JP6067754B2 - システイン残基を含むモチーフが結合した修飾抗体、前記修飾抗体を含む修飾抗体−薬物複合体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
また、本発明は、前記修飾抗体−薬物複合体を含む疾病、特に癌の治療用組成物及びこれを利用した治療方法に関する。
本発明の修飾抗体は、一つ以上のシステイン残基を含むモチーフを含み、システイン残基に薬物を結合させて薬物を標的組織に効果的に伝達できるだけでなく、薬物と結合できるシステイン残基個数の正確な調節が可能で、修飾抗体−薬物複合体に含まれる薬物の個数、すなわち量を調節できるという長所を有しているので、既存抗体−薬物複合体の短所を改善した優秀な薬物伝達体として用いることができ、究極的に癌などの疾病治療のために効率的に用いられる。
本発明では、一つ以上のシステイン残基を含むモチーフが親抗体と結合して、多数の薬物結合部位を持つ新しい形態の修飾抗体及びこれを利用した修飾抗体−薬物複合体を提供する。このような修飾抗体は、親抗体の特性は維持しながら、非常に多様な薬物が多数結合することができて、効率的な新しい修飾抗体−薬物複合体として用いられる。
(1)BMPRIB(骨形態形成タンパク質受容体−IB型、ジーンバンク承認番号NM_001203);
(2)E16(LAT1、SLC7A5、ジーンバンク承認番号NM_003486);
(3)STEAP1(前立腺の6回の膜横断上皮抗原、ジーンバンク承認番号NM_012449);
(4)0772P(CA125、MUC16、ジーンバンク承認番号AF361486);
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核球強化因子、メソテリン、ジーンバンク承認番号NM_005823);
(6)Napi3b(NAPI−3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアーファミリー34(リン酸ナトリウム)、メンバー2、第II型ナトリウム−依存性ポスフェート輸送体3b、ジーンバンク承認番号NM_006424);
(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm、42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン5b Hlog、セマドメイン、七つのトロンボスポンジン反復体(第1型及び類似第1型)、膜横断ドメイン(TM)及び短い細胞質ドメイン、(セマフォリン)5B、ジーンバンク承認番号AB040878);
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12遺伝子、ジーンバンク承認番号AY358628);
(9)ETBR(エンドセリンB型受容体、ジーンバンク承認番号AY275463);
(10)MSG783(RNF124、仮想タンパク質FL、J20315、ジーンバンク承認番号NM_017763);
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA−1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回の膜横断上皮抗原2、6回の膜横断前立腺タンパク質、ジーンバンク承認番号AF455138);
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一時的受容体電位陽イオンチャネル(transient receptor potential cation channel)、M亜族(subfamily M)、メンバー4、ジーンバンク承認番号NM_017636);
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌腫−由来成長因子(teratocarcinoma-derived growth factor)、ジーンバンク承認番号NP_003203またはNM_003212);
(14)CD21(CR2(補体受容体2)または、C3DR(C3d/エプスタイン・バール・ウイルス受容体)またはHs.73792ジーンバンク承認番号M26004);
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫グロブリン−関連β)、B29、ジーンバンク承認番号NM_000626);
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファターゼ固定タンパク質1a)、SPAP1B、SPAP1C、ジーンバンク承認番号NM_030764);
(17)HER2(ジーンバンク承認番号M11730);
(18)NCA(ジーンバンク承認番号M18728);
(19)MDP(ジーンバンク承認番号BC017023);
(20)IL20Rα(ジーンバンク承認番号AF184971);
(21)プレビカン(ジーンバンク承認番号AF229053);
(22)EphB2R(ジーンバンク承認番号NM_004442);
(23)ASLG659(ジーンバンク承認番号AX092328);
(24)PSCA(ジーンバンク承認番号AJ297436);
(25)GEDA(ジーンバンク承認番号AY260763);
(26)BAFF−R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3、NP_443177.1);
(27)CD22(B−細胞受容体CD22−Bイソ形、NP−001762.1);
(28)CD79a(Igβ(CD79B)と共有的に相互作用してIgM分子と表面で複合体を形成するB細胞特異的タンパク質であるCD79A、CD79α、免疫グロブリン−関連α(immunoglobulin-associated alpha)はB細胞分化に関与する信号を伝達する、ジーンバンク承認番号NP_001774.1);
(29)CXCR5(CXCL13ケモカインにより活性化したGタンパク質カップリングされた受容体であるバーキットリンパ腫受容体1は、リンパ球移動及び体液性防御に作用してHIV−2感染に参加して、AIDS、リンパ腫、骨髄腫及び白血病の発病と関連があると見なされる、ジーンバンク承認番号NP_001707.1);
(30)HLA−DOB(ペプチドに結合してCD4+ Tリンパ球に提示する、MHCクラスII分子(Ia抗原)のβサブユニット、ジーンバンク承認番号NP_002111.1);
(31)P2X5(細胞外ATPによってゲートされるイオンチャネルである、プリン性受容体P2Xリガンド−ゲートイオンチャネル5は、シナプス伝達及び神経発生に関与でき、これの欠乏は特発性排尿筋不安定の病態生理に寄与される、ジーンバンク承認番号NP_002552.2);
(32)CD72(B−細胞分化抗原CD72、Lyb−2、ジーンバンク承認番号NP_001773.1);
(33)LY64(ロイシン豊富反復体(LRR)族の第I型膜タンパク質である、リンパ球抗原64(RP105)は、B細胞活性化及び細胞自滅を調節して、これの機能喪失は前身性紅斑性ループス患者の疾病活性増加と関連がある、ジーンバンク承認番号NP_005573.1);
(34)FcRH1(C2型Ig−類似及びITAMドメインを含有する免疫グロブリンとFcドメインに対する推定的受容体であるFc受容体様タンパク質1は、Bリンパ球分化に関与できる、ジーンバンク承認番号NP_443170.1)
(35)IRTA2(B細胞発生及びリンパ腫発生に作用できる推定的免疫受容体である免疫グロブリン巨大族受容体転座関連2(Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated 2)、転座による前記遺伝子脱調節は、いくつかのB細胞悪性腫瘍で起きる、ジーンバンク承認番号NP_112571.1);及び
(36)TENB2(成長因子のEGF/ヘレグリン族及びポルリスタチンと関連がある推定的膜横断プロテオグリカン、ジーンバンク承認番号AF179274);
等があるが、これに対し限定されることなく、治療用、または診断用で使用可能ないずれの抗原が含まれる。
Xa−[(MCys)n−Xbn]n 構造式(1)
前記構造式(1)で、(MCys)nは、単なるシステイン残基、または、システイン残基を含んで特定の作用能や2次あるいは3次構造を持つペプチドモチーフを意味して、Xa及びXbnは、互いに独立的にシステインを除いたアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、nは1〜20の整数である。
前記構造式(1)での各(MCys)n、すなわち(MCys)1、(MCys)2・・・・(MCys)nは、互いに同じでも異なっても良い。また、各Xbn、すなわちXb1、Xb2・・・・Xbnも互いに同じでも異なっても良い。
Xa−(Cys−Xbn)n 構造式(2)
構造式(2)でのXa、Xbn及びnは、前記構造式(1)での定義と同様である。
YKCKQCGKAFGCPSNLRRHGRTH(配列番号1)、
YQCNICGGKCFSCNSNLHRHQRTH(配列番号2)、
YSCGICGKSFSDSSAKRRHCILH(配列番号3)、
YTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTH(配列番号4)、
YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIH(配列番号5)、
YKCKECGKAFNHSSNFNKHHRIH(配列番号6)、
FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTH(配列番号7)、
YRCKYCCDRSFSISSNLQRHVRNIH(配列番号8)、
YECDHCGKAFSIGSNLNVHRRIH(配列番号9)、
YGCHLCCKAFSKSSNLRRHEMIH(配列番号10)、
YKCKECGQAFRQRAHLIRHHKLH(配列番号11)、
YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH(配列番号12)、
FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLH(配列番号13)、
YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIH(配列番号14)、
YACHLCGKAFTQSSHRRHEKTH(配列番号15)、
YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIH(配列番号16)、
YACHLCGKAFTQCSHLRRHEKTH(配列番号17)、
YACHLCAKAFIQCSHLRRHEKTH(配列番号18)、
YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH(配列番号19)、
YKCEECEGKAFRQSSHLTTHKIIH(配列番号20)、
YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH(配列番号21)、
YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTH(配列番号22)、
YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIH(配列番号23)、
FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH(配列番号24)、
YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTH(配列番号25)、
YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSH(配列番号26)、
YECVQCGKSYSQSSNLFRHQRRH(配列番号27)、
YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVH(配列番号28)、
YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTH(配列番号29)、
YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIH(配列番号30)、
YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIH(配列番号31)、
YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTH(配列番号32)、
YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH(配列番号33)、
YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTH(配列番号34)、
YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSH(配列番号35)、
YKCEECGKAFNQSSTLTRHKIVH(配列番号36)、
YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIH(配列番号37)、
YEVHDCGKSFRQSTHTLTQHRRIH(配列番号38)、
YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH(配列番号39)、
HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTH(配列番号40)、
YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH(配列番号41)、
YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(配列番号42)、
YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKH(配列番号43)、
FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTH(配列番号44)、
FACSWQDCNKKFARSDELARHYRTH(配列番号45)、
YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(配列番号46)、
FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSH(配列番号47)、
CRCNECGKSFSRRDHLVRHQRTH(配列番号48)、
FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH(配列番号49)、
FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKH(配列番号50)、
YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRH(配列番号51)、
YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH(配列番号52)、
YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(配列番号53)、
YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(配列番号54)、
FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(配列番号55)、
YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(配列番号56)、
YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(配列番号57)、
YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(配列番号58)、
YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(配列番号59)、
FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(配列番号60)、
CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(配列番号61)、
CDICGRKFARSDERKRHTKIH(配列番号62)
などが挙げられるが、これに制限されるのではなく、
http://www.zincfingers.org、http://www.genenames.org/genefamilies/ZF、http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php、https://zifdb.msi.umn.edu:8444/ZiFDB/、または Macpherson et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70(3), 583-604等に報告されたジンクフィンガータンパク質の金属イオン結合モチーフのうち本発明の技術的特性と符合するのであれば、いずれも制限されることなく使用可能である。
CadCタンパク質:
CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYALCQDEELCVC(配列番号63)
AztRタンパク質:
CDTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSELCVC(配列番号64))
ZiaRタンパク質:
CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSALARQELCVC(配列番号65)
BxmRタンパク質:
CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRVVSVLAKQELCVC(配列番号66)
ArsRタンパク質:LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCM(配列番号67)
CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPVRLRILSQLAAGGC(配列番号68)
YRAAMPVVRALVAYLTENCCHGTRDC(配列番号69)
CmtRタンパク質:
CLRGCGLVVATYEGRQVRYALADSHLARALGELVQVVLAVDTDQPC(配列番号70)
CLRDCGLVVTVPDGRRSRYELADERLGHALDDLRAAVVAVDADRTCPDADELECC(配列番号71)
などが挙げられるが、これに限定されるのではない。
Tn501 MerP:VPGMTCSACPITVKKAISEVEGVSKVDVTFE(配列番号73)
Tn501 MerA:ITGMTCDSCAAHVKEALEKVPGVQSALVSY(配列番号74)
S.aureus CadA:VQGFTCANCAGKFEKNVKKIPGVQDAKVNFG(配列番号75)
Human Menkes:VEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGEHHIKVSLE(配列番号76)
Yeast Atx1:VVMTCSGCSGAVNKVLTKLEPDVSKIDIS(配列番号77)
Rat Wilsons:GMTCASCVANIERNLRREEGIYSV(配列番号78)
Hum Wilsons:YEGMTCQSCVSSIEGKYRKLQGVVRYKVSL(配列番号79)
Rice Cu ATPase:GMSCQGCAGAVRRVLTKMEGVETFDIDME(配列番号80)
H.pylori Cu ATPase:VPSITCSHCVDKIEKFVGEIEGVSFIDANVE(配列番号81)
Ran1:VTGMTCAACSNSVEAALMNVNGVDVGGMTCGGCSASVKKLLESQPCVASASV(配列番号82)
Cpx89:VSGMVCAACSTAVENALLSCSGV(配列番号83)
Paa1:DVGGMTCGGCSASVKKILESQP(配列番号84)
Cpx1184:DVGGMKCGGCVEHVKKILEEQFGVTSAS(配列番号85)
ジンクフィンガーモチーフを基にして人為的に合成された金属イオン結合モチーフではPYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTHで最も必須の役割を果たすシステイン残基やヒスチジン残基中システインをメチル基が置換されたメチル−システイン基(Me−Cys)に置換されたり、またはヒスチジン残基をシステインに置換された(Roehm and Berg, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120. 13083-13087 参照)下記のような金属結合ペプチドモチーフが用いられる。
PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTM(配列番号87)、
PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHT(Me−C)(配列番号88)、
PYK(Me−C)PECGKSFSQKSALVKHQRTHTH(配列番号89)、
PYKCPE(Me−C)GKSFSQKSALVKHQRTHTH(配列番号90)、
PYKCPE(Me−C)GKSFSQKSALVKHQR(配列番号91)
前記金属結合ペプチドモチーフで、Me−Cはメチル基が置換されたシステイン残基を意味する。
その他にも、現在まで報告された多くの金属イオン結合タンパク質モチーフを基にする人為的合成ペプチドも使用可能である。タンパク質の2次及び3次構造に基づいた金属イオン結合モチーフは、beta−sheet、混在されたalpha/betaモチーフ、そして最も多く発見されるalpha−ヘリックス構造などが挙げられるが、alpha−ヘリックス構造には単一鎖だけでなく、二重鎖、三重鎖、四中鎖alpha−ヘリックス構造を持つペプチドがある。
GLKALEEKCKALEEKLKALEEKLKALEEKG(配列番号92)
GLKALEEKLKALEEKLKACEEKLKALEEKG(配列番号93)
GLKALEEKCKALEEKLKACEEKLKALEEKG(配列番号94)
GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKG(配列番号95)
GLKALEEKLKALEEKLKALEEKCKALEEKG(配列番号96)
GLKALEEKLKALEEKLKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(配列番号97)
GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(配列番号98)
ELYALEKELGALEKELACLEKELGALEKELYALEK(配列番号99)
KLYALKEKLGALKEKLACLKEKLGALKEKLYALKE(配列番号100)
ELYALEKELGALEKELACLKEKLGALKEKLYALKE(配列番号101)
KLYALKEKLGALKEKLACLEKELGALEKELYALEK(配列番号102)
この他にも環状構造を持つ
Cyclo[K 1,12](QCGVCGKCIACK)
のような金属イオン結合ペプチドモチーフ(Nivorozhkin et al. 2000. Inorg. Chem. 39(11) 2306-2313)等数多くのの金属イオン結合ペプチドも用いられる。
本発明に係る修飾抗体に用いられるシステインを含む金属イオン結合モチーフをまとめると、下の表1のとおりになる。
しかし、親抗体の特異性が維持される限り、本発明に係るシステイン残基を含むモチーフ、特にシステイン残基を含むモチーフが金属イオン結合モチーフのようにシステイン残基を含み、特定の作用能や2次あるいは3次構造を持つペプチドモチーフである場合には、親抗体の重鎖と軽鎖末端以外の他の位置、すなわち抗体の内部のどことも連結されてもよく、長い鎖のペプチドリンカーを介して導入されることもできる。可変領域を除いた親抗体の重鎖や軽鎖のアミノ酸をシステインやリジンに置き換えた修飾抗体に長い鎖の炭化水素リンカーを介して導入された抗体−薬物複合体の場合、親抗体の構造的特性と抗体の特異性を維持させらることができるのは、良く知られている。したがって、このような位置に長い鎖のペプチドリンカーで連結されたシステイン残基を含む金属イオン結合ペプチドモチーフは、親抗体の特異性を維持させながら同一性(homogeneity)が高い抗体−薬物複合体を提供することができる。
親抗体に結合されたシステイン残基を含むモチーフ内のシステイン残基とシステイン残基のチオール基(−SH)を介して直接結合されることができ、システインと薬物を連結する第2リンカーが挿入された形態で結合されることもできる。
具体的に、本発明の修飾抗体−薬物複合体に用いられることができる薬物は、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を持つ任意の化合物、部分または基を含み、
(i)マイクロチュブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、またはDNAインターカレーターとして機能できる化学療法剤;
(ii)酵素的に機能できるタンパク質毒素;
(iii)特定癌遺伝子の発現を抑制させることができるマイクロRNA(miRNA)、siRNA、shRNA;及び
(iv)放射線同位元素などが含まれる。
本発明の前記第2リンカーの部分を介して抗体と結合できる薬物の数は、前記記載された通り親抗体に結合したモチーフに含まれたシステイン残基の数が増加するほど増加することができる。
また、本発明では親抗体及び一つ以上のシステインが含まれたモチーフと結合した修飾抗体を製造する方法を提供する。
システインが含まれたモチーフが結合した親抗体は、親抗体の重鎖または軽鎖不変ドメインをコードするヌクレオチド配列にシステインが含まれたモチーフをコードするヌクレオチド配列を連結して、融合された形態で発現できるように組み換えられた発現ベクターを製造して、これを原核または真核細胞で発現させて、前記親抗体の製造方法と類似の方法で生産、精製することができる。
(a)一つ以上のシステインが含まれたモチーフが結合した親抗体をリンカー試薬と反応して共有結合を介して抗体−第2リンカー中間体を形成させた後、この抗体−第2リンカー中間体を活性化薬物の部分と反応させる方法;または
(b)薬物の部分の親核基を第2リンカー試薬と反応させて共有結合を介して薬物−第2リンカー中間体を形成させた後、この薬物−第2リンカー中間体を一つ以上のシステインが含まれたモチーフと結合した親抗体のシステイン基と反応させる方法を介しても製造可能である。
前記組成物で修飾抗体−薬物複合体の薬物は、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤、化学療法剤、免疫抑制剤、抗炎症剤などが用いられるが、これに限定されるのではなく、癌治療において腫瘍細胞を死滅または抑制する薬物の局所的伝達のための抗体複合体の使用によって薬物の部分が腫瘍内に抗体−抗原で標的化された伝達及び細胞内での蓄積を可能にする。この時、このような非結合薬物製剤の投与は除去しようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞にも許容できない水準の毒性を誘発したりもする。しかし、本発明では、修飾抗体−薬物複合体に含まれた抗体の抗原に対する高い特異性により、ターゲット細胞に薬物を正確に伝達できて、治療効果を高めることができ、また高い効果にもかかわらず、毒性により使用が制限的な薬物、特に抗癌剤などの活用度を向上することができる。これにより、最小の毒性を伴った最高の効能が追求される抗体−薬物複合体が製造、精製されて提供される。
本発明での治療可能な癌は、肝臓癌、胃癌、乳癌、結腸癌、骨癌、すい臓癌、頭部または、頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直膓癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、質癌腫、陰門癌腫、ホジキン病(Hodgkin’s disease)、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、及び中枢神経系腫瘍から選択される一つ以上のもので、これに限定されない。具体的な例として、試験管内のHER2−増幅された乳癌細胞であるBT−474で修飾抗体−薬物複合体を接触させて、細胞増殖抑制を誘導することができる。そのため、本発明での修飾抗体−薬物複合体を有効性分とする抑制方法は、前記疾病に関連した細胞を死滅させたり増殖速度を減少させて抑制させる効果を有することが明らかである。
本発明で使われる技術用語及び科学用語において、他の定義がない限り、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を持つ。また、従来と同じ技術的構成及び作用に対する繰り返される説明は省略することにする。
1.1:UV−VIS分光分析
本発明では、抗癌剤であるドキソルビシン(6−maleimidocaproyl)hydrazoneにリンカーを付着した薬物(DOX−EMCH)を利用して抗体−薬物複合体を製造した。DOX−EMCHは人体に注射時血液内アルブミンに存在するシステインのチオール基と結合して、アルブミン−薬物複合体を形成する薬物[Willner et al., Bioconjugate Chem. 1993 (4):521-7]であって、本発明の説明に容易に適用されることができる。
修飾抗体−薬物複合体(mADC)の細胞毒性または細胞増殖抑制性活性は、受容体タンパク質を持つ哺乳動物細胞、例えばSK−BR−3細胞あるいはBT−474細胞を細胞培養培地で修飾抗体−薬物複合体(mADC)に露出させて、細胞を約6時間〜約5日間培養して、細胞生存率を測定することによって確認した。
ハーセプチンは、直接的に癌細胞死滅を起こすことなく、ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity)を介して、Her2陽性細胞死滅を起こす。それに対して、薬物治療方法は、直接的に癌細胞死滅を誘導(apoptotic cell death)するので、caspase活性を測定すると、修飾抗体−薬物複合体(mADC)の細胞毒性がカスパーゼ媒介アポトーシス(caspase mediated apoptosis)であるか確認することができる(Bayascas, et al. (2002), Cell Death and Differentiation. 9: 1078-1089; Preaudat, et al (2002), Journal of Biomolecular Screening. 7: 267-274; Phillips, et al. (2008), Cancer Research 68(22): 9280-9290)。
実施例1:発現ベクターpAV4の製造
本発明に必要な発現ベクタークローニングは、親ベクターであるpSGHV0(GenBank Accession No.AF285183)を利用して、産業界で抗体製作に使用可能なように目的に合わせて改良させて開発したpAV4ベクターを利用した。親ベクターは、大腸菌のようなバクテリアを利用して人体由来タンパク質を発現させる場合、細胞内に過量発現するが、活性を持つ物質で得られにくいタンパク質の場合に動物細胞を利用して細胞外に生理活性を持つ目的のタンパク質を高濃度で発現させて、容易に精製する目的で製作された研究用ベクターである。しかし、産業界で生産用として用いるには多くの制限があるので、このベクターの最も大きい長所である発現量が高いことを生産に利用するために、産業界で使用可能なように改良したものである。また、抗体の場合、重鎖(heavy chain)と軽鎖(light chain)の二つのタンパク質を同時に発現させなければならないので、このような目的に合ったベクターを開発した。
トラスツズマプ(HHL002)ベクターを製造するために、トラスツズマプの重鎖と軽鎖のcDNAをCHO細胞で発現が最大化されるようにコドン最適化された配列でそれぞれ合成した。この遺伝子をpAV4ベクターのXhoI/NotIとApaI/SmaIにそれぞれクローニングしてトラスツズマプベクター(pHHL002)を製造した。
トラスツズマプのC−末端にコードされたリジンを除去してシステイン残基一つだけが追加されたトラスツズマプシステイン修飾抗体(HR−Cys、HHL002C)とCys−Gly−Cys(CGC)で構成されたペプチドが追加された別の修飾抗体(HR−Cys−Gly−Cys、HHL002C2)を製造するために、製造したトラスツズマプベクター(pHHL002)を鋳型にして二つの正方向プライマーと逆方向プライマーを利用して、PCRを行った。具体的には、トラスツズマプを鋳型にして二つのプライマーであるXhoHH正方向けプライマー(5’−GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT −3’)とHHNot逆方向プライマー(5’−GCG GCC GGC CGC TCA ACA ACC CGG AGA CAG −3’)、またはHHNot逆方向プライマー2(5’−GCG GCC GGC CGC TCA ACA GCC ACA ACC CGG AGA CAG−3’)を利用してPCRで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるXhoIとNotIで切断して、XhoI/NotI切断部を持っている発現ベクターpHHL002と接合してトラスツズマプシステイン修飾抗体ベクター(pHHL002C、pHHL002C2)を製造した。ベクター模式図は図1のとおりである。本実施例で製造されたシステイン追加修飾抗体は、C−末端リジンが除去されて、システインまたはシステイン、グリシン、システインが追加されたトラスツズマプのシステイン追加抗体である。
金属イオン結合モチーフ(CGH)を二つ持つトラスツズマプ修飾抗体であるHR−M2(Cys)(HR−ACHGAACGHA、HHL002M2)を製造するためにトラスツズマプベクター(pHHL002)を鋳型にしてXhoHH正方向プライマー(5’−GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT −3’)とM2逆方向プライマー(5’ CCCCGC GGC CGC CTA GGC ATG GCC ACA AGC AGC ATG GCC ACA GGC GCC GGG AGA CAG AGA 3’)を利用してPCRで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるXhoIとNotIで切断して、XhoI/NotI切断部を有している発現ベクターpHHL002と接合してトラスツズマプシステイン修飾抗体ベクター(pHHL002M2)を製造した。
金属イオン結合モチーフ(CGH)を一つだけ持つトラスツズマプ修飾抗体であるHR−M(Cys)(HR−GGGACGHA、HHL002M)を製造するために、前記製造したトラスツズマプ修飾抗体HR−M2(Cys)を鋳型にして、正方向プライマー(5’−GGT GGA GGT GCT TGT GGC CAT TAA GC)と逆方向プライマー(3’−GCC GGG AGA CAG AGA CAG TG)を用いて、site−directed mutagenesis(エンジノミックスEzChange Site−directed mutagenesis kit、Ez004S)方法でPCRを利用して、二つの金属イオン結合モチーフのうちC−末端のモチーフを除去して、親抗体との間にグリシンリンカーを添加した。元の鋳型であるHR−M2(Cys)は制限酵素であるDpnIで切り出した後、PCRを介して作られた5−M(Cys)は、リガーゼ(ligase)を利用して、二本鎖DNAに再び連結してトラスツズマプ修飾抗体ベクター(pHHL002M)を製造した。
金属イオン結合モチーフ(CGH)が三つのアミノ酸リンカーに連結されたトラスツズマプ修飾抗体であるHR−M2L(Cys)(HR−ACGHAGGGACGHA、HHL002M2L)を製造するために前記製造したトラスツズマプ修飾抗体HR−M2(Cys)を鋳型にして、正方向プライマー(5’−GGT GGA GGTGCT TGT GGC CAT GCC TAA GCG)と逆方向プライマー(3’−AGC ATG GCC ACA GGC GCC)を使ってsite−directed mutagenesis(エンジノミックスEzChange Site−directed mutagenesis kit、Ez004S)方法でPCRを利用して、二つの金属イオン結合モチーフの間にグリシンリンカーを添加した。元の鋳型であるHR−M2(Cys)は制限酵素であるDpnIで切り出した後、PCRを介して作られた5−M2L(Cys)は、リガーゼを利用して、二本鎖DNAに再び連結してトラスツズマプ修飾抗体ベクター(pHHL002M2L)を製造した。
金属イオン結合特性を持つクラスI(Class I)ジンクフィンガーモチーフを持つHR−Z(Cys)(HR−CDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQK、HHL002Z)を製造するために、トラスツズマプベクター(pHHL002)を鋳型にして、XhoHH正方向プライマー(5’−GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT −3’、配列番号1)とZ逆方向プライマー(5'−GCA TGC GGC CGC CTT ACT TCT GCC GCA GGT GGA TCT TGG TAT GCC TTT TTC GCT CGT CGG ATC TAG CAA ATT TGC GTC CAC AAA TAT CGC ATT TGC CGG GAG ACA GAG A−3')を利用してPCRで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるXhoIとNotIで切断して、XhoI/NotI切断部を有する発現ベクターpHHL002と接合してトラスツズマプシステイン修飾抗体ベクター(pHHL002Z)を製造した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−K1)を利用して実施例1及び2で製造したトラスツズマプ(HHL002)及びこれのシステイン修飾抗体(HHL002C、HHL002C2、HHL002M、HHL002M2、HHL002M2L、HHL002Z)のタンパク質発現を確認した。CHO−K1は10%FBS(Fetal Bovine Serum)と抗生剤を含んだDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Media)に37℃、5%CO2、培養器で培養した。トラスツズマプ及びこれの修飾抗体発現ベクターを導入する一日前、100mmシャーレに細胞を5×106/mL濃度で播種して培養した後、FBSと抗生剤がない800μLのDMEMと10μgのトラスツズマプまたはシステイン修飾抗体発現ベクターを混合して、常温で1分維持した後、20μgのPEI(Polyethylenimine、linear、Polysciences Inc(Cat.no:23966、MW〜25,000))と混合して10〜15分程度常温で放置した。この時、一日前に培養した細胞をPBSで洗浄して新しい培養液6mLのDMEMを添加した。10〜15分常温に放置したトラスツズマプまたはシステイン修飾抗体の発現ベクターをこのシャーレに添加した。次の日PBS洗浄してFBSが内IMDM(Cat.No 12200−028、Gibco、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培地を添加してタンパク質発現を確認した。
4.1:トラスツズマプを基にする修飾抗体と薬物(ドキソルビシン)の複合体製造
通常タンパク質のシステインが内部ジスルフィド結合をなしていなければ、タンパク質同士ジスルフィドをなして二量体をなすが、図2で示すように、本発明で製造されたHR−CysはSDS−PAGEとウエスタンブロット(western blot)で確認したところ、完全な抗体の形態で存在した。また、遊離チオール基を持つシステインは、細胞内成分であるグルタチオンやアミノ酸で存在するシステインとジスルフィド結合状態で存在されうるので、薬物−第2リンカーとの結合時、ジスルフィド結合を解体するためにDTT(dithiothreitol)やTCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)で代表される還元剤処理段階を必要とするが、常温で攪拌する処理だけで十分結合反応が起きることもある。
本発明では、ドキソルビシンより細胞毒性がはるかに高いと知られているMMAEとHR−Cys−GLy−Cysを接合させてハーセプチン−MMAE結合体(HR−Cys2−MMAE)を製造した。MMAEと知られているオーリスタチン(Auristatin)の接合の可能性誘導体である単一メチルオーリスタチンE(monomethyl Auristatin E、[式(2)]参照)であって、細胞内でタンパク質分解酵素(protease)によって分解されるバリン−シトルリン(valine-citrulline)と自らの分解スペーサーグループであるパラアニリン安息香酸(para-aniline benzoic acid:PABA)を介して、チオール基に選択的に結合するマレイミド基に連結される構造を持つ。これを通称してMC(maleimido caproic acid)−VC(valine-citrulline)−PAB−MMAEとし、これに対する合成方法はすでに知られているのと同様である(米国特許第6214345号;米国特許第7745394号)。オーリスタチンは、細胞内毒性が強い物質であり、細胞増殖抑制試験でのIC50値が200〜300pMと知られている。
トラスツズマプの重鎖C−末端部位に導入されたシステイン残基に選択的に薬物が接合されるのか確認するために、チオール基に選択的に結合するマレイミド基が置換された蛍光染料であるAlexa Fluor(商標)r488をそれぞれのトラスツズマプ変異抗体と反応させた。通常タンパク質のシステインが内部ジスルフィド結合をなしていなければタンパク質同士ジスルフィドをなして二量体をなすが、図2で示すように、本発明で製造されたHR−CysはSDS−PAGEとウエスタンブロットで確認したところ、完全な抗体の形態で存在した。また、遊離チオール基を持つシステインは、細胞内成分であるグルタチオンやアミノ酸で存在するシステインとジスルフィド結合状態で存在されうるので、薬物−第2リンカーとの結合時、ジスルフィド結合を解除するためにDTTやTCEPで代表される還元剤処理段階を必要とするが、常温で攪拌する処理だけで十分結合反応が起きることもある。2〜4当量の還元剤は、重鎖のC−末端に導入されたシステイン残基だけでなく、重鎖と軽鎖それぞれの鎖内のジスルフィド結合と重鎖と軽鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合も還元させることができる。したがって、還元剤によって還元されたシステイン基には、どこにでも蛍光染料が結合される可能性がある。鎖間または鎖内のジスルフィドに結合される薬物体は、抗体−薬物複合体の同一性を低下させて、また結合した比較的大きさが大きい薬物体は、抗体タンパク質自らの構造的安定性と抗原特異性を阻害する可能性が大きいので、究極的バイオ薬物製造においてその効用性が非常に低下することがある。
前記の通り、金属イオン結合モチーフであるCGHを持つペプチドは、金属イオンに結合してシステイン残基の酸化を抑制したり遅くして、システインの過酸化によるスルホン化反応を防止する。システイン残基の酸化は、二つの反応経路を解して進められる。一つは、チオール−チオール結合を介したジスルフィド結合が生じることがあって、他の一つは空気中で過量の酸素と反応して酸化されて中間生成物でスルフェン酸(sulfenic acid:R−S−OH)が生成されることもある。この場合、チオール−ジスルフィド形成反応は可逆反応で、還元剤を介して再びチオール単体に還元されることができるが、酸素が結合したスルフェン酸の形成は、非可逆的反応である。ジスルフィドとスルフェン酸は過量の酸素に長期間露出する場合、全てが非可逆的反応を介してスルホン酸(R−SO3H)に酸化される。このようなスルフェン酸やスルホン酸は、共にマレイミドに対する反応性がないので、スルフェン酸やスルホン酸での酸化は、抗体変異体のマレイミドに対する反応性を弱化させて、したがって抗体−薬物複合体の接合収率と同質性に大きい影響を及ぼしかねない。
6.1:ドキソルビシンと修飾抗体複合体の細胞増殖抑制能
BT−474細胞を10%FBSが添加されたDMEM/F12培地に希釈して1×104個/ウェルになるように調整した後、100μL細胞培養物を96−ウェルプレートの各ウェルに播種した。播種後、ウェルプレートを5%二酸化炭素及び37℃と設定された培養器で24時間培養して細胞をプレートに付着させた。ハーセプチン、ハーセプチンとドキソルビシンの1:2混合物、前記実施例で製造されたHR−Cys−DOX、そしてドキソルビシンを培地に希釈した後、100μL/ウェルで終濃度1000nM、100nM、10nM、1nM及び0.1nMになるように添加し、それと共に対照群ウェルには培地のみ(薬物なし)添加した。5日間培養後に、20μL/ウェルでCellTiter 96−AQueous One Solution試薬[MTS−基礎検定;生きている細胞のデヒドロゲナーゼ(dehydrogenase)によりMTSが紫色ホルマザン(formazan)を形成して、生成された紫色ホルマザンの量によって増殖測定]を添加した後、37℃と設定された培養器で2時間培養した。10%SDS溶液を20μL/ウェル添加して反応を終了させた後、十分混合して細胞溶菌を誘導した。細胞溶菌を吸光分析器で測定し、細胞生存率(viability)(%)として図5にグラフでしめした。その結果、低濃度で処理した時は、HR−Cys−DOXの細胞成長抑制効果は、ハーセプチン、そしてハーセプチンとドキソルビシンの1:2混合物の効果と類似して示され、高濃度ではドキソルビシンと類似する細胞毒性を示した。この結果から、HR−Cys−DOXは、ハーセプチン固有の機能を維持すると同時に第2リンカーと連結されて、ハーセプチンに結合しているにも関わらずドキソルビシン固有の細胞毒性も十分示すことを確認した。
SK−BR3細胞を10%FBSが添加されたDMEM/F12培地に希釈して1×104個/ウェル(well)になるように調整した後、100μL細胞培養物を96−ウェルプレートの各ウェルに加えた。以後ウェルプレートを5%二酸化炭素及び37℃と設定された培養器で24時間培養して細胞をプレートに付着させた。ハーセプチンと前記例で製造したハーセプチン変異抗体−MC−vc−PAB−MMAE複合体を培地に希釈した後、最終濃度66.7nM、33.3nM、6.7nM、3.3nM、0.67nM、0.33nM、0.067nM、及び0.0067nMとなるように添加し、それと共に対照群ウェルには培地のみ(薬物なし)添加した。5日間培養後、20μL/ウェルでCellTiter 96− AQueous One Solution試薬[MTS−基礎検定;生きている細胞のデヒドロゲナーゼによりMTSが紫色ホルマザンを形成して、生成された紫色ホルマザンの量によって増殖測定]を添加した後、37℃と設定された培養器で2時間培養した。細胞溶菌を吸光分析器でO.D.490nmで測定して細胞生存率(%)を測定した。HR−Cys−MC−vc−PAB−MMAE、HR−Cys−Gly−Cys−MC−vc−PAB−MMAE、HR−M2(Cys)−MC−vc−PAB−MMAE、HR−M(Cys)−MC−vc−PAB−MMAE、HR−M2L(Cys)−MC−vc−PAB−MMAE、HR−Z(Cys)−MC−vc−PAB−MMAE共に親抗体であるハーセプチンに比べて優秀な細胞増殖抑制能を見せた。図6に示したように、HR−M2(Cys)−MC−vc−PAB−MMAEは親抗体であるハーセプチンに比べてIC50値は5倍以上(ハーセプチンは細胞生存率が50%以下に低下しなかったので、細胞生存率最大値と最小値の中間値を取った)減少して、高濃度での細胞毒性は、抗体−薬物複合体が約85%が減少するのに比べて親抗体であるハーセプチンは、約40%だけ減少することが示された。これから抗体−薬物複合体が親抗体に比べて非常に優秀な細胞毒性とIC50値を示すことが分かった。
SK−BR−3細胞を10%FBSが添加されたRPMI1640培地に希釈して1×104個/ウェルになるように調整した後、100μL細胞培養物を96−ウェルプレートの各ウェルに加えた。以後ウェルプレートを5%二酸化炭素及び37℃と設定された培養器で24時間培養して細胞をプレートに付着させた。ハーセプチンと前記実施例で製造された抗体変異体−薬物複合体を培地に希釈した後、終濃度66.7nM、33.3nM、6.7nM、3.3nM、0.67nM、0.33nM、0.067nM及び0.0067nMになるように添加し、それと共に対照群ウェルには培地のみ(薬物なし)添加した。48時間培養後、100μL/ウェルでCaspase−Glo3/7試薬[Caspase−Glo3/7検定;カスパーゼパスウェイ(Caspase pathway)を介してアポトーシスが進行される細胞で形成されたカスパーゼ3、7の活性によってカスパーゼ気質が分解されて、発光する程度を測定]を添加した後、室温で30分間培養した。発光をルミノメーター(luminometer)で測定した。
Claims (17)
- 修飾抗体に薬物が結合された修飾抗体−薬物複合体であって、
前記修飾抗体は、親抗体の末端に下記の構造式(1):
Xa−[(M Cys ) n −Xb n ] n 構造式(1)
{前記構造式(1)で、(M Cys ) n は、システイン残基を含む金属イオン結合モチーフを意味して、Xaは、システインを除いたアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、Xb n は、A、G、及びSから成る群から選択されるアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、nは1〜20の整数であり;
(M Cys ) 1 〜(M Cys ) n は、独立して、同じであり又は異なり、そしてXb 1 〜Xb n は、独立して、同じであり又は異なり;そして
システイン残基を含む前記金属イオン結合モチーフは、ジンクフィンガータンパク質のC 2 H 2 グループ(Cys 2 His 2 class:Cys−X 2−4 −Cys−X 12 −His−X 3−5 −His(XはCys以外のアミノ酸残基である)を含むジンクフィンガーモチーフ、膜タンパク質ATP分解酵素のSer−Pro−Cysモチーフ、又はCGH若しくはHGC含有モチーフである}
で表されるシステイン残基を含むモチーフが結合したことを特徴としており、そして
前記親抗体に結合された構造式(1)で表される金属イオン結合モチーフ内のシステイン残基のチオール基を介して薬物が結合されることを特徴とする前記修飾抗体−薬物複合体。 - 前記の構造式(1)で表されるシステイン残基を含む金属イオン結合モチーフが親抗体の重鎖末端に結合したことを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記の構造式(1)で表されるシステイン残基を含む金属イオン結合モチーフが親抗体の重鎖C−末端に結合したことを特徴とする請求項2に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記ジンクフィンガータンパク質のC2H2グループは、
YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIH(配列番号5)、
FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTH(配列番号7)、
YECDHCGKAFSIGSNLNVHRRIH(配列番号9)、
YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH(配列番号12)、
FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLH(配列番号13)、
YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIH(配列番号14)、
YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIH(配列番号16)、
YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH(配列番号19)、
YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH(配列番号21)、
YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTH(配列番号22)、
YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIH(配列番号23)、
FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH(配列番号24)、
YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTH(配列番号25)、
YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSH(配列番号26)、
YECVQCGKSYSQSSNLFRHQRRH(配列番号27)、
YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVH(配列番号28)、
YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTH(配列番号29)、
YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIH(配列番号30)、
YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIH(配列番号31)、
YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTH(配列番号32)、
YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH(配列番号33)、
YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTH(配列番号34)、
YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSH(配列番号35)、
YKCEECGKAFNQSSTLTRHKIVH(配列番号36)、
YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIH(配列番号37)、
YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH(配列番号39)、
HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTH(配列番号40)、
YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH(配列番号41)、
YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(配列番号42)、
YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKH(配列番号43)、
FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTH(配列番号44)、
FACSWQDCNKKFARSDELARHYRTH(配列番号45)、
YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(配列番号46)、
FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSH(配列番号47)、
FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH(配列番号49)、
FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKH(配列番号50)、
YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRH(配列番号51)、
YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH(配列番号52)、
YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(配列番号53)、
YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(配列番号54)、
FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(配列番号55)、
YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(配列番号56)、
YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(配列番号57)、
YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(配列番号58)、
YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(配列番号59)、
FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(配列番号60)、
CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(配列番号61)、及び
CDICGRKFARSDERKRHTKIH(配列番号62)
から選択されるいずれか一つであり、
前記CGHモチーフは、下記の式(1)の構造を持つことを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体:
- 前記親抗体は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、キメラ抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体から一つまたは二以上選択することを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記親抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMから選択される一つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記親抗体は、癌特異抗原、細胞表面受容体タンパク質、細胞表面タンパク質、膜横断タンパク質、信号伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達または分化と関連した分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関連した分子、血管形成に関連した分子、及び血管新生に関連した分子に対する結合能と特異性を持つことを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記親抗体は、
(1)BMPRIB(骨形態形成タンパク質受容体−IB型);
(2)E16(LAT1、SLC7A5);
(3)STEAP1(前立腺の6回の膜横断上皮抗原);
(4)0772P(CA125、MUC16);
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核球強化因子、メソテリン);
(6)Napi3b(NAPI−3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアーファミリー34(リン酸ナトリウム)、メンバー2、第II型ナトリウム−依存性ポスフェート輸送体3b);
(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン5b Hlog、セマドメイン、七つのトロンボスポンジン反復体(第1型及び類似第1型)、膜横断ドメイン(TM)及び短い細胞質ドメイン、(セマフォリン)5B);
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12遺伝子);
(9)ETBR(エンドセリンB型受容体);
(10)MSG783(RNF124、仮想タンパク質FLJ20315);
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA−1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回の膜横断上皮抗原2、6回の膜横断前立腺タンパク質);
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一時的受容体電位陽イオンチャネル、M亜族、メンバー4);
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌腫−由来成長因子);
(14)CD21(CR2(補体受容体2)または、C3DR(C3d/エプスタイン・バール・ウイルス受容体)またはHs.73792);
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫グロブリン−関連β)、B29);
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファターゼ固定タンパク質1a)、SPAP1B、SPAP1C);
(17)HER2;
(18)EGFR、HER3及びHER4から選択されたErbB;
(19)NCA;
(20)MDP;
(21)IL20Rα;
(22)プレビカン;
(23)EphB2R;
(24)ASLG659;
(25)PSCA;
(26)GEDA;
(27)BAFF−R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3);
(28)CD22(B−細胞受容体CD22−Bイソ形);
(29)CD79a(Igβ(CD79B)と共有的に相互作用してIgM分子と表面で複合体を形成するB細胞特異的タンパク質であるCD79A、CD79α、免疫グロブリン−関連αはB細胞分化に関与する信号を伝達する);
(30)CXCR5(CXCL13ケモカインにより活性化したGタンパク質カップリングされた受容体であるバーキットリンパ腫受容体1は、リンパ球移動及び体液性防御に作用してHIV−2感染に参加して、AIDS、リンパ腫、骨髄腫及び白血病の発病と関連があると見なされる);
(31)HLA−DOB(ペプチドに結合してCD4+ Tリンパ球に提示する、MHCクラスII分子(Ia抗原)のβサブユニット);
(32)P2X5(細胞外ATPによってゲートされるイオンチャネルである、プリン性受容体P2Xリガンド−ゲートイオンチャネル5は、シナプス伝達及び神経発生に関与でき、これの欠乏は特発性排尿筋不安定の病態生理に寄与される);
(33)CD72(B−細胞分化抗原CD72、Lyb−2);
(34)LY64(ロイシン豊富反復体(LRR)族の第I型膜タンパク質である、リンパ球抗原64(RP105)は、B細胞活性化及び細胞自滅を調節して、これの機能喪失は全身性紅斑性ループス患者の疾病活性増加と関連がある);
(35)FcRH1(C2型Ig−類似及びITAMドメインを含有する免疫グロブリンとFcドメインに対する推定的受容体であるFc受容体様タンパク質1は、Bリンパ球分化に関与できる)
(36)IRTA2(B細胞発生及びリンパ腫発生に作用できる推定的免疫受容体である免疫グロブリン巨大族受容体転座関連2、転座による前記遺伝子脱調節は、いくつかのB細胞悪性腫瘍で起きる);及び
(37)TENB2(成長因子のEGF/ヘレグリン族及びポルリスタチンと関連がある推定的膜横断プロテオグリカン);
(38)MAGE−C1/CT7(精巣癌過発現タンパク質);
(39)androgen receptor、PTEN、human kallikrein−related peptidase 3(前立腺癌で過発現するタンパク質);
(40)CD20;
(41)CD30;
(42)CD33;
(43)CD52;
(44)EpCam;
(45)CEA;
(46)gpA33;
(47)Mucins;
(48)TAG−72;
(49)Carbonic anhydrase IX;
(50)PSMA;
(51)folate binding protein;
(52)gangliosides(GD2、GD3、GM2);
(53)糖水和物Lewis−Y;
(54)VEGF;
(55)VEGFR;
(56)aVb3;
(57)a5b1;
(58)ERB3;
(59)c−MET;
(60)EphA3;
(61)TRAIL−R1、TRAIL−R2;
(62)RANKL;
(63)FAP;及び
(64)Tenascin
から選択された一つ以上のタンパク質に対する結合能を持つことを特徴とする請求項7に記載の修飾抗体−薬物複合体。 - 前記親抗体は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イピリムマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ゲムツズマブ、プレンツキシマブ、90Y−イブリツモマブ、131I−トシツモマブ、cBR96、cAClO、抗−CD20抗体、抗−EphB2抗体、抗−IL−8、E−セレクチン抗体、抗−MUC16抗体、抗−CD30抗体、抗−CD33抗体及び抗−CD52抗体から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項7に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記親抗体に結合された構造式(1)で表される金属イオン結合モチーフ内のシステイン残基と薬物は、リンカーを介して連結されることを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記リンカーは、ハロアセチル官能基を含むアルキルハライド誘導体、マレイミド基を含む誘導体、アジリジン誘導体、アクリルロイル誘導体、またはフルオロベンゼンなどを含むアリールハライド誘導体から一つまたは二以上選択されることを特徴とする請求項10に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記誘導体は、アルキル化反応基、アリール化反応基、マレイミド基、アジリジン基、アクリロイル基、または、ピリジルジスルフィド及びチオニトロ安息香酸を含む二硫化相互交換反応基を含み、前記反応基は、モチーフ内システイン残基のチオール基と反応して共有結合することを特徴とする請求項11に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記薬物は、マイクロチュブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、DNAインターカレーターとして機能できる化学療法剤、抗癌剤、酵素的に機能できるタンパク質毒素、特定癌遺伝子の発現を抑制させることができるマイクロRNA(miRNA)、siRNA、shRNA、及び放射線同位元素から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- 前記薬物は、メイタンシノイド、オーリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、N8−アセチルスペルミジン、1−(2クロロエチル)−1,2−ジメチルスルホニルヒドラジド、タクソル、エスペラマイシン、エトポシド、6−メルカプトプリン、トラスタチン、トリコテセン、CC1065(細胞毒性化合物)、カリケアマイシン及び他のエンジイン抗生剤、タキサン、アントラサイクリン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンデシン、ビンンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンA、マイトマイシンC、クルラムブシル、ダウノルビシン、ダウノマイシン及びその立体異性体、同配体、同族体または誘導体、テュオカルマイシン及びその立体異性体、同配体、同族体または誘導体、核酸分解酵素、抗生剤、細菌や動植物由来の毒素、シスプラチン、CPT−11、ドキソルビシン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される一つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の修飾抗体−薬物複合体。
- (a)下記の構造式(1)で表されるモチーフが結合した親抗体をリンカー試薬と反応して抗体−リンカー中間体を形成させる工程と、
(b)前記抗体−リンカー中間体を活性化薬物の部分と反応させて修飾抗体−薬物複合体を形成させる工程と、を含む修飾抗体−薬物複合体の製造方法、ここで、前記親抗体に結合された構造式(1)で表される金属イオン結合モチーフ内のシステイン残基のチオール基を介して薬物が結合されるものとする:
Xa−[(MCys)n−Xbn]n 構造式(1)
{前記構造式(1)で、(MCys)nは、システイン残基を含む金属イオン結合モチーフを意味して、Xaは、システインを除いたアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、Xbnは、A、G、及びSから成る群から選択されるアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、nは1〜20の整数であり;
(MCys)1〜(MCys)nは、独立して、同じであり又は異なり、そしてXb1〜Xbnは、独立して、同じであり又は異なり;そして
システイン残基を含む前記金属イオン結合モチーフは、ジンクフィンガータンパク質のC2H2グループ(Cys2His2class:Cys−X2−4−Cys−X12−His−X3−5−His(XはCys以外のアミノ酸残基である)を含むジンクフィンガーモチーフ、膜タンパク質ATP分解酵素のSer−Pro−Cysモチーフ、又はCGH若しくはHGC含有モチーフである}。 - (a)薬物の部分の親核基を第2リンカー試薬と反応させて薬物−リンカー中間体を形成させる工程と、
(b)前記薬物−リンカー中間体を下記の構造式(1)で表されるモチーフと結合した親抗体と反応させる工程と、を含む修飾抗体−薬物複合体の製造方法、ここで、前記親抗体に結合された構造式(1)で表される金属イオン結合モチーフ内のシステイン残基のチオール基を介して薬物が結合されるものとする:
Xa−[(MCys)n−Xbn]n 構造式(1)
{前記構造式(1)で、(MCys)nは、システイン残基を含む金属イオン結合モチーフを意味して、Xaは、システインを除いたアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、Xbnは、A、G、及びSから成る群から選択されるアミノ酸残基0個〜20個で構成されたペプチドを意味して、nは1〜20の整数であり;
(MCys)1〜(MCys)nは、独立して、同じであり又は異なり、そしてXb1〜Xbnは、独立して、同じであり又は異なり;そして
システイン残基を含む前記金属イオン結合モチーフは、ジンクフィンガータンパク質のC2H2グループ(Cys2His2class:Cys−X2−4−Cys−X12−His−X3−5−His(XはCys以外のアミノ酸残基である)を含むジンクフィンガーモチーフ、膜タンパク質ATP分解酵素のSer−Pro−Cysモチーフ、又はCGH若しくはHGC含有モチーフである}。 - 請求項1〜14のいずれか一項に記載の修飾抗体−薬物複合体を含む治療用組成物。
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