MX2014010054A - Anticuerpo modificado en el que el tema que comprende residuos de cisteina esta ligado, conjugado de farmaco de anticuerpo modificado que comprende el anticuerpo modificado y metodo de produccion para el mismo. - Google Patents

Anticuerpo modificado en el que el tema que comprende residuos de cisteina esta ligado, conjugado de farmaco de anticuerpo modificado que comprende el anticuerpo modificado y metodo de produccion para el mismo.

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Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo en el que un motivo compuesto de una secuencia de amino ácido que incluye uno o más residuos de cisteína se une al termino de anticuerpo parental, particularmente al termino de cadena pesada del anticuerpo parental. También, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco (mADC) que comprende un fármaco unido al anticuerpo, y un método para producir el anticuerpo o el conjugado anticuerpo-fármaco. El conjugado anticuerpo-fármaco modificado de acuerdo a la invención puede entregarse de manera segura el fármaco a una célula diana debido a su alta especificidad antígeno, y de este modo puede aumentar el efecto terapéutico del fármaco. También puede aumentar la usabilidad de los fármacos, particularmente fármacos anticancerígenos, el uso de los cuales esta restringido debido a su toxicidad, a pesar de su alta eficacia. Además, la invención se refiere a una composición para el tratamiento de enfermedades, particularmente canceres, que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco modificado.

Description

ANTICUERPO MODIFICADO EN EL QUE EL TEMA QUE COMPRENDE RESIDUOS DE CISTEÍNA ESTÁ LIGADO, CONJUGADO DE FÁRMACO DE ANTICUERPO MODIFICADO QUE COMPRENDE EL ANTICUERPO MODIFICADO Y MÉTODO DE PRODUCCIÓN PARA EL MISMO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un anticuerpo modificado que comprende un enlace del motivo que contiene cisteína (Cys) para un anticuerpo parental, preferentemente el termino de anticuerpo parental, más preferentemente el término de la cadena pesada o ligera del anticuerpo parental, y mas preferentemente el termino C de la cadena pesada o ligera del anticuerpo parental, un conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC) que comprende un fármaco para el enlace de tratamiento o diagnostico para el anticuerpo modificado o el conjugado anticuerpo-fármaco modificado .
El conjugado anticuerpo-fármaco modificado de acuerdo a la presente invención puede entregar de manera segura el fármaco a una célula diana debido a la alta especificidad de antígeno del anticuerpo parental incluido en el conjugado, y de este modo puede aumentar el efecto terapéutico del fármaco. También, puede aumentar la utilidad de los fármacos, particularmente fármacos anticancerígenos con alta eficacia anticancerígena, el uso de estos está restringido debido a su toxicidad.
Además, la presente invención se refiere a la composición, que incluye conjugados anticuerpo-fármaco modificados, para el tratamiento de enfermedades, particularmente cáncer y a un metodo de tratamiento de enfermedades que utilizan el conjugado anticuerpo-fármaco modificado.
El conjugado anticuerpo-fármaco modificado de acuerdo a la presente invención puede contener un número de residuos de cisteína que se puede utilizar para conjugar a fármacos, por que el motivo que contiene uno o más residuos de cisteína se une al anticuerpo parental. De este modo, éste puede contener una gran cantidad de fármacos enlazados al mismo, y una gran cantidad de fármacos enlazados se puede entregar de manera efectiva a una célula diana o tejido. Sin embargo, debido al número de residuos de cisteína que son enlazados al anticuerpo parental puede ser fácilmente controlado, la cantidad del fármaco contenido en el conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC) puede ser fácilmente controlado a un nivel deseado.
Además, debido a que el conjugado anticuerpo-fármaco modificado de acuerdo a la presente invención puede entregar de manera segura el fármaco a una célula diana debido a su alta especificidad para un antígeno, puede aumentar el efecto terapéutico del fármaco y también puede mejorar la utilidad de los fármacos, particularmente fármacos anticancerígenos, los cuales están restringidos en uso debido a su toxicidad, a pesar de su alto efecto anticancerígeno.
ANTECEDENTE Entre los productos biofarmacéuticos, los agentes terapéuticos que utilizan anticuerpos se están estudiando más activamente, los cuales se enlazan específicamente a los objetivos (es decir, antígenos) que se expresan específicamente en ciertas enfermedades. Particularmente, se está realizando de manera activa la identificación de antígenos relacionados con tumor que se expresan en la superficie de las células cancerígenas y los métodos de diagnostico y tratamiento de tumores que utilizan anticuerpos (es decir, anticuerpos cancerígenos) que enlazan a los antígenos para inhibir el crecimiento de células o inducir células saludables que son ampliamente utilizadas, y el campo de estos métodos también tiene un buen prospecto.
Dichos anticuerpos anticancerígenos tiene una muy alta especificidad objetivo, pero sus efectos citotóxicos en las células cancerígenas son usualmente menores que las de los fármacos citotóxicos existentes (es decir, fármacos o agentes anticancerígenos). Por lo que, en muchos casos, estos anticuerpos anticancerígenos están sujetos a una terapia de combinación con fármacos citotóxicos u otros fármacos inhibidores de proliferación de células.
En conexión con la terapia de combinación como se describió anteriormente, ha habido estudios activos en un conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC), en el que el efecto terapéutico de los fármacos de enlace citotóxico aumenta mientras que disminuye la toxicidad. Se reconoce que cuando el conjugado anticuerpo-fármaco modificado se utiliza, la toxicidad sistémica del fármaco se puede reducir y la cito-toxicidad del fármaco se puede lograr específicamente en celulas (particularmente células cancerígenas) que tienen un objetivo sobre expresado en el mismo, mediante el cual se aumenta el efecto terapéutico del fármaco.
En efecto, los conjugados anticuerpo-fármaco modificados que comprende 5 el fármaco citotóxico o conjugado radioisótopo para un anticuerpo, tales como ZEVALIN™ [Witzig et al., J. Clin. Oncol, 2002, 20(15): 3262-3269]) o MYLOTARG™ [Fármacos del Futuro, 2000, 25(7):686]), han sido desarrollados de manera exitosa para el tratamiento de linfoma no Hodgkin o leucemia mieloide aguda. Además, se han hecho muchos intentos para conjugar mertansine ío altamente tóxica (tales como mertansine cantuzumab (Inmunógeno, Inc. [Xie et al, J. of Pharm y Exp Ther 2004, 308 (3):.... 1073-1082] ) o mertansine trastuzumab (Roche [Isakoff et al, J. Clin Oncol 2011, 29 (4...): 351-4])) a un anticuerpo o conjugado otros fármacos citotóxicos, por ejemplo, derivados de dolastatina tales como péptidos auristatina, auristatina E (AE), monometil auristatina (MMAE) o 15 MMAF a los anticuerpos como cBR96 (específicos a Lewis Y en carcinomas), cACIO que es específico para CD30 en tumores hematológicos, o anticuerpo anti- CD20 para el tratamiento de cáncer que expresa CD20, o Rituxan para los trastornos inmunes, anticuerpos anti-EphB2R para el tratamiento de cáncer colorrectal, 2H9, anti-IL-8, o anticuerpo E-selectina ([Klussman, et al, Química 20 Bioconjugada, 2004, 15 (4):. 765-773] ; [Doronina et al, Bioteenología Natural, 2003, 21 (7): 778-784.]; [Francisco et al, Sangre, 2003,102 (4):. 1458-1465]) US 2004/0018194 A1) WO 04 / 032828 A3; [Mao et al, Investigación del Cáncer, 2004, 64 (3):. 781-788]; [Bhaskar et al, Cáncer Res, 2003, 63:6387-6394]).
Además, también se ha hecho un intento para desarrollar conjugados anticuerpo-fármaco modificados, utilizando la daunomicina, doxorrubicina, metotrexato o vindesina. Se sabe que las toxinas bacterianas tales como toxina de la difteria, toxinas vegetales tales como ricina, o moléculas pequeñas tales como geldanamicina ([Mandler et al, J. del Inst. Nat. Cáncer, 2000, 92 (19): 1573-1581] ; [. Mandler et al, Bioorganic y Med Chem Letters, 2000, 10: 1025-1028..]; [Mandler et al, Bioconjugate Chem, 2002, 13:. 786-791]), maitansinoide ([EP 1391213 A1] ; [Liu et al, Proc Nati Acad Sci EE.UU., 1996, 93: 8618 hasta 8623. ]) o caliqueamicina ([Lode et al, Cáncer Res, 1998, 58:2928]; [Hinman et al. , Cáncer Res, 1993, 53:3336-3342]) pueden utilizarse como fármacos en los conjugados anticuerpo-fármaco. Estos fármacos citotóxicos muestran efectos inhibitorios de proliferación citotóxica y celular por mecanismos tales como enlace de tubulina, enlace de ADN o inhibición de topoisomerasa.
Cuando se utiliza un proceso convencional que se utilizó para inducir la unión covalente entre un fármaco y un anticuerpo para preparar el conjugado de anticuerpo-fármaco como se describió anteriormente, el fármaco se une a un número de sitios en el anticuerpo, produciendo una mezcla heterogénea. Por ejemplo, un fármaco citotóxico es probable que esté ligado a un anticuerpo a través de un número de residuos de lisina contenidos en el anticuerpo para producir una mezcla de conjugado anticuerpo-fármaco heterogénea. Además, la mezcla heterogénea podría tener diferente distribución de unión de fármacos que van de 0 a aproximadamente 8 dependiendo de las condiciones de reacción, lo que significa que el número de moleculas de fármaco unido por el anticuerpo unidad varía.
También para el conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene el número definido de unión de fármacos, podría haber otra heterogeneidad potencial, en función de los diversos sitios de conjugación. La purificación homogénea de esta mezcla heterogénea no es adecuada para su uso en la producción masiva de medicamentos ([Hamblett et al., Clin. Cáncer Res., 2003, 10, 7063 hasta 7070], [Wang et al., Protein Sci. 2005, 14 , 2436-2446]).
Otro método para la conjugación de un fármaco a un anticuerpo es la reducción de enlaces disulfuro entre residuos de cisteína en el anticuerpo mediante agentes reductores, y luego la conjugación de fármacos para liberar los grupos tiol de los residuos de cisteína reducidos. Este método también tiene desventajas en que las características inherentes del anticuerpo se pueden perder y una mezcla heterogénea se produce en grandes cantidades. Específicamente, la inmunoglobulina M es un ejemplo de un pentámero unido por disulfuro, mientras que la inmunoglobulina G es un ejemplo de una proteína con puentes de disulfuro internos uniendo las subunidades juntas. En tales proteínas, la reducción de los enlaces disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) o selenol genera reactivos de tioles libres ([Singh et al, Anal Biochem 2002, 304:147-156]). Este enfoque puede resultar en la pérdida de la estructura terciaria de anticuerpos y especificidad de unión al antígeno ([Jagath et al, Nature Biotechnology, 2008, 26 (8): 925-32]).
La desventaja representativa del metodo de conjugación de anticuerpo-fármaco convencional como se describió anteriormente es que es difícil de controlar con precisión los sitios de conjugación en el anticuerpo y el número de fármacos conjugados. En un intento de superar este problema y para introducir un grupo tiol libre, un aminoácido específico fue sustituido con cisteína, donde la cisteína sustituida no deterioró la función de un anticuerpo. Para este propósito, un método de cribado para la óptima mutación de cisteína se desarrolló después de predecir la reactividad del grupo tiol en cada sitio de mutación posible en anticuerpos (la patente coreana abierta a inspección pública N ° 2.007-0054682, ThioFab teenología'). Un conjugado anticuerpo-fármaco de mertansine trastuzumab producido por este método se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer de mama metastático ([Burris III et al, J. Clin Oncol, 2011, 29 (4):398-405]). La tecnología ThioFab anteriormente descrita tiene la ventaja de que los daños para un enlace de disulfuro en un anticuerpo parental puede ser minimizado mediante la introducción de una nueva cisteína en el anticuerpo, pero la preocupación acerca de la modificación de la estructura y la función del anticuerpo parental sigue permaneciendo, debido a que algunos aminoácidos en el anticuerpo parental están mutados por cisteína.
Por consiguiente, existe una necesidad urgente para el desarrollo de un nuevo conjugado anticuerpo-fármaco y un método de producción del mismo, en la que el número y la posición de las moléculas del fármaco conjugado a un anticuerpo parental se puedan controlar con precisión al tiempo que conserva las características estructurales y funcionales del anticuerpo parental.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se ha hecho con la finalidad de resolver los problemas anteriormente descritos que ocurren en el estado de la teenica, y es un objetivo de la presente invención proporcionar un anticuerpo novedoso (en lo sucesivo referido como un “anticuerpo modificado”), que comprende un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína enlazados a un anticuerpo parental para proporcionar una pluralidad de sitios de unión de fármaco. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un conjugado anticuerpo-fármaco modificado que comprende un fármaco unido al anticuerpo modificado.
El anticuerpo modificado de acuerdo a la presente invención puede ser conjugado de manera eficiente con diversos fármacos mientras que se mantienen las características de un anticuerpo parental, y de este modo se puede tener una alta especificidad del objetivo e incrementa el efecto terapéutico de los fármacos conjugados.
El anticuerpo modificado de la presente invención tiene ventajas en que, éste comprende un motivo que contiene uno o mas residuos de cisteína, y de este modo el fármaco puede ser conjugado a los residuos de cisteína y el fármaco conjugado se puede entregar de manera efectiva a un tejido objetivo. Además, el número de residuos de cisteína que se pueden unir al fármaco se pueden controlar de manera adecuada, y de este modo el número o cantidad de moléculas del fármaco en el conjugado del fármaco de anticuerpo modificado pueden ser controlados. Por consiguiente, el conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la presente invención se puede utilizar como un excelente sistema de entrega de anticuerpo-fármaco de Herceptin-MMAE en celulas SK-BR3 que expresan HER2 en comparación con la de Herceptin.
La Fig. 7 muestra los resultados de la observación de la activación de caspasa en diversas concentraciones del tratamiento con la finalidad de examinar el efecto de muerte celular (apoptosis) de HR-Cys2-MMAE en células SK-BR-2 que expresa HER2 en comparación con el de la Herceptin.
La Fig. 8 muestra los resultados de observación de activación caspasa en diversas concentraciones de tratamiento con la finalidad de examinar el efecto apoptosis de MMAE conjugado para una variante de anticuerpo de herceptin en células SK-BR3 que expresa HER2 en comparación con el de Herceptin.
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN En lo sucesivo, la presente invención será descrita en más detalle.
La presente invención proporciona un anticuerpo novedoso modificado, el cual comprende un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína unido a un anticuerpo parental para proporcionar una pluralidad de sitios de fármaco de anticuerpo, y un conjugado anticuerpo-fármaco modificado que comprende el anticuerpo modificado. Tal anticuerpo modificado puede conjugarse a diversos fármacos mientras que se conservan las características del anticuerpo parental, y de este modo se puede utilizar de manera eficiente como un conjugado anticuerpo-fármaco modificado.
Como se utiliza en la presente, el termino “anticuerpo parental” significa un motivo que contiene cisteína que no tiene un “anticuerpo” convencional. Cualquier anticuerpo parental que tiene una afinidad y especificidad de unión para un fármaco que supera el problema de los conjugados de anticuerpo-fármaco convencionales y se pueden utilizar de manera eficiente para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer. 5 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es un mapa vectorial de un vector de expresión de anticuerpo modificado que comprende trastuzmab que contiene cisteína.
La Fig. 2 muestra la imagen western blot de FIR-Cys después de la purificación ío de trastuzumab (dos vías a la derecha) y una variante de trastuzumab que contiene cisteína (HR-Cis, dos vías a la izquierda).
La Fig. 3 muestra los resultados de espectrometría UV-VIS (Fig. 3A) y SDS- PAGE (FIG. 3B) realizado para confirmar si la doxorrubicina se conjugo a HR-Cys.
La Fig.4 muestra los resultados de electroforesis en gel SDS-PAGE (Fig.4A) y 15 el análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de Alexa488 colorante unido a cada uno de las cadenas ligeras y pesadas (FIG. 4B) para un Her-M2(Cys)- Alexa488 que es conjugado de un anticuerpo variante de Fler-M2(Cys) y Alexa Fluor® 488.
La Fig. 5 muestra los resultados de un ensayo MTS de anti-proliferación 20 realizado para examinar el efecto inhibitorio de crecimiento de células de HR-Cys- DOX en células BT-474 que expresa HER2 en comparación con los de Herceptin, una mezcla 1:2 de Herceptin y doxorubicina y doxorubicina.
La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo de anti-proliferación realizado para examinar el efecto inhibitorio de crecimiento celular de HER-M (Cys)-MME - 9 - antígeno específico puede ser utilizado en la presente invención sin limitación. Los ejemplos de los anticuerpos parentales que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen anticuerpos monoclonal y policlonal, tales como anticuerpos derivados de animales tales como ratones, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, y anticuerpos humanos desarrollados utilizando ratones transgénicos o teenología de presentación de fagos. Además, será obvio para los expertos en la materia que los anticuerpos modificados tales como anticuerpos biespecíficos, o fragmentos de anticuerpos, también pueden ser utilizados en la presente invención.
Como se utiliza en la presente, el término “fragmento de anticuerpo” se refiere a un fragmento que al menos conserva una afinidad de unión a un antígeno. Los ejemplos del fragmento del anticuerpo incluye anticuerpos de cadena simple, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos Fab, F (ab ') 2 fragmentos, Fd, scFv, anticuerpos de dominio, minicuerpos, anticuerpos de una sola cadena (scAb), derivados de regiones de anticuerpos constantes, y anticuerpos artificiales basados en armazones proteicos.
Además, ejemplos de los anticuerpos parentales que se pueden utilizar en la presente invención incluye todos los tipos de moléculas de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) y subtipos de los mismos (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgAl and lgA2). Además, el anticuerpo parental puede ser uno derivado de cualquier especie.
El anticuerpo parental en la presente invención tiene afinidad de unión y especificidad a antígenos específicos de cáncer tales como antígenos asociados a tumores (TAAs), proteínas receptoras de la superficie celular, proteínas de la superficie celular y moleculas distintas a las receptoras, proteínas transmembrana, proteínas de señalización, reguladores de sobrevivencia celular, reguladores de proliferación celular, moléculas asociadas con (por ejemplo, sabe o se sospecha que contribuyen funcionalmente a) desarrollo de tejido o diferenciación linfoquinas, citoquinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, las moléculas que participan en la vasculogénesis y moléculas asociadas con (por ejemplo, se sabe o se sospecha que contribuyen funcionalmente a) la angiogénesis.
Específicamente, los antígenos a los que el anticuerpo parental en la presente invención puede unir, pero no se limita a: (1) BMPRIB (proteína morfogenética ósea del receptor tipo IB; de Acceso GenBank NM_001203); (2) E16 (LAT 1 , SLC7A5; No. de Acceso Genbank NM_003486); (3) STEAP1 (seis transmembrana antígeno epitelial de próstata; No. de Acceso Gen Bank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16, No. de Acceso GenBank AF361486); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, el factor potenciador de megacariocitos, mesotelina; No. de Acceso GenBank NM_005823); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia vehículo de soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, fosfato transportador de sodio- dependiente 3b tipo II ; No. de Acceso GenBank NM_006424); (7) 5b Sema (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y tipo 1 -similar), dominio transmembrana (TM) y el dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B; No. de Acceso GenBank AB040878); (8) LCSP hlg (2700050C12Rik, C530008016R¡k, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12; No. de Acceso GenBank AY358628); (9) ETBR (receptor de endotelina tipo B; No. de Acceso GenBank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, FLJ20315 proteína hipotetica, No. de Acceso GenBank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado a cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis transmembrana, No. de Acceso GenBank AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cationes potencial del receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4; No. de Acceso GenBank NMJ317636); (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma; No. de Acceso GenBank NP_003203 o NM_003212); (14) CD21 (CR2 (Complemento receptor 2) o C3DR (receptor del virus C3d / Epstein Barr) o Hs.73792; No. de Acceso GenBank M26004); (15) CD79b (CD79B, CD79p, IGB (beta inmunoglobulina asociada), B29, No. de Acceso GenBank NM_000626); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a ancla de fosfatasa que contiene dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C; No. de Acceso GenBank NM_030764); (17) HER2 (No. de Acceso GenBank M11730); (18) NCA (No. de Acceso GenBank M18728); (19) MDP (No. de Acceso GenBank BC017023); (20) IL20Ra (No. de Acceso GenBank AF184971 ); (21) Brevican (No. de Acceso GenBank AF229053); (22) EphB2R (No. de Acceso GenBank NM_004442); (23) ASLG659 (No. de Acceso GenBank AX092328); (24) PSCA (No. de Acceso GenBank AJ297436); (25) GEDA (No. de Acceso GenBank AY260763); (26) BAFF-R (Receptor del factor que activa células B, receptor BLyS, BR3, NP_443177.1); (27) CD22 (receptor de células B CD22-B isoforma; NP-001762, 1 ); (28) CD79a (CD79A, CD79.alfa., Inmunoglobulina asociado alfa, una proteína específica de la célula B que interactúa de forma covalente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo en la superficie con moléculas IgM, transduce una señal implicada en B- diferenciación celular; No. de Acceso GenBank NP_001774.1); (29) CXCR5 (receptor 1 de linfoma de Burkitt, un receptor acoplado a la proteína T que se activa por las quimioquinas de CXCL 13, las funciones en la migración de linfocitos y la defensa humoral, juega un papel en la infección de VIH-2 y considerado para el desarrollo del SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia; No. de Acceso Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidad beta de molecula MHC de clase II (antígeno la) que se une a péptidos y los presenta a los linfocitos CD4 + T, No. de Acceso a Genbank NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de iones 5 receptor ligando-cerrado purinérgico P2X, un canal iónico cerrado por el ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sinóptica y la neurogénesis, la deficiencia puede contribuir a la fisiopatología de la inestabilidad del detrusor idiopática; No. de Acceso a Genbank NP_002552.2); (32) CD72 (antígeno de diferenciación de células B CD72, Lyb-2; No. de Acceso a Genbank NP_001773.1); (33) LY64 (antígeno linfocítico 64 (RP105), proteína de membrana tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR), regula la activación y apoptosis de células B, la pérdida de función se asocia con mayor actividad de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso sistémico; No. de acceso GENBANK . NP_005573.1); (34) FcRH1 (Proteína 1 similar al receptor Fe, un receptor putativo para el dominio Fe de inmunoglobulina que contiene dominios de tipo C2 similares a Ig e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B; No. de Acceso a Genbank NP_443170.1); (35) IRTA2 (translocación receptora de la superfamilia de Inmunoglobulina asociada 2, un immunoreceptor putativo con posibles funciones en el desarrollo de células B y linfomagénesis; Se produce la desregulación del gen por la translocación en algunos tumores malignos de celulas B; No. de Acceso a Genbank NP_1 12571.1); y (36) TENB2 (proteoglicano transmembrana putativo, relacionado con la familia EGF / heregulina de factores de crecimiento y folistatina; No. de Acceso a Genbank AF179274). Además, los ejemplos de antígenos incluyen todos los antígenos que pueden utilizarse para el tratamiento y el diagnóstico.
En una forma de realización preferente, el anticuerpo parental en la presente invención tiene una afinidad de unión y especificidad para un receptor ErbB seleccionado de entre EGFR, HER2, HER3 y HER4, u otros antígenos cancerígenos.
Particularmente, el anticuerpo parental que se utiliza en la presente invención comprende uno o mas seleccionados de alrededor de trastuzumab (nombre comercial: Herceptin), rituximab (nombre comercial: Rituxan), bevacizumab (nombre comercial: Avastin), cetuximab (nombre comercial: Erbitux), cBR96, cACIO, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-EphB2, anti-IL-8, anticuerpo E-selectina, anticuerpo anti-MUC16, y el anticuerpo anti-CD30, pero no se limita a ello.
HER2 significa un miembro de la familia del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), una cascada de señalización importante que está implicada en la proliferación y sobrevivencia de las células del cáncer de mama. Se sabe que los receptores de tirosina quinasas de la familia EGFR se componen de erb1, erb2/HERB2, erb3 y erb4 y están involucrados en la regulación de la adhesión, migración y diferenciación de células además de la proliferación y proliferación celular.
No hay ligando que se une a erB2 / HER2 de los cuatro miembros de la familia erb, pero erb2 / HER2 se conoce como el oncogén más potente en el cáncer de mama. Si el nivel de HER2 es normal, está involucrado en el crecimiento y desarrollo de tejido mamario normal, pero si HER2 es anormalmente sobreexpresado o amplificado, se romperá la regulación normal de las células de modo que se formen células cancerosas agresivas en el tejido mamario. En otras palabras, si HER2 se activa por oligomerización con otros miembros de la familia EGFR, se fosforilarán muchas moléculas corriente abajo, lo que conduce a la activación de una variedad de cascadas de señalización. La vía de SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK que está implicado en la proliferación celular y de la vía PI-3K / Akt que inhibe la muerte celular son mecanismos representativos asociados con la proliferación de células de cáncer.
Los resultados de los ensayos preclínicos y clínicos indican que la sobreexpresión de HER2 es un importante biomarcador que aparece desde el estado inicial del desarrollo del cáncer y desempeña un papel importante en el crecimiento y la progresión del cáncer. Se sabe que la sobreexpresión de HER2 aparece en aproximadamente el 20-30% de los cánceres de mama invasivos y también se asocia con un mal pronóstico del cáncer de mama con una mayor agresividad y malignidad.
Los resultados de los ensayos preclínicos y clínicos indican que la sobreexpresión de HER2 es un importante bio-marcador que aparece desde el estado inicial del desarrollo del cáncer y desempeña un papel importante en el crecimiento y la progresión del cáncer. Se sabe que la sobre-expresión de HER2 aparece en aproximadamente el 20-30% de los cánceres de mama invasivos y tambien se asocia con un mal pronóstico del cáncer de mama con una mayor agresividad y malignidad.
Según la presente invención, un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína se une a un anticuerpo parental que tiene especificidad para un receptor del factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste de los receptores de HER2 o receptores de EGF. Y un fármaco contra el cáncer convencional se conjuga con el motivo para obtener un conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la presente invención. Cuando el conjugado anticuerpo-fármaco modificado se administra a un paciente en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de células tumorales en el paciente, puede exhibir un excelente efecto de tratamiento del cáncer mediante la inhibición del crecimiento de células tumorales que sobreexpresan el receptor del factor de crecimiento mientras que induce la muerte celular.
Además, el anticuerpo parental en la presente invención es preferentemente trastuzumab. Aunque el trastuzumab que se prepara de manera que sea sustancialmente libre de la lisina de terminal-C (Lys), el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención podría ser aplicada a trastuzumab que contiene lisina (Lys) o trastuzumab que no contiene lisina (Lys) en la región terminal-C de la región del mismo, en donde la el motivo que contiene cisterna (Cys) puede estar unido al mismo.
Los aminoácidos en la presente invención son expresadas por sus conocidos 5 abreviaturas conocidas de 3 letras o 1 letras. Los nucleótidos presentes en varios fragmentos de ácido nucleico son designados por la designación de una sola letra estándar utilizada rutinariamente en la téenica.
El motivo que contiene cisteína en la presente invención tiene residuos de ío aminoácidos 1-100, preferiblemente 1-50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 1-30 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente 1-10 residuos de aminoácidos, y contiene uno o más residuos de cisteína. En particular, el motivo que contiene cisteína en la presente invención contiene preferiblemente 1-20 residuos de cisteína, más preferiblemente 1-10 residuos de cisteína, e incluso 15 más preferiblemente 1-5 residuos de cisteína.
El motivo que contiene cisteína en la presente invención puede ser un motivo peptídico sencillo que no tiene funcionalidad específica o estructura secundaria o terciaria y es preferiblemente un motivo que tiene una funcionalidad específica o una estructura secundaria o terciaria. La funcionalidad específica es 2 o preferiblemente la propiedad de ser capaz de mantener/protección de la capacidad de conjugación química de residuos de cisteína, pero no se limita a ello. En particular, el motivo que contiene cisteína puede mantener más eficazmente la funcionalidad de residuos de cisteína mediante la prevención o retardo de la oxidación de los residuos de cisteína debido a la unión a un ligando específico o la estructura secundaria o terciaria del motivo peptídico en sí mismo.
El motivo que contiene cisteína en la presente invención tiene una estructura s representada por la siguiente fórmula 1 : Xa-[(MCys)n-Xbn]n Formula (1) wherein (Mcys)n representa un residuo de cisteína simple o un motivo peptídico que contiene un residuo de cisteína y tiene una funcionalidad específica ío o una estructura secundaria o terciaria; Xa y Xbn cada uno representa independientemente un péptido que comprende de 0 a 20 residuos de aminoácido distinto de cisteína; y n es un número entero que varía de 1 a 20.
En la formula (1), (MCys)n, esto es, (MCys)i, (MCys)2 . (MCys)n, puede ser el mismo o diferente el uno del otro. También Xbn, esto es, Xbi, Xb2 .... Xbn puede 15 ser el mismo o diferente el uno del otro.
Además, si (Mcys)nen formula (1) es un simple residuo de cisteína, el motivo que contiene cisteína de acuerdo con la presente invención tiene una estructura representada por la siguiente fórmula (2): Formula (2) 20 Xa-(Cys-Xbn)n Caracterizada por que Xa, Xbn y n son los mismo como se define en la formula.
También, si (MCys)n en formula (1) es un motivo peptídico que contiene un residuo de cisteína y tiene una funcionalidad específica o una estructura secundaria o terciaria, (Mcys)n puede ser preferiblemente un motivo de unión a iones de metal que contiene un residuo de cisteína. Se sabe que el motivo de unión de iones de metal que contiene un residuo de cisteína puede unirse a un ión metálico para inhibir la oxidación del residuo de cisteína, de ese modo retiene eficazmente la reactividad de alquilación del residuo de cisteína (Van Horn et al. (2003) J. Biol. .. Inorg Chem 8: 601-610).
Ejemplos de un motivo de unión de iones metálicos que contienen un residuo de cisteína, que puede utilizarse en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, quelantes de iones metálicos (Zhang et al. (2012) Biochem. Genet. 50 (7-8) : 585-599) que se utilizan para controlar la concentración de iones de metal in vivo, chaperones (Ansbacher y Shurki, J. Phys Chem B (2012) 116 (15): 4425-4432; Alien et al (2012). Bioquímica 51 (7): 1439-1448; Click et al (2012) H. Comput. Chem 33 (11): 1142-1151) que funciona para entregar iones metálicos a una posición específica fuera o dentro de las celulas, los reguladores transcripcionales (Gunther et al (2012) Biochim Biophys Acta 1823 (2): 476-483; Sitthisak et al (2012) FEMS Microbiol. Lett. 327 (2): 126-133) que regulan la transcripción dependiendo de la concentración de iones metálicos, motivo dedo de zinc (MacPherson et al (2006) Microbiol. Mol. Bio. Rev. 70 (3): 583-604; Schaeffer et al. (2012) Ácidos Nucleicos Res. 40 (18): 9298 -9307) que están ampliamente presentes en muchas proteínas y están involucradas en las interacciones proteína-proteína o proteína-DNA, y motivos (Zielazinski et al (2012.) Bioquímica 51(40): 7891-7900; . Zhou et al (2012) FEBS J. 279 (2):285-298; Cochran et al (2011) Nat Struct. Mol. Biol. 19 (1): 122-127) derivada de varias enzimas. Los motivos de unión de ión metálico contienen un residuo de cisteína como un grupo de unión esencial de la misma, y dichos motivos de unión de iones de metal puede ser utilizado en la producción del conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la presente invención.
Ejemplos preferentes del motivo de unión metálico en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, grupo C2FI2 (clase Cys2His2: Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3.5-HÍS), grupo C4 (clase C4: Cys-X2-Cys-Xn-Cys-X2-Cys-Xm-Cys-X2-Cys-Xn-Cys-X2-Cys) o grupo CQ (clase C6: Cys-X2-Cys-X6-Cys-X5-i2-Cys-X2-Cys-X6-8-Cys) de proteína de dedo de zinc, un motivo de Cys-Xm-Cys tales como Cys-X-X-Cys o Cys-X-Cys, un motivo Met-X-Cys-X-X-Cys ó un motivo C-Q-C-Q-C-A-C, que se encuentra frecuentemente en las proteínas regulatorias de transcripción, proteínas chaperonas de metal, transportadores de iones de metal, superóxido dismutasa o similares, un motivo Ser-Pro-Cys de proteína de membrana ATPasa, etc. En el metal motivo peptídico de unión descrito anteriormente, X representa los residuos de aminoácidos distintos de Cys; m es un número entero que varía de 1 a 10, y preferiblemente de 1 a 5; y Xm o Xm-q representa residuos de aminoácidos distintos de Cys, el número de los cuales es indicado por m ó m a q.
Más específicamente, los ejemplos del motivo de unión de iones metálicos de la proteína de dedo de zinc, que se puede utilizar en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, YKCKQCGKAFGCPSNLRRHGRTH (SEQ ID NO:1), YQCNICGGKCFSCNSNLHRHQRTH (SEQ ID NO:2), YSCGICGKSFSDSSAKRRHCILH (SEQ ID N0:3), YTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTH (SEQ ID N0:4), YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIH (SEQ ID N0:5), YKCKECGKAFNHSSNFNKHHRIH (SEQ ID N0:6), FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTH (SEQ ID N0:7), YRCKYCCDRSFSISSNLQRHVRNIH (SEQ ID N0:8), YECDHCGKAFSIGSNLNVHRRIH (SEQ ID N0:9), YGCHLCCKAFSKSSNLRRHEMIH (SEQ ID NO:10), YKCKECGQAFRQRAHLIRHHKLH (SEQ ID N0:11). YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH (SEQ ID N0:12), FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLH (SEQ ID N0:13), YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIH (SEQ ID N0:14), YACHLCGKAFTQSSHRRHEKTH (SEQ ID N0:15), YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIH (SEQ ID N0:16), YACHLCGKAFTQCSHLRRHEKTH(SEQ ID N0:17), YACHLCAKAFIQCSHLRRHEKTH(SEQ ID N0:18), YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH(SEQ ID N0:19), YKCEECEGKAFRQSSHLTTHKIIH(SEQ ID NO:20), YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH(SEQ ID N0:21), YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTH(SEQ ID NO:22), YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIH(SEQ ID NO:23), FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:24), YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:25), YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSH(SEQ ID NO:26), YECVQCGKSYSQSSNLFRHQRRH(SEQ ID NO:27), YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVH(SEQ ID NO:28), YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTH(SEQ ID NO:29), YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIH(SEQ ID NO:30), YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIH(SEQ ID N0:31), YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTH(SEQ ID NO:32), YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH(SEQ ID NO:33), YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTH(SEQ ID NO:34), YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSH(SEQ ID NO:35), YKCEECGKAFNQSSTLTRHKIVH(SEQ ID NO:36), YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIH(SEQ ID NO:37), YEVHDCGKSFRQSTHTLTQHRRIH(SEQ ID NO:38), YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH(SEQ ID NO:39), HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTH(SEQ ID NO:40), YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH(SEQ ID N0:41), YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO:42), YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKH(SEQ ID NO:43), FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTH(SEQ ID NO:44), FACSWQDCNKKFARSDELARHYRTH(SEQ ID NO:45), YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO:46), FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSH(SEQ ID NO:47), CRCNECGKSFSRRDHLVRHQRTH(SEQ ID NO:48), FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH(SEQ ID NO:49), FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKH(SEQ ID NO:50), YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRH(SEQ ID NO:51), YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH(SEQ ID NO:52), YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:53), YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(SEQ ID NO:54), FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(SEQ ID NO:55), YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(SEQ ID NO:56), YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(SEQ ID NO:57), YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(SEQ ID NO:58), YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(SEQ ID NO:59), FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID NO:60), CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(SEQ ID NO:61), CDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID NO:62), etc. El motivo de unión de iones metálicos de la proteína de dedo de Zinc puede ser cualquiera de los motivos seleccionados del motivo de unión de ión metálico de proteínas con dedos de zinc descritos en http:bwww.zincfinaers.ora. http://www.aenenames.ora/aenefamilies/ZF. http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesiqn/zfdesiqnhome.php. https://zifdb.msi.umn.edu:8444/ZiFDB/. o Macpherson et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70(3), 583-604, que es consistente con las características teenicas de la presente invención.
Ejemplos del motivo de unión de ión metálico de proteínas reguladoras de transcripción, proteínas chaperonas de metal o similares, que se puede utilizar en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: Proteína CadC: CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYALCQDEELCVC (SEQ ID NO:63), Proteína AztR: DTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSELCVC (SEQ ID NO:64), Proteína ZiaR: CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSALARQELCV C (SEQ ID NO:65), Proteína BxmR: CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRWSVLAKQELCV C (SEQ ID NO:66), Proteína ArsR: LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCM(NO. DE ID DE SEQ:67), CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPVRLRILSQLAAGGC(NO. DE ID DE SEQ:68), YRAAMPWRALVAYLTENCCHGTRDC (SEQ ID NO:69), Proteína CmtR: CLRGCGLWATYEGRQVRYALADSHLARALGELVQWLAVDTDQPC (SEQ ID NO:70) LRDCGLWTVPDGRRSRYELADERLGHALDDLRAAWAVDADRTCPDADELECCf (SEQ ID NO:71), etc.
Zinc (Zn) proteínas que se encuentran en las proteínas de membrana que están involucradas en que la transducción de la señalización bacteriana tenga un motivo de unión de ión metálico inherente compuesto por un residuo de cisteína y tres residuos de histidina (Draper et al., J. Bacteriol. 2011, 193 (17), 4338 a 4345). Aquí, el motivo de unión de ión metálico tiene una estructura de HXXWFYLX21-28CXLFMVIGXWFLVIXI8-27HXXH, en el que X representa cualquier aminoácido, y Xm-q representa residuos de aminoácidos distintos de Cys, el número de los cuales es indicado por m a q. Además, 150 o más proteínas de zinc reportados hasta la fecha de unión puede ser utilizado como el motivo de unión de iones metálicos en la presente invención.
Transportadores de iones de metal conocidos incluyen facilitadores de difusión de catión, Zrt, proteínas similares a Irk, intercambiadores de cationes, transportistas de cobre, ATPasa de tipo P de metal pesado, transportadores de casete de unión ATP, etc. (Hanikenne et al. Fisiología Vegetal 2005, 137, 428-446; Hall y Williams, J. experimental Botánica, 2003, 54 (393) 2601-2613), y el siguiente motivo M-X-C-X-X-C se pueden utilizar preferiblemente en la presente invención, pero no se limita a ellos: E.coli ZntA : VSGMDCAACARKVENAVRQLAGVNQVQVLFA (SEQ ID NO:72) Tn501 MerP : VPGMTCSACPITVKKAISEVEGVSKVDVTFE (SEQ ID NO:73) Tn501 MerA : ITGMTCDSCAAHVKEALEKVPGVQSALVSY (SEQ ID NO:74) S.aureus CadA ; VQGFTCANCAGKFEKNVKKIPGVQDAKVNFG (SEQ ID NO:75) Menkes Humanos: VEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGEHHIKVSLE (SEQ ID NO:76) Yeast Atx1 : WMTCSGCSGAVNKVLTKLEPDVSKIDIS(SEQ ID NO:77) Rat Wilsons : GMTCASCVANIERNLRREEGIYSV(SEQ ID NO:78) Hum Wilsons : YEGMTCQSCVSSIEGKYRKLQGWRYKVSL(SEQ ID NO:79) Rice Cu ATPasa : GMSCQGCAGAVRRVLTKMEGVETFDIDME(SEQ ID NO:80) H.pylori Cu ATPasa : VPSITCSHCVDKIEKFVGEIEGVSFIDANVE(NO. DE ID DE SEQ:81) Ran1: VTGMTCAACSNSVEAALMNVNGVDVGGMTCGGCSASVKKLLESQPCVASASV (SEQ ID NO:82) Cpx89 : VSGMVCAACSTAVENALLSCSGV(SEQ ID NO:83) Paa1 : DVGGMTCGGCSASVKKILESQP(SEQ ID NO:84) Cpx1184 : DVGGMKCGGCVEHVKKILEEQFGVTSAS(SEQ ID NO:85) Además, diversos motivos de unión de iones metálicos diseñados artificialmente basados en motivos de unión de ión metálico de tipo salvaje encontrados in vivo pueden ser utilizados en el conjugado anticuerpo-fármaco modificado de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de estos motivos de unión metálico incluyen, pero no se limitan a, un motivo CGH (Van Horn et al (2003) J. Biol. Quim. Inorg. 8: 601-610) diseñado en base a un motivo GGH de la proteína de dedo de zinc que no contiene residuos de cisteína y motivos de unión de iones metálicos (Jancso et al (2011) Metalonómico 3 (12): 1331-1339) obtenido mediante la sustitución de uno o más residuos de cisteína en un motivo peptídico con otro residuo aminoácido, tal como treonina, serina o histidina. El motivo CGH tiene una estructura representada por la siguiente fórmula química 1, y preferiblemente tiene una estructura de ACGHA que tienen alaninas tanto en el C-y la N-terminal.
Formula Química 1 [caracterizado por que M representa un ión metálico, y R representa un residuo de aminoácido distinto de cisteína, preferiblemente alanina.] El motivo CGH en la presente invención todavía tiene la propiedad de unión de iones metálicos, incluso cuando se invierten las posiciones de la N-terminal y el C-terminal. Por lo tanto, será obvio para los expertos en este campo de la téenica que un motivo de HGC que tiene las posiciones invertidas de la N-terminal y el C-terminal cae dentro del alcance del motivo CGH en la presente invención.
Los motivos de unión de ión metálico artificialmente diseñados en base a motivos de dedo de zinc, que se pueden usar en la presente invención, incluyen los siguientes motivos peptídicos de unión metálico (véase Roehm y Berg, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120. 13083-13087) obtenido mediante la sustitución de un residuo de cisteína (que desempeña el papel más esencial) en PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTH con metil-cisteína (Me-Cys) o la sustitución de un residuo de histidina en esta secuencia con cisteína: PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTC(SEQ ID NO:86), PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTM(SEQ ID NO:87), B PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHT(Me-C) (SEQ ID NO:88), PYK(Me-C)PECGKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO:89), PYKCPE(Me-C)GKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO:90), y PYKCPE(Me-C)GKSFSQKSALVKHQR(SEQ ID N0:91) [En el motivo de peptido de unión metálico descrita anteriormente, Me-C 0 representa un residuo de cisteína metilada.] Además, los péptidos diseñados artificialmente basados en muchos motivos de proteína de unión de iones metálicos reportados hasta la fecha también se pueden usar en la presente invención.
Los motivos de unión de iones metálicos en base a la estructura secundaria 5 o terciaria de la proteína incluyen laminas beta, motivos mezclados alfa/beta, y estructuras alfa-hélice que se encuentran con más frecuencia. Las estructuras alfa- hélice incluyen péptidos que tienen una sola cadena, doble cadena, triple cadena o estructuras alfa-hélice de cuatro cadenas. 0 Con respecto a estas hélices multi-cadena alfa, la familia TRI, por ejemplo, tiene una estructura de G (LKALEEK) 4G que tiene cuatro repeticiones de la secuencia del péptido LKALEEK. Han sido reportados motivos peptídicos de unión de iones de metal artificialmente diseñados obtenidos mediante la sustitución de un aminoácido específico en esta familia TRI con cisteína que han sido reportados (Peakcock et al. 2009 Dalton. Trans 7 (13). 2271-2280), y motivos peptídicos diseñados artificialmente que tienen las siguientes estructuras se pueden utilizar en la presente invención, pero no se limita a los mismos: GLKALEEKCKALEEKLKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:92) GLKALEEKLKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:93) GLKALEEKCKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:94) GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:95) GLKALEEKLKALEEKLKALEEKCKALEEKG(SEQ ID NO:96) GLKALEEKLKALEEKLKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID NO:97) GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID NO:98) ELYALEKELGALEKELACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO:99) KLYALKEKLGALKEKLACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO:100) ELYALEKELGALEKELACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO:101) KLYALKEKLGALKEKLACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO:102) Además, muchos motivos peptídicos de unión de iones metálicos (Nivorozhkin et al. 2000 Inorg. Chem. 39 (11) 2306-2313) que tienen una estructura circular, como Ciclo [K 1,12] (QCGVCGKCIACK), tambien se pueden utilizar en la presente invención.
Los motivos de unión de ión metálico que contienen cisteína se pueden utilizar en el anticuerpo modificado de la presente invención que contiene cisteína se resumen en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1: Estructuras de motivo de unión de ión metálico que contiene cisteína pueden ser usadas en la presente invención Tales motivos que contienen cisteína pueden estar unidos a la N-terminal o C-terminal de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo parental sin limitación, tanto tiempo como un fármaco diana se puede conjugar al mismo tiempo que se mantiene la especificidad del anticuerpo parental. El motivo está unido preferiblemente a la C-terminal de la cadena pesada o ligera. En particular, se une a la C-terminal de la cadena pesada, es decir, la terminal de la región constante del anticuerpo parental. Si se utiliza un fragmento de anticuerpo, el motivo está unido preferiblemente a la C-terminal de la cadena pesada del fragmento.
Sin embargo, como siempre que se mantenga la especificidad del anticuerpo parental, el motivo que contiene cisteína en la presente invención, específicamente motivo de cisteína que tiene una funcionalidad de unión de iones metálicos o de cierta funcionalidad específica o una estructura secundaria o terciaria, podría estar vinculado a cualquier posición distinta de la cadena pesada y ligera del anticuerpo parental y puede ser introducido en el anticuerpo parental por un enlazador péptido de cadena larga. Es bien sabido que, cuando un conjugado anticuerpo-fármaco se produce mediante la conjugación de los fármacos a cisteína o lisina residuos mutados específicamente en el sitio, ya sea en cadenas pesadas o ligeras (excepto región CDR) de anticuerpo a través de un enlazador de hidrocarburo de cadena larga, todavía puede conservar las características estructurales y la especificidad del anticuerpo original. Por lo tanto, un motivo de péptido de unión de iones metálicos que contiene cisteína ligada a esta posición del anticuerpo parental por un enlazador de péptido de cadena larga puede proporcionar un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene una alta homogeneidad mientras que conserva la especificidad del anticuerpo parental.
En el anticuerpo modificado de acuerdo a la presente invención, el motivo que contiene cisteína se puede fusionar directamente con el anticuerpo parental mediante un enlace amida. Alternativamente, el grupo funcional terminal del motivo que contiene cisteína puede estar unido químicamente al grupo funcional terminal del anticuerpo parental. Alternativamente, el motivo también se puede enlazar al anticuerpo parental de una manera mediada por el vinculante mediante el uso de un primer vinculante.
Un medicamento puede conjugarse directamente al residuo de cisteína y el grupo tiol (-SH) de la cisteína en el motivo que contiene cisteína unido al anticuerpo parental, y también puede estar relacionado con el residuo de cisteína a través de un segundo vinculante.
La unión del segundo vinculante que une un fármaco al resto de cisteína en el motivo que contiene cisteína se puede realizar mediante el uso de alquilación, de intercambio de disulfuro o trans-tioesterificación. El segundo vinculante puede ser uno o más seleccionados de entre los derivados de haluro de alquilo que contienen un grupo funcional haloacetilo, derivados que contienen un grupo maleimida, derivados de aziridina, derivados de acriloílo, y derivados de haluro de arilo que contienen fluorobenzen o similar, pero no se limita a ellos. Los derivados pueden estar unidos al grupo tiol del resto de cisteína en el motivo por un grupo reactivo de alquilación, un grupo reactivo de arilación, un grupo maleimida, un grupo aziridina, un grupo acriloilo o un grupo reactivo de intercambio de disulfuro que contiene disulfuro de piridilo y ácido tionitrobenzoico (teenicas de Bioconjugado, segunda edición, pp 182 ~ 192, Gerg T.Hermanson, Elsvier).
Por ejemplo, un grupo maleimida que se utiliza generalmente para ligarse tiol y un enlazador se utiliza para conjugar un fármaco para cisteína, debido a la reactividad nucleófila del grupo tiol de un residuo de cisteína para el grupo maleimida es aproximadamente 1000 veces mayor que la de la grupo amino o grupo amino N-terminal de otro residuo de aminoácido, tales como residuos de lisina. Así, en el caso de un conjugado anticuerpo-fármaco modificado que comprende maleimida o yodoacetamida como el segundo vinculante, la cisteína está unida al fármaco por un enlace tioéter. Generalmente, el segundo vinculante tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que reacciona con la cisteína nucleófila presente en el anticuerpo.
Un fármaco que se une al anticuerpo modificado de la presente invención puede ser cualquier fármaco que tiene efectos terapéuticos en la enfermedad. Particularmente, es preferiblemente un fármaco terapéutico del cáncer que tiene el efecto de inhibir la proliferación de células tumorales.
Específicamente, un fármaco que puede usarse en el conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la presente invención comprende cualquier compuesto, resto o grupo que tiene el efecto de citotoxicidad o la inhibición de la proliferación celular, y los ejemplos del mismo incluyen: (i) agentes quimioterapeuticos capaces de funcionar como inhibidores de microtubulina, inhibidores de la mitosis, inhibidores de la topoisomerasa, o intercaladores de ADN (ii) toxinas proteicas capaces de funcionar como enzimas; (iii) micro-ARN (miARN), siARN, o shARN: que puede inhibir la expresión de un oncogén específica; y (iv) radioisótopos Ejemplos de tales fármacos incluyen, pero no se limitan a, maitansinoide, auristatina, dolastatina, tricotecenos, CC1065 (compuesto citotóxico), caliqueamicina y otros antibióticos de enediyne, taxano, antracielina, metotrexato, adriamicina, vindesina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina, daunomicina, y estereoisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos, otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal y diversos agentes antitumorales o anticancerosos tales como el cisplatino, CPT-11, doxorubicina, paclitaxel y docetaxel.
Además, un grupo nucleófilo sobre el resto de fármaco en la presente invención incluye uno o más seleccionados de amina, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y grupos arilo hidrazida, que puede reaccionar con el segundo resto del vinculante y un grupo electrófilo en el segundo reactivo vinculante para formar un enlace covalente, pero no se limita a ello.
Como se ha descrito anteriormente, el número de moleculas de fármaco que pueden conjugarse al anticuerpo por el segundo resto del vinculante puede aumentar a medida que el número de residuos de cisteína en el motivo unido al anticuerpo parental aumenta.
Como se describió anteriormente, el anticuerpo modificado de acuerdo con la presente invención puede comprender un número de residuos de cisteína, porque el motivo que contiene uno o más residuos de cisteína se une al anticuerpo parental, preferiblemente el C-terminal del anticuerpo parental. Por lo tanto, una gran cantidad de un fármaco puede conjugarse con el anticuerpo modificado de la presente invención, y una gran cantidad del fármaco conjugado puede ser entregado efectivamente a una célula o tejido diana.
También, debido a que el número de residuos de cisteína que están enlazados al anticuerpo parental se controla fácilmente, la cantidad de un fármaco que está contenido en el conjugado del fármaco de anticuerpo modificado (mADC) puede ser fácilmente controlado a un nivel deseado. Este rasgo característico supera las deficiencias de los conjugados anticuerpo-fármaco convencionales modificados, y el conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado como un excelente sistema de suministro de fármaco y puede ser utilizado de manera eficiente para el tratamiento de enfermedades como el cáncer.
La presente invención tambien proporciona un método para producir un anticuerpo modificado, que comprende un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína unidos a un anticuerpo parental.
El anticuerpo parental puede ser producido mediante la construcción de un vector de expresión adecuado que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o un dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo parental, la transformación de una célula procariota o eucariota con el vector de expresión construido para expresar una proteína de anticuerpo, aislando la proteína anticuerpo y, a continuación, la purificación de la proteína anticuerpo aislado a una pureza farmacéuticamente aceptable.
Un vector de expresión adecuado en la presente invención puede incluir elementos de expresión reguladoras, tales como un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, una señal de poliadenilación, y un potenciador, así como secuencias de señal para dirigir la secreción de membrana o. Ejemplos de promotores que están generalmente disponibles en las células procariotas incluyen lac, tac, promotores T3 y T7. Ejemplos de promotores disponibles en células eucariotas incluyen el virus de simio 40 (SV40), el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), virus de la inmunodeficiencia humana promotor (VIH) tal como el promotor de repetición terminal larga del VIH (LTR), el promotor del virus de Moloncy, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein Barr (EBV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), así como promotor de b-actina, los promotores de genes humanos tales como la humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y metalotioneína humana.
Un vector de expresión puede incluir un marcador seleccionable que permite la selección de celulas huésped que contienen el vector. Los marcadores que confieren fenotipos seleccionables, tales como resistencia a fármacos, requerimiento de nutrientes, resistencia a los agentes citotóxicos o la expresión de proteínas de superficie, se utilizan como marcadores seleccionables. Dado que sólo las células que expresan un marcador seleccionable sobreviven en el medio ambiente tratado con un agente selectivo, las células transformadas se pueden seleccionar. Además, un vector de expresión replicable puede incluir un origen de replicación con una secuencia de ácido nucleico específica que inicia la replicación.
Como vectores de expresión recombinantes para expresar genes exógenos, pueden utilizarse diversos tipos de vectores tales como vectores de plásmido, virus o cósmidos. El tipo de vector recombinante no está limitado específicamente, siempre y cuando funcione para expresar un gen deseado en diversas células huésped, tales como células procariotas y eucariotas y para producir una proteína deseada. Sin embargo, es preferible utilizar un vector que incluye un promotor que presenta actividad fuerte y puede producir la proteína exógena, que conserva similitud con una proteína de origen natural, con un alto rendimiento.
Una variedad de combinaciones huésped / vector de expresión puede usarse para expresar un anticuerpo padre o un anticuerpo modificado que comprende un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos incluyen, pero no se limitan a, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus, virus adeno-asocíado, citomegalovirus y retrovirus. Los vectores de expresión útiles para huespedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos, tales como plásmidos de E. coli, incluyendo PET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de amplia gama de hospedadores, tales como RP4, ADNs de fago, por ejemplo, los númerosos derivados del fago lambda, por ejemplo, gt10, gt11, NM989, y otros fagos de ADN, tales como 13 y fagos de ADN monocatenario filamentosos. Los vectores de expresión útiles para células de levadura incluyen los 2 mih plásmido y derivados de los mismos. Los vectores útiles para células de insectos incluyen pVL 941.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped transformada con el vector recombinante descrito anteriormente. El vector recombinante se introduce en una célula huésped para formar un transformante. Una célula huésped adecuada para ser transformada con el vector puede ser una célula procariota tal como E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis o Staphylococcus sp. Además, las células huésped pueden ser células de hongos tales como Aspergillus sp., Células de levadura, tales como Pichia pastorís, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. y Neurospora crassa, células eucariotas inferiores, y células eucariotas superiores tales como células de insecto. Además, las células huésped se pueden derivar de plantas y / o mamíferos. Los ejemplos preferidos de las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células PER.C6, células de riñón de mono 7 (COS7, células COS de simio en particular), células NSO, SP2/0, células de ovario de hámster chino (CHO), W138, riñón de hámster bebé (BHK), células Madln-Darby de riñón canino (MDCK), líneas celulares de mieloma, células HUT 78, células HEK293, y otras células huésped de mamífero que produce la proteína de anticuerpo de acuerdo con la presente invención.
En particular, para maximizar la eficacia de la expresión, la célula huésped en la presente invención es preferiblemente uno o más seleccionada de entre las células de E. coll, células COS de simio, células de ovarlo de hámster chino (CHO), y otras células huésped de mamífero que produce la proteína de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente, la célula huésped en la presente Invención es el de células de ovarlo de hámster CHO-K1.
En la presente invención, la "transformación" en las células huésped incluye cualquier método para introducir ácidos nucleicos en organismos, células, tejidos u órganos y puede llevarse a cabo utilizando una téenica estándar seleccionado dependiendo del tipo de célula huésped como se conoce en la técnica. Los ejemplos de este método incluyen, pero no se limitan a, electroporación, fusión de protoplasto, fosfato de calcio (CaP04) precipitación, cloruro de calcio (CaCI2) precipitación, agitación usando fibra de carburo de silicio, transformación mediada por agrobaCterium, y PEG, Sulfate-dextrano, lipofectamine- o la desecación / inhibición de la transformación mediada.
La proteína anticuerpo expresado como se describió anteriormente se puede recuperar de la célula huésped, el sobrenadante del cultivo, o las células después de la lisis, y se purificó mediante el uso de una técnica de purificación de proteínas convencionales, para producir el anticuerpo modificado que comprende un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína.
El anticuerpo puede ser aislado del medio de cultivo por un procedimiento de purificación de inmunoglobulinas convencionales, por ejemplo, proteína A Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
La secuencia de nucleótidos que codifica el motivo de cisteína que contiene se puede fusionar a una secuencia nucleotídica que codifica ya sea de la cadena pesada del dominio constante de la cadena ligera o dominio constante de anticuerpo parental. El vector recombinante fusionado de esta manera puede producir anticuerpo modificado con el metodo similar al empleado en el anticuerpo parental después de transformado y expresado en la célula huésped procariota o eucariota.
Además, el anticuerpo modificado de la presente invención se puede producir mediante la expresión de cada uno de un anticuerpo parental y un motivo que contiene uno o más residuos de cisteína, y luego une químicamente el grupo funcional terminal del anticuerpo parental con el grupo funcional terminal de la cisteína que contengan motivo o une el anticuerpo parental al motivo por un primer enlazador. Un fármaco puede estar unido al anticuerpo modificado producido con el motivo que contiene cisteína, produciendo de este modo un conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC).
Específicamente, un conjugado anticuerpo-fármaco modificado con múltiples motivos de que contienen cisteínas puede ser producido por: (a) la conjugación de un anticuerpo parental que contiene un motivo que contiene cisteína con un reactivo enlazador para formar un vinculante intermedio del segundo anticuerpo unido de manera covalente, y luego añadir una fracción de fármaco activado a la sustancia intermedia; o (b) conjugando el grupo nucleófilo de una fracción de fármaco con un segundo reactivo enlazador para formar un vinculante intermedio del segundo fármaco unido de manera covalente, y luego añadir un anticuerpo modificado con un motivo que contiene cisteína.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición terapeutica que comprende el conjugado de anticuerpo-fármaco como un ingrediente activo.
En la composición mencionada anteriormente, el fármaco conjugado con un conjugado anticuerpo-fármaco modificado puede ser un agente citotóxico, un inhibidor de proliferación celular un agente quimioterapéutico, un inhibidor inmune, un agente anti-inflamatorio o similar, pero no está limitada a los mismos. En la terapia del cáncer, el uso del conjugado anticuerpo-fármaco para la entrega local de un fármaco que mata o inhibe las células tumorales permite la administración dirigida del resto de fármaco en las células tumorales por interacciones anticuerpo-antígeno y la acumulación intracelular del resto de fármaco. La administración de la formulación del fármaco no conjugado puede causar un nivel inaceptable de toxicidad no sólo en las células tumorales, sino también en las células normales. Sin embargo, el conjugado anticuerpo-fármaco modificado de acuerdo con la presente invención puede entregar con precisión el medicamento debido a la alta especificidad de antígeno del anticuerpo, lo que aumenta el efecto terapéutico del fármaco. Además, se puede ampliar la capacidad de uso de los medicamentos, en particular los agentes contra el cáncer, cuyo uso es limitado debido a su toxicidad, a pesar de su alta eficacia contra el cáncer. De acuerdo a la presente invención, se proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco que maximiza la eficacia del fármaco mientras se minimiza la toxicidad del fármaco.
La presente invención también proporciona un método para inhibir la proliferación de las células diana de cáncer, autoinmune, inflamatoria o enfermedad infecciosa por el conjugado anticuerpo-fármaco modificado como un ingrediente activo.
El cáncer que se pueden tratar de acuerdo a la presente invención puede ser uno o más seleccionados de entre cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer anal, cáncer de trompa de Falopio, cáncer endometrial, cáncer cervical, cáncer vaginal, cáncer de de válvula, enfermedad de Hodgkin, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de uréter, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal, y cáncer del sismotivo nervioso central. En un ejemplo específico, la proliferación de cáncer de mama HER2 amplificado por células BT-474 puede ser inhibida por lo que el conjugado anticuerpo-fármaco modificado en contacto con las células in vitro. Por lo tanto, es evidente que el método de la invención de inhibir la proliferación de células diana usando el conjugado anticuerpo-fármaco modificado como ingrediente activo tiene el efecto de matar a las células relacionadas con la enfermedad descrita anteriormente o la reducción de la tasa de proliferación de las células.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Será evidente para un experto en la teenica que estos ejemplos no deben interpretarse como una limitación del alcance de la presente invención, y diversas modificaciones y cambios se pueden hacer dentro de la idea técnica y el alcance de la presente invención.
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos o científicos como se usan aquí tienen los mismos significados tal como se entiende por aquellos que tienen conocimiento ordinario en el campo técnico al que pertenece la presente invención. Además, la descripción detallada de la misma construcción y efecto como las de la técnica anterior se omitirá en este documento. 1. Método Analítico 1.1: UV-VIS espectrofotometría En la presente invención, se produjo un conjugado anticuerpo-fármaco mediante la utilización de un fármaco (DOX-EMCH) con un vinculante unido al agente anticancerígeno doxorrubicina (6-maleimidocaproil) hidrazona. El DOX-EMCH, cuando se inyecta en un cuerpo humano, se une al grupo tiol de la cisteína presente en albúmina de la sangre para formar un conjugado de albúmina -fármaco [Willner et al., Bioconjugate Chem. 1993 (4): 521-7] y se puede aplicar fácilmente en la descripción de la presente invención.
Con la finalidad de examinar si un fármaco está todavía unido a una proteína después de las etapas de conjugación y purificación, se emplea generalmente la espectroscopia de absorción UV-VIS. La proteína muestra la absorbancia máxima a una longitud de onda de 280 nm (longitud de onda UV), y doxorrubicina utilizado en la presente invención tiene la absorbancia máxima a 495 nm (longitud de onda visible). Tanto la proteína y doxorrubicina tienen coeficientes de absorción característicos, respectivamente, en la región de longitud de onda específica. Por tanto, cuando se mide la absorbancia a 280 nm y 495 nm, el 5 equivalente de fármaco unido por molecula de proteína se determina (Patente US No. 7.528.234 B2). 1.2 Ensayo de inhibición de proliferación celular in Vitro ío La actividad inhibidora de la proliferación celular o la citotoxicidad del conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC) se determinó mediante la exposición de células de mamífero que tiene la proteína del receptor, por ejemplo, SK-BR-3 o BT-474 células, para el conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC) en medio de cultivo celular. Las células tratadas con mADC se cultivaron 15 durante aproximadamente 6 horas ~ 5 días, y se midió su viabilidad. 1.3: Medición de la actividad caspasa 3/7 in vitro La Herceptin no induce directamente la muerte de células de cáncer, pero induce la muerte de las células cancerosas HER2 positivo por ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Sin embargo, una terapia de drogas induce directamente la muerte celular apoptótica, por lo tanto, cuando se mide la actividad caspasa, se podría determinar si el conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC) induce la apoptosis mediada por caspasa o no (Bayascas, et al. (2002), .Muerte Celular y Diferenciación 9: 1078-1089; Preaudat, et al (2002), Journal of Biomolecular Screening 7: 267-274; Phillips, et al (2008), Investigación del cáncer68 (22) : 9280-9290 ).
En la presente invención, con el fin de examinar el mecanismo de la apoptosis por el conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC), se midió la actividad de la caspasa 3/7. Generalmente, la apoptosis por el conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC) se determina mediante la exposición de células de mamífero que tiene la proteína del receptor, por ejemplo, SK-BR-3 o células BT-474 células, para el conjugado anticuerpo-fármaco modificado (mADC). Las células tratadas con mADC se cultivaron en mediumfor - 2 días, y se midió su actividad de caspasa. 2. Ejemplos Ejemplo 1. Preparación de vector de expression pAV4 La clonación del vector de expresión requerido en la presente invención se realizó mediante el uso de un vector pAV4 que fue construido y modificado a partir del vector parental pSGHVO (número de acceso GenBank AF285183), con el fin de ser utilizado para la producción de anticuerpos en el campo industrial. Aunque la proteína humana podría ser sobreexpresada en células bacterianas tales como E. coli, es difícil de obtener como una sustancia activa. Por lo tanto el vector parental fue fabricado para expresar la proteína fisiológicamente activa en alta concentración en las celulas animales in vitro, junto con etapas de purificación fáciles. Aunque su mayor mérito de alto nivel de expresión de proteínas de este vector parental, no es una limitación para su uso en el campo industrial. Por lo tanto el vector pAV4 se modificó a partir de su vector parental para ser adaptable en el campo industrial. Además, el vector pAV4 se modifica adecuadamente para el propósito de expresar dominios tanto de la cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo.
Ejemplo 2: Construcción de vectores para la producción de trastuzumab y trastuzumab modificado de cisteína Para construir un vector de trastuzumab (HHL002), los cDNA de la cadena ligera y la cadena pesada de trastuzumab se sintetizaron en secuencias de codón optimizado de manera que la expresión del mismo en células CHO se maximiza. Los genes se clonaron respectivamente en el Xhol / Notl y los sitios de restricción Apal / Smal del vector pAV4, se preparó de este modo un vector de trastuzumab (pHHL002). 2.1 Construccción de vectores de los anticuerpos de trastuzumab modificados HR-Cys v HR-Cys-GIv-Cvs Con el fin de construir vectores para los anticuerpos de trastuzumab modificado, HR-Cys (HHL002C), un único mutante de cisteína en lugar de la lisina terminal en el C-terminal y otra variante de trastuzumab HR-Cys-Gly-Cys (HHL002C2) con un terminal C-péptido que consiste en Cys-Gly-Cys (CGC), se re realizó la amplificación de PCR utilizando el vector construido trastuzumab (pHHL002) como una plantilla. Específicamente, se realizó la amplificación de PCR usando trastuzumab como una plantilla y un cebador directo XhoHH (5'-GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT -3 ') y un HHNot cebador inverso (5'- 5 GGC GCC GCG CGC TCA ACA ACC inversa CGG AGA CAG -3’) para HHL002C o un cebador inverso HHNot (5'-GGC GCC GCG CGC TCA ACA ACA ACC CCG CGG AGA CAG-3’) para HHL002C2. La secuencia de nucleótidos amplificada se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Notl y se ligó con el vector de expresión que tiene sitios de escisión Xhol/Notl, de este modo se construyen ío vectores de anticuerpo de trstuzumab modificado de cisteína (pHHL002C; pHHL002C2). La Fig. 1 es una vista esquemática del vector. La variante de anticuerpo que contiene cisteína producido en este Ejemplo es un anticuerpo de trastuzumab que contiene cisteína que contiene una deleción de la lisina en el extremo C-terminal y una adición de una sola cisteína o un peptido corto de 15 cisteína, glicina y cisteína. 2.2 Construcción de un vector para el anticuerpo trastuzumab modificado Para construir un vector que codifica un anticuerpo trastuzumab modificado 20 HR-M2 (Cys) (HR-ACHGAACGHA; HHL002M2) que tiene dos motivo de unión de iones metálicos (CGH), amplificación por PCR se realizó utilizando el vector de trastuzumab (pHHL002) como una plantilla y un cebador XhoHH adelante (5'-GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT -3’) y un cebador inverso M2 (5 ’CCCCGC GGC CGC CTA GGC ATG GCC ACA AGC AGC ATG GCC ACA GGC GCC GGG AGA CAG AGA 3 '). La secuencia de nucleótidos amplificada se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Notl y se ligó con el vector de expresión que tiene pHHL002 sitios de escisión / Notl Xhol, construyendo de ese modo un vector de anticuerpo trastuzumab de cisteína modificada (pHHL002M2). 2.3: Producción de anticuerpo trastuzumab modificado HR-M (Cys) A fin de construir un anticuerpo trastuzumab que codifica el vector modificado HR-M (Cys) (HR-GGGACGHA; HHL002M) que tiene un solo motivo de unión de iones metálicos (CGH), amplificación por PCR se realizó utilizando un kit de mutagénesis dirigida a sitio EZchange (Enzynomics , Ez004S). El anticuerpo trastuzumab modificado producido anteriormente HR-M2 (Cys) se utilizó como una plantilla con un cebador directo (5'-GGT GGA GGT GCT TGT GGC CAT TAA GC) y un cebador inverso (3 '-GCC GGG AGA AGA CAG CAG TG). A partir de los dos motivo de unión de iones metálicos en HR-M2 (Cys), el motivo de unión a un ion de metal de la C-terminal se eliminó y se añadió un vinculante de glicina (GGG) entre el motivo restante y el anticuerpo parental. Después de la amplificación por PCR EZchange, la plantilla original HR-M2 (Cys) se escindió con la enzima de restricción Dpnl, y la resultante 5-M (Cys) se ligó en un vector de ADN de doble cadena por ligasa, construyendo de ese modo un vector de anticuerpo trastuzumab modificado (pHHL002M). 2.4 Construcción de un vector para anticuerpo tastuzumab modificado HR-M2L(Cys) A fin de construir un anticuerpo trastuzumab que codifica el vector modificado HR-M (Cys) (HR-ACGHAGGGACGHA; HHL002M2L) se realizó con un vinculante de tres aminoácidos (GGG) insertado entre un motivo de unión de iones metálicos (CGH), la amplificación se realizó por PCR. El vector modificado 5 producido anteriormente para el anticuerpo trastuzumab HR-M2 (Cys) se utilizó como una plantilla con un cebador directo (5-GGT GGA GGTGCT TGT GGC CAT TAA GCG) y un cebador inverso (3 '-AGC ATG GCC ACA GGC GCC. Después de la plantilla original HR-M2 (Cys) con la enzima de restricción Dpnl, la codificación de nucleótidos resultante 5-M2L (Cys) se ligó en un vector de ADN de doble ío cadena por ligasa, construyendo de ese modo un vector de anticuerpo trastuzumab modificado (pHHL002M2L). 2.5: Construcción de un vector para el anticuerpo trastuzumab modificado HR-Z (Cys) 15 A fin de construir un vector que codifica HR-Z(Cys) (HR- CDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQK, HHL002Z) que tiene un motivo de unión de ión metálico de la proteína de dedo de zinc de Clase I, se realizó la amplificación de PCR utilizando el vector de trastuzumab (pHHL002) como una plantilla con un 20 cebador directo XhoHH (5-GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT - 3’, SEQ ID NO: 1) y un cebador inverso Z (5’-GCA TGC GGC CGC CTT ACT TCT GCC GCA GGT GGA TCT TGG TAT GCC TTT TTC GCT CGT CGG ATC TAG CAA ATT TGC GTC CAC AAA TAT CGC ATT TGC CGG GAG ACA GAG A-3 '). La secuencia de nucleótidos amplificada se escindió con las enzimas de restricción Xhol y Notl y se ligó con el vector de expresión pHHL002 que tiene sitios de escisión Xhol/Notl, construyendo de ese modo un anticuerpo trastuzumab cisteína modificada (pHHL002Z).
Ejemplo 3: Expresión v purificación de anticuerpo de trastuzumab v cisteína modificada Mediante el uso de celulas de ovario de hámster chino (CHO-K1), la expresión de trastuzumab (HHL002) y sus anticuerpos modificados en cisteína (HHL002C, HHL002C2, HHL002M, HHL002M2, HHL002M2L, HHL002Z) fueron analizados. Específicamente, las células CHO-K1 se cultivaron en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) que contiene 10% de FBS (suero fetal bovino) y antibióticos. Las células CHO-K1 se inocularon en una placa de 100mm de cultivo a una concentración de 5x 106 células/ml y después se cultivaron durante 24 horas. 800 m2 de FBS- y DMEM libre de antibióticos se mezcló con 10 mg vector y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 minuto, después de lo cual la mezcla se mezcló con 20 mg PEI (polietilenimina, lineal, Polysciences Inc (Cat. no:23966, MW ~ 25000)) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-15 minutos. Mientras tanto, las células se lavaron con PBS y 6 de DMEM fresco se añadieron a éste. Se añadió trastuzumab o vector de anticuerpo trastuzumab de cisteína modificada mantenida a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos a la placa de cultivo. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS, y FBS libre de medio IMDM -(Cat. No 12200-028, Gibco, Iscove's Dulbecco Medio modificado) se añadió a la misma para confirmar la expresión de la proteína anticuerpo.
Los anticuerpos de trastuzumab de cisteína modificada y el trastuzumab expresadas como se describió anteriormente fueron purificados de la siguiente manera. Específicamente, con el fin de purificar el trastuzumab y los anticuerpos de trastuzumab de cisteína modificada secretados en el medio de cultivo celular, el 5 medio de cultivo se centrifugó para eliminar las celulas, y el sobrenadante se inyectó en columna de HiTrap proteína A HP (GE Healthcare, EE.UU.) que se equilibró con búfer de equilibrio. La columna se lavó suficientemente con búfer de equilibrio y después la proteína se eluyó por el cambio de pH con búfer de glicina (glicina 100 mM, pH 2.8). La solución resultante se dializó frente a búfer de fosfato, ío y después se concentró utilizando Vivaspin20 (Sartorius, EE.UU.).
Ejemplo 4: Producción de un anticuerpo variante v conjugado del fármaco 4.1: Producción de un anticuerpo variante basado en trastuzumab v conjugado de fármaco (doxorrubicina) 15 En general, si los residuos de cisteína de las proteínas no participan en un enlace disulfuro intramolecular, las proteínas suelen formar un dímero por enlace disulfuro intermolecular. Sin embargo, como se muestra en la figura. 2, HR-Cys producido en la presente invención estaba presente como un anticuerpo 20 monomérico en conjunto como es determinado por SDS-PAGE y análisis de transferencia Western. Además, un residuo de cisteína que tiene un grupo tiol libre en la proteína puede formar un enlace disulfuro con glutatión o cisteína intracelular. Por esta razón, con el fin de romper el enlace disulfuro, un paso de tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) o TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina), se requiere a la unión con un vinculante del segundo fármaco, pero una reacción de unión suficiente también se puede lograr incluso por agitación a temperatura ambiente.
El segundo fármaco-vinculante conjugado utilizado en este experimento es un (6-maleimidocaproil) derivado de hidrazona de doxorrubicina conocido como DOXO-EMCH. Un método de unir un compuesto tal como DOXO-EMCH, que tiene un grupo maleimida, para el grupo tiol de la proteína, está bien descrito en la literatura [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4): 765-773, página 766; Emmanuel et al. (2010) Química y Biología 2010 (17): 213-227].
El HR-Cys purificado en la presente invención se mezcló con DOXO-EMCH en una relación molar de 1:10 y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Después, el DOXO-EMCH restante se eliminó usando una columna de desalado, y el material restante se lavó tres veces por ultrafiltración, produciendo de este modo un-Cys-doxorrubicina conjugada HR (HR-Cys-DOX). El conjugado producido fue confirmado por espectrofotometría UV-VIS como se muestra en la figura. 3. Del cálculo basado en los coeficientes de absorción característicos de la proteína y del fármaco, se pudo ver que alrededor de dos moléculas de DOXO-EMCH estaban ligados por la molécula HR-Cys. 4.2: Producción de un anticuerpo y el fármaco modificado basado en conjugado de trastuzumab (MMAE) En la presente invención, MMAE se sabe que tiene citotoxicidad mucho mayor que la doxorrubicina se conjugó con HR-Cys-Gly-Cys para hacer un conjugado Herceptin-MMAE (HR-Cys2-MMAE). Monometil auristatina E (véase la Fórmula Química 2 a continuación), un derivado de auristatina conjugables, está relacionada con el grupo tiol-maleimida específica a través de una valina- citurulina, que puede ser degradado por la proteasa en las células, y un espaciador 5 auto-degradante, ácido benzoico para-anilina (PABA). Esto se conoce como C (ácido caproico maleimido) -VC (valina-citurulina) -PAB-MMAE, y un método de síntesis de los mismos ya es bien sabido (Patente US No. 6214345; patente estadounidense n ° 7745394). Auristatina, un compuesto altamente citotóxicos, se sabe que tiene un valor de IC50 de 200 a 300 pM, en un ensayo de inhibición de la ío proliferación celular.
Formula Química 2: MC-vc-PAB- Metil auristatina E En la presente invención, se añadieron 2-10 equivalentes del agente reductor TCEP al anticuerpo trastuzumab modificado y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 30 minutos para reducir el grupo tiol, después de lo cual 2-10 20 equivalentes de MC-vc-PAB-MMAE fue añadido y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante alrededor de 2-4 horas. La reacción se terminó mediante la adición de una cantidad en exceso de cisteína, y que no ha reaccionado, el MC-vc-PAB-MMAE y el TCEP se eliminaron por centrifugación-filtración y diálisis en en tampón fosfato salino, obteniendo de este modo una variante de trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE purificada.
Con el fin de confirmar la especificidad de unión selectiva de la variante producida de trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, el mapeo peptídico de HR-M2 (Cys) -MC-vc-PAB-MMAE producida se realizó (ProteinWorks Co., Ltd ., Daejeon, Corea). Los resultados de la cartografía peptídico indicaron que MC-vc-PAB-MMAE se introdujo en el residuo de cisteína del peptido que es un sitio de unión del fármaco en el C-terminal de la cadena pesada. No se observó la unión del fármaco a la cisteína derivado del enlace de disulfuro intracatenario o intercatenario de la cadena pesada o ligera. Esto sugiere que la variante de anticuerpo diseñado en la presente invención se sintetizó de manera efectiva, lo que puede aumentar significativamente la homogeneidad del conjugado anticuerpo-fármaco con el fármaco unido específicamente a la C-terminal de la cadena pesada. 4.3: Análisis de la propiedad de conjugación selectiva de anticuerpo trastuzumab modificado mediante el uso de un colorante fluorescente que contiene maleimida, Alexa Flour® 488.
Con el fin de examinar si un fármaco se conjuga selectivamente a un residuo de cisteína introducido en el C-terminal de la cadena pesada de Trastuzumab, colorante fluorescente Alexa Fluor ® 488 sustituido con un grupo maleimida-tiol específica se hizo reaccionar con cada uno de los anticuerpos modificados trastuzumab. Cuando los residuos de cisteína de las proteínas no forman un enlace disulfuro intramolecular, las proteínas por lo general forman un dímero por un enlace disulfuro intermolecular. Sin embargo, como se muestra en la figura. 2, HR-Cys producido en la presente invención estaba presente como un anticuerpo monomérico en conjunto como se determina por SDS-PAGE y análisis de transferencia Western. Además, un residuo de cisteína que tiene un grupo tiol libre puede formar un enlace disulfuro con glutatión o cisteína intracelular. Por esta razón, con el fin de romper el enlace disulfuro, un paso de tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) o TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina), se requiere sobre la unión con un vinculante del segundo fármaco, pero una reacción de unión suficiente también se puede lograr incluso por agitación a temperatura ambiente. 2-4 equivalentes del agente reductor puede reducir no sólo un residuo de cisteína introducido en el extremo C-terminal de la cadena pesada, sino también de un enlace disulfuro intracetenario de cada una de las cadenas pesada y ligera y el enlace disulfuro entre cadenas que une la cadena pesada a la cadena ligera. De este modo, el colorante fluorescente puede estar unido a cualquier residuo de cisteína reducida por el agente reductor. Un fármaco que está enlazado a un disulfuro de intercadena o intracatenario puede reducir la homogeneidad del conjugado anticuerpo-fármaco, y la unión del fármaco que tiene una tamaño relativamente grande es altamente probable que reduzca la estabilidad estructural y la especificidad de antígeno de la proteína de anticuerpo en sí, y por esta razón, la eficacia del mismo en la fabricación de biofármacos se puede reducir significativamente. 2-4 equivalentes de TCEP se añade al anticuerpo trastuzumab modificado y se hace reaccionar a 4 °C durante aproximadamente 30 minutos para reducir el grupo tiol. En este proceso, ya sea la variante de anticuerpo presente como un dímero con un enlace de disulfuro o el grupo funcional tiol de la cisteína que está presente en una forma de enlace oxidante durante un proceso de expresión se restaura a una forma reducida que puede unirse a un grupo maleimida. Despues de la reacción de reducción, el agente reductor tal como la DTT, que es reactivo al grupo maleimida, debe ser eliminado mediante, por ejemplo, centrifugación filtración, pero TCEP, que no está involucrado en la reacción de conjugación entre el grupo maleimida y el tiol grupo, no se elimina necesariamente. 2-10 equivalentes de Alexa Fluor (D 488 se añade al anticuerpo trastuzumab modificado y se hicieron reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2-4 horas. La reacción se terminó por adición de una cantidad en exceso de cisteína , y el colorante sin reaccionar y el agente reductor se eliminó por centrifugación-filtración. El material resultante se dializó frente a solución salina amortiguada con fosfato, obteniendo de este modo un conjugado de colorante Alexa488 - anticuerpo trastuzumab modificado.
El conjugado de colorante Alexa488-anticuerpo trastuzumab modificado obtenido como se describió anteriormente se separó por electroforesis en gel de SDS-PAGE, y posteriormente la cantidad del colorante unido a cada una de las cadenas pesadas y ligeras se analizó mediante un analizador de imágenes de fluorescencia (Analizador de Imágenes en fluorescencia , Typoon 9410, Amersham Bioscience Ltd.). Los resultados del análisis de imagen de fluorescencia indican que, en el caso de las variantes de anticuerpos HR-Cys y HR-Cys-Gly-Cys, la cantidad del colorante unido a la cadena pesada era más grande que la del colorante unido a la luz cadena. Tambien en el caso de HR-M (Cys), HR-M2 (Cys), HR-M2L (Cys) y HR-Z (Cys), la cantidad del colorante unido a la cadena pesada era más grande que la cantidad del colorante unido a la cadena ligera. Como puede verse en la figura. 4, en el caso de la variante de anticuerpo HR-M2 (Cys), la intensidad del colorante fluorescente unido a la cadena pesada fue aproximadamente 6 veces superior a la intensidad del colorante unido a la cadena ligera. Esta diferencia en la intensidad de fluorescencia indica que la cantidad del colorante unido a la cadena pesada es mucho mayor que la cantidad del colorante unido a la cadena ligera, lo que sugiere que la selectividad del grupo maleimida a la cadena pesada es significativamente mayor.
Ejemplo 5: Medición de la afinidad de unión del ion metálico del motivo de unión de ión metálico Como se mencionó anteriormente, los iones metálicos se unen a un péptido que tiene el motivo CGH de unión de iones metálicos e inhiben o retardan la oxidación del residuo de cisteína, evitando de este modo una reacción de sulfonación causado por la sobre-oxidación de la cisteína. La oxidación del residuo de cisteína puede ocurrir a través de dos vías de reacción. En una ruta de reacción, un enlace de disulfuro puede ser creado por la unión de tiol-tiol, y en la otra vía, la cisteína también puede ser oxidada por reacción con un exceso de oxígeno en el aire para producir ácido sulfónico (R-S-OH) como producto ¡ntermedio. En este caso, la formación de disulfuro es una reacción reversible en la que el enlace disulfuro se puede reducir a tiol, pero la formación de ácido sulfónico por reacción con el oxígeno es uno irreversible. Cuando el disulfuro y ácido sulfónico están expuestos a oxígeno durante un largo período de tiempo, todos ellos son oxidados a ácido sulfónico (R-S03H) por una reacción irreversible.
Debido a que este ácido sulfónico o ácido sulfónico no tienen reactividad a la maleimida, la oxidación a los ácidos sulfónicos o sulfenicos reducen la reactividad de la variante de anticuerpo con maleimida, y por lo tanto pueden influir en gran medida el rendimiento de la conjugación y la homogeneidad del conjugado anticuerpo-fármaco.
Como se describió anteriormente, se ha informado que un péptido que contiene el motivo CGH sintético, derivado del GGH del motivo de unión de iones metálicos que se encuentran con frecuencia in vivo, los iones metálicos unen e inhiben la sulfonación de cisteína (Van Horn et al. (2003) J. Biol. Quím. Inorg 8: 601-610). Después de secretar al medio extracelular durante el proceso de expresión, la proteína de anticuerpo que tiene el motivo de péptido de unión de iones metálicos se pueden unir a una cantidad traza de iones metálicos presentes en el medio de cultivo celular y efectivamente inhibe la sulfonación de cisteína. Con el fin de medir la capacidad de unión de iones metálicos de la variante de anticuerpo que tiene este motivo de péptido de unión de ión metálico, la afinidad de unión se midió mediante el uso de un Fura-2 (Invitrogen, F-1200), un conocido quelante de iones metálicos. A partir de esta medición, HR-M2 (Cys) tuvo una constante de disociación (Kd) de alrededor de 20 nM, lo que sugiere que se formó una unión muy fuerte con iones metálicos. Además, para examinar si la variante de anticuerpo que tiene un motivo de unión de ión metálico se une a iones metálicos y protege el residuo de cisteína, se midió la tasa de alquilación. Se observó que la variante de anticuerpo forma una unión muy fuerte con iones metálicos de zinc, y por lo tanto inhibe la alquilación de cisteína durante un máximo de 24 horas en comparación a cuando no había ningún ion metálico. Los Iones de níquel no se unieron al motivo CGH tan fuertemente como lo hicieron los iones de zinc, lo que sugiere que el efecto de inhibir la alquilación de cisteína es menor que la de los iones de zinc. Sin embargo, cuando se compara con el búfer sin iones metálicos, los iones de níquel reducen la tasa de alquilación de cisteína. Cuando se añadió un fuerte quelante de iones metálicos EDTA para eliminar los iones de zinc a partir de HR-M2 (Cys), se observó que la alquilación de cisteína se produjo rápidamente, como el caso en el que no se añadió ninguna impureza de iones metálicos.
Ejemplo 6: Ensayo in vitro para la inhibición de la proliferación celular 6.1: Ensayo de inhibición de la proliferación celular de un anticuerpo variante v conjugado de doxorrubicina Celulas BT-474 se diluyeron en 10% de FBS que contienían DMEM/F12, y 100 mR de la suspensión celular diluida se inocularon en cada pocilio de una placa de 96 pocilios a una densidad de 1x104 células/pocillo. Después de la inoculación, la placa de pocilio se incubó en un incubador de CO2 al 5% a 37 °C durante 24 horas. Cada uno de Herceptin, una mezcla 1:2 de Herceptin y doxorrubicina, HR-Cys-DOX preparada en el ejemplo anterior, y doxorrubicina, se diluyó en el medio, y luego 100 m£ de cada dilución se añadió a cada pocilio de la placa en varios concentraciones de 1,000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM y 0,1 nM. También el medio (que no tiene fármaco) se añadió a otros pocilios para el control negativo. Despues de la incubación durante aproximadamente 5 días, 20 m2 de reactivo CelITíter 96 Aqueous One Solution [ensayo basado en MTS; la medición de la proliferación celular por la cantidad de formazán púrpura formado por MTS debido a la deshidrogenasa de las células viables] se añadió a cada pocilio, seguido de incubación en una incubadora a 37 °C durante 2 horas. 20 m2 de 10% de solución de SDS se añadió a cada pocilio para detener la reacción, seguido de mezclado suficiente para inducir la lisis celular. La absorbancia de cada pocilio se midió por un espectrofotómetro, y la viabilidad (%) basada en la absorbancia se muestra gráficamente en la figura. 5. Como resultado, se demostró que el efecto inhibitorio del crecimiento de células de HR-Cys-DOX usado en bajas concentraciones era similar a las de las Herceptin y 1: 2 mezclas de Herceptin y doxorrubicina y HR-Cys-DOX en una alta concentración mostró citotoxicidad similar a la de la doxorrubicina. Estos resultados indican que HR-Cys-DOX conserva la función característica de Herceptin y muestra suficientemente la citotoxicidad característica de la doxorrubicina, a pesar de que la doxorrubicina está unida a Herceptin por el segundo vinculante. 6.2 Ensayo de inhibición de la proliferación celular de un anticuerpo variante v conjugado MMAE Células SK-BR3 se diluyeron en 10% de medio DMEM/F12 que contiene DMEM/F12, y 100 j J2 de la suspensión celular diluida se agregó en cada pocilio de una placa de 96 pocilios a una densidad de 1x104 células/pocillo. Después, la placa de pocilio se incubó en un incubador de CO2 a 5% a 37 °C durante 24 horas. Cada uno de Herceptin, y el conjugado del anticuerpo-MC-vc-PAB-MMAE variante de Herceptina preparada en el ejemplo anterior, se diluyó en el medio, y luego se añadió a cada pocilio de la placa en varios concentraciones de 66.7 nM, 33.3 nM, 5 6.7 nM, 3.3 nM, 0.67 nM, 0.33 nM, 0.067 nM y 0.0067 nM . Tambien el medio (que no tiene fármaco) se añadió a otros pocilios para el control negativo. Después de la incubación durante aproximadamente 5 días, 20 m de CelITiter 96 de reactivo de una solución acuosa [ensayo basado en MTS; la medición de la proliferación celular por la cantidad de formazán púrpura formado por MTS debido a la ío deshidrogenasa de las células viables] se añadió a cada pocilio, seguido de incubación en una incubadora a 37 °C durante 2 horas. La absorbancia de cada pocilio a 490 nm se midió por un espectrofotómetro para determinar la viabilidad celular (%). Como resultado, todo lo de HR-Cys-MC-vc-PAB-MMAE, HR-Cys-Gly- Cys-MC-vc-PAB-MMAE, HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE, HR-M(Cys)-MC-vc-15 PAB-MMAE, HR-M2L(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE y HR-Z(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE demostró excelente efecto inhibitorio de proliferación celular comparado con la Herceptin del anticuerpo parental . Como se muestra en la figura 6, el valor IC50 de HR-M2 (Cys) -MC-vc-PAB-MMAE era al menos 5 veces menor que la del anticuerpo parental Herceptin (el valor medio entre el mayor y los valores más 20 bajos fue tomada para el IC50 para Herceptin porque la viabilidad en el caso de Herceptin no se redujo a 50% o menos). Además, la viabilidad celular a altas concentraciones se redujo en aproximadamente un 85% para el conjugado anticuerpo-fármaco, pero se redujo sólo en un 40% para el anticuerpo parental Herceptin. Estos resultados indican que el conjugado anticuerpo-fármaco tiene una muy alta citotoxicidad y un valor de IC50 muy bajo en comparación con el anticuerpo parental.
Ejemplo 7: Ensayo in vitro de la casoasa 3/7 activivacion 5 Celulas SK-BR3 se diluyeron con medio de RPMI 1640 que contiene FBS al 10% y 100 ju2 de la suspensión diluida de células se añadieron a cada pocilio de una placa de 96 pocilios a una densidad de 1x104 células/pocillo. A continuación, la placa de 96 pocilios se incubó en un incubador de CO2 al 5% a 37 °C durante 24 ío horas. Cada uno de los conjugados de Herceptin y el anticuerpo-fármaco modificados producidos en el Ejemplo anterior se diluyó en el medio, y después se añadió a cada pocilio de la placa a diferentes concentraciones de 66.7 nM, 33.3 nM, 6.7 nM, 3.3 nM, 0.67 nM, 0.33 nM , 0.067 nM y 0.0067 nM. También el medio (que no tiene fármaco) se añadió a un pocilio de control para el control negativo. 15 Después de la incubación durante 48 horas, 100 m2 de reactivo 3/7 de caspasa-Glo [ensayo 3/7 de caspasa-Glo; la medición de la luminiscencia resultante de la degradación de un sustrato de caspasa por actividad 3/7 de caspasa formada en células en las que la apoptosis es inducida por la vía de la caspasa] se añadió a cada pocilio, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. 20 La luminiscencia se mide mediante un luminómetro.
Como se muestra en la Fig. 7, en las células tratadas con Herceptin del anticuerpo parental, se observó poca o ninguna actividad caspasa, pero en las células tratadas con HR-Cys2-MMAE, la actividad 3/7 aumentó como la concentración de HR-Cys2-MMAE aumento. Estos resultados sugieren que el fármaco MMAE liberado de HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE entregado en las células induce la apoptosis a través de la vía de la caspasa, a diferencia de Herceptin. 5 Además, como se muestra en la Fig. 8, en las células tratadas con Herceptin, poca o ninguna actividad caspasa apareció, pero en las células tratadas con HR-M2 (Cys) -MC-vc-PAB-MMAE, aumentó la actividad de caspasa como la concentración de HR-M2 (Cys) -MC-vc-PAB-MMAE aumentó. Estos resultados indican que el fármaco liberado de MMAE HR-M2 (Cys) -MC-vc-PAB-MMAE ío entregado en las células inducir la apoptosis a través de la vía de la caspasa, a diferencia de Herceptin.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL 15 Como se describió anteriormente, el anticuerpo modificado de la presente invención y el conjugado anticuerpo-fármaco modificado que comprende el mismo puede entregar con precisión un fármaco a una célula diana debido a su alta especificidad a antígeno, y por lo tanto pueden aumentar el efecto terapéutico del fármaco. Además, puede aumentar la capacidad de uso de los medicamentos, en 20 particular los agentes contra el cáncer, cuyo uso es limitado debido a su toxicidad, a pesar de su alta eficacia.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo modificado que comprende un motivo que contiene cisteína en el termino de anticuerpo, con una estructura representativa mediante la siguiente formula 1 : 5 Xa-[(MCys)n-Xbn]n Formula (1) caracterizado por que (Mcys)n representa un residuo de cisteína simple ó un motivo peptídico que contiene residuo de cysteina y tiene una funcionalidad especifica o una estructura terciaria o secundaria; Xa y Xbn , cada una representa de manera independiente un péptido que comprende de 0 a 20 ío residuos de aminoácidos que no sean cisteína; y n es un número entero comprendido entre 1 a 20. 2. El anticuerpo modificado de la reivindicación 1, caracterizado por que el motivo que contiene cisteína que tiene la estructura representada por la 15 formula anterior 1 se une a la terminal de la cadena pesada del anticuerpo parental. 3. El anticuerpo modificado de la reivindicación 2, caracterizado por que el motivo que contiene cisteína que tiene la estructura representada por la 20 formula anterior, se une a la terminal C de la cadena pesada del anticuerpo parental. El anticuerpo modificado de la reivindicación 1, caracterizado por que el motivo del péptido que tiene la funcionalidad especifica o la estructura secundario o terciaria es uno o más seleccionados del grupo que consiste en: Grupo C2H2 (clase Cys2His2: Cys-X2-4-Cys-Xi2-His-X3.5-His), grupo C4 (clase C4: Cys-X2-Cys-Xn-Cys-X2-Cys-Xm-Cys-X2-Cys-Xn-Cys-X2-Cys) o grupo C6 (clase C6 : Cys-X2-Cys-X6-Cys-X5-i2-Cys-X2-Cys-X6-8-Cys) de proteína de dedo de zinc; un motivo de unión de ión metálico designado en base al motivo de dedo de zinc o un motivo de proteína de unión de ión metálico; un motivo Cys-Xm-Cys, a motivo Met-X-Cys-X-X-Cys, ó un motivo C-Q-C-Q- C-A-C de proteína regulatoria de transcripción, proteínas acompañantes de metal, trasportadores de ión metálico, o superóxido dismutasa; un motivo Ser-Pro-Cys de proteína de membrana ATPasa; un motivo peptídico de unión de ión metálico que tiene una estructura circular; y un motivo CGH ó HGC, (caracterizado por que en la estructura del motivo peptídico que tiene la funcionalidad especifica o la estructura secundaria o terciaria descrita anteriormente, X representa residuos de amino ácidos que no sean Cys; m es un número entero que va de 1 a 10, y preferentemente de 1 a 5; y Xm ó Xm-q representa m ó m a q residuos de amino acido que no sea Cys.) 5. El anticuerpo modificado de la reivindicación 4, caracterizado por que el grupo C2H2, el grupo C4 ó el grupo C6 de la proteína de dedo de zinc es cualquiera de las seleccionada del grupo que consiste de YKCKQCGKAFGCPSNLRRHGRTH(SEQ ID NO:1), YQCNICGGKCFSCNSNLHRHQRTH(SEQ ID NO:2), YSCGICGKSFSDSSAKRRHCILH(SEQ ID NO:3), YTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTH(SEQ ID NO:4), YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIH(SEQ ID NO:5), YKCKECGKAFNHSSNFNKHHRIH(SEQ ID NO:6), FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTH(SEQ ID NO:7), YRCKYCCDRSFSISSNLQRHVRNIH(SEQ ID NO:8), YECDHCGKAFSIGSNLNVHRRIH(SEQ ID NO:9), YGCHLCCKAFSKSSNLRRHEMIH(SEQ ID NO:10), YKCKECGQAFRQRAHLIRHHKLH(SEQ ID NO:11), YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH(SEQ ID NO:12), FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLH(SEQ ID NO:13), YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIH(SEQ ID NO:14), YACHLCGKAFTQSSHRRHEKTH(SEQ ID NO:15), YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIH(SEQ ID NO:16), YACHLCGKAFTQCSHLRRHEKTH(SEQ ID NO:17), YACHLCAKAFIQCSHLRRHEKTH(SEQ ID NO:18), YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH(SEQ ID NO:19), YKCEECEGKAFRQSSHLTTHKIIH(SEQ ID NO:20), YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH(SEQ ID NO:21), YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTH(SEQ ID NO:22), YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIH(SEQ ID NO:23), FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:24), YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:25), YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSH(SEQ ID NO:26), YECVQCGKSYSQSSNLFRHQRRH(SEQ ID NO:27), YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVH(SEQ ID NO:28), YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTH(SEQ ID NO:29), YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIH(SEQ ID NO:30), YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIH(SEQ ID NO:31), YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTH(SEQ ID NO:32), YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH(SEQ ID NO:33), YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTH(SEQ ID NO:34), YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSH(SEQ ID NO:35), YKCEECGKAFNQSSTLTRHKIVH(SEQ ID NO:36), YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIH(SEQ ID NO:37), YEVHDCGKSFRQSTHTLTQHRRIH(SEQ ID NO:38), YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH(SEQ ID NO:39), HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTH(SEQ ID NO:40), YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH(SEQ ID NO:41), YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO:42), YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKH(SEQ ID NO:43), FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTH(SEQ ID NO:44), FACSWQDCNKKFARSDELARHYRTH(SEQ ID NO:45), YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO:46), FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSH(SEQ ID NO:47), CRCNECGKSFSRRDHLVRHQRTH(SEQ ID NO:48), FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH(SEQ ID NO:49), FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKH(SEQ ID NO:50), YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRH(SEQ ID NO:51), YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH(SEQ ID NO:52), YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:53), YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(SEQ ID NO:54), FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(SEQ ID NO:55), YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(SEQ ID NO:56), YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(SEQ ID NO:57), YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(SEQ ID NO:58), YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(SEQ ID NO:59), FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID NO:60), CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(SEQ ID NO:61), y el motivo de unión de ión metálico artificialmente diseñado en base al motivo de dedo de zinc o el motivo de proteína de unión de ión metálico es cualquiera del grupo que consiste de PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTC(SEQ ID NO: 86), PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTM(SEQ ID NO: 87), PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHT(Me-C) (SEQ ID NO: 88), PYK(Me-C)PECGKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO: 89), PYKCPE(Me- C)GKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO: 90), PYKCPE(Me- C)GKSFSQK$ALVKHQR(SEQ ID NO: 91),GLKALEEKCKALEEKLKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO: 92), GLKALEEKLKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO: 93), GLKALEEKCKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO: 94), GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO: 95), GLKALEEKLKALEEKLKALEEKCKALEEKG(SEQ ID NO: 96), GLKALEEKLKALEEKLKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID NO: 97), GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID NO: 98), ELYALEKELGALEKELACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO: 99), KLYALKEKLGALKEKLACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO: 100), ELYALEKELGALEKELACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO: 101), and KLYALKEKLGALKEKLACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO: 102); El motivo Cys-Xm-Cys, el motivo Met-X-Cys-X-X-Cys, ó el motivo C-Q-C-Q-C-A-C de las proteínas regulatorias de transcripción, las proteínas acompañantes de metal, los transportadores de ión metálico, o el superóxido dismutasa es cualquiera de los seleccionados del grupo que consiste de CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYALCQDEELCVC (SEQ ID NO: 63), CDTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSELCV C(SEQ ID NO: 64)), CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSALARQE LCVC(SEQ ID NO: 65), CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRWSVLAKQE LCVC(SEQ ID NO: 66), LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCM(SEQ ID NO: 67), CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPVRLRILSQLAAGGC(SEQ ID NO: 68), YRAAMPWRALVAYLTENCCHGTRDC(SEQ ID NO: 69), CLRGCGLWATYEGRQVRYALADSHLARALGELVQWLAVDTDQPC(SEQ ID NO: 70), CLRDCGLWTVPDGRRSRYELADERLGHALDDLRAAWAVDADRTCPDADE LECC(SEQ ID NO: 71), HXXWFYLX2i.28CXLFMVIGXWFLVIXi8-27HXXH (caracterizado por que X representa cualquier aminoácido, y Xm-q representa residuos de aminoácido que no sea Cys, el número del cual está indicado por m a q), VSGMDCAACARKVENAVRQLAGVNQVQVLFA(SEQ ID NO: 72), VPGMTCSACPITVKKAISEVEGVSKVDVTFE(SEQ ID NO: 73), ITGMTCDSCAAHVKEALEKVPGVQSALVSY(SEQ ID NO: 74), VQGFTCANCAGKFEKNVKKIPGVQDAKVNFG(SEQ VEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGEHHIKVSLE(SEQ WMTCSGCSGAVNKVLTKLEPDVSKIDIS(SEQ GMTCASCVANIERNLRREEGIYSV(SEQ ID NO: 78), YEGMTCQSCVSSIEGKYRKLQGWRYKVSL(SEQ ID NO: 79), GMSCQGCAGAVRRVLTKMEGVETFDIDME(SEQ ID NO: 80), VPSITCSHCVDKIEKFVGEIEGVSFIDANVE(SEQ ID NO: 81), VTGMTCAACSNSVEAALMNVNGVDVGGMTCGGCSASVKKLLESQPCVASA SV(SEQ ID NO: 82), VSGMVCAACSTAVENALLSCSGV(SEQ ID NO: 83), DVGGMTCGGCSASVKKILESQP(SEQ ID NO: 84), and DVGGMKCGGCVEHVKKILEEQFGVTSAS (SEQ ID NO: 85); el motivo peptídico de unión de ión metálico que tiene la estructura circular es Cyclo[K 1,12] (QCGVCGKCIACK); y el motivo CGH tiene una estructura representada por la siguiente formula química 1: Formula química 1 ' caracterizada por que M representa un ión metálico, y R representa un residuo de amino ácido que no sea cisteína. 6. Un anticuerpo modificado de la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo parental es uno o mas seleccionado del grupo que consiste de un 5 anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humano, y un anticuerpo humanizado. 7. El anticuerpo modificado de la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo parental es uno o mas seleccionados del grupo que consiste de IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM. ío 8. El anticuerpo modificado de la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo parental tiene una afinidad y especificidad de unión para antigenos específicos del cáncer, proteínas receptoras de la superficie celular, proteínas de la superficie celular, proteínas transmembrana, proteínas de señalización, reguladores de supervivencia celular, reguladores de proliferación celular, 15 moléculas asociadas con el desarrollo del tejido o la diferenciación, linfoquinas, citoquinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, moléculas implicadas en la vasculogénesis, o moléculas asociadas con la angiogénesis. 9. El anticuerpo modificado de la reivindicación 8, caracterizado por que el 20 anticuerpo parental tiene una afinidad de unión para una ó más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de; (1) BMPRIB (proteína morfogenética ósea de tipo receptor IB; No. de Acceso GenBank NMJ301203); (2) E16 (LAT1, SLC7A5; No. de Acceso Genbank NM_003486); (3) STEAP1 (seis transmembrana antígeno epitelial de próstata; No. de Acceso Gen Ba n k N M_012449) ; (4) 0772P (CA125, MUC16, No. de Acceso GenBank AF361486); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, el factor potenclador de megacariocitos, mesotelina; No. de Acceso GenBank NM_005823); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia vehículo de soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, fosfato transportador de sodio-dependiente 3b tipo II ; No. de Acceso GenBank NM_006424); (7) 5b Sema (FLJ 10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y tipo 1 -similar), dominio transmembrana (TM) y el dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B; No. de Acceso GenBank AB040878); (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12; No. de Acceso Genbank AY358628); (9) ETBR (endotelina receptor de tipo B; No. de Acceso GenBank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, FLJ20315 proteína hipotetica, No. de Acceso Genbank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado a cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis transmembrana, No. de Acceso GenBank AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cationes potencial del receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4; No. de Acceso GenBank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma; No. de Acceso GenBank NP 003203 o NM_003212); (14) CD21 (CR2 (Complemento receptor 2) o C3DR (receptor del virus C3d / Epstein Barr) o Hs.73792; No. de Acceso GenBank M26004); (15) CD79b (CD79B, O?79b, IGB (beta inmunoglobulina asociada), B29, No. de Acceso GenBank NM_000626); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a ancla de fosfatasa que contiene dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C; No. de Acceso GenBank NM_030764); (17) HER2 (No. de Acceso GenBank M11730); (18) ErbB receptor seleccionado de EGFR, HER3, y HER4 (19) NCA (No. de Acceso GenBank M 18728); (20) MDP (No. de Acceso GenBank BC017023); (21) IL20Ra (No. de Acceso GenBank AF184971); (22) Brevican (No. de Acceso GenBank AF229053); (23) EphB2R (No. de Acceso GenBank NM_004442); (24) ASLG659 (No. de Acceso GenBank AX092328); (25) PSCA (No. de Acceso GenBank AJ297436); (26) GEDA (No. de Acceso GenBank AY260763); (27) BAFF-R (Receptor del factor que activa celulas B, receptor BLyS, BR3, NP_443177.1); (28) CD22 (receptor de células B CD22-B isoforma; NP-001.762,1); (29) CD79a (CD79A, CD79.alpha., Inmunoglobulina alfa asociada, una proteína específica de la célula B que interactúa de forma covalente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo en la superficie con moléculas IgM, transduce una señal implicada en B- diferenciación celular; No. de Acceso GenBank NP_001774.1); (30) CXCR5 (receptor 1 de linfoma de Burkitt, un receptor acoplado a la proteína G que se activa por las quimioquinas de CXCL 13, las funciones en la migración de linfocitos y la defensa humoral, juega un papel en la infección de VIH-2 y considerado para el desarrollo del SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia; No. de Acceso Genbank NP_001707.1); (31) HLA-DOB (subunidad beta de molécula MHC de clase II (antígeno la) que se une a péptidos y los presenta a los linfocitos CD4 + T, No. de Acceso a Genbank NP_002111.1); (32) P2X5 (canal de iones 5 receptor ligando-cerrado purinérgico P2X, un canal iónico cerrado por el ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y la neurogénesis, la deficiencia puede contribuir a la fisiopatología de la inestabilidad del detrusor idiopática; No. de Acceso a Genbank NP_002552.2); (33) CD72 (antígeno de diferenciación de células B CD72, Lyb-2; No. de Acceso a Genbank NP_001773.1); (34) LY64 (linfocítico Antígeno 64 (RP105), proteína de membrana tipo I de la familia (LRR) de repetición rica en leucina, regula la activación de celulas B y la apoptosis, la pérdida de función está asociada con el aumento de actividad de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso 5 sistémico; N 0 de Acceso Genbank NP_005573.1); (35) FcRH1 (Proteína 1 similar al receptor Fe, un receptor putativo para el dominio Fe de ¡nmunoglobulina que contiene dominios de tipo C2 similares a Ig e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B; No. de Acceso a Genbank NP_443170.1); ío (36) IRTA2 (translocación receptora de la superfamilia de Inmunoglobulina asociada 2, un immunoreceptor putativo con posibles funciones en el desarrollo de células B y linfomagénesis; Se produce la desregulación del gen por la translocación en algunos tumores malignos de células B; No. de Acceso a Genbank NP_112571.1); y 15 (37) TENB2 (proteoglicano transmembrana putativo, relacionado con la familia EGF / heregulina de factores de crecimiento y folistatina; No. de Acceso a Genbank AF179274). (38) MAGE-C1/CT7 (proteína sobre-expresada en el cáncer testicular); (39) Receptor de andrógenos, PTEN, peptidasa relacionada con la calicreína 20 humana 3 (proteína sobre-expresada en el cáncer de próstata); (40) CD20; (41) CD30; (42) CD33; (43) CD52; (44) EpCam; (45) CEA; (46) gpA33; (47) Mucinas; (48) TAG-72; (49) Anhidrasa carbónica IX; (50) PSMA; (51) Proteína de unión a folato; (52) gangliósidos (GD2, GD3, GM2); (53) hidrato / sacárido Lewis-Y; (54) VEGF; (55) VEGFR; (56) aVb3; (57) a5b1; (58) ERB3; (59) c-MET; (60) EphA3; (61) TRAIL-R1, TRAIL-R2; (62) RANKL; (63) FAP; y (64) Tenascin. 10. El anticuerpo modificado de la reivindicación 8, caracterizado por que el anticuerpo parental comprende uno ó más de los seleccionados del grupo que consiste de trastuzumab, rituximab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ipilimumab, alemtuzumab, ofatumumab, gemtuzumab, brentuximab, 90Y- ibritumomab, 131l-tositumomab, cBR96, cACIO, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo 5 anti-EphB2, anti-IL-8, anticuerpo E-selectin, anticuerpo anti-MUC16, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD33, y anticuerpo anti-CD52. 11. Un conjugado anticuerpo-fármaco modificado que comprende un fármaco unido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que el ío fármaco es conjugado al grupo tiol del residuo de cisteína en el motivo de unión para el anticuerpo parental y que tiene una estructura representada por la anterior formula 1. 12. El conjugado fármaco-anticuerpo modificado de la reivindicación 11, 15 caracterizado por que el fármaco es conjugado al residuo de cisteína en el motivo por un vinculante, el motivo que tiene una estructura representada por la anterior formula 1 que se une al anticuerpo parental. 13. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 12, caracterizado 20 por que el vinculante es uno o más de los seleccionados del grupo que consiste de derivados de haluro de alquilo que contienen un grupo haloacetilo, derivados que contienen un grupo maleimida, derivados de aziridina, derivados de acriloílo, y derivados de haluro de arilo que contienen fluorobenzen o similares. 25 14. El conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la reivindicación 13 caracterizado por que los derivados comprenden un grupo alquilante reactivo, un grupo reactivo de arilación, un grupo maleimida, un grupo aziridina, un grupo acriloilo o un grupo reactivo de intercambio de disulfuro que comprende disulfuro de piridilo o ácido tionitrobenzoico, que reacciona con el grupo tiol del resto de 5 cisteína en el motivo y es covalentemente unido al mismo. 15. El conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la reivindicación 11, caracterizado por que el fármaco es uno o más seleccionado del grupo que consiste de inhibidores de microtubulina, inhibidores de la mitosis, inhibidores de la ío topoisomerasa, o agentes quimioterapeuticos capaces de funcionar como intercaladores de ADN, agentes anticancerígenos, toxinas proteicas capaces de funcionar como enzimas, micro-ARN (miARN), siRNA, o shRNA, que pueden inhibir la expresión de una específica oncogén, y radioisótopos. 16. El conjugado anticuerpo-fármaco modificado de la reivindicación 11, 15 caracterizado por que el fármaco es uno o más seleccionados del grupo que consiste de maitansinoide, auristatina, aminopterina, actinomicina, bleomicina, talisomycin, camptotecina, espermidina acetil N8-, 1 (2 cloroetil) -1,2-dimetil hidracida sulfonilo, taxol, esperamicina, etopósido, 6-mercaptopurina, dolastatina, tricotecenos, CC1065 (compuesto citotóxico), caliqueamicina y otros antibióticos 20 de enedina, taxano, antracielina, metotrexato, adriamicina, vindesina, alcaloides de la vinca, vincristina, vinblastina, etopósido, doxorrubicina, melfalán, mitomicina A, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina, daunomicina y estereoisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos, y estereoisómeros, duocamycin isósteros, análogos o derivados de los mismos, enzimas nucleolíticas, antibióticos, 25 toxinas de origen bacteriano, vegetal o animal, cisplatino, CPT-11, doxorubicina, paclitaxel y docetaxel. 17. Un metodo de producción de un conjugado de anticuerpo-fármaco modificado que comprende: (a) reacción del anticuerpo modificado , caracterizado por que el motivo de una estructura representada por la siguiente formula 1 del mismo, con un reactivo vinculante para formar un anticuerpo-vinculante intermediario; (b) reacción del intermediario con un grupo farmacológico activo para producir el conjugado anticuerpo-fármaco modificado: Xa-[(MCys)n-Xbn]n Formula (1) Caracterizado por que (Mcys)n representa un residuo de cisteina simple o un motivo peptídico simple o un motivo peptídico que contiene un residuo de cisteina y tiene una funcionalidad especifica o una estructura secundaria o terciaria Xa y Xbn cada uno independientemente representa un péptido que comprende de 0 a 20 residuos de aminoácidos que no sean cisteina, y n es un número entero de 1 a 20. 18. Un método de producción de un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende: (a) reacción del grupo nucleofílico de un grupo farmacológico con un reactivo vinculante para formar un intermediario fármaco-vinculante; y (b) reacción del intermediario con un anticuerpo parental que comprende la unión del motivo del mismo y caracterizado por que el motivo que tiene una estructura representada por la siguiente formula 1: Xa-[(MCys)n-Xbn]n Formula (1) caracterizada por que (Mcys)n representa un residuo de cisteína simple o un motivo peptídico que contiene un residuo de cisteína y tiene una funcionalidad especifica o una estructura secundaria o terciaria; Xa y Xbn cada una representa de manera independiente un peptido que comprende 0 a 20 residuos de amino ácidos que no sean cisteína; y n es un número entero q oscila de 1 a 20. 19. Un método de producción de un anticuerpo modificado que comprende un motivo que une un anticuerpo parental, el método comprende los pasos de: (a) construcción de un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleótida en la que la una secuencia polinucleótida que codifica el motivo y una secuencia polinucleótida que codifica el anticuerpo parental se vinculan de manera recombinante entre si; (b) expresión del vector de expresión construido en un cultivo que utiliza célula huésped; y (c) aislamiento y purificación del anticuerpo modificado del cultivo, caracterizado por que el motivo tiene una estructura representada por la siguiente formula 1: Xa-[(MCys)n-Xbn]n Formula (1) Caracterizada por que (MCys)n representa un residuo de cisteína simple o un motivo peptídico que contiene un residuo de cisteína y tiene una funcionalidad específica o una estructura secundaria o terciaria; Xa y Xbn cada una representa de manera independiente un peptido que comprende de 0 a 20 residuos de amino ácidos que no sean cisteína; y n es un número entero que oscila de 1 a 20. 20. El método de la reivindicación 19, caracterizado por que las células huésped son seleccionadas del grupo que consiste de células de riñón de mono 7 (COS7), células NSO, células SP2/0, células de ovario de hámster Chino(CHO), W138, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de Madin-Darby de riñón canino (MDCK), líneas celulares de mieloma, células HuT 78, y células HEK293. 21. Una composición terapéutica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.
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