEQ ID 169(核苷酸序列)。 
mAb 4F3显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为2339pg/ml。 
表16 
ID SEQ ID   序列
4F3 VH CDR1 170 CDR1 VH GYTMI
4F3 VH CDR2 171 CDR2 VH IISSSGNTYYASWVKG
4F3 VH CDR3 172 CDR3 VH GSGAYISDYFNV
4F3 VK CDR1 173 CDR1 VL QASQSIDSWLS
4F3 VK CDR2 174 CDR2 VL SASKLAP
4F3 VK CDR3 175 CDR3 VL QSYYDVNAGYG
5C5： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 176(氨基酸序列)；SEQ ID 177(核苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 178(氨基酸序列)；SEQ ID 179(核苷酸序列)。 
mAb 5C5显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为1907pg/ml。 
表17 
ID SEQ ID   序列
5C5 VH CDR1 180 CDR1 VH SYTMI
5C5 VH CDR2 181 CDR2 VH IISAGGSAYYASWVNG
5C5 VH CDR3 182 CDR3 VH GSGTYTSDYFNI
5C5 VK CDR1 183 CDR1 VL QASQSIDSWLA
5C5 VK CDR2 184 CDR2 VL SASKLAT
5C5 VK CDR3 185 CDR3 VL QSYYDANAGYG
14B5： 
可变区重链(Vh)鉴定为SEQ ID 186(氨基酸序列)；SEQ ID 187(核苷酸序列)； 
可变区轻链(Vl)鉴定为SEQ ID 188(氨基酸序列)；SEQ ID 189(核 苷酸序列)。 
mAb 14B5显示高效价和抗原结合特性，EC50(计算为抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的浓度)为767pg/ml。 
表18 
ID SEQ ID   序列
14B5 VH CDR1 190 CDR1 VH DYTMI
14B5 VH CDR2 191 CDR2 VH IISSSGNTYYATWVKG
14B5 VH CDR3 192 CDR3 VH GSGAYISDYFNV
14B5 VK CDR1 193 CDR1 VL QASQSIDSWLS
14B5 VK CDR2 194 CDR2 VL AASKLAT
14B5 VK CDR3 195 CDR3 VL QSYYDVNAGYG
5.1IL-12生物测定 
用IL-12反应细胞系NK-92(CRL-2407，ATCC，Manassas，Virginia，美国)测定抗体的IL-12中和能力。将50μl来自B细胞克隆平板的培养物上清或50μl来自抗体转染的上清转移至96孔组织培养板。向每个孔中加入50μl 4ng/ml的人IL-12(Cat.#Cyt-362，Prospec-Tany Technogene，Rehovot，以色列)。室温孵育平板30-60分钟，然后向每个孔中加入100μl中的5x104NK-92细胞。37℃孵育培养物3天，并针对人干扰素-γ的产生测定上清。测定培养基是RPMI1640、10％FBS、NEAA、丙酮酸、50μM2-巯基乙醇、庆大霉素和10ng/ml人IL-2(Cat#Z00368，GeneScript Corporation，Piscataway，NJ，美国)。 
干扰素-γ ELISA 
用ELISA测定来检测人干扰素-γ。用含1μg/ml抗-人干扰素-γ(Cat.#Mab1-D1K，Mabtech，Cincinnati，OH，美国)的100μl PBS在4℃过夜包被平板或在37℃包被1小时。在去离子水中洗涤平板，并用100μl PBS，10％山羊血清封闭1小时。洗涤平板后，向平板中加入50μlPBS/10％山羊血清和50μl培养物上清，并孵育1小时。洗涤平板，加入100μl/孔含0.5μg/ml抗-人干扰素-γ-生物素(Cat#Mab 7b6-1-biotin，Mabtech)的PBS/10％山羊血清，室温孵育平板1小时，洗涤，并与100μl/孔1∶1000稀释在PBS/10％山羊血清中的链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Labs)反应。再次洗涤平板，并通过加入100μl/孔TMB底物(Thermo Scientific， IL，美国)来检测信号。用100μl/孔1N H2SO4终止反应后，在450nM读取光密度。 
实施例6：人源化scFv的改造 
人源化简介 
从分离自来自免疫兔的外周血B细胞的mRNA捕获兔免疫球蛋白可变区(V区)。将这些兔B细胞以低密度接种在96孔板中，并按之前所述激活。用反转录酶PCR(RT-PCR)从每个孔的mRNA扩增V区cDNA，来自恒定区的基因特异性引物用于第一链合成，3’端的嵌套J区特异性引物和5’前导序列引物用于PCR步骤。然后将V区克隆入人IgG重链、κ或λ轻链载体盒，在HEK 293细胞中瞬时表达，转染后72小时，针对总IgG表达和各自靶标的中和测试上清。然后测序有效的中和剂来确定存在于亚克隆它们的孔中的复杂性水平。一旦确定独特的轻链和重链的数目，即再次在HEK 293中瞬时表达存在的所有可能的组合，测定中和和IgG含量。然后进一步测定有效的中和剂的其他希望的活性。针对来自非人灵长类的IL-6的中和测试抗-人IL-6抗体。不仅针对非人灵长类IL-23的中和，还针对人IL-12的中和测定抗-人IL-23抗体，因为IL-12二聚体和IL-23二聚体二者具有相同的p19链。 
发明人遵循两种策略：它们通过以VLVH或VHVL取向PCR遗传融合重链和轻链V区，在两个结构域之间引入由序列gly-gly-gly-gly-ser(G4S)的四个串联重复组成的20个氨基酸的接头，直接从选择的重链(VH)和轻链(VK或VL)构建兔scFv。兔scFv在评估从嵌合抗体转化为scFv形式是否对V区对的功能特性或生物物理特性具有副作用中有帮助。然后在HEK 293中瞬时表达scFv，并测定图12A中所示的功能。选择有效的中和剂进行人源化(见6.1部分)。 
备选地，以scFv形式直接人源化兔V区(见下文6.2)。 
可以以包括全长抗体和单链Fv(scFv)二者的许多不同形式人源化免疫球蛋白V区。由于所述发明依赖于原核重组蛋白质表达，不希望得到全长抗体结构。但是，本发明确实描述以抗体形式成功人源化兔V区。无论什么形式，本发明涉及去除任意天然存在的甲硫氨酸残基，用其他氨基酸 取代它们。由于甲硫氨酸残基常见于免疫球蛋白V区的构架区和CDR内，有必要为这些残基找到适合的取代，其中它们的存在不影响希望的蛋白质的表达、稳定性或功能。然后可以优化这种不含甲硫氨酸的scFv用于在甲硫氨酸营养缺陷型细菌菌株中表达，纯化，重折叠，并测试生物学活性。 
成功的人源化和随后的甲硫氨酸取代提供了部分治疗载体，该载体可以通过插入用作非天然氨基酸插入位点的单个甲硫氨酸密码子来进行化学修饰，该非天然氨基酸具有用于共价连接其他互补分子(如活化的PEG部分)的化学反应位点。然后可以通过PEG聚合物保留端的类似反应基团与另一个这种scFv共价连接来进一步修饰此PEG化scFv。然后可以纯化此双特异性PEG化产物并重折叠，以产生稳定、具有生物学活性的治疗性蛋白质。 
6.1全长抗体人源化方法 
可以将兔-人嵌合单克隆抗体人源化为全长抗体。这需要用人VH和VL构架区交换兔构架区，保留兔CDR，且通常包括保留特定兔构架残基。正如存在多种用于人源化啮齿类V区的策略，存在可以通过其来部分或完全人源化兔-人嵌合抗体的其他可能的方法。我们在此描述用来以抗体形式人源化抗-人IL-6克隆9C8的方法。通过将VH和VL的构架区换为人构架序列(有限地回复突变为兔构架序列)来人源化9C8(高亲和力和高效价的嵌合mAb)。 
通过首先将它们的一级氨基酸序列与见于人V区中的那些(Altschul等，1990)相比较来达到人源化NZW兔V区。根据构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)内的序列相似性、互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)内的序列长度和含量以及已知对支持IgV规范环结构至关重要的关键FR残基来进行可能相容的人V区构架的选择。用这些数据来为轻链和重链V区二者选择人构架，并通过使用重叠寡核苷酸引物(表19)的PCR来将兔CDR移植到图15中所示的这些构架上。 
对于9C8的人源化，将兔的Vκ构架换为人构架DPK8 VK1，而兔的VH构架换为人的DP42 VH3-53构架。所有CDR均为兔。产生了两种形式(v1和v2)的重链(见下文)。这两种形式在邻近CDR1 VH的构架区 (残基H23-20)中不同。此处的内源9C8兔构架区是用于v2的氨基酸序列TVSGIDLS。对于v1，将此序列的前两个构架残基(兔中的TV)换为在同源的人VH3构架位置中高度保守的AA。将亲本嵌合9C8 mAb与人源化形式9C8 mAbv1和mAbv2并排比较(图9B)。两种形式都保留完全活性。 
9C8 v1和v2中的构架和CDR1 VH变异： 
9C8 v1 
FW VH回复突变(H23-30)：AASGIDLS(SEQ ID NO.355) 
CDR1 VH(H31-35)：SYDMS 
9C8 v2 
FW-VH回复突变(H23-30)：TVSGIDLS(SEQ ID NO.356) 
CDR1 VH(H31-35)：SYDMS 
图9B显示亲本嵌合9C8mAb与包含邻近VH区CDR1的2个不同的兔回复突变(在位置H23-H30)的人源化9C8 mAb(9C8 mAbv1和9C8mAbv2)的并排比较。通过按之前所述将重链和轻链DNA二者瞬时共转染入HEK293细胞来表达人源化单克隆抗体9C8 mAbv1(在VH残基23-24处包含TV)和9C8 mAbv2(23-24为AA)。针对50pg/ml的IL-6的中和测试人源化单克隆抗体，如所示，这些改变(TVSGIDLS(mAbv2)或AASGIDLS(mAbv1))不影响功能活性(图9B)。图9C中进一步将9C8mAbv1与人源化mAb 18D4相比较。 
表19 
用来将兔CDR移植到所选择的人V区构架上的寡核苷酸引物。 
Figure BDA00003166002601041
Figure BDA00003166002601051
Figure BDA00003166002601061
Figure BDA00003166002601071
用于扩增人源化V区的引物编码与前一实施例中用来捕获兔V区并在图10中显示的那些相同的限制酶位点。以这种方式将人源化轻链连接至含有Cκ的表达载体，人源化重链V区连接至含有Cγ1的表达载体，并按之前所述转化入大肠杆菌。然后筛选和测序分离的菌落。 
表20 
Figure BDA00003166002601081
从人源化mAbv1(TV)和mAbv2(AA)衍生人源化9C8 scFv。产生的scFv保留邻近VH1CDR1的兔构架1残基(23-30)。这些scFv也在H34和H82处保留内源甲硫氨酸残基。然后从这些scFv产生9C8的最终形式的人源化scFv，但取代新的构架DPK5，6/DP47。这些新的人源化scFvs(9C8 Hum scFv v3-1和9C8 Hum scFv v3-2)显示有效的抗IL-6中和活性(图9D)。 
6.2V区的一步人源化及从兔-人嵌合mAb产生scFv 
还可以以scFv形式直接人源化兔V区。虽然所使用的人源化方法通常与用于人源化单克隆抗体的那些相同，但并非所有人源化抗体都易于转化为scFv。此外，抗体的人源化具有对恒定区与移植的CDR的相互作用负责的要求。按实施例6.1中所述用V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)及IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将重链和轻链V区二者的序列与人种系序列和表达的序列相比较。 
大多数克隆的兔VH和VL区分别密切匹配人IGVH3(IGHV3-66，IGHV3-49)和IGVK1(DPK-9)家族的成员，但因其在位置L4上缺乏甲硫氨酸而用DPK-8(VK1 Locus L8，V-BASE数据库)作为轻链构架(见6.1部分)。 
设计人源化scFv编码5’Not I限制酶位点，随后是Kozak盒(Kozak，1987)、IgVK3前导序列(L2)、人VK1-JK4构架、20个氨基酸的柔性(gly4ser)4接头、人VH3-JH4构架及嵌套在VH3-FR4的C端最后两个丝氨酸残基内的3’Xho I限制位点(图15)。所有scFv DNA都通过使用重叠DNA寡核苷酸延伸的从头DNA合成(Dillon和Rosen，1990)来构建，用Not I和Xho I(NEB，Ipswich，MA)消化，在1％琼脂糖-TAE凝胶上分离，从凝胶切下，并按厂家的说明用MinElute Gel Extraction试剂盒(Qiagen，wherever，CA)纯化。用T4 DNA Ligase(NEB，Ipswich，MA)将此DNA连接至Not I-Xho I消化的pcDNA 3.1(-)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。该pcDNA3.1(-)载体盒已修饰为编码与scFv的C端符合读框的短的富含脯氨酸的接头，该接头后面跟随6XHis标记(gly-pro-pro-pro-pro-his-his-his-his-his-his)。将连接的pcDNA3.1-6_13A8转化入感受态大肠杆菌TOP 10(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并在LB琼脂+100μg/ml羧苄青霉素(Teknova，Hollister，CA)上37℃过夜选择。从这些平板挑取分离的菌落，接种入2ml YT培养基+100μg/ml羧苄青霉素(Teknova)，在振荡培养箱中37℃过夜培养。用PureLink Quick Plasmid Miniprep柱(Invitrogen)从几个克隆分离DNA，然后通过限制酶切消化针对0.8Kbp scFv片段的存在进行筛选。然后在PCR循环测序后按厂家的说明用Big Dye Terminator v3.1试剂盒(ABI)在Applied Biosystems 3130Genetic Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA)上测序产生正确限制图谱的克隆。用VNTI v 10(Invitrogen)分析产生的DNA序列，并 与它们的参考核苷酸和氨基酸序列相比较。 
序列确认后，按厂家的流程用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将各scFv转染入HEK293细胞。简言之，转染前一天，将对数期HEK293细胞按每孔500,000个细胞的密度在完全培养基(DMEM+Glutamax+非必需氨基酸+Pen-Strep+10％ FBS-Life Sciences)中接种入12孔培养板(Corning，Lowell，MA)，并在37℃ CO2培养箱中过夜孵育。细胞大致80％汇合时，将4μgscFv DNA稀释在100μL Opti-MEM中，4μLLipofectamine 2000稀释在100μL Opti-MEM中，然后将两种稀释液组合为转染混合物，并在室温孵育20分钟。然后从12孔板去除培养基，换为1ml/孔SFM4-Transfectx-293无血清培养基(Hyclone，Logan，UT)，将转染混合物逐滴加至各孔。将转染平板放回37℃ CO2培养箱，培养3天，按前述实施例中所述测试功能活性。 
如13A8(图11A-B)、28D2和9C8 v3-1(图11C)所示，在哺乳动物细胞中表达时，用一步法人源化的抗IL-6scFv保留IL-6中和活性。通过表面等离振子共振(SPR)测量结合亲和力也证明13A8和9C8抗IL-6 scFv的成功人源化(表21)。用于亲和力测试的人源化13A8和9C8 scFv包含6x组氨酸标记，从转染的HEK上清纯化(用前述实施例中所述的方法)，并通过基本按实施例2中所述进行的SPR来测试。 
表21：人源化和哺乳动物表达的抗IL-6 scFv(甲硫氨酸取代前)及其亲本嵌合mAb的亲和力和效价。 
在哺乳动物细胞中表达的抗IL-23 31A12人源化scFv保留与亲本mAb相当的对人和灵长类IL-23二者的IL-23中和活性(图12)。此外，31A12 scFv保留至少与亲本嵌合mAb一样好的皮摩尔亲和力(图22)。 
表22：人源化和哺乳动物表达的抗IL-23 scFv 31A12及亲本嵌合mAb的亲和力和效价。 
Figure BDA00003166002601111
如图13中所描述，45G5人源化scFv保留对IL-23的有效生物学活性。 
表23：人源化V区氨基酸和核苷酸序列： 
抗IL-6 AZ_ID SEQ_ID
人源化_13A8 VH AA 259
人源化_13A8 VH nt 260
人源化_13A8 VL AA 261
人源化_13A8 VL nt 262
人源化_28D2 VH AA 263
人源化_28D2 VH nt 264
人源化_28D2 VL AA 265
人源化_28D2 VL nt 266
抗IL-23 AZ_ID SEQ_ID
人源化_31A12 VH AA 267
人源化_31A12 VH nt 268
人源化_31A12 VL AA 269
人源化_31A12 VL nt 270
抗IL-12/23 AZ_ID SEQ_ID
[0790] 
人源化_22H8 VH AA 271
人源化_22H8 VH nt 272
人源化_22H8 VL AA 273
人源化_22H8 VL nt 274
人源化_45G5 VH AA 275
人源化_45G5 VH nt 276
人源化_45G5 VL AA 277
人源化_45G5 VL nt 278
6.3人源化scFv中的甲硫氨酸取代 
人免疫球蛋白(Ig)V区通常在轻链和重链二者的CDR1中、在VH-FR3中相对保守的残基(人VH3家族，氨基酸H82)上、以及在κ轻链的L4位置上包含甲硫氨酸残基。由于这些人源化scFv最终将用甲硫氨酸类似物共价连接，必须通过另一天然存在的氨基酸来取代成熟scFv内的所有甲硫氨酸残基。此氨基酸取代必须对产生的scFv的功能或稳定性具有最小的影响或无影响。 
为了避免轻链氨基酸位置L4上的甲硫氨酸残基，将CDR移植入在该位置具有亮氨酸残基的人种系构架DPK8(GenBank X93626)。为了取代重链H82位置上的甲硫氨酸残基，设计简并寡核苷酸引物，使得甲硫氨酸变为异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)或苯丙氨酸(phe)。这四种氨基酸可以见于来自其他物种的IgVH区中的H82位置上，以及一些表达的人抗体中。在HEK293细胞中瞬时表达这些新的不含甲硫氨酸的scFv，然后将中和活性与它们的亲本scFv的中和活性相比较。 
根据效价和表达，通过改变可干扰翻译效率的密码子选择和潜在二级结构来优化不含甲硫氨酸的DNA序列用于在大肠杆菌中表达。 
为了取代VH位置H82M上的替代氨基酸，设计重叠简并引物(以上引物54、55)来与侧翼引物(以上引物1、2，分别为seq ID 200和201)一起通过PCR在位置H82上引入亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。按上文所述克隆PCR产物，并测序DNA来确定所选择的每个克隆编码哪 个氨基酸。 
人源化抗IL-6scFv 13A8(如其他几个scFv)在VH位置H34和H82上具有两个甲硫氨酸。使用上文所述导致亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代甲硫氨酸的简并寡核苷酸引物，通过PCR来取代这些残基。然后用厂家的流程将这些不含甲硫氨酸的scFv(下文表24)转染(Lipofectamine 2000，Invitrogen，Carlsbad，CA)HEK 293细胞，并针对IL-6中和测定得到的72小时上清，与野生型亲本scFv对照上清相比较。几乎所有取代都导致活性的完全保留(图14A-D)。 
表24：所测试的13A8scFv甲硫氨酸取代 
Figure BDA00003166002601131
H34L通常是良好耐受的取代。与含甲硫氨酸的亲本scFv相比，在抗 IL-23人源化的scFv，31A12中，与H34L组合，用不同氨基酸取代H82导致活性的完全保留(图14E)。以相似的方式，与最初的嵌合mAb相比，与H34L组合，用L或V取代45G5H82导致活性的完全保留(图14F)。用H82L和H34L取代9C8人源化scFv中的Met也保留有效活性(图14G)。22H8 scFv在位置H82上天然不具有Met残基。用L或V替换H34上的Met导致有效的IL-23中和活性的完全保留(图14H)。每个领先候选VH区的具体VH突变显示在表25X中，其显示H23-30和H49上的兔回复突变，以及H34和H82甲硫氨酸取代。 
对于每个最终的领先候选scFv，选择亮氨酸作为在H82和H34两个位置上取代的氨基酸。通过按照大肠杆菌优选的那些修饰密码子选择来优化领先候选scFv DNA序列用于在大肠杆菌中表达。此时，研究用于通过甲硫氨酸类似物(如Aha)体内取代的单个Met残基的放置。将通过PCR合成的DNA(如上文所述)克隆入适当的表达载体，如pQE载体。通过DNA序列确认表达载体中的合成DNA基因序列。最后，将表达载体中的合成基因转化入甲硫氨酸营养缺陷型大肠杆菌(如B834)进行重组蛋白质产生。 
表25X：领先人源化兔VH序列的氨基酸突变 
这些突变是回复突变为兔序列(H23-30和H49)或许多VH序列共有 的Met取代(H34、H82)。 
*na指在兔或人序列中不是Met而不需要取代的位置。 
表25A：scFv氨基酸序列 
scFv    AZ_ID SEQ_ID
13A8 scfv大肠杆菌 280
28D2 scfv大肠杆菌 282
31A2 scfv大肠杆菌 284
22H8 scfv大肠杆菌 286
45G5 scfv大肠杆菌 288
表25B：适于大肠杆菌表达的nt序列 
scFv    AZ_ID SEQ_ID
13A8 scfv大肠杆菌 279
28D2 scfv大肠杆菌 281
31A2 scfv大肠杆菌 283
22H8 scfv大肠杆菌 285
45G5 scfv大肠杆菌 287
scFv必须在可以在大肠杆菌中产生蛋白质期间掺入非天然氨基酸(NNAA)的位置上具有单个Met残基。此NNAA将成为生物缀合的特异性位点。选择用于这些产物的NNAA是允许使用铜催化的环加成生物缀合的叠氮基高丙氨酸(Aha)。为了产生含有一个Aha残基的scFv，对用于大肠杆菌表达的含有单个甲硫氨酸密码子的scFv DNA进行密码子优化，合成，并克隆入甲硫氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株，如B384。将细胞培养至对数期，转换为含Aha的无甲硫氨酸培养基，并通过加入1mM IPTG来诱导scFv表达。然后分离含有希望的scFv的包涵体(IB)，该scFv在希望的位置上具有功能性Aha基团。 
据测定，可以在许多可能的位置上将单个甲硫氨酸残基引入scFv，其包括但不限于N端和C端，或连接VL和VH结构域的接头中。构建人源 化28D2的全部三种单Met形式并在大肠杆菌中表达，引入Aha NNAA取代甲硫氨酸残基，并测试功能活性。全部三种形式都保留全部生物学活性(图15)。此外，它们还保留高亲和力。 
表26：在不同位置具有Aha的28D2的亲和力 
scFv Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
28D2 9,18x105 1,002x10-4 109
28D2 N-Aha 1,46x106 8,99x10-4 62
28D2-C Aha 1,45x106 7,60x10-5 52
28D2-L Aha 1,30x106 6,88x10-5 53
实施例7：人源化scFv的PEG化和再折叠 
双特异性制剂总体概述 
通过用接头将两个不同的scFv抗原结合结构域相互缀合来构建双特异性scFv。以两步法实现此策略，其中每个scFv与双功能性接头缀合。包含在双特异性缀合物中的两个scFv各在作为特异性缀合位点的位置上包含单个非天然氨基酸(Aha或其他)。接头可以是同双功能接头或异双功能接头，且含有与包含在scFv中的非天然氨基酸(Aha)反应的互补官能团(炔)。如以下实施例中详述，发明人成功地用该反应方案来成功产生了几种双特异性scFv(下文方案1)。 
用于这些实施例中的接头是PEG(聚乙二醇)。PEG具有希望在最终的双特异性产物中得到并解决scFv所特有的问题的几种化学性质。PEG化改善蛋白质溶解性并提高scFv稳定性，减少scFv聚集和沉淀。此外，已显示PEG化提高scFv双特异性产物的血清半衰期。诸如PEG的长和柔性的接头增加了两个抗体片段的物理分隔，允许它们相互独立地重折叠。这解决了通过遗传融合连接的双特异性抗原结合结构域的重折叠(其常趋向于存在两个结构域的不受控和不希望的交联)中常出现的重要问题之一。 
由于化学合成的灵活性，PEG接头的使用具有附加的优势。PEG可以容易地功能化为与掺入scFv蛋白质中的任意非天然氨基酸互补的反应配偶体。PEG还可以功能化为具有多个缀合位点，其使得能够构建多价蛋 白质杂合。取决于希望的缀合化学，可以用同双功能或异双功能PEG进行PEG功能化。可以使PEG的结构适应于线性或分支变异，其可以影响药物动力学和生物活性。 
用来将scFv与接头缀合的化学品与20种天然氨基酸正交。在scFv-PEG缀合物和双特异性剂的制备中，此处使用氮化物-炔铜介导环加成。在典型顺序中，使包含叠氮基高丙氨酸(Aha)的scFv与用炔功能化的过量同双功能PEG接头反应。纯化单价PEG化材料，然后使PEG接头的自由侧炔与包含Aha的第二scFv进行第二次铜介导的氮化物-炔环加成，产生双特异性剂。 
流程1 
步骤1概述 
制备双特异性剂的第一步是用同双功能(例如二炔)或异双功能(例如至少单炔)PEG位点特异性PEG化含有非天然氨基酸(如叠氮基高丙氨酸(Aha))的scFv。通过一系列CHT和SEC层析纯化单价PEG化scFv，然后进行该方法的第二步。还针对它们重折叠的能力评估单价材料。最后，通过生物测定评价重折叠材料的活性。 
用过量PEG二炔(2-100当量)进行含有非天然氨基酸叠氮基高丙氨酸(Aha)的scFv的PEG化。使用了多种PEG分子量。用于缀合的氮化物-炔环加成由铜(I)介导，铜(I)来自诸如CuI的铜(I)源，或通过用诸如 DTT、半胱氨酸、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、胱胺、三-羧乙基膦的还原剂还原铜(II)源(CuSO4)来衍生。反应混合物中还包含诸如三[(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)的配体。已显示诸如TBTA的配体稳定反应性铜类别，并提高反应产率。通过加入诸如磷酸钠缓冲液、Tris或HEPES的缓冲试剂来将反应pH保持在3-10之间，或可选地保持在6-9之间。可以用诸如SDS的其他赋形剂来增强反应条件和蛋白质动力学。在scFv序列主链中任何地方掺入非天然氨基酸(如Aha)的能力随后使得能够在此预定的位置上发生PEG化。在这些实施例中，在scFv的C端和N端显示了PEG化，但也可以发生在其他规划好的位置。已成功地用此一般化的方法来PEG化几种抗IL-6scFv和抗IL-23scFv。(方案2) 
流程2 
Figure BDA00003166002601181
反应后，可以从未反应的scFv和PEG分离单价PEG化scFv。这防止在随后的双特异性剂制备步骤中形成副产物。为此，通常离心或过滤混合物来去除固体颗粒，并用诸如DTT的过量还原剂处理溶液。然后对溶液进行一系列层析步骤。纯化单价scFv-PEG的第一步是将还原的反应混合物上样在CHT柱上，CHT柱捕获反应的scFv和scFv-PEG产物，但不结合所有未反应的PEG。可以通过磷酸盐从CHT柱洗脱来部分或完全溶解反应的scFv和产物scFv-PEG。混合希望的级分，然后上样在大小排阻柱(SEC)上，大小排阻柱可以分开残留的未反应scFv。SEC后，物质具有足够的纯度用于下一步或进行重折叠实验。 
7.1抗IL-6scFv的缀合 
7.1.128D2c Aha与30kDa PEG缀合 
在具有磁力搅拌子的250mL玻璃烧杯中放入磷酸钠缓冲液(250mM， pH 7.4，7.1mL)和SDS溶液(10％重量/体积，3.3mL)。加入28D2c Aha的溶液(2.81mg/mL，1当量，53mL)和30K PEG炔的溶液(NOF，2mM，60mg/mL，8.7当量，22mL)。迅速加入TBTA三唑配体和碘化铜的DMSO溶液(两种成分均为80mM，2.8mL)来进行沉淀。使混合物静置5分钟，然后开始搅拌。过夜搅拌混合物(18小时)，然后通过SDS-PAGE(还原)和激光光密度测定法来测定，其显示56％的产率。 
将反应混合物倒入50mL离心管并离心(12,000g，10分钟)。将上清倒在DTT(1.5g)上，并在氮气下搅拌1小时。通过CHT和SEC层析的组合来达到纯化。 
7.1.2用PEG二炔PEG化28D2c Aha 
在具有磁力搅拌子的50mL圆底瓶中加入水(9.7mL)和28D2c Aha的溶液(2.58mg/mL，1当量，8.7mL)。向此溶液中加入20K PEG二炔的溶液(3mM，60mg/mL，4当量，1mL)。加入TBTA三唑配体(48mg)，并使溶液静置几分钟。加入碘化铜的DMSO溶液(40mM，DMSO溶液，1.1mL)，盖上圆底瓶，过夜搅拌混合物(16小时)。通过SDS-PAGE(还原)和光密度测定法来分析反应混合物，其显示42％的产率。 
将反应混合物倒入50mL离心管并离心(12,000g，10分钟)。将上清加至DTT(462mg)上，并在氮气下搅拌1小时，然后-20℃保存。 
7.1.3用20K PEG二炔PEG化13A8n Aha 
在具有磁力搅拌子的400mL玻璃烧杯中放入磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.4，14mL)、十二烷基硫酸钠溶液(10％重量/体积，42mL)和二硫苏糖醇溶液(250mM，2.7mL)。加入13A8n Aha的溶液(3mg/mL，1当量，86mL)和20K PEG二炔的溶液(3mM，60mg/mL，26当量，75mL)。加入TBTA三唑配体(537mg)，并使混合物在不搅拌的情况下静置。加入硫酸铜溶液(80mM，6.4mL)，并用铝箔覆盖烧杯。室温下过夜搅拌混合物(16小时)。以激光光密度测定法进行凝胶分析，通过SDS-PAGE(还原)来评价混合物，其显示69％的产率(图16A)。 
将反应混合物倒入离心瓶，离心(10000g，15分钟)。将上清倒入已 加入DTT(3.4g)的250mL瓶中，并在氮气下搅拌1小时。通过在陶瓷羟基磷灰石(CHT-I，Bio-Rad)层析后进行大小排阻层析(SEC)(Superdex 200)来达到进一步纯化。 
7.1.4用20K PEG二炔PEG化13A8c Aha 
在具有螺盖和磁力搅拌子的1000mL玻璃瓶中放入磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝7.4，58mL)、SDS溶液(10％重量/体积，112mL)和二硫苏糖醇溶液(250mM，7.2mL)。向瓶中加入scFv 13A8c Aha的溶液(3.5mg/mL，1当量，206mL)和20K PEG二炔的溶液(3mM，60mg/mL，25当量，200mL)。加入TBTA三唑配体(1.4g)，并使混合物在不搅拌的情况下静置。5分钟后，加入硫酸铜溶液(80mM，17mL)，盖上瓶盖，中等速度过夜搅拌混合物。通过SDS-PAGE(还原)来评价蓝灰色溶液，激光光密度测定法分析测定反应具有70％的产率(图16B)。 
将反应混合物倒入一对离心瓶并离心(10000g，15分钟)。将上清倒入具有螺盖的2L玻璃瓶中。加入DTT(9g)，用氮气覆盖容器，并搅拌1小时。通过实施例7.1.3中的CHT和SEC层析的组合来达到反应混合物的纯化。 
7.1.5用40K PEG二炔PEG化13A8c Aha 
在具有螺盖和磁力搅拌子的500mL聚碳酸酯离心瓶中放入scFv13A8cAHA的溶液(8.8mg/mL，1当量，142mL)、磷酸钠缓冲液(500mM贮存液，pH＝7.4，23mL)和SDS溶液(20％重量/体积贮存液，8.8mL)。将40K PEG二炔(9.35g)作为固体加入搅拌的溶液。搅拌溶液至所有PEG溶解，加入TBTA三唑配体(446mg)，使混合物在不搅拌的情况下静置5分钟。重新开始搅拌，加入新鲜半胱氨酸溶液(250mM贮存液，534uL)。加入硫酸铜溶液(160mM贮存液，2.6mL)，用氮气覆盖混合物，并以中等速度搅拌4小时。取样反应混合物进行SDS-PAGE(还原)，通过激光光密度测定法进行凝胶分析来测定反应产率(51％)(图16C)。 
从反应容器去除搅拌子，高速离心(10000g，15分钟)混合物。将上清倒入500mL聚碳酸酯瓶中。加入DTT(3g)，用氮气覆盖容器，并搅 拌1小时。通过前述实施例中的CHT和SEC层析的组合来完成反应混合物的纯化。 
7.1.6用20K PEG二炔PEG化13A8LAha 
在具有磁力搅拌子的250mL圆底瓶中放入高纯度水(12.5mL)、SDS溶液(10％重量/体积贮存液，17.3mL)和scFv 13A8L AHA溶液(4.11mg/mL贮存液，26.3mL)。向反应混合物中加入20K PEG二炔溶液(3mM，60mg/mL贮存液，30mL)。加入TBTA三唑配体(214mg)，使混合物在不搅拌的情况下静置。重新开始搅拌，加入二硫苏糖醇溶液(250mM贮存液，1.08mL)，然后加入硫酸铜溶液(80mM贮存液，2.53mL)。用隔膜密封圆底瓶，过夜搅拌。次日通过SDS-PAGE(还原)来评价反应混合物。通过激光光密度测定法分析来分析所得到的凝胶，显示60％的反应产率(图16D)。 
将反应混合物转入离心瓶(250mL)并离心(12000g，15分钟)。将上清倒入250mL瓶中，加入DTT(1.5g)。用氮气覆盖容器，并搅拌至固体溶解。通过前述制备中的CHT和SEC层析的组合来达到反应混合物的纯化。 
7.2与抗-IL-23scFv Aha的反应 
7.2.1IL-2331A12c Aha scFv与20kDa PEG-二炔缀合 
在具有螺盖和磁力搅拌子的1000mL玻璃瓶中放入磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝7.4，65mL)、SDS溶液(10％溶液，80mL)和二硫苏糖醇溶液(250mM，5.1mL)。轻轻搅拌溶液，加入IL-23-31A12c Aha溶液(pH＝7.4，4mg/mL，1当量，121mL)和20K PEG二炔溶液(60mg/mL，26当量，142mL)。暂停搅拌，加入TBTA(1.1g)。使材料静置(～5分钟)，加入硫酸铜溶液(80mM，12mL)，并重新开始搅拌。盖上瓶盖，室温下搅拌混合物16小时。通过SDS-PAGE(还原)来分析反应混合物，并通过光密度测定法来分析所得到的凝胶，其显示59％的起始材料转化为希望的PEG化产物(图16B)。 
将反应混合物转入离心瓶(500mL)并离心(10,000g，15分钟)。将 得到的上清转入无菌聚碳酸酯瓶，加入二硫苏糖醇(6.3g)，并在氮气下搅拌溶液1小时。通过实施例7.1.3中所进行的CHT和SEC层析来达到进一步纯化。 
7.2.2用20K PEG二炔PEG化45G5c Aha 
在具有磁力搅拌子的250mL圆底瓶中放入磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.4，74mL)，开始搅拌，加入二硫苏糖醇溶液(250mM，1.9mL)。向搅拌的溶液中加入scFv 45G5c Aha溶液(1.8mg/mL，1当量，53mL)和20K PEG二炔溶液(3mM，60mg/mL，25当量，27mL)。暂停搅拌，加入TBTA三唑配体(382mg)，使混合物静置5分钟。加入硫酸铜溶液(80mM，4.5mL)，用橡胶隔膜盖上瓶子。在最低速设置下过夜搅拌混合物(16小时)。通过SDS-PAGE(还原胶)来测定反应，并通过光密度测定法来分析凝胶，其显示40％的产率(图16E)。 
将反应混合物转入离心瓶，在倾斜转子上离心(10,000g，15分钟)。将得到的上清转入新的聚碳酸酯瓶，加入搅拌子和DTT(2.4g)，并在氮气下搅拌1小时。通过实施例7.1.3中所进行的CHT层析后进行大小排阻层析来达到纯化。 
7.4折叠 
折叠可以这样发生，取变性的scFv-PEG(例如在8M尿素中)，将它交换进入(例如，通过透析或切向流过滤)含有氧化还原系统(例如半胱氨酸/胱氨酸)的部分变性缓冲液(例如3M尿素)中，然后将它交换进入非变性缓冲液(例如磷酸缓冲盐溶液)中。 
7.4.128D2c-PEG的折叠 
折叠了C端缀合30kDa线性PEG二炔的scFv 28D2。先纯化28D2c-PEG，将缓冲液换为含9M尿素和二硫苏糖醇(DTT)、pH 7.2的缓冲液。然后将28D2c-PEG稀释至0.05-1mg/mL蛋白质的起始浓度。然后在室温下将起始材料过夜透析入由3M尿素、30mM Tris pH 8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸组成的第一折叠缓冲液。然后在室温下将材料过夜透析入由20mM磷酸钠和150mM NaClpH 7.4组成的最终缓冲 液。 
通过非还原SDS-PAGE和SEC观察重折叠材料为单体。单体28D2c-PEG的回收在0.05-0.25mg/mL蛋白质的蛋白质折叠浓度下最高。用6∶1至2∶3mM范围内的半胱氨酸∶胱氨酸浓度达到了相似的结果。作为具体实例，用3mM胱氨酸和2mM半胱氨酸在0.1mg/mL蛋白质下折叠材料时，通过SEC测定单体回收为37％，产物的EC50为116pg/mL(图17A)，通过SPR(基本按实施例1.4中进行)测量的结合亲和力在表27中给出。 
表27：通过从尿素透析重折叠的折叠28D2c-PEG的结合亲和力。 
  Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
28D2c-PEG 5.07x105 9.78x10-5 193.3
28D2cAha 1.05x106 7.10x10-5 67.4
折叠还可以这样发生，取变性的scFv-PEG，迅速将它稀释入部分变性缓冲液，然后将它交换入非变性缓冲液。用于此方法的起始材料可以包含在尿素或胍中变性或在SDS中变性的scFV-PEG。 
将含9M尿素和DTT、pH 7.2的缓冲液中的1mg/mL的28D2c-PEG迅速稀释入由3M尿素、30mM Tris pH 8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸组成的第一折叠缓冲液至0.05-0.1mg/mL，然后在室温下在相同的缓冲液中过夜透析。然后在室温下将材料过夜透析入由20mM磷酸钠和150mM NaCl，pH 7.4组成的最终缓冲液。作为具体实例，用2mM半胱氨酸和2mM胱氨酸在0.1mg/mL下折叠材料时，通过SEC测定单体回收为38％，产物的EC50为138pg/mL。 
将含0.1％SDS和DTT、pH 7.25的缓冲液中的0.52mg/mL蛋白质的28D2c-PEG迅速稀释入由3M尿素、30mM Tris pH 8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸组成的第一折叠缓冲液，然后在相同的缓冲液中过夜透析。使用200X稀释，将SDS终浓度降低至0.0005％。可选地，该折叠缓冲液还含有400mM精氨酸/或150mM NaCl。备选地，该折叠缓冲液包含2mM谷胱甘肽和2mM氧化谷胱甘肽代替半胱氨酸/胱氨酸。然后将 材料在5℃透析3天，进入由20mM磷酸钠和150mM NaCl，pH 7.4组成的最终缓冲液。然后用Millipore Centriprep浓缩器(10,000MWCO)将材料浓缩20倍。 
作为具体实例，在用3mM胱氨酸和2mM半胱氨酸折叠材料时，通过SEC测定单体回收为20％，产物的EC50为256pg/mL。通过SPR测定了这些样品的IL-6结合动力学，并在表28中给出。(SPR基本按实施例1.4中进行) 
表28：通过从SDS迅速稀释重折叠的28D2c-PEG的结合亲和力。 
  Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
28D2c-PEG 3.26x105 1.04x10-5 319.4
还可以通过从在胍中变性的起始材料交换和/或稀释来发生。在含6M盐酸胍和DTT、pH 8.0的缓冲液中制备28D2c-PEG。然后将材料透析入(或迅速稀释，然后透析入)折叠缓冲液，然后透析入PBS。折叠缓冲液中的蛋白质浓度为0.05-0.25mg/mL，且折叠缓冲液由3M尿素、30mM TrispH 8.5、2mM半胱氨酸和2mM胱氨酸组成。可选地，折叠缓冲液还含有400mM精氨酸，且还可选地含有150mM NaCl。作为具体实例，在蛋白质浓度为0.25mg/mL时，通过SEC测定单体回收为22％，产物的EC50为150pg/mL。 
7.4.2 其他PEG化scFv的折叠 
还通过相似的方法折叠了N端或C端缀合20kDa线性PEG的scFv13A8n、13A8c、13A8L和31A12c。在含8M尿素和DTT的缓冲液中制备scFv-PEG，并稀释至0.05-0.5mg/mL总蛋白质。然后在室温下将它们透析入含3M尿素、30mM Tris pH 8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸的折叠缓冲液。备选地，还可以使用pH 8或9、4M或2M尿素、1％多乙氧基醚和/或4℃透析。还可以通过透析入不含尿素、加入或不加入多乙氧基醚的折叠缓冲液中来折叠蛋白质。通过透析入PBS或含氧化还原系统(2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸)的PBS来完成折叠。具体实例在表29中给出。 
表29 
Figure BDA00003166002601251
*通过SDS PAGE测定13A8L回收 
蛋白质在0.05-0.1mg/mL下折叠的回收最佳。在折叠缓冲液中不存在尿素的情况下折叠31A12c-PEG导致产物中存在更多二硫键连接的高分子量种类。评估PEG化scFv在不同温度下的稳定性，并与哺乳动物表达的非PEG化scFv相比较。两个PEG化种类(13A8c-PEG和31A12c-PEG)在13-20天的时期内保留其全部活性(图17B和17C)。 
PEG化scFv的Tm测量结果进一步确认了这些分子的稳定性。发现31A12-PEG具有69.9℃的Tm。发现13A8-PEG具有66.1℃的Tm。 
7.4.3非PEG化scFv的折叠 
可以用相似的折叠方法来折叠非PEG化scFv[例如13A8c和22H8c]。如果希望，这些方法可以用来折叠缀合前的蛋白质。作为具体实例，以0.1mg/mL的总蛋白质浓度在含3M尿素、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸和30mM Tris pH 8.5的折叠缓冲液中折叠3个批次的13A8c，然后透析入PBS。折叠流程可重现，通过SDS-PAGE测定来自三个批次的单体13A8c回收产率分别为37％、35％和44％。与亲本mAb相比，重折叠的非PEG化22H8c scFv保留高效价。 
实施例8：scFv-PEG-scFv双特异性抗IL-6/IL23缀合物的产生 
产生抗IL-6/抗IL-23scFv缀合物的下一步是将包含非天然氨基酸(如Aha)的scFv与实施例7中制备的scFv-PEG炔缀合物缀合。缀合反应后， 通过层析组合来纯化混合物，然后进行重折叠过程来产生希望的scFv-PEG-scFv双特异性剂。评估最终的材料的生物活性和药物动力学性质，以及在疾病模型中的功效。 
双特异性剂制备中的第二个化学步骤是将纯化的单价(scFv-PEG)与第二scFv缀合。通过使单价scFv-PEG的自由侧炔经铜介导的Huisgen环加成与第二scFv的Aha反应来达到偶联。成功制备了几种单价scFv-PEG缀合物，可以使用抗-IL-6-scFv-PEG或抗-IL-23scFv-PEG。同样，含有Aha的蛋白质可以是抗-IL-6scFv或抗-IL-23scFv。 
对于第二反应，反应条件与第一步骤中铜介导的环加成不同。在步骤一中，反应条件利用过量PEG二炔和诸如SDS的添加剂来辅助反应。但是，使用过量的炔在经济上不可行，或从纯化角度看不希望。因此，第二步骤使用比例更为紧缩的炔和氮化物(炔∶氮化物为1∶1至1∶3)反应成分。此外，发现第二步缀合在更高稀释度下进行得最好。此外，最后放弃了用于该方法第一步的TBTA三唑配体。 
通过类似于实施例7中所使用的层析组合来进行反应混合物的纯化。先将反应混合物上样在CHT柱上，并用磷酸盐梯度洗脱。混合希望的级分，然后上样在SEC柱上。然后为折叠条件进一步处理此材料。 
在本文所述方法中，缀合先于折叠。PEG接头的存在便于随后的重折叠步骤，scFv独立地重折叠，具有最小的链间交联。 
8.1抗IL-23、抗IL-6双特异性31A12c-PEG-28D2c的制备 
在具有磁力搅拌子的1L玻璃烧杯中放入磷酸钠缓冲液(125mM，pH7.4，486mL)。加入28D2c Aha溶液(4.2mg/mL，5.1mL)和31A12c-PEG溶液(0.49mg/mL，44mL)。加入TBTA三唑配体和碘化铜的溶液(两种成分为80mM，16mL)，形成沉淀。过夜搅拌混合物(16小时)。通过SDS-PAGE(还原)和光密度测定法来分析反应混合物(产率＝29％)。 
将反应混合物分入两个离心瓶(500mL)，离心(10000g，30分钟)，弃上清。向一个瓶中加入SDS溶液(8％重量/体积)、TPPTS溶液(含500mM TPPTS的1M HEPES，pH 7.4，25mL)和磷酸钠缓冲液(10mM， 25mL)。垂下并涡旋瓶子直至材料溶解或完全悬浮。将内容物转入第二离心瓶/沉淀，用2份磷酸钠缓冲液(10mM，12.5mL)漂洗第一离心瓶。涡旋第二离心瓶直至沉淀溶解。将材料离心(10,000g，5分钟)。保留上清用于进一步纯化。 
8.2抗IL-23、抗IL-6双特异性31A12c-PEG-13A8c的制备 
向具有螺盖和小号搅拌子的2000mL玻璃瓶中加入水(814mL)和二硫苏糖醇溶液(250mM，12mL)，轻轻搅拌。加入scFv 13A8c Aha溶液(0.85mg/mL，35mL)，然后加入31A12c-PEG缀合物溶液(0.55mg/mL，55mL)。加入MES缓冲液(80mM，pH 7.5，56mL)和硫酸铜(80mM，28mL)。盖上瓶子，以最慢搅拌速度过夜搅拌混合物(16小时)。通过SDSPAGE(还原)和光密度测定法来分析反应物，其显示51％的产率。以相似的产率同时进行另外两个1000mL反应。 
将部分混合反应混合物(3000mL)倒入离心瓶(每个250mL瓶～200mL)，并在旋桶式离心机中离心(Sorvall RC-3BP，5000g，15分钟)。弃上清。向沉淀中加入另外的混合反应混合物，并再次离心。重复该顺序，直至处理完所有反应混合物。向沉淀中加入600mL以下缓冲液：10mM磷酸pH＝7.4、2％SDS和250mM DTT。加入搅拌子，搅拌混合物30分钟，然后加温至50℃5分钟，然后在室温下搅拌。用玻璃棒破碎固体。加入TPPTS(Strem，350mM，pH 7.6，25mL)，搅拌混合物1小时，此时所有固体溶解。将材料进一步纯化。用陶瓷羟基磷灰石(CHT-I，BioRad)层析和大小排阻(Superdex 6 prep)层析来纯化双特异性产物。 
8.3抗IL-23、抗IL-6双特异性13A8c-PEG-31A12c的制备 
在配有磁力搅拌子的2000mL螺盖玻璃瓶中放入水(830mL)，加入二硫苏糖醇溶液(250mM，12mL)，同时轻轻搅拌溶液。加入scFv31A12cAha溶液(0.88mg/mL，45mL)和13A8c-PEG缀合物溶液(0.7mg/mL，30mL)。加入MES缓冲液(80mM，56mL)和硫酸铜溶液(80mM，28.1mL)，盖上瓶子。轻轻连续过夜搅拌。反应混合物的SDS PAGE分析和光密度测定法显示48％的产率。该反应与另外两个1L反应和另外 七个500mL反应同时进行，平均产率为49％(图18A)。 
按以下处理混合的6500mL反应体积。在两个离心瓶(500mL)中每瓶放入约450mL反应混合物。在转桶式离心机中离心(5000g，15分钟)。弃上清，向每个收集离心瓶中加入另外的反应混合物，并再次离心材料。重复该顺序，直至将所有混合的反应体积离心，保留沉淀(x2)。向每瓶中加入搅拌子和以下缓冲液(700mL)：250mM DTT、2％SDS、10mM磷酸钠缓冲液。室温搅拌30分钟。放入水浴(40℃)，搅拌10分钟。再搅拌30分钟，此时无固体残留。混合两个溶液，然后上样在CHT柱上。用磷酸盐梯度洗脱。混合希望的级分，通过大小排阻柱进一步纯化。 
8.4抗IL-23、抗IL-6双特异性13A8n-PEG-31A12c的制备 
在配有小号磁力搅拌子的2000mL螺盖玻璃瓶中放入水(640mL)和DTT溶液(250mM，9.6mL)。向此混合物中加入31A12cAha溶液(0.88mg/mL，27mL)和13A8c-PEG缀合物溶液(0.42mg/mL，56mL)。加入MES缓冲液(80mM，45mL)和硫酸铜溶液(80mM，23mL)，盖上瓶子。以最低搅拌速度轻轻过夜搅拌混合物(16小时)。SDS-PAGE和光密度测定法显示47％的产率。按之前所述同样地制备另外两个反应，并通过凝胶分析得到分别为51％和47％的产率。 
组合三个反应体积并按以下处理。在两个离心瓶(250mL)中每瓶放入约200mL反应混合物。在转桶式离心机中离心(5000g，15分钟)。弃上清，向每个收集离心瓶中加入另外的反应混合物，并再次离心材料。重复该顺序，直至将来自三个反应的所有反应混合物离心，保留沉淀。向每瓶中加入搅拌子和以下缓冲液(220mL)：250mM DTT、2％SDS、10mM磷酸钠缓冲液。室温搅拌30分钟。放入水浴(40℃)，搅拌10分钟。固体残留。从水浴取出，加入TPPTS溶液(250mM，pH＝7.4，5mL)。搅拌(1小时)，此时无固体残留。混合溶液，然后上样在CHT柱上。用磷酸盐梯度洗脱材料，得到双特异性剂和附加蛋白质成分的半纯化混合物。通过SEC进一步纯化，得到希望的双特异性产物。 
8.5抗IL-12/23、抗IL-6双特异性13A8n-PEG-45G5c的制备 
在具有大号磁力搅拌子的2000mL玻璃烧杯中放入水(898mL)和DTT溶液(250mM，12mL)。加入45G5cAha溶液(0.9mg/mL，33mL)和13A8n-PEG溶液(0.98mg/mL，30mL)。加入硫酸铜溶液(80mM，28mL)，并过夜搅拌混合物(16小时)。与前述反应平行进行第二个相同的反应。通过SDS-PAGE(还原)和光密度测定法来评估反应混合物(反应1产率24％，反应2产率25％)(图18B)。 
将约400mL反应混合物倒入离心瓶(500mLx2，使两个反应混合物保持分开)。放入转桶式离心机中离心(5000g，15分钟)。弃上清。重复该顺序，直至处理完全部反应混合物，只留下沉淀。向沉淀中加入以下缓冲液(200mL)：20mM磷酸钠缓冲液、2％SDS、250mM DTT。轻轻搅拌30分钟。在水浴(40℃)中加温搅拌10分钟。回到室温，搅拌至固体溶解。将减少的材料混合，通过CHT和SEC层析来达到进一步纯化。 
8.6抗IL-12/23、抗IL-6双特异性13A8c-PEG-22H8的制备 
在具有螺盖和磁力搅拌子的2000mL瓶中放入水(950mL)和DTT溶液(250mM，14mL)，轻轻搅拌。向此搅拌溶液中加入scFv 22H8cAha溶液(0.75mg/mL，60mL)和13A8c-PEG缀合物溶液(0.69mg/mL，35mL)。加入MES缓冲液(80mM，65mL)和硫酸铜溶液(80mM，32mL)，盖上瓶子，过夜搅拌混合物。SDS PAGE分析和光密度测定法显示60％的产率(图18C)。同时进行另外5个相同比例的1150mL反应，平均产率为54％。 
与之前所述类似地处理组合的6900mL反应体积。在两个500mL离心瓶(500mL)中放入约450mL(x2)反应体积。在转桶式离心机中离心混合物(5000g，15分钟)。弃上清，向每个收集离心瓶中加入另外的反应混合物，并再次离心。重复该步骤，直至处理完全部6900mL。向每个沉淀中加入以下缓冲液(700mL)：250mM DTT、2％SDS、10mM磷酸钠缓冲液。室温搅拌30分钟。用药勺破碎固体，重新开始搅拌1小时。组合两个溶液，上样在CHT柱上，通过磷酸盐梯度洗脱。通过SEC层析来达到半纯化的双特异性剂的进一步纯化。 
8.7 抗IL-23、抗IL-6双特异性13A8c-40KPEG-31A12c的制备 
在配有磁力搅拌子的5000mL螺盖玻璃瓶中放入磷酸钠缓冲液(5mM贮存液，2100mL)。加入单价中间体13A8c-40KPEG溶液(0.34mg/mL贮存液，138mL)和scFv 31A12cAHA溶液(3.2mg/mL贮存液，26.1mL)。加入MES缓冲液(80mM贮存液，141mL)和二硫苏糖醇溶液(250mM贮存液，12mL)，同时轻轻搅拌溶液。加入硫酸铜溶液(80mM贮存液，70mL)，盖上瓶子，轻轻连续过夜搅拌。反应混合物的SDS PAGE分析和光密度测定法显示58％的产率。该反应与另外两个2.5L反应和另外一个1.0L反应同时进行，平均产率为58％(图18D)。 
离心混合的8500mL反应体积来收集所有固体。将固体溶解在以下处理缓冲液(1700mL)中：250mM DTT、2％SDS、10mM磷酸钠缓冲液。通过CHT和SEC层析的组合来纯化最终的溶液。 
8.8抗IL-23、抗IL-6双特异性31A12c-20KPEG-13A8L的制备 
在具有磁力搅拌子的8x30mM管中放入水(87uL)和MES缓冲液(80mM贮存液，5.6uL)。向此管中加入31A12c-20KPEG溶液(0.550mg/mL贮存液，3.8uL)和scFv 13A8LAHA溶液(4.11mg/mL贮存液，0.95uL)。加入DTT溶液(250mM贮存液，1.2uL)和硫酸铜溶液(80mM贮存液，2.8uL)，盖上管，使管在室温下过夜搅拌。次日取样反应混合物进行SDS-PAGE。通过激光光密度测定法来分析所得到的凝胶，显示双特异性剂的产率为37％(图18E)。 
8.9双特异性scFv的折叠 
通过与上文给出的那些相似的方法来折叠经线性20kDa PEG接头与13A8缀合的31A12(二者都在C端缀合)。按0.05-0.1mg/mL的总蛋白质在含8M尿素和DTT、pH 7.3的缓冲液中制备该双特异性分子。除双特异性分子外，此阶段的材料可以包含某个量的残留的未反应31A12-PEGscFv。然后通过在室温下过夜透析入3M尿素、30mM Tris pH 8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸来折叠材料。可选地，还向折叠缓冲液中加入1％多乙氧基醚、500mM Tris或500mM精氨酸，或者可以在4℃进行折叠。 进一步将折叠反应透析入20mM磷酸钠、150mM NaCl，pH 7.4(PBS)。作为具体实例，在室温下在3M尿素、30mM Tris pH 8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中重折叠4个批次的0.1mg/mL 31A12c-PEG-13A8c，然后透析入PBS。重折叠流程可重现，产生相似的单体双特异性scFv回收产率和EC50(表30，图19A和19B)。回收单体蛋白质，与亲本分子相比，得到的分子保留高生物活性。重要地，折叠在高量31A12c-PEG scFv的存在下也可进行。此外，表面等离振子共振数据进一步确认了双特异性剂的两端对IL-6(13A8)和IL-23(31A12)两个靶标的生物活性(表31)。 
表30：来自不同批次的单体双特异性scFv回收和EC50。 
Figure BDA00003166002601311
表31：31A12c-PEG-13A8c双特异性剂的结合亲和力。 
  Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
对IL-6的亲和力 2.9x105 5.14x10-5 214.9
对IL-23的亲和力 7.73x105 7.11x10-5 91.8
将用20kDa线性PEG接头制备的双特异性剂的体内药物动力学与裸scFv的PK相比较。scFv单独非常快地排出，终端t1/2为约2小时，Cmax为500pg/ml，tmax为1-2小时，8小时内几乎完全清除(图20A)。双特异性剂显示长得多的体内半衰期，终端t1/2为约24小时，Cmax为1500pg/ml，tmax为24小时，100小时时血清中有可检测的水平(图20B)。双特异性scFv的药物动力学行为的这种改善将使它成为比简单的scFv更强力和有效的治疗剂。 
相同的折叠方法可以用于PEG化的双特异性13A8n-PEG20-31A12c(在13A8的N端而不是C端PEG化)。在3M尿素、30mM Tris pH 8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中折叠2个批次的0.1mg/mL的蛋白质， 然后透析入PBS。两个批次都产生通过SEC的＞95％的单体回收，与哺乳动物衍生的13A8 scFv的59pg/ml的EC50相比，双特异性剂中和IL-6的EC50分别为1674和1691pg/mL(图21)，中和IL-23的EC50分别为4956和3249pg/mL。单体蛋白质以良好的产率回收。 
8.8其他双特异性scFv构建体的重折叠 
通过与用于基于31A12的双特异性剂的那些相似的方法来折叠13A8n-PEG-45G5c。在3M尿素、30mM Tris pH 8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中折叠0.1mg/mL的蛋白质，然后透析入PBS。这产生通过SEC的29％的单体回收，对IL-6的EC50为933pg/mL，对IL-23的EC50为5,662pg/mL(图22A和B)。 
通过与以上类似的方法来折叠13A8c-PEG-22H8c。在含8M尿素和DTT的缓冲液中制备13A8c-PEG-22H8c，并稀释至0.05-0.1mg/mL总蛋白质。然后在室温下将它们透析入含3M尿素、30mM Tris pH 8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸的折叠缓冲液中。备选地，还可以使用pH 8或9、0.01-1％多乙氧基醚和/或4℃透析。通过透析入PBS来完成折叠。作为具体实例，在室温下在3M尿素、30mM Tris pH 8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸、0.05％多乙氧基醚中折叠0.1mg/mL的13A8c-PEG-22H8c，然后透析入含0.05％多乙氧基醚的PBS中。这产生通过SEC的35％的单体回收，中和IL-6的EC50为246pg/mL，中和IL-23的EC50为234pg/mL(图23A和B)。 
通过与用于20K双特异性剂的那些相似的方法来折叠13A8c-40KPEG-31A12c。在4℃下在3M尿素、30mM Tris pH 8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中折叠0.1mg/mL的蛋白质，然后在4℃下透析入PBS中。这产生通过SEC的56.3％的回收，对IL-6的EC50为137.5pg/mL，对IL-23的EC50为2699pg/mL(图24A和B)。此外，还可以通过在室温和4℃二者下透析入含0.5M盐酸胍的重折叠缓冲液来在更高浓度(0.5mg/mL)下重折叠13A8c-40KPEG-31A12c。 
将13A8c-40KPEG-31A12c双特异性剂的体内药物动力学与 13A8c-20KPEG-31A12c、13A8c-PEG和裸28D2的PK相比较(图25A和B)。按1mg/kg(双特异性剂和裸scFv)或0.5mg/kg(13A8c-PEG)在大鼠中皮下施用测试制品。给药后定期采血，用B9 IL-6中和测定针对测试制品的存在测定血清。结果显示，裸scFv快速清除，而双特异性剂和13A8c-PEG具有显著更长的半衰期和AUC。相对于13A8c-20KPEG-31A12c，13A8c-40KPEG-31A12c还显示显著增强的AUC(图25B)。 
重折叠的双特异性缀合物显示了优良的稳定性，在4℃下至多为6个月。13A8-PEG-31A12双特异性剂在抗IL-6和抗IL-23两种测定中显示一致的效价。在SDS-PAGE分析或SEC层析中观察到非常少的降解。 
Figure BDA00003166002601331
实施例9：体外测量的双特异性scFv对Th17和Th22细胞的产生的作用 
可以通过用抗-CD3加抗CD28刺激全PBMC或纯化的T细胞，或通过混合淋巴细胞培养物中的异源细胞来使Th17和Th22T细胞亚群在体外分化(图26A)。这类T细胞的分化还需要加入尤其是针对Th17细胞良好表征的许多关键的调节细胞因子。这些调节细胞因子主要衍生自髓样细胞，它们的加入可以用髓样细胞连同刺激那些细胞释放它们的调节细胞因子的化合物的加入来代替。用LPS与抗CD3一起刺激全PBMC来分化为Th17细胞。在还加入IL-1和TGFβ时获得最佳结果，因为许多研究人员之前已显示这些衍生自髓样细胞的细胞因子促进Th17从纯化的幼稚T细胞分化。加入刺激物来诱导髓样细胞释放它们的调节细胞因子，Th17和Th22T细 胞还可以在异源混合淋巴细胞培养物(MLC)中分化。向MLC中加入肽聚糖作为刺激物，因为已知它诱导IL-1、IL-6、TNF及其他调节细胞因子和促炎症细胞因子的分泌。在目的是研究Th22细胞的诱导时，还需要加入IL-2。用抗CD3/28加LPS和TGFβ刺激PBMC。5天后，用PMA+洛诺霉素再刺激它们来诱导细胞因子分泌，并通过流式细胞术来分析IL-17的表达。PBMC培养物中Th17细胞的百分比由于这些培养条件而提高三倍(图26B)。IL-6的包含与IL-23拮抗剂组合阻止Th17细胞提高三倍。在抗CD3/28刺激中还观察到Th22细胞(图26C)。用异源白细胞体外刺激体外人T细胞也诱导高水平的产生IL-17的T细胞(图26D)。 
单种IL-6和IL-23拮抗剂的加入抑制抗CD3/28培养物系统中的Th17和Th22分化。31A12和13A8 scFv这2种拮抗剂的组合比两种拮抗剂中任一种单独更有效(图27)。通过与前一实验相同的拮抗剂来抑制MLC中的Th17的情况也如此(图28)。在抑制MLC中的Th17细胞中，13A8c-20kPEG-31A12c双特异性剂比亲本嵌合mAb 13A8和31A12的组合更有活性，且比两种mAb中任一种单独更好(图29)。这证明了通过使用本发明的二价双特异性构建体获得的有益作用。 
实施例10：体内测量的scFv对Th17和Th22细胞的产生的作用 
为了在体内评价TH17和TH22分外的抑制，利用了异种移植模型，其中将人造血干细胞移植入免疫缺陷小鼠，免疫缺陷小鼠转而获得人免疫系统。用与植入小鼠的人免疫细胞异源的人皮肤移植这些人源化NOD-scidIL2rgnull(NSG)小鼠(图30)。然后用IL-6和IL-23的PEG化scFv拮抗剂(13A8c-PEG和31A12c-PEG)的混合物处理它们。然后人免疫系统将通过人T细胞分化为效应细胞来排斥此异源人皮肤。IL-6和IL-23拮抗剂抑制Th17细胞的分化，Th17细胞的分化是异源皮肤移植的一个结果，但这些拮抗剂不抑制皮肤异源移植的排斥，反映了它们的靶向免疫抑制作用。简言之，照射新生NSG小鼠，注射衍生自脐带血的人造血干细胞，然后在第12周针对外周血中的移入水平进行筛选(Brehm等，2010)。用人异源皮肤移植成功移入的小鼠，并每2天接受100μg抗IL-6和抗IL-23 (13A8c-PEG和31A12c-PEG)。皮肤移植后30天，回收脾，用PMA/洛诺霉素刺激单细胞悬液，并测定胞内细胞因子。通过流式细胞术分析CD3+/CD4+细胞的IL-17和IL-22产生。 
在未用细胞因子拮抗剂处理的小鼠中，如流式细胞术图谱(图31A)中和代表各亚群中的Th细胞数的汇编数据(图31B)中所示，出现非常显著的TH17和TH22细胞水平。皮肤移植后用抗IL-6(13A8c scFv-PEG)和抗IL-23(31A12c-PEG)的组合处理小鼠30天。处理的小鼠中TH17和TH22细胞的分化完全被抑制。这些数据首次清楚地显示，IL-6和IL-23为这些TH17和TH22细胞的体内分化所需。此外，这些数据将此动物模型确认为能够引起和调节人T细胞分化的模型。最后，这些数据显示了此处使用的IL-6和IL-23拮抗剂在体内完全抑制这些细胞因子的作用的有效性。 
用13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23双特异性剂获得了相似的结果。如图32A-C中所示，双特异性分子在抑制Th17分化上比单价抗IL-23试剂更有效。但是，图32D-L显示双特异性剂并非广泛地免疫抑制，因为TH17/22以外的细胞类型的白细胞标志未显著减少。 
实施例11：体内银屑病模型中测量的scFv对Th17和Th22细胞效应子功能的作用 
为了在炎症部位评价Th17效应子功能的抑制，使用了scid/hu银屑病模型，其中将人银屑病皮肤移植到免疫缺陷的scid小鼠上。皮肤移入和银屑病炎症持续至多2个月。用药物处理小鼠两周，通过组织学分析来测量对炎症的作用，如图33中所示，其中可以在表皮厚度的显著减少中清楚地观察到13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23双特异性剂的作用。还可以从组织切片定量该作用。如通过病理学家在移植物仍在小鼠上时的半定量临床评分(图34A)、或通过上述组织切片中表皮厚度的定量测量(图34B)来测定，13A8c-20kPEG-31A12c与它的单价抗IL-6抑制剂成分或与IL-6拮抗剂mAb(Tocilizumab(Actemra))的比较显示3A8c-20kPEG-31A12c显著优于两种IL-6拮抗剂中任一种单独。此外， 13A8c-20kPEG-31A12c比TNF拮抗剂Enbrel更快发挥作用来抑制炎症(图34C-D)。 
实施例12：体内测量的双特异性scFv对IL-23介导的耳炎的产生的作用 
将人IL-23皮内注射入小鼠耳时，IL-23将引起炎症，因为人IL-23可以作用于小鼠IL-23受体。通过用IL-23每天注射耳、注射4天来测量13A8c-PEG-31A12c抑制人IL-23诱导的耳炎的能力。然后测量耳肿(图35A)。在IL-23处理开始前一天和IL-23处理开始后一天开始处理小鼠，此处理有效阻断耳肿(图35B)。如图35C中所示，13A8c-PEG-31A12c至少与IL-12/23拮抗剂mAb，Stelera(Ustekinumab)一样有效。重要地，即使仅在IL-23处理开始前一天施用时，用13A8c-PEG-31A12c(用20kDaPEG或40kDa PEG制备)处理小鼠也是非常有效的耳肿抑制剂(图35D)。 
实施例13：AZ17的IL-23特异性scFv成分的表位作图 
31A12mAb结合之前未描述过的独特表位。虽然31A12和49B7对IL-23抑制特异而不抑制人IL-12(图36B)，但使用的所有mAb都与人IL-12结合(图36B)。这些数据清楚地显示，这些mAb与p40链结合。与还抑制IL-12的22H8相比，31A12和49B7与人IL-12相对弱地结合。但是，全部三种mAb都与猴IL-12强烈结合(图36B)，且还抑制猴IL-12生物活性(图36C)。因此，31A12和49B7区分人和猴IL-12活性。31A12和49B7似乎结合在人IL-12中部分遮蔽，而在猴IL-12以及来自两个物种的IL-23中暴露的p40表位。此外，AZ17不抑制Ustekinumab的结合，Ustekinumab是抑制人IL-12和IL-23二者的p40特异性mAb。 
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Claims (122)

1.二价双特异性构建体，其包含抗-IL-6抗体或其衍生物，和抗-IL-23抗体或其衍生物。
2.权利要求1的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物是或衍生自单克隆抗体，和/或所述抗-IL-23抗体或其衍生物；是或衍生自单克隆抗体。
3.权利要求2的二价双特异性构建体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
4.权利要求2的二价双特异性构建体，其中所述单克隆抗体是嵌合抗体。
5.权利要求4的二价双特异性构建体，其中所述嵌合抗体包含人源化构架区。
6.权利要求1-4中任一项的二价双特异性构建体，其包含抗-IL-6抗体的衍生物，和/或抗-IL-23抗体的衍生物，其中所述衍生物可以包含整个可变区、可变区的重链(VH)、可变区的轻链(VL)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb或互补决定区(CDR)。
7.权利要求6的二价双特异性构建体，其中所述衍生物是scFv。
8.权利要求1-8中任一项的二价双特异性构建体，其中已修饰所述抗-IL-6抗体或其衍生物，和/或所述抗-IL-23抗体或其衍生物来掺入至少一个非天然氨基酸。
9.权利要求1-8中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列YIYTDX1STX2YANWAKG(SEQ IDNO.335)的CDR2区，其中：
X1选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；和
X2选自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和
优选地，X1是丝氨酸或苏氨酸，而X2是色氨酸或酪氨酸。
10.权利要求1-9中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列RX1STLX2S(SEQIDNO.336)的CDR5区，其中X1和X2独立地是丙氨酸或苏氨酸。
11.权利要求1-10中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.10-15的CDR区。
12.权利要求1-11中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物的重链包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.10-12的CDR区。
13.权利要求1-12中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物的轻链包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.13-15的CDR区。
14.权利要求1-13中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含SEQIDNO.10-15的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物的重链包含SEQIDNO.259。
16.权利要求1-14中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物的轻链包含SEQIDNO.261。
17.权利要求1-16中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物是scFv。
18.权利要求1-17中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物是包含以下的scFv：
(i)含有至少一个具有选自SEQIDNO.10-12的序列的CDR的重链；和
(ii)含有至少一个具有选自SEQIDNO.13-15的序列的CDR的轻链。
19.权利要求1-18中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物是包含以下的scFv：
(i)含有SEQIDNO.259的氨基酸序列的重链；和
(ii)含有SEQIDNO.261的氨基酸序列的轻链。
20.权利要求1-19中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列与选自SEQIDNO.10-15的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。
21.权利要求1-20中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列含有对选自SEQIDNO.10-15的氨基酸序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。
22.权利要求21的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列含有对选自SEQIDNO.10-15的氨基酸序列的一个或多个保守氨基酸取代。
23.权利要求1-22中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区与具有对应于SEQIDNO.10-15的氨基酸序列的CDR的抗-IL-6抗体结合相同的表位。
24.权利要求1-23中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物选自或衍生自13A8、9H4、9C8、8C8、18D4和28D2。
25.权利要求1-24中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列YYAX1WAX2G(SEQIDNO.337)的CDR2区，其中：
X1选自丝氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；和
X2选自赖氨酸和谷氨酰胺。
26.权利要求1-25中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列AX1TLX2S(SEQIDNO.338)的CDR5区，其中：
X1选自丝氨酸和丙氨酸；
X2选自丙氨酸和苏氨酸。
27.权利要求1-26中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.90-95的CDR区。
28.权利要求1-27中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物的重链包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.90-92的CDR区。
29.权利要求1-28中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物的轻链包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.93-95的CDR区。
30.权利要求1-29中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含SEQIDNO.90-95的氨基酸序列。
31.权利要求1-30中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物的重链包含SEQIDNO.267。
32.权利要求1-31中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物的轻链包含SEQIDNO.269。
33.权利要求1-32中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物是scFv。
34.权利要求1-33中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物是包含以下的scFv：
(i)含有至少一个具有选自SEQIDNO.90-92的序列的CDR的重链；和
(ii)含有至少一个具有选自SEQIDNO.93-95的序列的CDR的轻链。
35.权利要求1-24中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物是包含以下的scFv：
(i)含有SEQIDNO.267的重链；和
(ii)含有SEQIDNO.269的轻链。
36.权利要求1-35中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列与选自SEQIDNO.90-95的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。
37.权利要求1-35中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列含有对选自SEQIDNO.90-95的氨基酸序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。
38.权利要求37的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列含有对选自SEQIDNO.90-95的氨基酸序列的一个或多个保守氨基酸取代。
39.权利要求1-38中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区与具有对应于SEQIDNO.90-95的氨基酸序列的CDR的抗-IL-23抗体结合相同的表位。
40.权利要求1-39中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物选自或衍生自31A12、34E11、35H4、49B7和16C6。
41.权利要求1-24中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物还能够抑制IL-12(即抗-IL-23/IL-12抗体)。
42.权利要求41的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列WX1KG(SEQIDNO.358)的CDR2区，其中X1是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，且优选是丙氨酸或缬氨酸。
43.权利要求42的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列YAYX1GDAFDP(SEQIDNO.339)的CDR3区，其中X1是丙氨酸或异亮氨酸。
44.权利要求42的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列SDYFNX1(SEQIDNO.340)的CDR3区，其中X1是异亮氨酸或缬氨酸。
45.权利要求41-44中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列QX1SQX2(SEQIDNO.359)的CDR4区，其中：
X1是丙氨酸或丝氨酸；和
X2选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；
优选地，X2是丝氨酸或苏氨酸。
46.权利要求41-45中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列ASX1LA(SEQIDNO.341)的CDR5区，其中X1是赖氨酸或苏氨酸。
47.权利要求41-46中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含含有氨基酸序列QSYYDX1NAGYG(SEQIDNO.342)的CDR6区，其中X1是丙氨酸或缬氨酸。
48.权利要求41-47中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.140-145的CDR区。
49.权利要求41-48中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的重链包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.140-142的CDR区。
50.权利要求41-49中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的轻链包含至少一个氨基酸序列选自SEQIDNO.143-145的CDR区。
51.权利要求41-50中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物包含SEQIDNO.140-145的氨基酸序列。
52.权利要求41-51中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物的重链包含SEQIDNO.271。
53.权利要求41-52中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23抗体或其衍生物的轻链包含SEQIDNO.273。
54.权利要求41-53中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-p40抗体或其衍生物是scFv。
55.权利要求41-54中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物是包含以下的scFv：
(i)含有至少一个具有选自SEQIDNO.140-142的序列的CDR的重链；和
(ii)含有至少一个具有选自SEQIDNO.143-145的序列的CDR的轻链。
56.权利要求41-55中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物是包含以下的scFv：
(i)含有SEQIDNO.271的重链；和
(ii)含有SEQIDNO.273的轻链。
57.权利要求41-56中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列与选自SEQIDNO.140-145的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。
58.权利要求41-57中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列含有对选自SEQIDNO.140-145的氨基酸序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。
59.权利要求58的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区的氨基酸序列含有对选自SEQIDNO.140-145的氨基酸序列的一个或多个保守氨基酸取代。
60.权利要求41-59中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物包含至少一个CDR区，该CDR区与具有对应于SEQIDNO.140-145的氨基酸序列的CDR的抗-IL-23/IL-12抗体结合相同的表位。
61.权利要求41-60中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物选自或衍生自22H8、45G5、14B5、4F3、5C5和1H1。
62.权利要求1-61中任一项的二价双特异性构建体，其中所述抗-IL-6抗体或其衍生物，和所述抗-IL-23抗体或其衍生物二者都掺入一个或多个非天然氨基酸。
63.权利要求62的二价双特异性构建体，其中通过各抗体或其衍生物中的非天然氨基酸之间的接头将所述抗-IL-6抗体或其衍生物与所述抗-IL-23抗体或其衍生物偶联。
64.权利要求63的二价双特异性构建体，其中接头是PEG分子。
65.抗-IL-6抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列YIYTDX1STX2YANWAKG(SEQIDNO.335)的CDR2区，其中：
X1选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；和
X2选自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和
优选地，X1是丝氨酸或苏氨酸，而X2是色氨酸或酪氨酸。
66.IL-6抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列RX1STLX2S(SEQIDNO.336)的CDR5区，其中X1和X2独立地是丙氨酸或苏氨酸。
67.抗-IL-6抗体或其衍生物，其具有一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个CDR)具有选自SEQIDNO.10-15或20-25或30-35或40-45或50-55或60-65的序列的CDR。
68.抗-IL-6抗体或其衍生物，其选自13A8、9H4、9C8、8C8、18D4和28D2或其衍生物；或抗-IL-6抗体或其衍生物，其与所述抗体中的任一种结合相同的表位。
69.权利要求67的抗-IL-6抗体或其衍生物，其包含含有SEQIDNO.259的氨基序列的重链和含有SEQIDNO.261的氨基序列的轻链。
70.IL-23抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列YYAX1WAX2G(SEQIDNO.337)的CDR2区，其中：
X1选自丝氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；和
X2选自赖氨酸和谷氨酰胺。
71.IL-23抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列AX1TLX2S(SEQIDNO.338)的CDR5区，其中：
X1选自丝氨酸和丙氨酸；
X2选自丙氨酸和苏氨酸。
72.抗-IL-23抗体或其衍生物，其具有一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个CDR)具有选自SEQIDNO.90-95或100-105或110-115或120-25或130-135的序列的CDR。
73.抗-IL-23抗体或其衍生物，其选自31A12、34E11、35H4、49B7和16C6或其衍生物；或抗-IL-23抗体或其衍生物，其与所述抗体中的任一种结合相同的表位。
74.权利要求72的抗-IL-23抗体或衍生物，其包含含有SEQIDNO.267的氨基序列的重链和含有SEQIDNO.269的氨基序列的轻链。
75.抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列WX1KG(SEQIDNO.358)的CDR2区，其中X1是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，且优选是丙氨酸或缬氨酸。
76.抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列YAYX1GDAFDP(SEQIDNO.339)的CDR3区，其中X1是丙氨酸或异亮氨酸。
77.抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列SDYFNX1(SEQIDNO.340)的CDR3区，其中X1是异亮氨酸或缬氨酸。
78.抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其包含含有氨基酸序列QX1SQX2(SEQIDNO.359)的CDR4区，其中：
X1是丙氨酸或丝氨酸；和
X2选自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；
优选地，X2是丝氨酸或苏氨酸；
和/或它包含含有氨基酸序列ASX1LA(SEQIDNO.341)的CDR5区，其中X1是赖氨酸或苏氨酸；
和/或它包含含有氨基酸序列QSYYDX1NAGYG(SEQIDNO.342)的CDR6区，其中X1是丙氨酸或缬氨酸。
79.抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其具有一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个CDR)具有选自SEQIDNO.140-145或150-155或160-165或170-175或180-185或190-195的序列的CDR。
80.抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其选自22H8、45G5、14B5、4F3、5C5和1H1或其衍生物；或抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物，其与所述抗体中的任一种结合相同的表位。
81.权利要求79的抗-IL-23/IL-12抗体或衍生物，其包含含有SEQIDNO.271的氨基序列的重链和含有SEQIDNO.273的氨基序列的轻链。
82.权利要求65至81中任一项的抗-IL-6或抗-IL-23(包括抗-IL-23/IL-12抗体)或其衍生物，其是PEG化的。
83.多核苷酸，其编码权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体的部分。
84.多核苷酸，其编码权利要求1-81中任一项的抗体或其衍生物。
85.权利要求83或84的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核酸序列已为在大肠杆菌中表达而优化。
86.载体，其包含权利要求83至85中任一项的多核苷酸。
87.宿主细胞，其包含权利要求86的载体。
88.权利要求87的宿主细胞，其中所述宿主细胞是营养缺陷型。
89.用于产生权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体的方法，其包括：
(i)提供通过掺入至少一个非天然氨基酸而修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物；
(ii)提供通过掺入至少一个非天然氨基酸而修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)；
(iii)使所述修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物与所述修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物反应，使得二者通过各部分的非天然氨基酸之间的连接偶联。
90.权利要求89的方法，其中所述修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物，和所述修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物之间的连接包含接头部分，其中所述接头部分的一端与所述修饰的抗-IL-6抗体或其修饰的衍生物的非天然氨基酸偶联，而所述接头部分的另一端与所述修饰的抗-IL-23抗体或其修饰的衍生物的非天然氨基酸偶联。
91.权利要求90的方法，其中所述接头部分包含PEG、水溶性聚合物、聚乙烯醇、多糖、聚环氧烷、羟乙基淀粉或多元醇，且优选PEG。
92.权利要求89至91中任一项的方法，其中所述非天然氨基酸在连接前包含氮化物、炔、烯、应变环辛炔、应变环烯、环丙烯、降冰片烯或芳基、烷基或乙烯基卤化物、酮、醛、氰基、肼、酮缩醇、缩醛、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有机锡、有机硅、β-甲硅烷基链烯基卤化物、β-甲硅烷链烯基磺酸酯、氧化腈、吡喃酮、四嗪、哒嗪、芳基磺酸酯、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸基团。
93.权利要求89至92中任一项的方法，其中所述非天然氨基酸是叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有内部烯(如反式-巴豆烯)的氨基酸、丝氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸或乙烯基甘氨酸、吡咯赖氨酸、N-σ-邻-叠氮基苄氧基羰基-L-赖氨酸(AzZLys)、N-σ-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-2-叠氮基乙氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸(BocLys)、N-σ-烯丙氧基羰基-L-赖氨酸(AlocLys)、N-σ-乙酰基-L-赖氨酸(AcLys)、N-σ-苄氧基羰基-L-赖氨酸(ZLys)、N-σ-环戊氧基羰基-L-赖氨酸(CycLys)、N-σ-D-脯氨酰基-L-赖氨酸、N-σ-烟酰-L-赖氨酸(NicLys)、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-赖氨酸(NmaLys)、N-σ-生物素酰-L-赖氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-赖氨酸、N-σ-甲基-L-赖氨酸、N-σ-二甲基-L-赖氨酸、N-σ-三甲基-L-赖氨酸、N-σ-异丙基-L-赖氨酸、N-σ-丹酰-L-赖氨酸、N-σ-邻，对-二硝基苯基-L-赖氨酸、N-σ-对-甲苯磺酰-L-赖氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2羧乙基-L-赖氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-赖氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-赖氨酸。
94.权利要求89至93中任一项的方法，其中用于将第一部分与第二部分偶联的反应是[3+2]环加成或氮化物-炔环加成反应、Staudinger连接、Heck反应、Sonogashira反应、Suzuki反应、Stille偶联、Hiyama/Denmark反应、烯烃复分解反应、Diels-alder反应或碳基与肘、酰肘、烷氧基胺或楚基胺缩合。
95.权利要求89至94中任一项的方法，其包括：
(i)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含具有编码抗-IL-6抗体或其衍生物的多核苷酸的载体，所述抗体或衍生物通过掺入至少一个非天然氨基酸来修饰；
(ii)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含具有编码抗-IL-23抗体或其衍生物(包括抗-IL-23/IL-12抗体或其衍生物)的多核苷酸的载体，所述抗体或衍生物通过掺入至少一个非天然氨基酸来修饰；
(iii)在使得所述宿主细胞表达所述修饰的抗-IL-6抗体或其衍生物，和所述修饰的抗-IL-23抗体或其衍生物的条件下培养所述宿主细胞；
(iv)分离所述抗-IL-6抗体或其衍生物，和所述抗-IL-23抗体或其衍生物；
(v)使所述抗-IL-6抗体或其衍生物与所述抗-IL-23抗体或其衍生物反应，使得所述抗-IL-6抗体或其衍生物通过各部分的非天然氨基酸之间的连接与所述抗-IL-23抗体或其衍生物偶联。
96.选择适合包含于权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体中的亲本抗体的方法，其包括以下步骤：
(i)选择对IL-6或IL-23特异的B细胞；
(ii)整分出所述B细胞的分开的样品(例如，放入96细胞孔板的孔中)；
(iii)培养所述B细胞；
(iv)分别从各整分样品收集含有所述抗体的上清；
(v)针对IL-6或IL-23结合测定来自各整分样品的上清(例如用ELISA)；
(vi)针对IL-6或IL-23活性的抑制测定来自各整分样品的上清；
(vii)选择来自显示高水平的IL-6或IL-23活性抑制和/或强烈的IL-6或IL-23结合的孔的抗体；和
(viii)可选地针对IL-12活性的抑制测定来自IL-23整分样品的上清；和
(ix)选择还显示高水平的IL-12活性和/或强烈的IL-12结合的IL-23抗体作为亲本抗体。
97.权利要求1至64中任一项的二价双特异性构建体或权利要求65至82中任一项的抗体，其用于治疗。
98.治疗TH17介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体的步骤。
99.权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体，其用于治疗TH17介导的疾病。
100.权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体的用途，用于制备用于治疗TH17介导的疾病的药物。
101.治疗TH22介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体。
102.权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体，其用于治疗TH22介导的疾病。
103.权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体的用途，用于制备用于治疗TH22介导的疾病的药物。
104.治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体。
105.权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体，其用于治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病。
106.权利要求1-64中任一项的二价双特异性构建体的用途，用于制备用于治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病的药物。
107.治疗TH17介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的权利要求65至69中任一项的抗-IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合。
108.权利要求65至69中任一项的抗-IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合，其用于治疗TH17介导的疾病。
109.权利要求65-69中任一项的IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合的用途，用于制备用于治疗TH17介导的疾病的药物。
110.治疗TH22介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的权利要求65-69中任一项的抗-IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合。
111.权利要求65-69中任一项的抗-IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合，其用于治疗TH22介导的疾病。
112.权利要求65-69中任一项的IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合的用途，用于制备用于治疗TH22介导的疾病的药物。
113.治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病的方法，其包括对患者施用治疗有效量的权利要求65-69中任一项的抗-IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合。
114.权利要求65-69中任一项的抗-IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合，其用于治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病。
115.权利要求65-69中任一项的IL-6抗体和权利要求70-81中任一项的抗-IL-23或抗-IL-23/抗-IL-12抗体的组合的用途，用于制备用于治疗TH17和TH1细胞二者介导的疾病的药物。
116.权利要求107、110或113中任一项的方法，其中所述抗体是抗-IL-23/抗-IL-12抗体。
117.权利要求108、111或114中任一项的组合，其中所述抗体是抗-IL-23/抗-IL-12抗体。
118.权利要求109、112或115中任一项的用途，其中所述抗体是抗-IL-23/抗-IL-12抗体。
119.权利要求98、101、104、107、110、113或116中任一项的方法，其中所述TH17、TH22、或TH17和TH1介导的疾病选自炎性和自身免疫性障碍，如多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、寻常性天疱疮、器官移植排斥、克隆病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮和糖尿病。
120.权利要求99、102或105中任一项的二价双特异性构建体，其用于治疗TH17、TH22、或TH17和TH1介导的疾病，该疾病选自炎性和自身免疫性障碍，如多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、寻常性天疱疮、器官移植排斥、克隆病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮和糖尿病。
121.权利要求108、111、114或117中任一项的组合，其用于治疗TH17、TH22、或TH17和TH1介导的疾病，该疾病选自炎性和自身免疫性障碍，如多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、寻常性天疱疮、器官移植排斥、克隆病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮和糖尿病。
122.权利要求100、103、106、109、112、115或118中任一项的用途，其中所述药物用于治疗TH17、TH22、或TH17和TH1介导的疾病，该疾病选自炎性和自身免疫性障碍，如多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、寻常性天疱疮、器官移植排斥、克隆病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)、红斑狼疮和糖尿病。
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