JP7265788B2 - 修飾ミクロシスチンおよびノジュラリン - Google Patents

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Description

本発明は、癌治療の分野に属する。本発明は、癌治療に使用するための毒素の分野に属する。本発明は、ミクロシスチンおよびノジュラリン、ならびに癌、代謝疾患などの疾患の治療、およびその他の応用でのそれらの使用の分野に属する。本発明は、概して、分子生物学、薬学、およびバイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、腫瘍などを標的化することができる修飾ミクロシスチンおよびノジュラリンの合成に関する。
ミクロシスチンは、藍藻としても知られるシアノバクテリアによって天然に産生される毒素である。湖または池でシアノバクテリアが過多に増殖すると、緑色のスカムの層として現れることが多い藻類ブルームを形成する。しかしながら、湖の全ての緑色のスカムが藻類ブルームであるわけではなく、全ての藻類ブルームがミクロシスチンを産生する種類のシアノバクテリアを含むわけではない。多くのミクロシスチン同族体があり、ミクロシスチン－ＬＲは、より毒性が高く、よく研究されている同族体の一つである。ミクロシスチンは、多くのシアノバクテリア属によって産生される環状ヘプタペプチド肝毒素の群である。その中で最も有名であるのは、同名である、広く分布しているミクロシスティス属である。構造的には、ほとんどのミクロシスチンは、一般化構造シクロ（－Ｄ－Ａｌａ１－Ｘ２－Ｄ－ＭｅＡｓｐ３－Ｙ４－Ａｄｄａ５－Ｄ－Ｇｌｕ６－Ｍｄｈａ７－）からなる。ＸおよびＹは可変Ｌ－アミノ酸であり、Ｄ－ＭｅＡｓｐはＤ－エリスロ－β－メチルアスパラギン酸であり、ＭｄｈａはＮ－メチルデヒドロアラニンである。しかしながら、ＸおよびＹが最も可変のアミノ酸ではあるが、ミクロシスチンコア構造の全ての位置で変異が見られ得る（図１参照）。Ａｄｄａは、シアノバクテリアに特有のＣ２０－β－アミノ酸 ３－アミノ－９－メトキシ－２，６，８－トリメチル－１０－フェニル－デカ－４，６－ジエノン酸である。位置２および４での可変Ｌ－アミノ酸の置換と、見られる頻度はより低い他の構成アミノ酸における変化とによる、１００を超える天然のミクロシスチンが現在までに報告されている。
ミクロシスチンは、１型および２Ａ型のプロテインホスファターゼの強力な阻害剤である。例えば、ミクロシスチン－ＬＲのＩＣ５０は、１型および２Ａ型のプロテインホスファターゼについて、それぞれ、０．０３ｎＭおよび０．０４ｎＭである。
プロテインホスファターゼ１および２Ａは、真核細胞の２つの主要なホスファターゼであり、セリンおよびスレオニン残基を脱リン酸化する。
プロテインホスファターゼ２Ｂの阻害は１０００倍弱く、６つの他の試験したホスファターゼおよび８つの試験したプロテインキナーゼは影響を受けない。
ノジュラリンは、ミクロシスチンに進化的に由来し、ミクロシスチンに見られるアミノ酸Ａｄｄａも含むため、ミクロシスチンに構造的に関連する化合物である。ノジュラリンは、特にノジュラリア種によって産生され、ミクロシスチンに比して、環状ペンタペプチドであり、最も一般的に見られる同族体は、シクロ［－Ｄ－エリスロ－＿－メチルＡｓｐ－Ｌ－Ａｒｇ－Ａｄｄａ－Ｄ－Ｇｌｕ－Ｍｄｈｂ］であり、ここで、ＭｄｈｂはＮ－メチルデヒドロブチレートである（図１参照）。
ミクロシスチンおよびノジュラリンは、抗癌剤となり得る。ＯＡＴＰ１Ｂ１に比べて有効なトランスポーターの種類であるＯＡＴＰ１Ｂ３によって優先的に輸送される天然のミクロシスチン変異体を単離し、臨床的に許容できる肝毒性を有する抗癌剤として進歩させることができると仮定された（ＯＡＴＰ１Ｂ３トランスポーターは、癌組織、例えば肝臓癌で主に見られる）。ミクロシスチン変異体が単離され、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３トランスポーターで安定にトランスフェクトした癌細胞で細胞毒性について試験されている。細胞毒性ＯＡＴＰ１Ｂ１／ＯＡＴＰ１Ｂ３のＩＣ５０比が０．２～３２の範囲であるミクロシスチン変異体が見つかり、トランスポーター選択性が１５０倍の範囲にあることが示された。ミクロシスチンの構造は、トランスポーター選択性に大きな影響を及ぼすため、さらにより顕著なＯＡＴＰ１Ｂ３選択性を有するアナログを開発し、それにより抗癌剤として開発しやすくすることが可能であり得る。しかしながら、より特異的な送達法が好ましい。このような方法の一つは、標的化部分の付与という本明細書に開示されている新規の概念に関連する。非特異的な毒性を回避する標的化された高度に特異的な癌治療のためには、ミクロシスチンおよびノジュラリンの構造変異体が、標的化部分（例えば、癌特異的モノクローナル抗体）を保有し、全てのＯＡＴＰトランスポーターサブタイプによって輸送されないか、もしくは不充分に輸送されるか、または癌特異的ＯＡＴＰサブタイプ１Ｂ３によって排他的に、もしくは主として輸送されることが理想的である。
ミクロシスチンは、化学的に合成することが難しい。より簡便なミクロシスチンを得る一つの方法は、シアノバクテリアによるミクロシスチンのインビボ産生を伴う。
学究的グループの以前の実験は、与えた菌株によって合成される、それぞれのミクロシスチンの１以上の構造変異体に組み込まれているアミノ酸を供給することにより、天然に産生される非リボソーム性ペプチド（ここではミクロシスチン）の産生量を増加させることを目的としていた。より具体的には、アミノ酸ロイシン（Ｌ，Ｌｅｕ）またはアルギニン（Ｒ，Ａｒｇ）を、ミクロシスチン（ＭＣ）変異体ＭＣ－ＬＲおよびＭＣ－ＲＲ（ロイシンはＬ、アルギニンはＲ）を産生するシアノバクテリア株に供給することは、供給するアミノ酸に応じて、両方の変異体の収率に影響を及ぼす。さらに、与えた菌株によって合成される、それぞれのミクロシスチンの１以上の構造変異体に組み込まれているアミノ酸を供給することは、バイオマス産生にも影響を与え得る。
さらに、与えた菌株によって産生されるそれぞれの非リボソーム性ペプチドに天然に組み込まれているアミノ酸のわずかに修飾された型を表すアミノ酸を供給しても、それぞれの非リボソーム性ペプチドに組み込まれ得ることも示されている。当該アプローチは、概して、ｍｕｔａｓｙｎｔｈｅｓｉｓとして一般に知られている。しかしながら、シアノバクテリアの非リボソーム性ペプチドの場合、当該アプローチは、これまで、チロシンの代わりのホモチロシン（１つのメチレン基のみが異なる）またはチロシンの代わりのクロロチロシンなどのハロゲン化アミノ酸（１つのハロゲン原子のみが異なる）などの天然アミノ酸の単純な類似体に制限されていた。より大幅に修飾されたアミノ酸の供給、または非リボソーム性ペプチドに天然に組み込まれているアミノ酸とは異なるアミノ酸およびそれらの類似体の供給は、これまでに報告されていない。さらに、ミクロシスチンに組み込まれる修飾アミノ酸の供給は不可能であることが文献に記載されている。
修飾ミクロシスチンおよびノジュラリンが必要とされている。修飾ミクロシスチンおよびノジュラリンを産生する方法、ならびに（例えば、癌の標的治療のための抗体薬物複合体の構築に関連する）ミクロシスチンおよびノジュラリンを標的化単位に結合する方法が必要とされている。
課題は、ミクロシスチンおよび／またはノジュラリンに１以上の修飾基質を組み込むことによって、修飾ミクロシスチンおよびノジュラリンを産生することにより、解決した。
本発明は、１以上の修飾基質を含んでなる修飾ミクロシスチンおよび／またはノジュラリン化合物であって、前記１以上の修飾基質が、標的化部分および／もしくは標識の結合のために、ならびに／または追加の構造修飾のために、クリックケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能なアンカー基を含んでなる、前記化合物に関連する。
定義
本明細書において、本発明に係るミクロシスチンは、一般構造Ｄ－Ａｌａ１－Ｘ２－Ｄ－ＭｅＡｓｐ３－Ｚ４－Ａｄｄａ５－Ｄ－Ｇｌｕ６－Ｍｄｈａ７を有し、構造変異体は、原則、全ての位置で生じ得るが、最も頻度が高いのはＸおよびＺである（図１参照）。これらは、可変Ｌ－アミノ酸である。Ｄ－ＭｅＡｓｐは、Ｄ－エリスロ－ｂ－メチルアスパラギン酸であり、Ｍｄｈａは、Ｎ－メチルデヒドロアラニンであり、Ａｄｄａは、３－アミノ－９－メトキシ－２，６，８－トリメチル－１０－フェニルデカ－４，６－ジエノン酸である。図１に示されているように、位置３および／または７での脱メチル化、ならびに位置６でのメチル化、ならびに位置１、５、および７でのさらなる修飾も本発明の範囲内にある。
本明細書において、位置２および４の可変Ｌ－アミノ酸（ＸおよびＺ）と他のＤ－アミノ酸における修飾との様々な組み合わせについて示す。
本明細書において、ノジュラリンは、シクロ［－Ｄ－エリスロ－メチルＡｓｐ（イソ結合）－Ｌ－Ａｒｇ－Ａｄｄａ－Ｄ－Ｇｌｕ（イソ結合）－Ｍｄｈｂ］からなる単環式ペンタペプチドの化合物であり、式中、Ｍｄｈｂは、Ｎ－メチルデヒドロブチレートを表し、Ａｄｄａは、特定のＣ２０－アミノ酸：３－アミノ－９－メトキシ－２，６，８－トリメチル－１０－フェニルデカ－４，６－ジエノン酸であり、図１に示されているように、全ての位置が天然にわずかに修飾されていることができる。ノジュラリンは、構造および生物活性に関してミクロシスチンと酷似している。
ミクロシスチンおよびノジュラリンの修飾は、ＡｄｄａおよびＤ－Ｇｌｕの位置では起きないものとするが、これは、当該２つの位置がＰＰ１およびＰＰ２Ａに対する活性の阻害に必須であるからである。
本明細書において、ミクロシスチンおよびノジュラリンの全ての修飾変異体を、細胞毒性薬またはＣＡと呼ぶ。
本明細書において、ＣＡ産生シアノバクテリア株をＣＡ株と呼ぶ。
本明細書において、標的化部分は、タンパク質（主に抗体およびその断片）、ペプチド、核酸（アプタマー）、小分子、またはその他（ビタミンもしくは炭水化物）、ならびにナノ粒子である。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、改変および修飾ミクロシスチンまたはノジュラリンの標的化送達のためのエスコート分子として好ましい。しかしながら、小分子も、前記ペプチドの物理化学的特性に影響を与え得るため、標的化部分になり得る。これの一例として、例えば前記ペプチドの水への溶解性を高めるために、糖などの親水性部分と結合させることが挙げられる。さらに、結合した小分子は、ペプチドのインビボでの薬物動態特性を変える目的を有し得、例えば、インビボで代謝されやすい官能基の結合は、肝クリアランスを増加させ、肝毒性を減少させることができるか、またはトランスポーター選択性、ひいては細胞による修飾非リボソーム性ペプチドの（有効な）取り込みに影響を及ぼすことができる。
本明細書において、ＡＤＣ（ＡＤＣは抗体薬物複合体を表す）は、直接的に、またはリンカー（Ｌ）を介して標的化部分（ＴＭ）に結合しているＣＡであり、ＡＤＣの定義により、標的化部分は抗体である。
本明細書において、抗体（ＡＢ）という用語は、最も広い意味において使用され、具体的には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を包含する。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または他の種に由来する抗体であり得る。抗体は、特定の抗原の認識および結合が可能である、免疫系によって生じるタンパク質である。標的抗原は、概して、複数の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって認識される、エピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、一つの抗原は、複数の対応する抗体を有し得る。抗体には、全長免疫グロブリン分子、または全長免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、目的の標的の抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれ、当該標的には、癌細胞、微生物細胞、または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれるが、これらに限定されない。免疫グロブリンは、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であることができる。免疫グロブリンは、任意の種に由来することができ、例えば、ヒト、マウス、またはウサギ由来が挙げられる。
抗体断片（ＡＢ断片）は、全長抗体の一部、通常、その抗原結合領域または可変領域を含んでなる。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；Ｆａｂ発現ライブラリによって作製された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、および癌細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原に免疫特異的に結合する上記のいずれかのエピトープ結合断片、単鎖抗体分子；抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
リンカーは、抗体またはＡＢ断片または標的化部分またはＣＡに対する標識に共有結合により結合する。リンカーは、１以上の薬物部分（Ｄであり、Ｄ＝ＣＡ）と抗体単位（Ａｂ）とをつないで、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するために使用することができる二官能性または多官能性部分である。リンカー（Ｌ）は、細胞の外側、すなわち細胞外で安定であってもよく、または酵素活性、加水分解、もしくは他の代謝条件によって切断可能であってもよい。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、薬物部分（ここではＣＡ）および抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して簡便に作製することができる。ここで、ＡＤＣは、標的化部分に結合したＣＡである。リンカーは、リンカー、薬物、および標的化部分の間の好ましい空間距離を得るために有利であり得るスペーサーを含むこともできる。
後述するように、システインチオール、アミン、例えば、リシンなどのＮ末端もしくはアミノ酸側鎖、または抗体（ＡＢ）のその他の修飾は、リンカー試薬、薬物部分（Ｄ）、または薬物－リンカー試薬（Ｄ－Ｌ）の官能基と結合を形成することができる。リンカーは細胞外で安定であることが好ましい。細胞への輸送または送達前は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が安定であり、そのままであること、すなわち、抗体が薬物部分に結合したままであることが、好ましい。リンカーは、標的細胞の外側で安定であり、細胞内である程度の速度で切断され得る。有効なリンカーは以下である：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持する；（ｉｉ）複合体または薬物部分の細胞内送達を可能にする；（ｉｉｉ）複合体がその標的部分に送達または輸送されるまで、安定であり、そのままである、すなわち切断されないままである；かつ（ｉｖ）ＣＡの細胞毒性、細胞致死効果、または細胞増殖抑制効果を維持する。ＡＤＣの安定性は、質量分析法、ＨＰＬＣ、および分離／分析法ＬＣ／ＭＳなどの標準的分析法によって測定され得る。抗体とＣＡとの共有結合は、リンカーが２つの反応性官能基、すなわち反応性の意味における二価性を有することを必要とする。ペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテン、およびレポーター基などの２以上の機能的部分または生理活性部分を結合するのに有用な二価リンカー試薬は、公知である。
別の実施形態において、リンカーは、スルホネート置換基、または試薬の水溶性を高め、ＡＤＣの作製に利用される合成経路に応じて、リンカー試薬と抗体もしくはＣＡとの結合反応を促進するか、もしくはＡＢ－ＬとＤとの、もしくはＤ－ＬとＡＢとの結合反応を促進することができる他の置換基で置換されていてもよい。抗体の求核基として、限定はされないが、以下が挙げられる：（ｉ）Ｎ－末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合、糖ヒドロキシルまたはアミノ基。アミン基、チオール基、およびヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分、リンカー試薬、およびＣＡ（＝Ｄ）の求電子基と共有結合を形成するように反応することができ、当該求電子基として、以下が挙げられる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステル、および酸ハライド；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、およびマレイミド基。特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬との結合に対して反応性にすることができる。したがって、各システイン架橋は、理論的には２つの反応性チオール求核基を形成することになる。追加の求核基は、リシンと２－イミノチオラン（トラウト試薬（Traut’s reagent））とを反応させて、アミンをチオールへ変換させることにより、抗体に導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４、またはそれ以上のシステイン残基を導入することにより、抗体（またはその断片）に導入することができる（例えば、１以上の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異抗体を作製）。米国第２００７／００９２９４０号は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体エンジニアリングである。
修飾基質とは、それぞれの非リボソーム性ペプチドにおける修飾基質のペプチド結合形成を可能する少なくとも１つのアミノ基と１つのカルボキシル基とを有し、特定のシアノバクテリア株により合成される非リボソーム性ペプチドに天然には組み込まれていないアミノ酸および関連化合物を意味する。
修飾アミノ酸または修飾基質は、アミノ酸リンカー成分、例えば、天然に存在するもの、ならびにマイナーなアミノ酸および非天然アミノ酸類似体、例えばシトルリンを含んでなり得る。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、およびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に対する選択性に関して、設計および最適化することができる。アミノ酸側鎖には、天然に存在するもの、ならびにマイナーなアミノ酸および非天然アミノ酸類似体、例えばシトルリンが含まれる。
左：ミクロシスチンの一般構造。Ｘ２およびＺ４は、可変Ｌ－アミノ酸を示す。Ｄ－Ａｌａ＝Ｄ－アラニン，Ｄ－Ｍｅ－Ａｓｐ＝Ｄ－メチルアスパラギン酸，Ａｒｇ＝アルギニン，Ａｄｄａ＝３－アミノ－９－メトキシ－２，６，８－トリメチル－１０－フェニルデカ－４，６－ジエノン酸，Ｄ－Ｇｌｕ＝Ｄ－グルタミン酸，Ｍｄｈａ＝Ｎ－メチルデヒドロアラニン。右：ノジュラリンの一般構造。Ａｒｇ２は、ミクロシスチン分子のＺ４に相当する可変Ｌ－アミノ酸を示す。Ｄ－Ｍｅ－Ａｓｐ＝Ｄ－メチルアスパラギン酸，Ａｒｇ＝アルギニン，Ａｄｄａ＝３－アミノ－９－メトキシ－２，６，８－トリメチル－１０－フェニルデカ－４，６－ジエノン酸，Ｄ－Ｇｌｕ＝Ｄ－グルタミン酸，Ｍｄｈｂ＝Ｎ－メチルデヒドロブチレート ミクロシスチンおよびノジュラリンなどのＣＡを含む非リボソーム性ペプチドを修飾するための修飾基質の供給に適した株に対する好適なスクリーニング法に関する、様々な培養系およびスケールならびに様々な質量分析検出間の比較（図２Ａ～２Ｄ）。ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）株ＣＢＴ ４８０に修飾基質を５０ｍｌスケールで供給した後の２つの異なる質量分析法による修飾ミクロシスチンの検出（４つの図Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々の上側はＥＳＩ－ＩＴ－ＴｏＦ－ＭＳによる検出；４つの図Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々の下側はＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳによる検出）。Ａ：コントロール（Ｏ－メチルチロシンの供給なし) Ｂ：コントロール（ホモアルギニンの供給なし）Ｃ：Ｏ－メチルチロシンを供給 Ｄ：ホモアルギニンを供給 天然に産生されたミクロシスチンの分子質量：９９５Ｄａ＝ＭＣ－ＬＲ，１０４５Ｄａ＝ＭＣ－ＹＲ Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅｔＹ）およびホモアルギニン（ｈＲ）の供給により産生された修飾ミクロシスチンの分子質量 １０５９Ｄａ＝ＭＣ－ＯＭｅｔＹＲまたはＭＣ－ＹｈＲ；１００９Ｄａ＝ＭＣ－ＬｈＲ ミクロシスチンおよびノジュラリンなどのＣＡを含む非リボソーム性ペプチドを修飾するための修飾基質の供給に適した株に対する好適なスクリーニング法に関する、様々な培養系およびスケールならびに様々な質量分析検出間の比較（図２Ａ～２Ｄ）。ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）株ＣＢＴ ４８０に修飾基質を６ｍｌスケールで供給した後の２つの異なる質量分析法による修飾ミクロシスチンの検出（２つの図Ａ／Ａ’およびＢ／Ｂ’の各々の上側はＥＳＩ－ＩＴ－ＴｏＦ－ＭＳによる検出；２つの図Ａ／Ａ’およびＢ／Ｂ’の各々の下側はＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳによる検出）。Ａ，Ａ‘：Ｏ－メチルチロシンを供給したＣＢＴ ４８０培養物 Ｂ，Ｂ‘：ホモアルギニンを供給したＣＢＴ ４８０培養物 天然に産生されたミクロシスチンの分子質量：９９５Ｄａ＝ＭＣ－ＬＲ，１０４５Ｄａ＝ＭＣ－ＹＲ Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅｔＹ）およびホモアルギニン（ｈＲ）の供給により産生された修飾ミクロシスチンの分子質量１０５９Ｄａ＝ＭＣ－ＯＭｅｔＹＲまたはＭＣ－ＹｈＲ；１００９Ｄａ＝ＭＣ－ＬｈＲ； ミクロシスチンおよびノジュラリンなどのＣＡを含む非リボソーム性ペプチドを修飾するための修飾基質の供給に適した株に対する好適なスクリーニング法に関する、様々な培養系およびスケールならびに様々な質量分析検出間の比較（図２Ａ～２Ｄ）。１．６ｍｌ（ｄｗ－ＭＴＰ）スケールでＯ－メチルチロシンを用いてミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）株ＣＢＴ ４８０に修飾基質を供給した後の２つの異なる質量分析法による修飾ミクロシスチンの検出（左側ＥＳＩ－ＩＴ－ＴｏＦ－ＭＳ；右側ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳ）Ａ，Ａ‘：３００μＭ Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅｔＹ）の供給，ＤＭＳＯなし Ｂ，Ｂ‘：３０μＭ Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅｔＹ）の供給，ＤＭＳＯなし Ｃ，Ｃ‘：３００μＭ Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅｔＹ）の供給，１％ＤＭＳＯ Ｄ，Ｄ‘：３０μＭ Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅｔＹ）の供給，１％ＤＭＳＯ Ｅ，Ｅ‘：コントロール（供給なし） 天然に産生されたミクロシスチンの分子質量：９９５Ｄａ＝ＭＣ－ＬＲ，１０４５Ｄａ＝ＭＣ－ＹＲ Ｏ－メチルチロシンの供給により産生された修飾ミクロシスチンの分子質量 １０５９Ｄａ＝ＭＣ－ＯＭｅｔＹＲ ミクロシスチンおよびノジュラリンなどのＣＡを含む非リボソーム性ペプチドを修飾するための修飾基質の供給に適した株に対する好適なスクリーニング法に関する、様々な培養系およびスケールならびに様々な質量分析検出間の比較（図２Ａ～２Ｄ）。１．６ｍｌ（ｄｗ－ＭＴＰ）スケールでホモアルギニンを用いてミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）株ＣＢＴ ４８０に修飾基質を供給した後の２つの異なる質量分析法による修飾ミクロシスチンの検出（左側ＥＳＩ－ＩＴ－ＴｏＦ－ＭＳ検出；右側ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳ検出）Ａ，Ａ‘：３００μＭ ホモアルギニン（ｈＲ）の供給，ＤＭＳＯなし Ｂ，Ｂ‘：３０μＭ ホモアルギニン（ｈＲ）の供給，ＤＭＳＯなし Ｃ，Ｃ‘：３００μＭ ホモアルギニン（ｈＲ）の供給，１％ＤＭＳＯ Ｄ，Ｄ‘：３０μＭ ホモアルギニン（ｈＲ）の供給，１％ＤＭＳＯ Ｅ，Ｅ‘：コントロール（供給なし） 天然に産生されたミクロシスチンの分子質量：９９５Ｄａ＝ＭＣ－ＬＲ，１０４５Ｄａ＝ＭＣ－ＹＲ ホモアルギニンの供給により産生された修飾ミクロシスチンの分子質量１０５９Ｄａ＝ＭＣ－ＹｈＲ；１００９Ｄａ＝ＭＣ－ＬｈＲ 全ての修飾ミクロシスチンを、両方のＭＳ法により検出することができた。しかしながら、培養培地中１％のＤＭＳＯの添加なしの供給により得られたほとんどのサンプルは、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳで検出することができなかったが、ＥＳＩ－ＩＴ－ＴｏＦ－ＭＳでは検出することができた。したがって、小スケール培養物（１～１０ｍｌの培養体積）のスクリーニングにおける供給実験では、特に修飾非リボソーム性ペプチドのＭＳ検出がＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳに基づく場合に、ＤＭＳＯの使用が推奨される。一方、ディープウェルマイクロタイタープレート（ｄｗ－ＭＴＷ）中で培養した１．６ｍｌの小スケール培養物に修飾基質を供給した後の修飾非リボソーム性ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳ検出は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を可能にする。ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳ用の両方の培養（修飾基質の供給がある場合およびない場合)ならびにサンプル調製は、Tillich et al. BMC Microbiology 2014, 14:239に記載のように、様々な株および基質の並行試験を可能にするピペッティングロボットを使用して行うことができる。 ＭｃｙＢＩは、ＭｃｙＢの２つの酵素分子のうちの第１を表し、ミクロシスチン分子の位置２でのアミノ酸の組み込みに関与する。このアミノ酸は、ミクロシスチン・エルギノーサ（Microcystin aeruginosa）株ＰＣＣ７８０６の場合には、ロイシンであり、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）株ＣＢＴ ４８０の場合には、ロイシンまたはチロシンである。ＭｃｙＢＩのアデニル化（Ａ）ドメインのいわゆるコアモチーフＡ２～Ａ６は黒で強調表示されており（Ａ２～Ａ６）、それぞれのミクロシスチンの生合成中の基質（アミノ酸）認識および活性化に関与するアミノ酸は、大きく太い白い文字で示されている。これらのアミノ酸は、Ａドメインの活性ポケットを形成し、その１レターのアミノ酸コードの配列は、Ａドメインの基質特異性の予測を可能にする、Ａドメインのいわゆる特異性付与コードを表す。ボックスおよび矢印は、両方の株のＭｃｙＢＩのアミノ酸配列における差異のみを示す。両方の株のＡドメインの９つのポケット形成アミノ酸のうちの１つだけが株間で異なり、Ａドメインおよび生合成遺伝子クラスター全体の残りの部分も株間でほぼ同一であり、このことから、ＣＢＴ ４８０株におけるミクロシスチンの位置２でのロイシンおよびチロシンの組み込みは、株特有の特徴であるが、生合成遺伝子クラスターのＤＮＡ配列とミクロシスチン合成酵素のアミノ酸配列のそれぞれにおける差異によって説明することはできないという結論に至る。 例示的実施形態第１：株ＣＢＴ ９５９により産生されたミクロシスチンＹＲへの位置２での修飾基質アジド－Ｌ－Ｐｈｅ（Ｐｈｅ＝フェニルアラニン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）について、および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ユーロ記号は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。株ＣＢＴ ９５９の増殖後に、７５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ７５０ｎｍ）の測定を行うことができなかったが、これは細胞が信頼性のあるＯＤ７５０ｎｍ値を測定することを不可能にする凝集体を形成するためである。 例示的実施形態第２：株ＣＢＴ ４８０により産生されたミクロシスチンＹＲへの位置２での修飾基質Ｐｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第２：Ｐｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ４８０培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第３：株ＣＢＴ ２７５により産生されたミクロシスチンＬＲへの位置４での修飾基質アジド－Ｌｙｓ（Ｌｙｓ＝リシン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第３：アジド－Ｌｙｓ（Ｌｙｓ＝リシン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ２７５培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第４：株ＣＢＴ ２７５により産生されたミクロシスチンＬＷへの位置４での修飾基質Ｐｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第４：Ｐｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ２７５培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第５：株ＣＢＴ １により産生されたミクロシスチンＹＲへの位置４での修飾基質ニトロ－Ａｒｇ（Ａｒｇ＝アルギニン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 ニトロ－Ａｒｇ（Ａｒｇ＝アルギニン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ １培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第６：株ＣＢＴ ２７５により産生されたミクロシスチンＬＲへの位置４での修飾基質フリル－Ｌ－Ａｌａ（Ａｌａ＝アラニン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。ミクロシスチンＬＲの新規フリル－Ａｌａ変異体のＰＤＡ－信号は、濃度が低いため、見られない。 例示的実施形態第６：フリル－Ａｌａ（Ａｌａ＝アラニン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ２７５培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第７：株ＣＢＴ ４８０により産生されたミクロシスチンＹＲへのそれぞれ位置２および４での修飾基質ニトロ－Ａｒｇ（Ａｒｇ＝アルギニン）およびＰｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第７：ニトロ－Ａｒｇ（Ａｒｇ＝アルギニン）およびＰｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ４８０培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第８：株ＣＢＴ ３２９により産生されたミクロシスチン（Ｄ－Ａｓｐ３，Ｅ－Ｄｈｂ７）－ＲＲへの位置２／４での修飾基質ニトロ－Ａｒｇ（Ａｒｇ＝アルギニン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体の二重プロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第８：ニトロ－Ａｒｇ（Ａｒｇ＝アルギニン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ３２９培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第９：株ＣＢＴ １により産生されたミクロシスチンＹＲへの位置４での修飾基質アジド－Ｌｙｓ（Ｌｙｓ＝リシン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。ミクロシスチンＹＲの新規のアジド－Ｌｙｓ（Ｌｙｓ＝リシン）変異体のＰＤＡ－信号は、サンプルにおいてピークが重なり合っているため、見られない。 例示的実施形態第９：アジド－Ｌｙｓ（Ｌｙｓ＝リシン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ １培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第１０：株ＣＢＴ ６３３により産生されたミクロシスチンＲＲへの位置２での修飾基質アジド－Ｎｏｒｖａｌ（Ｎｏｒｖａｌ＝ノルバリン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 アジド－Ｎｏｒｖａｌ（Ｎｏｒｖａｌ＝ノルバリン）の添加がある場合とない場合のＣＢＴ ６３３培養物の増殖曲線。 例示的実施形態第１１：株ＣＢＴ ７８６により産生されたノジュラリンへの位置２での修飾基質Ｈ－ｈｏｍｏａｒｇ－ＯＨ（ｈｏｍｏａｒｇ＝ホモアルギニン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ノジュラリン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第１２：大スケール（２ｌ）の培養系で株ＣＢＴ ４８０により産生されたミクロシスチンＹＲへの位置２での修飾基質アジド－Ｌ－Ｐｈｅ（Ｐｈｅ＝フェニルアラニン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第１３：ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）株ＣＢＴ ４８０へ様々な量の修飾基質４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（０μＭ，１０μＭ，３０μＭ）を供給すると、供給される修飾基質４－アジド－Ｌ－フェニルアラニンの量の増加に伴い、産生される修飾ミクロシスチンの量が増加する。この結果は、修飾非リボソーム性ペプチド（ここでは修飾ミクロシスチン）のそれぞれの産生のための供給プロトコルの最適化を可能にする。図の上部は、コントロール培養のサンプル、培養培地中１０μＭの基質４－アジド－Ｌ－フェニルアラニンを添加した培養のサンプル、および培養培地中３０μＭの基質４－アジド－Ｌ－フェニルアラニンを添加した培養のサンプルについてのオーバーレイした２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラムを示す。図の下部は、ＨＰＬＣクロマトグラムで約１０分に見られる新たに形成されたピークの平均化質量スペクトルを示す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第１４：株ＣＢＴ ２８０により産生された（Ｄ－Ａｓｐ３，Ｅ－Ｄｈｂ７）ミクロシスチン－ＲＲへの位置２での修飾基質Ｐｒｇ－Ｔｙｒ（Ｔｙｒ＝チロシン）の組み込み。コントロール培養のサンプル（ａ）について、修飾基質を添加した培養のサンプル（ｂ）についての２３８ｎｍでのＨＰＬＣ－ＰＤＡクロマトグラム。コントロール培養のサンプル（ｃ）および修飾基質を添加した培養のサンプル（ｄ）についての新規ミクロシスチン変異体のプロトン化分子イオンの質量値の正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＭＳデータからの抽出イオンクロマトグラム。最後に、ｅ）は、クロマトグラムｄ）に見られるピークの平均化質量スペクトルを表す。検出器の信号強度（ｙ軸）は、ＰＤＡおよび質量分析データについて、それぞれ、ミリ吸光単位（ｍＡＵ）およびカウント（無次元量）で測定されている。 例示的実施形態第２０：産生されたＡＤＣおよび分析的ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果。分析的ＳＥＣ－ＨＰＬＣにおいて、複合体であるミクロシスチン－ＡＤＣ１およびミクロシスチン－ＡＤＣ２は、高いレベルの純度を示し、モノマーが９８．９％および９９．０％であった。両方の場合において、凝集体および小断片が、０．８％および０．２％の割合で検出された。 例示的実施形態第２１：クーマシー染色したゲル電気泳動ゲルは、モノクローナル抗体へのペイロードとしてのミクロシスチン変異体１および２の結合を示している。還元条件下でのクーマシー染色では、全てのサンプルが、約５０ｋＤａで重鎖のシグナルを示し、約２５ｋＤａで軽鎖のシグナルを示した。全ての複合体は、ネイキッドＭＡＢと比較して重鎖および軽鎖のタンパク質シグナルのアップシフトを示し、両方の抗体鎖への毒素結合を示した。全てのＡＤＣについて、二重シグナルが軽鎖で検出され、結合（conjugated）種および非結合（unconjugated）種の両方を示した。非還元条件下でのクーマシー染色では、ネイキッド抗体は、約１５０ｋＤａでインタクトな抗体の二重シグナルを示した。両方の場合において、毒素が還元された鎖間ジスルフィドに結合し、３７℃でのインキュベーション中に抗体の不安定化をもたらしたため、ＡＤＣは、２５ｋＤａ～１５０ｋＤａの間の様々なシグナルを示した。 例示的実施形態第２２：ミクロシスチン系ＡＤＣの成功裡のインビトロのプルーフ・オブ・コンセプト。ペイロードとしての２種のミクロシスチン変異体に対する様々な濃度のミクロシスチンＡＤＣについて、癌細胞株を用いたインビトロアッセイで、細胞生存率をモニタリングしている。ＡＤＣは、切断可能ではないリンカーを保有する。ミクロシスチン－ＡＤＣ－２では、２２０ｐＭのＥＣ５０値が求められた。ペイロードの構造変異体間の差異は、さらに構造を最適化できる可能性が極めて高いことをはっきりと示している。
本発明の詳細な説明
本発明者らは、初めて、分子全体とペプチドリンカーまたは他の機能的単位、例えば抗体との迅速で容易な結合を可能にする、いわゆるクリック可能なアンカー基を保有する修飾アミノ酸（図４～１０、１５／１６参照）、または、クリック可能なアンカー基への追加の修飾に容易に利用できる官能基を保有する供給基質（図１１～１８参照）のミクロシスチンへの組み込みを行った。
クリック可能な基質と、例えば、ミクロシスチンおよび／もしくはノジュラリンに天然に存在するアミノ酸、これらのアミノ酸の修飾型、または他の基質との組み合わせを供給すると、供給する基質の組み合わせが非リボソーム性ペプチドへ組みこまれ得ることが示されている（図１５～１８参照）。
本発明者らは、初めて、成功裡に供給した基質（例えば、修飾アミノ酸）が、ミクロシスチンまたはノジュラリンに天然に組み込まれている基質（例えば、それぞれの非修飾アミノ酸）に構造的に関連し、必ずしも直接的に関連するわけではないことを示している（図７／８，１３／１４，１９～２２参照）。つまり、過去において、成功裏の供給は、天然に（自然に）組み込まれているアミノ酸から直接誘導される構造変異体のみとされていた（例えば、チロシンの代わりのｏ－メチル－チロシンもしくはクロロ－チロシン、またはアルギニンの代わりのホモ－アルギニン）。本発明者らの新規の結果を考慮すると、それぞれの非リボソーム性ペプチドに天然に組み込まれている基質に構造的に由来し、直接的に由来するわけではなく、標的化部分または標識の結合のために、クリックケミストリーを含むコンジュゲーションケミストリーに使用するために直接利用可能または変換可能ではない官能基による天然に組み込まれている基質の置換物でもない基質を使用することができる場合でも、供給により得られる非リボソーム性ペプチドの構造的および機能的多様性が顕著に増加することが明らかである。
本発明は、１以上の修飾基質を含んでなる修飾ミクロシスチンおよび／またはノジュラリン化合物であって、前記１以上の修飾基質が、標的化部分および／もしくは標識の結合のために、または追加の構造修飾のために、クリックケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能なアンカー基を含んでなる、前記化合物に関する。このため、例えば、抗体をミクロシスチンおよびノジュラリンに連結することが可能になり、新規構造を有するミクロシスチンおよびノジュラリンの大きな化合物ライブラリの作製が可能になる。
本発明の一実施形態において、１以上の修飾基質が、ミクロシスチンおよび／またはノジュラリンの所定の位置に組み込まれている。
ＣＡは、アミノ酸を、天然には当該アミノ酸が存在しない位置に保有することができる。当該アミノ酸は、修飾されていてもよい。
驚いたことに、本発明者らは、ミクロシスチンのいわゆる可変位置２および４またはノジュラリンのそれぞれのＡｒｇ２位置以外の複数の位置を修飾することができる。
本発明は、１以上の修飾基質が、以下の一般構造を有するミクロシスチンのＡｄｄａ５およびＤＧｌｕ６以外の位置に組み込まれている化合物であって、
Ｄ－Ａｌａ１－Ｘ２－Ｄ－ＭｅＡｓｐ３－Ｚ４－Ａｄｄａ５－ＤＧｌｕ６－Ｍｄｈａ７、
Ｘ２および／またはＺ４が、前記修飾基質の好ましい組み込みの位置である、前記化合物にさらに関する。
ノジュラリンにおいて、１以上の修飾基質が、以下の一般構造のＡｄｄａ３およびＤＧｌｕ４以外の位置に組み込まれており、
Ｄ－ＭｅＡｓｐ１－Ａｒｇ２－Ａｄｄａ３－ＤＧｌｕ４－Ｍｄｈｂ５．
Ａｒｇ２が、前記修飾基質の好ましい組み込みの位置である。
ＣＡがミクロシスチンである場合、修飾位置がＸ２またはＺ４であり、修飾基質が修飾アミノ酸であることが好ましい（図４～１４参照）。
ＣＡがミクロシスチンである場合、修飾位置がＸ２およびＺ４であり、修飾基質が修飾アミノ酸であることも好ましい（図１５～１８参照）。
ノジュラリンでは、修飾位置がＡｒｇ２であり、修飾基質が修飾アミノ酸であることが好ましい。
修飾基質、好ましくは修飾アミノ酸は、標的化部分もしくは標識の結合のために、または追加の構造修飾のために、（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能なアンカー基を含むことが好ましい（図４～２２参照）。
本発明に係る方法において、クリック可能な基質の（クリックケミストリー反応を含む）コンジュゲーションケミストリー反応は、銅（Ｉ）－触媒アジド－アルキン付加環化、歪促進アジド－アルキン付加環化、アルキン－アジド付加環化、またはアルキン－テトラジン逆要請型ディールス－アルダー反応を含んでなる反応から選択される。別のコンジュゲーションケミストリーは、一級アミン、チオール、アルデヒド、カルボキシル、およびオキシムの特有の反応性を利用する反応から選択することができる。したがって、標的化部分の結合のために、（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接利用可能な１以上の修飾基質のアンカー基は、以下の群から選択することができる。
・アルキン、活性化アルケン、またはホスフィンとの反応などによって後で修飾することができるアジド基。細胞毒素のアジド基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・アジドとの反応などによって後で修飾することができるアルキン（例えば、プロパルギルまたはジアリール－歪シクロオクチン）基。細胞毒素のアルキン基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・アルキンまたはアルケンとの反応などによって後で修飾することができるテトラジン。細胞毒素のテトラジン基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネイト、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ホスフィン、またはフルオロフェニルエステルとの反応などによって後で修飾することができる一級アミン。細胞毒素のアミノ基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホナート（thiosulfonare）、またはビニルスルホンとの反応などによって後で修飾することができるチオール。細胞毒素のチオール基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・アミン、アミノチオール、エルマン試薬、アルコキシアミン、ヒドラジド、またはチオールとの反応などによって後で修飾することができるアルデヒド。細胞毒素のアルデヒド基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・カルボジイミドとの反応などによって後で修飾することができるカルボキシル。細胞毒素のカルボキシ基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
・ｐ－アセチルフェニルアラニンなどのアセトフェノンとの反応などによって後で修飾することができるオキシム。細胞毒素のオキシム基は、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子のそれぞれの官能基と反応する。
標的化部分の結合のために（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接変換可能な官能基を有する１以上の基質の導入も、請求項に記載されている。この一例は、一級アミノ基を生じるように還元することができるニトロ基を含む基質の導入であり、当該一級アミノ基は、上述したように、（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用することができる。別の例は、ヒドラジンなどの求核剤との光反応などによって後で修飾することができるフラニルを含む基質の導入であり、フラニル基は、不飽和ジカルボニル残基への活性化後に、リンカー、抗体、または蛍光色素もしくはポリマーマトリックスなどの他の機能分子などの標的化部分のそれぞれの求核性官能基と反応する（図１１～１８参照）。
チロシン含有ミクロシスチンは、４－フェニル－３Ｈ－１，２，４－トリアゾリン－３，５（４Ｈ）－ジオン（ＰＴＡＤ）を使用して官能化して、上記の（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに適した官能基をさらに導入することもできる。
理想的には、（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能な修飾アミノ酸は、以下の表の群から選択される（それぞれの実施例について図４～２２および表１～４を参照）。
Figure 0007265788000001
本発明は、以下の式のうちの一つを有するミクロシスチンである化合物であって、
Ｄ－Ａｌａ１－Ｘ２－Ｄ－ＭｅＡｓｐ３－Ｚ４－Ａｄｄａ５－ＤＧｌｕ６－Ｍｄｈａ７、
Figure 0007265788000002
式中、以下は、
Figure 0007265788000003
１以上の修飾基質の組み込みの位置を含んでなり、好ましくは、コンジュゲーション（クリック）ケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能な修飾基質は、以下の群から選択されるアミノ酸である、前記化合物に関する。
Figure 0007265788000004
本発明は、以下の式のうちの一つを有するノジュラリンである化合物であって、
Figure 0007265788000005
式中、以下は、
Figure 0007265788000006
１以上の修飾基質を含んでなり、好ましくは、前記修飾基質は、以下の群から選択されるアミノ酸である、前記化合物にも関する。
Figure 0007265788000007
理想的には、ノジュラリンは、Ａｒｇ２の位置で修飾されている。
本発明に係る方法において、クリック可能な基質の（クリックケミストリー反応を含む）コンジュゲーションケミストリー反応は、銅（Ｉ）－触媒アジド－アルキン付加環化、歪促進アジド－アルキン付加環化、アルキン－アジド付加環化、またはアルキン－テトラジン逆要請型ディールス－アルダー反応を含んでなる群から選択される。別のコンジュゲーションケミストリーは、一級アミン、チオール、アルデヒド、カルボキシル、およびオキシムの特有の反応性を利用する反応から選択することができる。
本発明に係る方法において、１以上の修飾アミノ酸は、修飾アミノ酸と標的化部分および／または標識との間のリンカーを介した、またはリンカーなしの標的化部分および／または標識の結合のために、（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能なアンカー基を含んでなる。
しかしながら、ミクロシスチンおよびノジュラリンであるＣＡの修飾基質の導入による修飾において、最も好ましいのは、ミクロシスティス属、プランクトスリックス（Planktothrix）属、オスキラトリア属、ノストック属、アナベナ属、アファニゾメノン属、ハパロシフォン（Hapalosiphon）属、ノジュラリア（Nodularia）属である。
本発明の一実施形態において、標的化部分（ＴＭ）は、抗体、抗体断片、ｆａｂ断片、ペプチド、修飾抗体、フルオロフォア、およびクロマトグラフィーカラムの群から選択される。標的化部分に関して、一実施形態において、ＡＤＣは、ＥｒｂＢ遺伝子がコードするレセプターに特異的に結合する。ＴＭは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４から選択されるＥｒｂＢレセプターに特異的に結合し得る。ＡＤＣは、ＨＥＲ２レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合し、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害し得る（図２９参照）。ＡＤＣの抗体は、モノクローナル抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－７、またはｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８（トラスツズマブ）であり得る。抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ断片であり得る。
本発明において、本発明の化合物は、薬剤として使用することができる。さらに、本発明の化合物は、癌ならびに／またはその他の疾患および障害の診断または治療用の薬剤として使用することができる。
本発明のＡＤＣは、癌の治療に有用であり得、例えば、限定はされないが、細胞表面レセプターおよび腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体である。腫瘍関連抗原は、当業で公知であり、当業で周知の方法および情報を用いて、抗体作製に使用するために作製することができる。癌の診断および治療のための有効な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、１以上の正常な非癌性細胞と比較して、１以上の特定の種類の癌細胞の表面に特異的に発現する膜貫通または腫瘍関連ポリペプチドを同定しようとした。このような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上と比較して、癌細胞の表面上により多く発現する場合が多い。このような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定により、抗体ベースの標的治療によって、癌細胞を特異的に標的化し、破壊することができるようになった。
ＴＡＡの例には、限定はされないが、以下に挙げる腫瘍関連抗原が含まれる。抗体が標的化する腫瘍関連抗原には、引用文献で同定されている配列と比較して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するか、または引用文献に見られる配列を有するＴＡＡと実質的に同じ生物学的性質もしくは特徴を示す、全てのアミノ酸配列変異体およびアイソフォームが含まれる。例えば、変異配列を有するＴＡＡは、通常、記載の対応する配列を有する、ＴＡＡに特異的に結合する抗体に、特異的に結合することができる。本明細書に具体的に挙げられた参考文献中の配列および開示内容は、明示的に参照により援用される。
ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプター－ＩＢ型，Genbank受入番号ＮＭ－００１２０３）；
Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５，Genbank受入番号ＮＭ－００３４８６）；
ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原，Genbank受入番号ＮＭ－０１２４４９）；
０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６，Genbank受入番号ＡＦ３６１４８６）；
ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子，メソセリン，Genbank受入番号ＮＭ－００５８２３）；
Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー（solute carrier family）３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ，Genbank受入番号ＮＭ－００６４２４）；
Ｓｅｍａ ５ｂ（Ｆ１１１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ．４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ５ｂ Ｈｌｏｇ，ｓｅｍａドメイン，７回トロンボスポンジンリピート（１型および１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン，（セマフォリン）５Ｂ，Genbank受入番号ＡＢ０４０８７８）；
ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子，Genbank受入番号ＡＹ３５８６２８）；
ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型レセプター，Genbank受入番号ＡＹ２７５４６３）；
ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，仮想タンパク質Ｆ１１２０３１５，Genbank受入番号ＮＭ－０１７７６３）；
ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ－８６３９，ＩＰＣＡ－１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通上皮抗原２，６回膜貫通前立腺タンパク質，Genbank受入番号ＡＦ４５５１３８）；
ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，Ｆ１１２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位型カチオンチャネル，サブファミリーＭ，膜４，Genbank受入番号ＮＭ－０１７６３６）；
ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌由来増殖因子，Genbank受入番号ＮＰ－００３２０３またはＮＭ－００３２１２）；
ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプステインバーウイルスレセプター）またはＨｓ．７３７９２ Genbank受入番号Ｍ２６００４）；
ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ（immunoglobulin-associated beta），Ｂ２９，Genbank受入番号ＮＭ－０００６２６または１１０３８６７４）；
ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ，Genbank受入番号ＮＭ－０３０７６４，ＡＹ３５８１３０）；
ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２，Genbank受入番号Ｍ１１７３０）；Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139)；
ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６，Genbank受入番号Ｍ１８７２８）；Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988；
ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１，Genbank受入番号ＢＣ０１７０２３）；
ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ，ＺＣＹＴＯＲ７，Genbank受入番号ＡＦ１８４９７１）；
Ｂｒｅｖｉｃａｎ（ＢＣＡＮ，ＢＥＨＡＢ，Genbank受入番号ＡＦ２２９０５３）；
ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ，ＥＲＫ，ＨｅｋＳ，ＥＰＨＴ３，Ｔｙｒｏ５，Genbank受入番号ＮＭ－００４４４２）；
ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ，Genbank受入番号ＡＸ０９２３２８）；米国第２００４０１０１８９９号（請求項２）；
ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体，Genbank受入番号ＡＪ２９７４３６）；
ＧＥＤＡ（Genbank受入番号ＡＹ２６０７６３）；ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１ホモサピエンス（ヒト）；
（２６）ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３，Genbank受入番号ＡＦ１１６４５６）；ＢＡＦＦレセプター／ｐｉｄ＝ＮＰ－４４３１７７．１－ホモサピエンス；Thompson, J. S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001)；国際公開第２００４０５８３０９号；国際公開第２００４０１１６１１号；国際公開第２００３０４５４２２号（実施例；ページ３２～３３）；国際公開第２００３０１４２９４号（請求項３５；図６Ｂ）；国際公開第２００３０３５８４６号（請求項７０；ページ６１５～６１６）；国際公開第２００２９４８５２号（Ｃｏｌ １３６～１３７）；国際公開第２００２３８７６６号（請求項３；ページ１３３）；国際公開第２００２２４９０９号（実施例３；図３）；相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ－４４３１７７．１；ＮＭ－０５２９４５－１；ＡＦ１３２６００
ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２－Ｂアイソフォーム，ＢＬ－ＣＡＭ，Ｌｙｂ－８，Ｌｙｂ８，ＳＩＧＬＥＣ－２，ＦＬＪ２２８１４，Genbank受入番号ＡＫ０２６４６７）；
ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連アルファ（immunoglobulin-associated alpha），Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合により相互作用し、表面でＩｇＭ分子と複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝えるＢ細胞特異的タンパク質）；
ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１，ＣＸＣＬ１３ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走および体液性防御において作用し、ＨＩＶ－２感染において何らかの役割を担っており、おそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、および白血病を発症させる役割を担っているＧタンパク質共役レセプター）；
ＨＬＡ－ＤＯＢ（ペプチドに結合し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球に当該ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；
Ｐ２Ｘ５（細胞外ＡＴＰにより開口するイオンチャネルである、プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、シナプス伝達および神経発生に関与し得、欠乏は突発性排尿筋不安定の病態の一因となり得る）；
ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ－２）；３５９ａａ），ｐＩ：８．６６，ＭＷ：４０２２５ ＴＭ：１［Ｐ］ 遺伝子染色体：９ｐ１３．３，Genbank受入番号ＮＰ－００１７７３．1)；
ＬＹ６４（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であるリンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）は、Ｂ細胞活性化およびアポトーシスを制御し、機能欠損は、全身性エリテマトーデスの患者における疾患活動性の亢進と関連する）；
ＦｃＲＨ１（Ｃ２ Ｉｇ型様ドメインおよびＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインの推定レセプターであるＦｃレセプター様タンパク質１は、Ｂリンパ球分化において何らかの役割を有し得る）；
ＩＲＴＡ２（ＦｃＲＨ５，免疫グロブリンスーパーファミリーレセプター転座関連２，Ｂ細胞発生およびリンパ腫形成において何らかの役割を有し得る推定免疫レセプター；
ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２，ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ，ＴＰＥＦ，ＨＰＰ１，ＴＲ，推定膜貫通プレテオグリカン，増殖因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリーおよびホリスタチンに関連）；
ＭＵＣ１（腫瘍関連ＭＵＣ１グリコペプチドエピトープ）；ヒト腺癌は、異常単糖および二糖抗原、例えば、Ｔｎ、シアリルＴｎ（sialyl-Tn）、およびＴＦ、ならびに可変数タンデムリピート（variable number of tandem repeats）（ＶＮＴＲ）領域の非グリコシル化タンパク質骨格の伸長物を含む、低グリコシル化された（hypoglycosylated）腫瘍関連型のムチン様糖タンパク質ＭＵＣ１を過剰発現する。
本発明に基づいて作製することができるＡＤＣは、癌および自己免疫状態などの患者の様々な疾患または障害、例えば、疾患関連抗原、例えば、限定はされないが、腫瘍関連抗原の過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療するために使用し得る。状態または障害の例として、感染症およびその他、特に、良性または悪性腫瘍；白血病およびリンパ性腫瘍；その他の障害、例えば、ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、間質、胞胚腔、炎症性、血管新生、および免疫の障害が挙げられる。ＡＤＣ治療に感受性の癌の種類には、特定の腫瘍関連抗原または細胞表面レセプター、例えばＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌の種類が含まれる。
一つの方法は、哺乳動物における癌治療法であって、前記癌が、ＥｒｂＢレセプターの過剰発現を特徴とする、前記癌治療法である。哺乳動物は、非結合型（unconjugated）抗ＥｒｂＢ抗体による治療に反応しないか、または反応が不十分であってもよい。当該方法は、哺乳動物に治療有効量の抗体薬物複合体化合物を投与することを含んでなる。ＨＥＲ２レセプターまたはＥＧＦレセプターなどの増殖因子レセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖は、前記増殖因子レセプターに特異的に結合する本発明に係るＡＤＣ、および化学療法剤を患者に投与することにより阻害され得、ここで、前記抗体薬物複合体および前記化学療法剤は、それぞれ、患者における腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量で投与される（図２９参照）。
本明細書において治療される癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。当該癌のより具体的な例として、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、例えば、消化器癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
本発明のさらなる実施形態は、１以上の修飾基質を含んでなるミクロシスチンおよび／またはノジュラリン化合物であり、前記１以上の修飾基質は、天然に組み込まれている基質に直接的に由来するものではなく、好ましくは、前記非リボソーム性ペプチドの特定の位置に天然には組み込まれておらず、かつ、標的化部分または標識の結合のために、クリックケミストリーを含むコンジュゲーションケミストリーに使用するために直接利用可能または変換可能ではない官能基による天然に組み込まれている基質の置換物でもないアミノ酸または修飾アミノ酸である。
修飾基質の成功裡の供給は、スクリーニング（１０ｍｌ以下の小スケール；図２Ａ～Ｄ参照）および修飾非リボソーム性ペプチドの産生（２～２０Ｌスケール；図２４，２５参照）を可能にする様々な培養系およびスケールで実施した。様々なスクリーニングスケールは、以下を含んでなる。
約２．２ｍｌのディープウェルマイクロタイタープレート（ｄｗ－ＭＴＰ）中で１．６ｍｌの培養物を培養し、６００ｒｐｍの激しい振盪と、ｄｗ－ＭＴＰ上方のヘッドスペースにおける５％で一定のＣＯ２濃度とにより、確実にＣＯ２を供給した。ＬＥＤパネルまたはバイアル蛍光管（vial fluorescence bulb）により、毎日２４時間照射を行った。菌株およびその増殖期に応じて、光強度を３５～２５０μｍｏｌ／ｓ＊ｍ２の間で調節した。温度を菌株に応じて２０℃～３０℃の間で変化させた。
このように、振盪が４００～８００ｒｐｍであり、一定のＣＯ２濃度がヘッドスペースにおいて１～１０％、好ましくはヘッドスペースにおいて３～８％である方法による培養が好ましい。
１０ｍｌの培養物を４０ｍｌのポリスチレンチューブで培養し、２５０～３５０ｒｐｍの激しい振盪と、培養容器下方において５％で一定のＣＯ２濃度とにより、確実にＣＯ２を供給した。これにより、培養容器の底にあるＣＯ２透過性ポリプロピレン膜を介してＣＯ２が培養物に導入された。蛍光管により毎日２４時間照射を行い、菌株およびその増殖期に応じて、光強度を３５～２５０μｍｏｌ／ｓ＊ｍ２の間で再度調節した。温度を菌株に応じて２０℃～３０℃の間で再度変化させた。
このように、蛍光管により毎日２４時間照射を行い、照射が２０～４５０μｍｏｌ／ｓ＊ｍ２である方法による培養が好ましい。
５０ｍｌの培養物をガラスフラスコで培養し、５％で一定のＣＯ２濃度でバブリングすることにより確実にＣＯ２を供給した。磁気撹拌子を用いて１００ｒｐｍで撹拌することにより、培養物を混合した。蛍光管により毎日２４時間照射を行い、菌株および増殖期に応じて、強度を３５～２５０μｍｏｌ／ｓ＊ｍ２の間で調節した。
さらに、２Ｌ～２０Ｌの産生スケールでの供給実験も行い、０．５～５．０％で一定のＣＯ２濃度でバブリングすることにより、確実にＣＯ２を供給し、混合した。蛍光管により照射を行い、菌株および増殖期に応じて、強度を３５～２５０μｍｏｌ／ｓ＊ｍ２の間で調節した。
必要に応じて、上記の期間中、同じ光強度で１６時間光／８時間の昼夜サイクル下で培養を行った。
必要に応じて、異なる光源（例えば、ＬＥＤ光または硫黄－プラズマランプ）を用い、菌株に応じて異なる光強度、ＣＯ２濃度、振盪／撹拌強度、および培地組成を用いて、培養を行った。
１０ｍｌスケールの実施例の供給スキームは以下である。
全ての菌株を、事前に決定した菌株に応じた培養条件に従って、ＢＧ１１培地（以下参照）で培養した。
細胞を、４日間、２５℃で、７０ｒｐｍの撹拌器上で、低い光条件（３０μｍｏｌ／ｓ＊ｍ２）下で、エルレンマイヤーフラスコ中で予備培養した。
１０ｍｌスケールの供給実験では、約４０ｍｌのポリスチレンチューブで、７５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ７５０ｎｍ）を０．５として細胞をインキュベートした。培地中１０ｍＭの濃度になるようにＴＥＳを添加することにより、培地を緩衝化した。必要に応じて、ＤＭＳＯを培地中１％の濃度になるように添加した。
それぞれの修飾基質を培地中１０ｍＭの濃度になるように添加することによる接種で、培養物の供給を開始した。修飾基質の毎日の添加は、１日あたりさらに１０μＭを供給することにより、４日間にわたって一定とした（１～４日目）。あるいは、接種後１日目および３日目に、各日培地中３０μＭの濃度になるように修飾基質を供給することにより、修飾基質の添加を行った。培養物の増殖を、７５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ７５０ｎｍ）の測定により、毎日モニタリングした。培養物に終濃度が２０％になるようにメタノールを添加することにより、培養を終わらせた。その後、Ｃ１８修飾シリカカートリッジを使用して、標準的な固相抽出手順により抽出を行った。
上記の他のスケールでは、プロトコルは類似しており、わずかに異なっているだけであった。例えば、２Ｌおよび２０Ｌスケールでは、培地は常に緩衝化されているわけではなく、増殖速度が遅いため、培養期間をさらに１週間延長した。さらに、場合によっては、修飾非リボソーム性ペプチドの収率を増加させるために、添加する修飾基質の量を３００μＭの培地濃度まで（菌株が当該濃度に耐える場合に）増加させて使用した。
Figure 0007265788000008
 表：供給実験に使用したＢＧ１１培地の配合表
以下の菌株について、１以上の修飾されたクリック可能な基質の供給を実際に行った。
Figure 0007265788000009
 ＭＣは、ミクロシスチンであり、ＭＣの後ろの２文字は、可変位置２および４のアミノ酸を規定し、Ｒはアルギニンであり、Ｙはチロシンであり、Ｌはロイシンであり、Ｗはトリプトファンであり、Ｆはフェニルアラニンである。Ｄ－ＭＡｓｐ３は、位置３のＤ－エリスロ－β－メチルアスパラギン酸であり、Ｄｈｂ７は、位置７のデヒドロブチレートである。
図４～２２は、クリック可能なアンカー基、またはコンジュゲーション可能なアンカー基へのさらなる修飾に簡単に利用できるアンカー基を保有する、様々な属および株によりそれぞれ産生される、様々な位置でのミクロシスチンおよびノジュラリンへの修飾アミノ酸の組み込みを示す。
以下の表は、修飾アミノ酸と標的化部分および／または標識との間のリンカーを介した、またはリンカーなしの標的化部分および／または標識の結合のために、（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能なアンカー基をそれぞれ含んでなる１つまたは２つの修飾基質を用いた、様々なシアノバクテリア属および株のそれぞれの供給実験の結果をまとめたものである。
Figure 0007265788000010
Figure 0007265788000011
Figure 0007265788000012
Figure 0007265788000013

Claims (18)

  1. １以上の修飾アミノ酸を含んでなる修飾ミクロシスチンと標的化部分との結合によって形成される化合物であって、前記標的化部分が、目的の標的の抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む抗体または抗体断片からなる群から選択され、前記１以上の修飾アミノ酸が、前記修飾ミクロシスチンと前記標的化部分との前記結合の形成のために（クリックケミストリーを含む）コンジュゲーションケミストリーに使用するための直接利用可能または変換可能なアンカー基を含んでなり、
    前記修飾ミクロシスチンが環状ヘプタペプチドであり、
    前記修飾アミノ酸が前記ミクロシスチンの２位及び／又は４位に組み込まれている、前記化合物。
  2. 免疫特異的に結合する前記抗原結合部位が、腫瘍関連抗原に結合する、請求項1に記載の化合物。
  3. 前記腫瘍関連抗原が、BMPR1B、E16、STEAP1、0772P、MPF、Napi3b、Sema、PSCA hlg、ETBR、MSG783、STEAP2、TrpM4、CRIPTO、CD21、CD79b、FcRH2、HER2、NCA、MDP、IL20Rα、BCAN、EphB2R、ASLG659、PSCA、GEDA、BAFF-R、CD22、CD79a、CXCR5、HLA-DOB、P2X5、CD72、LY64、FcRH1、IRTA2、TENB2及びMUC1からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
  4. 前記修飾ミクロシスチンが以下の構造を有し、
    Ｄ－Ａｌａ１－Ｘ２－Ｄ－ＭｅＡｓｐ３－Ｚ４－Ａｄｄａ５－ＤＧｌｕ６－Ｍｄｈａ７、
    ここで、それぞれ互いに独立して、Ｄ－Ａｌａ１及びＤ－ＭｅＡｓｐ３はそれぞれ可変Ｄ－アミノ酸位置であり、Ａｄｄ５はＡｄｄａ、ＤＭ－Ａｄｄａ、（６Ｚ）Ａｄｄａ及びＡＤＭ－Ａｄｄａからなる群から選ばれ、Ｄ－Ｇｌｕ６はＤ－Ｇｌｕ及びＤ－Ｇｌｕ（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ｍｄｈａ７はＭｄｈａ、Ｄｈａ、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－ＭｅＳｅｒ、Ｄｈｂ及びＭｅＬａｎからなる群から選ばれ、Ｘ２及びＺ４がそれぞれ独立してＬ－アミノ酸又は修飾アミノ酸であり、
    前記１以上の修飾アミノ酸が、ミクロシスチンのＸ ２ 及び／又はＺ ４ の位置に組み込まれている、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. 前記Ｄ－Ａｌａ１がＤ－Ａｌａ、Ｄ－Ｓｅｒ及びＤ－Ｌｅｕからなる群から選ばれ、前記Ｄ－ＭｅＡｓｐ３がＤ－ＭｅＡｓｐ及びＤ－Ａｓｐからなる群から選ばれる、請求項４に記載の化合物。
  6. ミクロシスチンにおける修飾位置がＸ２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. ミクロシスチンにおける修飾位置がＺ４である、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 前記修飾アミノ酸が、以下の群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
    Figure 0007265788000014
  9. 前記修飾ミクロシスチンが以下の式のうちの１つを有し、
    Ｄ－Ａｌａ１－Ｘ２－Ｄ－ＭｅＡｓｐ３－Ｚ４－Ａｄｄａ５－ＤＧｌｕ６－Ｍｄｈａ７、
    Figure 0007265788000015
     式中、「Ｘ２」および／または「Ｚ４」は、前記１以上の修飾アミノ酸を含んでなり、前記修飾アミノ酸は、以下の群から選択されるアミノ酸である、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
    Figure 0007265788000016
  10. 前記修飾アミノ酸の（クリックケミストリー反応を含む）コンジュゲーションケミストリー反応が、銅（Ｉ）－触媒アジド－アルキン付加環化、歪促進アジド－アルキン付加環化、アルキン－アジド付加環化、またはアルケン－テトラジン逆要請型ディールス－アルダー反応、ならびに一級アミン、チオール、アルデヒド、カルボキシル、およびオキシムの特有の反応性を利用する反応を含んでなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物であって、前記１以上の修飾アミノ酸が、天然に組み込まれているアミノ酸に直接的に由来するものではない、前記化合物。
  12. 前記化合物が、同じ化合物群に属する化合物の細胞内取り込みをインビボで可能にし得る標的細胞の天然のレセプターまたはトランスポーターが、当該特定の構造変異体を、有機アニオン輸送ポリペプチド１Ｂ１（ＯＡＴＰ１Ｂ１）がミクロシスチン－ＬＲを輸送する速度よりも５０倍以上遅い非常に遅い速度でしか取り込むことができないような化学構造を含んでなり、それにより、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現するヒト細胞への前記化合物の取り込みが制限される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 前記化合物が、水への溶解性、低ｐＨ下での安定性、薬物動態、および薬力学などの薬物様特性が、ミクロシスチン－ＬＲと比較して、ＡＤＣのペイロードとしての用途に１０％以上有利に変化するような化学構造を含んでなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 前記修飾ミクロシスチンがリンカーを介して前記標的化部分に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 薬剤としての使用のための請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
  16. 癌ならびに／またはその他の疾患および障害の診断または治療に使用するための請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
  17. 前記癌が、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌（kidney cancer）、筋肉癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、血液癌、結合組織癌、胎盤癌、骨癌、脳癌、子宮癌、白血病、ＣＮＳ癌、黒色腫、および腎癌（renal cancer）を含んでなる群から選択される、請求項１６に記載の使用のための化合物。
  18. 抗体に結合した１以上の修飾アミノ酸を含む修飾ミクロシスチン化合物を含んでなる抗体薬物複合体であって、前記1以上の修飾アミノ酸が、前記修飾ミクロシスチン化合物を前記抗体に結合するクリックケミストリー結合に含まれるアンカー基を含んでなり、前記修飾ミクロシスチンが環状ヘプタペプチドであり、前記修飾アミノ酸が前記ミクロシスチンの２位及び／又は４位に組み込まれている、前記抗体薬物複合体。
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