JP2013545438A - 抗体誘導体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(二重特異性抗体)
単一特異性抗体、例えば、天然に存在するIgGは、それらが、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖から作られているので、2つの同一の抗原結合パラトープを有する。二重特異性抗体は、通常異なる抗原又はエピトープに向けられた、2つの異なる結合パラトープを有する改変された免疫グロブリン誘導体である。
CD4+ T-ヘルパー(TH)リンパ球は、適応免疫において不可欠な役割を果たす不均一な細胞集団を表す。これらの細胞には、病原体からの防御に当たるエフェクター細胞、及び自己抗原に対するエフェクター応答から保護する調節性T細胞(Treg)が含まれる。THという用語は、これらの細胞が、B細胞が抗体を産生するのを助けるのに極めて重要であるという観察に由来した。他方、CD4+ T細胞は、CD8+ T細胞が、いわゆる細胞性免疫のキラーエフェクター細胞に分化するのを助けるのに関与していることも分かった。CD4+ T細胞は、それ自体、遅延型過敏症などの免疫反応における免疫エフェクター細胞であることができ、該免疫反応において、これらの細胞は、マクロファージの活性化を主に特徴とする炎症反応を誘導する。
本発明は、抗IL-6抗体又はその誘導体、及び抗IL-23抗体又はその誘導体を含む二価の二重特異性コンストラクト、そのようなコンストラクトを作製する方法、並びに治療におけるそのようなコンストラクトの使用を提供する。
アミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKG
(式中、
X1は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンからなる群から選択され;かつ
X2は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択され;かつ
好ましくは、X1は、セリン若しくはトレオニンであり、かつX2が、トリプトファン若しくはチロシンである);(配列番号335)を含むCDR2領域、並びに/又は
アミノ酸配列RX1STLX2S
(式中、
X1及びX2は、独立に、アラニン若しくはトレオニンである)(配列番号336)を含むCDR5領域
を含む、抗IL-6抗体又はその誘導体を提供する。
アミノ酸配列YYAX1WAX2G
(式中、
X1は、セリン、プロリン、及びアスパルテートからなる群から選択され、かつ
X2は、リジン及びグルタミンからなる群から選択される);(配列番号337)を含むCDR2領域、並びに/又は
アミノ酸配列AX1TLX2S
(式中、
X1は、セリン及びアラニンからなる群から選択され、
X2は、アラニン及びトレオニンからなる群から選択される)(配列番号338)を含むCDR5領域
を含む、抗IL-23抗体又はその誘導体を提供する。
アミノ酸配列の配列WX1KG(式中、X1は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、若しくはトリプトファンであり、好ましくは、アラニン若しくはバリンである)(配列番号358)を含むCDR2領域;並びに/又は
アミノ酸配列YAYX1GDAFDP(式中、X1は、アラニン若しくはイソロイシンである);(配列番号339)を含むCDR3領域、並びに/又は
アミノ酸配列SDYFNX1(式中、X1は、イソロイシン若しくはバリンである);(配列番号340)を含むCDR3領域、並びに/又は
アミノ酸配列QX1SQX2(式中、
X1は、アラニン若しくはセリンであり、かつ
X2は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群から選択され;
好ましくは、X2は、セリン若しくはトレオニンである)を含むCDR4領域;並びに/又は(配列番号359)
アミノ酸配列ASX1LA(式中、X1は、リジン若しくはトレオニンである)(配列番号341)を含むCDR5領域、並びに/又は
アミノ酸配列QSYYDX1NAGYG(式中、X1は、アラニン若しくはバリンである)(配列番号342)を含むCDR6領域。
請求項259記載のアミノ配列を含む重鎖、及び請求項261記載のアミノ配列を含む軽鎖を含む、抗IL-6抗体又はその誘導体
請求項267記載のアミノ配列を含む重鎖、及び配列番号269のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗IL-23抗体又はその誘導体
請求項271記載のアミノ配列を含む重鎖、及び請求項273記載のアミノ配列を含む軽鎖を含む、抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。
(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾された抗IL-6抗体又はその誘導体を提供すること;
(b)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾された抗IL-23抗体又はその誘導体を提供すること;
(c)これら2つが各部分の非天然アミノ酸間の連結によって結合されるように、該修飾された抗IL-6抗体又は修飾されたその誘導体を、該修飾された抗IL-23抗体又は修飾されたその誘導体と反応させること。
他の部分への連結の前のアジド、シアノ、ニトリル酸化物、アルキン、アルケン、歪んだシクロオクチン、歪んだシクロアルケン、シクロプロペン、ノルボルネン、又はアリール、アルキル、若しくはビニルハライド、ケトン、アルデヒド、ケタール、アセタール ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、ボロン酸、有機スズ、有機ケイ素、β-シリルアルケニルハライド、β-シリルアルケニルスルホネート、ピロン、テトラジン、ピリダジン、アリールスルホネート、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール、α-ケト酸基:から選択される群を含む非天然アミノ酸の使用を含むことができる。特に、該非天然アミノ酸は、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、p-ブロモフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン又はエチニルフェニルアラニン(ethynylephenylalanine)、trans-クロチルアルケンなどの内部アルケンを含むアミノ酸、セリンアリルエーテル、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ビニルグリシン、ピロリジン、N-σ-o-アジドベンジルオキシカルボニル-L-リジン(AzZLys)、N-σ-プロパルギルオキシカルボニル-L-リジン、N-σ-2-アジドエトキシカルボニル-L-リジン、N-σ-tert-ブチルオキシカルボニル-L-リジン(BocLys)、N-σ-アリルオキシカルボニル-L-リジン(AlocLys)、N-σ-アセチル-L-リジン(AcLys)、N-σ-ベンジルオキシカルボニル-L-リジン(ZLys)、N-σ-シクロペンチルオキシカルボニル-L-リジン(CycLys)、N-σ-D-プロリル-L-リジン、N-σ-ニコチノイル-L-リジン(NicLys)、N-σ-N-Me-アントラニロイル-L-リジン(NmaLys)、N-σ-ビオチニル-L-リジン、N-σ-9-フルオレニルメトキシカルボニル-L-リジン、N-σ-メチル-L-リジン、N-σ-ジメチル-L-リジン、N-σ-トリメチル-L-リジン、N-σ-イソプロピル-L-リジン、N-σ-ダンシル-L-リジン、N-σ-o,p-ジニトロフェニル-L-リジン、N-σ-p-トルエンスルホニル-L-リジン、N-σ-DL-2-アミノ-2カルボキシエチル-L-リジン、N-σ-フェニルピルバミド-L-リジン、N-σ-ピルバミド-L-リジン;及び特に、他の部分への連結の前のアジド、アルキン、アルケン、又はアリール、アルキル、若しくはビニルハライド、ケトン、アルデヒド、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、ボロン酸、有機スズ、有機ケイ素基:から選択される基であることができる。特に、該非天然アミノ酸は、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、p-ブロモフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン又はエチニルフェニルアラニン(ethynylephenylalanine)、trans-クロチルアルケンなどの内部アルケンを含むアミノ酸、セリンアリルエーテル、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ビニルグリシンであることができる。
(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている、抗IL-6抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること;
(b)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている、抗IL-23抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること;
(c)該宿主細胞が、該修飾された抗IL-6抗体若しくはその誘導体、又は該修飾された抗IL-23抗体若しくはその誘導体を発現するような条件下で、該宿主細胞を成長させること
(d)該抗IL-6抗体又はその誘導体、及び該抗IL-23抗体又はその誘導体を単離すること;
(e)該修飾された抗IL-6抗体又はその誘導体が、各々の修飾された抗体又はその誘導体の非天然アミノ酸間の連結によって、該修飾された抗IL-23抗体又はその誘導体に結合されるように、該修飾された抗IL-6抗体又はその誘導体を、該修飾された抗IL-23抗体又はその誘導体と反応させること。
(i)IL-6又はIL-23に特異的なB細胞を選択する工程;
(ii)該B細胞の個別の試料を(例えば、96細胞ウェルプレートのウェルに)分注する工程;
(iii)該B細胞を培養する工程;
(iv)抗体を含む上清を、各々の分注試料から個別に回収する工程;
(v)各々の分注試料由来の上清を(例えば、ELISAを用いて)IL-6又はIL-23結合についてアッセイする工程;
(vi)該各々の分注試料由来の上清をIL-6又はIL-23活性の阻害についてアッセイする工程;
(vii)高レベルのIL-6若しくはIL-23活性の阻害及び/又は強いIL-6若しくはIL-23結合を示したウェルから抗体を選択する工程;並びに
(viii)任意に、IL-23分注試料由来の上清をIL-12活性の阻害についてアッセイする工程;並びに
(ix)高レベルのIL-12活性及び/又は強いIL-12結合をさらに示すIL-23抗体を親抗体として選択する工程。
(二重特異性コンストラクト)
本明細書では、特に、IL-6及びIL-23に結合し、それらの活性を調節する二価の二重特異性コンストラクトが記載される。IL-6とIL-23は両方とも、TH17細胞の分化及び活性化において役割を果たすことが知られている。活性化TH17細胞はさらに、種々の下流経路を通じて免疫応答を媒介することに関与する。これら2つのサイトカインは、TH17分化の異なる段階で機能しており、IL-6は、TH17経路のT細胞コミットメントのごく初期に作用し、IL-23は、コミットしたTH17細胞に対して作用する。したがって、本発明は、TH17活性化経路の2つの異なる点を阻害し、かつ(例えば、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、及び間質細胞における)TH17産物によって媒介される下流の炎症応答の一部に対してさらなる阻害効果を有する新規の二価の二重特異性コンストラクトを提供する。IL-6とIL-23の両方を標的とすることによって、該二重特異性分子は、TH17経路内の複数の点でTH17媒介性応答を阻害することができ、また、対応する単一特異性抗体単独よりも大きい効力で作用する可能性がある。当業者は、二価の二重特異性抗体の作製に関わる不確実性を考慮して、その成分抗体の機能的特徴を保持するか、又は改善された機能的特徴を有する安定な二価の二重特異性コンストラクトの産生の成功が、意外かつ予想外の結果を表すものであることを理解するであろう。
本発明の二価の二重特異性コンストラクトにおいて、抗体、及びその誘導体が基にしている初期抗体を、標準的な実験技術によって同定することができる。これらの抗体は、本明細書において、親抗体と呼ばれる。
ある実施態様では、親抗体は、IL-6、IL-23、又はIL-12に結合するその能力に基づいて選択される。親抗体の結合は、そのKd値を決定することによって測定することができる。別の実施態様では、親抗体は、IL-6、IL-23、又はIL-12の活性を調節するその能力に基づいて選択される。好ましい実施態様では、親抗体は、IL-6、IL-23、又はIL-12に結合するその能力、及びIL-6、IL-23、又はIL-12の活性を調節するその能力に基づいて選択される。親抗体は、IL-6、IL-23、若しくはIl-12の生物学的活性を阻害するその能力について選択され得るか、又はそれらは、IL-6、IL-23、若しくはIL-12の生物学的活性を促進するその能力について選択され得る。好ましくは、親抗体は、IL-6、IL-23、及びIL-12を阻害するその能力について選択される。
ある実施態様では、親抗体又はその誘導体は、同一の又は別々の動物種から得ることができる。
親抗体は、標準的な実験技術によって不死化することができる。したがって、本発明は、本発明による二価の二重特異性コンストラクトへの組込みに好適である親抗体から作製されるモノクローナル抗体を提供する。
本発明はまた、抗体及び/又はその誘導体の組合せを含む組成物を提供する。該組成物は、IL-6抗体又はその誘導体、及びIL-23抗体又はその誘導体を含む。IL-23抗体又はその誘導体は、IL-12にも結合することができる。
二価の二重特異性コンストラクトの抗体は、ヒトに投与されたとき、それらが免疫原性の低いものとなるように改変に供することができる。そのような改変は、キメラ化、ヒト化、CDR-移植、脱免疫化、及び/又は最も近いヒト生殖系列配列に対応するフレームワーク領域アミノ酸の突然変異(生殖系列化)として一般に知られている技術のうちの1つ又は複数を含むことができる。抗体をそのような改変に供することは、もし改変に供さなければ、宿主免疫応答を誘発することになる抗体を、宿主免疫系にとって、より又は完全に「見えないもの」にし、結果として、そのような免疫応答が起こらないか、又は低減するという利点を有する。したがって、この実施態様によって記載されているように改変されている抗体は、いかなるそのような改変(複数可)も受けていない対応する抗体よりも長い期間、免疫応答関連の副作用を低下させて、又は該副作用を全く伴わずに、投与可能であり続ける。当業者は、抗体が望まない宿主免疫応答を誘発するのを防ぐために、抗体を改変しなければならないかどうか、又は抗体をどの程度改変しなければならないかを決定する方法を理解しているであろう。
したがって、本発明によれば、特定のヒト化抗IL-6、抗IL-23、及び抗IL-23/IL-12抗体が提供される。これらの抗体は、両方ともIL-6、IL-23、又はp40に結合し、かつその生物学的活性を調節する(例えば、阻害する)能力を示した親抗体に基づいている。さらに、本発明によって提供される特定の抗体は、不死化及びヒト化の後に、これらの能力を保持するか、又は実質的に保持する。
抗IL-6抗体:
13A8(配列番号259のVH及び配列番号261のVLを含む);
9H4(配列番号46のVH及び配列番号48のVLを含む)
9C8(配列番号56のVH及び配列番号58のVLを含む)
8C8(配列番号36のVH及び配列番号38のVLを含む)
18D4(配列番号26のVH及び配列番号28のVLを含む);並びに
28D2((配列番号16のVH及び配列番号18のVLを含む)。
抗IL-23抗体:
31A12(配列番号267のVH及び配列番号269のVLを含む);
34E11(配列番号116のVH及び配列番号118のVLを含む);
35H4(配列番号126のVH及び配列番号128のVLを含む);
49B7(配列番号96のVH及び配列番号98のVLを含む);並びに
16C6(配列番号106のVH及び配列番号108のVLを含む)。
抗IL-23/IL-12抗体:
45G5(配列番号275のVH及び配列番号277のVLを含む);
14B5(配列番号186のVH及び配列番号188のVLを含む)
4F3(配列番号166のVH及び配列番号168のVLを含む)
5C5(配列番号176のVH及び配列番号178のVLを含む)
22H8(配列番号271のVH及び配列番号273のVLを含む);並びに
1H1(配列番号156のVH及び配列番号158のVLを含む)
本発明はまた、例えば、二価の二重特異性コンストラクトの成分として、抗体変異体を提供する。該抗体は、結合親和性、及びIL-6、IL-23、又はIL-12の生物学的活性を調節する能力を保持するか、又は実質的に保持する(例えば、変異体抗体のKd値は、その親抗体と比べて少なくとも80%であり、生物学的活性を調節するその能力は、本明細書に開示されるアッセイによって決定したとき、その親抗体の能力の少なくとも80%である)。
ある実施態様では、本発明は、突然変異前の抗IL-6抗体との少なくとも90%の配列同一性を有する変異体抗IL-6抗体を提供する。好ましくは、変異体抗IL-6抗体は、突然変異前の抗IL-6抗体との少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する。
一実施態様では、突然変異前の抗IL-6抗体と比べた変異体抗IL-6抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて10個以下のアミノ酸変化がある。
別の実施態様では、突然変異前の抗IL-23抗体と比べた変異体抗IL-23抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて10個以下のアミノ酸変化がある。
別の実施態様では、突然変異前の抗IL-23/IL-12抗体と比べた変異体抗IL-23/IL-12抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて10個以下のアミノ酸変化がある。
抗体誘導体は、当業者に公知の技術及び方法を用いて作製することができる。本発明による抗体誘導体は、それらが由来している抗体の結合親和性、及び該抗体のIL-6、IL-23、又はp40の生物学的活性を調節する能力を保持するか、又は実質的に保持する。抗体誘導体の例としては、本明細書に開示される抗IL-6、抗IL-23、及び抗IL-23/IL-12抗体に由来するFab、Fab'、F(ab)'、及びscFvコンストラクト、カッパボディ、ミニボディ、並びにヤヌシンが挙げられる。
本発明のある実施態様では、抗IL-6抗体又は変異体抗IL-6抗体のFab、Fab'、F(ab)'断片が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-23抗体又は変異体抗IL-23抗体のFab、Fab'、F(ab)'断片が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-23/IL-12-23/IL-126抗体又は変異体抗IL-23/IL-12抗体のFab、Fab'、F(ab)'断片が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-6抗体又は変異体抗IL-6抗体のscFv誘導体が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-23抗体又は変異体抗IL-23抗体のscFv誘導体が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-23/IL-12抗体又は変異体抗IL-23/IL-12抗体のscFv誘導体が提供される。
好ましい実施態様では、抗IL-23単鎖抗体は、上記のヒト化抗IL-23抗体に由来する。
好ましい実施態様では、抗IL-23/IL-12単鎖抗体は、上記のヒト化抗IL-23/IL-12抗体に由来する。
別の実施態様では、他の修飾抗体は、抗IL-6抗体、抗IL-23抗体、又は抗IL-23/IL-12抗体をコードする核酸分子を用いて調製することができる。例えば、「カッパボディ」(ILlらの文献(Protein Eng 10: 949-57(1997)))、「ミニボディ」(Martinらの文献(EMBO J 13: 5303-9(1994)))、又は「ヤヌシン」(Trauneckerらの文献(EMBO J 10: 3655-3659(1991))及びTrauneckerらの文献(「ヤヌシン:二重特異性試薬のための新しい分子設計(Janusin : new molecular design for bispecidfic reagents)」Int J Cancer Suppl 7: 51-52(1992)))は、標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。
相補性決定領域(CDR)は、抗原受容体(例えば、免疫グロブリン及びT細胞受容体)の可変(V)ドメインに見られる、柔軟なループの形状の比較的短いアミノ酸配列である。免疫グロブリンとT細胞受容体の両方のCDRは、それらの特異性を決定し、特異的リガンドと接触するこれらの分子の部分である。CDRは、該分子の最も変化しやすい部分であり、これらの分子の多様性の一因となり、免疫グロブリン及びT細胞受容体が、巨大な抗原レパートリーを認識するのを可能にする。したがって、本発明の二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗IL-6、抗IL-23、及び抗IL-23/IL-12抗体中のこれらの領域は、抗体の特異性を決定する上で重要な役割を果たしており、特定の共通したCDR領域を有する抗体は、同一又は同様の抗原特異性を有すると考えられる。したがって、本発明の一態様では、抗IL-6、抗IL-23、及び抗IL-23/IL-12抗体、又はそれらの誘導体は、それらが基にしている抗体のCDR領域を含む。
個々のCDRの場合にも、特定の抗体又はその誘導体の特異性を決定する際に特に重要である特定の領域(本明細書ではモチーフと呼ばれる)があることが当業者によって理解されるであろう。これらの領域の特異性は、いくつかの因子、例えば、その立体構造及び該領域内での荷電アミノ酸残基の場所によって決定され得る。当業者は、エピトープマッピング、及び同じ標的に結合することが知られている抗体の配列を比較することを含む、当技術分野で公知の技術によって、これらのモチーフを同定することができる。したがって、本発明は、特定のモチーフを有するCDRを含む抗体又はその誘導体を提供する。
アミノ酸配列の配列WX1KG(式中、X1は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、又はトリプトファンであり、好ましくは、アラニン又はバリンである);
アミノ酸配列YAYX1GDAFDP(式中、X1は、アラニン若しくはイソロイシンである);(配列番号339)を含むCDR3領域中のモチーフ
並びに/又は
アミノ酸配列SDYFNX1(式中、X1は、イソロイシン若しくはバリンである);(配列番号340)を含むCDR3領域中のモチーフ、並びに/又は
アミノ酸配列QX1SQX2
(式中、
X1は、アラニン若しくはセリンであり、かつ
X2は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群から選択され;
好ましくは、X2は、セリン若しくはトレオニンである)を含むCDR4領域中のモチーフ;並びに/又は
アミノ酸配列ASX1LA(式中、X1は、リジン若しくはトレオニンである);(配列番号341)を含むCDR5領域中のモチーフ、並びに/又は
アミノ酸配列QSYYDX1NAGYG(式中、X1は、アラニン若しくはバリンである)(配列番号342)を含むCDR6領域中のモチーフ。
アミノ酸配列YYAX1WAX2G
(式中、
X1は、セリン、プロリン、及びアスパルテートからなる群から選択され、かつ
X2は、リジン及びグルタミンからなる群から選択される);(配列番号337)を含むCDR2領域中のモチーフ、並びに/又は
アミノ酸配列AX1TLX2S
(式中、
X1は、セリン及びアラニンからなる群から選択され、
X2は、アラニン及びトレオニンからなる群から選択される)(配列番号338)を含むCDR5領域中のモチーフ。
アミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKG
(式中、
X1は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンからなる群から選択され;かつ
X2は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択され;かつ
好ましくは、X1は、セリン若しくはトレオニンであり、かつX2は、トリプトファン若しくはチロシンである);(配列番号335)を含むCDR2領域中のモチーフ、並びに/又は
アミノ酸配列RX1STLX2S(式中、X1及びX2は、独立に、アラニン若しくはトレオニンである)(配列番号336)を含むCDR5領域中のモチーフ。
本発明は、抗IL-6、抗IL-23、及び抗IL-23/IL-12抗体、又はそれらの誘導体への非天然アミノ酸残基の組込みを提供して、抗IL-6抗体又はその誘導体の、抗IL-23又は抗IL-23/IL-12抗体、又はそれらの誘導体への付着点を提供する。当業者は、例えば、アジドホモアラニン(Aha)を含む、いくつかの潜在的に好適な非天然アミノ酸を認識している。さらなる非天然アミノ酸としては、アジドノルロイシン、3-(1-ナフチル)アラニン、3-(2-ナフチル)アラニン、p-エチニル-フェニルアラニン、p-プロパルギル-オキシ-フェニルアラニン、m-エチニル-フェニルアラニン、6-エチニル-トリプトファン、5-エチニル-トリプトファン、(R)-2-アミノ-3-(4-エチニル-1H-ピロル-3-イル)プロパン酸(propanic acid)、p-ブロモフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン(idiophenylalanine)、p-アジドフェニルアラニン、3-(6-クロロインドリル)アラニン、3-(6-ブロモインドイル(bromoindoyl))アラニン、3-(5-ブロモインドリル)アラニン、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、及びp-クロロフェニルアラニンが挙げられる。好ましい実施態様では、非天然アミノ酸はAhaである。
本発明の二価の二重特異性コンストラクト又は抗体を誘導体化するか、又は別の分子に結合させることができる。一般に、二価の二重特異性コンストラクトは、成分抗体又はその誘導体の結合及び生物学的活性が誘導体化又は標識によって悪影響を受けないように、誘導体化される。
本発明の二価の二重特異性コンストラクト、並びに該二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗体、及びその誘導体を、従来の組換え技術を用いて発現させることができる。さらに、該コンストラクト、並びに/又は抗体、及びその誘導体が非天然アミノ酸を含む場合、WO 2007/130453号に記載されているような組換え法を用いることができる。該二価の二重特異性コンストラクト、並びに該抗体、及びその誘導体を発現させるために用いられるヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞などは、本発明の目的である。
ある実施態様では、本発明は、二価の二重特異性コンストラクト、並びに上で定義したような二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗体、及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
ある実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、プロモーター配列に機能的に連結されている。好適なプロモーターの例としては、T5/Lacプロモーター、:T7/Lac又は修飾されたT7/lacプロモーター、Trc又はtacプロモーター、ファージpL又はpR温度誘導性プロモーター、tetAプロモーター/オペレーター、araBAD(pBAD)プロモーター、rhaPBADプロモーター、及びlac UV5プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なプロモーターは、Terpe, K.の文献(2006)(Appl Microbiol Biotechnol 72:211222)から特定することができる。好ましい実施態様では、プロモーターは、T5/Lacプロモーターである。
ある実施態様では、本発明は、任意に、プロモーター配列に機能的に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
ある実施態様では、本発明は、本発明のベクターでトランスフェクトされ、該ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現することができる宿主細胞を提供する。任意に、該宿主細胞は、特定の天然アミノ酸の代わりに非天然アミノ酸(例えば、Metの代わりにAHA)を組み込むことができる栄養要求性細胞である。該宿主細胞は、原核生物細胞又は真核生物細胞であることができる。好適な真核生物細胞としては、酵母細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。好ましくは、該宿主細胞は、原核生物、特に、大腸菌B384であり、これはメチオニン要求性細胞である。或いは、該細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくは、それらはヒト細胞であり、さらにより好ましくは、それらは、ヒト胚性腎細胞(例えば、HEK293若しくはHEK 293c18細胞)又はCHO細胞である。
本発明のある実施態様では、抗IL-6、抗IL-23抗体、及び抗IL-23/IL-12抗体、並びにそれらの誘導体のクローニング及び発現のためのプライマーが提供される。これらのプライマーは、10〜40ヌクレオチドで長さが様々であり、好ましくは、それらは、長さが15〜30ヌクレオチドである。当業者は、本明細書に開示される抗体、及びその誘導体の核酸配列の開示を考慮して、好適なプライマー配列を決定することができるであろう。関心対象の特定のプライマー配列は、配列番号200〜258に与えられており、これらは、本明細書に開示される抗体及びscFvのクローニング及び発現に有用である。
部分をペプチドにコンジュゲートさせることを可能にする非天然アミノ酸の使用は、WO 2007/130453号に開示されている。そのようなタンパク質工学も以下で論じられる。
(二重特異性体を形成させる一般的方法)
ある実施態様では、本発明の二価の二重特異性コンストラクトは、下記のことを含む、以下の方法よって作製することができる:
(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL-6抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること;
(ii)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL-23抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること;
(iii)該宿主細胞が、該修飾された抗IL-6抗体又はその誘導体、及び該修飾された抗IL-23抗体又はその誘導体を発現するような条件下で、該宿主細胞を成長させること、
(iv)該抗IL-6抗体又はその誘導体、及び該抗IL-23抗体又はその誘導体を単離すること;
(v)該抗IL-6抗体又はその誘導体が、各部分の非天然アミノ酸間の連結によって該抗IL-23抗体又はその誘導体と結合されるように、該抗IL-6抗体又はその誘導体を該抗IL-23抗体又はその誘導体と反応させること。
当技術分野で公知の組換え二重特異性抗体の短所の1つは、体内でのその短い循環時間である。ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、及びタンデムscFv分子は、50〜60kDaの分子量を有しており、このため、溢出、タンパク質分解、及び腎排出によるこれらの実体の循環からの迅速なクリアランスが生じることがある。これらの実体の例示的な初期半減期(t1/2α)は30分未満である。組換え抗体の薬物動態を改善するために、いくつかの手法が取られている。1つの手法は、これらの分子のサイズを増大させることである。100〜115kDaの分子量を有する二量体単鎖ダイアボディ分子は、可変ドメインを接続するリンカーの長さを変えることによって作製することもできる。他の手法は、二重特異性体と、長い半減期を有する血清タンパク質との会合に依存している。これらには、二重特異性抗体と、ヒト血清アルブミン(HSA)、HSA結合ペプチド、又は本来長い半減期を有するホルモンに由来するペプチドとの融合が含まれる。そのような方法を、本発明の二価の二重特異性コンストラクトに適用することができる。しかしながら、本発明は、ポリエチレングリコールポリマー(PEG)の使用を提供するものでもあり、該使用は、本発明の二価の二重特異性コンストラクトの半減期を延長する上で特に有利であることが本明細書で初めて示されている。
別の態様に従って、本発明は、本発明の二価の二重特異性コンストラクト及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物及びキットを提供する。いくつかの実施態様では、該医薬組成物又はキットはさらに、別の成分、例えば、イメージング試薬又は治療剤を含む。好ましい実施態様では、該医薬組成物又はキットは、診断法又は治療法で用いられる。
別の態様に従って、本発明は、治療における本発明の二価の二重特異性コンストラクトの使用を提供する。特に、本発明は、TH17、TH22、及びTH1媒介性疾患、並びにこれらのTH細胞の組合せによって媒介される疾患の治療を提供する。
本発明の別の態様では、本発明(the present ionvention)による治療で使用するための二価の二重特異性コンストラクト、抗体、及び抗体組合せは、当技術分野で現在利用可能な治療と比べて同じ治療効果を達成しながらも、有利に低い用量で患者に投与することができる。この低用量は、本明細書に開示される抗体のより高い活性によって促進されることができ、かつ副作用の発生を低下させる可能性がある。
(抗体親和性の決定)
抗体親和性は、当業者に周知の方法を用いて決定することができる。抗体が、それらを、本発明の二価の二重特異性抗体に含めるのに潜在的に適したものにする所望の親和性を有するかどうかを決定する目的のために、以下の詳細なアッセイ手順を提供するが、(例えば、異なるが、類似する装置、又は異なるブランドの一般試薬の使用において)方法論を少し変更しても、同じ決定がなされることが可能になることが理解されるであろう。
二重特異性scFvのSPRを、抗IL-6部分の測定について先に記載した通りに実施する;但し、二重特異性体の他方の末端での、付着した抗IL-23 scFv、31A12の結合反応速度も決定するために、プロトコルを修正する。簡潔に述べると、二重特異性体によるIL-23結合を、記載したようなIL-6を用いて、該二重特異性体を一定密度(〜240RU)で固定化することによって実施した。組換えヒト二量体IL-23(34-8239, eBiosciences, San Diego, CA)の結合及び解離は、上で詳述したのと同じパラメータを用いて、3〜25nMの範囲の濃度でアッセイすることができる。
IL-6活性を調節する抗体及びその誘導体の能力は、当業者に周知の方法を用いてアッセイすることができる。抗体が、それらを、本発明の二価の二重特異性抗体に含めるのに潜在的に適したものにする所望のIL-6活性調節能力を有するかどうかを決定する目的のために、以下の詳細なアッセイ手順を提供するが、(例えば、異なるが、類似する装置、又は異なるブランドの一般試薬の使用において)方法論を少し変更しても、同じ決定がなされることが可能になることが理解されるであろう。
ELISAアッセイを用いて、IL-23結合を評価することができる(Aggarwalらの文献(2003))。ELISAプレートは、IL-23直接結合法又はIL-23間接結合法のどちらかを用いて、コーティングすることができる。
さらに、IL-23のp40サブユニットも、TH1シグナル伝達経路に関与するIL-12の一部を形成することを考慮して、IL-12に対するその中和能力を測定するアッセイが、IFN-γ(TH1細胞活性の生成物)のレベルを調節するその能力を利用することが本明細書に開示されている。当業者であれば、抗体の中和効果、及びIFN-γ産生に対するその効果を決定するための好適なアッセイ法を認識しているであろうが、以下のアッセイを好適なアッセイの一例として提供する。
霊長類インターロイキンに対するアッセイは、霊長類バージョンのサイトカインの使用がアッセイされることを除いて、ヒトアッセイに対する活性の測定用のものと同一である。
以下の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有することが理解されるものとする:
抗原結合ドメインは、過免疫化ウサギから、クローニングされた抗原特異的B細胞から作製される。抗原特異的B細胞は、抗原パニングによってウサギ血液から選択され、活性化B細胞の拡大に有利に働く培養条件下でクローニングされる。
ヒトIL-6(DQ891463;ABM82389.1、配列番号343及び344)を3xFLAG-IL6-Avi融合体として発現させた。発現コンストラクトを、2工程のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって作製した。生成物を、CMVプロモーターの下流で、プレ-プロ-トリプシンリーダー配列及び三連FLAGタグとインフレームにして、プラスミドp3xFLAG-CMV-23(Sigma)に挿入した。発現されたIL-6(配列番号1)は、アミノ末端三連FLAGタグ(アミノ酸配列dhdgdykdhdidykdddd;配列番号345)及びカルボキシル末端Aviタグ(glndifeaqkiewhe;配列番号346)(ALLO66-MM4-80)を含んでいた。IL6コード領域をPCRで増幅し、p3xFLAG-CMV-23に挿入して、3xFLAG-IL6及び3xFLAG-IL6-myc融合体(配列番号2)を発現させた。
哺乳動物サイトカインの発現をHEK293又はHEK293c18細胞で実施した。トランスフェクションを、およそ200,000細胞/cm2の密度でプレーティングされた細胞に対して3μl/μg DNAのlipofectamine 2000、又は293fectin(Invitrogen)を用いて、100万個の細胞当たり2〜2.5μgのDNAを用いて実施した。細胞を、10%胎仔ウシ血清を含むDMEM中で、37℃で3〜4日間インキュベートし、成長培地を標的タンパク質の精製のために回収した。精製のために、6xHISタグ化タンパク質、1/10量の10×結合バッファー(500mMリン酸バッファー pH7.5、3M NaCl、200mMイミダゾール、1%Tween-20)を培養培地に添加し、PBSに対して4℃で一晩透析した。Ni-NTAビーズを抽出物に4℃で2〜3時間添加し、回転混合した。ビーズを遠心分離によって回収し、Ni-NTA洗浄バッファー(50mMリン酸塩、300mM NaCl、20mMイミダゾール、0.1%Tween)中で洗浄した。Ni-NTAビーズに結合したタンパク質を溶出バッファー(50mMリン酸バッファー pH7.5、300mM NaCl、500mMイミダゾール)によって溶出させた。標的タンパク質を含む画分をSDS-PAGE及びクマシーブルー染色によって同定し、デンシトメトリーによって定量した。ピーク画分を合わせ、PBSに対して透析し、インビトロアッセイ又はSPR解析で直接用いた。
平衡解離定数は、SensiQ Pioneer(ICx Nomadics, Stillwater, OK)、及びアミンカップリングに適したカルボキシル化COOH1センサー(同上)を用いて、表面プラズモン共鳴によって決定した。プロテインG(6510-10, Biovision, Mountain View, CA)を、アミンカップリング試薬(Sigma Aldrich(N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS, 56480)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-B'-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC, E7750)、エタノールアミン(398136), St. Louis, MO)を用いるか、又はBiacoreアミンカップリングキット(BR-1000-50, GE Healthcare, Waukesha, WI)を用いて、COOH1センサーにカップリングさせた。
(3.1 ウサギ免疫化:)
1匹のニュージーランドホワイトウサギを、Sigma Adjuvant System(Sigma S6322)中で、0、21、及び42日目に、100μgのIL-6タンパク質(組換え大腸菌由来ヒトIL-6、参照配列アクセッションNP000591.1、ProSpec-Tany TechnoGene社, Rehovot, Israel(カタログ# CYT-213i)から入手した)で免疫化した。採血の10日以上前に、ウサギに追加免疫した。ウサギを、NIH、USDA、及びIACUCガイドラインに従って、R & R Research Laboratories(Stanwood, WA, USA)で維持した。
30mlの血液を静脈穿刺により各ウサギから回収した。末梢血単核細胞(PBMC)を密度遠心分離(Lympholyte-rabbit, カタログ# CL5050, Cedarlane Laboratories社, Ontario, Canada)により調製した。
V-領域レスキューのプロセスを図2にまとめる。
配列番号6のアミノ酸配列;配列番号7のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号8のアミノ酸配列;配列番号9のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号16のアミノ酸配列及び配列番号17のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号18のアミノ酸配列及び配列番号19のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号28のアミノ酸配列及び配列番号29のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号36のアミノ酸配列及び配列番号37のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号38のアミノ酸配列及び配列番号39のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号46のアミノ酸配列及び配列番号47のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号48のアミノ酸配列及び配列番号49のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号56のアミノ酸配列及び配列番号57のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号58のアミノ酸配列及び配列番号59のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
ヒト治療用の任意のサイトカインアンタゴニストの開発の成功は、初期の毒性試験を必要とする。毒性は、非ヒト種において最も効率的に証明される。毒性研究を実施するために、研究が検討されている種に由来するIL-6を中和する抗体の能力を示すことがまず必要である。
(4.1 ウサギ免疫化)
1匹のニュージーランドホワイトウサギ(NZW)及び1匹のB9ウサギを、0、21、及び42日目に、Sigma Adjuvant System(Sigma S6322)中で、100μgのIL-23タンパク質(p40鎖、アクセッションNM_002187及びp19鎖、アクセッションNM_016584から構成されるバキュロウイルス由来組換えヒトIL-23、eBiosciences, San Diego CA, USA製(カタログ#34-8239))で免疫化した。免疫化の少なくとも10日後に、該動物から採血した。ウサギを、NIH、USDA、及びIACUCガイドラインに従って、R & R Research Laboratories(Stanwood, WA, USA)及びSpring Valley Laboratories(Woodbine, MD, USA)で維持した。
IL-23に特異的なB細胞を実施例3と同様に選択した。
IL-23中和アッセイとIL-23結合アッセイの両方について陽性のB細胞由来のIgG可変重鎖及び軽鎖を、本質的に実施例3と同様のRT-PCRで取得した。
配列番号86のアミノ酸配列;配列番号87のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号88のアミノ酸配列;配列番号89のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号96のアミノ酸配列及び配列番号97のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号98のアミノ酸配列及び配列番号99のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号106のアミノ酸配列及び配列番号107のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号108のアミノ酸配列及び配列番号109のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号116のアミノ酸配列及び配列番号117のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号118のアミノ酸配列及び配列番号119のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号126のアミノ酸配列及び配列番号127のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vh)。
配列番号128のアミノ酸配列及び配列番号129のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
図8Aに示すように、IL-23を中和する抗体を、IL-23に特異的であるものと、IL-23とIL-12の両方を中和するものとに細かく分けることができる。IL-12及びIL-23は、共通のp40ポリペプチドを共有しており、p40に共有結合する第二の鎖が異なる(図7A)。IL-23のp19鎖及びIL-12のp35鎖は両方とも、4ヘリックスバンドル型のサイトカイン様ポリペプチドである。p19サブユニット及びp40サブユニットは、ジスルフィド結合によって共通のp40サブユニットに連結される。IL-12とIL-23の両方を中和する抗体は、この2つの分子間でのp40鎖の共有のために生じる。
配列番号136のアミノ酸配列;配列番号137のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号138のアミノ酸配列;配列番号139のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号146のアミノ酸配列;配列番号147のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号148のアミノ酸配列;配列番号149のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号156のアミノ酸配列;配列番号157のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号158のアミノ酸配列;配列番号159のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号166のアミノ酸配列;配列番号167のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号168のアミノ酸配列;配列番号169のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号176のアミノ酸配列;配列番号177のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh);
配列番号178のアミノ酸配列;配列番号179のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号186のアミノ酸配列;配列番号187のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(VH);
配列番号188のアミノ酸配列;配列番号189のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(VL)。
抗体を、IL-12応答性細胞株NK-92(CRL-2407, ATCC, Manassas, Virginia, USA)を用いて、IL-12中和能力についてアッセイした。B細胞クローニングプレートからの50μlの培養上清、又は抗体トランスフェクションからの50μlの上清を96ウェル組織培養プレートに移した。50μlのヒトIL-12(カタログ# Cyt-362, Prospec-Tany Technogene, Rehovot, Israel)を各ウェルに4ng/mlで添加した。プレートを室温で30〜60分間インキュベートし、その後、5×104個のNK-92細胞を100μl中で各ウェルに添加した。培養物を37℃で3日間インキュベートし、上清をヒトインターフェロン- 産生についてアッセイした。アッセイ培地は、RPMI 1640、10%FBS、NEAA、ピルピン酸塩、50μM 2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及び10ng/mlヒトIL-2(カタログ# Z00368, GeneScript社, Piscataway, NJ, USA)である。
ELISAアッセイを用いて、ヒトインターフェロン-γを検出した。プレートを、100μのPBS中1μg/mlの抗ヒトインターフェロン-γ(カタログ# Mab 1-D1K, Mabtech, Cincinnati, OH, USA)で、4℃で一晩又は37℃で1時間コーティングした。プレートを脱イオン水中で洗浄し、100μlのPBS、10%ヤギ血清で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄した後、50μlのPBS/10%ヤギ血清及び50μlの培養上清をプレートに添加し、1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、PBS/10%ヤギ血清中0.5μg/mlで100μl/ウェルの抗ヒトインターフェロン-γ--ビオチン(カタログ# Mab 7b6-1-ビオチン, Mabtech)を添加し、プレートをRTで1時間インキュベートし、洗浄し、PBS/10%ヤギ血清中1:1000で100μl/ウェルのストレプトアビジン-HRP(Jackson Labs)と反応させた。プレートを再洗浄し、00μl/ウェルのTMB基質(Thermo Scientific, IL, USA)を添加することによって、シグナルを検出した。100μl/ウェルの1N H2SO4で反応を停止させた後、光学密度を450nMで読み取った。
(ヒト化の概要)
ウサギ免疫グロブリン可変領域(V-領域)を免疫化ウサギ由来の末梢血B細胞から単離されたmRNAから取得する。これらのウサギB細胞を低密度で96ウェルプレートにプレーティングし、先に記載したように活性化した。定常領域由来の遺伝子特異的プライマーを第一鎖合成用に、及びその3'末端の入れ子型J-領域特異的プライマーを5'リーダープライマーとともにPCR工程用に用いる、逆転写酵素-PCR(RT-PCR)を用いて、V-領域cDNAを各ウェルのmRNAから増幅する。その後、V-領域を、ヒトIgG重鎖ベクターカセット、カッパ軽鎖ベクターカセット、又はラムダ軽鎖ベクターカセットのいずれかにクローニングし、HEK 293細胞で一過性に発現させ、72時間後のトランスフェクション上清を、全体のIgG発現とそれぞれの標的の中和の両方について試験する。その後、強力な中和作用物質(neutralizer)をシークエンシングし、それらがサブクローニングされたウェル中に存在する複雑さのレベルを決定した。固有の軽鎖及び重鎖の数を決定した後、存在する全ての考えられる組合せをHEK 293に再び一過性に発現させ、中和及びIgG含量についてアッセイした。その後、強力な中和作用物質を、他の望ましい活性についてさらにアッセイした。抗ヒトIL-6抗体を非ヒト霊長類由来のIL-6の中和について試験した。IL-12二量体とIL-23二量体は両方とも同じp19鎖を共有するので、抗ヒトIL-23抗体を、非ヒト霊長類IL-23の中和だけでなく、ヒトIL-12の中和についてもアッセイする。
ウサギ-ヒトキメラモノクローナル抗体を全長抗体としてヒト化することができる。これは、ヒトのVHフレームワーク領域及びVLフレームワーク領域を、ウサギCDRを保持したままウサギフレームワークと交換することを必要とし、多くの場合、特定のウサギフレームワーク残基を保持することを含む。齧歯類V-領域をヒト化する戦略も多数あるし、ウサギ-ヒトキメラ抗体を部分的に又は完全にヒト化し得る他の方法も考えられる。ここでは、本発明者らは、抗ヒトIL-6クローン9C8を抗体フォーマットでヒト化するために用いられる方法を記載する。高親和性かつ高効力のキメラmAbである9C8を、VH及びVLのフレームワーク領域をヒトフレームワーク配列に変化させることによってヒト化し、ウサギフレームワーク配列への復帰突然変異を制限した。
9C8 v1
FW VH復帰突然変異(H23-30):AASGIDLS(配列番号355)
CDR1 VH(H31-35):SYDMS
9C8 v2
FW-VH復帰突然変異(H23-30):TVSGIDLS(配列番号356)
CDR1 VH:(H31-35)SYDMS
ウサギV-領域は、scFvフォーマットで直接ヒト化することもできる。用いられるヒト化方法は、一般に、モノクローナル抗体をヒト化するのに用いられるものと同じであり得るが、全てのヒト化抗体が容易にscFvに変換されるわけではない。さらに、抗体のヒト化は、移植されたCDRとの定常領域相互作用を説明する必要条件を備えている。重鎖V-領域と軽鎖V-領域の両方の配列をヒト生殖系列比較し、実施例6.1に記載されているようなV-ベース(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)及びIgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の両方を用いて、配列を発現させた。
ヒト免疫グロブリン(Ig)V領域は、VH-FR3の比較的保存された残基(ヒトVH3ファミリー、アミノ酸H82)、及びカッパ軽鎖の位置L4で、軽鎖と重鎖の両方のCDR1にメチオニン残基を含むことが多い。これらのヒト化scFvは、メチオニン類似体を用いて最終的に共有結合されるので、成熟scFv内の全てのメチオニン残基は、別の天然に存在するアミノ酸に置換されなければならない。このアミノ酸置換は、得られるscFvの機能又は安定性に対して、最小限の影響しか及ぼさないもの、又は全く影響を及ぼさないものでなければならない。
(二重特異性体調製の一般的概観)
二重特異性scFvは、2つの異なるscFv抗原結合ドメインをリンカーによって互いにコンジュゲートさせることにより構築される。この戦略は、各scFvが二官能性リンカーにコンジュゲートされる2工程プロセスで実現される。二重特異性コンジュゲートを含む2つのscFvは、各々、特異的なコンジュゲーション部位の役割を果たす位置で単一の非天然アミノ酸(Aha又はその他)を含む。リンカーは、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性であることができ、scFvに含まれる非天然アミノ酸(Aha)と反応性がある相補的官能基(アルキン)を含む。反応スキームは、以下の実施例で詳述されているように、本発明者らによって、いくつかの二重特異性scFvの良好な作製にうまく適用されている(下記スキーム1)。
二重特異性体の調製の第一工程は、アジドホモアラニン(Aha)などの非天然アミノ酸を含むscFvのPEGによる部位特異的PEG化であり、該PEGは、ホモ二官能性(例えば、ビス-アルキン)又はヘテロ二官能性(例えば、少なくともモノ-アルキン)のどちらかである。一価のPEG化scFvを、このプロセスの第二工程の前に、一連のCHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーによって精製する。また、一価材料を、再フォールディングされるその能力について評価する。最後に、再フォールディングされた材料を活性についてバイオアッセイにより評価する。
(7.1.1 30kDa PEGへの28D2c Ahaのコンジュゲーション)
磁気撹拌棒を備えた250mLのガラスビーカーに、リン酸ナトリウムバッファー(250mM、pH7.4、7.1mL)及びSDSの溶液(10%wt/vol、3.3mL)を入れた。28D2c Ahaの溶液(2.81mg/mL、1当量、53mL)及び30K PEGアルキンの溶液(NOF、2mM、60mg/mL、8.7当量、22mL)を添加した。TBTAトリアゾール配位子及びヨウ化銅のDMSO溶液(両成分とも80mM、2.8mL)を速やかに添加すると、沈殿が生じた。混合物を5分間静置させておき、その後、撹拌を開始した。該混合物を一晩(18h)撹拌し、その後、SDS-PAGE(還元型)及びレーザーデンシトメトリーでアッセイすると、56%の収率が示された。
磁気撹拌子を備えた50mLの丸底フラスコに、水(9.7mL)、及び28D2c Ahaの溶液(2.58mg/mL、1当量、8.7mL)を添加した。この溶液に、20K PEGビス-アルキンの溶液(3mM、60mg/mL、4当量、1mL)を添加した。TBTAトリアゾール配位子(48mg)を添加し、溶液を数分間静置させておいた。ヨウ化銅のDMSO溶液(40mM、DMSO溶液、1.1mL)を添加し、丸底フラスコに蓋をして、混合物を一晩(16h)撹拌した。反応混合物をSDS-PAGE(還元型)及びデンシトメトリーで解析すると、42%の収率が示された。
磁気撹拌棒を備えた400mLのガラスビーカー中に、リン酸ナトリウムバッファー(50mM、pH7.4、14mL)、ドデシル硫酸ナトリウムの溶液(10%wt/vol、42mL)、及びジチオスレイトールの溶液(250mM、2.7mL)を入れた。13A8n Ahaの溶液(3mg/mL、1当量、86mL)及び20K PEGビス-アルキンの溶液(3mM、60mg/mL、26当量、75mL)を添加した。TBTAトリアゾール配位子(537mg)を添加し、混合物を撹拌しないで静置させておいた。硫酸銅溶液(80mM、6.4mL)を添加し、ビーカーをアルミ箔で覆った。混合物を室温で一晩(16時間)撹拌した。該混合物を、レーザーデンシトメトリーによるゲル解析を伴うSDS-PAGE(還元型)で評価すると、69%の収率が示された。図16A。
スクリューキャップ及び磁気撹拌子を備えた1000mLのガラスボトル中に、リン酸ナトリウムバッファー(50mM、pH=7.4、58mL)、SDSの溶液(10%wt/vol、112mL)、及びジチオスレイトールの溶液(250mM、7.2mL)を入れた。scFv 13A8c Ahaの溶液(3.5mg/mL、1当量、206mL)及び20K PEGビス-アルキンの溶液(3mM、60mg/mL、25当量、200mL)を該ボトルに添加した。TBTAトリアゾール配位子(1.4g)を添加し、混合物を撹拌しないで静置させておいた。5分後、硫酸銅の溶液(80mM、17mL)を添加し、該ボトルに蓋をして、混合物を適度な速度で一晩撹拌した。青灰色の溶液をSDS-PAGE(還元型)及びレーザーデンシトメトリー解析で評価し、反応物が70%の収率を有することを明らかにした(図16B)。
スクリューキャップ及び磁気撹拌棒を備えた500mLのポリカーボネート遠心分離ボトルの中に、scFv 13A8cAHAの溶液(8.8mg/mL、1当量、142mL)、リン酸ナトリウムバッファーの溶液(500mMストック溶液、pH=7.4、23mL)、及びSDSの溶液(20%wt/volストック溶液、8.8mL)を入れた。40K PEGビス-アルキン(9.35g)を該撹拌溶液に固体として添加した。混合物を全てのPEGが溶解するまで撹拌し、TBTAトリアゾール配位子(446mg)を添加し、該混合物を撹拌しないで5分間静置させておいた。撹拌を再開し、新鮮なシステインの溶液(250mMストック、534uL)を添加した。硫酸銅の溶液(160mMストック溶液、2.6mL)を添加し、混合物に窒素を行き渡らせ、適度な撹拌で4時間撹拌した。該反応混合物をレーザーデンシトメトリーによるゲル解析を伴うSDS-PAGE(還元型)用にサンプリングして、反応収率(51%)を決定した(図16C)。
磁気撹拌子を備えた250mLの丸底フラスコ中に、極めて純粋な水(12.5mL)、SDSの溶液(10%wt/volストック、17.3mL)、及びscFv 13A8L AHAの溶液(4.11mg/mLストック、26.3mL)を入れた。20K PEGビス-アルキンの溶液(3mM、60mg/mLストック、30mL)を該反応混合物に添加した。TBTAトリアゾール配位子(214mg)を添加し、混合物を撹拌しないで静置させておいた。撹拌を再開し、ジチオスレイトールの溶液(250mMストック、1.08mL)、次いで、硫酸銅の溶液(80mMストック、2.53mL)を添加した。丸底をセプタムで閉じ、一晩撹拌した。翌日、反応混合物をSDS-PAGE(還元型)で評価した。得られたゲルをレーザーデンシトメトリー解析で解析すると、60%の反応収率が示された(図16D)。
(7.2.1 20kDa PEG-ビスアルキンへのIL-23 31A12c Aha scFvのコンジュゲーション)
スクリューキャップ及び磁気撹拌子を備えた1000mLのガラスボトルに、リン酸ナトリウムバッファーの溶液(50mM、pH=7.4、65mL)、SDSの溶液(10%溶液、80mL)、及びジチオスレイトールの溶液(250mM、5.1mL)を入れた。該溶液を穏やかに撹拌し、IL-23-31A12c Ahaの溶液(pH=7.4、4mg/mL、1当量、121mL)及び20K PEGビス-アルキンの溶液(60mg/mL、26当量、142mL)を添加した。撹拌を中断し、TBTA(1.1g)を添加した。該材料を沈殿させておき(〜5分)、硫酸銅の溶液(80mM、12mL)を添加し、撹拌を再開した。ボトルに蓋をし、混合物を室温で16時間撹拌した。該反応混合物をSDS-PAGE(還元型)で解析し、得られたゲルをデンシトメトリーで解析すると、出発材料の所望のPEG化生成物への59%変換が示された(図16B)。
磁気撹拌子を備えた250mLの丸底フラスコ中に、リン酸ナトリウムバッファー(50mM、pH7.4、74mL)を入れ、撹拌を開始し、ジチオスレイトールの溶液(250mM、1.9mL)を添加した。scFv 45G5c Ahaの溶液(1.8mg/mL、1当量、53mL)及び20K PEGビスアルキンの溶液(3mM、60mg/mL、25当量、27mL)を該撹拌溶液に添加した。撹拌を中断し、TBTAトリアゾール配位子(382mg)を添加し、混合物を5分間静置させておいた。硫酸銅溶液(80mM、4.5mL)を添加し、フラスコにゴム製のセプタムで蓋をした。混合物を設定を最低にして一晩(16時間)撹拌した。反応をSDS-PAGE(還元ゲル)でアッセイし、ゲルをデンシトメトリーで解析すると、40%の収率が示された(図16E)。
フォールディングは、変性したscFv-PEG(例えば、8M尿素中)を取り、それを(例えば、透析又は接線流濾過によって)酸化還元系(例えば、システイン/シスチン)を含む部分変性バッファー(例えば、3M尿素)中に交換し、その後、それを非変性バッファー(例えば、リン酸緩衝化食塩水)中に交換することによって生じることができる。
30kDaの線状PEGビスアルキンがC末端にコンジュゲートされたscFv 28D2をフォールディングさせた。28D2c-PEGをまず精製し、バッファーを9M尿素及びジチオスレイトール(DTT)を含むバッファー、pH7.2に交換した。その後、28D2c-PEGを0.05〜1mg/mLタンパク質の出発濃度にまで希釈した。その後、出発材料を、室温で一晩、3M尿素、30mMトリス pH8.5、2〜6mMシステイン、及び1〜3mMシスチンからなる第一のフォールディングバッファー中に透析した。その後、該材料を、室温で一晩、20mMリン酸ナトリウム及び150mM NaCl、pH7.4からなる最終的なバッファー中に透析した。
線状PEG 20kDaがN末端又はC末端にコンジュゲートされたscFvの13A8n、13A8c、13A8L、及び31A12cも同様の方法でフォールディングさせた。これらのscFv-PEGを8M尿素及びDTTを含むバッファー中で調製し、0.05〜0.5mg/mLの総タンパク質になるまで希釈した。その後、それらを、室温で、3M尿素、30mMトリス pH8.5、2〜6mMシステイン、及び1〜3mMシスチンを含むフォールドバッファー中に透析した。交互に、pH8若しくは9、4M若しくは2M尿素、1%ポリソルベート80、及び/又は4℃での透析も用いた。タンパク質は、ポリソルベート80を添加した、又はポリソルベート80を添加していない、尿素を含まないフォールドバッファー中への透析によってフォールディングさせることもできた。フォールディングを、PBS、又は酸化還元系(2〜6mMシステイン及び1〜3mMシスチン)を含むPBS中への透析によって完了させた。具体的な例を表29に示す。
同様のフォールディング方法を、非PEG化scFv[例えば、13A8c及び22H8c]をフォールディングさせるために用いることができた。これらの方法は、望ましい場合、コンジュゲーションの前にタンパク質をフォールディングさせるのに有用であり得た。具体的な例として、3つのバッチの13A8cを、3M尿素、4mMシステイン、2mMシスチン、30mMトリスを含むバッファー、pH8.5中、0.1mg/mLの総タンパク質でフォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。この再フォールディングプロトコルは再現性があり、SDS-PAGEによる3つのバッチからの単量体13A8c回収収率は、それぞれ、37%、35%、及び44%であった。再フォールディングされた非PEG化22H8c scFvは、親mAbと比べて高い効力を保持していた。
抗IL-6/抗IL-23 scFv PEGコンジュゲートの作製の次の工程は、Ahaなどの非天然アミノ酸を含むscFvの、実施例7で調製されたscFv-PEGアルキンコンジュゲートへのコンジュゲーションである。コンジュゲーション反応後、混合物をクロマトグラフィーの組合せによって精製し、その後、再フォールディングプロセスを経ると、所望のscFv-PEG-scFv二重特異性体が得られる。最終的な材料を、生体活性及び薬物動態特性、並びに疾患モデルにおける効力について評価する。
磁気撹拌棒を備えた1Lのガラスビーカー中に、リン酸ナトリウムバッファー(125mM、pH7.4、486mL)を入れた。28D2c Ahaの溶液(4.2mg/mL、5.1mL)及び31A12c-PEGの溶液(0.49mg/mL、44mL)を添加した。TBTAトリアゾール配位子及びヨウ化銅の溶液(両成分とも80mM、16mL)を添加すると、沈殿が形成した。混合物を一晩(16時間)撹拌した。反応混合物をSDS-PAGE(還元型)及びデンシトメトリーで解析した(収率=29%)。
スクリューキャップ及び小型撹拌棒を備えた2000mLのガラスボトルに、水(814mL)、及びジチオスレイトールの溶液(250mM、12mL)を添加し、穏やかに撹拌した。scFv 13A8c Ahaの溶液(0.85mg/mL、35mL)、次いで、31A12c-PEGコンジュゲートの溶液(0.55mg/mL、55mL)を添加した。MESバッファーの溶液(80mM、pH7.5、56mL)及び硫酸銅(80mM、28mL)を添加した。該ボトルに蓋をし、混合物を最低撹拌速度で一晩(16時間)撹拌した。反応をSDS PAGE(還元型)及びデンシトメトリーで解析すると、51%の収率が示された。2つのさらなる1000mL反応を同時に実施すると、同様の収率であった。
磁気撹拌子を備えたスクリューキャップ付きの2000mLのガラスボトル中に、水(830mL)を入れ、ジチオスレイトールの溶液(250mM、12mL)を添加しながら、この溶液を穏やかに撹拌した。scFv 31A12cAhaの溶液(0.88mg/mL、45mL)及びコンジュゲート13A8c-PEGの溶液(0.7mg/mL、30mL)を添加した。MESバッファー(80mM、56mL)及び硫酸銅の溶液(80mM、28.1mL)を添加し、ボトルに蓋をした。一晩穏やかに撹拌し続ける。反応混合物のSDS PAGE解析及びデンシトメトリーにより、48%の収率が示された。反応を、2つのさらなる1L反応及び7つのさらなる500mL反応を用いて同時に実施すると、49%の平均収率であった(図18A)。
小型磁気撹拌子を備えたスクリューキャップ付きの2000mLのガラスボトル中に、水(640mL)及びDTTの溶液(250mM、9.6mL)を入れた。この混合物に、31A12cAhaの溶液(0.88mg/mL、27mL)及び13A8c-PEGコンジュゲートの溶液(0.42mg/mL、56mL)を添加した。MESバッファー(80mM、45mL)及び硫酸銅溶液(80mM、23mL)を添加し、ボトルに蓋をした。混合物を、最低撹拌速度で、一晩(16時間)穏やかに撹拌した。SDS-PAGE及びデンシトメトリーによって、47%の収率が示された。2つのさらなる反応を先に記載したのと同じように調製すると、ゲル解析によって、それぞれ、51%及び47%の収率が得られた。
大きい磁気撹拌棒を備えた2000mLのガラスビーカー中に、水(898mL)及びDTTの溶液(250mM、12mL)を入れた。45G5cAhaの溶液(0.9mg/mL、33mL)及び13A8n-PEGの溶液(0.98mg/mL、30mL)を添加した。硫酸銅溶液(80mM、28mL)を添加し、混合物を一晩撹拌した(16時間)。第二の同一の反応を先に記載した反応と並行して実施した。反応混合物をSDS-PAGE(還元型)及びデンシトメトリーで評価した(24%収率-反応1及び25%反応2)(図18B)。
スクリューキャップ及び磁気撹拌子を備えた2000mLのボトル中に、水(950mL)及びDTTの溶液(250mM、14mL)を入れて、穏やかに撹拌した。この撹拌溶液に、scFv 22H8cAhaの溶液(0.75mg/mL、60mL)及び13A8c-PEGコンジュゲートの溶液(0.69mg/mL、35mL)を添加した。MESバッファー(80mM、65mL)及び硫酸銅の溶液(80mM、32mL)を添加し、該ボトルに蓋をして、混合物を一晩撹拌した。SDS PAGE解析及びデンシトメトリーによって、60%の収率が示された(図18C)。同じ割合のさらに5つの1150mL反応を同時に実施すると、54%の平均収率であった。
磁気撹拌子を備えたスクリューキャップ付きの5000mLのガラスボトル中に、リン酸ナトリウムバッファー(5mMストック溶液、2100mL)を入れた。一価の中間体13A8c-40KPEGの溶液(0.34mg/mLストック、138mL)及びscFv31A12cAHAの溶液(3.2mg/mLストック、26.1mL)を添加した。該溶液を穏やかに撹拌しながら、MESバッファー(80mMストック、141mL)及びジチオスレイトールの溶液(250mMストック、12mL)を添加した。硫酸銅の溶液(80mMストック、70mL)を添加し、該ボトルに蓋をして、一晩穏やかに撹拌し続けた。反応混合物のSDS PAGE解析及びデンシトメトリーによって、58%の収率が示された。反応を、2つのさらなる2.5L反応及び1つのさらなる1.0L反応を用いて同時に実施すると、58%の平均収率であった(図18D)。
磁気撹拌子を備えた8×30mMのバイアル中に、水(87uL)及びMESバッファー(80mMストック、5.6uL)を入れた。これに、31A12c-20KPEGの溶液(0.550mg/mLストック、3.8uL)及びscFv 13A8LAHAの溶液(4.11mg/mLストック、0.95uL)を添加した。DTTの溶液(250mMストック、1.2uL)及び硫酸銅の溶液(80mMストック、2.8uL)を添加し、バイアルに蓋をし、室温で一晩撹拌させておいた。翌日、反応混合物をSDS-PAGE用にサンプリングした。得られたゲルをレーザーデンシトメトリーで解析し、37%の二重特異性体の収率が示された(図18E)。
線状の20kDa PEGリンカーを介して13A8にコンジュゲートされた31A12(両方ともC末端にコンジュゲートされている)を、上に示したものと同様の方法でフォールディングさせた。二重特異性分子を、8M尿素及びDTTを含むバッファー、pH7.3中、0.05〜0.1mg/mLの総タンパク質で調製した。材料は、この段階で、二重特異性分子の他に、若干量の残留未反応31A12-PEG scFvを含んでいる可能性があった。その後、該材料を、3M尿素、30mMトリス pH8.5、4mMシステイン、2mMシスチン中に、室温で一晩透析することによってフォールディングさせた。任意に、1%ポリソルベート80、500mMトリス、又は500mMアルギニンも、該フォールドバッファーに添加したか、又はフォールディングを4℃で実施することができた。フォールディング反応物を20mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4(PBS)中にさらに透析した。具体的な例としては、4つのバッチの0.1mg/mLの31A12c-PEG-13A8cを、3M尿素、30mMトリス pH8.5、4mMシステイン、2mMシスチン中、室温で再フォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。この再フォールディングプロトコルは再現性があり、同様の単量体二重特異性scFv回収収率及びEC50をもたらした(表30、図19A及び19B)。単量体タンパク質を回収し、得られた分子は、親分子と比べて高い生体活性を保持していた。重要なことに、フォールディングは、大量の31A12c-PEG scFvの存在下でもうまく行った。さらに、表面プラズモン共鳴データによって、IL-6標的(13A8)とIL-23標的(31A12)の両方に対する二重特異性体の両方の末端の生体活性がさらに確認された(表31)。
13A8n-PEG-45G5cを、31A12に基づく二重特異性体についての方法と同様の方法でフォールディングさせた。0.1mg/mLのタンパク質を、3M尿素、30mMトリス pH8.5、4mMシステイン、2mMシスチン中でフォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。これにより、SEC による29%の単量体回収、並びにIL-6に対する933pg/mLのEC50、及びIL-23に対する5,662pg/mLのEC50が得られた(図22A及びB)。
Th17 T細胞サブセット及びTh22 T細胞サブセットは、抗CD3+抗CD28を用いた全PBMC若しくは純化T細胞の刺激によるか、又は混合リンパ球培養物中の同種異系細胞によるかのどちらかによって、インビトロで分化させることができる(図26A)。そのようなT細胞の分化は、Th17細胞について特に十分に特徴付けられているいくつかの重要な調節性サイトカインの添加をさらに必要とする。これらの調節性サイトカインは、主に骨髄性細胞に由来しており、該調節性サイトカインの添加は、骨髄性細胞をその調節性サイトカインを放出するように刺激する化合物と併せた該骨髄性細胞の添加と置き換えることができる。LPSを抗CD3とともに用いて、Th17細胞へと分化するように全PBMCを刺激した。多くの研究者により、骨髄性細胞に由来するこれらのサイトカインが、純化されたナイーブT細胞からのTh17の分化を促進することが以前に示されているように、最も良好な結果は、IL-1及びTGFβも添加したときに得られた。Th17 T細胞及びTh22 T細胞は、骨髄性細胞をその調節性サイトカインを放出するように誘導する刺激物質を添加して、同種異系混合リンパ球培養物(MLC)中で分化させることもできる。ペプチドグリカンは、IL-1、IL-6、TNF、並びに他の調節性サイトカイン及び炎症促進性サイトカインの分泌を誘導することが知られているので、ペプチドグリカンをその刺激物質としてMLCに添加した。Th22細胞の誘導を研究することが目的である場合、IL-2の添加も必要であった。PBMCを抗CD3/28+LPS及びTGFβで刺激した。5日後、それらをPMA+イオノマイシンで再刺激して、サイトカイン分泌を誘導し、IL-17の発現についてフローサイトメトリーで解析した。PBMC培養物中のTh17細胞のパーセンテージは、これらの培養条件の結果として3倍になった(図26B)。IL-23アンタゴニストと組み合わせてIL-6を含めると、Th17細胞の3倍化が妨げられた。Th22細胞は、抗CD3/28刺激でも見られる(図26C)。同種異系白血球を用いるインビトロのヒトT細胞のインビトロ刺激もまた、高レベルのIL-17産生T細胞を誘導した(図26D)。
インビボでのTH17及びTH22分化の阻害を評価するために、異種移植片モデルを使用した。このモデルでは、ヒト造血幹細胞が免疫不全マウスに移植され、それにより、ヒト免疫系が獲得されている。これらのヒト化NOD-scid IL2rgnull(NSG)マウスに、マウスに存在するヒト免疫細胞と同種異系のヒト皮膚を移植する(図30)。その後、それらを、IL-6及びIL-23のPEG化scFvアンタゴニスト(13A8c-PEG及び31A12c-PEG)の混合物で処置する。その後、ヒト免疫系は、ヒトT細胞のエフェクター細胞への分化を介して、この同種異系ヒト皮膚を拒絶する。IL-6アンタゴニスト及びIL-23アンタゴニストは、同種異系皮膚移植の1つの結果であるTh17細胞の分化を阻害したが、これらのアンタゴニストは、皮膚同種移植片の拒絶を阻害せず、その狙いを定めた免疫抑制効果を反映した。簡潔に述べると、新生NSGマウスに放射線照射し、臍帯血由来のヒト造血幹細胞を注射し、その後、12週での末梢血中の生着レベルをスクリーニングした(Brehmらの文献(2010))。生着に成功したマウスに、ヒト同種異系皮膚を移植し、100μgの抗IL-6及び抗IL-23(13A8c-PEG及び31A12c-PEG)を2日おきに投与した。皮膚移植から30日後、脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液をPMA/イオノマイシンで刺激し、細胞内サイトカインについてアッセイした。CD3+/CD4+細胞を、IL-17及びIL-22産生についてフローサイトメトリーで解析した。
炎症部位でのTh17エフェクター機能の阻害を評価するために、ヒトの乾癬皮膚が免疫不全scidマウスに移植されているscid/hu乾癬モデルを用いた。皮膚移植片及び乾癬炎症は、最大2カ月間存続する。このマウスを薬物で2週間処置し、炎症に対する効果を、図33に示すような組織学的解析で測定する。この解析では、13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23二重特異性体の効果を、表皮厚の有意な低下に明白に見ることができる。この効果は、組織学的切片から定量することもできる。13A8c-20kPEG-31A12cとその一価抗IL-6阻害剤成分、又はIL-6アンタゴニストmAbのトシリズマブ(Actemra)との比較は、移植片がまだマウス表面に存在する間の、病理学者による半定量的臨床スコアリング(図34A)、又は上記のような組織学的切片における表皮厚の定量的測定(図34B)のどちらかによって測定される、どちらかのIL-6アンタゴニスト単体に対する13A8c-20kPEG-31A12cの有意な優位性を示している。さらに、13A8c-20kPEG-31A12cは、TNFアンタゴニストのEnbrelよりも素速く炎症を阻害するように作用する(図34C〜D)。
ヒトIL-23はマウスIL-23受容体に作用することができるので、ヒトIL-23をマウスの耳に皮内注射すると、該IL-23は炎症を引き起こす。耳に4日間毎日IL-23を注射することにより、ヒトIL-23によって誘導される耳の炎症を阻害する13A8c-PEG-31A12cの能力を測定した。その後、耳の腫脹を測定した(図35A)。IL-23処置が始まる前日に始めて、IL-23処置が始まった翌日に、マウスを処置し、この処置は、耳の腫脹を効果的に阻止した(図35B)。13A8c-PEG-31A12cは、図35Cに示すように、IL-12/23アンタゴニストmAbのStelera(ウステキヌマブ)と少なくとも同じくらい効果的であった。重要なことに、20kDa PEG又は40kDa PEGのどちらかを用いて作製された13A8c-PEG-31A12cによるマウスの処置は、IL-23処置が始まる前日にしか投与されない場合でも、耳の腫脹の非常に効果的な阻害剤となった(図35D)。
31A12 mAbは、これまでに記載されていない独特のエピトープに結合する。使用されたmAbは全て、ヒトIL-12に結合するが(図36B)、31A12及び49B7は、IL-23阻害に特異的であり、ヒトIL-12を阻害しない(図36B)。これらのデータは、これらのmAbがp40鎖に結合することを明白に示している。31A12及び49B7は、IL-12も阻害する22H8と比べて、比較的弱くヒトIL-12に結合する。しかしながら、3つのmAbは全て、サルIL-12に強く結合し(図36B)、かつサルIL-12生体活性も阻害する(図36C)。したがって、31A12及び49B7は、ヒトIL-12活性とサルIL-12活性を識別する。31A12及び49B7は、ヒトIL-12で部分的にマスクされ、サルIL-12、及び両方の種由来のIL-23で露出しているp40エピトープを認識するようである。さらに、AZ17は、ヒトIL-12とヒトIL-23の両方を阻害するp40特異的mAbである、ウステキヌマブの結合を阻害しない。
本発明のある実施態様では、抗IL-6抗体又は変異体抗IL-6抗体のFab、Fab'、F(ab)'断片が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-23抗体又は変異体抗IL-23抗体のFab、Fab'、F(ab)'断片が提供される。
本発明のある実施態様では、抗IL-23/IL-12抗体又は変異体抗IL-23/IL-12抗体のFab、Fab'、F(ab)'断片が提供される。
本発明は、抗IL-6、抗IL-23、及び抗IL-23/IL-12抗体、又はそれらの誘導体への非天然アミノ酸残基の組込みを提供して、抗IL-6抗体又はその誘導体の、抗IL-23又は抗IL-23/IL-12抗体、又はそれらの誘導体への付着点を提供する。当業者は、例えば、アジドホモアラニン(Aha)を含む、いくつかの潜在的に好適な非天然アミノ酸を認識している。さらなる非天然アミノ酸としては、アジドノルロイシン、3-(1-ナフチル)アラニン、3-(2-ナフチル)アラニン、p-エチニル-フェニルアラニン、p-プロパルギル-オキシ-フェニルアラニン、m-エチニル-フェニルアラニン、6-エチニル-トリプトファン、5-エチニル-トリプトファン、(R)-2-アミノ-3-(4-エチニル-1H-ピロル-3-イル)プロパン酸(propanic acid)、p-ブロモフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン(idiophenylalanine)、p-アジドフェニルアラニン、3-(6-クロロインドリル)アラニン、3-(6-ブロモインドリル(bromoindoyl))アラニン、3-(5-ブロモインドリル)アラニン、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、及びp-クロロフェニルアラニンが挙げられる。好ましい実施態様では、非天然アミノ酸はAhaである。
平衡解離定数は、SensiQ Pioneer(ICx Nomadics, Stillwater, OK)、及びアミンカップリングに適したカルボキシル化COOH1センサー(同上)を用いて、表面プラズモン共鳴によって決定した。プロテインG(6510-10, Biovision, Mountain View, CA)を、アミンカップリング試薬(Sigma Aldrich(N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS, 56480)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC, E7750)、エタノールアミン(398136), St. Louis, MO)を用いるか、又はBiacoreアミンカップリングキット(BR-1000-50, GE Healthcare, Waukesha, WI)を用いて、COOH1センサーにカップリングさせた。
配列番号16のアミノ酸配列及び配列番号17のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号18のアミノ酸配列及び配列番号19のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号28のアミノ酸配列及び配列番号29のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号36のアミノ酸配列及び配列番号37のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号38のアミノ酸配列及び配列番号39のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号46のアミノ酸配列及び配列番号47のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号48のアミノ酸配列及び配列番号49のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号56のアミノ酸配列及び配列番号57のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号58のアミノ酸配列及び配列番号59のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号96のアミノ酸配列及び配列番号97のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号98のアミノ酸配列及び配列番号99のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
配列番号106のアミノ酸配列及び配列番号107のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号108のアミノ酸配列及び配列番号109のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号116のアミノ酸配列及び配列番号117のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号118のアミノ酸配列及び配列番号119のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)
配列番号126のアミノ酸配列及び配列番号127のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖(Vh)。
配列番号128のアミノ酸配列及び配列番号129のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖(Vl)。
抗体を、IL-12応答性細胞株NK-92(CRL-2407, ATCC, Manassas, Virginia, USA)を用いて、IL-12中和能力についてアッセイした。B細胞クローニングプレートからの50μlの培養上清、又は抗体トランスフェクションからの50μlの上清を96ウェル組織培養プレートに移した。50μlのヒトIL-12(カタログ# Cyt-362, Prospec-Tany Technogene, Rehovot, Israel)を各ウェルに4ng/mlで添加した。プレートを室温で30〜60分間インキュベートし、その後、5×104個のNK-92細胞を100μl中で各ウェルに添加した。培養物を37℃で3日間インキュベートし、上清をヒトインターフェロン-γ産生についてアッセイした。アッセイ培地は、RPMI 1640、10%FBS、NEAA、ピルピン酸塩、50μM 2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及び10ng/mlヒトIL-2(カタログ# Z00368, GeneScript社, Piscataway, NJ, USA)である。
Claims (122)
- 抗IL-6抗体又はその誘導体、及び抗IL-23抗体又はその誘導体を含む、二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、モノクローナル抗体であるか、若しくはモノクローナル抗体に由来するものであり、かつ/又は前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、モノクローナル抗体であるか、若しくはモノクローナル抗体に由来するものである、請求項1記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項2記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記モノクローナル抗体がキメラ抗体である、請求項2記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記キメラ抗体がヒト化フレームワーク領域を含む、請求項4記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 抗IL-6抗体の誘導体及び/又は抗IL-23抗体の誘導体を含み、ここで、該誘導体(複数可)が、可変領域全体、可変領域の重鎖(VH)、可変領域の軽鎖(VL)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dAb、又は相補性決定領域(CDR)を含み得る、請求項1〜4のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記誘導体がscFvである、請求項6記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体、及び/又は前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つの非天然アミノ酸を組み込むように修飾されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKG(配列番号335)
(式中、
X1は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群から選択され;かつ
X2は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択され;かつ
好ましくは、X1は、セリン又はトレオニンであり、かつX2が、トリプトファン又はチロシンである)
を含むCDR2領域を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列RX1STLX2S(配列番号336)(式中、X1及びX2は、独立に、アラニン又はトレオニンである)を含むCDR5領域を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10〜15からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体の重鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10〜12からなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体の軽鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号13〜15からなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、配列番号10〜15のアミノ酸配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体の重鎖が、配列番号259を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体の軽鎖が、配列番号261を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体がscFvである、請求項1〜16のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、
(i)配列番号10〜12からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖;及び
(ii)配列番号13〜15からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖
を含むscFvである、請求項1〜17のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、
(i)配列番号259のアミノ酸配列を含む重鎖;及び
(ii)配列番号261のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含むscFvである、請求項1〜18のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10〜15からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有する、請求項1〜19のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10〜15からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10〜15からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項21記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、配列番号10〜15のアミノ酸配列に対応するCDRを有する抗IL-6抗体と同じエピトープに結合する少なくとも1つのCDR領域を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、13A8、9H4、9C8、8C8、18D4、及び28D2からなる群から選択されるか、又は該群に由来する、請求項1〜23のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列YYAX1WAX2G(配列番号337)
(式中
X1は、セリン、プロリン、及びアスパルテートからなる群から選択され、かつ
X2は、リジン及びグルタミンからなる群から選択される)
を含むCDR2領域を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列AX1TLX2S(配列番号338)
(式中、
X1は、セリン及びアラニンからなる群から選択され、
X2は、アラニン及びトレオニンからなる群から選択される)
を含むCDR5領域を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90〜95からなる群から選択される、請求項1〜26のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体の重鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90〜92からなる群から選択される、請求項1〜27のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体の軽鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号93〜95からなる群から選択される、請求項1〜28のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、配列番号90〜95のアミノ酸配列を含む、請求項1〜29のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体の重鎖が、配列番号267を含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体の軽鎖が、配列番号269を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体がscFvである、請求項1〜32のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、
(i)配列番号90〜92からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖;及び
(ii)配列番号93〜95からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖
を含むscFvである、請求項1〜33のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、
(i)配列番号267を含む重鎖;及び
(ii)配列番号269を含む軽鎖
を含むscFvである、請求項1〜24のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90〜95からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有する、請求項1〜35のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90〜95からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換を含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90〜95からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項37記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、配列番号90〜95のアミノ酸配列に対応するCDRを有する抗IL-23抗体と同じエピトープに結合する少なくとも1つのCDR領域を含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、31A12、34E11、35H4、49B7、及び16C6からなる群から選択されるか、又は該群に由来する、請求項1〜39のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体が、IL-12を阻害することもできる(すなわち、抗IL-23/IL-12抗体)、請求項1〜24のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列WX1KG(配列番号358)(式中、X1は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、又はトリプトファンであり、好ましくは、アラニン又はバリンである)を含むCDR2領域を含む、請求項41記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列YAYX1GDAFDP(配列番号339)(式中、X1は、アラニン又はイソロイシンである)を含むCDR3領域を含む、請求項42記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列SDYFNX1(配列番号340)(式中、X1は、イソロイシン又はバリンである)を含むCDR3領域を含む、請求項42記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列QX1SQX2(配列番号359)
(式中、
X1は、アラニン又はセリンであり、かつ
X2は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群から選択され;
好ましくは、X2は、セリン又はトレオニンである)
を含むCDR4領域を含む、請求項41〜44のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列ASX1LA(配列番号341)(式中、X1は、リジン又はトレオニンである)を含むCDR5領域を含む、請求項41〜45のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列QSYYDX1NAGYG(配列番号342)(式中、X1は、アラニン又はバリンである)を含むCDR6領域を含む、請求項41〜46のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140〜145からなる群から選択される、請求項41〜47のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体の重鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140〜142からなる群から選択される、請求項41〜48のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体の軽鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号143〜145からなる群から選択される、請求項41〜49のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、配列番号140〜145のアミノ酸配列を含む、請求項41〜50のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体の重鎖が、配列番号271を含む、請求項41〜51のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23抗体又はその誘導体の軽鎖が、配列番号273を含む、請求項41〜52のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-p40抗体又はその誘導体がscFvである、請求項41〜53のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、
(i)配列番号140〜142からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖;及び
(ii)配列番号143〜145からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖
を含むscFvである、請求項41〜54のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、
(i)配列番号271を含む重鎖;及び
(ii)配列番号273を含む軽鎖
を含むscFvである、請求項41〜55のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。 - 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140〜145からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有する、請求項41〜56のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140〜145からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換を含む、請求項41〜57のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140〜145からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項58記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、配列番号140〜145のアミノ酸配列に対応するCDRを有する抗IL-23/IL-12抗体と同じエピトープに結合する少なくとも1つのCDR領域を含む、請求項41〜59のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体が、22H8、45G5、14B5、4F3、5C5、及び1H1からなる群から選択されるか、又は該群に由来する、請求項41〜60のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体と前記抗IL-23抗体又はその誘導体の両方が、1以上の非天然アミノ酸を組み込んでいる、請求項1〜61のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記抗IL-6抗体又はその誘導体が、各々の抗体又はその誘導体中の非天然アミノ酸間のリンカーを介して、前記抗IL-23抗体又はその誘導体に結合している、請求項62記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- リンカーがPEG分子である、請求項63記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- アミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKG(配列番号335)
(式中、
X1は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群から選択され;かつ
X2は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択され;かつ
好ましくは、X1は、セリン又はトレオニンであり、かつX2が、トリプトファン又はチロシンである)
を含むCDR2領域を含む、抗IL-6抗体又はその誘導体。 - アミノ酸配列RX1STLX2S(配列番号336)(式中、X1及びX2は、独立に、アラニン又はトレオニンである)を含むCDR5領域を含む、IL-6抗体又はその誘導体。
- 配列番号10〜15又は20〜25又は30〜35又は40〜45又は50〜55又は60〜65から選択される配列を有する1以上のCDR(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDR)を有する、抗IL-6抗体又はその誘導体。
- 13A8、9H4、9C8、8C8、18D4、及び28D2、若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される抗IL-6抗体若しくはその誘導体;又は該抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗IL-6抗体若しくはその誘導体。
- 配列番号259のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号261のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項67記載の抗IL-6抗体又はその誘導体。
- アミノ酸配列YYAX1WAX2G(配列番号337)
(式中、
X1は、セリン、プロリン、及びアスパルテートからなる群から選択され、かつ
X2は、リジン及びグルタミンからなる群から選択される)
を含むCDR2領域を含む、IL-23抗体又はその誘導体。 - アミノ酸配列AX1TLX2S(配列番号338)
(式中、
X1は、セリン及びアラニンからなる群から選択され、
X2は、アラニン及びトレオニンからなる群から選択される)
を含むCDR5領域を含む、IL-23抗体又はその誘導体。 - 配列番号90〜95又は100〜105又は110〜115又は120〜25又は130〜135から選択される配列を有する1以上のCDR(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDR)を有する、抗IL-23抗体又はその誘導体。
- 31A12、34E11、35H4、49B7、及び16C6、若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される抗IL-23抗体若しくはその誘導体;又は該抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗IL-23抗体若しくはその誘導体。
- 配列番号267記載のアミノ配列を含む重鎖、及び配列番号269記載のアミノ配列を含む軽鎖を含む、請求項72記載の抗IL-23抗体又は誘導体。
- アミノ酸配列WX1KG(配列番号358)(式中、X1は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、又はトリプトファンであり、好ましくは、アラニン又はバリンである)を含むCDR2領域を含む、抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。
- アミノ酸配列YAYX1GDAFDP(配列番号339)(式中、X1は、アラニン又はイソロイシンである)を含むCDR3領域を含む、抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。
- アミノ酸配列SDYFNX1(配列番号340)(式中、X1は、イソロイシン又はバリンである)を含むCDR3領域を含む、抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。
- アミノ酸配列QX1SQX2(配列番号359)
(式中、
X1は、アラニン若しくはセリンであり、かつ
X2は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンからなる群から選択され;
好ましくは、X2は、セリン若しくはトレオニンである)
を含むCDR4領域を含み;かつ/又は
アミノ酸配列ASX1LA(配列番号341)(式中、X1は、リジン若しくはトレオニンである)を含むCDR5領域を含み;かつ/又は
アミノ酸配列QSYYDX1NAGYG(配列番号342)(式中、X1は、アラニン若しくはバリンである)を含むCDR6領域を含む、抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。 - 配列番号140〜145又は150〜155又は160〜165又は170〜175又は180〜185又は190〜195から選択される配列を有する1以上のCDR(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDR)を有する、抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。
- 22H8、45G5、14B5、4F3、5C5、及び1H1、若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される、抗IL-23/IL-12抗体若しくはその誘導体;又は該抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗IL-23/IL-12抗体若しくはその誘導体。
- 配列番号271記載のアミノ配列を含む重鎖、及び配列番号273記載のアミノ配列を含む軽鎖を含む、請求項79記載の抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体。
- PEG化されている、請求項65〜81のいずれか一項記載の抗IL-6若しくは抗IL-23(抗IL-23/IL-12抗体を含む)、又はそれらの誘導体。
- 請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの一部をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜81のいずれか一項記載の抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項83又は84記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドの核酸配列が、大腸菌(E. coli)での発現に最適化されている、前記ポリヌクレオチド。
- 請求項83〜85のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項86記載のベクターを含む宿主細胞。
- 栄養要求性である、請求項87記載の宿主細胞。
- 請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトを産生する方法であって:
(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL-6抗体又はその誘導体を提供すること;
(ii)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている、抗IL-23抗体又はその誘導体(抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体を含む)を提供すること;
(iii)これら2つが各部分の非天然アミノ酸間の連結によって結合されるように、該修飾された抗IL-6抗体又は修飾されたその誘導体を、該修飾された抗IL-23抗体又は修飾されたその誘導体と反応させること
を含む、前記方法。 - 前記修飾された抗IL-6抗体又は修飾されたその誘導体と修飾された抗IL-23抗体又は修飾されたその誘導体の間の連結がリンカー部分を含み、ここで、該リンカー部分の一方の末端が、該修飾された抗IL-6抗体又は修飾されたその誘導体の非天然アミノ酸に結合されており、かつ該リンカー部分のもう一方の末端が、該修飾された抗IL-23抗体又は修飾されたその誘導体の非天然アミノ酸に結合されている、請求項89記載の方法。
- 前記リンカー部分が、PEG、水溶性ポリマー、ポリビニルアルコール、多糖、ポリアルキレンオキシド、ヒドロキシエチルデンプン、又はポリオール、好ましくはPEGを含む、請求項90記載の方法。
- 前記非天然アミノ酸が、連結の前のアジド、アルキン、アルケン、歪んだシクロオクチン、歪んだシクロアルケン、シクロプロペン、ノルボルネン、又はアリール、アルキル、若しくはビニルハライド、ケトン、アルデヒド、シアノ、ヒドラジン、ケタール、アセタール、ヒドラジド、アルコキシアミン、ボロン酸、有機スズ、有機ケイ素、β-シリルアルケニルハライド、β-シリルアルケニルスルホネート、ニトリル酸化物、ピロン、テトラジン、ピリダジン、アリールスルホネート、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール、α-ケト酸基を含む、請求項89〜91のいずれか一項記載の方法。
- 前記非天然アミノ酸が、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、p-ブロモフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、又はエチニルフェニルアラニン(ethynylephenylalanine)、trans-クロチルアルケンなどの内部アルケンを含むアミノ酸、セリンアリルエーテル、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、又はビニルグリシン、ピロリジン、N-σ-o-アジドベンジルオキシカルボニル-L-リジン(AzZLys)、N-σ-プロパルギルオキシカルボニル-L-リジン、N-σ-2-アジドエトキシカルボニル-L-リジン、N-σ-tert-ブチルオキシカルボニル-L-リジン(BocLys)、N-σ-アリルオキシカルボニル-L-リジン(AlocLys)、N-σ-アセチル-L-リジン(AcLys)、N-σ-ベンジルオキシカルボニル-L-リジン(ZLys)、N-σ-シクロペンチルオキシカルボニル-L-リジン(CycLys)、N-σ-D-プロリル-L-リジン、N-σ-ニコチノイル-L-リジン(NicLys)、N-σ-N-Me-アントラニロイル-L-リジン(NmaLys)、N-σ-ビオチニル-L-リジン、N-σ-9-フルオレニルメトキシカルボニル-L-リジン、N-σ-メチル-L-リジン、N-σ-ジメチル-L-リジン、N-σ-トリメチル-L-リジン、N-σ-イソプロピル-L-リジン、N-σ-ダンシル-L-リジン、N-σ-o,p-ジニトロフェニル-L-リジン、N-σ-p-トルエンスルホニル-L-リジン、N-σ-DL-2-アミノ-2カルボキシエチル-L-リジン、N-σ-フェニルピルバミド-L-リジン、N-σ-ピルバミド-L-リジンである、請求項89〜92のいずれか一項記載の方法。
- 第一の部分を第二の部分と結合させる反応が、[3+2]環状付加若しくはアジド-アルキン環状付加反応、シュタウディンガーライゲーション、ヘック反応、薗頭反応、鈴木反応、スティルカップリング、檜山/デンマーク反応、オレフィンメタセシス、ディールス-アルダー反応、又はヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、若しくはヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合である、請求項89〜93のいずれか一項記載の方法。
- 請求項89〜94のいずれか一項記載の方法であって:
(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL-6抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること;
(ii)少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL-23抗体又はその誘導体(抗IL-23/IL-12抗体又はその誘導体を含む)をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること;
(iii)該宿主細胞が、修飾された抗IL-6抗体又はその誘導体、及び修飾された抗IL-23抗体又はその誘導体を発現するような条件下で、該宿主細胞を成長させること、
(iv)該抗IL-6抗体又はその誘導体、及び該抗IL-23抗体又はその誘導体を単離すること;
(v)該抗IL-6抗体又はその誘導体が、各部分の非天然アミノ酸間の連結によって該抗IL-23抗体又はその誘導体と結合されるように、該抗IL-6抗体又はその誘導体を該抗IL-23抗体又はその誘導体と反応させること
を含む、前記方法。 - 請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトに含めるのに好適な親抗体を選択する方法であって:
(i)IL-6又はIL-23に特異的なB細胞を選択する工程;
(ii)該B細胞の個別の試料を(例えば、96細胞ウェルプレートのウェルに)分注する工程;
(iii)該B細胞を培養する工程;
(iv)抗体を含む上清を、各々の分注試料から個別に回収する工程;
(v)各々の分注試料由来の上清を(例えば、ELISAを用いて)IL-6又はIL-23結合についてアッセイする工程;
(vi)該各々の分注試料由来の上清をIL-6又はIL-23活性の阻害についてアッセイする工程;
(vii)高レベルのIL-6若しくはIL-23活性の阻害及び/又は強いIL-6若しくはIL-23結合を示したウェルから抗体を選択する工程;並びに
(viii)任意に、IL-23分注試料由来の上清をIL-12活性の阻害についてアッセイする工程;並びに
(ix)高レベルのIL-12活性及び/又は強いIL-12結合をさらに示すIL-23抗体を親抗体として選択する工程
を含む、前記方法。 - 治療で使用するための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト又は請求項65〜82のいずれか一項記載の抗体。
- TH17媒介性疾患を治療する方法であって、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。
- TH17によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記TH17によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの使用。
- TH22媒介性疾患を治療する方法であって、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。
- TH22細胞によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記TH22細胞によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの使用。
- TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患を治療する方法であって、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。
- 前記TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 前記TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項1〜64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの使用。
- TH17媒介性疾患を治療する方法であって、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。
- TH17媒介性疾患の治療で使用するための、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せ。
- TH17媒介性疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せの使用。
- TH22媒介性疾患を治療する方法であって、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。
- TH22媒介性疾患の治療で使用するための、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せ。
- TH22媒介性疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せの使用。
- TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療方法であって、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。
- TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せ。
- TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項65〜69のいずれか一項記載の抗IL-6抗体と請求項70〜81のいずれか一項記載の抗IL-23又は抗IL-23/抗IL-12抗体の組合せの使用。
- 前記抗体が抗IL-23/抗IL-12抗体である、請求項107、110、又は113のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗体が抗IL-23/抗IL-12抗体である、請求項108、111、又は114のいずれか一項記載の組合せ。
- 前記抗体が抗IL-23/抗IL-12抗体である、請求項109、112、又は115のいずれか一項記載の使用。
- 前記TH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患が、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択される、請求項98、101、104、107、110、113、又は116のいずれか一項記載の方法。
- 炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択されるTH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患の治療で使用するための、請求項99、102、又は105のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。
- 炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択されるTH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患の治療で使用するための、請求項108、111、114、又は117のいずれか一項記載の組合せ。
- 前記薬剤が、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択されるTH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患の治療用のものである、請求項100、103、106、109、112、115、又は118のいずれか一項記載の使用。
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